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A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière?
Stéphane BretagneHôpital Henri Mondor, CréteilCNR Mycologie Antifongiques,
Institut Pasteur, Paris
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Questions
Diagnostic positifGénotypageIdentification
Aspergilloses invasives Candidoses invasives« Emergents »
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Diagnostic positif
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Diagnostic microbiologique des infections fongiques
Peu sensibles (< 50%)Interprétation?
Véritable infection?Colonisation?Contamination?
TardifMortalité de l’aspergillose invasive : 70-90%Mortalité des candidémies : 50 %
Une solution: la PCRLBAsérum
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PCR Aspergillus LBA
Jusqu’à 35% de PCR+ (Spreadbury C. JCM 1993; Tang CM, Am Rev Resp Dis 1993; Verweij P. JCM 1994; Bretagne S.JCM 1995, Skladny R. JCM 1999 ...)
Confirmation de cultures positivesConidies en transit? Colonisaton? Infection?
5% de PCR + (Einsele H. Lancet 1998)134 patients sous flux, LBA avant greffe7/134 PCR+5 des 7 PCR+ développent une aspergillose3 des PCR- développent une aspergillose
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PCR sérum
Hebart et al JID 200084 patients greffés de moelle sous flux169/1193 PCR +37,5% (30/84) patients PCR+ avant J40 et 40% (12/30) après J407 aspergilloses prouvéesSensibilité: 100%Spécificité: 65%VPP: 15,2%VPN: 100%
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Comment expliquer ces résultats?
Faux + et faux -Manque de standardisation
Pas d’intérêt commercialMéthodes artisanales
Différences dues:A la méthode employée ?Aux populations testées ?
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Comment expliquer ces résultats divergents ?
Germes de l’environnementOn trouve de l’ADN fongique partoutStratégie
Panfungus ?Ciblé sur des germes d’intérêt ?
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Comment avancer?
Standardiser les méthodes de PCR Associer plusieurs tests de finalités différentes
Comparaison Ag-ADNRecherche d’ARN
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Standardisation des techniques
PCR en temps réelSondes d’hydrolyse « Taqman »Sondes d’hybridation « FRET »
NASBAARNADN
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PCR en temps réel- Prévention des contaminations -
![Page 12: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/12.jpg)
NASBA- détection d’ARN -
![Page 13: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/13.jpg)
Comparaison de différents tests
PCR quantitative vs GM vs ß-D-GlucanCriblage hebdomadaire des sérums149 épisodes, 96 patients d’hématologie9 prouvées, 2 probables, 13 possibles (critères EORTC)
Kawazu M, et al, JCM, 2004
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Comparaison des différents tests
0,960,400,930,55ß-D-Glucan
0,960,400,930,55qPCR
1,000,550,931,00GM
NPVPPVspécificitésensibilitéméthode
Kawazu M, et al, JCM, 2004
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NASBA + GM
448 sérums de 128 patients14 patients avec IA (2 prouvées, 12 probables)
Sensibilité (NASBA >5 + GM> 0,5) = 100%Valeur pronostique des index NASBA
Pb: ARNs extraits de tube EDTA
Yoo J-H, CID 2005
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Seuil détection PCR Candida
Cible ARNr
détection SensibilitéCFU/ml
référence
5S Br. éthidium
15 Holmes, JCM 94
5,8S EIA 10 Fujita, JCM 95
18S Souhern-blot
100-150 van Deventer, JCM 95
18S Souhern-blot
10-100 Polanco, EJCMID 95
18S ELISA 10 Loffler, Med Mycol, 98
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PCR Candida
Difficultés à concurrencer les automates à hémoculturesDétection d’ADN répétépotentiellement plus sensible que les hémocultures mais signification?
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Diagnostic
Standardisation des méthodes de détectionStandardisation des méthodes d’extractionAssociation de tests de finalitédifférente
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Typage moléculaire
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Pourquoi disposer d’un système de génotypage?
GénétiquePopulationsReproduction clonaleSexualité
Epidémiologie cliniqueTransmission nosocomialeInvestigation d ’épidémiesIsolats pathogènes versus non pathogènesCorrespondance génotype-phénotype (résistance aux antifongiques, variation des génotypes sous pression médicamenteuses)Physiopathologie d’une infection (même isolat ou contamination avec un nouveau)…
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Caryotype A. nidulans
H. Brody, PNAS 1989
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RFLP + hybridation: différentes étapes pour informatiser les données expérimentales
Soll DR Clin Microbiol Rev 2000
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RAPD C. albicans
Soll DR Clin Microbiol Rev 2000
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MLST (multilocus sequence typing)
ME Bougnoux et al, JCM 2002
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Microsatellites
Short tandem repeats: motifs de 2-6 nucléotidesPolymorphes et nombreux (Weber, Genomics 1990)Présents chez les eucaryotes inférieurs, e.g. Candida
albicans (Field et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; Bretagne et al., Clin. Microbiol. 1997) etAspergillus fumigatusAnalyse par PCR et séquenceur automatique
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Microsatellite parfait
Figure 1
Allele 1 (122bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 4 TTTATAA--------
Allele 2 (128bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 5 TTTATAA--------
Allele 3 (134bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 6 TTTATAA--------
Allele 4 (140bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 7 TTTATAA--------
Allele 5 (146bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 8 TTTATAA--------
Gène RPM2 C. glabrata (F. Foulet, JCM accepté)
![Page 27: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/27.jpg)
Microsatellite: analyse des produits de PCR d’A. fumigatus
![Page 28: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/28.jpg)
Analyse des microsatellites d’isolats d’Aspergillus fumigatus
Isolat 1
Isolat 2
Isolat 3
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C. albicans :2 allèles
C. albicans :homozygote
Microsatellite: analyse des produits de PCR de C. albicans
![Page 30: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/30.jpg)
Applications du génotypage:
Question: Infection nosocomiale ou non?Deux exemples
Aspergillus fumigatusCandida albicans
![Page 31: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/31.jpg)
G : 16 / 20G : 16 / 20
15 / 15 20 / 2215 / 15 20 / 22
13 / 14 10 / 1013 / 14 10 / 106 / 76 / 7
13 / 13 8 / 8 13 / 13 8 / 8
A : 80 / 93A : 80 / 93
M : 78 / 89M : 78 / 89
13 / 14 11 / 1113 / 14 11 / 11
21/ 22 9 / 9 9 / 921/ 22 9 / 9 9 / 9
14 / 1414 / 14
OutpatientOutpatient ClinicClinic ::74 / 7974 / 79
200 m200 m
GardenGarden56 / 6156 / 61
16/18 8/8 16/18 8/8 13/1513/15
15 / 1715 / 17
5 / 5 18 / 205 / 5 18 / 20
11 / 1111 / 11
8 / 9 8 / 9
4 / 44 / 4
6 / 6 7 / 10 6 / 6 7 / 10
HematologyHematologyUnitUnit
HôtelHôtel--Dieu, ParisDieu, Paris
Institut Pasteur, Laboratoire des Aspergillus Debeaupuis JP et al, Inf Immun 1997
![Page 32: Stéphane Bretagne Hôpital Henri Mondor, Créteil CNR ... · Microsoft PowerPoint - JNI PC Nice.ppt Author: Serge Alfandari Created Date: 6/26/2005 11:18:28 PM](https://reader034.vdocument.in/reader034/viewer/2022051917/60093069bc68d96d3a7d8d8b/html5/thumbnails/32.jpg)
--2525
--2020
--1515
--1010
--55
00
55
1010
1515
2020
2525
NumberNumber ofof monthsmonths
NumberNumber ofof isolatesisolates
Institut Pasteur, Laboratoire des Aspergillus Debeaupuis JP et al, Inf Immun 1997
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EE
P
P
P
P
-3
1.1-1.5 4.5 1 environmental
≥ 2 environmental
1 clinical≥ 2 clinicalref. strain
Isolates
Bart-Delabesse et al, JCM 1998
RRéépartition des gpartition des géénotypesnotypesen fonction de len fonction de l’’origineorigine
clinique ou environnementaleclinique ou environnementale
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November December January February March April May June July August September October November
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20 21 22
23
24
Pt 3-C
Pt 4-D*
Pt 1-A
Pt 2-B
Pt 30-X
Pt 18-H
Pt 17-OPt 16-N
Pt 14-L*
Pt 13-K
Pt 12-J
Pt 11-EPt 10-I
Pt 9-I
Pt 8-H
Pt 7-GPt 6-F
Pt 5-E
Pt 15-M*
Pt 28-V
Pt 27-I
Pt 26-U
Pt 25
Pt 24-S
Pt 23-R
Pt 22-Q
Pt 21-H
Pt 19-P
Pt 20-I
Pt 21-H
Pt 24-S*
Pt 25-T*
Pt 29-W*
B4
B3
B2
B1
Stéphan et al CID 2002
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Conclusion génotypage
Nombreuses techniques possiblesDéfinir sa questionUne technique donnée ne répondra pas à toutes les questions
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Identification
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Filaments dans une biopsie ?
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Diagnostic des mucormycoses
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Identification
Cultures difficiles de certains champignonsExtraction d’ADN de biopsiesAmplification, séquençageComparaison aux banques de données
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A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière?
OUIDomaine en plein développement
Intérêt certain pour une meilleure prise en charge des patients