A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière?

Stéphane BretagneHôpital Henri Mondor, CréteilCNR Mycologie Antifongiques,

Institut Pasteur, Paris

Questions

Diagnostic positifGénotypageIdentification

Aspergilloses invasives Candidoses invasives« Emergents »

Diagnostic positif

Diagnostic microbiologique des infections fongiques

Peu sensibles (< 50%)Interprétation?

Véritable infection?Colonisation?Contamination?

TardifMortalité de l’aspergillose invasive : 70-90%Mortalité des candidémies : 50 %

Une solution: la PCRLBAsérum

PCR Aspergillus LBA

Jusqu’à 35% de PCR+ (Spreadbury C. JCM 1993; Tang CM, Am Rev Resp Dis 1993; Verweij P. JCM 1994; Bretagne S.JCM 1995, Skladny R. JCM 1999 ...)

Confirmation de cultures positivesConidies en transit? Colonisaton? Infection?

5% de PCR + (Einsele H. Lancet 1998)134 patients sous flux, LBA avant greffe7/134 PCR+5 des 7 PCR+ développent une aspergillose3 des PCR- développent une aspergillose

PCR sérum

Hebart et al JID 200084 patients greffés de moelle sous flux169/1193 PCR +37,5% (30/84) patients PCR+ avant J40 et 40% (12/30) après J407 aspergilloses prouvéesSensibilité: 100%Spécificité: 65%VPP: 15,2%VPN: 100%

Comment expliquer ces résultats?

Faux + et faux -Manque de standardisation

Pas d’intérêt commercialMéthodes artisanales

Différences dues:A la méthode employée ?Aux populations testées ?

Comment expliquer ces résultats divergents ?

Germes de l’environnementOn trouve de l’ADN fongique partoutStratégie

Panfungus ?Ciblé sur des germes d’intérêt ?

Comment avancer?

Standardiser les méthodes de PCR Associer plusieurs tests de finalités différentes

Comparaison Ag-ADNRecherche d’ARN

Standardisation des techniques

PCR en temps réelSondes d’hydrolyse « Taqman »Sondes d’hybridation « FRET »

NASBAARNADN

PCR en temps réel- Prévention des contaminations -

NASBA- détection d’ARN -

Comparaison de différents tests

PCR quantitative vs GM vs ß-D-GlucanCriblage hebdomadaire des sérums149 épisodes, 96 patients d’hématologie9 prouvées, 2 probables, 13 possibles (critères EORTC)

Kawazu M, et al, JCM, 2004

Comparaison des différents tests

0,960,400,930,55ß-D-Glucan

0,960,400,930,55qPCR

1,000,550,931,00GM

NPVPPVspécificitésensibilitéméthode

Kawazu M, et al, JCM, 2004

NASBA + GM

448 sérums de 128 patients14 patients avec IA (2 prouvées, 12 probables)

Sensibilité (NASBA >5 + GM> 0,5) = 100%Valeur pronostique des index NASBA

Pb: ARNs extraits de tube EDTA

Yoo J-H, CID 2005

Seuil détection PCR Candida

Cible ARNr

détection SensibilitéCFU/ml

référence

5S Br. éthidium

15 Holmes, JCM 94

5,8S EIA 10 Fujita, JCM 95

18S Souhern-blot

100-150 van Deventer, JCM 95

18S Souhern-blot

10-100 Polanco, EJCMID 95

18S ELISA 10 Loffler, Med Mycol, 98

PCR Candida

Difficultés à concurrencer les automates à hémoculturesDétection d’ADN répétépotentiellement plus sensible que les hémocultures mais signification?

Diagnostic

Standardisation des méthodes de détectionStandardisation des méthodes d’extractionAssociation de tests de finalitédifférente

Typage moléculaire

Pourquoi disposer d’un système de génotypage?

GénétiquePopulationsReproduction clonaleSexualité

Epidémiologie cliniqueTransmission nosocomialeInvestigation d ’épidémiesIsolats pathogènes versus non pathogènesCorrespondance génotype-phénotype (résistance aux antifongiques, variation des génotypes sous pression médicamenteuses)Physiopathologie d’une infection (même isolat ou contamination avec un nouveau)…

Caryotype A. nidulans

H. Brody, PNAS 1989

RFLP + hybridation: différentes étapes pour informatiser les données expérimentales

Soll DR Clin Microbiol Rev 2000

RAPD C. albicans

Soll DR Clin Microbiol Rev 2000

MLST (multilocus sequence typing)

ME Bougnoux et al, JCM 2002

Microsatellites

Short tandem repeats: motifs de 2-6 nucléotidesPolymorphes et nombreux (Weber, Genomics 1990)Présents chez les eucaryotes inférieurs, e.g. Candida

albicans (Field et al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; Bretagne et al., Clin. Microbiol. 1997) etAspergillus fumigatusAnalyse par PCR et séquenceur automatique

Microsatellite parfait

Figure 1

Allele 1 (122bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 4 TTTATAA--------

Allele 2 (128bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 5 TTTATAA--------

Allele 3 (134bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 6 TTTATAA--------

Allele 4 (140bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 7 TTTATAA--------

Allele 5 (146bp) --------TTAGCATTAGCATTAGC [ACAAGC] 8 TTTATAA--------

Gène RPM2 C. glabrata (F. Foulet, JCM accepté)

Microsatellite: analyse des produits de PCR d’A. fumigatus

Analyse des microsatellites d’isolats d’Aspergillus fumigatus

Isolat 1

Isolat 2

Isolat 3

C. albicans :2 allèles

C. albicans :homozygote

Microsatellite: analyse des produits de PCR de C. albicans

Applications du génotypage:

Question: Infection nosocomiale ou non?Deux exemples

Aspergillus fumigatusCandida albicans

G : 16 / 20G : 16 / 20

15 / 15 20 / 2215 / 15 20 / 22

13 / 14 10 / 1013 / 14 10 / 106 / 76 / 7

13 / 13 8 / 8 13 / 13 8 / 8

A : 80 / 93A : 80 / 93

M : 78 / 89M : 78 / 89

13 / 14 11 / 1113 / 14 11 / 11

21/ 22 9 / 9 9 / 921/ 22 9 / 9 9 / 9

14 / 1414 / 14

OutpatientOutpatient ClinicClinic ::74 / 7974 / 79

200 m200 m

GardenGarden56 / 6156 / 61

16/18 8/8 16/18 8/8 13/1513/15

15 / 1715 / 17

5 / 5 18 / 205 / 5 18 / 20

11 / 1111 / 11

8 / 9 8 / 9

4 / 44 / 4

6 / 6 7 / 10 6 / 6 7 / 10

HematologyHematologyUnitUnit

HôtelHôtel--Dieu, ParisDieu, Paris

Institut Pasteur, Laboratoire des Aspergillus Debeaupuis JP et al, Inf Immun 1997

--2525

--2020

--1515

--1010

--55

00

55

1010

1515

2020

2525

NumberNumber ofof monthsmonths

NumberNumber ofof isolatesisolates

Institut Pasteur, Laboratoire des Aspergillus Debeaupuis JP et al, Inf Immun 1997

EE

P

P

P

P

-3

1.1-1.5 4.5 1 environmental

≥ 2 environmental

1 clinical≥ 2 clinicalref. strain

Isolates

Bart-Delabesse et al, JCM 1998

RRéépartition des gpartition des géénotypesnotypesen fonction de len fonction de l’’origineorigine

clinique ou environnementaleclinique ou environnementale

November December January February March April May June July August September October November

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20 21 22

23

24

Pt 3-C

Pt 4-D*

Pt 1-A

Pt 2-B

Pt 30-X

Pt 18-H

Pt 17-OPt 16-N

Pt 14-L*

Pt 13-K

Pt 12-J

Pt 11-EPt 10-I

Pt 9-I

Pt 8-H

Pt 7-GPt 6-F

Pt 5-E

Pt 15-M*

Pt 28-V

Pt 27-I

Pt 26-U

Pt 25

Pt 24-S

Pt 23-R

Pt 22-Q

Pt 21-H

Pt 19-P

Pt 20-I

Pt 21-H

Pt 24-S*

Pt 25-T*

Pt 29-W*

B4

B3

B2

B1

Stéphan et al CID 2002

Conclusion génotypage

Nombreuses techniques possiblesDéfinir sa questionUne technique donnée ne répondra pas à toutes les questions

Identification

Filaments dans une biopsie ?

Diagnostic des mucormycoses

Identification

Cultures difficiles de certains champignonsExtraction d’ADN de biopsiesAmplification, séquençageComparaison aux banques de données

A-t-on besoin de la biologie moléculaire en mycologie hospitalière?

OUIDomaine en plein développement

Intérêt certain pour une meilleure prise en charge des patients