dÉveloppement de nouvelles mÉthodologies par …
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DEacuteVELOPPEMENT DE NOUVELLESMEacuteTHODOLOGIES PAR SPECTROMEacuteTRIE DEMASSE A TREgraveS HAUTE REacuteSOLUTION POURLrsquoANALYSE STRUCTURALE DE COMPLEXES
PROTEacuteIQUESOpheacutelie Robine
To cite this versionOpheacutelie Robine DEacuteVELOPPEMENT DE NOUVELLES MEacuteTHODOLOGIES PAR SPEC-TROMEacuteTRIE DE MASSE A TREgraveS HAUTE REacuteSOLUTION POUR LrsquoANALYSE STRUCTURALEDE COMPLEXES PROTEacuteIQUES Chimie analytique Ecole Polytechnique X 2012 Franccedilaispastel-00750754
THESE
Preacutesenteacutee pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE LrsquoECOLE POLYTECHNIQUE
Speacutecialiteacute Chimie
Par
Opheacutelie ROBINE
Deacuteveloppement de nouvelles meacutethodologies par spectromeacutetrie
de masse agrave tregraves haute reacutesolution pour lrsquoanalyse structurale de
complexes proteacuteiques
Directrice de thegravese Julia Chamot-Rooke
Soutenue le 28 septembre 2012 devant la commission d‟Examen composeacutee de
M Jean-Michel Camadro Preacutesident
Mme Julia Chamot-Rooke Directrice de thegravese
Mme Emmanuelle Leize Rapporteur
M Christian Rolando Rapporteur
M Guillaume van der Rest Co-directeur de thegravese
i
ii
Le geacutenie crsquoest 1 drsquoinspiration
et 99 de transpiration
Thomas Edison
So mushkil vakt comando sakth
A close friend
iii
Remerciements
Je tiens tout d‟abord agrave remercier Gilles Ohanessian Directeur du laboratoire des
Meacutecanismes Reacuteactionnels de l‟Eacutecole Polytechnique de m‟avoir accueillie au sein de son
Uniteacute de Recherche et de m‟avoir donneacute l‟opportuniteacute de reacutealiser ce travail de thegravese
Ce travail de thegravese a eacuteteacute reacutealiseacute sous la direction de Julia Chamot-Rooke et la co-direction
de Guillaume van der Rest Je vous remercie de votre aide de votre soutien et de vos
encouragements dans les moments plus difficiles qui surviennent au cours d‟une thegravese Un
grand merci agrave tous les deux de m‟avoir accompagneacutee jusqu‟au bout de cette belle aventure
J‟adresse mes plus sincegraveres remerciements agrave Madame Emmanuelle Leize et Monsieur
Christian Rolando d‟avoir accepteacute d‟ecirctre les rapporteurs de ce travail Merci eacutegalement agrave
Monsieur Jean-Michel Camadro d‟avoir participeacute agrave l‟eacutevaluation de ma Thegravese de Doctorat
Je tiens aussi agrave exprimer ma profonde reconnaissance agrave Eacutedith et Christian de m‟avoir
eacutepauleacutee quand j‟en avais besoin dans mes expeacuteriences et de m‟avoir enseigneacute les rouages des
spectromegravetres de masse du laboratoire plus ou moins capricieux Je suis d‟accord avec Eacutedith
bien que Christian ait toujours raison le FT-ICR (sous toutes ses versions) est le meilleur
instrument du monde entier J‟exprime eacutegalement ma gratitude agrave Vincent d‟Orsay et agrave
Thibaut et Manuel de Paris 7 de m‟avoir aideacutee agrave dompter leur machine
Un grand merci agrave Yves Meacutechulam Directeur du laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole
Polytechnique de m‟avoir offert l‟opportuniteacute d‟enseigner au sein de son deacutepartement et de
travailler en collaboration avec son laboratoire Merci aussi agrave Emmanuelle pour ses conseils
Un tregraves grand merci agrave toutes celles et ceux qui ont partageacutes mon bureau et mon amitieacute
pendant ces trois anneacutees de dur labeur Notamment merci agrave Yasmine Jianqing Jana et Jan
J‟adresse eacutegalement mes sincegraveres remerciements agrave Eacutedith et Julien pour vos pauses cafeacute (ou
plutocirct theacute ) que j‟ai beaucoup appreacutecieacutees en cette fin de thegravese et agrave Joe pour tes discussions agrave
n‟en plus finir et ton humour anglais Best of Luck Merci aux anciens Mag Renjiehellip
Merci enfin agrave toutes les personnes que jrsquoai cocirctoyeacutees ou croiseacutees au DCMR pendant ces
trois anneacutees meacutemorables Merci agrave Theacuteregravese Carine Sophie Steph Michel Chris Gilles
Ash P-H Vanessa Tatianahellip Et pour finir je tiens eacutegalement agrave remercier chaleureusement
mes entraineurs de boxe agrave l‟X Merci agrave Reacutemy Fred et Gilou pour votre coaching deacutecoiffant
Un exemple de prochain challenge les JO de Rio de Janeiro en 2016hellip
iv
Je nrsquooublierai pas de remercier eacutegalement
Jean-Baptiste
Je ne te remercierai jamais assez de ta preacutesence agrave mes cocircteacutes depuis maintenant quelques
anneacutees deacutejagrave et de tout ce que tu fais pour moi Notre rencontre remonte au deacutebut de notre vie
eacutetudiante et voici que nous la finissons ensemble J‟espegravere te retrouver tregraves prochainement
pour le commencement d‟une nouvelle vie agrave deux Merci pour ton soutien et ta compliciteacute
Merci de partager mon quotidien et de me remonter le moral quand il est dans les chaussettes
Merci de partager mes joies mes peines Merci de t‟ecirctre inteacuteresseacute agrave mon travail et d‟avoir
chercheacute avec moi des solutions Merci pour tes petits plats mijoteacutes avec amourhellip Un grand
merci pour TOUT ton amour avec un grand A
Mes parents et mes sœurs
Merci de m‟avoir insuffleacute la soif d‟apprendre et la curiositeacute intellectuelle de m‟avoir
donneacute l‟envie et les moyens de faire des eacutetudes Merci de m‟avoir soutenue et encourageacutee
jusqu‟au bout de ma longue formation Merci de vous ecirctre tenus au courant de l‟avanceacutee de
mon travail de recherche Merci pour votre amour votre tendresse et votre reacuteconfort de tous
les jours Merci pour tout Ma reacuteussite est eacutegalement la vocirctre
Ma famille et belle-famille
Merci agrave vous tous pour votre affection et votre bienveillance mais je tiens agrave remercier plus
particuliegraverement ma Mamie d‟ecirctre encore pregraves de moi aujourd‟hui Merci du fond du cœur de
m‟avoir toujours beaucoup aideacutee soutenue encourageacutee reacuteconforteacutee entoureacuteehellip durant toutes
ces anneacutees et encore plus ces trois derniegraveres Merci pour notre cohabitation nos fous rires nos
discussionshellip merci pour tous ces tregraves bons moments que nous avons partageacutes ensemble
Mes amis
Laurence ma sœur siamoise du hand avec laquelle j‟ai lieacute une sincegravere amitieacute il y a six
ans deacutejagrave Merci d‟avoir gardeacute le contact et de m‟avoir soutenue durant ces trois derniegraveres
anneacutees malgreacute les contraintes d‟espace et de temps imposeacutees par la thegravese et la vie active
J‟espegravere que maintenant nous allons nous revoir plus souvent autour d‟une triple Carmeacutelite
Ash my best male friend I met you in DCMR lab two years ago where you were pursuing
a post doctoral research work Thanks a lot for ALL your happiness your support your
helphellip You taught me how to be self-confident I found in you a confidant and a collaborator
Un grand merci agrave vous tous
v
Liste des abreacuteviations
AA acide formique
ACN aceacutetonitrile
AF acide formique
aIF2 facteur d‟initiation 2 chez les archeacutees
ATD distribution des temps d‟arriveacutee
ATP adeacutenosine triphosphate
ARN(mt) acide ribonucleacuteique (messagertransfert)
BN-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en condition bleue native
CI ionisation chimique
CID dissociation induite par collision
DNA acide deacutesoxyribonucleacuteique
DSG DiSuccinimidyl Glutarate
ECD dissociation par capture d‟eacutelectron
EGTA acide eacutethylegravene glycol teacutetraaceacutetique
ESI ionisation par eacutelectroneacutebulisation
ESSI ElectroSonic Spray Ionisation
ETD dissociation par transfert d‟eacutelectron
FID Free Induction Decay
FT-ICR reacutesonance cyclotronique ionique agrave transformeacutee de Fourier
FT-MS spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier
GTP guanosine triphosphate
HDX eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
HDXMS eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium analyseacute par spectromeacutetrie de masse
HIV virus de limmunodeacuteficience humaine
HMQC correacutelation quantique multiple heacuteteacuteronucleacuteaire
HPLC chromatographie en phase liquide agrave haute performance
HSQC correacutelation quantique unique heacuteteacuteronucleacuteaire
vi
IgG immunoglobulines G
IRMPD dissociation multiphotonique infrarouge
ISD In-Source Decay
LC chromatographie en phase liquide
LC-MSMS chromatographie en phase liquide coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse en
tandem
LILBID Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption
m-NBA alcool m-nitrobenzylique
MALDI deacutesorptionionisation au laser assisteacutee par matrice
MPT modification post-traductionnelle
MS spectromeacutetrie de masse
MSMS spectromeacutetrie de masse en tandem
NHS N-HydroxySuccinimide
nOe effet Overhauser nucleacuteaire
Q-ToF quadripocircle-temps de vol
RMN reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire
SAXS diffusion des rayons X aux petits angles
SDS-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en conditions deacutenaturantes contenant
du dodeacutecyl sulfate de sodium
SMI spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique
SORI Sustained Off-Resonance Irradiation
SPR reacutesonance plasmonique de surface
TAP-Tag purification par affiniteacute en tandem
TEV virus de la gravure du tabac
TROSY spectroscopie de relaxation transversale optimiseacutee
UPLC chromatographie en phase liquide ultra haute performance
UV ultraviolet
vii
Table des matiegraveres
Introduction geacuteneacuterale 1
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10 I112 Structure secondaire 12 I113 Structure tertiaire 15 I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19 I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24 I1221 Diffusion aux petits angles 24 I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24 I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26 I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27 I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40 I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42 I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43 I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43 I2133 Catalyse de la reacuteaction 46 I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46 I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et repliement
des proteacuteines 47 I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49
I221 Marquage continu 50 I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51 I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53 I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD 60 I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60 I2332 Approches top-down et HDX 62 I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
viii
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes 108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ 121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD 131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
ix
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166 IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169 IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174 IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175 IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176 IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186 IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
Conclusion geacuteneacuterale 191
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap 214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
x
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
xi
1
Introduction geacuteneacuterale
2
3
Acteurs essentiels de l‟organisation cellulaire et de la reacutegulation du meacutetabolisme les
proteacuteines sont agrave la fois des cibles theacuterapeutiques et des meacutedicaments potentiels Leacutetude de ces
proteacuteines agrave grande eacutechelle appeleacutee analyse proteacuteomique a eacuteteacute rendue possible ces derniegraveres
anneacutees par la mise au point dapproches robustes baseacutees sur des deacuteveloppements importants
en spectromeacutetrie de masse Cependant un simple inventaire de ces proteacuteines ne suffit pas agrave
comprendre les pheacutenomegravenes biologiques complexes qui reacutegissent lactiviteacute cellulaire Ainsi
appreacutehender la maniegravere dont sont organiseacutees ces proteacuteines en complexes multiproteacuteiques est
un des deacutefis actuels de la proteacuteomique Le nombre dinteractions entre proteacuteines au sein d‟une
cellule eacutetant tregraves important linvestigation de ces multiples reacuteseaux proteacuteiques neacutecessite de
nouveaux deacuteveloppements agrave la fois en spectromeacutetrie de masse mais aussi en bioinformatique
pour fournir des meacutethodologies adapteacutees ainsi que des outils puissants pour les analyser
Les interactions entre proteacuteines sont gouverneacutees par leur agencement et repliement dans
l‟espace faisant de la structure tridimensionnelle de ces complexes un eacuteleacutement-cleacute dans
l‟eacutetude et la compreacutehension de la vie de la cellule Les meacutethodes physico-chimiques les plus
couramment utiliseacutees pour ces eacutetudes structurales sont la cristallographie et la spectroscopie
RMN Bien que ces meacutethodes d‟analyse soient les piliers de la biologie structurale actuelle
elles preacutesentent toutefois des limitations majeures la cristallographie des proteacuteines
eacutegalement appeleacutee diffraction des rayons X neacutecessite de pouvoir cristalliser les proteacuteines et la
spectroscopie RMN est limiteacutee agrave des systegravemes de taille modeste Par ailleurs les deux
techniques requiegraverent des quantiteacutes relativement importantes d‟eacutechantillon et ne donnent
quune image statique qui est loin de la reacutealiteacute de la structure des proteacuteines Il est donc
devenu indispensable de deacutevelopper des meacutethodes alternatives permettant de sinteacuteresser agrave la
dynamique de ces systegravemes biologiques tout en travaillant avec des quantiteacutes les plus faibles
possibles d‟eacutechantillon
Dans ce contexte la spectromeacutetrie de masse est devenue ces derniegraveres anneacutees un outil
inteacuteressant pour la biologie structurale La spectromeacutetrie de masse preacutesente l‟avantage de
permettre des eacutetudes sur des proteacuteines non cristallisables d‟ecirctre peu consommatrice en
mateacuteriel et de permettre des analyses rapides sur des systegravemes complexes tant par la diversiteacute
que par la taille Il existe aujourd‟hui trois grandes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de
masse pour eacutetudier l‟organisation structurale d‟un complexe proteacuteique La premiegravere consiste agrave
utiliser des conditions d‟ionisation adapteacutees permettant de maintenir en phase gazeuse des
interactions non covalentes au sein de complexes proteacuteiques La deuxiegraveme approche repose
sur le pontage covalent des proteacuteines en association suivi d‟une digestion enzymatique et
4
analyse par spectromeacutetrie de masse Les agents pontants permettent dobtenir des informations
de topologie du complexe initial en creacuteant des liaisons covalentes entre des acides amineacutes
proches dans la structure tertiaire Une derniegravere technique consiste agrave effectuer un marquage de
la surface accessible du complexe qui peut ecirctre soit permanent par l‟utilisation de reacuteactifs
chimiques particuliers ou par l‟exposition aux radicaux hydroxyles soit labile Dans ce
dernier cas les eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium sont geacuteneacuteralement utiliseacutes La
vitesse deacutechange des hydrogegravenes damide dun squelette polypeptidique deacutepend de
l‟accessibiliteacute au solvant mais eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale Ainsi les
hydrogegravenes d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine telles
que les boucles et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses
d‟eacutechange rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au
contraire ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices
α et les feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent
plus lentement car ils sont proteacutegeacutes La mesure des vitesses deacutechange permet donc de sonder
localement la structure dune proteacuteine ou dun complexe L‟avantage majeur de cette approche
est qu‟elle ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas
toujours le cas avec des marquages covalents De plus elle permet de sinteacuteresser agrave des
complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire En revanche le fait que le marquage soit labile
impose des conditions expeacuterimentales strictes agrave respecter pour eacuteviter le deacutemarquage et
davantage de contraintes au niveau de la rapiditeacute de l‟analyse Malgreacute ces limitations
l‟association des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium et de la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode largement employeacutee pour l‟eacutetude structurale et
dynamique des proteacuteines et complexes proteacuteiques
L‟analyse par spectromeacutetrie de masse des proteacuteines marqueacutees au deuteacuterium est
classiquement reacutealiseacutee par une approche laquo bottom-up raquo Cette derniegravere consiste agrave analyser des
peptides obtenus par digestion enzymatique de la proteacuteine dinteacuterecirct Chaque hydrogegravene
remplaceacute par un deuteacuterium conduit agrave un increacutement en masse de 1 Da facilement deacutetectable par
spectromeacutetrie de masse Pour chaque peptide une cineacutetique d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
peut donc ecirctre obtenue Si cette approche a montreacute tout son inteacuterecirct mecircme pour des systegravemes
tregraves grands l‟inconveacutenient majeur en est la reacutesolution qui est limiteacutee par la taille des peptides
geacuteneacutereacutes (en moyenne 5-10 acides amineacutes) Une alternative qui sest deacuteveloppeacutee ces derniegraveres
anneacutees est celle qui consiste agrave introduire la proteacuteine intacte en phase gazeuse (approche laquo top-
down raquo) et agrave la fragmenter par capture ou transfert dun eacutelectron En effet contrairement aux
approches de fragmentation classiques par CID (laquo Collision Induced Dissociation raquo) qui
conduisent agrave une redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums dans la seacutequence ces approches ECD
5
ou ETD permettent de localiser les deuteacuteriums dans la seacutequence avec une reacutesolution qui peut
ecirctre agrave lacide amineacute
Ce travail de thegravese sinscrit dans cette theacutematique de deacuteveloppement dapproches top-down
apregraves eacutechanges HD pour lanalyse de complexes proteacuteiques Les systegravemes biologiques sur
lesquels nous avons choisi de travailler sont les complexes dinitiation de la traduction et ce
travail est meneacute en collaboration avec le laboratoire de Biochimie de lEacutecole Polytechnique
(E Schmitt et Y Meacutechulam) Il a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de M Duchateau (soutenue en
feacutevrier 2010)
Cette thegravese comporte quatre grands chapitres
Le premier est un chapitre bibliographique Il comprend des geacuteneacuteraliteacutes sur la structure des
proteacuteines les meacutethodes physico-chimiques classiquement utiliseacutees en biologie structurale et
fait eacutegalement le point sur les diffeacuterentes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de masse
permettant dobtenir des informations structurales sur des proteacuteines ou des complexes
proteacuteiques Le principe des eacutechanges HD et leur analyse par spectromeacutetrie de masse incluant
les derniers deacuteveloppements dans le domaine fait lobjet de la fin de ce chapitre
Le chapitre II est consacreacute agrave leacutetude de peptides modegraveles qui peuvent ecirctre seacutelectivement
marqueacutes au deuteacuterium Ces peptides ont eacuteteacute utiliseacutes comme sonde (i) du deacutemarquage (D H)
qui peut avoir lieu agrave diffeacuterents endroits du spectromegravetre de masse et (ii) du reacutearrangement
aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes dans la seacutequence polypeptidique lors dexpeacuteriences
de spectromeacutetrie de masse en tandem Lobjectif de ces eacutetudes eacutetait de mettre au point une
approche robuste par ECD ou ETD pour lanalyse de peptides deuteacutereacutes en vue de lappliquer agrave
des proteacuteines
Dans le chapitre III sont regroupeacutes les reacutesultats obtenus pour lanalyse du complexe aIF2 et
notamment toute la mise au point de lapproche top-down HDX sur une des sous-uniteacutes de ce
complexe Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave la fois en ECD sur diffeacuterents spectromegravetres de masse
FT-ICR et en ETD sur un instrument de type Orbitrap installeacute sur la plateforme proteacuteomique
de Paris Diderot dirigeacutee par J-M Camadro Ce chapitre montre toute la difficulteacute quil peut y
avoir pour rendre lapproche robuste et reproductible notamment pour des eacutechantillons reacuteels
pour lesquels de nouvelles contraintes apparaissent (quantiteacute disponible dessalage
stabiliteacute)
Sur la base des reacutesultats obtenus dans le chapitre III il nous est apparu eacutevident quun
problegraveme majeur de reproductibiliteacute eacutetait lieacute agrave leacutetape dintroduction des eacutechantillons deuteacutereacutes
dans le spectromegravetre de masse Nous avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme
complegravetement diffeacuterent de tout ce qui avait eacuteteacute deacuteveloppeacute jusquagrave preacutesent baseacute sur lutilisation
6
dune enceinte isoleacutee qui peut ecirctre maintenue agrave -30degC La mise au point de ce montage
expeacuterimental que nous avons appeleacute cryosource fait lobjet du quatriegraveme chapitre de ce
manuscrit Les diffeacuterentes modifications ayant conduit agrave la version finale de cette cryosource
les difficulteacutes rencontreacutees et la maniegravere donc nous les avons reacutesolues et les performances que
lon peut atteindre sur des peptides ou des proteacuteines sont deacutecrites dans ce chapitre
Le manuscrit se termine par une conclusion geacuteneacuterale et les perspectives lieacutees agrave ce travail et
une annexe deacutecrivant les mateacuteriels et meacutethodes
7
Chapitre I Introduction
8
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10
I112 Structure secondaire 12
I113 Structure tertiaire 15
I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19
I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24
I1221 Diffusion aux petits angles 24
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24
I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27
I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43
I2133 Catalyse de la reacuteaction 46
I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines 47
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49 I221 Marquage continu 50
I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD60
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60
I2332 Approches top-down et HDX 62
I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
9
I1 Analyse de complexes proteacuteiques
Les proteacuteines sont des composants essentiels de la cellule En effet elles assurent
l‟immense majoriteacute des fonctions cellulaires responsables de la vie Les proteacuteines sont
responsables de la catalyse enzymatique du transport des moleacutecules de la deacutefense de l‟hocircte
de la conversion eacutenergeacutetique ainsi que de beaucoup d‟autres processus cellulaires essentiels
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules biologiques de haut poids moleacuteculaire qui
comportent diffeacuterents niveaux de structuration allant de leur seacutequence en acides amineacutes agrave leur
structure tridimensionnelle au sein de complexes proteacuteiques La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine est intimement lieacutee agrave sa fonction Toute l‟information requise pour qu‟une
proteacuteine adopte une conformation native particuliegravere est contenue dans sa seacutequence en acides
amineacutes (1) Les multiples conformations que sont capables d‟adopter les proteacuteines leur
permettent de remplir la varieacuteteacute de tacircches qui leur incombent mais en font des systegravemes
complexes agrave analyser
Cependant aussi puissantes que les proteacuteines puissent ecirctre individuellement leur veacuteritable
pouvoir et leur complexiteacute deacutecoulent des interactions qu‟elles entretiennent avec d‟autres
moleacutecules Beaucoup d‟entre elles ne remplissent leur fonction que si elles sont lieacutees agrave des
ligands tels que des ions meacutetalliques des groupes prostheacutetiques ou agrave d‟autres proteacuteines (2) En
effet un grand nombre de pheacutenomegravenes biologiques implique l‟activiteacute de plusieurs proteacuteines
agrave travers la formation de complexes multi-proteacuteiques Ainsi la compreacutehension des processus
cellulaires au niveau atomique passe par la deacutetermination de la structure tridimensionnelle de
ces complexes
I11 Structure des proteacuteines
L‟analyse de la structure tridimensionnelle revient agrave deacutecrire la position relative des
diffeacuterents atomes constituant une proteacuteine donneacutee De la seacutequence de la proteacuteine agrave la
formation de complexes oligomeacuteriques il existe quatre niveaux de structuration de la
proteacuteine
10
I111 Structure primaire
Les proteacuteines sont des assemblages d‟acides amineacutes (nombre supeacuterieur agrave 50) lieacutes entre eux
par des liaisons peptidiques Il existe vingt acides amineacutes naturels reacutepondant tous agrave la mecircme
structure geacuteneacuterale (Fig I 1) Ce sont des moleacutecules organiques formeacutees d‟un atome de
carbone central (alpha) auquel sont lieacutes un atome d‟hydrogegravene un radical R appeleacute aussi
chaicircne lateacuterale (R repreacutesente un groupement fonctionnel et correspond agrave la portion variable
d‟un acide amineacute agrave l‟autre) ainsi que deux groupements terminaux conserveacutes une amine et un
acide carboxylique
Fig I 1 Structure geacuteneacuterale des acides amineacutes Agrave pH physiologique les groupements
terminaux -NH2 et -COOH sont retrouveacutes respectivement sous la forme -NH3+ et -COO
-
Les acides amineacutes peuvent ecirctre distingueacutes suivant les proprieacuteteacutes physico-chimiques de leur
chaicircne lateacuterale (Fig I 2) Un premier groupe est formeacute par les acides amineacutes preacutesentant des
chaicircnes lateacuterales aliphatiques tels que la glycine (Gly G)1 l‟alanine (Ala A) la valine (Val
V) la leucine (Leu L) l‟isoleucine (Ile I) et la proline (Pro P) Ces acides amineacutes sont
apolaires On peut classer dans une seconde cateacutegorie ceux qui sont aromatiques
pheacutenylalanine (Phe F) tyrosine (Tyr Y) et tryptophane (Trp W) On distingue eacutegalement les
acides amineacutes basiques (lysine [Lys K] arginine [Arg R] histidine [His H]) et acides (acide
aspartique [Asp D] acide glutamique [Glu E]) L‟asparagine (Asn N) et la glutamine [Gln
Q] sont deux acides amineacutes polaires non ionisables Les deux derniers groupes sont constitueacutes
des acides amineacutes hydroxyleacutes (seacuterine [Ser S] threacuteonine [Thr R]) et ceux qui contiennent du
soufre (cysteacuteine [Cys C] meacutethionine [Met M]) Chacun des vingt acides amineacutes possegravede
donc une chaicircne lateacuterale avec une fonction chimique qui lui est propre L‟existence
simultaneacutee d‟une grande diversiteacute de fonctions chimiques est en partie agrave l‟origine de la
1 Les abreacuteviations entre parenthegraveses correspondent agrave la nomenclature en trois lettres et en une lettre des acides
amineacutes Elles seront utiliseacutees dans la suite de ce manuscrit
11
multitude de fonctions biochimiques que peuvent remplir les proteacuteines dans le monde du
vivant
Fig I 2 Tableau des vingt acides amineacutes naturels Ils peuvent ecirctre apolaires (hydrophobes) et
dans ce cas ils sont retrouveacutes le plus souvent au cœur des proteacuteines ou au contraire polaires
(hydrophiles) et localiseacutes geacuteneacuteralement agrave leur surface Parmi ces derniers certains sont acides
dautre basiques dautres encore sont neutres
Les acides amineacutes peuvent se lier entre eux de maniegravere covalente par la formation d‟une
liaison amide appeleacutee aussi liaison peptidique Elle s‟eacutetablit entre le groupement acide (-
COOH) dun acide amineacute et le groupement amine (-NH2) d‟un autre et permet la formation
12
d‟un dipeptide Au cours de la reacuteaction de condensation une moleacutecule deau est eacutelimineacutee Les
polymegraveres comprenant un plus grand nombre d‟acides amineacutes (de 10 agrave 100) sont nommeacutes
polypeptides Ces derniers servent dans la synthegravese des proteacuteines qui sont de longues chaicircnes
polypeptidiques
La structure primaire d‟une proteacuteine est donneacutee par la seacutequence lineacuteaire des acides amineacutes
la constituant Elle est orienteacutee Le premier acide amineacute de la seacutequence est par convention
celui qui possegravede une extreacutemiteacute amine libre on parle dextreacutemiteacute N-terminale De maniegravere
symeacutetrique le dernier acide amineacute est celui qui possegravede une extreacutemiteacute carboxyle libre on
parle d‟extreacutemiteacute C-terminale Cette convention correspond eacutegalement agrave l‟ordre de la synthegravese
de la proteacuteine par les ribosomes Par exemple la description AGSLK correspond agrave
l‟enchaicircnement des acides amineacutes alanine-glycine-seacuterine-leucine-lysine
Cependant une proteacuteine ne peut ecirctre simplement deacutecrite par une structure primaire
lineacuteaire En effet ses proprieacuteteacutes deacutecoulent eacutegalement de sa capaciteacute agrave former des structures
plus eacutelaboreacutees
I112 Structure secondaire
La structure secondaire d‟une proteacuteine correspond au repliement local de sa chaicircne
principale2 Il s‟eacutetablit alors des liaisons hydrogegravenes entre des acides amineacutes qui sont
relativement proches dans sa seacutequence primaire donnant naissance agrave des motifs structuraux
particuliers Lexistence de structures secondaires est due au fait que les repliements
eacutenergeacutetiquement favorables de la chaicircne peptidique sont en nombres limiteacutes et que seules
certaines conformations sont possibles Ainsi une proteacuteine se deacutecrit par sa seacutequence dacides
amineacutes mais aussi par l‟enchaicircnement de ses eacuteleacutements de structure secondaire
En d‟autres termes certaines conformations se trouvent nettement favoriseacutees car
particuliegraverement stabiliseacutees par des liaisons hydrogegravene entre les groupements amide (-NH) et
carbonyle (CO) du squelette peptidique Il existe trois principaux types de structures
secondaires selon le repliement des liaisons peptidiques et l‟eacutetablissement de ponts hydrogegravene
entre les acides amineacutes les heacutelices les feuillets et les coudes
2 La chaicircne principale dune proteacuteine correspond aux atomes impliqueacutes dans la structure de base du polypeptide
(-NH-CαH-CO-) Les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (souvent noteacutees -R) nappartiennent donc pas au
squelette carboneacute
13
L‟heacutelice est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine adopte
un repliement heacutelicoiumldal peacuteriodique L‟heacutelice est dite laquo droite raquo quand elle tourne dans le sens
horaire Il s‟agit du cas rencontreacute le plus freacutequent A linverse lorsquune heacutelice tourne dans le
sens anti-horaire elle est dite laquo gauche raquo Lheacutelice droite de type alpha est un motif structural
tregraves retrouveacute au sein des proteacuteines (Fig I 3) L‟heacutelice α est une structure tregraves stable
caracteacuteriseacutee par la formation de liaisons hydrogegravene entre le groupement carbonyle dun reacutesidu
n et le groupement amide dun reacutesidu n+4 Un tour dheacutelice α moyen est constitueacute de 36
acides amineacutes Dans une heacutelice α les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes sont localiseacutees en
peacuteripheacuterie de lheacutelice et pointent vers lexteacuterieur perpendiculairement agrave l‟axe de la spirale La
structure compacte eacutenergeacutetiquement favorable de lheacutelice α a eacuteteacute preacutedite par Linus Pauling et
Robert Corey en 1951 (3) agrave partir de calculs theacuteoriques Elle a ensuite eacuteteacute observeacutee pour la
premiegravere fois en 1958 dans la myoglobine en huit exemplaires impliquant environ 75 des
acides amineacutes de la proteacuteine La structure tridimensionnelle de cette derniegravere fut la premiegravere
eacutelucideacutee par cristallographie des proteacuteines (4)
Fig I 3 Scheacutema de l‟heacutelice droite de type α tregraves reacutepandue dans le repliement des proteacuteines
Le pas de l‟heacutelice est de 54 Aring (5)
Le feuillet becircta est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine
adopte un repliement eacutetendu peacuteriodique Le feuillet β est composeacute de plusieurs brins β qui
eacutetablissent des liaisons hydrogegravene entre eux afin de stabiliser la structure De ce fait les ponts
hydrogegravenes qui le stabilisent se font entre reacutesidus distants plutocirct quentre reacutesidus conseacutecutifs
comme c‟est le cas dans une heacutelice α Dans un feuillet β les chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes sont situeacutees alternativement en dessus et en dessous du plan du feuillet Le repliement
β est favoriseacute par des acides amineacutes portant des petits groupements lateacuteraux laquoRraquo non chargeacutes
De la mecircme maniegravere que pour la structure de lheacutelice α la structure du feuillet β a eacuteteacute preacutedite
14
par Pauling et Corey en 1951 (6) Les feuillets β sont repreacutesenteacutes par des flegraveches (Fig I 4)
correspondant aux chaicircnes polypeptidiques qui les constituent Ces derniegraveres sont plisseacutees et
peuvent ecirctre aligneacutees de maniegravere parallegravele et dans ce cas elles ont la mecircme orientation ou de
maniegravere antiparallegravele avec des orientations opposeacutees Le sens est deacutetermineacute par la polariteacute des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes Lorsque deux brins β sorganisent de maniegravere
antiparallegravele les groupements -NH et -CO dun reacutesidu i du premier brin forment des liaisons
hydrogegravene avec les groupements -CO et -NH dun reacutesidu j appartenant au second
Typiquement deux brins β conseacutecutifs relieacutes par un coude forment un feuillet β antiparallegravele
Lorsque deux brins β sont orienteacutes dans le mecircme sens ils s‟organisent en un feuillet parallegravele
Les groupements -NH et -CO dun reacutesidu dun brin A forment alors des liaisons hydrogegravene
avec les groupements -CO dun premier reacutesidu et -NH d‟un second reacutesidu appartenant tous les
deux agrave un brin B Le feuillet β antiparallegravele est plus stable que le feuillet parallegravele car les ponts
hydrogegravene sont dans un alignement parfait
Fig I 4 Scheacutema du feuillet β anti-parallegravele qui est la juxtaposition de brins β ayant des
orientations opposeacutees (5)
Les coudes ne sont pas des structures reacuteguliegraveres et peacuteriodiques Il sagit plutocirct dun
repliement particulier de la chaicircne principale localiseacute sur trois ou quatre reacutesidus conseacutecutifs
Les coudes permettent bien souvent de relier deux structures secondaires peacuteriodiques telles
que les heacutelices etou les brins
15
Les heacutelices α les feuillets β et les coudes ne sont pas les seuls motifs structuraux
secondaires mais sont ceux qui sont le plus freacutequemment rencontreacutes Il existe une grande
varieacuteteacute de motifs moins courants qui ne seront pas deacutetailleacutes dans ce manuscrit
I113 Structure tertiaire
La structure tertiaire d‟une proteacuteine correspond agrave sa structure tridimensionnelle
d‟ensemble Il s‟agit de la structure finale adopteacutee par une proteacuteine apregraves le repliement dans
l‟espace des heacutelices α feuillets β et autres eacuteleacutements de la structure secondaire
Bien que la plupart des proteacuteines neacuteosyntheacutetiseacutees aient la capaciteacute de se replier
correctement certaines en sont incapables sans l‟intervention de proteacuteines dicirctes chaperonnes
Une proteacuteine chaperonne est donc une proteacuteine particuliegravere dont une des fonctions est
dassister dautres proteacuteines dans leur maturation en leur assurant un repliement
tridimensionnel adeacutequat Le repliement dans l‟espace des chaicircnes polypeptidiques est un
processus co-traductionnel (7) Les proteacuteines chaperonnes ont eacuteteacute co-deacutecouvertes en 1989 par
Arthur L Horwich et Franz-Ulrich Hartl (8-9)
La structure tertiaire donne une forme particuliegravere agrave la proteacuteine la rendant ainsi
fonctionnelle Pour cela elle faccedilonne la surface des proteacuteines de maniegravere complexe leur
permettant d‟interagir speacutecifiquement avec des ligands ou d‟autres macromoleacutecules comme
des proteacuteines partenaires (10) La structure tridimensionnelle est thermodynamiquement
stable dans un domaine restreint de tempeacuterature pH et force ionique Au-delagrave de ce domaine
une proteacuteine peut se deacuteplier et perdre son activiteacute biologique on dit alors qu‟elle est
deacutenatureacutee A l‟inteacuterieur des cellules ce sont les proteacuteines chaperonnes qui interviennent Elles
preacuteviennent les dommages potentiels causeacutes par de telles variations des conditions physico-
chimiques et regraveglent la perte de fonction due au mauvais repliement tridimensionnel pouvant
conduire agrave une varieacuteteacute de pathologies telles que la maladie d‟Alzheimer ou les maladies agrave
prion (11) L‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines est donc un eacuteleacutement cleacute
dans la compreacutehension de leurs fonctions biochimiques Son importance est aussi retrouveacutee
dans l‟industrie biopharmaceutique notamment dans le controcircle de la conception de proteacuteines
pharmaceutiques Il faut noter par ailleurs que la structure tridimensionnelle d‟une proteacuteine
en solution n‟est pas totalement rigide mais dynamique (12-13) En effet la chaicircne
polypeptidique subit des mouvements thermiques et est susceptible de se deacuteformer lors
16
d‟interactions avec d‟autres moleacutecules Ces fluctuations de conformations sont souvent
consideacutereacutees comme une condition preacutealable agrave la fonction biologique (14-15)
Cette organisation structurale dans l‟espace est obtenue et rendue possible gracircce agrave
diffeacuterents types dinteractions qui la stabilisent Ces interactions plus ou moins fortes sont
eacutetablies entre les radicaux de diffeacuterents acides amineacutes geacuteneacuteralement eacuteloigneacutes dans la structure
primaire La chaicircne principale de la proteacuteine aura donc tendance agrave se replier sur elle-mecircme
pour adopter une structure tridimensionnelle preacutecise Parmi les interactions les plus notables
sont retrouveacutees les interactions covalentes non covalentes ainsi que les interactions
hydrophobes
Les interactions covalentes eacutetablissent des liaisons fortes entre deux acides amineacutes qui
peuvent ecirctre tregraves proches dans la structure tertiaire mais tregraves eacuteloigneacutes dans la structure
primaire de la proteacuteine De ce fait la formation de cette liaison conduit agrave une stabilisation
accrue de la structure tertiaire Dans le cas des proteacuteines il s‟agit principalement de la
creacuteation d‟un pont disulfure par une reacuteaction d‟oxydation se deacuteroulant entre les fonctions
thiols de deux cysteacuteines Les interactions non covalentes regroupent quant agrave elles les liaisons
eacutelectrostatiques les liaisons hydrogegravene et les liaisons de van der Waals Elles se distinguent
par leur geacuteomeacutetrie leur longueur et leur speacutecificiteacute Elles sont affecteacutees de diffeacuterentes faccedilons
par la preacutesence d‟eau
Les liaisons eacutelectrostatiques peuvent s‟eacutetablir entre deux groupements portant une charge
nette positive ou neacutegative Cette interaction peut conduire agrave un effet reacutepulsif (charges de signe
identique) ou attractif (charges opposeacutees) Une interaction entre deux groupes de charge
opposeacutee est eacutegalement appeleacutee liaison ionique liaison saline pont salin ou paire d‟ions Il
s‟agit de l‟interaction la plus forte parmi les interactions non covalentes Elle est plus forte
dans le vide et plus faible dans un milieu tel que l‟eau
Les liaisons hydrogegravene peuvent ecirctre formeacutees aussi bien entre des moleacutecules non chargeacutees
que des moleacutecules chargeacutees Elle correspond agrave une liaison entre deux atomes eacutelectroneacutegatifs
assureacutee par un atome d‟hydrogegravene partageacute entre les deux L‟atome auquel l‟hydrogegravene est le
plus fermement lieacute est le donneur d‟hydrogegravene tandis que l‟autre est l‟accepteur d‟hydrogegravene
Avec des eacutenergies de liaison de l‟ordre de 3 agrave 7 kcalmol les liaisons hydrogegravene sont plus
fortes que celles de van der Waals Les liaisons hydrogegravene sont directionnelles Les plus
fortes sont celles dans lesquelles le donneur l‟hydrogegravene et l‟accepteur sont colineacuteaires
17
Les liaisons de van der Waals force attractive non speacutecifique entrent en jeu lorsque deux
atomes sont distants de 3 agrave 4 Aring Elle est due au fait que la distribution de la charge
eacutelectronique autour d‟un atome varie dans le temps A un instant donneacute la distribution de la
charge n‟est pas parfaitement symeacutetrique Cette asymeacutetrie transitoire de la charge eacutelectronique
autour d‟un atome induit une asymeacutetrie semblable dans la distribution eacutelectronique des
atomes voisins non lieacutes Ceci conduit donc agrave des interactions de type dipocircle-dipocircle induit
L‟eacutenergie des interactions de van der Waals est faible avec une eacutenergie de stabilisation de
l‟ordre de 06 kcalmol Comme pour les liaisons hydrogegravene le nombre de ces interactions au
sein d‟une proteacuteine peut ecirctre tregraves eacuteleveacute La somme de l‟eacutenergie mise en jeu est alors
substantielle A titre d‟exemple dans le cytochrome C de cheval et dans la myoglobine de
cachalot les interactions de van der Waals agrave l‟inteacuterieur de la proteacuteine contribuent pour
l‟essentiel agrave la stabiliteacute de la structure
Dans une solution aqueuse une moleacutecule apolaire tend agrave interagir avec d‟autres moleacutecules
apolaires plutocirct que de s‟entourer de moleacutecules d‟eau On nomme cette proprieacuteteacute
hydrophobiciteacute et cela conduit agrave des interactions entre moleacutecules qu‟on appelle des
interactions hydrophobes Ces derniegraveres engendrent dans le cas des proteacuteines un
regroupement des reacutesidus apolaires geacuteneacuteralement vers le centre formant un cœur hydrophobe
ou encore au niveau d‟autres reacutegions hydrophobes de la cellule comme dans les membranes
lipidiques Les interactions hydrophobes constituent une force essentielle dans le repliement
des proteacuteines
I114 Structure quaternaire
La structure quaternaire d‟une proteacuteine est donneacutee par l‟association des diffeacuterentes chaicircnes
polypeptidiques la constituant Elles peuvent ecirctre identiques ou diffeacuterentes et sont relieacutees par
des liaisons non covalentes (liaisons hydrogegravene liaisons ioniques interactions hydrophobes)
et plus rarement par des ponts disulfures Leffet hydrophobe est un facteur preacutepondeacuterant dans
lassemblage des eacuteleacutements structuraux y compris dans lassociation des chaicircnes Chacune de
ces chaicircnes est appeleacutee monomegravere (ou sous uniteacute) et lensemble oligomegravere ou proteacuteine
multimeacuterique
18
Seulement certaines proteacuteines preacutesentent une telle organisation Lheacutemoglobine est un
exemple de proteacuteine posseacutedant une structure quaternaire Elle est constitueacutee de quatre sous-
uniteacutes deux sous-uniteacutes α (de 141 acides amineacutes) et deux sous-uniteacutes β (de 146 acides
amineacutes)
Ces assemblages polypeptidiques peuvent ecirctre parfaitement bien deacutefinis mais certains
peuvent former des complexes multiproteacuteiques uniquement transitoires tout en eacutetant
fonctionnellement importants En effet dans l‟environnement cellulaire les proteacuteines sont
rarement isoleacutees et les interactions qu‟elles peuvent creacuteer avec d‟autres partenaires sont
essentielles agrave leur fonction Dans d‟autres cas comme dans les macroassemblages amyloiumldes
la formation d‟un complexe entre des proteacuteines peut conduire agrave la formation d‟assemblages
potentiellement pathogegravenes (16) L‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
macroassemblages est donc primordiale agrave la compreacutehension de leur fonctionnement et
dysfonctionnement
~
Nous venons de mettre en eacutevidence l‟importance de l‟eacutetude structurale des proteacuteines ainsi
que sa complexiteacute qui en font un veacuteritable deacutefi analytique La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine donneacutee n‟est pas neacutecessairement unique elle peut fluctuer temporellement ou
deacutependre des autres moleacutecules (proteacuteines ou ligands) avec lesquelles la proteacuteine interagit dans
l‟environnement cellulaire Il existe un grand nombre de techniques physico-chimiques
biophysiques ou biochimiques permettant d‟obtenir des informations structurales sur des
proteacuteines et des complexes proteacuteiques Les approches les plus couramment employeacutees pour
identifier et caracteacuteriser des interactions proteacuteine-proteacuteine combinent des meacutethodes
biochimiques et biophysiques
Parmi ces techniques deux meacutethodes physico-chimiques sont couramment utiliseacutees pour
l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines Il s‟agit de la cristallographie et de la
reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire (RMN) En ce qui concerne l‟analyse des complexes
proteacuteiques qui sont geacuteneacuteralement des eacutedifices macromoleacuteculaires bien plus importants ces
derniegraveres anneacutees ont vu le deacuteveloppement de meacutethodes alternatives telles que la cryo-
microscopie eacutelectronique la diffraction de rayons X ou de neutrons aux petits angles ou
encore diffeacuterentes techniques baseacutees sur l‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse Il est aussi
possible d‟aborder la composition des complexes proteacuteiques par des meacutethodes biochimiques
parmi lesquelles le TAP-Tag et le double hybride occupent une place de choix
19
Les paragraphes suivants seront consacreacutes agrave une description des grandes meacutethodes
d‟analyse physico-chimique et biochimique utilisables pour appreacutehender la structure des
proteacuteines mais surtout celle des complexes proteacuteiques
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique
I121 Meacutethodes classiques pour lrsquoeacutetude de la structure tridimensionnelle des
proteacuteines
I1211 Cristallographie des proteacuteines
La cristallographie est la science qui eacutetudie les systegravemes cristallins agrave leacutechelle atomique
Les macromoleacutecules dont font partie les proteacuteines sont geacuteneacuteralement trop petites pour ecirctre
observeacutees directement par microscopie optique En effet leur taille nest pas suffisante pour
diffracter la lumiegravere dans les longueurs d‟onde du domaine visible du spectre
eacutelectromagneacutetique En revanche les distances interatomiques au sein des proteacuteines (environ
15 Aring) sont du mecircme ordre de grandeur que la longueur d‟onde des rayons X Par conseacutequent
la diffraction des rayons X par les atomes d‟une proteacuteine peut quant agrave elle ecirctre envisageacutee
Dans un cristal reacutegulier les proteacuteines forment un arrangement peacuteriodique suivant des axes de
l‟espace tridimensionnel de mailles eacuteleacutementaires deacutefinies comme eacutetant le plus petit eacuteleacutement
repreacutesentant le cristal entier Des translations suivant les axes d‟une maille eacuteleacutementaire
permettent de reconstituer l‟ensemble du cristal
Chaque atome d‟une proteacuteine a donc exactement la mecircme position dans toutes les mailles
Le cristal est ainsi composeacute de plans d‟atomes Ces plans d‟atomes ou plutocirct les nuages
d‟eacutelectrons correspondants produisent un motif de diffraction lors de l‟irradiation du cristal
aux rayons X (17) Le motif de diffraction contient les informations sur la position de tous les
atomes de la maille Par conseacutequent il est possible par l‟analyse de ce motif de calculer les
angles de diffraction ainsi que les distances interatomiques pour reconstituer la structure
moleacuteculaire
La haute reacutesolution reste le principal avantage de cette technique Malgreacute des donneacutees
relativement complexes agrave analyser la diffraction des rayons X donne des informations tregraves
preacutecises sur la structure moleacuteculaire des proteacuteines souvent agrave une reacutesolution atomique
20
infeacuterieure ou eacutegale agrave 12 Aring (18) A des reacutesolutions encore plus eacuteleveacutees ie infeacuterieures ou
eacutegales agrave 08 Aring les atomes d‟hydrogegravene deviennent visibles et les atomes ne peuvent plus ecirctre
consideacutereacutes comme des sphegraveres en raison de la deacuteformation des nuages eacutelectroniques Une telle
visualisation des eacutelectrons permet de deacuteterminer la distribution des charges et la polarisation
des liaisons (19) Une image tregraves deacutetailleacutee de la structure de la proteacuteine est alors obtenue
Toutefois la technique preacutesente des limites La principale difficulteacute lieacutee agrave la meacutethode reste
l‟obtention de cristaux avec des tailles suffisantes Il est indispensable de disposer de
plusieurs cristaux identiques car ils sont souvent deacutegradeacutes en preacutesence des rayons X (par
chauffage ou par des radicaux libres) Pour faire pousser des cristaux il est neacutecessaire de
produire une proteacuteine extrecircmement pure Il est eacutegalement indispensable d‟exprimer des
quantiteacutes importantes de proteacuteine afin de trouver les conditions optimales de cristallisation
Ces derniegraveres eacutetant proteacuteines deacutependantes il est impeacuteratif d‟en tester un grand nombre Les
cristaux peuvent se former rapidement ou au contraire apparaicirctre apregraves un temps
consideacuterablement long Parfois mecircme il est malheureusement impossible d‟en obtenir Les
chaicircnes polypeptidiques partiellement replieacutees telles que le prion sont un exemple probant de
proteacuteines difficilement cristallisables (20) De plus si des cristaux sont finalement obtenus
alors les segments peptidiques qui sont non structureacutes en solution apparaicirctront soit ordonneacutes
par des liaisons intermoleacuteculaires au sein du systegraveme cristallin ou n‟apparaicirctront pas Par
conseacutequent il est important de deacutevelopper une meacutethode alternative permettant d‟eacutetudier la
structure de proteacuteines partiellement replieacutees ou mecircme deacutesordonneacutees
Par deacutefinition l‟eacutetude cristallographique est baseacutee sur des structures statiques (les cristaux)
de l‟eacutetat le plus stable Il est donc peu probable que cette technique renseigne sur la
dynamique des moleacutecules Si la proteacuteine cristalliseacutee preacutesente une dynamique sans mouvement
agrave grande eacutechelle alors des eacuteveacutenements dynamiques peuvent ecirctre caracteacuteriseacutes En revanche les
mouvements agrave grande eacutechelle sont quasiment toujours bloqueacutes dans le cristal D‟importants
deacuteveloppements technologiques ont eacuteteacute apporteacutes agrave la technique pour ameacuteliorer l‟observation
de la dynamique agrave courte eacutechelle Il s‟agit de la cryo-cristallographie (21-23) ou des meacutethodes
de cristallographie en temps reacutesolu (24-26)
L‟avegravenement du synchrotron a consideacuterablement acceacuteleacutereacute la vitesse d‟acquisition des
donneacutees En effet celle-ci a eacuteteacute reacuteduite de quelques semaines agrave quelques heures gracircce agrave la
production d‟un rayonnement X intense stable de longueur d‟onde variable et de grande
21
qualiteacute optique Actuellement la plupart des donneacutees de cristallographie sont collecteacutees agrave
partir d‟un synchrotron
La diffraction des rayons X est eacutegalement un outil de choix pour l‟eacutetude de complexes
proteacuteiques permettant d‟obtenir des informations structurales de tregraves grande qualiteacute mecircme
pour des systegravemes tregraves complexes (27) ou membranaires (28-29)
I1212 Spectroscopie RMN
La spectroscopie RMN est eacutegalement devenue une meacutethode performante pour l‟eacutetude de la
conformation des proteacuteines Deacuteveloppeacutee en 1945 elle n‟a cesseacute d‟ecirctre ameacutelioreacutee depuis sa
mise au point En raison de l‟impact scientifique exceptionnel qu‟elle a eu au fil des anneacutees
elle a eacuteteacute reacutecompenseacutee par quatre prix Nobel Le dernier en date (2002) a eacuteteacute deacutecerneacute au
Professeur Kurt Wuumlthrich pour ses deacuteveloppements porteacutes agrave la RMN qui ont permis
l‟eacutelucidation de la structure tridimensionnelle des macromoleacutecules biologiques en solution
Plus particuliegraverement il a eacuteteacute primeacute pour son eacutetude structurale de la proteacuteine prion
partiellement replieacutee (30)
Technique d‟analyse chimique et structurale non destructive elle est baseacutee sur l‟absorption
de la radiation agrave une radio freacutequence par des noyaux atomiques Les niveaux d‟eacutenergie de spin
des noyaux sont seacutepareacutes dans un champ magneacutetique (effet Zeeman) Sous l‟effet d‟une radio
freacutequence chaque noyau de la moleacutecule va reacutesonner agrave sa freacutequence speacutecifique (freacutequence de
Larmor) Chaque noyau de la proteacuteine a donc sa propre freacutequence de Larmor qui deacutepend de
l‟environnement local du noyau (par exemple protection par des champs magneacutetiques locaux)
Un spectre RMN contient ainsi des pics correspondants aux reacutesonances de tous les noyaux de
l‟eacutechantillon chacun avec une freacutequence (caracteacuteriseacutee par le deacuteplacement chimique δ)
caracteacuteristique de son environnement chimique De plus la surface sous un pic est
proportionnelle au nombre des noyaux reacutesonnant agrave cette freacutequence ce qui permet de
quantifier les reacutesidus identifieacutes et caracteacuteriseacutes
Un facteur tregraves important permettant la deacutetermination de la structure des proteacuteines est la
correacutelation entre des noyaux d‟une moleacutecule La perturbation locale des nuages d‟eacutelectrons
par le spin des noyaux conduit agrave un couplage scalaire entre des noyaux qui sont lieacutes de faccedilon
covalente avec un maximum de quatre liaisons entre eux L‟origine de ce couplage est le
22
changement des niveaux d‟eacutenergie des eacutetats de spin des noyaux en question pour conduire agrave
des nouveaux niveaux d‟eacutenergie en fonction de l‟alignement des spins des noyaux (parallegravele
ou anti-parallegravele) Le nombre et la nature des noyaux voisins produit des motifs et des
constantes de couplage speacutecifiques qui permettent d‟attribuer une structure covalente Dans
les proteacuteines chaque chaicircne lateacuterale d‟un acide amineacute preacutesente un motif de couplage scalaire
caracteacuteristique Il est alors aiseacute d‟attribuer les signaux RMN agrave la structure d‟une proteacuteine
L‟eacutetude d‟une proteacuteine peut ecirctre reacutealiseacutee par RMN homonucleacuteaire ou heacuteteacuteronucleacuteaire Les
noyaux protons sont alors observeacutes respectivement seuls ou avec les noyaux carbones etou
azotes Les expeacuteriences RMN permettent l‟observation des couplages scalaires et dipolaires
entre spins Le transfert d‟aimantation par couplage dipolaire produit des effets Overhauser
nucleacuteaires (nOe) entre noyaux situeacutes agrave moins de 5 Aring l‟un de l‟autre La mise en eacutevidence de
ces pheacutenomegravenes permet l‟estimation des distances entre les noyaux consideacutereacutes Cependant la
RMN homonucleacuteaire preacutesente certaines limites pour l‟eacutetude des proteacuteines en solution en
raison du taux de superposition des pics sur les spectres et du mauvais transfert d‟aimantation
entre protons par couplage scalaire Ces inconveacutenients qui rendaient probleacutematique l‟emploi
de la RMN pour l‟eacutetude de proteacuteines de taille supeacuterieure agrave cent acides amineacutes ont eacuteteacute
surmonteacutes par l‟utilisation des proprieacuteteacutes RMN de noyaux autres que le proton En effet des
noyaux diffeacuterents reacutesonnent dans des gammes de freacutequences diffeacuterentes ce qui permet de
reacutesoudre les superpositions de deacuteplacements chimiques De plus les constantes de couplage
heacuteteacuteronucleacuteaires ameacuteliorent la sensibiliteacute du couplage scalaire
Les trois isotopes de spin 12 naturellement preacutesents dans les proteacuteines sont 1H
15N et
13 C
Cependant les faibles abondances naturelles des isotopes 13
C du carbone (11 ) et 15
N de
l‟azote (037 ) ne permettent pas de reacutealiser des expeacuteriences de correacutelation heacuteteacuteronucleacuteaire
les impliquant Par conseacutequent un enrichissement des eacutechantillons proteacuteiques en isotopes 13
C
et 15
N preacutealable agrave l‟analyse en RMN doit ecirctre envisageacute
La preacuteparation d‟eacutechantillons marqueacutes est reacutealiseacutee le plus souvent par clonage
moleacuteculaire et par techniques de surexpression et de purification de proteacuteines La
surexpression des proteacuteines isotopiquement enrichies peut se faire agrave partir d‟une culture en
milieu minimum ou en milieu riche Le milieu minimum est preacutepareacute de faccedilon agrave ne renfermer
qu‟une seule source du noyau dont on veut enrichir la proteacuteine (eg glucose avec 13
C
chlorure d‟ammonium avec 15
N) Les cultures en milieu riche se font en utilisant un milieu
standard enrichi en isotopes Si l‟on souhaite simplement proceacuteder agrave un marquage partiel de la
23
proteacuteine sur certains types de reacutesidus alors on peut utiliser un organisme heacuteteacuterotrophe Ce
dernier incapable de syntheacutetiser certains acides amineacutes devra donc les puiser dans son milieu
de culture Ces organismes sont cultiveacutes dans un milieu contenant les acides amineacutes marqueacutes
que l‟on veut incorporer dans la proteacuteine
Les expeacuteriences de RMN heacuteteacuteronucleacuteaire peuvent ecirctre reacutealiseacutees sur des eacutechantillons
simplement marqueacutes au 15
N ou doublement marqueacutes (15
N 13
C) Dans le cas de proteacuteines
marqueacutees agrave l‟isotope lourd de l‟azote (15
N) des expeacuteriences 2D HSQC ou HMQC
(laquo Heteronuclear Single Multiple Quantum Correlation raquo) peuvent ecirctre meneacutees Elles
permettent d‟observer les pics de correacutelation dus au couplage scalaire entre l‟hydrogegravene
amide et l‟azote de chaque reacutesidu La strateacutegie d‟attribution baseacutee sur le double marquage
utilise quant agrave elle exclusivement les couplages scalaires homo- et heacuteteacuteronucleacuteaires Si l‟on
souhaite augmenter la limite de taille des systegravemes eacutetudieacutes alors en sus du marquage 15
N et
13C on peut remplacer 70 agrave 100 des protons par des deuteacuteriums En effet cela permet de
diminuer la fuite de l‟aimantation due aux interactions dipolaires entre protons La diminution
de la relaxation transverse agrave l‟aide de l‟expeacuterience TROSY (laquo Transverse Relaxation-
Optimized SpectroscopY raquo) permet eacutegalement de repousser cette limite (31) Des expeacuteriences
combinant les deux approches ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees pour l‟analyse de complexes
proteacuteiques de haut poids moleacuteculaire (gt 50 kDa) (32)
Les intermeacutediaires du repliement d‟une proteacuteine peuvent aussi ecirctre caracteacuteriseacutes par
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avec le deuteacuterium de l‟eau lourde Enfin une interpreacutetation
qualitative des deacuteplacements chimiques en fonction de la structure primaire de la moleacutecule
permet la deacutetection des structures secondaires telles que l‟heacutelice α ou le feuillet β
Si l‟avantage majeur de la RMN par rapport agrave la diffraction des rayons X est de permettre
l‟eacutetude de proteacuteines en solution elle preacutesente des limites importantes qui sont d‟une part la
quantiteacute de mateacuteriel neacutecessaire pour reacutealiser les expeacuteriences (des concentrations de l‟ordre du
millimolaire de proteacuteine sont geacuteneacuteralement utiliseacutees et d‟une centaine de micromoles avec
l‟utilisation d‟une cryosonde) mais surtout la taille des systegravemes qui peuvent ecirctre eacutetudieacutes (lt
50 kDa) Il faut par ailleurs noter que dans certains cas des concentrations d‟eacutechantillon tregraves
eacuteleveacutees peuvent induire des perturbations de la structure quaternaire des proteacuteines (agreacutegation
ou preacutecipitation de certaines proteacuteines)
24
I122 Meacutethodes pour lrsquoeacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
assemblages macromoleacuteculaires
I1221 Diffusion aux petits angles
La diffusion aux petits angles des rayons X en solution (laquo Small Angle X-ray Scattering raquo
SAXS) est une technique qui repose sur la diffusion eacutelastique des rayons X par des proteacuteines
et des macro-assemblages dans la gamme 10-1000 Aring (33) Bien qu‟il ne soit pas possible
d‟obtenir une reacutesolution atomique par cette meacutethode elle fournit des informations structurales
preacutecieuses agrave basse reacutesolution (forme globale de la proteacuteine structures tertiaire et quaternaire)
Elle permet donc d‟eacutetudier les changements conformationnels de macromoleacutecules ainsi que la
formation d‟assemblages supramoleacuteculaires dans des conditions quasi-physiologiques La
diffusion en solution qui n‟est pas soumise aux principales limitations de la cristallographie
et de la RMN apparaicirct comme une technique compleacutementaire pour l‟eacutetude structurale des
macromoleacutecules
Les eacutechantillons reacuteels sont le plus souvent complexes (co-existence de plusieurs espegraveces de
proteacuteines) et heacuteteacuterogegravenes (manque dhomogeacuteneacuteiteacute au niveau de la conformation des
moleacutecules) Leur eacutetude repreacutesente un deacutefi majeur pour cette technique En effet dans un tel
cas le profil de diffusion contiendra des contributions de tous les composants rendant
l‟analyse complexe Cette difficulteacute peut ecirctre surmonteacutee par des meacutethodes de traitement des
donneacutees afin de caracteacuteriser des conformegraveres individuels de proteacuteines (34) ou bien des
agreacutegats de proteacuteines (35)
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique
La cryomicroscopie eacutelectronique se base sur les principes geacuteneacuteraux de la microscopie
eacutelectronique agrave transmission tout en eacutevitant les eacutetapes de preacuteparation endommageant les
eacutechantillons Elle repose sur l‟observation de moleacutecules ayant eacuteteacute fixeacutees de maniegravere brutale
par congeacutelation agrave tregraves basse tempeacuterature (processus de quelques millisecondes agrave environ -
170degC) afin d‟eacuteviter la formation de cristaux de glace Les moleacutecules totalement englobeacutees
dans un fin film d‟eau vitrifieacutee sont ainsi preacuteserveacutees dans leur environnement et leur eacutetat
natifs Compleacutementaire agrave la cristallographie des proteacuteines et agrave la spectroscopie RMN cette
meacutethode permet d‟obtenir la structure de larges assemblages macromoleacuteculaires en solution
25
La microscopie eacutelectronique permet d‟obtenir des images bidimensionnelles correspondant
agrave des projections de toute leacutepaisseur de leacutechantillon Cependant elles ne possegravedent quun
contraste tregraves faible et lanalyse dimages est alors indispensable Celle-ci consiste dans un
premier temps agrave additionner des images de faible contraste afin de moyenner le bruit preacutesent
et dobtenir un meilleur rapport signal sur bruit Dans un deuxiegraveme temps ces moyennes qui
repreacutesentent des vues de leacutechantillon sous diffeacuterents angles peuvent ecirctre combineacutees de
maniegravere matheacutematique pour calculer la structure tridimensionnelle de lobjet de deacutepart (36)
Cette technique de reconstruction en 3D utilisant des images obtenues sous diffeacuterents angles
est appeleacutee tomographie
La cryomicroscopie eacutelectronique est particuliegraverement bien adapteacutee agrave l‟observation de
moleacutecules de masse moleacuteculaire supeacuterieure agrave 200 ou 300 kDa (37) En effet seuls des eacutedifices
macromoleacuteculaires de grande taille remplissent les critegraveres neacutecessaires pour ecirctre visualiseacutes au
dessus du bruit de fond Il est possible d‟obtenir une reacutesolution de l‟ordre de 10 agrave 30 Aring (38)
Pour des macro-assemblages on peut envisager de compleacuteter une structure agrave basse reacutesolution
avec des structures agrave haute reacutesolution des proteacuteines individuelles Ces derniegraveres peuvent ecirctre
obtenues par exemple par cristallographie Il est ainsi possible d‟obtenir des informations
structurales agrave une reacutesolution presque atomique de structures subcellulaires (39)
Cette technique permet l‟eacutetude du changement conformationnel d‟assemblages
macromoleacuteculaires par imagerie de complexes fixeacutes par vitrification dans diffeacuterents eacutetats
conformationnels (37 40) La microscopie eacutelectronique permet eacutegalement aujourd‟hui
d‟obtenir des informations sur des macromoleacutecules et leurs assemblages dans le contexte
cellulaire par imagerie de la structure biologique entiegravere (41-43) Ceci a eacuteteacute rendu possible par
les progregraves effectueacutes dans le deacuteveloppement de la tomographie eacutelectronique et l‟eacutelaboration
de la cryomicroscopie de sections vitreuses
Il existe de nombreuses eacutetudes de complexes macromoleacuteculaires par cryomicroscopie
eacutelectronique parmi lesquelles la structure du ribosome agrave une reacutesolution de 115 Aring (44) et celle
de virus (45) l‟environnement cytosolique total de cellules eucaryotes (46) ainsi que l‟eacutetude
d‟une interaction proteacuteine chaperone-substrat (47)
La cryomicroscopie eacutelectronique possegravede plusieurs avantages par rapport agrave la
cristallographie et agrave la RMN En effet elle requiert de plus faibles quantiteacutes de mateacuteriel
(environ 2 mL agrave une concentration de 01-10 mgmL-1
par grille) elle ne neacutecessite pas
26
l‟obtention de cristaux et elle permet l‟observation d‟objets de lordre de grandeur de 300 kDa
agrave 1000 MDa Mais cette meacutethode preacutesente aussi des limites Les eacutechantillons doivent ecirctre
purs uniformes et sans agreacutegats et contenir seulement une faible concentration de sel et de
solvants afin de maximiser le contraste entre la proteacuteine et le tampon
I1223 Chromatographie drsquoexclusion steacuterique
La chromatographie est une technique de chimie analytique quantitative et qualitative Il
s‟agit d‟une meacutethode physique de seacuteparation d‟espegraveces chimiques Le principe est le suivant
leacutechantillon renfermant une ou plusieurs espegraveces est entraicircneacute par une phase mobile le long
dune phase stationnaire Chaque espegravece a une vitesse de migration propre qui deacutepend de ses
caracteacuteristiques et de celles des deux phases
La chromatographie d‟exclusion steacuterique appeleacutee aussi filtration sur gel permet de seacuteparer
des proteacuteines ou autres moleacutecules biologiques suivant leur taille (48) tandis que la plupart des
meacutethodes chromatographiques utilisent l‟affiniteacute chimique avec un support La phase
stationnaire est un gel hydrateacute constitueacute de pores de tailles diffeacuterentes Les macromoleacutecules de
l‟eacutechantillon entrent et sortent de ces pores selon leur taille Les moleacutecules les plus petites
peuvent entrer dans un plus grand nombre de pores ce qui allonge la dureacutee de leur migration
alors que les plus grosses moleacutecules sont eacutelueacutees plus rapidement En conseacutequence les
macromoleacutecules sont seacutepareacutees selon leurs dimensions
Plus rigoureusement cette meacutethode permet de seacuteparer des macromoleacutecules en fonction de
leur taille mais aussi de leur forme ie suivant leur volume hydrodynamique Ainsi deux
macromoleacutecules de mecircme masse moleacuteculaire mais d‟architecture diffeacuterente pourront ecirctre
distingueacutees En effet une macromoleacutecule peu structureacutee aura un plus grand volume
hydrodynamique qu‟une macromoleacutecule de mecircme masse moleacuteculaire mais de structure tregraves
globulaire Par conseacutequent la premiegravere sera plus rapidement eacutelueacutee que la seconde bien que
les deux masses soient identiques
Une eacutetude reacutecente a montreacute qu‟il eacutetait possible de caracteacuteriser des macroassemblages de
tregraves grande taille jusqu‟agrave plusieurs millions de daltons par chromatographie d‟exclusion
steacuterique (49)
27
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface
La reacutesonance plasmonique de surface (laquo Surface Plasmon Resonance raquo SPR) est un
pheacutenomegravene physique baseacute sur les proprieacuteteacutes de la lumiegravere Lorsquun faisceau de lumiegravere
polariseacutee monochromatique illumine une surface placeacutee entre deux milieux dindice de
reacutefraction diffeacuterent une partie du rayon incident est reacutefleacutechie tandis que lautre partie est
reacutefracteacutee agrave travers la surface Selon langle dincidence du rayon toute la lumiegravere peut ecirctre
reacutefleacutechie Lorsquil ny a pas de reacutefraction ie sous les conditions de reacuteflexion interne totale
une des composantes eacutelectromagneacutetiques de la lumiegravere londe eacutevanescente se propage
perpendiculairement agrave la surface sur une distance eacutequivalente agrave sa longueur donde Si une
couche fine de meacutetal riche en eacutelectrons libres est deacuteposeacutee sur cette surface alors ceux-ci
entrent en reacutesonance avec les photons du faisceau incident et creacuteent la reacutesonance plasmonique
de surface Une conseacutequence eacutenergeacutetique de cette reacutesonance est visible dans le faisceau
reacutefleacutechi qui preacutesente une chute dintensiteacute agrave un angle deacutefini Cet angle pour lequel on observe
une intensiteacute minimale est langle de reacutesonance Il varie en fonction de lindice de reacutefraction
du milieu dans lequel londe eacutevanescente se propage
Depuis sa deacutecouverte par Wood en 1902 (50-51) la reacutesonance plasmonique de surface est
principalement utiliseacutee comme senseur ie comme deacutetecteur placeacute agrave la source mecircme du
pheacutenomegravene eacutetudieacute capable de deacuteceler des modifications au niveau moleacuteculaire L‟application
de cette technique pour le controcircle des interactions biomoleacuteculaires a eacuteteacute deacutemontreacutee pour la
premiegravere fois en 1983 (52) La reacutesonance plasmonique de surface permet de mettre en
eacutevidence la formation d‟une liaison entre un ligand et un reacutecepteur adsorbeacute agrave la surface
meacutetallique par mesure de la variation de lindice de reacutefraction (Fig I 5) Lanalyte est mis au
contact de la surface meacutetallique greffeacutee Les changements induits par lassociation ou la
dissociation des complexes modifient la reacutefringence du milieu et deacutecalent la position de
langle de reacutesonance Lenregistrement de la variation de langle de reacutesonance permet de suivre
en temps reacuteel la fixation des moleacutecules injecteacutees Cette technique permet donc d‟obtenir des
donneacutees cineacutetiques sur des interactions mettant en jeu deux ou plusieurs partenaires (53)
28
Fig I 5 Scheacutema du principe de la reacutesonance plasmonique de surface utiliseacute par la technologie
Biacore TM pour l‟analyse des interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans marquage
Dans un tel systegraveme les deux milieux d‟indices de reacutefraction diffeacuterents sont la solution dans
laquelle se trouvent les moleacutecules agrave analyser et le verre d‟une lame qui sert de senseur Le
film conducteur agrave l‟interface des deux est un tregraves fin film d‟or agrave la surface de la lame de verre
La reacutesonance plasmonique de surface permet donc de deacutetecter et de quantifier des
interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans avoir recours au marquage de ces derniegraveres
Par le suivi en temps reacuteel de la formation et de la dissociation des complexes il est possible
de caracteacuteriser minutieusement la force des associations et d‟obtenir les cineacutetiques des
interactions moleacuteculaires La technique ne neacutecessitant pas l‟utilisation de marquage pour la
deacutetection et eacutetant non destructrice les biomoleacutecules qui sont seacutelectivement retenues sur la
surface du capteur peuvent ecirctre par la suite reacutecupeacutereacutees et analyseacutees par spectromeacutetrie de
masse Cette combinaison de technologies offre donc une toute nouvelle gamme
d‟applications telle que l‟identification et la rapide caracteacuterisation de nouvelles interactions
proteacuteineproteacuteine entre une proteacuteine d‟inteacuterecirct et un meacutelange complexe de proteacuteines (54-55)
I1225 Spectromeacutetrie de masse
Bien que les techniques de diffraction des rayons X et de spectroscopie RMN soient les
deux meacutethodes phares pour l‟eacutelucidation structurale des proteacuteines nous avons vu
preacuteceacutedemment qu‟elles preacutesentaient des limites En effet elles sont toutes les deux peu
sensibles et la cristallographie des proteacuteines neacutecessite l‟obtention de cristaux tandis que la
spectroscopie RMN est limiteacutee en gamme de masse Ainsi le choix de ces meacutethodes
29
classiques pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques n‟est pas toujours possible En revanche
l‟apport de la spectromeacutetrie de masse dans ce domaine est en constante progression La
spectromeacutetrie de masse ne permet pas d‟obtenir des informations structurales avec la mecircme
reacutesolution spatiale que les rayons X ou la RMN mais apporte un gain important en termes de
sensibiliteacute et rapiditeacute par rapport aux deux meacutethodes preacuteceacutedentes Il existe plusieurs
approches par spectromeacutetrie de masse permettant d‟obtenir des informations de structure
L‟une d‟entre elles repose sur le pontage covalent de proteacuteines en association suivi d‟une
digestion enzymatique et analyse par spectromeacutetrie de masse Une deuxiegraveme implique des
eacutechanges isotopiques (ou un marquage covalent) permettant soit de deacuteterminer des zones de
flexibiliteacute induites par la liaison d‟un ligand agrave une proteacuteine soit des zones d‟interaction entre
macromoleacutecules au sein d‟un complexe La spectromeacutetrie de masse offre eacutegalement
l‟opportuniteacute de caracteacuteriser des complexes non covalents (proteacuteine-proteacuteine proteacuteine-ligand)
gracircce agrave l‟utilisation de modes d‟ionisation adapteacutes On peut noter pour l‟analyse de
complexes proteacuteiques intacts l‟eacutemergence de spectromegravetres de masse eacutequipeacutes d‟une cellule
de mobiliteacute ionique
Approche par pontage covalent
Les interactions proteacuteine-proteacuteine peuvent donc ecirctre analyseacutees par pontage covalent
(laquo crosslinking raquo) et spectromeacutetrie de masse L‟avantage majeur de cette approche est qu‟elle
permet d‟obtenir agrave la fois des informations sur la composition et sur la structure des
complexes gracircce agrave la grande sensibiliteacute de la spectromeacutetrie de masse Le laquo crosslinking raquo est
une technique qui permet de relier chimiquement les sous-uniteacutes d‟un complexe non covalent
ce qui permet de stabiliser les interactions au sein de l‟eacutedifice macromoleacuteculaire et d‟en
faciliter l‟eacutetude Ceci est reacutealiseacute par des agents pontants ou laquo crosslinkers raquo qui sont des
composeacutes chimiques posseacutedant un groupe reacuteactif agrave leur extreacutemiteacute capable de reacuteagir avec des
fonctions speacutecifiques des proteacuteines ou d‟autres moleacutecules (eg amines primaires
sulfhydryles hellip) Les agents pontants eacutetablissent des liaisons covalentes entre des acides
amineacutes proches dans la structure tertiaire L‟utilisation de laquo crosslinkers raquo de taille diffeacuterente
permet d‟obtenir des contraintes de distance entre les peptides des partenaires proteacuteiques du
complexe L‟analyse des peptides ponteacutes par spectromeacutetrie de masse permet d‟obtenir des
informations sur la topologie initiale du complexe Il existe maintenant une grande varieacuteteacute
d‟agents pontants multifonctionnels (homo- ou heacuteteacuterofonctionnels) disponibles dans le
commerce (wwwpiercenetcom)
30
Fig I 6 Scheacutema de la reacuteaction de pontage covalent entre deux proteacuteines utilisant le DSG
(DiSuccinimidyl Glutarate) reacuteactif homobifonctionnel Il a deux groupes identiques des
esters de NHS agrave chacune de ses extreacutemiteacutes qui reacuteagissent avec les amines primaires des
proteacuteines (extreacutemiteacute N-terminale et chaicircne lateacuterale des lysines) Son bras espaceur long de 77
Aring est constitueacute de cinq atomes
Les groupes reacuteactifs peuvent ecirctre des esters de NHS (N-HydroxySuccinimide) (Fig I 6)
ou des maleacuteimides qui ciblent les thiols des cysteacuteines ou encore des aryl azides qui s‟insegraverent
dans des liaisons C-H ou N-H sous activation UV Les esters de NHS et leurs deacuteriveacutes solubles
sulfonyleacutes sont les plus couramment utiliseacutes malgreacute les reacuteactions secondaires qu‟ils
entraicircnent compliquant l‟analyse des spectres obtenus apregraves digestion enzymatique du
complexe proteacuteique En effet si les amines primaires des lysines (ou des extreacutemiteacutes N-
terminales) sont les cibles majeures des groupements NHS il n‟est pas rare d‟observer des
reacuteactions de pontage impliquant les groupements hydroxyles des tyrosines des seacuterines ou
encore des threacuteonines (56) De plus les esters de NHS conventionnels ont une forte tendance
agrave s‟hydrolyser pendant l‟eacutetape de pontage conduisant agrave des produits de type laquo dead-end raquo
qu‟il est difficile de seacuteparer des autres (57) Par conseacutequence avec la connaissance de toutes
les cibles possibles des laquo crosslinkers raquo l‟eacutelucidation de la structure des complexes proteacuteiques
pourrait ecirctre significativement ameacutelioreacutee due agrave la plus grande fraction d‟espegraveces ponteacutees
identifieacutees
Bien que l‟association pontage covalent et spectromeacutetrie de masse soit devenue un outil
analytique performant pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques elle preacutesente des limites qui
sont (i) la faible intensiteacute dans les spectres de masse des pics correspondant aux peptides
ponteacutes et (ii) la difficulteacute agrave les identifier parmi les autres due au fait qu‟ils sont tregraves
minoritaires dans les meacutelanges obtenus Dans ce contexte le choix d‟un spectromegravetre de
masse alliant excellente reacutesolution et tregraves bonne preacutecision sur la mesure de masse (FT-ICR
orbitrap) est judicieux Il permet d‟une part de bien seacuteparer les diffeacuterents constituants obtenus
31
apregraves la digestion des complexes et d‟autre part d‟utiliser la masse exacte comme critegravere de
seacutelection Des strateacutegies permettant d‟identifier plus facilement les peptides ponteacutes dans le
meacutelange tregraves complexe obtenu apregraves digestion enzymatique ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees
ces derniegraveres anneacutees Elles sont baseacutees sur l‟utilisation d‟agents pontants posseacutedant des
isotopes stables (58) ou inteacutegrant une fonction biotine permettant un enrichissement seacutelectif
des peptides ponteacutes (59) Des agents pontants permettant une identification plus aiseacutee des
peptides ponteacutes en MSMS ont eacutegalement eacuteteacute mis au point ces derniegraveres anneacutees (60-62)
Reacutecemment l‟utilisation de laquo crosslinkers raquo photoactivables a permis de mettre en eacutevidence
des sites d‟interaction diffeacuterents entre trois activateurs de la transcription (Gal4 Gcn4 et
VP16) et le cofacteur MD15 (63) Cette eacutetude montre par ailleurs la compleacutementariteacute des
modes d‟ionisation MALDI et ESI pour retrouver un grand nombre de peptides ponteacutes Dans
un exemple un peu moins reacutecent Rappsilber et al ont proposeacute un modegravele tridimensionnel
pour un complexe du pore nucleacuteaire chez la levure (64)
Approche par marquage
Une deuxiegraveme approche consiste agrave modifier chimiquement la surface du complexe
proteacuteique accessible en solution et agrave identifier les sites de modifications par spectromeacutetrie de
masse Les segments peptidiques impliqueacutes dans des interactions proteacuteine-proteacuteine ne sont
pas accessibles en solution et a priori ne seront pas modifieacutes La comparaison des cartes
d‟accessibiliteacute pour des proteacuteines seules et associeacutees permet de remonter agrave la topologie initiale
du complexe La modification chimique peut ecirctre reacuteversible ou irreacuteversible Les eacutechanges
hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) des amides de la liaison peptidique sont un exemple de
modifications labiles (65-67) La modification chimique des chaicircnes lateacuterales par des reacuteactifs
speacutecifiques tels que l‟aceacutetanhydride le dieacutethylpyrocarbonate ou le phenylglyoxal est quant agrave
elle permanente (67-68) ce qui impose moins de contraintes au niveau de la rapiditeacute de
l‟analyse apregraves modifications La premiegravere strateacutegie qui fait l‟objet de cette thegravese sera deacutecrite
en deacutetails dans la seconde partie de cette introduction
Les radicaux hydroxyles peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutes dans une approche par marquage
covalent Leur formation peut avoir lieu de diffeacuterentes faccedilons ie par chimie Fenton
radiolyse de l‟eau eacutelectrochimie ou photolyse UV du peroxyde d‟hydrogegravene Ces techniques
aboutissent agrave des concentrations en radicaux diffeacuterentes avec des eacutechelles de temps varieacutees
mais en principe les reacuteactions avec les proteacuteines conduisent aux mecircmes produits Les produits
d‟oxydation sont nombreux puisque quatorze acides amineacutes sur vingt peuvent ecirctre modifieacutes
(Cys Met Trp Tyr Phe His Leu Ile Arg Lys Val Ser Gln et Glu) L‟analyse des
32
produits de la reacuteaction et des sites de modification est geacuteneacuteralement reacutealiseacutee par couplage LC-
MSMS apregraves digestion enzymatique La cineacutetique d‟oxydation des diffeacuterents peptides permet
d‟obtenir des informations de structure Elle est eacutetablie agrave partir de la disparition des peptides
non modifieacutes mais eacutegalement agrave partir de l‟apparition des peptides oxydeacutes Si le temps
d‟exposition aux radicaux est court (infeacuterieur agrave quelques centaines de ms) alors la vitesse
d‟oxydation enregistreacutee pour un peptide donneacute deacutependra principalement (i) de la reacuteactiviteacute
intrinsegraveque des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes et (ii) de leur accessibiliteacute au solvant dans
la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (ou du complexe) Ainsi la comparaison des
vitesses d‟oxydation mesureacutees pour deux peptides dont les acides amineacutes modifieacutes sont
identiques permettra d‟obtenir des informations en termes d‟accessibiliteacute relative agrave la surface
de deux reacutegions diffeacuterentes d‟une proteacuteine
L‟avantage majeur des approches par marquage covalent reacuteside dans le fait de pouvoir
analyser les peptides modifieacutes sans prendre de preacutecautions particuliegraveres puisque la
modification n‟est pas labile En revanche la technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium
impose de travailler dans des conditions expeacuterimentales strictes permettant de conserver le
marquage jusqu‟agrave l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Cependant cette derniegravere
approche ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas toujours
le cas avec des approches par marquage covalent En effet une alteacuteration de la structure des
macroassemblages peut ecirctre observeacutee sous l‟effet de l‟oxydation par l‟utilisation de radicaux
hydroxyles (69)
L‟approche par marquage peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour obtenir des informations sur la
dynamique structurelle des proteacuteines et complexes proteacuteiques La caracteacuterisation des
modifications dans des conditions expeacuterimentales diffeacuterentes permet de remonter aux
changements structuraux Ainsi Dumoulin et al ont eacutetudieacute le changement conformationnel
du lysozyme induisant la formation d‟agreacutegats multimeacuteriques (70) Un autre exemple est
l‟eacutetude des changements d‟interaction proteacuteine-proteacuteine lors de la maturation des capsides du
virus HIV-1 (71) Des informations sur les changements conformationnels d‟une proteacuteine lors
de la fixation d‟un ligand ont pu eacutegalement ecirctre obtenues (72-74) Par ailleurs une eacutetude
reacutecente du complexe Arp23 formeacute de sept sous-uniteacutes proteacuteiques a permis de mettre en
eacutevidence finement des modifications de structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave
l‟ATP en utilisant les radicaux hydroxyles (75)
33
Approche par proteacuteolyse meacutenageacutee
Une autre approche consiste agrave reacutealiser une proteacuteolyse meacutenageacutee Les premiers travaux
rapportant l‟eacutetude d‟une empreinte proteacuteique par proteacuteolyse meacutenageacutee datent de 1987 et sont
directement inspireacutes des travaux de laquo DNA footprint raquo (76) Le principe ici consiste agrave tester
l‟accessibiliteacute agrave diffeacuterentes proteacuteases des proteacuteines eacutetudieacutees Un profil proteacuteolytique diffeacuterent
peut traduire des surfaces accessibles qui ne sont pas identiques ou un masquage par une
moleacutecule de ligand Associeacutee agrave la spectromeacutetrie de masse la proteacuteolyse meacutenageacutee est ainsi
devenue un outil puissant dont l‟une des applications premiegraveres a eacuteteacute l‟identification preacutecise
d‟eacutepitopes agrave partir de complexes antigegravene-anticorps immobiliseacutes (77) Depuis cette technique
est largement utiliseacutee pour des eacutetudes de dynamique structurelle (78) d‟interaction proteacuteine-
ligand (79-82) de diffeacuterences conformationnelles lieacutees agrave des mutations (83-84) ou pour
l‟eacutelucidation de domaines structuraux (85-87)
Les enzymes classiquement utiliseacutees sont la trypsine qui clive apregraves les acides amineacutes
basiques tels que les reacutesidus lysine et arginine et la proteacutease V8 qui coupe speacutecifiquement
apregraves les reacutesidus acide aspartique et acide glutamique Elles ont eacuteteacute choisies
preacutefeacuterentiellement en raison de la haute freacutequence de ces reacutesidus dans les proteacuteines et de la
compleacutementariteacute des profils proteacuteolytiques obtenus Par ailleurs la proteacuteolyse doit ecirctre la plus
limiteacutee possible afin de ne pas deacutestructurer la proteacuteine conduisant agrave d‟autres sites de coupure
non repreacutesentatifs de la structure tertiaire La reacutesolution de cette meacutethode est cependant
modeste C‟est la raison pour laquelle la proteacuteolyse meacutenageacutee est tregraves souvent coupleacutee avec des
approches par eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium afin d‟obtenir des reacutesultats compleacutementaires
(88-89)
Analyse de complexes non covalents
L‟avegravenement des techniques d‟ionisation douces telles que l‟ESI (laquo ElectroSpray
Ionisation raquo) (90) et le MALDI (laquo Matrix Assisted Laser DesorptionIonisation raquo) (91) a
ouvert agrave la spectromeacutetrie de masse un nouveau champ d‟application celui de l‟analyse de
macromoleacutecules biologiques intactes (92) Pour le deacuteveloppement de ces meacutethodes qui ont
ces derniegraveres anneacutees largement participeacute agrave l‟essor de la spectromeacutetrie de masse dans le cadre
des analyses proteacuteomiques J Fenn et K Tanaka ont eacuteteacute reacutecompenseacutes en 2002 par
l‟attribution du prix Nobel de chimie
34
Par comparaison aux diffeacuterentes techniques utiliseacutees pour la caracteacuterisation des proteacuteines
la spectromeacutetrie de masse apporte plusieurs avantages Tout d‟abord elle est tregraves sensible En
effet quelques picomoles voire mecircme attomoles de peptides suffisent agrave obtenir un signal Par
ailleurs la spectromeacutetrie de masse est caracteacuteriseacutee par sa grande preacutecision en masse Elle est
ainsi capable de deacuteterminer des masses moleacuteculaires agrave moins d‟une partie par million (ppm)
pour les instruments les plus preacutecis alors que la technique de SDS-PAGE (laquo Sodium Dodecyl
Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis raquo) donne des erreurs de l‟ordre de 20 Enfin la
spectromeacutetrie de masse est une meacutethode d‟analyse rapide A titre de comparaison un spectre
de masse est enregistreacute en quelques secondes agrave minutes tandis qu‟une expeacuterience de SDS-
PAGE dure plusieurs heures
Dans le cadre de l‟eacutetude des complexes proteacuteiques la spectromeacutetrie de masse est
susceptible de fournir d‟une part des informations preacutecises sur la stœchiomeacutetrie des
macroassemblages et d‟autre part des donneacutees structurales en combinaison avec du
marquage
Une des questions souvent poseacutees aux spectromeacutetristes de masse concerne la possibiliteacute de
reacutealiser une mesure de masse directe d‟un complexe proteacuteique intact dans le but d‟obtenir des
informations sur la stœchiomeacutetrie de l‟interaction Il convient de noter que la mesure de
masse est alors effectueacutee sur le complexe en phase gazeuse alors que pour le biologiste
l‟interaction d‟inteacuterecirct est celle qui a lieu en solution Dans ces conditions une interaction non
covalente preacutesente en solution peut ne pas ecirctre deacutetecteacutee en phase gazeuse C‟est le cas par
exemple des interactions hydrophobes Des eacutetudes ont ainsi montreacute l‟impossibiliteacute de
corroborer les reacutesultats obtenus en phase gazeuse et en solution pour ce type d‟interaction (93-
94) A l‟inverse des interactions principalement eacutelectrostatiques seront renforceacutees en phase
gazeuse et un complexe mecircme peu stable en solution peut ecirctre deacutetecteacute facilement par
spectromeacutetrie de masse Compte tenu de ces eacuteleacutements il nest pas toujours facile de relier des
stabiliteacutes en phase gazeuse eacutetudieacutees par exemple en modifiant la tension agrave l‟interface aux
stabiliteacutes en solution Dans certains cas le problegraveme est encore plus complexe puisque le
type d‟interaction en phase gazeuse peut ecirctre diffeacuterent de celui en solution L‟exemple retenu
est celui des complexes entre des cyclodextrines et des acides amineacutes aromatiques (95) en
solution l‟interaction est principalement de type hydrophobe entre le groupe aromatique et la
caviteacute de la cyclodextrine alors qu‟en phase gazeuse il s‟agit d‟une interaction ion-dipocircle agrave
l‟exteacuterieur de la caviteacute Ceci implique la formation en phase gazeuse de complexes
inexistants en solution donnant ainsi naissance agrave des faux positifs
35
Malgreacute ces contraintes quelques revues reacutecentes de la litteacuterature montrent l‟inteacuterecirct de la
spectromeacutetrie de masse pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers (96-99) Actuellement il est mecircme possible de mesurer des masses
moleacuteculaires de l‟ordre de plusieurs millions de daltons Parmi les plus importantes jamais
atteintes il a celles des heacutemocyanines de 22 MDa de crabes abyssaux (100) du ribosome de
Thermus thermophilus de 233 MDa (98) des assemblages viraux des capsides du virus de
l‟heacutepatite B de 3 et 4 MDa (101) et du complexe multiproteacuteique de l‟ureacutease de Helicobacter
pylori agrave 426 MDa (98)
La technique d‟ionisation de reacutefeacuterence pour analyser les complexes proteacuteiques est
l‟eacutelectrospray (ou sa variante le nano eacutelectrospray) Dans des cas particuliers il est mecircme
possible de les eacutetudier par MALDI (102) bien que cette meacutethode ne soit probablement pas
geacuteneacuteralisable agrave tous les systegravemes Quelques techniques eacutemergentes pour l‟analyse
d‟assemblages macromoleacuteculaires ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees reacutecemment ou sont en cours de
deacuteveloppement comme la mobiliteacute ionique (SMI) (103) l‟laquo ElectroSonic Spray Ionization raquo
(ESSI) (104) ou le laquo Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption raquo (LILBID) (105) Le
processus d‟ionisation doit ecirctre reacutealiseacute en conditions non deacutenaturantes (pH controcircleacute) pour
conserver les complexes proteacuteiques dans leur conformation active Il faut donc choisir un
tampon (nature des sels) qui soit compatible agrave la fois avec la meacutethode d‟ionisation employeacutee
et le maintien de l‟inteacutegriteacute des complexes biologiques Dans le cas de l‟eacutelectrospray des sels
volatils comme l‟aceacutetate d‟ammonium (AcNH4) sont preacutefeacuterentiellement utiliseacutes Neacuteanmoins
lors de la preacuteparation des eacutechantillons une eacutetape de dessalage (par centrifugation gel
filtration hellip) est indispensable En ce qui concerne l‟analyseur du spectromegravetre de masse le
choix est porteacute sur les temps de vol (laquo Time of Flight raquo ToF et laquo Quadrupole Time of
Flight raquo Q-ToF) qui permettent d‟analyser des ions avec des rapports masse sur charge
eacuteleveacutes proprieacuteteacute inteacuteressante pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers Une optimisation des paramegravetres instrumentaux est preacutealablement requise
pour controcircler l‟eacutenergie communiqueacutee aux ions dans l‟interface du spectromegravetre de masse
Pour les complexes proteacuteiques qui restent intacts apregraves leur ionisation en phase gazeuse la
spectromeacutetrie de masse est ainsi devenue un outil tregraves puissant pour obtenir des informations
sur leur masse moleacuteculaire et donc pour deacuteterminer leur stœchiomeacutetrie
36
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment la spectromeacutetrie de masse est souvent combineacutee agrave une
autre technique pour obtenir des informations de structure On peut dans ce contexte citer les
derniers deacuteveloppements dans le domaine de la mobiliteacute ionique qui permet de seacuteparer
diffeacuterents complexes proteacuteiques en fonction de leur structure en phase gazeuse Le principe de
la Spectromeacutetrie de Mobiliteacute Ionique (SMI) est illustreacute dans la Fig I 7 L‟utilisation en
routine de la SMI a eacuteteacute rendue possible par la commercialisation par Waters de spectromegravetres
de masse eacutequipeacutes d‟une cellule de mobiliteacute ionique
Fig I 7 Scheacutema du principe de la meacutethode de spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique (SMI)
coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse (SM) Les ions produits par la source eacutelectrospray (ES)
sont introduits dans la cellule de laquo drift raquo dans laquelle regravegne un champ eacutelectrique E Le
frottement avec les moleacutecules d‟heacutelium contenues dans la cellule eacutetant plus important avec
des ions de conformation deacuteplieacutee ceux-ci arriveront plus tard au deacutetecteur Ici les ions sont
seacutelectionneacutes en masse par un quadripocircle apregraves la cellule de drift
La mobiliteacute ionique est l‟eacutequivalent en phase gazeuse de la mobiliteacute eacutelectrophoreacutetique les
ions sont agrave la fois acceacuteleacutereacutes dans le champ eacutelectrique et freineacutes par les nombreuses collisions
avec le gaz-tampon (heacutelium) Il s‟eacutetablit donc un reacutegime stationnaire les ions atteignent une
vitesse de translation constante La mobiliteacute ionique correspond au rapport entre la vitesse de
laquo drift raquo et le champ eacutelectrique appliqueacute Plus l‟ion a une conformation compacte moins sa
section efficace est grande et moins il est freineacute par des collisions donc plus sa vitesse est
eacuteleveacutee Il arrivera plus rapidement au deacutetecteur par rapport agrave un ion de conformation plus
deacuteployeacutee Un ion laquo funnel raquo ou un piegravege agrave ions quadripolaire est placeacute en amont de la cellule
de laquo drift raquo afin de focaliser les ions en paquets agrave envoyer agrave un temps zeacutero et ainsi pour
pouvoir mesurer la distribution des temps d‟arriveacutee (laquo Arrival Time Distribution raquo ou ATD)
Les premiers instruments de SMI ont eacuteteacute conccedilus par quelques groupes pionniers en la
matiegravere (Bowers (106-107) Jarrold (108) et Clemmerb (109) pour les biomoleacutecules) La
socieacuteteacute Waters (Milford Etats-Unis wwwwaterscom) a reacutecemment commercialiseacute le
systegraveme Synapttrade High Definition MS qui inclut une cellule de mobiliteacute de type laquo travelling
37
wave raquo (champ eacutelectrique oscillant entre les anneaux successifs d‟un tunnel agrave ions) entre un
filtre quadripolaire et un analyseur agrave temps de vol
L‟analyse des complexes proteacuteiques par SMIMS permet non seulement d‟obtenir des
informations sur leur taille mais eacutegalement des donneacutees de topologie (110) L‟agencement des
proteacuteines au sein des complexes peut ecirctre sondeacute suivant deux approches diffeacuterentes La
premiegravere consiste agrave dissocier le complexe en phase gazeuse les proteacuteines se trouvant agrave la
peacuteripheacuterie se deacutetachent theacuteoriquement en premier Neacuteanmoins il est difficile de fragmenter en
phase gazeuse des complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire Par ailleurs l‟activation
neacutecessaire agrave la dissociation conduit agrave une augmentation des sections efficaces de collision et
donc agrave une perturbation partielle de la conformation native des proteacuteines du complexe Il est
alors possible que les proteacuteines qui se seacuteparent du complexe en premier ne soient pas celles
qui ont initialement les surfaces d‟interaction les plus petites avec les autres partenaires
proteacuteiques (111) Neacuteanmoins l‟utilisation reacutecente de la dissociation sur surface par le groupe
de V Wysocki pour dissocier ces complexes en maintenant les structures des sous-uniteacutes
semble ouvrir des perspectives nouvelles et prometteuses dans le domaine (112) L‟autre
approche consiste agrave deacutenaturer progressivement le complexe en solution et agrave analyser les
diffeacuterents sous-complexes par SMI pour reconstruire la topologie initiale L‟avantage majeur
de cette approche est que les sous-complexes sont formeacutes en solution et reflegravetent donc de
maniegravere plus fidegravele la composition du complexe dans son eacutetat natif Le laboratoire de Carol
Robinson en Angleterre est devenu ces derniegraveres anneacutees leader pour l‟analyse structurale par
SMI de ces complexes proteacuteiques de tregraves grande taille (113)
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique
Ces meacutethodes permettent de travailler sur l‟objet biologique lui-mecircme Parmi elles le
TAP-Tag (laquo Tandem Affinity Purification-Tag raquo) et le double hybride occupent une place de
choix pour l‟eacutetude des interactions proteacuteine-proteacuteine Il s‟agit de deux techniques in-situ
La meacutethode du TAP-Tag permet d‟isoler le complexe proteacuteique eacutetudieacute qui est dans sa
conformation native par deux eacutetapes de purification successives (Fig I 8) La premiegravere
utilise une colonne constitueacutee de billes greffeacutees avec des immunoglobulines G (IgG) qui ont
une forte affiniteacute pour la proteacuteine A proteacuteine recombinante dite appacirct agrave laquelle est fixeacute le
complexe proteacuteique Le complexe retenu sur cette colonne est ensuite eacutelueacute speacutecifiquement par
38
coupure avec la proteacutease TEV Puis il est appliqueacute sur la seconde colonne constitueacutee de billes
de calmoduline En preacutesence d‟ions calcium la calmoduline est sous sa forme active
favorisant l‟attachement du complexe L‟eacutelution est reacutealiseacutee par l‟ajout d‟un cheacutelateur de
calcium (EGTA) qui rend la calmoduline inactive et donc libegravere le complexe Finalement ce
dernier pourra ecirctre analyseacute par spectromeacutetrie de masse afin de deacuteterminer ses diffeacuterents
constituants ou bien ecirctre utiliseacute pour des eacutetudes fonctionnelles
Fig I 8 Scheacutema du principe de la technique du TAP-Tag
Cette meacutethode a eacuteteacute appliqueacutee agrave l‟analyse agrave haut deacutebit du proteacuteome de la levure
Saccharomyces cerevisiae (114-116) Son utilisation chez les eucaryotes supeacuterieurs reste plus
complexe mais tout de mecircme envisageable (117) Des ameacuteliorations de l‟approche TAP-
TagMS ont eacuteteacute apporteacutees pour la possibiliteacute d‟utiliser cette meacutethode agrave haut deacutebit chez les
eucaryotes supeacuterieurs (118)
La technique du double hybride permet quant agrave elle de mettre en eacutevidence une interaction
physique entre deux proteacuteines X et Y Le principe est le suivant par geacutenie geacuteneacutetique deux
proteacuteines de fusion sont syntheacutetiseacutees puis exprimeacutees dans la levure La premiegravere est constitueacutee
de la proteacuteine X agrave laquelle est fusionneacute le domaine de liaison agrave l‟ADN (DL) d‟un facteur de
transcription tandis que la seconde est formeacutee de la proteacuteine Y et du domaine d‟activation de
39
la transcription (DA) de ce mecircme facteur Les deux domaines ont eacuteteacute dissocieacutes et le gegravene
rapporteur de la β-galactosidase est sous le controcircle de la seacutequence ougrave vient se fixer
speacutecifiquement le DL La β-galactosidase est une enzyme qui transforme un substrat soluble
et incolore en un composeacute bleu insoluble Lorsque la proteacuteine Y interagit avec la proteacuteine X
le DA est de nouveau associeacute au DL permettant alors la transcription du gegravene rapporteur Les
clones capables d‟utiliser le galactose preacutesent dans le milieu peuvent donc ecirctre seacutelectionneacutes
(colonies bleues) En effet le changement de couleur teacutemoigne de l‟interaction entre les deux
proteacuteines
Ce systegraveme a eacuteteacute agrave l‟origine mis au point pour tester l‟interaction pouvant exister entre
deux proteacuteines connues (119) De nouvelles variantes de la meacutethode double hybride ont fait
leur apparition reacutecemment permettant la deacutetection des proteacuteines impliqueacutees dans des
interactions avec l‟ADN (laquo one-hybrid system raquo) l‟ARN (laquo RNA-based three-hybrid
system raquo) de petits ligands (laquo small molecule-based threehybrid system raquo) et des proteacuteines
ayant subi des modifications post-traductionnelles (laquo tribrid system raquo) (120)
Il existe eacutegalement des techniques de seacuteparation des complexes proteacuteiques en conditions
non deacutenaturantes pour conserver intactes les interactions Ainsi l‟eacutelectrophoregravese sur gel de
polyacrylamide en condition bleue native ou BN-PAGE (laquo Blue Native-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis raquo) permet d‟isoler les macro-assemblages dans leur conformation native en
fonction de leur taille et de leur forme En combinaison avec une seconde dimension de
seacuteparation sur gel cette fois-ci en conditions deacutenaturantes les proteacuteines d‟un mecircme complexe
peuvent agrave leur tour ecirctre isoleacutees puis identifieacutees par spectromeacutetrie de masse Il est donc
possible par cette technique de mettre en eacutevidence le nombre et la masse moleacuteculaire des
proteacuteines impliqueacutees dans le complexe
Cette technique peut ecirctre utiliseacutee pour l‟isolation de complexes proteacuteiques membranaires
ou pour les complexes proteacuteiques extraits de cellules entiegraveres Un grand nombre
d‟applications pour cette technique concerne l‟analyse de complexes proteacuteiques issus de
plantes (121)
40
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la
spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique
structurelle des proteacuteines en solution
La technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) en solution s‟est reacuteveacuteleacutee tregraves
performante pour l‟eacutetude de la conformation et de la dynamique structurelle des proteacuteines La
spectroscopie RMN agrave deux dimensions a longtemps eacuteteacute choisie comme meacutethode d‟analyse de
ces eacutechanges isotopiques (32 122-123) L‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse comme
meacutethode alternative d‟analyse apregraves eacutechanges HD s‟est deacuteveloppeacutee ces derniegraveres anneacutees La
spectromeacutetrie de masse qui permet de s‟inteacuteresser agrave des complexes proteacuteiques de tregraves haut
poids moleacuteculaire ouvre ainsi de nouvelles opportuniteacutes pour l‟eacutetude de systegravemes proteacuteiques
plus importants (gtgt 50 kDa) Par ailleurs en raison de sa meilleure sensibiliteacute cette technique
requiert une quantiteacute initiale de mateacuteriel beaucoup moins importante (de l‟ordre de quelques
dizaines de nganalyse) Elle permet eacutegalement de deacutetecter la coexistence de diffeacuterents
conformegraveres proteacuteiques en solution (124)
Les premiers travaux combinant les eacutechanges HD et la spectromeacutetrie de masse datent de
1991 Ils portent alors sur l‟analyse de proteacuteines entiegraveres (125) Depuis les avantages de la
spectromeacutetrie de masse ont permis aux eacutechanges isotopiques HD d‟eacutetudier des proteacuteines
individuelles de poids moleacuteculaires plus importants (126) des proteacuteines s‟associant pour
former des polymegraveres de haut poids moleacuteculaire (127) des particules virales (71 128) ainsi
que des complexes proteacuteine-ligand (129) ou proteacuteine-proteacuteine (130) De plus l‟association
HDXMS semble prometteuse pour l‟analyse structurale de proteacuteines membranaires connues
pour ecirctre difficilement eacutetudiables par beaucoup d‟autres techniques (131-133)
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux
proteacuteines en solution
I211 Quel type drsquohydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX
Les hydrogegravenes lieacutes agrave des heacuteteacuteroatomes dans les moleacutecules biologiques telles que les
proteacuteines sont labiles Autrement dit les atomes d‟hydrogegravene appartenant aux groupements
O-H N-H et S-H peuvent s‟eacutechanger avec ceux des moleacutecules d‟eau environnantes Il s‟agit
des hydrogegravenes des proteacuteines qui sont repreacutesenteacutes en bleu et en rouge sur la Fig I 9
41
Fig I 9 Scheacutema des diffeacuterents types d‟hydrogegravene dans une proteacuteine
Si un atome d‟hydrogegravene est eacutechangeacute avec un autre atome d‟hydrogegravene alors il est eacutevident
que ce remplacement ne sera pas deacutetecteacute par spectromeacutetrie de masse En revanche
l‟exposition d‟une proteacuteine agrave de l‟eau lourde (D2O ou 2H2O) conduit agrave des remplacements
d‟hydrogegravenes (1H) par des deuteacuteriums (
2H) qui accroissent la masse totale de la proteacuteine de 1
Da par hydrogegravene eacutechangeacute Lorsque les eacutechanges isotopiques se reacutealisent dans le sens deacutecrit
preacuteceacutedemment ie 1H
2H alors on utilise l‟expression laquo exchange-in raquo Mais les eacutechanges
isotopiques peuvent ecirctre reacutealiseacutes dans les deux directions On emploie alors le terme de
laquo exchange-out raquo pour eacutevoquer les eacutechanges qui s‟opegraverent dans le sens 2H
1H quand une
proteacuteine complegravetement deuteacutereacutee est incubeacutee dans de l‟eau leacutegegravere et que des deuteacuteriums sont
alors remplaceacutes par des hydrogegravenes (134) Les eacutetudes d‟eacutechange HD sont principalement
reacutealiseacutees suivant le principe laquo exchange-in raquo En effet ce dernier ne neacutecessite pas d‟eacutetape
suppleacutementaire qui consisterait agrave deuteacuterer complegravetement les proteacuteines avant le deacutebut des
expeacuteriences HDXMS C‟est la strateacutegie que nous avons adopteacutee pour notre eacutetude structurale
de complexes proteacuteiques
Si on considegravere maintenant les hydrogegravenes qui sont lieacutes de maniegravere covalente agrave un atome
de carbone dans les proteacuteines dessineacutes en vert sur la Fig I 9 ces derniers ne subiront pas
d‟eacutechange isotopique dans nos conditions expeacuterimentales Seule une catalyse chimique
importante serait agrave envisager pour proceacuteder agrave l‟eacutechange isotopique de ces hydrogegravenes Mais il
semblerait qu‟il soit possible d‟eacutechanger l‟hydrogegravene de la liaison C(ε1)-H du groupement
imidazole de la chaicircne lateacuterale de lhistidine (Fig I 10) (135)
42
Fig I 10 Scheacutema de l‟acide amineacute histidine
Parmi les hydrogegravenes eacutechangeables des proteacuteines il y a
- ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (en bleu sur la Fig I 9) et des extreacutemiteacutes N-
et C-terminales (groupements amino et carboxy) qui ont des vitesses d‟eacutechange isotopique
tregraves rapides de l‟ordre de la milliseconde agrave la seconde Dans l‟eacutechelle de temps de nos
expeacuterimentations ces vitesses d‟eacutechange sont trop rapides pour que nous puissions les
observer
- les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques (en rouge sur la Fig I 9) qui ont des
vitesses d‟eacutechange isotopique plus lentes de l‟ordre de la minute agrave l‟heure et donc qui sont
compatibles avec une deacutetection par spectromeacutetrie de masse Au cours de nos expeacuteriences
HDXMS nous allons par conseacutequent nous inteacuteresser aux eacutechanges isotopiques de ces
hydrogegravenes
Dans une proteacuteine tous les acides amineacutes agrave l‟exception de la proline et du premier reacutesidu
de la chaicircne polypeptidique possegravedent un groupement amide N-H de liaison Il est par
conseacutequent possible d‟obtenir des informations structurales tout le long de la chaicircne
polypeptidique
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de lrsquoaccessibiliteacute
des proteacuteines
La vitesse des eacutechanges isotopiques HD deacutepend de l‟accessibiliteacute au solvant mais
eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale des proteacuteines Autrement dit les hydrogegravenes
d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine tels que les boucles
et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses d‟eacutechange plus
rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au contraire
43
ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices α et les
feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent plus
lentement car ils sont proteacutegeacutes (136)
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les
proteacuteines et peptides
I2131 Deacutefinition du facteur chimique
Il vient d‟ecirctre dit que l‟eacutechange isotopique est plus rapide quand l‟hydrogegravene d‟amide de la
liaison peptidique est complegravetement exposeacute au solvant et non impliqueacute dans des liaisons
hydrogegravene intramoleacuteculaires stables Dans ces conditions la constante de vitesse du
remplacement de N-H par N-D (laquo exchange-in raquo) est noteacutee kch Il s‟agit du facteur chimique
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique
Pour chaque hydrogegravene d‟amide du squelette polypeptidique consideacutereacute individuellement la
valeur de kch est deacutetermineacutee selon une seacuterie de facteurs le pH la tempeacuterature et la
composition du solvant la pression la force ionique du milieu et la seacutequence locale en acides
amineacutes Nous deacutetaillerons uniquement l‟influence des trois facteurs les plus repreacutesentatifs
soit le pH (ou pD en solution deuteacutereacutee) la tempeacuterature et la seacutequence locale
Les eacutechanges isotopiques HD sont fortement deacutependants du pH ce qui est un point
extrecircmement important qui est utiliseacute pour leur analyse par spectromeacutetrie de masse La
reacuteaction peut s‟effectuer par des meacutecanismes de catalyse acide ou basique (II133) Le
facteur chimique kch s‟exprime comme suit
kch = kD3O+ [D3O+] + kOD
- [OD-] + kD2O
ougrave kD3O+ et kOD- sont les constantes d‟eacutechange en catalyse acide et en catalyse basique
respectivement
Des eacutetudes sur des peptides modegraveles des polyalanines ont montreacute que kOH- est supeacuterieure
d‟un facteur 108 agrave kH3O+ (137) Le pH influence donc les vitesses d‟eacutechange qui sont
44
principalement conditionneacutees par les ions OH- pour des pH supeacuterieurs agrave 3 et par les ions H3O
+
pour des pH infeacuterieurs agrave 3
Ainsi la constante de vitesse d‟eacutechange kch peut ecirctre relieacutee au pD (Fig I 11) Le minimum
d‟eacutechange se produit pour un pD voisin de 2-3 pour lequel les eacutechanges dus agrave la catalyse
acide sont eacutequivalents agrave ceux dus agrave la catalyse basique (pDmin)
pH
T(degC)
Fig I 11 Scheacutema repreacutesentant le taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium en fonction du pH
La plupart des hydrogegravenes eacutechangeables des chaicircnes lateacuterales ont des pHmin plus grands
que ceux des hydrogegravenes d‟amide Ainsi lorsque le pH est ajusteacute agrave 25 pour minimiser
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse les hydrogegravenes
des chaicircnes lateacuterales continuent de s‟eacutechanger par catalyse acide agrave l‟exception des Hε et Hη de
l‟arginine
Les vitesses d‟eacutechange HD sont eacutegalement deacutependantes de la tempeacuterature Elles sont
multiplieacutees par trois pour chaque increacutement de 10degC (138) Ainsi lorsque l‟on veut minimiser
les eacutechanges une diminution de la tempeacuterature de 20degC agrave 0degC conduit agrave une diminution de la
vitesse d‟eacutechange d‟un facteur 10 ce qui n‟est pas neacutegligeable
Le facteur chimique kch est principalement affecteacute par des changements de tempeacuterature En
effet la constante d‟ionisation de l‟eau varie avec la tempeacuterature alteacuterant les concentrations
de catalyseurs disponibles pour l‟eacutechange Par ailleurs agrave basse tempeacuterature les coefficients de
diffusion sont eacutegalement modifieacutes et la probabiliteacute de collision entre le donneur de proton et
45
le receveur diminue conduisant agrave un nombre de transfert (et donc un taux d‟eacutechange) moins
grand Le facteur chimique kch s‟exprime donc plutocirct comme suit
kch (t) = kD3O+ (t) [D3O+] + kOD
- (t) [OD-] + kD2O (t)
Les expeacuteriences d‟eacutechange HD s‟effectuent agrave pD physiologique pendant des temps
d‟incubation dans D2O variables et agrave une tempeacuterature adapteacutee agrave la proteacuteine d‟inteacuterecirct Pour ne
garder que les deuteacuteriums eacutechangeacutes avec les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques et
donc pour s‟affranchir de ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes la proteacuteine est remise
dans de l‟eau leacutegegravere (H2O) avant analyse Les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales sont alors
rapidement reacute-eacutechangeacutes en hydrogegravenes Mais cette eacutetape doit ecirctre controcircleacutee afin de ne pas reacute-
eacutechanger eacutegalement les deuteacuteriums d‟amide en hydrogegravenes Ainsi pour diminuer au
maximum les vitesses d‟eacutechange la reacuteaction d‟eacutechange est arrecircteacutee en ajoutant de l‟eau (H2O)
agrave pH acide (25) et en diminuant brusquement la tempeacuterature de l‟eacutechantillon (0degC) C‟est
cette approche de deacutemarquage dans H2O des chaicircnes lateacuterales avant analyse que nous avons
choisie pour ma thegravese D‟autres approches peuvent neacuteanmoins ecirctre envisageacutees comme le
marquage de la proteacuteine suivie de l‟analyse de tous les deuteacuteriums (139) Dans ce dernier cas
il ny a pas d‟eacutetape de deacutemarquage
Enfin les vitesses d‟eacutechanges des hydrogegravenes d‟amide dans une proteacuteine ou dans un
peptide sont sensibles aux effets de blocage steacuterique ou inductif lieacutes agrave la preacutesence proche de
certaines chaicircnes lateacuterales (138 140) Les effets inductifs sont dus principalement agrave la
preacutesence de groupements voisins attracteurs d‟eacutelectrons (chaicircnes lateacuterales polaires) qui vont
augmenter l‟aciditeacute des protons d‟amide en diminuant le pK favorisant la deacuteprotonation
Dans le cas d‟une catalyse basique la vitesse d‟eacutechange est donc augmenteacutee Les effets
d‟encombrement steacuterique sont quant agrave eux lieacutes agrave la preacutesence de reacutesidus aliphatiques
(isoleucine par exemple) ou aromatiques Les chaicircnes lateacuterales de ces amides amineacutes bloquent
steacuteriquement l‟interaction entre le catalyseur et le squelette polypeptidique ralentissant
l‟eacutechange
L‟additiviteacute de ces deux pheacutenomegravenes a eacuteteacute eacutetudieacutee en deacutetails et a permis d‟eacutetablir une
eacutequation pour kch tenant compte de facteurs correctifs associeacutes agrave la nature des chaicircnes lateacuterales
des acides amineacutes voisins (agrave droite et agrave gauche du reacutesidu d‟inteacuterecirct) pour une catalyse acide A
ou basique B
46
kch (t) = kD3O+ (t) (Agauche x Adroite) [D3O+] + kOD
- (t) (Bgauche x Bdroite) [OD-]
+ kD2O (t) (Bgauche x Bdroite)
I2133 Catalyse de la reacuteaction
Les eacutechanges peuvent se produire soit par catalyse basique soit par catalyse acide (Fig I
12) Dans les conditions physiologiques dans lesquelles les proteacuteines et les peptides se
trouvent geacuteneacuteralement la catalyse basique est la plus freacutequente
Fig I 12 Catalyse basique ou acide permettant lrsquoeacutechange isotopique drsquoun hydrogegravene drsquoamide
sur le squelette polypeptidique
La premiegravere eacutetape en catalyse basique est l‟abstraction d‟un proton amidique par un ion
hydroxyde (OD-) et formation d‟un anion imidate Cet imidate est ensuite reprotoneacute par D2O
pour proceacuteder agrave l‟eacutechange Nous venons de voir preacuteceacutedemment que le facteur chimique kch est
minimal pour un pDasymp25 Au-delagrave d‟un pD eacutegal agrave 4 il augmente d‟un ordre de grandeur
(facteur 10) avec chaque uniteacute de pD atteignant des valeurs de l‟ordre de 103 s
-1 pour un pD
de 9 (141) (Fig I 11) La possibiliteacute de reacutegler kch en controcirclant la basiciteacute du solvant est
cruciale dans beaucoup de strateacutegies HDXMS
I2134 Cineacutetique drsquoeacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de
protection
Comme la vitesse d‟eacutechange N-H N-D est moduleacutee par les proprieacuteteacutes
conformationnelles des proteacuteines il devient alors possible d‟utiliser la technique des eacutechanges
isotopiques HD pour les eacutetudes structurales Les reacutegions structureacutees possegravedent une multitude
de liaisons hydrogegravenes intramoleacuteculaires N-Hhellip
O=C qui sont autant de sites proteacutegeacutes
difficilement accessibles par les moleacutecules de solvant Les vitesses d‟eacutechange isotopique vont
47
donc varier consideacuterablement selon l‟implication de l‟hydrogegravene concerneacute dans des structures
secondaires stables (142) ou la flexibiliteacute de la reacutegion peptidique agrave laquelle il appartient (141)
ou encore suivant sa distance par rapport agrave la surface de la proteacuteine (143) Ces diffeacuterents
facteurs contribuent agrave la protection des hydrogegravenes d‟amide telle que la constante de vitesse
globale d‟eacutechange kHDX soit bien infeacuterieure agrave kch Le facteur de protection P correspondant est
donneacute par la formule qui suit
P= kchkHDX
ougrave kHDX est la constante de vitesse globale d‟eacutechange d‟un hydrogegravene d‟amide donneacute dans la
conformation native d‟une proteacuteine et kch la constante de vitesse d‟eacutechange de l‟hydrogegravene
concerneacute si celui-ci se trouvait dans un peptide non structureacute P est la probabiliteacute que
l‟hydrogegravene en question soit proteacutegeacute agrave l‟accegraves du solvant (et aux catalyseurs) P est alors
deacutependant de l‟accessibiliteacute au solvant et de la participation de l‟hydrogegravene concerneacute agrave des
liaisons hydrogegravene Le facteur de protection peut exceacuteder parfois la valeur de 106 pour une
proteacuteine dans sa conformation native replieacutee
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique drsquoeacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines
Neacuteanmoins mecircme un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute peut ecirctre eacutechangeacute En effet une proteacuteine
en solution est une moleacutecule dynamique Autrement dit mecircme dans son eacutetat natif replieacute elle
peut subir des fluctuations conformationnelles reacutesultant de son deacutepliement pendant un temps
tregraves court L‟eacutechange isotopique d‟un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute ne peut donc avoir lieu que
lorsque la proteacuteine adopte des d‟eacutetats intermeacutediaires transitoires deacuteplieacutes Ce deacutepliement peut
ecirctre localiseacute ou impliquer la proteacuteine dans sa globaliteacute Les constantes de vitesse du
deacutepliement et du repliement sont deacutesigneacutees par k1 et k-1 respectivement et le meacutecanisme
geacuteneacuteral de l‟eacutechange peut ecirctre deacutecrit comme suit
avec l‟existence d‟une combinaison unique de valeurs de k1 k-1 et pour chaque hydrogegravene
d‟amide En accord avec ce modegravele l‟eacutechange isotopique ne peut avoir lieu qu‟apregraves une
rupture transitoire des liaisons intramoleacuteculaires de la proteacuteine replieacutee rendant les hydrogegravenes
48
d‟amide eacutechangeables Puis la proteacuteine se replie pour revenir agrave un eacutetat natif La constante de
vitesse globale d‟eacutechange kHDX est donneacutee par la formule suivante
Deux modegraveles de cineacutetique EX1 et EX2 (123 144) sont discuteacutes agrave partir de ce meacutecanisme
d‟eacutechange Le premier modegravele (EX1) (Fig I 13) est caracteacuteriseacute par
kch gtgt k-1gt k1
impliquant que tous les hydrogegravenes d‟amide sont eacutechangeacutes avant le repliement de la proteacuteine
au cours du tout premier eacuteveacutenement de deacutepliement L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc
le deacutepliement de la proteacuteine ce qui se traduit par
kHDX= k1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 13 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX1
Inversement le second modegravele (EX2) (Fig I 14) est caracteacuteriseacute par
k-1 gtgt kchgtgt k1
menant agrave l‟expression
kHDX= K1kch
ougrave K1=k1k-1 est le constante d‟eacutequilibre de deacutepliement de la proteacuteine native Comme la
proteacuteine se replie plus vite qu‟elle n‟eacutechange la probabiliteacute d‟eacutechange pendant un seul
49
eacuteveacutenement deacutepliementrepliement est faible L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc la
vitesse d‟eacutechange kch et l‟eacutechange d‟un hydrogegravene a geacuteneacuteralement lieu apregraves un grand nombre
d‟eacutetapes de deacutepliementrepliement Dans ce modegravele le facteur de protection est donneacute par
P= K1-1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 14 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX2
Dans des conditions physiologiques le premier modegravele (EX1) est moins freacutequent que le
second (EX2) Les vitesses d‟eacutechange par le meacutecanisme EX2 deacutependent de maniegravere lineacuteaire
de la concentration en catalyseurs alors que dans le meacutecanisme EX1 la vitesse ne varie pas
avec la quantiteacute de catalyseurs Ce dernier est geacuteneacuteralement forceacute par l‟utilisation de
conditions deacutenaturantes telles que des tempeacuteratures ou un pH eacuteleveacutes ou encore par
l‟utilisation de chaotropes On peut neacuteanmoins rencontrer le cas de proteacuteines pour lesquelles
diffeacuterentes reacutegions s‟eacutechangent simultaneacutement avec des cineacutetiques d‟ordre 1 (modegravele EX1) et
2 (modegravele EX2) Par ailleurs il ne faut pas perdre de vue que mecircme une proteacuteine native peut
preacutesenter des hydrogegravenes d‟amide non proteacutegeacutes de faccedilon permanente ie exposeacutes au solvant
et non impliqueacutes dans des liaisons hydrogegravene L‟eacutechange agrave ces sites est reacutealiseacute sans
deacutepliement de la proteacuteine la vitesse y est alors plus rapide (kHDXasympkch)
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines
Pour mesurer un taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans une proteacuteine en condition
laquo exchange-in raquo la premiegravere eacutetape consiste agrave l‟exposer agrave du deuteacuterium Il existe deux grandes
strateacutegies d‟incorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines L‟exposition aux deuteacuteriums
peut ecirctre reacutealiseacutee de maniegravere continue (marquage continu) ou pulseacutee (marquage pulseacute) La
meacutethode sera choisie en fonction du type d‟information que l‟on souhaite obtenir (145)
50
I221 Marquage continu
Il s‟agit de la meacutethode la plus simple utiliseacutee dans la plupart des eacutetudes HDXMS Elle
consiste agrave diluer d‟un facteur quinze agrave vingt une proteacuteine qui se trouve initialement dans son
tampon hydrogeacuteneacute dans un tampon identique mais contenant 100 de D2O (146)
L‟incorporation des deuteacuteriums est alors suivie en fonction du temps d‟exposition de la
proteacuteine en condition native dans le D2O Une dilution d‟au moins un facteur quinze permet
de s‟assurer qu‟une fois qu‟un hydrogegravene est remplaceacute par un deuteacuterium la reacuteaction ne
revient pas en arriegravere
Le marquage continu est alors poursuivi jusqu‟agrave ce que le temps maximum d‟exposition
aux deuteacuteriums choisi initialement soit atteint Typiquement il varie des minutes aux heures
(parfois mecircme aux jours) En pratique des aliquotes de la solution sont preacuteleveacutes
reacuteguliegraverement leur reacuteaction est brusquement arrecircteacutee et l‟analyse se fait par spectromeacutetrie de
masse
Au cours de l‟eacutechange la masse de la proteacuteine augmente progressivement avec
l‟incorporation en deuteacuteriums selon les paramegravetres de cineacutetique deacutecrits preacuteceacutedemment Les
reacutegions preacutesentant une conformation deacuteplieacutee pendant un temps tregraves long subiront des
eacutechanges plus rapides que d‟autres reacutegions ayant une conformation plus compacte D‟apregraves le
meacutecanisme geacuteneacuteral de l‟eacutechange le marquage continu permet d‟obtenir essentiellement des
informations sur la dynamique conformationnelle des proteacuteines dans des conditions
d‟eacutequilibre plutocirct que sur leur structure agrave proprement parler Cependant il existe un lien
eacutevident entre ces deux aspects En effet des reacutegions hautement structureacutees sont geacuteneacuteralement
moins dynamiques que des reacutegions deacutesordonneacutees
I222 Marquage pulseacute
Le marquage pulseacute est quant agrave lui essentiellement utiliseacute pour eacutetudier les meacutecanismes de
repliement des proteacuteines ainsi que pour deacutetecter et caracteacuteriser des eacutetats intermeacutediaires
transitoires (147)
Dans les expeacuteriences de marquage pulseacute une proteacuteine initialement deacutenatureacutee est
rapidement transfeacutereacutee dans un solvant approprieacute permettant le deacuteclenchement du processus de
51
repliement A des temps bien deacutefinis au cours de la reacuteaction la proteacuteine est ensuite exposeacutee agrave
du deuteacuterium pendant un temps tregraves court (typiquement 10 s ou moins) Comme le temps de
marquage est tregraves court seuls les hydrogegravenes d‟amide accessibles et eacutechangeables facilement
(ceux qui sont dans les parties non structureacutees de la proteacuteine ou dans les parties les plus
accessibles au solvant) sont deuteacutereacutes Des seacuteries de mesures sont effectueacutees en faisant varier
l‟intervalle de temps entre l‟initiation du repliement et le pulse de deuteacuterium De cette faccedilon
il est possible d‟obtenir des aperccedilus deacutetailleacutes de la seacutequence temporelle des eacuteveacutenements qui
conduisent la proteacuteine d‟un eacutetat deacuteplieacute agrave sa conformation native Les pulses de deuteacuterium
requiegraverent des conditions basiques (pD 8-10) pour s‟assurer qu‟un grand nombre d‟eacutechanges
isotopiques se produisent pendant l‟eacutetape courte de marquage La reacuteaction de marquage est
arrecircteacutee par une rapide baisse du pH et de la tempeacuterature (agrave pH 25 et agrave 0degC) de la solution ou
par l‟eacutevaporation du solvant pendant le processus d‟ionisation par eacutelectrospray lors
d‟expeacuteriences laquo on-line raquo HDXMS L‟usage d‟un systegraveme automatiseacute est neacutecessaire pour
reacutealiser des pulses sur des temps tregraves courts (lt 10 ms) et acceacuteder ainsi agrave des dynamiques tregraves
rapides
La deacutenaturation preacutealable de la proteacuteine est effectueacutee par l‟addition d‟un agent qui va
perturber sa structure (148) Ces agents sont geacuteneacuteralement des chaotropes mais peuvent
eacutegalement ecirctre des ligands qui vont venir se fixer sur la proteacuteine ou un simple changement de
tempeacuterature ou de pH
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par
spectromeacutetrie de masse
Les eacutechanges HD en solution sont donc devenus ces derniegraveres deacutecennies un outil
technique puissant pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines (149) Alors que la
plupart des eacutetudes HDX initiales utilisaient la RMN agrave haute reacutesolution (32) comme meacutethode
pour le suivi des cineacutetiques d‟eacutechange HD la spectromeacutetrie de masse occupe deacutesormais une
place de choix (150-153)
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN
C‟est le deacuteveloppement de meacutethodes de spectroscopie RMN multidimensionnelle de haute
reacutesolution (154-155) qui a permis d‟exploiter toute la puissance de la technique HDX (156)
52
La RMN est resteacutee pendant longtemps l‟outil de choix pour suivre les eacutechanges HD car de
ces deux isotopes seul l‟hydrogegravene conduit agrave un signal deacutetectable Ainsi remplacer des
hydrogegravenes d‟amide par des deuteacuteriums peut ecirctre facilement suivi en observant la disparition
des signaux correspondant dans les spectres RMN L‟analyse des eacutechanges HD par RMN
devient alors facile une fois que tous les signaux ont eacuteteacute attribueacutes Par ailleurs elle est reacutealiseacutee
en solution dans la continuiteacute du marquage rendant son interpreacutetation aiseacutee Un profil de
deuteacuteration en solution est observeacute en solution n‟engendrant pas de problegravemes quelconques
L‟eacutechange d‟un hydrogegravene par un deuteacuterium conduisant agrave un increacutement de masse de 1 Da
peut eacutegalement ecirctre suivi de maniegravere tregraves simple par spectromeacutetrie de masse Cette technique
plus reacutecente offre par ailleurs plusieurs avantages importants par rapport agrave la RMN Elle
permet des analyses plus rapides sur des systegravemes plus complexes tant par la diversiteacute que par
la taille avec moins de mateacuteriel initialement Neacuteanmoins l‟association HDXMS n‟atteint que
rarement la haute reacutesolution spatiale facilement accessible par la technique HDXRMN La
spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) est reacutecemment apparue comme une solution agrave ce
problegraveme faisant de la technique HDX-MSMS un candidat potentiel pour devenir une
meacutethode de choix pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo
Comme il a eacuteteacute dit preacuteceacutedemment la strateacutegie du marquage continu est choisie pour la
plupart des eacutetudes en HDXMS Elle consiste agrave suivre le taux de deuteacuteration des proteacuteines en
fonction de leur temps d‟exposition t agrave D2O pour deacutetecter le plus souvent des diffeacuterences en
reacuteponse agrave des modifications chimiques ou expeacuterimentales (157-158) agrave la liaison de ligands
(159-160) ou encore agrave la formation de complexes (161) L‟incorporation des deuteacuteriums peut
ecirctre mesureacutee au niveau de la proteacuteine entiegravere (eacutechange global) etou pour des courts segments
proteacuteiques (eacutechange local) Seulement la mesure de l‟eacutechange global ne preacutesente aucune
reacutesolution spatiale puisque elle est reacutealiseacutee pour l‟ensemble des hydrogegravenes d‟amide de la
proteacuteine Les expeacuteriences spatialement reacutesolues apportent quant agrave elles des informations sur
le comportement vis-agrave-vis de la deuteacuteration de reacutegions speacutecifiques de la proteacuteine
53
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS
Les expeacuteriences spatialement reacutesolues deacuterivent pour la plupart de l‟approche classique de
fragmentation enzymatique en solution (146 162-163) appeleacutee approche laquo bottom-up raquo La
digestion des proteacuteines par des proteacuteases conduisant agrave des fragments peptidiques pour
lesquels le taux d‟eacutechange peut ecirctre calculeacute a permis une premiegravere ameacutelioration de la
reacutesolution de l‟approche (164-166) La digestion proteacuteolytique a ensuite eacuteteacute associeacutee agrave une
seacuteparation chromatographique en phase liquide coupleacutee en ligne agrave la spectromeacutetrie de masse
(LC-MS) (141 167) Dans le cadre de l‟analyse des eacutechanges HD par LC-MS des meacutethodes
chromatographiques de courte dureacutee et agrave basse tempeacuterature doivent ecirctre impeacuterativement mises
au point afin de minimiser le laquo back-exchange raquo (168-169) Pour reacutealiser une analyse rapide
des colonnes courtes sont utiliseacutees Bien qu‟elles ne permettent qu‟une seacuteparation grossiegravere
des peptides elles limitent neacuteanmoins le deacutemarquage L‟utilisation de la spectromeacutetrie de
masse agrave tregraves haute reacutesolution est importante car elle peut permettre une identification plus
fiable des peptides sur la base de leur masse preacutecise L‟approche classique est dutiliser une
seacuteparation par HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo) et de placer toute la
chaicircne chromatographique dans une armoire reacutefrigeacutereacutee Notons quun systegraveme commercial
optimiseacute pour limiter leacutechange inverse a eacuteteacute deacuteveloppeacute reacutecemment par la socieacuteteacute Waters Le
choix d‟une meacutethode HPLC et non d‟une chaicircne de nano-chromatographie liquide conduit agrave
utiliser une quantiteacute importante d‟eacutechantillon C‟est la raison pour laquelle notre eacutequipe a mis
au point une approche par nano-LC pour l‟eacutetude des eacutechanges HD en solution Ce travail a
fait lobjet dune partie de la thegravese de Magalie Duchateau au laboratoire Les diffeacuterents
systegravemes d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse seront plus
deacutetailleacutes dans le Chap IV Le plus souvent les peptides sont analyseacutes en utilisant
l‟eacutelectrospray comme mode d‟ionisation (LCESI-MS) La technique MALDI-MS est moins
communeacutement utiliseacutee (170-172)
Choix des enzymes
Bien eacutevidemment la proteacuteolyse doit ecirctre reacutealiseacutee dans les conditions expeacuterimentales de
l‟arrecirct de la reacuteaction (agrave pH final 25 et agrave 0degC) afin d‟empecirccher l‟eacutechange inverse (D H)
avant l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Il est par conseacutequent neacutecessaire d‟utiliser
des proteacuteases acides L‟enzyme la plus couramment utiliseacutee pour ce type d‟expeacuteriences est la
pepsine (173) Cette enzyme est non speacutecifique contrairement agrave la trypsine ou la
chymotrypsine mais elle est active dans les conditions expeacuterimentales requises et peut geacuteneacuterer
de nombreux peptides chevauchants permettant de localiser des zones d‟inteacuterecirct avec une
54
meilleure reacutesolution Cependant cette faible speacutecificiteacute (174) rend neacutecessaire une eacutetape
preacutealable aux eacutechanges HD d‟identification des peptides obtenus par spectromeacutetrie de masse
en tandem
La reacutesolution spatiale attendue avec l‟approche de digestion enzymatique agrave la pepsine est
de l‟ordre de 5 agrave 10 acides amineacutes Elle est limiteacutee par la taille des fragments geacuteneacutereacutes par
l‟eacutetape de digestion et le nombre de peptides chevauchants En revanche l‟utilisation de
proteacuteases immobiliseacutees sur des colonnes semble permettre d‟une part de standardiser le
protocole HDXMS et d‟autre part dans certains cas d‟atteindre une reacutesolution spatiale
proche de l‟acide amineacute pregraves (175-176) Notons le deacuteveloppement reacutecent d‟une nouvelle
approche baseacutee sur une digestion agrave la pepsine mais utilisant des conditions de haute pression
(177) semblant encore ameacuteliorer les reacutesultats
D‟autres proteacuteases acides peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutees mais les conditions
expeacuterimentales imposent qu‟elles soient capables de digeacuterer leur substrat en moins de cinq
minutes afin de minimiser l‟eacutechange inverse L‟utilisation combineacutee de diffeacuterentes proteacuteases
permet de geacuteneacuterer un grand nombre de peptides chevauchants et ainsi d‟augmenter
consideacuterablement la reacutesolution spatiale (178) La proteacutease de type XIII d‟Aspergillus saitoi
(179) ainsi que celle de type XVIII extraite des diffeacuterentes espegraveces de Rhizopus (178) ou
encore plus reacutecemment la plasmepsine II de Plasmodium falciparum (180) peuvent ecirctre
utiliseacutees dans les eacutetudes HDXMS (172 179 181-182) Par ailleurs une version recombinante
de la proteacutease de type XVIII vient d‟ecirctre mise au point Elle permettrait l‟utilisation d‟un
rapport enzymeproteacuteine beaucoup plus faible qu‟avec la version sauvage (183)
Une meacutethode permettant de geacuteneacuterer un tregraves grand nombre de peptides chevauchants baseacutee
sur l‟utilisation de deux proteacuteases acides et de les identifier efficacement et preacuteciseacutement a
reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee pour les analyses HDXMS (184-185) La difficulteacute de lanalyse
du fait de la grande quantiteacute de donneacutees geacuteneacutereacutees par la proteacuteolyse (nombreux peptides
chevauchants) combineacutee agrave la complexiteacute des informations obtenues par HDX (incorporation
des deuteacuteriums perte du marquage) a encourageacute le deacuteveloppement d‟une plateforme ougrave les
expeacuteriences et le traitement de donneacutees sont totalement automatiseacutes (186)
Problegraveme de leacutechange inverse
Malgreacute une optimisation des conditions expeacuterimentales (diminution du pH et de la
tempeacuterature de l‟eacutechantillon ainsi que du temps d‟analyse) le pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse
55
reste un problegraveme crucial lors des eacutetapes de digestion proteacuteolytique et d‟analyse des
fragments peptidiques En effet chaque clivage enzymatique conduit agrave une perte
d‟information au niveau de deux sites eacutechangeables Les sites concerneacutes sont l‟hydrogegravene
d‟amide du squelette peptidique qui a eacuteteacute cliveacute et converti en amine libre et celui adjacent agrave
l‟extreacutemiteacute N-terminale (168) Par ailleurs le deacutemarquage peut eacutegalement avoir lieu au cours
de l‟eacutetape de digestion Or la perte totale de la deuteacuteration au niveau de sites particuliers tels
que ceux proteacutegeacutes par une interaction proteacuteine-partenaire signifierait que les surfaces
d‟interaction de macroassemblages ne pourraient pas ecirctre deacutetermineacutees par cette approche
C‟est la raison pour laquelle plusieurs tentatives de correction systeacutematique du laquo back-
exchange raquo ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees (187) Une meacutethode de reacuteajustement a ainsi eacuteteacute deacutecrite par
Zhang et al (141) Briegravevement elle consiste agrave mesurer le taux d‟eacutechange de peptides
complegravetement deuteacutereacutes et agrave le comparer agrave la reacutefeacuterence sans eacutechange Les analyses sont
reacutealiseacutees dans les mecircmes conditions de digestion et de seacuteparation par HPLC Le facteur de
correction du laquo back-exchange raquo relative agrave l‟expeacuterience est alors deacutetermineacute Mais cela
implique que le deacutemarquage soit identique pour tous les sites eacutechangeables ce qui n‟est pas le
cas (I2132) Le taux d‟eacutechange inverse est consideacuterablement diffeacuterent d‟un site agrave un autre
site et donc d‟un peptide agrave un autre peptide Il peut neacuteanmoins ecirctre preacutedit pour des peptides
non structureacutes en utilisant les paramegravetres de calcul de kch suivant la formule donneacutee au
I2132 (188)
Exemples de complexes proteacuteiques analyseacutes
Malgreacute les problegravemes poseacutes par l‟eacutechange inverse et la reacutesolution relativement faible de
l‟approche un des avantages majeurs des approches laquo bottom-up raquo est leur utilisation pour
l‟eacutetude de complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire puisque ce sont des peptides issus d‟une
digestion enzymatique qui sont analyseacutes Ainsi cette approche a eacuteteacute utiliseacutee par l‟eacutequipe de
V Wysocki afin d‟eacutetudier des complexes proteacuteiques proteacuteine chaperonne-substrat et ainsi de
mieux comprendre leur meacutecanisme d‟action (I113) (189) Il s‟agit de proteacuteines s‟associant
pour former des oligomegraveres de tregraves haut poids moleacuteculaire Les complexes qui ont eacuteteacute
analyseacutes par la technique HDXMS coupleacutee agrave une approche laquo bottom-up raquo sont les suivants
TaHsp169-MDH (gt 1000 kDa) et PsHsp181-MDH (~600-700 kDa) Un pourcentage de
couverture peptidique de 100 a eacuteteacute obtenu pour les deux proteacuteines Par ailleurs une eacutetude
du complexe Arp23 avait permis de mettre en eacutevidence finement des modifications de
structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave l‟ATP ou agrave des proteacuteines activatrices telles
que les proteacuteines WASp en utilisant l‟approche par marquage avec les radicaux hydroxyles
(75) (I1225) Plus reacutecemment le complexe Arp23 a eacuteteacute analyseacute par une approche
56
compleacutementaire HDXMS afin de mettre en eacutevidence des modifications de structure et de
dynamique reacutesultant de l‟activation par les proteacuteines WASp et de comparer les reacutesultats avec
les modegraveles du meacutecanisme preacuteexistants Pour autant que nous sachions le complexe Arp23
de sept sous-uniteacutes proteacuteiques avec un poids moleacuteculaire de 220 kDa est le plus important
macroassemblage jamais eacutetudieacute par HDXMS Ceci a eacuteteacute possible gracircce agrave une analyse par
laquo bottom-up raquo (190)
Comment ameacuteliorer la reacutesolution
Une faccedilon d‟augmenter la reacutesolution des approches bottom-up serait de recourir agrave la
fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques afin de localiser plus preacuteciseacutement
les deuteacuteriums dans la seacutequence D‟une maniegravere geacuteneacuterale la fragmentation peut ecirctre reacutealiseacutee
de diffeacuterentes maniegraveres dans un spectromegravetre de masse Tout d‟abord il est possible de
fragmenter les ions dans la source (laquo In-Source Decay raquo ou ISD) en les acceacuteleacuterant dans une
reacutegion de haute pression mais ce processus ne conduit agrave aucune seacutelectiviteacute et pose donc des
problegravemes quant agrave l‟analyse des meacutelanges La spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS)
peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour la dissociation des peptides Elle est adapteacutee agrave l‟eacutetude des
meacutelanges apporte des informations structurales de qualiteacute et est doteacutee d‟une grande
sensibiliteacute Elle consiste agrave seacutelectionner un ion preacutecurseur par un premier analyseur agrave le
fragmenter (par diffeacuterentes techniques d‟activation) et agrave analyser les fragments obtenus agrave
l‟aide d‟un autre analyseur (le mecircme pour les instruments de type trappe ionique)
Neacuteanmoins comme cela sera deacutetailleacute dans le paragraphe suivant le choix de la technique
d‟activation pour des peptides deuteacutereacutes est tregraves important pour obtenir des informations
valables
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques
L‟objectif des expeacuteriences de MSMS sur les peptides deuteacutereacutes est de pouvoir preacuteciseacutement
localiser les deuteacuteriums incorporeacutes dans la seacutequence au niveau des diffeacuterents hydrogegravenes
d‟amide afin d‟obtenir une reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves En theacuteorie la spectromeacutetrie de
masse en tandem constitue donc un moyen inteacuteressant et simple pour ameacuteliorer la reacutesolution
des approches HDXMS
Il existe diffeacuterents modes d‟activation susceptibles d‟ecirctre utiliseacutes pour fragmenter les
peptides Dans une approche proteacuteomique classique la meacutethode de dissociation induite par
57
collision (CID) est largement preacutefeacutereacutee Le principe consiste agrave fragmenter la moleacutecule par
collision avec un gaz inerte (heacutelium diazote argon ou xeacutenon) Malheureusement dans le
cadre d‟eacutetudes HDXMS ces meacutethodes conventionnelles de fragmentation par activation
collisionnelle de proteacuteines et peptides protoneacutes ont rapidement eacuteteacute eacutecarteacutees En effet bien que
la litteacuterature soit contradictoire il a eacuteteacute montreacute qu‟elles conduisent tregraves souvent agrave une
redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums partielle ou totale le long de la chaicircne polypeptidique
(y compris au niveau des chaicircnes lateacuterales) (191-194) pendant l‟eacutetape de fragmentation Le
processus de migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes en phase gazeuse est appeleacute
laquo scrambling raquo en anglais
En fait ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo peut se produire agrave diffeacuterents endroits du
spectromegravetre de masse Le premier est lors de la deacutesolvatation des ions encore solvateacutes dans la
source dans les toutes premiegraveres eacutetapes preacuteceacutedant leur transmission vers l‟analyseur (195-
196) Une autre possibiliteacute est donc dans la cellule de collision au moment de la
fragmentation Le laquo scrambling raquo est induit par un apport d‟eacutenergie vibrationnelle conduisant
agrave un eacutechange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums avant la dissociation Il est clair que le
meacutecanisme de fragmentation des peptides protoneacutes dit meacutecanisme du proton mobile
proposeacute par Simon Gaskell (197) et Vicky Wysocki (198-200) n‟est pas en faveur d‟une
conservation de la position des deuteacuteriums d‟amide avant la fragmentation En effet ce
meacutecanisme (Fig I 15) fait l‟hypothegravese que preacutealablement agrave la fragmentation un proton
migre des sites les plus basiques de la moleacutecule vers un azote d‟amide eacutevegravenement preacutealable agrave
une cyclisation pour former des ions b et y Cette eacutetape eacutetant a priori reacuteversible les
deuteacuteriums peuvent ecirctre meacutelangeacutes avec des hydrogegravenes agrave ce moment lagrave
HN
NHO
R1
R2
OR3
R1
O
N
O
R2
H+
HN
NH2O
R1
R2
OR3
H3N Nter+
+
Nter
Cter Cter
R3
NH2
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
NH
R3
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
H3N
R3
Cter
+
ion b ion y
Proton
Mobile
Attaque
Nucleacuteophile
Reacutearrangement
Fig I 15 Formation des ions b et y (201)
58
Le laquo scrambling raquo conduit donc agrave une perte d‟information au niveau du profil de
deuteacuteration rendant l‟analyse difficilement interpreacutetable La litteacuterature indique que ce
pheacutenomegravene semble deacutependre de la seacutequence du peptide fragmenteacute (202) mais eacutegalement de
l‟eacutenergie de collision apporteacutee et de la flexibiliteacute de la chaicircne polypeptidique en phase
gazeuse (195 203) Ces deux derniers facteurs joueraient un rocircle deacuteterminant dans le
reacutearrangement aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes le long du squelette peptidique
avant la dissociation Une faible eacutenergie de collision et donc une lente activation des ions en
phase gazeuse seraient favorables agrave une migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes En
revanche la reacuteduction de la flexibiliteacute des ions proteacuteiques pourrait diminuer la mobiliteacute du
proton dans des conditions d‟activation collisionnelle de basse eacutenergie Le pheacutenomegravene du
laquo scrambling raquo a pu ecirctre mis en eacutevidence par l‟utilisation de peptides modegraveles (204-206) Le
principe des peptides seacutelectivement deuteacutereacutes deacuteveloppeacutes par T Jorgensen sera deacutetailleacute dans
le Chap II
La conclusion des eacutetudes de fragmentation par CID de peptides deuteacutereacutes est que les
meacutethodes d‟activation conduisant agrave une augmentation progressive de l‟eacutenergie vibrationnelle
(CID IRMPD SORI-CID) (195) ne peuvent pas ecirctre utiliseacutees pour localiser les deuteacuteriums
dans la seacutequence peptidique De ce fait d‟autres meacutethodes de fragmentation en phase gazeuse
ont eacuteteacute investigueacutees Parmi elles les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons telles que l‟ECD
et l‟ETD se sont reacuteveacuteleacutees tregraves prometteuses (207-209)
L‟ECD est une technique de dissociation speacutecifique des spectromegravetres de masse FT-ICR
Son principe repose sur la capture exothermique (~4-5 eV) d‟un eacutelectron par une espegravece
multichargeacutee (210) L‟ion proteacuteique multichargeacute est irradieacute par un faisceau d‟eacutelectrons de
faible eacutenergie (lt 1 eV) Apregraves capture d‟un eacutelectron l‟ion radicalaire se fragmente La
reacuteactiviteacute est diffeacuterente par rapport aux meacutethodes par activation collisionnelle en raison de la
preacutesence d‟un eacutelectron dans le systegraveme et notamment le meacutecanisme du proton mobile n‟est
pas celui qui explique la fragmentation rendant son utilisation possible pour analyser des
peptides ou des proteacuteines deuteacutereacutes (139 207 211-212) En ECD on n‟observe pas la rupture
des liaisons peptidiques (pour conduire agrave des ions b et y) ni geacuteneacuteralement la perte de
modifications post-traductionnelles labiles comme ce qui est observeacute pour l‟activation par
CID Le site de clivage quasi-speacutecifique en ECD est la liaison N-Cα entraicircnant la formation
d‟ions fragments de type c et z le plus souvent mais aussi parfois a b et y (Fig I 16) Une
charge positive eacutetant neutraliseacutee par un eacutelectron la technique d‟ECD ne peut ecirctre utiliseacutee que
sur des ions preacutecurseurs qui sont au minimum deux fois chargeacutes (doublement protoneacutes)
59
Fig I 16 Nomenclature des fragments peptidiques issus de la spectromeacutetrie de masse en
tandem
L‟ETD qui a reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee est une technique similaire agrave l‟ECD conduisant
eacutegalement agrave la formation d‟ions fragments de type c et z (213) La fragmentation repose sur
la reacuteaction ionion qui se produit entre le peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire Cet
anion se trouve seacutequestreacute dans un piegravege agrave ions Quand les deux ions se trouvent agrave une distance
suffisante il se produit le transfert d‟un eacutelectron de l‟anion vers le peptide chargeacute
positivement ce qui induit sa fragmentation L‟avantage majeur de l‟ETD est qu‟il peut ecirctre
reacutealiseacute sur une varieacuteteacute de types d‟instruments standards utilisant la radiofreacutequence d‟un champ
eacutelectrique oscillant pour pieacuteger les ions (213-215) L‟ECD quant agrave lui neacutecessite des champs
eacutelectrique et magneacutetique stables disponibles exclusivement sur des spectromegravetres de masse
FT-ICR (207 216)
Bien que le meacutecanisme des techniques ECD et ETD ne soit pas encore complegravetement
eacutelucideacute il passe par une voie alternative de fragmentation de type radicalaire dont on a pu
discuter du caractegravere ergodique ou non (217) n‟induisant pas de laquo scrambling raquo pourvu que
les paramegravetres instrumentaux soient controcircleacutes et optimiseacutes pour la minimisation du
pheacutenomegravene Il s‟agit d‟une part de minimiser les paramegravetres des optiques de transfert ionique
tels que le potentiel de deacutesolvatation des ions et la tension des lentilles du tube de transfert et
d‟autre part de minimiser l‟excitation vibrationnelle des ions pendant leur filtration et avant
leur fragmentation en augmentant le paramegravetre fenecirctre d‟isolation (207) Il a eacuteteacute montreacute que la
fragmentation des ions par ECD se produisait avant que l‟eacutenergie puisse ecirctre redistribueacutee au
niveau du site de clivage de la liaison le plus favorable (210 218-219) Cette rapide et
efficace meacutethode d‟activation conduit donc agrave une limitation du laquo scrambling raquo et permet donc
de localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence peptidique (207) Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves de l‟incorporation des deuteacuteriums a eacutegalement pu ecirctre obtenue par
60
fragmentation ETD au niveau de peptides seacutelectivement marqueacutes (208) ainsi que de peptides
proteacuteolytiques issus de la digestion enzymatique de la β2-microglobuline deuteacutereacutee (209)
L‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu est calculeacutee en faisant la diffeacuterence des contenus en
deuteacuteriums de fragments conseacutecutifs pour les seacuteries d‟ions c (c2-c1 c3-c2 hellip) et z (z2-z1 z3-z2
hellip) Une cineacutetique deacutechange HD par acide amineacute peut eacutegalement ecirctre obtenue en suivant
l‟incorporation des deuteacuteriums des ions c ou z au cours du temps
Cette approche combinant la digestion enzymatique en solution et la fragmentation ETD en
phase gazeuse est devenue tregraves reacutecemment assez robuste pour ecirctre utiliseacutee sur de vrais
systegravemes biologiques Elle a eacuteteacute complegravetement automatiseacutee en plateforme HDX (220)
La spectromeacutetrie de masse en tandem peut donc ecirctre utiliseacutee pour ameacuteliorer la reacutesolution
des expeacuteriences utilisant les eacutechanges HD La fragmentation en phase gazeuse des ions
peptidiques obtenus apregraves digestion enzymatique du systegraveme biologique dinteacuterecirct permet donc
d‟obtenir la localisation preacutecise des deuteacuteriums dans la seacutequence Pour cela elle doit ecirctre
reacutealiseacutee en utilisant des meacutethodes alternatives d‟activation par les eacutelectrons (ECD ETD) tout
en controcirclant les processus de deacutesolvatation transfert et seacutelection des ions preacutealables agrave la
fragmentation (207-208) Ces meacutethodes ayant eacutegalement fait leur preuve pour la
fragmentation de proteacuteines entiegraveres (221-222) il est rapidement apparu qu‟il serait possible de
les utiliser dans des approches dites laquo top-down raquo pour des eacutetudes HDXMS Dans cette
derniegravere approche l‟eacutetape de digestion enzymatique n‟est plus requise
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD
L‟approche laquo top-down raquo s‟affranchit donc de l‟eacutetape de proteacuteolyse et de seacuteparation des
peptides en chromatographie liquide Au lieu de cela la proteacuteine est introduite entiegravere dans le
spectromegravetre de masse et fragmenteacutee directement en phase gazeuse (223)
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD
Il existe plusieurs modes d‟activation pour la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines
entiegraveres Les meacutethodes dissociatives par capture ou transfert deacutelectron (ECD ou ETD) sont
particuliegraverement utiliseacutees dans ce type d‟approche
61
Des couvertures de seacutequence importantes peuvent ecirctre obtenues par ces approches sur
proteacuteines entiegraveres conduisant eacutegalement agrave la localisation de modifications post-
traductionnelles (MPT) (223-225) Le laboratoire pionnier dans le domaine est celui de Neil
Kelleher aux USA qui a deacuteveloppeacute une veacuteritable approche inteacutegreacutee pour lanalyse
proteacuteomique laquo top-down raquo allant de la seacuteparation des proteacuteines entiegraveres agrave lanalyse
automatiseacutee des spectres MSMS complexes obtenus lorsque lon fragmente une proteacuteine
entiegravere Ses proteacuteines de preacutedilection sont les histones petites proteacuteines de 13 kDa que lon
peut retrouver sous un grand nombre disoformes diffeacuterentes (mecircme stucture primaire mais
modifications post-traductionnelles diffeacuterentes et dynamiques) lieacutees au code des histones
Lavantage majeur des approches laquo top-down raquo en proteacuteomique est de permettre non
seulement lidentification des isoformes de proteacuteines par simple mesure de masse mais aussi
dobtenir des informations structurales (preacutesence de MPT notamment) sur lensemble de la
seacutequence Cela nest pas possible par des approches classiques par laquo bottom-up raquo car tous les
peptides issus de la digestion ne sont pas retrouveacutes lors de lanalyse
Neacuteanmoins elles preacutesentent encore certaines limitations comme leacutetape cruciale de
seacuteparation des proteacuteines entiegraveres le poids moleacuteculaire des proteacuteines qui peuvent ecirctre
fragmenteacutees et la sensibiliteacute Le problegraveme majeur rencontreacute avec les proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire est leur propension agrave se replier en phase gazeuse formant un reacuteseau de liaisons
hydrogegravene qui conduit agrave une perte defficaciteacute au niveau de la fragmentation par ECD ou
ETD En effet bien que leacutelectron soit captureacute par un site peptidique et la liaison N-Cα
rompue les deux morceaux de la proteacuteine (parties N-terminales et C-terminales) restent
lieacutees entre elles et les fragments ne peuvent ecirctre deacutetecteacutes Une solution consiste agrave introduire
une eacutetape de chauffage lent des ions (photons infrarouge par exemple) pour rompre ce reacuteseau
de liaisons hydrogegravene avant ou apregraves la capture de leacutelectron Neacuteanmoins si lapproche
fonctionne souvent bien dans le cas de proteacuteines non deuteacutereacutees elle ne peut ecirctre envisageacutee
dans le cadre des eacutetudes HDX car le chauffage lent conduira agrave un eacutechange des hydrogegravenes et
des deuteacuteriums avant la fragmentation
62
I2332 Approches top-down et HDX
Dans les eacutetudes HDX le deacuteveloppement de l‟approche laquo top-down raquo ECD ou ETD comme
meacutethodologie alternative agrave l‟approche classique de laquo bottom-up raquo semble tregraves prometteur En
effet l‟approche laquo top-down raquo permet d‟une part d‟eacuteliminer le laquo back-exchange raquo relatif aux
eacutetapes de digestion enzymatique en solution et de seacuteparation en chromatographie liquide et
d‟autre part d‟obtenir une meilleure reacutesolution spatiale tout au moins pour des proteacuteines de
petite agrave moyenne taille (211)
La faisabiliteacute d‟expeacuteriences HDX par laquo top-down raquo ECD spatialement reacutesolues a eacuteteacute
reacutecemment deacutemontreacutee par Pan et al pour l‟eacutetude d‟une proteacuteine de 17 kDa (211) Il est
eacutegalement possible gracircce agrave cette approche d‟obtenir des informations structurales au niveau
d‟espegraveces speacutecifiques en meacutelange heacuteteacuterogegravene en isolant au preacutealable un ion preacutecurseur (212)
De plus en raison de son association avec des meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons qui
limitent le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo dans des conditions expeacuterimentales bien controcircleacutees
et conduisent agrave de bonnes couvertures de seacutequence elles permettent de localiser preacuteciseacutement
la position des deuteacuteriums dans la seacutequence (Fig I 17)
La meilleure reacutesolution spatiale obtenue par l‟approche laquo top-down raquo s‟explique de la
maniegravere suivante tandis que l‟expeacuterience laquo bottom-up raquo consiste agrave cliver la proteacuteine au
niveau de plusieurs sites geacuteneacuterant des peptides de taille relativement petite l‟eacutetude laquo top-
down raquo quant agrave elle conduit agrave un seul eacuteveacutenement de fragmentation au niveau de chaque
chaicircne polypeptidique Il en reacutesulte la formation d‟une paire d‟ions compleacutementaires cz
dans le cas de la fragmentation ECD ou ETD issus de l‟extreacutemiteacute N- et C-terminale Une
reacutesolution spatiale agrave l‟acide amineacute pregraves peut donc ecirctre obtenue avec l‟approche laquo top-down raquo
car les proteacuteines en phase gazeuse sont cliveacutees une seule fois agrave diffeacuterents sites (Fig I 17)
63
Fig I 17 Scheacutema illustrant la diffeacuterence conceptuelle entre les approches MS de laquo bottom-
up raquo et laquo top-down raquo appliqueacutees aux eacutetudes HDX (226) Lrsquoapproche par fragmentation en
phase gazeuse de la proteacuteine entiegravere dite laquo top-down raquo permet de localiser preacuteciseacutement les
deuteacuteriums dans la seacutequence proteacuteique
Dans le cadre des eacutetudes HDXMS un autre avantage des approches laquo top-down raquo par
rapport agrave celles dites de laquo bottom-up raquo est le fait qu‟il est possible en theacuteorie de reconstruire
une cineacutetique d‟eacutechange par acide amineacute Cela sera deacutetailleacute dans le Chap III de ce manuscrit
Il est eacutegalement avantageux de pouvoir saffranchir des eacutetapes de digestion enzymatique et de
seacuteparation en chromatographie liquide En effet un gain de temps et une possible reacuteduction
du laquo back-exchange raquo sont des eacuteleacutements cruciaux pour ces eacutetudes
64
I2333 Limitations des approches top-down HDX
La limitation majeure de la fragmentation des proteacuteines deuteacutereacutees par ECD reste la taille
des systegravemes comme en analyse laquo top-down raquo classique De tregraves bonnes couvertures de
seacutequence peuvent ecirctre obtenues pour des proteacuteines de faible masse moleacuteculaire (lt 20 kDa)
Au-delagrave de cette valeur l‟efficaciteacute de fragmentation diminue avec le plus souvent une reacutegion
centrale de la proteacuteine peu fragmenteacutee au contraire des extreacutemiteacutes N- et C-terminales en
raison de la structuration des proteacuteines en phase gazeuse deacutecrite preacuteceacutedemment
Un autre problegraveme est d‟arriver agrave maintenir la proteacuteine entiegravere avec ses deuteacuteriums sans
qu‟elle se deacutemarque pendant le temps de l‟analyse En effet pour obtenir des couvertures de
seacutequence importantes un grand nombre de spectres doivent ecirctre accumuleacutes (ideacutealement
pendant trente minutes agrave une heure) et le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine en termes de
position des deuteacuteriums dans la seacutequence est primordial
Enfin le dernier inconveacutenient de ces approches est l‟analyse de proteacuteines reacuteelles qui
demeure compliqueacutee En effet sans seacuteparation par chromatographie liquide un dessalage des
eacutechantillons biologiques reacuteels doit se faire indeacutependamment et preacutealablement agrave lanalyse par
spectromeacutetrie de masse Il est donc effectueacute de maniegravere laquo off-line raquo et conduit
malheureusement agrave un certain deacutemarquage Par ailleurs il doit obligatoirement ecirctre reacutealiseacute agrave
froid ce qui complique le deacuteroulement des expeacuteriences
65
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79
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles
validation de lrsquoapproche combinant
eacutechanges HD et fragmentation ECD
80
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
81
II1 Introduction
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX
Comme indiqueacute dans le chapitre preacuteceacutedent un des problegravemes expeacuterimentaux majeurs lieacute
aux eacutetudes par HDX-MSMS est le laquo scrambling raquo qui correspond agrave une redistribution
aleacuteatoire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums preacutesents dans la seacutequence peptidique par des
processus qui ont lieu en phase gazeuse
Le plus connu est celui qui intervient au moment de la fragmentation par CID et qui
sexplique par le modegravele du proton mobile (1-4) Dans ce modegravele leacutenergie apporteacutee par la
collision conduit agrave une mobiliteacute du proton qui se trouve initialement sur le site le plus basique
du peptide (Lysine Arginine ou amine N-terminale) Ce proton se met donc agrave se deacuteplacer
dans le peptide pour aller vers des sites de protonation moins basiques tels que loxygegravene ou
lazote de la liaison peptidique Bien que la protonation sur lazote de lamide soit
thermodynamiquement moins favorable que la protonation sur l‟oxygegravene des carbonyles cest
ce site protoneacute qui conduit agrave la rupture de la liaison amide et agrave la formation des ions b et y La
protonation reacuteversible des atomes dazote des diffeacuterentes fonctions amides du squelette dans
le contexte dune eacutetude HDX conduit donc si lintermeacutediaire reacuteactionnel a un temps de vie
suffisamment long et si la cineacutetique de la voie retour est comparable agrave la cineacutetique de
fragmentation agrave un eacutechantillonnage du proton sur tous les amides et donc un meacutelange
complet des hydrogegravenes et des deuteacuteriums Pour eacuteviter ce pheacutenomegravene il faut (i) soit que la
protonation sur lamide ne soit pas reacuteversible (ii) soit que la dissociation de la liaison
peptidique soit plus rapide que la deacuteprotonation de lazote damide Paizs et Suhai (5) ont
eacutevalueacute la constante de vitesse de dissociation de la liaison amide par des calculs RRKM et ont
obtenu une valeur de lordre de la microseconde pour des eacutenergies internes denviron 45
kJmol soit une vitesse relativement lente due entre autre agrave la neacutecessaire cyclisation de la
partie b et donc probablement compeacutetitive avec de simples transferts de protons Ainsi de
nombreux exemples de la litteacuterature montrent quil nest pas possible dutiliser des approches
par CID pour localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans des peptides marqueacutes car le
laquo scrambling raquo qui a lieu avant la fragmentation est total (6-11)
Neacuteanmoins il est curieux de constater que certaines eacutetudes arrivent agrave des conclusions
opposeacutees A titre dexemple il a eacuteteacute montreacute par Deng et al pour une seacuterie de peptides issus de
82
la digestion du cytochrome C de cheval (12) ou par Kim et al sur des fragments peptidiques
de thioreacutedoxine oxydeacutee et reacuteduite d‟E coli (13-14) que les ions b preacutesentaient un
laquo scrambling raquo modeacutereacute alors que les ions y correspondants preacutesentaient au contraire un
laquo scrambling raquo total Des reacutesultats similaires deacutecrivant un pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
partiel ont eacutegalement eacuteteacute obtenus sur des proteacuteines entiegraveres (15-17)
Ce qui semble ressortir de ces articles est que les conditions expeacuterimentales utiliseacutees et la
seacutequence des peptides jouent un rocircle tregraves important sur le type de reacutesultat qui est obtenu Dans
ce contexte mieux comprendre les diffeacuterents facteurs affectant le reacutearrangement aleacuteatoire des
hydrogegravenes et des deuteacuteriums dans la seacutequence avant la fragmentation semble un point crucial
pour pouvoir deacutevelopper des approches de spectromeacutetrie de masse tandem robustes en HDX
Neacuteanmoins le problegraveme majeur pour reacutealiser de telles eacutetudes est de disposer dun systegraveme
modegravele permettant de caracteacuteriser la preacutesence du meacutelange entre les hydrogegravenes et les
deuteacuteriums quil soit partiel ou total
Cest le groupe de T Joslashrgensen au Danemark qui a reacutesolu ce problegraveme en mettant au
point des peptides modegraveles qui peuvent ecirctre deuteacutereacutes seacutelectivement sur leur extreacutemiteacute N-
terminale ou C-terminale Lutilisation de ces peptides lui a ainsi permis de montrer (i) quen
controcirclant finement un certain nombre de paramegravetres expeacuterimentaux et (ii) en utilisant des
meacutethodes dactivation baseacutees sur le transfert ou la capture dun eacutelectron (ECDETD) il eacutetait
possible de limiter consideacuterablement le laquo scrambling raquo et localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums
dans la seacutequence (18-19)
II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
Les premiers travaux publieacutes par T Joslashrgensen sont baseacutes sur lutilisation dun peptide qui
peut ecirctre marqueacute au deuteacuterium de maniegravere seacutelective gracircce agrave linteraction dune partie de sa
seacutequence avec un reacutecepteur La partie en interaction avec la proteacuteine eacutetant masqueacutee ne
conduit agrave aucun eacutechange HD alors que la partie libre eacutechange facilement ses hydrogegravenes
damide pour des deuteacuteriums (20) Neacuteanmoins il est vite apparu que le modegravele eacutetait trop
compliqueacute agrave manipuler et neacutecessitait decirctre simplifieacute
83
Pour ce faire T Joslashrgensen a deacutecideacute de maniegravere tout agrave fait astucieuse de mettre agrave profit le
fait quen solution les hydrogegravenes damide du squelette peptidique ont des vitesses deacutechange
avec le solvant qui varient fortement en fonction des acides amineacutes voisins pour construire
des peptides qui peuvent ecirctre seacutelectivement deuteacutereacutes Linfluence des reacutesidus voisins peut ecirctre
soit dordre steacuterique soit dordre inductif (21) A titre dexemple lhydrogegravene dun amide se
trouvant entre deux isoleucines eacutechange dix fois moins vite quun hydrogegravene damide situeacute
entre deux alanines Ces vitesses deacutechange ont eacuteteacute mesureacutees par des expeacuteriences de
spectroscopie RMN (22) Thomas Joslashrgensen a donc utiliseacute pour eacutetablir la seacutequence de ses
peptides modegraveles des acides amineacutes qui eacutechangent tregraves rapidement (histidine ou acide
aspartique) quil a placeacutes en N-terminal et des acides amineacutes qui eacutechangent beaucoup plus
lentement (isoleucine) en C-terminal Il a eacutegalement introduit des acides amineacutes basiques
(lysine) pour sassurer de la solubiliteacute de ses peptides La seacutequence geacuteneacuterale de ses peptides
est donc (His)n(Ile-Ile-Lys)m ou (Lys)2(Asp)n(Ile-Ile-Lys)m Ainsi apregraves un eacutechange complet
dans D2O et dilution dans H2O (acide et glaceacutee) les amides de la partie N-terminale des
peptides (His)n ou (Lys)2(Asp)n se retrouvent complegravetement hydrogeacuteneacutes alors que ceux de la
partie C-terminale (Ile-Ile-Lys)m portent encore des deuteacuteriums
Lutilisation de ces peptides a permis agrave T Joslashrgensen de montrer quil eacutetait possible de
trouver des conditions en ECD (18) mais aussi en ETD (19 23-24) qui permettent de
minimiser le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Diffeacuterents instruments ont eacuteteacute utiliseacutes pour ses
expeacuteriences un spectromegravetre de masse FT-ICR (LTQ-FT) de la socieacuteteacute Thermo pour les
expeacuteriences en ECD (18) et une trappe ionique Agilent (19) ainsi qu‟un spectromegravetre de
masse LTQ-Orbitrap XL (Thermo) (23 25) pour les expeacuteriences ETD Une des conclusions
de ces eacutetudes est que quel que soit le spectromegravetre de masse utiliseacute loptimisation des
conditions expeacuterimentales de la source eacutelectrospray et notamment tous les paramegravetres lieacutes agrave
la deacutesolvatation est un paramegravetre crucial pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Ce reacutesultat nest pas
eacutetonnant dans la mesure ougrave avant leur arriveacutee dans une reacutegion de tregraves basse pression les ions
subissent un certain nombre de collisions qui peuvent augmenter leur eacutenergie interne (26) et
favoriser ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Pour les expeacuteriences ECD T Joslashrgensen a
eacutegalement montreacute que la fenecirctre de seacutelection choisie dans le piegravege lineacuteaire pour isoler lion agrave
fragmenter est eacutegalement un paramegravetre agrave controcircler finement Une fenecirctre trop eacutetroite conduit
en effet agrave une excitation de lion preacutecurseur et au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
Dans ce contexte nous avons souhaiteacute utiliser les peptides deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
comme sondes du laquo scrambling raquo sur le spectromegravetre de masse FT-ICR APEX III du
84
laboratoire afin de pouvoir deacuteterminer les conditions expeacuterimentales propres agrave reacutealiser de
lECD sur des peptides puis des proteacuteines deuteacutereacutes Ce travail a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de
Magalie Duchateau (27) mais navait pas pu ecirctre termineacute pour des problegravemes instrumentaux
Afin dassurer la coheacuterence des reacutesultats toutes expeacuteriences reacutealiseacutees preacuteceacutedemment ont eacuteteacute
dupliqueacutees et compleacuteteacutees au deacutebut de ma thegravese Une mise agrave jour de linstrument en APEX-Q
puis en SolariX nous a ensuite conduits agrave devoir reacute-optimiser certains paramegravetres Les
reacutesultats obtenus lors de ce travail font lobjet du deuxiegraveme chapitre de cette thegravese Les
peptides choisis sont les suivants
P1 HHHHHHIIKIIK
P2 KKDDDDDDIIKIIK
P3 KKDDDIIKIIK
P4 KKDDIIK
II2 Reacutesultats
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons
Le systegraveme deacuteveloppeacute par T Joslashrgensen est celui que nous avons utiliseacute Il est constitueacute
dune seringue preacutealablement placeacutee entre deux sacs de glace puis refroidie pendant la dureacutee
de lanalyse par un sachet de carboglace La longueur du capillaire en PEEK (125 microm de
diamegravetre interne) entre la sortie de la seringue et lentreacutee dans la source dionisation a eacuteteacute
minimiseacutee agrave environ 30 cm et le deacutebit utiliseacute est de 600 microLmin afin de minimiser leacutechange
inverse pendant le transfert de leacutechantillon entre la seringue refroidie et la source dionisation
(voir Chap IV) Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees pendant 10 minutes avec le mecircme eacutechantillon
et la stabiliteacute du marquage (qui doit resteacutee dans les 10 du marquage initial qui sert de
reacutefeacuterence) est suivie par lacquisition reacuteguliegravere de spectres MS
II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence
Parmi les quatre peptides que nous avons choisis deux ont deacutejagrave eacuteteacute eacutetudieacutes preacuteceacutedemment
par T Joslashrgensen (18-19 21) Notre premier objectif eacutetait donc de retrouver le mecircme nombre
de deuteacuteriums initial que ce quil avait trouveacute Les peptides ont eacuteteacute conccedilus de telle sorte que
85
seule lextreacutemiteacute C-terminale doit porter des deuteacuteriums au niveau du motif IIKIIK pour les
peptides P1 P2 et P3 En theacuteorie on sattend donc agrave cinq eacutechanges H D pour ces peptides
Les reacutesultats expeacuterimentaux montrent que lon natteint pas tout agrave fait cette valeur mais quune
moyenne de 42 D est obtenue comme lindique le Tab II 1 Cette perte de 08 D
sexplique par le fait que le marquage au niveau de lamide situeacute entre la derniegravere histidine et
la premiegravere isoleucine nest pas parfait et quil existe un meacutelange de populations de peptides
pour lesquels cest bien un D qui est agrave cette place et des peptides pour lesquels le D a eacuteteacute
remplaceacute par un H De la mecircme faccedilon on nobtient pas exactement 2 D pour le peptide P4
mais seulement 16 Les reacutesultats regroupeacutes dans le Tab II 1 montrent eacutegalement que la taille
et la nature de la partie du peptide qui eacutechange vite (seacuterie dhistidines ou enchainement
lysine-acide aspartique) nont pas dinfluence sur le marquage global du peptide
Tab II 1 Seacutequence des quatre peptides utiliseacutes dans cette eacutetude Nombre de deuteacuteriums
retenus au niveau des acides amineacutes de lrsquoextreacutemiteacute C-terminale dans les diffeacuterents eacutetats de
charge apregraves reacute-eacutechange de certains deuteacuteriums avec les hydrogegravenes du solvant protieacute dans
des conditions controcircleacutees (Chap V)
Peptide Seacutequence Masse
monoisotopique MH
1+ MH2
2+ MH3
3+ Reacutefeacuterence
P1 HHHHHHIIKIIK 15498975 -
43 39 (18 21)
P2 KKDDDDDDIIKIIK 16738956 44a
43 43 (19)
P3 KKDDDIIKIIK 13288148 40b
42 42
P4 KKDDDIIK 9745517 20 16 -
Potentiel de deacutesolvatation a entre 200 et 250 V et
b entre 150 et 250 V
II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo
Afin deacutevaluer le taux de laquo scrambling raquo ducirc agrave la source eacutelectrospray les spectres ECD des
peptides ont eacuteteacute enregistreacutes en faisant varier les conditions expeacuterimentales dans la source
Comme les peptides sont construits pour ne porter des deuteacuteriums quagrave leur extreacutemiteacute C-
terminale les ions de type c (N-terminaux) fournissent des massifs isotopiques diagnostics
simples En labsence de laquo scrambling raquo les ions c de petite taille (comme lion c4 par
exemple) doivent conserver un massif isotopique identique agrave celui obtenu pour le peptide non
deuteacutereacute En revanche sil y a eu laquo scrambling raquo les enveloppes isotopiques seront deacuteplaceacutees
vers des rapports mz plus eacuteleveacutes
86
A titre dexemple la Fig II 1 montre le deacuteplacement du massif isotopique obtenu pour
lion c4 du peptide P2 lorsque lon augmente leacutenergie de deacutesolvatation
Fig II 1 Spectres ECD du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) (a) Spectre complet du peptide
non marqueacute (b) Massif isotopique de lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave partir du peptide
seacutelectivement marqueacute pour des valeurs de potentiel de deacutesolvatation eacuteleveacutee (180 V spectre du
haut) et basse (40 V spectre du milieu) Le spectre du bas montre lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave
partir du peptide agrave lrsquoeacutequilibre (marquage homogegravene) agrave 100 V
Alors quagrave 40 V correspondant agrave une basse eacutenergie de deacutesolvatation le massif isotopique
obtenu est le mecircme que pour le peptide non deuteacutereacute on observe agrave 180 V un deacuteplacement tregraves
clair du massif vers les hauts mz signature de lincorporation de deuteacuteriums du cocircteacute N-
terminal du peptide et donc de laquo scrambling raquo
Par cette approche diffeacuterents paramegravetres de source ont eacuteteacute testeacutes le potentiel de
deacutesolvatation (laquo CapExit raquo sur notre instrument) la tempeacuterature du gaz de deacutesolvatation et le
temps daccumulation dans lhexapocircle Parmi ces trois paramegravetres seul le potentiel de
deacutesolvatation a un effet majeur sur le laquo scrambling raquo comme le montre leacutevolution du nombre
de deuteacuteriums dans les diffeacuterents ions c et z formeacutes agrave partir du peptide P2 (Fig II 2)
87
88
Fig II 2 Graphes du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment ECD obtenu agrave
partir de lrsquoion preacutecurseur trichargeacute du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) seacutelectivement
marqueacute en fonction du potentiel de deacutesolvatation
Avec un potentiel de deacutesolvatation conduisant agrave tregraves peu de laquo scrambling raquo (40 V) on
nobserve pas deffet marquant de la tempeacuterature de la source (varieacutee de 50 agrave 140degC) ni du
temps daccumulation dans lhexapocircle (varieacute de 05 agrave 2 s) Les conditions optimales ayant eacuteteacute
obtenues pour limiter le laquo scrambling raquo nous navons pas chercheacute agrave faire varier dautres
paramegravetres qui par ailleurs ont eacutegalement une influence sur lefficaciteacute de transmission des
ions
Neacuteanmoins nous avons souhaiteacute comprendre un peu mieux le rocircle de leacutenergie de
deacutesolvatation et pour ce faire les spectres MS et MSMS en ECD ont eacuteteacute enregistreacutes Pour les
peptides P1-P3 les spectres ECD obtenus agrave partir dions preacutecurseurs trichargeacutes montrent des
courbes similaires agrave celles deacutecrites sur la Fig II 2 agrave bas potentiel de deacutesolvatation les
fragments contiennent un nombre de deuteacuteriums constant mais lorsque le potentiel est
augmenteacute on observe une incorporation de deuteacuteriums croissante pour les ions c et une perte
de deuteacuteriums pour les ions z Le seuil agrave partir duquel le laquo scrambling raquo commence est le
mecircme pour les diffeacuterents fragments dun mecircme peptide mais est diffeacuterent dun peptide agrave
lautre Pour le peptide P4 aucun fragment ECD na pu ecirctre observeacute agrave partir de lion
doublement chargeacute et lion triplement chargeacute nest apparemment pas formeacute
Ces reacutesultats sont tregraves proches de ce qui avait eacuteteacute observeacute par T Joslashrgensen sur le LTQ-FT
(18) et sur la trappe ionique (19) et ne semblent pas deacutependre de la taille et de la nature de la
partie du peptide qui preacutesente un eacutechange rapide
89
Un examen des spectres MS en fonction de leacutenergie de deacutesolvatation (Fig II 3) apporte
un eacuteclairage nouveau sur ce qui se passe dans la source qui est un pheacutenomegravene indeacutependant du
laquo scrambling raquo
Fig II 3 Intensiteacute des ions des diffeacuterents eacutetats de charge du peptide KKDDDIIKIIK (P3)
ainsi que celle de ses ions fragments geacuteneacutereacutes dans la source ionique en fonction du potentiel
de deacutesolvatation Lrsquointensiteacute des fragments correspond agrave la somme des intensiteacutes des ions
fragments b et y (a) Intensiteacutes absolues (b) Intensiteacutes relatives par rapport agrave lrsquointensiteacute
totale des ions
Tout dabord le type dion observeacute (simplement doublement ou triplement chargeacute) et
lapparition de fragments sont correacuteleacutes avec les potentiels de deacutesolvatation (Fig II 3) Comme
lindique la Fig II 3 les ions triplement chargeacutes sont largement favoriseacutes agrave bas potentiels de
deacutesolvatation et la fragmentation est quasi-inexistante Pour le peptide P3 on peut observer
une chute de lintensiteacute de lion triplement chargeacute au-delagrave de 160 V avec une augmentation
concomitante de lintensiteacute de lion moleacuteculaire doublement chargeacute et de celle des fragments
En intensiteacute absolue lion (1+) deacutecroicirct quant agrave lui lentement agrave partir de 200 V Ces reacutesultats
90
sexpliquent au moins en partie par le fait que lion (3+) est le premier agrave se fragmenter
lorsque lon augmente le potentiel de deacutesolvatation car chaque collision est trois fois plus
eacutenergeacutetique que pour son eacutequivalent monochargeacute
Si lon trace leacutevolution de la deuteacuteration de lion parent en fonction de leacutenergie de
deacutesolvatation un reacutesultat surprenant est obtenu (Fig II 4) le nombre de deuteacuteriums diminue
aux hauts potentiels de deacutesolvatation
Fig II 4 Nombre de deuteacuteriums dans les diffeacuterents eacutetats de charge de lrsquoion preacutecurseur en
fonction du potentiel de deacutesolvatation (a) Peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) (b) Peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK)
Ce reacutesultat explique le comportement observeacute pour les ions c111+
et c132+
aux hauts
potentiels de deacutesolvatation la diminution du nombre de deuteacuteriums pour ces ions fragments
est correacuteleacutee agrave celle de lion preacutecurseur Par ailleurs le nombre de deuteacuteriums perdu semble lieacute
(a)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
0 50 100 150 200 250 300
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M 2+
M 3+
M 4+
(b)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
100 150 200 250 300 350
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M3+
M2+
M1+
91
agrave la fois agrave la nature et agrave leacutetat de charge du peptide Par exemple le peptide P2 trois fois
chargeacute perd 08 D alors que le peptide P3 avec le mecircme eacutetat de charge perd au moins 2 D
Cette perte de deuteacuteriums ne peut sexpliquer que par lintervention dune autre moleacutecule
posseacutedant des hydrogegravenes eacutechangeables avec laquelle un eacutechange inverse D H peut avoir
lieu Cette moleacutecule peut par exemple provenir du solvant de spray utiliseacute pour les
expeacuteriences eau meacutethanol acide aceacutetique En effet il est possible deacutemettre lhypothegravese que
des reacuteactions ionmoleacutecule dans la source dans laquelle la pression est importante conduisent
agrave cet eacutechange dhydrogegravenes et de deuteacuteriums Le fait que P1 ne subisse aucune perte de
deuteacuterium permet mecircme de postuler que les acides amineacutes responsables de cet eacutechange sont
les acides aspartiques reacutesidus que lon retrouve dans tous les peptides eacutetudieacutes agrave lexception de
P1 Compte tenu du faible nombre de peptides eacutetudieacutes il est difficile de conclure sur un
meacutecanisme geacuteneacuteral permettant dexpliquer cet eacutechange en phase gazeuse mais le meacutecanisme
de flip-flop deacutecrit par Beauchamp et al (28-29) pourrait expliquer les reacutesultats observeacutes
Il est inteacuteressant de noter que les pheacutenomegravenes deacutecrits preacuteceacutedemment (apparition de
fragments dans la source laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums) apparaissent tous agrave une limite
preacutecise (mais diffeacuterente) de potentiel de deacutesolvatation (Tab II 2) Comme le potentiel de
deacutesolvatation est directement lieacute agrave leacutenergie interne des ions produits par la source
eacutelectrospray (26) il est possible dutiliser la valeur des seuils observeacutes comme indication de
leacutenergie requise pour chaque pheacutenomegravene Bien que les seuils deacutependent du peptide (et de son
eacutetat de charge) il est possible deacutetablir un ordre dapparition de chaque pheacutenomegravene car il est
conserveacute dune seacutequence et dun eacutetat de charge agrave lautre ainsi le laquo scrambling raquo apparaicirct en
premier avec un seuil assez bas deacutenergie de deacutesolvatation suivi dune perte du marquage et
enfin de lapparition de fragments aux plus hautes eacutenergies
Tab II 2 Valeurs de potentiel de deacutesolvatation (en V) pour lrsquoapparition de chaque
pheacutenomegravene observeacute laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums et fragmentation dans la source
Peptide
Desolvation potential (V) at onset
Scrambling Loss of D atom
Fragmentation
from 3+ from 2+
P1 100
- - 150
P2 110 160 - 170
P3 100 110 180 140
P4 - - - 120
92
Lordre des deux premiers pheacutenomegravenes indique que les hydrogegravenes damide ne sont pas
directement eacutechangeables avec ceux des moleacutecules de solvant vaporiseacutees Deux meacutecanismes
diffeacuterents peuvent alors ecirctre envisageacutes soit un eacutechange direct en phase gazeuse dun atome
dhydrogegravene du solvant avec un deuteacuterium porteacute par un azote dune des liaisons peptidiques
ce qui implique une eacutenergie dactivation importante soit un eacutechange agrave un autre site labile
apregraves transfert du deuteacuterium Comme la courbe du deacutemarquage est tregraves proche de celle du
laquo scrambling raquo deacutetermineacutee par les expeacuteriences ECD on peut supposer que la reacuteaction a lieu
en deux eacutetapes reacutearrangement intramoleacuteculaire dans le peptide conduisant agrave eacutechanger les
deuteacuteriums damide avec les hydrogegravenes carboxyliques des acides aspartiques puis reacuteaction
ionmoleacutecule avec le solvant en phase gazeuse En absence de ces acides carboxyliques relais
(cas de P1) seul le laquo scrambling raquo peut avoir lieu Ce meacutecanisme ne reacutepond toutefois pas agrave
une question qui est la suivante pourquoi dans le cas de P2 et pas de P3 le deacutemarquage
conduit-il agrave un eacutechange limiteacute agrave 08 D alors qu‟on devrait s‟attendre agrave suivre la courbe du
laquo scrambling raquo Si lon revient au scheacutema de la source dionisation de linstrument utiliseacute il
convient de se souvenir quapregraves leur deacutesolvatation dans le capillaire de transfert chauffeacute les
ions sont stockeacutes pendant une seconde environ dans un hexapocircle dans lequel regravegne une
pression assez importante (10-6
mbar environ) Ainsi un eacutechange HD partiel semble indiquer
que les deux pheacutenomegravenes observeacutes ont lieu dans deux reacutegions diffeacuterentes de linstrument le
reacutearrangement aurait lieu dans linterface entre le capillaire et le premier laquo skimmer raquo qui est
une reacutegion agrave haute pression et soumise agrave un potentiel eacutelectrique important tandis que les
reacuteactions ionmoleacutecule auraient plutocirct lieu dans lhexapocircle Ainsi si tous les sites labiles du
peptide ne participent pas aux reacuteactions ionmoleacutecule avec leur environnement gazeux (ce qui
est le cas dans lhypothegravese ougrave les acides aspartiques sont lieacutes speacutecifiquement agrave cet eacutechange) le
reacutearrangement conduirait agrave un nombre fini de sites eacutechangeables portant un atome de
deuteacuterium et ceux situeacutes sur dautres sites ne pourraient donc pas participer au deacutemarquage
II3 Conclusions
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III
Lobjectif initial de ce travail eacutetait de deacuteterminer quels paramegravetres expeacuterimentaux de la
source eacutelectrospray Apollo I de lAPEX III devaient ecirctre optimiseacutes pour minimiser le
reacutearrangement intramoleacuteculaire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums qui a lieu en source Parmi
les diffeacuterents paramegravetres testeacutes les reacutesultats preacutesenteacutes preacuteceacutedemment montrent que cest le
93
potentiel de deacutesolvatation qui est le plus critique Gracircce agrave lutilisation de lECD sur des
peptides seacutelectivement marqueacutes nous avons ainsi pu montrer que le potentiel de deacutesolvatation
doit ecirctre maintenu agrave une valeur leacutegegraverement infeacuterieure agrave celle conduisant agrave un maximum
dintensiteacute pour les ions formeacutes soit entre 80 et 110 V pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Cette
valeur est sensiblement la mecircme pour tous les peptides que nous avons eacutetudieacutes
Les reacutesultats obtenus sur les peptides seacutelectivement marqueacutes montrent clairement quil faut
faire extrecircmement attention agrave optimiser ce paramegravetre avant dutiliser lECD ou lETD pour
localiser des deuteacuteriums dans des peptides ou des proteacuteines qui ont eacuteteacute marqueacutes et pouvoir
tirer des conclusions sur la preacutesence de zones structureacutees ou non Utiliser des peptides
seacutelectivement marqueacutes pour deacuteterminer les conditions expeacuterimentales de source propres agrave
reacutealiser lanalyse de peptides ou de proteacuteines deuteacutereacutes (conditions qui deacutependent de
linstrument utiliseacute) devrait ainsi ecirctre leacutetape preacuteliminaire agrave toute expeacuterience HDX-MSMS
Au cours de ce travail nous avons eacutegalement mis en eacutevidence un pheacutenomegravene de reacuteactions
ionmoleacutecule dans la source qui sont potentiellement agrave lorigine deacutechanges entre les
deuteacuteriums preacutesents sur la seacutequence peptidique et des hydrogegravenes issus fort probablement de
moleacutecules de solvant en phase gazeuse Il est apparu au cours de notre travail que ce
pheacutenomegravene eacutetait particuliegraverement marqueacute pour les peptides portant des acides aspartiques par
rapport agrave ceux portant des histidines Ce pheacutenomegravene eacutetant a priori baseacute sur une premiegravere
eacutetape qui est leacutechange entre un deuteacuterium preacutesent sur une liaison amide et un hydrogegravene
carboxylique de la chaicircne lateacuterale des Asp il peut ecirctre reacuteduit par un reacuteglage approprieacute des
paramegravetres de source (diminution de leacutenergie de deacutesolvatation)
II32 Autres instruments FT-ICR
Nous avons proceacutedeacute agrave l‟laquo upgrade raquo de nos instruments agrave deux reprises (APEX III gt
APEX-Q en janvier 2011 et APEX-Q gt SolariX en avril 2012) De la mecircme maniegravere que pour
l‟APEX III nous avons pu deacuteterminer pour l‟APEX-Q et le SolariX le paramegravetre ou les
paramegravetres critiques qu‟il faut optimiser pour limiter le laquo scrambling raquo En effet agrave chaque
changement ou modification d‟instrument une reacute-optimisation de l‟ensemble des paramegravetres
entre la source et la cellule est requise pour eacuteviter un eacutechauffement des ions lors de leur
formation ou de leur transfert Les reacutesultats sont reacutesumeacutes dans le tableau ci-apregraves (Tab II 3)
94
Tab II 3 Paramegravetre(s) critique(s) agrave optimiser pour limiter le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
en fonction de lrsquoinstrument utiliseacute
APEX III Tension agrave la sortie du capillaire de source
(Potentiel de deacutesolvatation ou laquo CapExit)
lt 80 V
APEX-Q
APEX-Qe
Tension dans la cellule de collision
(laquo CollisionVoltage raquo)
gt 0 V
(3-5 V)
SolariX Tension du premier eacutecorceur (SK1)
Conditions de la cellule de collision
collision activeacutee
tension de collision en entreacutee
lt 50 V
Non
lt 2 V
Fig II 5 Nombre de deuteacuteriums dans lrsquoion preacutecurseur triplement chargeacute du peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK) et dans les fragments c2 c6 et z6 en fonction du potentiel du premier
eacutecorceur
A titre d‟illustration la Fig II 5 reprend les reacutesultats obtenus sur le SolariX avec le
peptide P1 en faisant varier la tension du premier eacutecorceur (laquo skimmer raquo) SK1 montrant une
valeur optimale vers 40 V On notera par contre la preacutesence d‟un taux de deuteacuteration non nul
sur les fragments c2 et c6 degraves les basses tensions Il faut noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un ion preacutecurseur triplement chargeacute preacutesentant un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
que ce qui est attendu
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
o
f d
eu
teri
um
SK1 (V)
C2 C6 Z6 Parent M3+
95
Les deux versions successives (APEX-Q et SolariX) preacutesentent une eacutevolution majeure qui
est l‟introduction d‟une cellule de collision sur le chemin optique des ions (Annexe Fig A 4
et Fig A 6) En conseacutequence on observe que cette seconde reacutegion agrave pression de gaz eacuteleveacutee
ajoute une seconde reacutegion susceptible de conduire agrave un deacutepocirct d‟eacutenergie dans les ions et par
conseacutequent agrave du laquo scrambling raquo Les paramegravetres optimiseacutes concernent par conseacutequent ces
deux reacutegions L‟ajout d‟entonnoirs agrave ions (laquo ion funnels raquo) au premier eacutetage de deacutesolvatation
semble rendre la tension en sortie de capillaire (laquo CapExit raquo) nettement moins critique sans
doute parce que les distances sont plus grandes (et donc le champ eacutelectrique plus faible) Par
contre sur le SolariX de l‟eacutenergie peut ecirctre deacuteposeacutee entre le premier eacutecorceur (SK1) et le
second entonnoir qui joue un rocircle critique dans le deacutepocirct d‟eacutenergie (Annexe Fig A 6)
En conclusion dans cette partie nous avons utiliseacute un jeu de peptides speacutecifiquement
marqueacutes par des deuteacuteriums pour valider notre instrumentation et trouver les paramegravetres
optimaux par rapport au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo ou meacutelange des deuteacuteriums lors des
eacutetapes de transfert en phase gazeuse et d‟introduction dans le vide du spectromegravetre de masse
Nous avons eacutegalement valideacute au passage que l‟ECD permet effectivement de mesurer des
fragments donc le nombre de deuteacuteriums correspond agrave celui attendu apregraves deacutemarquage seacutelectif
de peptides modegraveles Dans la partie suivante nous allons transposer ces reacutesultats agrave un systegraveme
reacuteel
96
II4 Bibliographie
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98
99
Chapitre III Deacuteveloppement de
lrsquoapproche HDX top-down ECD
100
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
101
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo
Comme nous l‟avons vu dans le premier chapitre de ce manuscrit (voir Chap I) les
eacutechanges HD coupleacutes agrave la spectromeacutetrie de masse (HDXMS) permettent d‟obtenir des
informations sur l‟organisation structurale des proteacuteines L‟approche classique dite
laquo bottom-up raquo (Fig III 1) repose sur une digestion enzymatique de la proteacuteine d‟inteacuterecirct apregraves
marquage afin de deacuteterminer la localisation des deuteacuteriums incorporeacutes Pour cela les peptides
issus de la digestion sont analyseacutes par spectromeacutetrie de masse une eacutetape preacutealable de
seacuteparation par chromatographie liquide eacutetant le plus souvent requise Les eacutetapes de digestion
enzymatique et de seacuteparation chromatographique qui se deacuteroulent en solution doivent ecirctre
reacutealiseacutees dans les conditions de conservation du marquage Des cineacutetiques deacutechange HD
peuvent alors ecirctre calculeacutees pour chaque peptide en mesurant le deacuteplacement de leur masse
dans les spectres Ces cineacutetiques sont correacuteleacutees dune part agrave laccessibiliteacute au solvant et dautre
part agrave la structure locale de la proteacuteine
Fig III 1 Scheacutema repreacutesentant les eacutetapes des approches laquo bottom-up raquo et laquo top-down raquo dans
des eacutetudes en HDXMS Le segment en bleu correspond agrave la proteacuteine hydrogeacuteneacutee tandis que
les portions en rouge correspondent aux zones de la proteacuteine qui ont eacuteteacute deuteacutereacutees Les
flegraveches vertes repreacutesentent le moment de la fragmentation en phase gazeuse
Cependant cette approche souffre de deux limitations majeures La premiegravere est l‟eacutechange
inverse entre les deuteacuteriums et les hydrogegravenes qui a lieu en solution lors des eacutetapes de
digestion et de seacuteparation avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Bien que le laquo back-
exchange raquo puisse ecirctre minimiseacute il ne peut ecirctre eacuteviteacute (1) La seconde limitation est la
reacutesolution qui deacutepend directement de la taille des peptides issus de la fragmentation
enzymatique par la pepsine et qui est typiquement de lordre de cinq agrave dix acides amineacutes
102
Une possibiliteacute pour ameacuteliorer la reacutesolution est de combiner diffeacuterentes enzymes Une
autre est de fragmenter les peptides obtenus dans le spectromegravetre de masse pour localiser
preacuteciseacutement les deuteacuteriums (2) Il a neacuteanmoins eacuteteacute montreacute que les techniques classiques par
chauffage lent (Collision Induced Dissociation CID) ne peuvent ecirctre utiliseacutees car une
migration intramoleacuteculaire et par conseacutequent un meacutelange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums a
lieu dans la seacutequence avant la rupture des liaisons peptidiques ce qui fait perdre linformation
de leur localisation (Fig III 2) (3) En revanche comme nous l‟avons montreacute dans le chapitre
preacuteceacutedent (voir Chap II) lutilisation de meacutethodes de fragmentation baseacutees sur la capture ou
le transfert dun eacutelectron (Electron Capture Dissociation ECD ou Electron Transfer
Dissociation ETD) permet de reacuteduire consideacuterablement ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo De
plus linteacuterecirct de ces modes de fragmentation alternatifs est quils peuvent ecirctre utiliseacutes aussi
bien dans une approche laquo bottom-up raquo sur les peptides proteacuteolytiques marqueacutes (4-5) que
directement sur la proteacuteine deuteacutereacutee dans une approche dite laquo top-down raquo Dans ce dernier
cas l‟incorporation des deuteacuteriums peut alors ecirctre mesureacutee pour chaque ion fragment comme
nous l‟avons fait pour les peptides modegraveles
Avec redistribution
NH2 COOHNH2
COOH
NH2COOH
CID ETDECD
NH2
COOH
by ionscz ions
D D DDD
H HH
H
NH2
COOH
Sans redistributionActivation
Fragmentation
Fig III 2 Illustration du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo qui est freacutequent lors de la
fragmentation par activation collisionnelle (CID) Les meacutethodes drsquoactivation par les eacutelectrons
(ECD ETD) ne conduisent pas agrave de la redistribution quand les conditions sont optimales
III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo
Dans une approche laquo top-down raquo la proteacuteine entiegravere est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse (Fig III 1) On s‟affranchit alors de l‟eacutetape de digestion proteacuteolytique De cette
maniegravere une partie du laquo back-exchange raquo qui a lieu en solution notamment lors de la
103
digestion enzymatique de la proteacuteine deuteacutereacutee (1) est eacutelimineacutee De plus dans la mesure ougrave
lobjet agrave analyser nest pas coupeacute en de nombreux morceaux en solution lutilisation dune
seacuteparation chromatographique n‟est pas requise ce qui permet eacutegalement de s‟affranchir de
l‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape L‟approche laquo top-down raquo est geacuteneacuteralement combineacutee agrave
une fragmentation par ECD ou ETD Comme nous l‟avons montreacute dans les chapitres
preacuteceacutedents (voir Chap I et II) l‟utilisation de ces techniques de dissociation par capture ou
transfert d‟eacutelectron permet de limiter au maximum le laquo scrambling raquo qui peut avoir lieu en
phase gazeuse au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem Elles sont donc
particuliegraverement bien adapteacutees pour deacuteterminer la position preacutecise des deuteacuteriums incorporeacutes
le long de la seacutequence polypeptidique
Des reacutesultats obtenus tregraves reacutecemment par diffeacuterents groupes utilisant aussi bien l‟ETD que
l‟ECD sur des proteacuteines modegraveles ont ainsi montreacute que ces techniques de dissociation utiliseacutees
en combinaison avec les eacutechanges HD permettent danalyser la structure native des proteacuteines
(6) ou encore de caracteacuteriser des espegraveces transitoires ce qui est essentiel pour la
compreacutehension des meacutecanismes de repliement (7) Il a mecircme eacuteteacute montreacute au cours de ces
eacutetudes qu‟une reacutesolution agrave lrsquoacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue Les premiers reacutesultats
provenant d‟une association entre eacutechanges HD et analyse laquo top-down raquo ont eacuteteacute obtenus en
2008 par l‟eacutequipe de Lars Konermann au Canada sur une petite proteacuteine modegravele de 86 kDa
l‟ubiquitine (8) Il montre dans son article que les informations de structure quil obtient sont
tregraves proches de celles issues de la RMN (Fig III 3)
Fig III 3 Symboles pleins taux de deuteacuteration des ions fragments ECD de lrsquoubiquitine apregraves
30 min incubation dans 95 de D2O agrave 22degC Symboles vides taux de deuteacuteration obtenus
par RMN dans les mecircmes conditions HDX
104
Dans une eacutetude plus reacutecente encore Igor Kaltashov a preacutesenteacute des reacutesultats tregraves
prometteurs sur une proteacuteine de 18 kDa en utilisant un spectromegravetre de masse FT-ICR
(Bruker) sur lequel une source d‟ionisation chimique permettant de faire des expeacuteriences ETD
a eacuteteacute installeacutee (9) Il a eacutegalement montreacute tregraves reacutecemment en travaillant sur la mecircme proteacuteine
modegravele que la fragmentation par activation collisionnelle (CID) pouvait ecirctre combineacutee agrave une
approche laquo top-down raquo dans des eacutetudes HDX indiquant que le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
pouvait ecirctre controcircleacute lorsque des eacutetats de charge tregraves eacuteleveacutes eacutetaient choisis pour la
fragmentation (10) Bien que les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons pour la fragmentation
de peptides (11-12) et de petites proteacuteines (6 8 13) se soient reacuteveacuteleacutees tregraves encourageantes
pour augmenter la reacutesolution des eacutetudes en HDX-MSMS elles ne fournissent pas une
couverture de seacutequence complegravete en particulier pour les gros polypeptides C‟est pour cette
raison qu‟il serait inteacuteressant de pouvoir utiliser en compleacutement les reacutesultats de la
fragmentation par CID qui conduit agrave des ions fragments souvent compleacutementaires agrave ceux
obtenus par dissociation ECD ou ETD Ainsi la possibiliteacute d‟utiliser les meacutethodes
d‟activation collisionnelle en plus des techniques d‟activation par les eacutelectrons dans les eacutetudes
laquo top-down raquo HDX conduirait agrave une reacutesolution spatiale significativement ameacutelioreacutee
permettant de sonder la conformation et la dynamique des proteacuteines Une autre faccedilon
d‟augmenter la reacutesolution est l‟utilisation d‟un reacuteactif tel que l‟alcool m-nitrobenzylique (m-
NBA) qui augmente leacutetat de charge des ions proteacuteiques en provoquant leur rapide
deacutenaturation lors du processus d‟ionisation par ESI Il en reacutesulterait le deacutepliement de la
proteacuteine dans la goutte eacutelectrospray mais sans l‟apparition de modifications significatives de
sa structure par rapport agrave celle de la solution initiale permettant d‟ameacuteliorer l‟efficaciteacute de
fragmentation et donc la couverture de seacutequence par ECD ou ETD Ainsi dans une eacutetude
reacutecente Evan Williams (14) a montreacute que lajout de m-NBA dans le spray utiliseacute pour ioniser
lubiquitine permet de former des ions de plus hauts eacutetats de charge dont la mobiliteacute ionique a
reacuteveacuteleacute quils eacutetaient comme attendu plus deacuteplieacutes que leurs homologues de plus bas eacutetat de
charge Ainsi comme lefficaciteacute de la fragmentation ECDETD augmente avec leacutetat de
charge du preacutecurseur Williams a pu montrer dans le cas de lubiquitine quune meilleure
couverture de seacutequence pouvait ecirctre obtenue simplement par lajout de m-NBA Une autre
possibiliteacute est de combiner les reacutesultats obtenus pour diffeacuterents eacutetats de charge d‟ions
preacutecurseurs ce qui peut ameacuteliorer un peu plus la reacutesolution spatiale des expeacuteriences ETD
Ceci peut devenir d‟autant plus important que le systegraveme proteacuteique est grand dans le cas ougrave
typiquement la fragmentation par ETD est limiteacutee
105
Les diffeacuterents exemples reacutecents deacutecrits preacuteceacutedemment montrent que les approches laquo top-
down raquo ont fait l‟objet de deacuteveloppements importants dans le contexte des eacutechanges HD ces
derniegraveres anneacutees Neacuteanmoins jusquagrave maintenant seules des proteacuteines modegraveles stables et
disponibles en quantiteacute importante ont eacuteteacute lobjet de ces deacuteveloppements Dans ce contexte
lobjet de ma thegravese a eacuteteacute de poursuivre les eacutetudes reacutealiseacutees au laboratoire dans lobjectif de
mettre au point une meacutethodologie robuste combinant eacutechanges HD et approche laquo top-
down raquo pour des complexes proteacuteiques reacuteels en collaboration avec le laboratoire de
Biochimie de lEacutecole Polytechnique Notre objectif est donc (i) de disposer dune meacutethode
permettant de localiser rapidement et preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence
polypeptidique et deacuteterminer ainsi des cineacutetiques deacutechange pour chaque acide amineacute (ii) de
pouvoir appliquer cette meacutethodologie agrave leacutetude structurale des complexes d‟initiation de la
traduction La difficulteacute ici reacuteside dans le fait qu‟il s‟agit d‟eacutechantillons biologiques reacuteels et
de grande taille Cela implique des eacutetapes additionnelles dans le protocole de preacuteparation et
d‟analyse des eacutechantillons et donc des preacutecautions suppleacutementaires agrave prendre vis-agrave-vis de la
conservation du marquage Notre eacutetude HDXMS preacuteliminaire qui a eacuteteacute meneacutee sur des
peptides de reacutefeacuterence et qui a eacuteteacute preacutesenteacutee dans le chapitre preacuteceacutedent (voir Chap II) a
montreacute que l‟utilisation de meacutethodes de fragmentation telle que la dissociation par capture
d‟eacutelectron (ECD) eacutetait adapteacutee pour mesurer les taux d‟eacutechanges HD pour chaque acide
amineacute Pour cela une optimisation fine des conditions de source et des paramegravetres
instrumentaux a eacuteteacute requise preacutealablement agrave l‟analyse pour reacuteduire au maximum le
laquo scrambling raquo pendant les processus de deacutesolvatation et de transfert des ions en phase
gazeuse Nous avons dans ce troisiegraveme chapitre reacuteutiliseacute ces paramegravetres optimiseacutes pour
l‟analyse laquo top-down raquo de nos eacutechantillons proteacuteiques Dans un premier temps cette partie se
focalisera sur l‟eacutetude laquo top-down raquo HDX avec activation par ECD qui est la technique
d‟activation pour laquelle le plus de reacutesultats ont eacuteteacute obtenus Ensuite pour mieux
comprendre le rocircle des meacutethodes d‟activation sur les migrations d‟hydrogegravene le mecircme
systegraveme a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacute avec d‟autres modes d‟activation (ETD et CID)
106
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation
lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX
III211 Proteacuteines drsquoeacutetude
Nous avons travailleacute sur le complexe proteacuteique aIF2 (archaeal Initiation Factor 2) de
Sulfolobus solfataricus (Fig III 4) qui est un des complexes responsables de l‟initiation de
la traduction chez les archeacutees Son rocircle est de recruter l‟ARNt meacutethionyleacute lieacute agrave l‟ARNm au
niveau de la petite sous-uniteacute du ribosome Nous savons deacutejagrave par des donneacutees
cristallographiques qu‟il est constitueacute de trois sous-uniteacutes α β et γ La sous-uniteacute γ (45
kDa) qui constitue la proteacuteine centrale du complexe est connue pour interagir avec les deux
autres sous-uniteacutes α (30 kDa) et β (15 kDa) au sein d‟aIF2 Afin d‟obtenir des informations
structurales sur l‟organisation de ce complexe nous avons deacuteveloppeacute notre meacutethodologie agrave
partir de l‟analyse de la proteacuteine aIF2α3 de 10 kDa qui est une version tronqueacutee de la sous-
uniteacute α du complexe aIF2 mais qui contient le site d‟interaction avec γ Ce travail a eacuteteacute initieacute
lors de la thegravese de M Duchateau (15) pendant laquelle l‟eacutetude de la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute
reacutealiseacutee par HDXECD sur l‟APEX III Dans le cadre du travail actuel nous avons eacutetendu
notre eacutetude au sous-complexe aIF2α3γ et compareacute les diffeacuterents modes de fragmentation en
utilisant d‟autres spectromegravetres de masse
Fig III 4 Scheacutema du complexe heacuteteacuterotrimeacuterique aIF2αβγ
107
III212 Protocole drsquoanalyse HDXMS
L‟analyse d‟eacutechantillons biologiques reacuteels a neacutecessiteacute une optimisation du protocole mis au
point pour les peptides En effet ces eacutechantillons proteacuteiques preacutesentent des inconveacutenients
majeurs qui sont les suivants
- ils ne sont pas disponibles en grande quantiteacute
- le maintien de leur structure native neacutecessite des concentrations importantes de sels non
volatils
- ils se deacutegradent rapidement agrave tempeacuterature ambiante
L‟ensemble des eacutetapes du protocole allant des conditions de l‟eacutechange en solution (pH
tempeacuterature tampons dessalage) agrave la fragmentation par ECD a donc eacuteteacute minutieusement
optimiseacute (Fig III 5) pour tenir compte de ces limitations Au deacutebut de l‟expeacuterience la
proteacuteine aIF2α3 est dans son eacutetat natif En effet elle est conserveacutee dans son tampon de
purification qui est riche en sels (chlorure de sodium) et qui lui permet ainsi de garder sa
conformation native La premiegravere eacutetape de notre protocole qui a consisteacute agrave initier la reacuteaction
d‟eacutechange HD a eacuteteacute de diluer aIF2α3 dans un tampon deuteacutereacute riche eacutegalement en sels
(solution de NaCl agrave 330 mM dans D2O) afin de ne pas deacutenaturer la proteacuteine et donc de sonder
sa conformation active Une incubation du meacutelange agrave 37degC sous agitation est reacutealiseacutee pendant
diffeacuterents temps agrave l‟issu desquels la reacuteaction de marquage est bloqueacutee Cette eacutetape d‟arrecirct de
la reacuteaction d‟eacutechange est effectueacutee par l‟addition d‟une solution aqueuse (H2O) acide (pH
final de 25) et glaceacutee (agrave 0degC) Etant donneacute que les fortes concentrations en sels non volatils
ne sont absolument pas compatibles avec une ionisation par eacutelectrospray nous avons ducirc
ajouter et optimiser une eacutetape de dessalage dans les conditions de conservation du marquage
Apregraves cette eacutetape de dessalage dont la dureacutee totale a eacuteteacute optimiseacutee agrave seulement une minute
(15) la proteacuteine deuteacutereacutee est precircte pour l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Elle est injecteacutee
par le systegraveme de seringue refroidie ioniseacutee par eacutelectrospray et fragmenteacutee par ECD dans la
cellule ICR
108
Alpha3 dans des conditions natives Arrecirct de la reacuteaction
H2O pH 25 et 0degC
Dilution dans D2O
NaCl 330 mM
Incubation
Temps variables
1 Dessalage
2 Eacutelution dans H2OACNAF2Alpha3 deuteacutereacutee dans le solvant pour ESI
ECD
Fig III 5 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude drsquoaIF2α3 en HDXMS par
analyse laquo top-down raquo
Pour eacuteviter l‟eacutetape de dessalage et optimiser encore plus le protocole nous avons fait de
nombreux essais pour essayer de remplacer les sels non volatils par des sels volatils
compatibles avec une analyse par ESI mais dans tous les cas la proteacuteine a preacutecipiteacute ou sest
deacutegradeacutee
III213 Instruments utiliseacutes
Les fragmentations par ECD ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur des spectromegravetres de masse de type FT-
ICR Les premiegraveres expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur un spectromegravetre APEX III qui nest pas
eacutequipeacute dun quadripocircle de seacutelection avant la cellule ICR puis sur un APEX-Qe disponible agrave
Orsay (P Maicirctre Laboratoire de Chimie Physique) Les diffeacuterences majeures entre les deux
instruments sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
Les expeacuteriences ETD ont quant agrave elles eacuteteacute effectueacutees sur un instrument LTQ Orbitrap
Velos (Thermo Scientific) en collaboration avec la plateforme proteacuteomique de Paris 7 dirigeacutee
par Jean-Michel Camadro
Les expeacuteriences CID ont eacuteteacute obtenues sur un spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
(Waters) installeacute au laboratoire DCMR
109
III22 Fragmentation par ECD
III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3
III2211 Spectre de masse
Le spectre de masse d‟aIF2α3 dont la masse monoisotopique est 10422985 Da a eacuteteacute
obtenu apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes (Fig III 6)
aiF2alpha3ss1 +MS
0
2
4
6
8
6x10
Intens
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+6H]6+
mz
Intensx106
Fig III 6 Spectre MS drsquoaIF2α3 enregistreacute sur notre instrument FT-ICR APEX III
III2212 Reacutesultats obtenus en ECD
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX III du DCMR
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres pour l‟ECD afin d‟obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour cette proteacuteine de 10 kDa sans eacutechange HD
Pour cela nous avons tout d‟abord utiliseacute une autre petite proteacuteine l‟ubiquitine (86 kDa)
pour optimiser lensemble des paramegravetres expeacuterimentaux
110
Lors de la thegravese de M Duchateau (15) notre eacutequipe a montreacute que la fragmentation par
ECD d‟aIF2α3 eacutetait beaucoup plus efficace sans seacutelection d‟un eacutetat de charge Nous avons
donc proceacutedeacute de la mecircme maniegravere
Pour l‟ubiquitine les spectres ECD les plus informatifs ont eacuteteacute obtenus avec une cathode
chauffeacutee agrave 16 A et une irradiation par des eacutelectrons de 09 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 80
ms Nous utilisons eacutegalement la technique de pieacutegeage dynamique des ions dans la cellule
afin de maximiser la quantiteacute d‟ions accumuleacutes avant la fragmentation ECD En effet la
qualiteacute des spectres ECD deacutepend en grande partie de lintensiteacute des ions preacutecurseurs et il
existe un veacuteritable seuil pour le nombre dions pour obtenir des spectres ECD de qualiteacute Le
pourcentage de couverture de seacutequence ainsi obtenu est de 68 Pour obtenir un reacutesultat
similaire avec aIF2α3 l‟eacutenergie cineacutetique des eacutelectrons a eacuteteacute augmenteacutee jusqu‟agrave 2 eV
Les proteacuteines marqueacutees sont introduites dans le spectromegravetre de masse par le systegraveme de
seringue refroidie qui est deacutecrit dans le Chap IV Afin de minimiser l‟eacutechange inverse en
solution l‟analyse ne doit pas exceacuteder dix minutes Dans ce laps de temps relativement court
deux cents scans sont accumuleacutes par spectre ECD
L‟analyse du spectre ECD d‟aIF2α3 reacutealiseacute sans seacutelection d‟eacutetat de charge permet
l‟identification d‟un total de 83 ions fragments correspondant agrave 39 ions c et 44 ions z dont 18
paires d‟ions compleacutementaires Cela se traduit par un tregraves bon pourcentage de couverture de
seacutequence de 706 (Fig III 7) L‟identification des ions fragments b et y permet d‟ameacuteliorer
leacutegegraverement la couverture de seacutequence en augmentant le pourcentage de 55 (1 ion b et 4 ions
y suppleacutementaires pour lesquels il n‟y a pas d‟ions c et z correspondants) atteignant donc la
valeur de 761
111
aIF2a3_noHD_ECD_000008d +MS
0
1
2
3
4
5
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
~ ~
~
~
~
~
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+ [M+8H]8+
[M+7H]7+
~[M+6H]6+
250 300 350 400 450 500 550 mz0
1
2
3
4
5
6
6x10
Intens
+MS
z2+
z3+
z4+ z5
+
c2+
c3+
c4+
Intens
mz
Fig III 7 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX III et sa couverture de seacutequence associeacutee Un agrandissement de la reacutegion mz
250-550 a eacuteteacute ajouteacute montrant la complexiteacute du spectre
Des problegravemes de stabiliteacute du signal et de sensibiliteacute sont apparus au cours de ces
expeacuteriences ECD il arrivait freacutequemment que le taux de fragmentation diminue brutalement
sans raison apparente au cours d‟une cineacutetique d‟eacutechange Pour pouvoir poursuivre nos
expeacuteriences nous avons deacutecideacute de continuer nos travaux sur l‟APEX-Qe accessible agrave
l‟Universiteacute Paris-Sud Une reacute-optimisation des paramegravetres pour l‟ECD a donc eacuteteacute neacutecessaire
car cet instrument nest pas le mecircme que celui du DCMR et notamment le fait que les sources
dionisation soient diffeacuterentes nous laissait agrave penser que des ajustements au moins au niveau
de la source seraient neacutecessaires (voir Chap II)
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX-Qe du Laboratoire de Chimie Physique agrave Orsay
Pour aIF2α3 les nouveaux paramegravetres optimiseacutes pour maximiser la couverture de
seacutequence obtenue en ECD ont eacuteteacute les suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par des
eacutelectrons de 17 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 10 ms Contrairement aux expeacuteriences
reacutealiseacutees sur l‟APEX III nous n‟avons pas utiliseacute la technique de pieacutegeage dynamique des
ions En effet un gain de sensibiliteacute a eacuteteacute apporteacute par les laquo ion funnels raquo Dans ces conditions
expeacuterimentales l‟analyse du spectre ECD a permis l‟identification d‟un total de 59 ions
112
fragments correspondant agrave 19 ions c et 40 ions z dont 3 paires d‟ions compleacutementaires Le
pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 608 (Fig III 8)
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
00
05
10
15
20
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+6H]6+
[M+13H]13+
~
~
~
~~
~
~
~
mz
Intensx107
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
250 300 350 400 450 500 550 mz
z2+
c2+
z3+
c3+
z4+
z5+
c4+
Fig III 8 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX-Qe La couverture de seacutequence correspondante agrave la fragmentation et
lrsquoagrandissement de la reacutegion mz 250-550 sont eacutegalement montreacutes
Si l‟on compare les deux spectres ECD ci-dessus une meilleure efficaciteacute de fragmentation
a eacuteteacute obtenue sur l‟APEX III permettant d‟avoir une meilleure reacutesolution en ce qui concerne la
zone [20-55] correspondant agrave la partie de la proteacuteine aIF2α3 qui se retrouve en contact avec la
sous-uniteacute γ lorsque leur association est effective Neacuteanmoins la fragmentation ECD de la
proteacuteine sur l‟APEX-Qe permet aussi d‟avoir un bon pourcentage de couverture de seacutequence
pour deacuteterminer des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute notamment au niveau des
extreacutemiteacutes
113
III2213 Reacutesultats en HDXECD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ECD
Pour cela nous avons mis en application notre protocole de marquage pour un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure (Fig III 5)
L‟observation des spectres ECD apregraves eacutechange HD montre que les massifs isotopiques
avec l‟incorporation de deuteacuteriums se deacuteplacent vers des rapports masse sur charge plus
importants tout en s‟eacutelargissant car lincorporation progressive de deuteacuteriums ajoute des pics
isotopiques dans le massif (Fig III 9) La premiegravere conseacutequence agrave cet eacutelargissement est que
l‟intensiteacute totale du signal obtenu pour un ion fragment est reacutepartie sur un nombre plus grand
de pics composant le massif Il en reacutesulte une diminution de l‟intensiteacute globale du signal
pouvant entraicircner une perte de deacutetection Dans ce contexte le nombre de fragments pouvant
ecirctre interpreacuteteacutes de maniegravere correcte car lenveloppe isotopique preacutesente une intensiteacute
suffisante diminue par rapport agrave lexpeacuterience sans deuteacuterium Parfois mecircme certains
fragments disparaissent complegravetement dans le bruit de fond contribuant agrave son augmentation
En effet les ions fragments c et z de faible intensiteacute avant l‟eacutechange ne sont plus deacutetectables
dans les spectres apregraves eacutechange Une autre conseacutequence de l‟eacutelargissement des massifs
isotopiques ayant incorporeacute des deuteacuteriums est leur superposition compliquant aussi fortement
l‟analyse des reacutesultats Plus le nombre de fragments est grand et moins il est facile de suivre
l‟incorporation des deuteacuteriums Par ailleurs pour les hauts rapports mz on note eacutegalement
l‟apparition de pics intenses agrave toutes les uniteacutes de masse perturbant davantage l‟interpreacutetation
des reacutesultats Ce pheacutenomegravene indeacutesirable reacutesultant de la recapture successive d‟un eacutelectron
avait eacutegalement eacuteteacute observeacute lors de la thegravese de M Duchateau (15) Une solution pour le
limiter a eacuteteacute d‟optimiser au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les
recaptures successives tout en obtenant suffisamment de fragmentations (eacutenergie cineacutetique
des eacutelectrons de 17 eV pendant 10 ms)
114
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
000
025
050
075
100
125
7x10
Intens
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
6x10
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
[M+12H]12+
[M+12H]12+
z324+
z324+
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
Fig III 9 Comparaison des spectres ECD drsquoaIF2α3 sans HDX (en bleu) et avec HDX t=1h
(en rouge) Agrandissements des reacutegions du spectre mz 869-884 (a) et mz 1080-1150 (b)
L‟analyse des spectres ECD montre donc une perte importante de sensibiliteacute apregraves eacutechange
HD essentiellement pour les hauts rapports mz La conseacutequence immeacutediate est une
diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD ce qui n‟est pas
favorable pour obtenir une bonne reacutesolution Nous avons identifieacute au total 43 ions fragments
correspondant agrave 23 ions c et 20 ions z dont une paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage
de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 456 (Fig III 10)
(a)
(b)
115
Fig III 10 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ECD
Lanalyse de la Fig III 10 montre clairement que si lanalyse des petits fragments
(extreacutemiteacutes N- et C-terminales) ne pose pas de problegraveme lanalyse dions fragments plus gros
correspondant agrave une rupture plutocirct au niveau du milieu de la seacutequence polypeptidique est
bien plus probleacutematique A la diffeacuterence de l‟APEX III en pieacutegeage dynamique il semble que
sur l‟APEX-Qe la capaciteacute de pieacutegeage du piegravege hexapolaire soit limitante et ne permette pas
d‟accumuler autant d‟ions dans la cellule Pour eacuteviter ce problegraveme il faudrait pouvoir
accumuler plus de temps pour faire sortir les pics peu intenses du bruit de fond (mais ce nest
pas possible avec notre systegraveme de seringue refroidie car leacutechange inverse devient trop grand
au bout de 10 minutes) Une autre solution agrave ce problegraveme aurait pu eacutegalement ecirctre une
augmentation du champ magneacutetique qui aurait permis d‟augmenter la gamme dynamique
ainsi que la vitesse de balayage
III2214 Analyse des donneacutees
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Data Analysis (Bruker Daltonics)
L‟analyse des spectres de fragmentation MSMS est effectueacutee entiegraverement manuellement ce
qui la rend longue et fastidieuse
La premiegravere eacutetape de l‟analyse consiste agrave identifier les ions fragments c et z preacutesents dans
le spectre enregistreacute avant l‟eacutechange HD Une liste de pics est alors geacuteneacutereacutee Elle contient
tous les pics des massifs isotopiques correspondant aux ions fragments identifieacutes Cette liste
reacutepertorie le rapport mz et l‟intensiteacute de chaque pic A partir de celle-ci les masses moyennes
pondeacutereacutees des fragments n‟ayant pas incorporeacute de deuteacuteriums sont calculeacutees Il s‟agit ensuite
de proceacuteder de la mecircme maniegravere pour les fragments ayant incorporeacute des deuteacuteriums apregraves
eacutechange Pour la seacuteparation des massifs isotopiques eacutelargis et la deacutetermination de leur masse
moyenne pondeacutereacutee la preacutecision sur la mesure de masse et la reacutesolution de l‟instrument sont
deux critegraveres essentiels Afin de cartographier les eacutechanges isotopiques des hydrogegravenes
d‟amide le choix de spectromegravetres de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR et Orbitrap) est
116
justifieacute Enfin le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour chaque ion fragment peut ecirctre
deacutetermineacute Il est obtenu en faisant la diffeacuterence entre la masse moyenne pondeacutereacutee d‟un ion
fragment donneacute apregraves eacutechange isotopique avec celle obtenue sans eacutechange et en multipliant
par la charge Le taux de deuteacuteration correspondant est deacuteduit en divisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le nombre d‟hydrogegravenes d‟amide eacutechangeables (multiplieacute par cent)
La repreacutesentation la plus directe des reacutesultats consiste agrave tracer le graphe du nombre total de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment en fonction de sa position (numeacutero de reacutesidu)
dans la seacutequence Pour un temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O donneacute deux graphes
peuvent alors ecirctre reacutealiseacutes correspondant agrave l‟analyse des deux seacuteries d‟ions c et z (Fig III 11)
La ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la seacutequence de tous les deuteacuteriums
incorporeacutes dans la proteacuteine Cette courbe theacuteorique correspond donc agrave l‟incorporation
moyenne en deuteacuteriums pour chaque ion fragment Elle tient compte du contenu maximal de
deuteacuteriums incorporeacutes par la proteacuteine Dans le cas que nous preacutesentons qui correspond agrave un
temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte eacutetait marqueacutee agrave 61 Chaque
point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de 061 deuteacuterium par reacutesidu Les
deacutecrochements de la courbe sont dus agrave la preacutesence de proline dans la seacutequence de la proteacuteine
qui est le seul acide amineacute qui ne possegravede pas de groupement amide N-H de liaison Si notre
expeacuterience avait abouti agrave un reacutearrangement total des deuteacuteriums sur les hydrogegravenes d‟amide le
long de la chaicircne peptidique tous les points expeacuterimentaux en rose et en bleu se situeraient
sur la courbe noire Or ce n‟est pas le cas Par conseacutequence nous pouvons conclure que nous
n‟avons pas de redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD
117
c-type fragments (N-terminus)
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Numeacutero de reacutesidu
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40 50 60
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Fig III 11 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment en fonction de son numeacutero de reacutesidu pour les seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure
drsquoincubation dans D2O
Une autre maniegravere de repreacutesenter ces reacutesultats est de tracer le nombre de deuteacuteriums par
reacutesidu (et non plus le nombre cumuleacute de deuteacuteriums le long de la seacutequence) (Fig III 12) Ce
nombre est calculeacute en faisant la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour deux
ions fragments conseacutecutifs Par exemple si on considegravere l‟extreacutemiteacute N-terminale le nombre
de deuteacuteriums incorporeacutes par le reacutesidu numeacutero dix a eacuteteacute deacutetermineacute en faisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le fragment c10 moins celui du fragment c9 Le taux de deuteacuteration
obtenu pour ce reacutesidu a eacuteteacute de 68 Lorsqu‟il manquait des ions fragments une moyenne
d‟incorporation des deuteacuteriums entre les deux reacutesidus les plus proches a alors eacuteteacute calculeacutee
Dans ce cas la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour les deux fragments
correspondants a donc eacuteteacute diviseacutee par le nombre de reacutesidus les seacuteparant Ainsi entre les
reacutesidus 33 et 44 le taux moyen de 70 a eacuteteacute calculeacute en faisant le nombre de deuteacuteriums
incorporeacutes dans c44 moins celui dans c33 diviseacute par 11
118
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero de reacutesidu
Fig III 12 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O
L‟ensemble des points se situe en dessous de un qui est la valeur maximale de deuteacuteration
attendue correspondant exactement agrave l‟incorporation d‟un deuteacuterium par hydrogegravene d‟amide
Plus le taux de deuteacuteration s‟eacuteloigne de la valeur de un plus la zone correspondante de la
proteacuteine est structureacutee Inversement plus le taux est proche de un moins la proteacuteine est
structureacutee Ces reacutesultats peuvent donc ecirctre exploiteacutes pour obtenir des informations structurales
sur la sous-uniteacute α3 du complexe d‟initiation de la traduction aIF2 chez Sulfolobus
solfataricus Ils ont eacuteteacute reporteacutes sur la structure primaire d‟aIF2α3 dans laquelle des eacuteleacutements
de structure connus (heacutelices feuillets et boucles) ont eacuteteacute indiqueacutes (Fig III 13) Les zones en
bleu caracteacuteriseacutees par une incorporation faible de deuteacuteriums indiquent une zone tregraves
structureacutee de la proteacuteine Le passage de bleu agrave rouge (avec des zones intermeacutediaires en vert
jaune ou orange) montre des segments de la proteacuteine de moins en moins structureacutes
119
Fig III 13 Repreacutesentation scheacutematique sur la structure primaire et secondaire drsquoaIF2α3 du
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu Ce nombre a eacuteteacute calculeacute agrave partir des taux de
deuteacuteration drsquoions fragments conseacutecutifs ou proches pour les seacuteries c et z apregraves une heure
drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O
Malgreacute la diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD des
informations de structure sont deacuteduites sur une grande partie de la proteacuteine Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves est principalement obtenue au niveau des extreacutemiteacutes et dans des zones non
structureacutees de la proteacuteine Notons que la zone pour laquelle agrave la fois des ions c et z sont
obtenus preacutesente une parfaite correacutelation entre nos reacutesultats ce qui constitue une validation
suppleacutementaire de notre approche Neacuteanmoins nous n‟observons pas toujours une tregraves bonne
correacutelation entre les taux d‟incorporation des deuteacuteriums que nous avons calculeacutes et les
eacuteleacutements structuraux proposeacutes par la cristallographie et notamment en ce qui concerne la
zone [20-55] Cette zone qui comprend l‟heacutelice α1 le feuillet β2 et le deacutebut du feuillet β3
correspond agrave la partie de la proteacuteine qui interagit avec la sous-uniteacute γ lorsqu‟il y a formation
du complexe
Il est eacutegalement possible de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums dans la proteacuteine entiegravere
ou au niveau des ions fragments au cours du temps en reacutealisant des cineacutetiques d‟eacutechange HD
En faisant varier le temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O il est alors possible
d‟obtenir diffeacuterents points de cineacutetique et donc de tracer une courbe de cineacutetique
d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) Elle nous renseigne sur la vitesse
d‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine et sur le taux de deuteacuteration maximal atteint
120
Dans le cas de la proteacuteine aIF2α3 la vitesse d‟eacutechange HD est tregraves rapide Un plateau est
atteint degraves trente minutes d‟incubation correspondant agrave un marquage maximal d‟environ 66
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
d
eu
teri
ation
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
Temps (minutes)
Po
urc
enta
ge
de
deu
teacutera
tio
n
Fig III 14 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la proteacuteine entiegravere
Les vitesses d‟eacutechange pour les diffeacuterents ions fragments peuvent eacutegalement ecirctre traceacutees
(Fig III 15) Une autre maniegravere simple (autre que celle discuteacutee dans III2214) de s‟assurer
qu‟il n‟y a pas eu un reacutearrangement aleacuteatoire total des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique est de veacuterifier que les pourcentages de deuteacuteration observeacutes pour les ions
fragments c et z de mecircme taille ne sont pas identiques En effet deux cineacutetiques d‟eacutechange
identiques pour des ions fragments c et z comportant le mecircme nombre d‟hydrogegravenes
eacutechangeables seraient la signature d‟une redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums ayant
eu lieu avant la formation de ces ions
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500
c13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
9193319575m1
0053075008066m2
9422930195m3
045244084732m4
NA12581Chisq
NA097786R
0
10
20
30
40
50
60
70
0 500 1000 1500
z13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
1007264506m1
3463903455m2
11624-095451m3
095437m4
NA93538Chisq
NA099061R
Fig III 15 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour les ions fragments c13 et z13
dichargeacutes
121
Nous avons donc geacuteneacutereacute un important jeu de donneacutees par la reacutealisation d‟une cineacutetique
d‟eacutechange HD combineacutee agrave une fragmentation par ECD Nous avons montreacute que notre
approche permettait de limiter la redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique en phase gazeuse et d‟obtenir des informations de structure sur une grande partie
de la proteacuteine Neacuteanmoins la comparaison de nos reacutesultats de HDX avec les donneacutees obtenues
par cristallographie montre des diffeacuterences que l‟on peut peut-ecirctre expliquer par le fait que les
donneacutees de cristallographie sont issues du complexe (16) La proteacuteine adopterait une
conformation particuliegravere (en heacutelice et feuillets) lorsqu‟elle serait en interaction avec la sous-
uniteacute γ afin de stabiliser la formation du complexe tandis qu‟en absence de son partenaire
proteacuteique elle resterait deacutestructureacutee Une analyse du sous-complexe aIF2α3γ permettra de
confirmer cette hypothegravese
En conclusion nos reacutesultats sont encourageants mais ils doivent eacutegalement ecirctre ameacutelioreacutes
pour que nous puissions obtenir des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute pour une
grande partie de la proteacuteine qui nous permettraient de distinguer tregraves nettement des zones
structureacutees de segments deacutesordonneacutes
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ
III2221 Optimisation du protocole drsquoanalyse
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres de source et la concentration de
l‟eacutechantillon proteacuteique afin d‟obtenir une bonne intensiteacute du signal sur l‟APEX-Qe Alors que
la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute analyseacutee agrave la concentration de 57 microM une concentration de 74 microM
apregraves laquo quench raquo et deacutenaturation a eacuteteacute neacutecessaire agrave l‟obtention d‟un spectre de masse aussi
intense que celui qui avait eacuteteacute obtenu pour la proteacuteine seule De plus nous avons reacutegleacute
l‟instrument pour maximiser l‟observation de la sous-uniteacute α3 en particulier via les reacuteglages
du quadripocircle de l‟instrument car nous avions deacutejagrave un jeu de donneacutees sur cette proteacuteine Le
spectre de masse d‟aIF2α3 en complexe avec γ ainsi obtenu est donneacute dans la Fig III 16
122
aIF2a3g_ss_noHD_000003d +MS
0
1
2
3
4
7x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+13H]13+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+[M+14H]14+
mz
Intensx107
Fig III 16 Spectre MS drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HDX obtenu sur lrsquoAPEX-
Qe avec maximisation de lrsquointensiteacute de la sous-uniteacute α3
Dans une deuxiegraveme eacutetape les paramegravetres ECD ont eacuteteacute optimiseacutes pour obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ avant
l‟ajout de l‟eacutetape d‟eacutechange HD Le meilleur pourcentage de couverture de seacutequence obtenu
a eacuteteacute d‟environ 40 avec les paramegravetres suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par
des eacutelectrons de 1 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 35 ms Le spectre ECD correspondant est
donneacute dans la Fig III 17
aIF2a3g_ss_noHD_000005d +MS
0
1
2
3
6x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 mzmz
Intensx106
Fig III 17 Spectre ECD drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HD enregistreacute sur
lrsquoAPEX-Qe
123
Finalement le complexe a eacuteteacute analyseacute par HDXECD Le protocole de marquage du
complexe aIF2α3γ est identique agrave celui utiliseacute pour la proteacuteine α3 seule Le principe est
rappeleacute dans la Fig III 18 La fragmentation ECD est reacutealiseacutee sur la sous-uniteacute α3 apregraves
diffeacuterents temps d‟incubation du complexe α3γ dans D2O
Fig III 18 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude de la sous-uniteacute alpha3 en
complexe avec gamma (aIF2α3γ) en HDXMS par analyse laquo top-down raquo ECD
III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD
L‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine aIF2α3 en complexe avec γ a eacuteteacute suivie au
cours du temps et compareacutee agrave celle qui avait eacuteteacute obtenue pour la sous-uniteacute α3 seule (Fig III
19) Les deux courbes de cineacutetique d‟eacutechange HD preacutesentent la mecircme allure Neacuteanmoins
une diffeacuterence notable au niveau du taux maximal de deuteacuteration a eacuteteacute mise en eacutevidence
apregraves association de la proteacuteine En effet lorsque la proteacuteine a eacuteteacute complexeacutee la valeur
maximale atteinte a diminueacute d‟environ 20 passant de 66 (pour la proteacuteine seule) agrave 48
(pour la proteacuteine en complexe) Ce reacutesultat est encourageant dans la mesure ougrave l‟on attend une
baisse de la deuteacuteration pour α3 apregraves son association avec γ En effet une diminution des
vitesses d‟eacutechange HD est attendue dans la zone d‟interaction des deux sous-uniteacutes
124
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
Sous uniteacute alpha3 seulSous uniteacute alpha3 en complexe
d
eu
teriatio
n
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
5657830388m1
00240560048802m2
5050216726m3
5630328684m4
NA43553Chisq
NA091987R
Temps (minutes)
Pourc
enta
ge
de
deu
teacutera
tion
Fig III 19 Cineacutetiques drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la sous-uniteacute alpha3 seule
(aIF2α3 courbe en noir) et en complexe avec gamma (aIF2α3γ courbe en rouge)
Nous nous sommes ensuite inteacuteresseacutes aux diffeacuterences locales d‟incorporation des
deuteacuteriums pour la proteacuteine en complexe que nous avons compareacutees agrave celles qui avaient eacuteteacute
obtenues pour la proteacuteine seule (Fig III 12) afin de deacuteterminer la surface d‟interaction Pour
cela nous avons repreacutesenteacute comme nous l‟avions fait pour la proteacuteine seule (III2214) le
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par fragments en fonction du numeacutero de reacutesidu
correspondant ainsi que le nombre de deuteacuteriums par acide amineacute calculeacute agrave partir des ions des
deux seacuteries c et z Les reacutesultats sont preacutesenteacutes dans les Fig III 20 et Fig III 21
Ainsi nous avons pu constater que nous n‟avions toujours pas de redistribution aleacuteatoire
totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD car l‟incorporation des deuteacuteriums le long
de la seacutequence ne suit pas la moyenne statistique (Fig III 20)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero du reacutesidu
Ions fragments c
Fig III 20 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion c issu
de la fragmentation ECD drsquoaIF2α3 en fonction de son numeacutero de reacutesidu apregraves une heure
drsquoincubation du complexe aIF2α3γ dans D2O
125
De plus en comparant le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour α3 seule
et α3 en complexe avec γ on a pu mettre en eacutevidence des zones de la proteacuteine qui
eacutechangeaient moins rapidement (flegraveches descendantes Fig III 21) dans le cas de
l‟association des sous-uniteacutes Les graphes montrent eacutegalement des segments peptidiques qui
ont un taux d‟eacutechange plus important (flegraveches ascendantes) ou similaire (signes eacutegal) dans la
proteacuteine en complexe par rapport agrave la proteacuteine seule
Nous avons ensuite repreacutesenteacute les diffeacuterences de deuteacuteration obtenues par reacutesidu ou
segment peptidique entre la proteacuteine α3 seule et en complexe avec γ (deacutetermineacutees agrave partir de
Fig III 21) sur la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (Fig III 22) afin d‟eacutemettre des
hypothegraveses quant agrave la maniegravere dont les sous-uniteacutes se lient entre elles Les reacutesultats montrent
que l‟ensemble de la proteacuteine semble voir la vitesse d‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide
modifieacutee dans le complexe et qu‟il n‟est pas possible de localiser preacuteciseacutement de surface
d‟interaction On notera en particulier que la reacuteduction de vitesse d‟eacutechange aurait pu donner
la zone de contact par une baisse d‟accessibiliteacute mais que la reacuteduction de la vitesse d‟eacutechange
peut aussi ecirctre lieacutee agrave des changements conformationnels ou agrave des variations de la dynamique
de la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ
126
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mbre
de
deu
teacuteri
um
s
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Fig III 21 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus pour la
sous-uniteacute alpha3 seule (aIF2α3 points en noir) sont compareacutes agrave ceux de la sous-uniteacute
alpha3 en complexe avec gamma (aIF2α3γ points en rouge)
Sous-uniteacute 3
N-ter
Heacutelice 2
C-ter
Heacutelice 1
D
Sous-uniteacute
Sous-uniteacute
Fig III 22 Structure tridimensionnelle du complexe aIF2αβγ de S solfataricus obtenu par
cristallographie (16) Zoom sur la sous-uniteacute α3 sur laquelle ont eacuteteacute reporteacutees les diffeacuterences
de deuteacuteration entre la proteacuteine seule et en complexe
127
Nous avons ensuite voulu comparer l‟ETD agrave l‟ECD en termes de sensibiliteacute rapiditeacute et
efficaciteacute de fragmentation avec pour objectif de gagner en reacutesolution spatiale Pour cela nous
avons fragmenteacute en ETD la proteacuteine aIF2α3 et compareacute ces reacutesultats agrave ceux obtenus
auparavant en ECD
III23 Fragmentation par ETD
III231 Spectre de masse
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment ces expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un instrument de type Orbitrap (Fig III 23) Le spectre de masse d‟aIF2α3 a eacuteteacute
obtenu apregraves infusion directe via le systegraveme de seringue refroidie de la proteacuteine agrave la
concentration de 57 microM et apregraves son ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
Fig III 23 Spectre MS drsquoaIF2α3 obtenu sur un spectromegravetre de masse LTQ Orbitrap Velos
apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
128
III232 Reacutesultats obtenus en ETD
Nous avons observeacute le mecircme pheacutenomegravene en ETD qu‟en ECD la couverture de seacutequence
obtenue apregraves seacutelection d‟un eacutetat de charge particulier est moins bonne que celle obtenue sans
seacutelection Le problegraveme est que si on peut travailler sans seacutelection sur le FT-ICR ce nest pas
le cas pour lOrbitrap Nous avons eacutegalement constateacute que comme en ECD le nombre d‟ions
fragments deacutetecteacute eacutetait lieacute agrave l‟eacutetat de charge seacutelectionneacute de la proteacuteine mecircme si une meilleure
couverture de seacutequence est obtenue sans seacutelection Il est classiquement observeacute que plus l‟eacutetat
de charge seacutelectionneacute est important meilleure est la fragmentation En ETD comme en ECD
nous avons observeacute que la fragmentation eacutetait meilleure lorsqu‟un eacutetat de charge pair eacutetait
seacutelectionneacute et qu‟elle eacutetait toujours moins bonne pour les eacutetats de charge impairs Nous avons
donc deacutecideacute de fragmenter en ETD deux eacutetats de charge pairs de la proteacuteine correspondant agrave
l‟eacutetat de charge pair le plus eacuteleveacute et agrave celui le plus intense Dans notre cas les eacutetats de charge
14+ et 12+ ont eacuteteacute seacutelectionneacutes (Fig III 23) pour ecirctre ensuite fragmenteacutes (Fig III 24)
L‟eacutetude des reacutesultats de fragmentation de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 12+ a permis
l‟identification de 51 ions fragments correspondant agrave 29 ions c et 22 ions z dont deux paires
d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de
533 (Fig III 24 (a)) L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ a
quant agrave elle reacuteveacuteleacute la preacutesence de 61 ions fragments correspondant agrave 31 ions c et 30 ions z
dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Une meilleure couverture de seacutequence avec un
pourcentage de 663 a ainsi eacuteteacute obtenue (Fig III 24 (b)) Afin d‟optimiser le pourcentage
de couverture de seacutequence de la proteacuteine trois temps d‟activation (10 15 et 25 ms) d‟une
minute chacun ont eacuteteacute testeacutes conseacutecutivement Il est apparu que la combinaison de tous les
scans enregistreacutes pendant ces trois minutes de fragmentation ETD a permis d‟obtenir le
meilleur reacutesultat de recouvrement de seacutequence L‟option laquo supplemental activation raquo a eacuteteacute
utiliseacutee Sur la base de ces reacutesultats nous avons donc choisi de fragmenter l‟eacutetat de charge
14+ apregraves eacutechange avec ces trois temps d‟activation
129
1102001-01_3_110105164919 300-536 RT 349-648 AV 237 NL 254E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 86974etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
1102001-01_3_110105164919 64-296 RT 048-344 AV 233 NL 257E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 74564etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
Fig III 24 Spectre ETD de la sous-uniteacute aIF2α3 seule sans eacutechange HD avec seacutelection de
lrsquoeacutetat de charge 12+ (a) et 14+ (b) et leur couverture de seacutequence associeacutee
III233 Reacutesultats en HDXETD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ETD De
la mecircme maniegravere qu‟en ECD nous avons proceacutedeacute au marquage d‟aIF2α3 pendant un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure
L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ reacutevegravele eacutegalement apregraves
eacutechange HD une diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence agrave 533 (Fig III
25) au lieu de 663 Nous avons identifieacute au total 49 ions fragments correspondant agrave 25 ions
c et 24 ions z dont aucune paire d‟ions compleacutementaires
(a)
(b)
130
Fig III 25 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ETD de lrsquoeacutetat de charge 14+
Le nombre de fragments identifieacutes dans les spectres ETD est leacutegegraverement plus important
que celui obtenu par ECD En revanche apregraves eacutechange HD en ETD comme en ECD une
importante perte de sensibiliteacute est observeacutee reacuteduisant consideacuterablement le pourcentage de
couverture de seacutequence (Fig III 26) Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment pour l‟ECD
une des ameacuteliorations agrave ce problegraveme serait d‟augmenter la dureacutee d‟analyse pour pouvoir
accumuler (ou combiner en ETD) un plus grand nombre de scans MSMS afin de faire sortir
les petits pics du bruit de fond Lagrave ougrave en ECD nous avions utiliseacute la totaliteacute des dix minutes
d‟analyse autoriseacutees avec le systegraveme de seringue refroidie avant que le laquo back-exchange raquo
devienne un problegraveme majeur en ETD en revanche seulement trois minutes de
fragmentation ont eacuteteacute reacutealiseacutees Ces expeacuteriences HDX eacutetant preacuteliminaires il conviendra par la
suite de profiter des dix minutes que nous disposons avec le systegraveme de seringue refroidie
pour reacutealiser la fragmentation ETD
Neacuteanmoins ces reacutesultats nous ont paru encourageants pour lutilisation de lETD plutocirct que
lECD pour ces approches laquo top-down raquo HDX car lETD est disponible sur un nombre de
spectromegravetres de masse bien plus important que lECD qui reste speacutecifique des FT-ICR
131
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
1102001-02_110111172633 11012011 172634ion transfer tube closed
1102001-02_110111172633 233-453 RT 180-470 AV 221 NL 220E3T FTMS + p ESI sa Full ms2 74973etd1000 [25000-200000]
1080 1085 1090 1095 1100 1105 1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145
mz
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Abun
danc
e
11206548
11186450
11226640
11046457
1093632811446618
1132659511096422
1137659710876289
11406533
10849925
11256479
1128648611026351
11111505
10896333
11166401
10986460
10951423
Fig III 26 Comparaison des spectres ECD (en rouge) et ETD (en noir) drsquoaIF2α3 apregraves une
heure drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O Agrandissements des reacutegions du spectre mz
1080-1150 En bleu le spectre ECD de la proteacuteine sans eacutechange HD
III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats drsquoECD
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Xcalibur (Thermo Scientific) La
fenecirctre du logiciel peut ecirctre diviseacutee en trois parties correspondant au chromatogramme au
spectre de masse et agrave la liste de pics associeacutes (Fig III 27) Le spectre ETD de l‟ion preacutecurseur
d‟eacutetat de charge 14+ agrave eacuteteacute geacuteneacutereacute agrave partir du chromatogramme Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment (III232) il reacutesulte de la combinaison des reacutesultats obtenus pour trois temps
d‟activation (10 15 et 25 ms) et correspond agrave une dureacutee d‟analyse d‟environ trois minutes
Les reacutesultats ETD peuvent eacutegalement ecirctre preacutesenteacutes sous forme d‟une liste de pics associant
chaque rapport mz d‟un ion agrave son abondance relative dans le spectre
132
[M+14H]14+
Fragmentation ETD (10 15 et 25 ms)
1 min temps d‟activation
RT ~3 min
Chromatogramme
Spectre ETDListe
des pics
Fig III 27 Preacutesentation de la fenecirctre du logiciel Xcalibur pour le traitement des spectres
ETD
Les reacutesultats ETD sont analyseacutes de la mecircme maniegravere qu‟en ECD Les ions fragments sont
identifieacutes dans les spectres sans eacutechange et apregraves eacutechange Leur masse moyenne pondeacutereacutee est
ensuite deacutetermineacutee dans les deux conditions (sans eacutechange et apregraves eacutechange) Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment est calculeacute en faisant la diffeacuterence de ses deux
masses moyennes pondeacutereacutees et en multipliant le reacutesultat par sa charge Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu est finalement deacuteduit par soustraction du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par deux ions fragments conseacutecutifs Dans le cas ougrave les ions fragments
ne sont pas conseacutecutifs cette diffeacuterence de deuteacuteriums incorporeacutes est moyenneacutee sur
l‟ensemble des acides amineacutes les seacuteparant Les reacutesultats ETD ont eacuteteacute compareacutes agrave ceux qui
avaient eacuteteacute obtenus par ECD (Fig III 28)
133
0
02
04
06
08
1
12
14
0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
0
02
04
06
08
1
12
14
0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Fig III 28 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute apregraves une
heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus en ETD (points en vert) sont compareacutes agrave
ceux obtenus en ECD (points en rose et en bleu respectivement pour les seacuteries drsquoions c et z)
Le taux de deuteacuteration de la proteacuteine entiegravere est de 66 en ECD contre 60 en ETD
Le premier constat agrave l‟issue de l‟analyse des reacutesultats ETD a eacuteteacute l‟obtention de nombres de
deuteacuteriums incorporeacutes supeacuterieurs agrave la valeur maximale attendue (gt 1) pour quelques reacutesidus
Deux hypothegraveses peuvent expliquer ce reacutesultat La premiegravere consiste agrave penser que le lavage
des chaicircnes lateacuterales n‟a pas eacuteteacute total Autrement dit il resterait des deuteacuteriums au niveau des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes qui n‟auraient pas eacuteteacute reacute-eacutechangeacutes avant l‟analyse
Cependant nous avons utiliseacute le mecircme protocole de marquage et le mecircme systegraveme
d‟introduction des eacutechantillons pour l‟analyse des eacutechanges isotopiques par ETD par rapport agrave
celle qui avait eacuteteacute reacutealiseacutee en ECD Or de telles valeurs n‟ont pas eacuteteacute obtenues en ECD
Notons ici que dans le cas de l‟analyse des ions z les zones pour lesquelles on obtient des
valeurs anormales en ETD correspondent agrave des reacutegions de la proteacuteine pour lesquelles tregraves peu
134
d‟informations en ECD avaient eacuteteacute extraites (incorporation moyenne de deuteacuteriums sur une
dizaine d‟acides amineacutes) La seconde hypothegravese repose sur le fait qu‟en ETD certains ions
fragments suivis apregraves eacutechange HD n‟auraient pas eacuteteacute correctement attribueacutes Des
expeacuteriences de MSMS sur ces ions fragments (expeacuteriences de MS3) permettraient de
confirmer ou d‟infirmer cette hypothegravese Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes mais n‟ont
malheureusement pas eacuteteacute concluants La faible intensiteacute des fragments obtenus par MS3 ne
nous a pas permis d‟identifier les ions fragments issus de la MSMS Un problegraveme de fuite au
niveau du montage de seringue refroidie en a eacuteteacute probablement la cause Nous n‟avons pas eu
le temps de reproduire les expeacuteriences
Neacuteanmoins on obtient une relativement bonne correacutelation pour les ions fragments c si on
compare les reacutesultats ETD agrave ceux obtenus en ETD tandis que des diffeacuterences notoires
d‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu pour les ions fragments z sont observeacutees Les
graphes ne se superposent pas agrave l‟exception de petites zones qui s‟alignent entre elles
III235 Conclusion
Contrairement aux analyses reacutealiseacutees en ECD les expeacuteriences ETD requiegraverent la seacutelection
preacutealable d‟un eacutetat de charge Malgreacute cette contrainte une couverture de seacutequence
leacutegegraverement meilleure a eacuteteacute obtenue en ETD (sans eacutechange et apregraves eacutechange HD) Elle a eacuteteacute
deacuteduite de la combinaison de spectres enregistreacutes pour trois temps d‟activation diffeacuterents (10
15 et 25 ms) correspondant agrave trois minutes de fragmentation au total Les spectres ECD
reacutesultent quant agrave eux de l‟accumulation de scans correspondant agrave la dissociation de la
proteacuteine par un faisceau d‟eacutelectrons d‟eacutenergie cineacutetique et de temps d‟irradiation fixeacutes
pendant dix minutes d‟analyse
Nous avons ensuite deacutecideacute de comparer la fragmentation CID sur des ions preacutecurseurs de
haut eacutetat de charge afin de limiter le laquo scrambling raquo (10) vs les meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECD et ETD)
135
III24 Fragmentation par CID
III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3
III2411 Spectres de masse
La proteacuteine aIF2α3 a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacutee par une approche HDX laquo top-down raquo CID La
premiegravere eacutetape a consisteacute agrave reacutealiser les spectres de masse sans eacutechange et apregraves eacutechange HD
gracircce agrave un instrument de type Q-ToF La proteacuteine deuteacutereacutee a eacuteteacute injecteacutee dans le spectromegravetre
de masse par le systegraveme de seringue refroidie puis ioniseacutee par eacutelectrospray dans des
conditions deacutenaturantes La faible reacutesolution de l‟instrument (Fig III 29) nous a ensuite
obligeacutes agrave veacuterifier les fenecirctres d‟isolation avant la fragmentation par CID Finalement les
eacutenergies de collision ont eacuteteacute optimiseacutees pour chaque eacutetat de charge
Sans eacutechange HD
Apregraves eacutechange HD
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
Fig III 29 Spectres MS drsquoaIF2α3 obtenus sans eacutechange (courbe rouge) et apregraves eacutechange
HD pendant une heure (courbe verte) agrave lrsquoaide drsquoun spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
Un agrandissement de lrsquoion preacutecurseur drsquoeacutetat de charge 13+ a eacuteteacute ajouteacute
136
III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID
L‟analyse des spectres CID des ions preacutecurseurs d‟eacutetat de charge 10+ agrave 16+ de la proteacuteine
aIF2α3 dans H2O a permis l‟identification d‟un total de 54 ions fragments correspondant agrave 23
ions b et 31 ions y dont deux paires d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de
seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 565 (Fig III 30 (a)) Il regroupe l‟ensemble de tous les ions
fragments identifieacutes dans les spectres correspondant agrave la dissociation des diffeacuterents eacutetats de
charge Apregraves incubation de la proteacuteine dans D2O pendant une heure et fragmentation par
CID seulement 20 ions fragments au total ont pu ecirctre suivis correspondant agrave 14 ions b et 6
ions y dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de la couverture de
seacutequence a ainsi eacuteteacute reacuteduit agrave 217 apregraves eacutechange HD (Fig III 30 (b))
b ions y ions Fig III 30 Pourcentages de couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 sans eacutechange (a) et apregraves
eacutechange HD (b) obtenus par fragmentation CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave
16+
La Fig III 31 illustre la complexiteacute du traitement des donneacutees en CID De la mecircme
maniegravere qu‟en ECD ou en ETD l‟analyse a consisteacute agrave deacuteterminer des masses moyennes
pondeacutereacutees d‟ions fragments La reacutesolution relativement faible de l‟instrument ainsi que la
faible abondance de certains ions fragments ont contribueacute agrave la diminution du nombre de
fragments pouvant ecirctre suivis apregraves eacutechange HD Ainsi le fragment b375+
a pu ecirctre interpreacuteteacute
dans les spectres de fragmentation par CID des ions preacutecurseurs 12+ agrave 16+ mais pas dans
ceux des eacutetats de charge 10+ et 11+ (Fig III 31) D‟autres (eg y2+ y3
+ y4
+ hellip) n‟ont pu ecirctre
suivis dans aucun des spectres (Fig III 30)
(a)
(b)
137
b375+[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+16H]16+
[M+11H]11+
[M+13H]13+
Fig III 31 Spectres CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave 16+ Agrandissement
(a) de la reacutegion mz 832-852 permettant de suivre le massif isotopique de lrsquoion fragment b375+
dans les diffeacuterents eacutetats de charge et (b) du massif isotopique lui-mecircme dans les eacutetats de
charge 11+ et 13+ pour montrer la complexiteacute de lrsquoanalyse
Nous avons ensuite calculeacute le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par les fragments qu‟il
nous eacutetait possible de suivre apregraves eacutechange HD dans les spectres CID des diffeacuterents eacutetats de
charge Nous avons reporteacute ces valeurs en fonction du numeacutero de reacutesidu dans la seacutequence
(Fig III 32) Rappelons que la ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la
seacutequence de tous les deuteacuteriums incorporeacutes dans la proteacuteine Il s‟agit donc dune courbe
theacuteorique Elle donne le nombre moyen de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment
calculeacute agrave partir du contenu maximal en deuteacuteriums de la proteacuteine Dans le cas que nous
preacutesentons qui correspond agrave un temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte
(a)
(b)
138
eacutetait marqueacutee agrave 57 Chaque point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de
057 deuteacuterium par reacutesidu
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Courbe theacuteorique
11+
12+
13+
14+
15+
16+
Numeacutero du reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments b ( Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
11+
13+15+14+
11+
14+15+
13+
12+
Fig III 32 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment b issus de la dissociation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 11+ agrave 16+ en
fonction de son numeacutero de reacutesidu La proteacuteine a eacuteteacute incubeacutee pendant une heure dans D2O
avant analyse
A la vue de ces reacutesultats on note que tous les points expeacuterimentaux ne sont pas aligneacutes sur
la courbe theacuteorique Par conseacutequent nous pouvons conclure de ce premier constat que nos
expeacuteriences HDXCID ne semblent pas aboutir agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des
deuteacuteriums le long de la chaicircne peptidique On remarque eacutegalement que les points
correspondant agrave la fragmentation du plus petit eacutetat de charge le 11+ (points en rouge sur la
Fig III 32) sont effectivement les plus proches de la redistribution totale des deuteacuteriums
Ainsi il semble reacuteellement y avoir un rapport entre le taux de redistribution HD et leacutetat de
charge du preacutecurseur Neacuteanmoins il est curieux dobserver que cest lion chargeacute 13+ qui
conduit aux ions fragments les plus eacuteloigneacutes de cette redistribution totale
Nous avons ici voulu reproduire les expeacuteriences HDXCID meneacutees tregraves reacutecemment par
l‟eacutequipe d‟I Kaltashov (10) sur notre systegraveme d‟eacutetude Ils ont montreacute qu‟il eacutetait possible
d‟analyser les eacutechanges isotopiques HD au sein des proteacuteines par une approche laquo top-down raquo
associeacutee agrave une activation collisionnelle (CID) En effet la seacutelection et la dissociation d‟ions
139
proteacuteiques de hauts eacutetats de charge limiteraient le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Or dans son
article I Kaltashov n‟a consideacutereacute qu‟un seul fragment le b19 pour en arriver agrave cette
conclusion Il ne s‟est donc inteacuteresseacute qu‟aux reacutesultats contenus sur une verticale du graphe
Dans notre cas si on se place au niveau des deux verticales que nous avons traceacutees sur la Fig
III 32 nos reacutesultats sont coheacuterents avec ceux de l‟article En revanche la discrimination nette
entre les grands et les petits eacutetats de charge n‟est pas toujours eacutevidente et parfois les reacutesultats
contredisent ceux obtenus par I Kaltashov
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines
Pour rendre l‟eacutetude du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo plus facile agrave mettre en eacutevidence
l‟article de I Kaltashov (10) se basait sur l‟utilisation d‟une eacutetiquette poly-histidines placeacutee agrave
l‟extreacutemiteacute soit N- soit C-terminale de la proteacuteine qu‟ils ont eacutetudieacutee L‟inteacuterecirct eacutetait que ces
segments sont connus comme eacutetant non structureacutes et qu‟on peut par conseacutequent preacutedire que la
vitesse d‟eacutechange y sera maximale par rapport agrave la partie structureacutee de la proteacuteine Dans le
cadre de leurs expeacuteriences la proteacuteine est initialement totalement marqueacutee par des deuteacuteriums
par dissolution dans du D2O et l‟incubation se fait en conditions natives apregraves dilution dans un
tampon H2O 10 mM aceacutetate d‟ammonium De ce fait on attend une perte rapide de la
deuteacuteration sur l‟extreacutemiteacute poly-histidines des proteacuteines Ils observent ainsi (Fig III 33) que
l‟activation par CID conduit agrave un laquo scrambling raquo important pour les eacutetats de charge faibles (9+
agrave 11+) alors qu‟il est nettement reacuteduit pour les eacutetats de charge 14+ agrave 20+
Nous avons souhaiteacute construire un systegraveme eacutequivalent pour notre proteacuteine aIF2α3 afin de
voir si nous aussi en CID pouvions mettre en eacutevidence la preacutesence de laquo scrambling raquo ou non
Pour cela nous avons construit un mutant de la proteacuteine aIF2α3 et l‟avons exprimeacute en
collaboration avec le Laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique La seacutequence de ce
mutant est donneacutee sur la Fig III 34
140
22 D
11 D
Avec Redistribution des D
Sans redistribution des D
Segment non structureacute de 21 acides amineacutes
Fig III 33 Nombre moyen de deuteacuteriums pour le fragment b19 en fonction de lrsquoeacutetat de charge
de lrsquoion preacutecurseur Les lignes horizontales en gris indiquent le nombre moyen de deuteacuteriums
calculeacute dans le cas drsquoune redistribution aleacuteatoire totale des hydrogegravenes et deuteacuteriums labiles
au sein de lrsquoion preacutecurseur avant la dissociation (en haut) et dans le cas de lrsquoabsence de
pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo (en bas)
Fig III 34 Seacutequence drsquoaIF2α3 comportant lrsquoeacutetiquette poly-histidines (acides amineacutes en vert)
En rose les fragments eacutetudieacutes par HDXCID
Notons degraves maintenant qu‟il nous eacutetait impossible de reproduire exactement l‟expeacuterience
d‟I Kaltashov avec notre proteacuteine en effet elle est instable dans des conditions non-salines
et ne peut ecirctre lyophiliseacutee Par conseacutequent il sera neacutecessaire de proceacuteder par un double
eacutechange tel que fait jusqu‟agrave preacutesent ie commencer par diluer la proteacuteine dans une solution
D2O NaCl 330 mM puis arrecircter l‟eacutechange par une dilution frac12 dans une solution H2O acide
formique 2 avant de proceacuteder au dessalage sur colonne De ce fait on ne profite plus de
l‟aspect deacutestructureacute de la chaicircne poly-histidines (qui sera rapidement deuteacutereacutee dans l‟eacutetape
d‟eacutechange) mais de la grande vitesse de reacute-eacutechange de la chaicircne poly-histidines une fois celle-
ci placeacutee en condition d‟arrecirct tel qu‟observeacute sur les peptides de T Joslashrgensen au Chap II On
peut consideacuterer que l‟eacutechange inverse (laquo back-exchange raquo) sera de la mecircme faccedilon que pour le
141
peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) nettement plus rapide sur la partie poly-histidines que sur le
reste de la seacutequence proteacuteique
Nous avons ensuite eacutetudieacute par HDXCID les fragments b2-10 correspondant aux fragments
situeacutes dans l‟eacutetiquette poly-histidines (en vert sur Fig III 34) ainsi que les fragments
communs avec ceux de la proteacuteine sans poly-histidines soit les fragments b21-22 et b28
correspondant aux fragments b9-10 et b16 de la proteacuteine sans eacutetiquette poly-histidines Les
reacutesultats obtenus sont preacutesenteacutes dans la Fig III 35 Ils sont compareacutes agrave ceux de la Fig III 32
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 20 25 30
Courbe theacuteorique
17+
16+
15+
14+
13+17+
14+
16+15+
17+
14+
16+
15+
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Numeacutero du reacutesidu
Fig III 35 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums contenus dans les ions b issus de la
fragmentation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 13+ agrave 17+ en fonction de leur
position dans la seacutequence (numeacutero de reacutesidu) La proteacuteine laquo taggeacutee raquo a eacuteteacute incubeacutee pendant
une heure dans D2O Son analyse en MS reacutevegravele un pourcentage de deuteacuteration de 57
On constate tout d‟abord que les fragments b2 agrave b10 preacutesentent un taux de deuteacuteration
largement infeacuterieur (jusqu‟agrave 2 D d‟eacutecart pour b10) agrave la courbe de laquo scrambling raquo complet Ceci
montre deux choses Le premier reacutesultat est que le laquo scrambling raquo est tregraves loin d‟ecirctre total sur
cette reacutegion Par conseacutequent mecircme en cas de laquo scrambling raquo partiel ce reacutesultat ne peut ecirctre
obtenu que si la deuteacuteration locale est tregraves infeacuterieure agrave la moyenne sur lensemble de la
proteacuteine On peut donc en deacuteduire ce second reacutesultat comme nous lavions espeacutereacute un laquo back-
exchange raquo rapide des hydrogegravenes damide des histidines a bien eu lieu On ne peut pas par
contre savoir si ce laquo back-exchange raquo a eacuteteacute total ou pas On note par ailleurs que dans cette
142
partie de la proteacuteine l‟eacutetat de charge ne semble pas jouer un rocircle important sur la deuteacuteration
nettement moins en tout cas que les effets observeacutes pour la proteacuteine sans eacutetiquette
Si on s‟inteacuteresse maintenant aux fragments b21-22 et b28 on constate une dispersion des
niveaux de deuteacuteration nettement reacuteduite par rapport agrave celle de la proteacuteine non-marqueacutee et en
tout cas sans aucune rupture brutale similaire agrave celle preacutesenteacutee dans l‟article d‟I Kaltashov Il
est par contre difficile de comparer un agrave un les niveaux de deuteacuteration car on ne connaicirct pas a
priori le niveau de deuteacuteration restant sur la partie poly-histidines Toutefois on notera
qu‟entre les fragments b22 et b28 de la proteacuteine portant un His-tag on a 35 D de diffeacuterence On
retrouve une diffeacuterence similaire entre les fragments b10 et b16 de la proteacuteine portant un His-
tag
Pour compleacuteter ce travail il nous manque un eacuteleacutement qui est la veacuterification du taux reacuteel de
deuteacuteration sur la partie poly-histidines Ce travail reste agrave faire avec un suivi par ECD en
faisant l‟hypothegravese d‟une absence de laquo scrambling raquo dans ce cas
Mais au final une tendance nette semble neacuteanmoins se deacutegager dans une approche laquo top-
down raquo l‟activation par CID ne conduit pas neacutecessairement agrave un laquo scrambling raquo total des
deuteacuteriums d‟amide au moins dans certaines conditions L‟article d‟I Kaltashov semble avoir
identifieacute l‟eacutetat de charge comme eacutetant un facteur Dans notre cas l‟eacutetat de charge ne semble
pas jouer un rocircle aussi marqueacute Mais il faut noter d‟une part que l‟article d‟I Kaltashov
comme notre approche avec le His-tag n‟ont regardeacute le laquo scrambling raquo qu‟au niveau des
extreacutemiteacutes de la proteacuteine et d‟autre part que dans les deux cas un laquo scrambling raquo partiel
semble observeacute puisqu‟il reste une fraction de deuteacuteriums au niveau de l‟extreacutemiteacute
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en
eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse
Les expeacuteriences sont difficilement reproductibles par une mecircme technique ce qui
complique la comparaison entre les diffeacuterentes meacutethodes Plusieurs raisons permettent
d‟expliquer ce fait Tout d‟abord il est tregraves difficile d‟obtenir le mecircme pourcentage initial de
deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere De plus l‟efficaciteacute de fragmentation varie en fonction du
de l‟instrument mais aussi en fonction du temps pour un mecircme instrument N‟oublions pas de
mentionner eacutegalement les problegravemes techniques que nous avons rencontreacutes qui sont lieacutes au
143
montage de seringue refroidie et qui concernent la fuite du systegraveme Un autre fait surprenant
est que nous ne sommes pas parvenus apregraves des temps longs d‟incubation dans D2O agrave un
maximum de deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere proche des 90-95 deacutecrits dans la
litteacuterature En effet le taux maximal de deuteacuteration obtenu pour aIF2α3 si on se reacutefegravere au
laquo fit raquo de double exponentielle de sa cineacutetique d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) a
eacuteteacute de 66 seulement A partir de ce constat deux hypothegraveses peuvent ecirctre formuleacutees
- nous ne sommes pas arriveacutes au bout de la cineacutetique d‟eacutechange de la proteacuteine Dans ce cas
des temps d‟incubation dans D2O plus longs seraient neacutecessaires pour que les hydrogegravenes
d‟amide qui preacutesentent des vitesses d‟eacutechange tregraves lentes finissent par s‟eacutechanger Le laquo fit raquo
de la cineacutetique serait alors agrave revoir
- d‟importantes pertes de deuteacuteriums sont enregistreacutees ce qui n‟est pas souhaitable et pose
le problegraveme de l‟interpreacutetation des reacutesultats
Afin de deacutepartager ces deux hypothegraveses et ainsi de mieux comprendre le sens de nos
reacutesultats nous avons deacutecideacute de deacuteterminer la valeur maximale de reacutefeacuterence ie le taux
maximal de deuteacuteration pour la proteacuteine aIF2α3 Pour cela la proteacuteine a eacuteteacute analyseacutee avec le
mecircme protocole qui a eacuteteacute deacutecrit dans la Fig III 5 agrave l‟exception pregraves qu‟elle a eacuteteacute initialement
placeacutee dans des conditions deacutenaturantes et non plus natives
Afin de deacuteterminer le taux maximal de deuteacuteration de la proteacuteine aIF2α3 nous avons donc
deacutecideacute de la deacutenaturer avec du chlorure de guanidinium preacutealablement agrave l‟analyse HDXMS
Il a eacuteteacute montreacute que ce composeacute chaotropique utiliseacute agrave forte concentration eacutetait capable de
deacutenaturer totalement les proteacuteines (17) ce qui rendrait tous les hydrogegravenes d‟amide
accessibles agrave l‟eacutechange
La proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M
dans D2O agrave 50degC sous agitation pendant 24 heures Puis elle a eacuteteacute analyseacutee en MS afin de
calculer son taux de deuteacuteration Malheureusement aucun signal n‟a eacuteteacute deacutetecteacute indiquant
que la proteacuteine a eacuteteacute deacutegradeacutee ou a preacutecipiteacute suite au traitement chimique La seacutequence de la
proteacuteine aIF2α3 ne comportant que tregraves peu d‟acides amineacutes aromatiques (seulement trois
tyrosines) n‟a pas permis la mesure de la concentration de l‟eacutechantillon par
spectrophotomeacutetrie UV agrave 280 nm Par ailleurs la solution de chlorure de guanidinium quant
agrave elle absorbe agrave la longueur donde utiliseacutee pour les proteacuteines
144
Dans le but de tester si le traitement chimique pour la deacutenaturation deacutegrade la proteacuteine
nous avons deacutecideacute de reacutealiser un gel SDS-PAGE 16 permettant de tester la preacutesence
d‟aIF2α3 (10 kDa) Nous avons eacutegalement souhaiteacute tester si c‟est l‟eacutetape de dessalage qui
conduit agrave la perte de la proteacuteine Pour cela un autre eacutechantillon traiteacute mais non dessaleacute agrave eacuteteacute
preacutepareacute Malheureusement les eacutechantillons sont si visqueux qu‟il est impossible de les
deacuteposer L‟origine de cette viscositeacute n‟est pas tregraves claire neacuteanmoins un temps d‟incubation de
24 heures dans le chlorure de guanidinium semble trop long
Nous avons donc reacutealiseacute d‟autres tests dans des conditions diffeacuterentes afin de deacuteterminer le
temps maximal d‟incubation dans le chlorure de guanidinium pour lequel la proteacuteine n‟est pas
deacutegradeacutee Diffeacuterents temps d‟incubation ont eacuteteacute testeacutes t0=0s t=5h et t=24h Pour chaque
temps d‟incubation le premier eacutechantillon proteacuteique n‟a pas eacuteteacute dessaleacute tandis que le second
l‟a eacuteteacute (Fig III 36) Dans le cas ougrave une eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee (puits 4 6 et 8) la
solution d‟eacutelution correspondant agrave la proteacuteine dans H2OACNAF (49492) a eacuteteacute eacutevaporeacutee
par SpeedVac pour ecirctre ensuite resuspendue dans H2O afin de faciliter son deacutepocirct sur gel apregraves
ajout du tampon Laemmli Sans dessalage la proteacuteine traiteacutee au chlorure de guanidinium est
dilueacutee dans H2OAF2 afin de mimer l‟eacutetape d‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange (Fig III 5)
Les eacutechantillons non dessaleacutes sont ensuite preacutepareacutes avec du tampon Laemmli Neacuteanmoins agrave
l‟issue du meacutelange avec le tampon les eacutechantillons ont preacutecipiteacute empecircchant leur deacutepocirct preacutevu
dans les puits 3 5 et 7 Ce qui explique l‟absence de bandes dans ces puits et donc l‟absence
de proteacuteine Un marqueur de poids moleacuteculaire a eacuteteacute deacuteposeacute dans le premier puits Il s‟agit
d‟un meacutelange de proteacuteines de reacutefeacuterence dont la taille est connue servant agrave estimer la taille des
moleacutecules d‟inteacuterecirct Un teacutemoin positif a eacuteteacute deacuteposeacute dans le deuxiegraveme et dernier puits Il est
constitueacute de la proteacuteine aIF2α3 n‟ayant pas subi de traitement chimique ni de dessalage Une
bande intense autour de 10 kDa est observeacutee dans ces deux puits teacutemoignant de la preacutesence de
la proteacuteine Une mecircme quantiteacute de mateacuteriel (18 microg) a eacuteteacute deacuteposeacutee dans tous les puits lorsque
le deacutepocirct eacutetait possible
145
Marqueurα3H2O
α3G3M agrave t0
sans incubation
avec dessalage
α3G3M
avec incubation de 5h
et dessalage
α3G3M avec
incubation de 24h
et dessalage
α3H2O
Jour + 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
18 microg 18 microg 18 microg 18 microg 18 microg
10 kDa
Fig III 36 Image du gel SDS-PAGE 16 La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute deacutenatureacutee apregraves
diffeacuterents temps drsquoincubation dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M Pour
chaque temps drsquoincubation deux eacutechantillons sont testeacutes sans et avec lrsquoeacutetape de dessalage
La proteacuteine aIF2α3 est preacutesente dans les puits 4 et 6 alors qu‟elle a subi le traitement
chimique avec le chlorure de guanidinium et l‟eacutetape de dessalage mais elle n‟est pas retrouveacutee
dans le puits 8 Pourtant dans ce cas lagrave elle a aussi eacuteteacute traiteacutee par le chlorure de guanidinium
mais pendant un temps beaucoup plus long (24 heures) et dessaleacutee
Par conseacutequent on peut conclure que c‟est le temps du traitement chimique (incubation
dans une solution de chlorure de guanidinium 3 M agrave 50degC sous agitation) qui est critique
dans le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine En effet la proteacuteine aIF2α3 est deacutegradeacutee suite agrave
une incubation pendant une dureacutee de vingt-quatre heures tandis qu‟elle est toujours preacutesente
pour un temps d‟incubation infeacuterieur ou eacutegal agrave cinq heures
Le taux de deuteacuteration maximal de la proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute deacutetermineacute par
spectromeacutetrie de masse apregraves deacutenaturation de la proteacuteine dans une solution de chlorure de
guanidinium 3 M preacutepareacutee dans du D2O Les temps d‟incubation t=1h et t=5h ont eacuteteacute testeacutes
(Tab III 1)
Nous obtenons des pourcentages de deuteacuteration leacutegegraverement plus eacuteleveacutes dans le cas d‟une
deacutenaturation de la proteacuteine pendant des temps d‟une heure et cinq heures (73) par rapport agrave
une incubation classique dans D2O (66) Afin de s‟assurer que la proteacuteine a bien eacuteteacute
deacutenatureacutee par le traitement chimique d‟autres conditions ont eacuteteacute testeacutees tempeacuterature
146
d‟incubation de 95degC concentration en chlorure de guanidinium de 6 M Les reacutesultats sont
preacutesenteacutes dans le Tab III 2 Malgreacute diffeacuterentes conditions de deacutenaturation testeacutees nous
n‟obtenons pas de pourcentage de deuteacuteration proche de la limite supeacuterieure de 875 donneacutee
par la dilution agrave 18 de la solution H2O dans du D2O
Tab III 1 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions natives (0 M de deacutenaturant) et
deacutenaturantes (3 M de deacutenaturant) La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee soit dans un tampon
NaCl 330 mMD2O (conditions natives) soit dans une solution de chlorure de guanidinium 3
MD2O (conditions deacutenaturantes) pendant des temps variables Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee
avant drsquoecirctre analyseacutee par MS La valeur de reacutefeacuterence (66) obtenue dans des conditions
natives est indiqueacutee Une valeur moyenne (triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes
conditions deacutenaturantes
Concentration
du deacutenaturant 0 M 3 M 3 M
Conditions
drsquoincubation 1 h
37degC 600 rpm 1 h
50degC 700 rpm 5 h
50degC 700 rpm
Taux de
deuteacuteration 66 73 73
Tab III 2 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions deacutenaturantes La proteacuteine
aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidiniumD2O dans diffeacuterentes
conditions Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee avant drsquoecirctre analyseacutee par MS Une valeur moyenne
(triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes conditions
Concentration
du deacutenaturant 3 M 6 M
Conditions
drsquoincubation 5 min
95degC 700 rpm 1 h
50degC 700 rpm Taux de
deuteacuteration 70 72
En reconsideacuterant donc les deux hypothegraveses formuleacutees preacuteceacutedemment il semblerait que le
pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse soit important dans nos conditions expeacuterimentales Il a lieu en
solution avant l‟analyse finale en MS lors de la preacuteparation des eacutechantillons (eacutetape de
dessalage) et au cours de leur introduction dans le spectromegravetre de masse avec le systegraveme de
seringue refroidie utiliseacute
Afin de mettre en eacutevidence l‟influence de l‟eacutetape de dessalage sur l‟eacutechange inverse nous
avons mesureacute les pourcentages de deuteacuteration de peptide et proteacuteine modegraveles complegravetement
deuteacutereacutes avec notre systegraveme de seringue refroidie La substance P (peptide de onze reacutesidus) a
donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution ACND2O (7525) pendant une heure agrave 37degC sous
agitation La reacuteaction d‟eacutechange a eacuteteacute arrecircteacutee par diminution du pH et de la tempeacuterature puis
147
le peptide totalement marqueacute a eacuteteacute dilueacute dans H2OACNAF (49492) afin d‟ecirctre analyseacute par
MS L‟expeacuterience a eacuteteacute reconduite une seconde fois mais en incluant l‟eacutetape de dessalage
avant l‟analyse par MS Sur le FT-ICR les pourcentages moyens (triplicats) de deuteacuteration
obtenus sont les suivants 914 sans l‟eacutetape de dessalage et 77 avec l‟eacutetape de dessalage
Sur le Q-TOF le taux maximum sans dessalage n‟atteint que 856 indiquant que c‟est bien
l‟introduction dans la source qui conduisait agrave un accroissement du laquo back-exchange raquo sur
celui-ci Il semblerait que l‟eacutetape de dessalage conduise agrave une perte d‟environ 15 de la
totaliteacute du marquage pour les peptides Il convient de noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees directement agrave partir de la poudre donc sans dilution initiale Par conseacutequent si on
considegravere les 77 de deuteacuteration obtenus apregraves dessalage appliqueacutes sur une solution agrave 875
de deuteacuteriums on trouve un maximum de deuteacuteration de 67 soit assez proche des 72-73
obtenus apregraves deacutenaturation complegravete
III4 Conclusion
Nos reacutesultats montrent qu‟il est possible deacuteviter une redistribution des deuteacuteriums dans la
seacutequence polypeptidique au moment de la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines par
approches laquo top-down raquo L‟ECD et l‟ETD semblent preacutesenter une bonne capaciteacute agrave garder la
localisation initiale des deuteacuteriums Dans le cas de l‟activation par CID nos reacutesultats
rejoignent ceux de la litteacuterature en restant incertains il ne nous a pas eacuteteacute possible ni de
montrer l‟absence de laquo scrambling raquo ni de montrer un laquo scrambling raquo complet tombant ainsi
dans une zone intermeacutediaire ougrave les paramegravetres controcirclant l‟extensiviteacute du laquo scrambling raquo
restent incertains
Un autre enseignement de cette partie est qu‟un des problegravemes majeurs de notre approche
est leacutechange inverse qui a lieu en solution avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Ce
pheacutenomegravene est accentueacute dans notre cas par lobligation que nous avons deffectuer une eacutetape
de dessalage des proteacuteines avant leur analyse et la difficulteacute agrave savoir ce qui relegraveve de cette
eacutetape ou de la source dionisation Un autre problegraveme lieacute agrave celui-lagrave est quil est difficile
daccumuler un grand nombre de spectres car au bout dune dizaine de minutes leacutechange
inverse est devenu trop important
Dans ce contexte et avec lideacutee de controcircler beaucoup mieux leacutechange inverse nous avons
deacutecideacute de deacutevelopper un systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
148
spectromegravetre de masse complegravetement nouveau baseacute sur l‟utilisation d‟une enceinte isoleacutee
refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui eacutevite le
deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des deacutebits
faibles Le deacuteveloppement de cette laquo cryosource raquo et les premiers reacutesultats obtenus en
lutilisant font lobjet du dernier chapitre de cette thegravese
149
III5 Bibliographie
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151
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source
refroidie
152
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169
IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186
IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
153
IV1 Echange inverse
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment dans la partie introductive l‟association des
eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium en solution avec la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode de choix pour obtenir des informations sur la structure
tridimensionnelle d‟une proteacuteine ou sur son changement de conformation induit par la fixation
d‟un ligand ou d‟un partenaire proteacuteique Neacuteanmoins cette approche souffre de deux
limitations importantes (i) l‟eacutechange inverse ou laquo back-exchange raquo qui peut avoir lieu en
solution agrave diffeacuterentes eacutetapes de l‟expeacuterience et (ii) la migration intramoleacuteculaire des protons
et des deuteacuterons ou laquo scrambling raquo qui peut se deacuterouler en phase gazeuse particuliegraverement
au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) Ces deux processus
doivent ecirctre minimiseacutes pour obtenir des reacutesultats interpreacutetables Nous avons vu dans le Chap
II que la minimisation du laquo scrambling raquo neacutecessitait une optimisation minutieuse et speacutecifique
des potentiels de la source d‟ionisation et des optiques de transfert ionique afin de rendre
minimale l‟excitation vibrationnelle des ions peptidiques deuteacutereacutes Les paramegravetres
instrumentaux ne peuvent neacuteanmoins pas ecirctre directement transfeacutereacutes d‟un instrument agrave un
autre Il convient donc d‟optimiser individuellement les diffeacuterents reacuteglages de l‟instrument
quand on en change pour eacuteviter la redistribution aleacuteatoire des hydrogegravenes et deuteacuteriums Cela
peut ecirctre commodeacutement reacutealiseacute par l‟utilisation de peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
servant de sonde du laquo scrambling raquo pendant la fragmentation ECD ou ETD (1-3)
Ce dernier chapitre de ma thegravese est consacreacute agrave la minimisation du laquo back-exchange raquo lors
d‟expeacuteriences HDXMS En effet l‟eacutechange inverse reste et demeure une neacutecessiteacute mais
eacutegalement un problegraveme seacuterieux inheacuterent agrave la technique HDX Il conduit agrave une variation du
nombre de deuteacuteriums entre l‟eacutetape de marquage et l‟analyse finale par spectromeacutetrie de
masse En geacuteneacuteral cette variation prend la forme d‟une perte de deuteacuteration apregraves eacutechange
en solution deuteacutereacutee la reacuteaction d‟eacutechange sur les hydrogegravenes d‟amide est fortement ralentie
mais pas totalement arrecircteacutee par passage en conditions acides (pH 25) et agrave tempeacuterature reacuteduite
(0degC) geacuteneacuteralement dans un solvant majoritairement hydrogeacuteneacute Par conseacutequent ce laquo back-
exchange raquo peut avoir lieu lors des eacutetapes de preacuteparation de l‟eacutechantillon (digestion
dessalage concentration seacuteparationhellip) jusqu‟agrave son injection dans le spectromegravetre de masse
et son ionisation en phase gazeuse Ce pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse est neacutecessaire pour
assurer un retour des hydrogegravenes porteacutes par les chaicircnes lateacuterales sous forme hydrogeacuteneacutee mais
doit ecirctre controcircleacute pour maintenir en place le plus grand nombre possible des deuteacuteriums en
position amide pendant le temps neacutecessaire agrave l‟analyse
154
La maniegravere la plus simple de minimiser l‟eacutechange inverse est de maintenir un pH ougrave
l‟eacutechange est minimal et de rester agrave froid (Fig I 11) Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment le pH et la tempeacuterature sont ajusteacutes respectivement agrave 25 et agrave 0degC Sous ces
conditions de laquo quench raquo l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide est diminueacute de cinq ordres de
grandeur par rapport agrave un pH de 7 et une tempeacuterature de 25degC
La demi-vie pour l‟eacutechange inverse dans des conditions d‟arrecirct de la reacuteaction est entre
trente et cent vingt minutes en fonction de la seacutequence peptidique Par conseacutequent les eacutetapes
d‟analyse doivent ecirctre reacutealiseacutees le plus rapidement possible degraves lors que la reacuteaction est
bloqueacutee Ainsi il n‟est pas envisageable de reacutealiser une digestion enzymatique d‟une heure
suivie d‟un gradient d‟une heure suppleacutementaire pour l‟eacutetape de seacuteparation
chromatographique Des protocoles et dispositifs expeacuterimentaux ont eacuteteacute mis au point afin
d‟optimiser les eacutetapes de digestion et de seacuteparation (4-5) Si ces eacutetapes tiennent dans un
minimum de temps d‟environ trente minutes au total le recouvrement en deuteacuteriums peut ecirctre
supeacuterieur agrave 85 Il faut noter que quelques eacutechanges inverses ont lieu dans l‟interface de
l‟eacutelectrospray mais qu‟ils n‟excegravedent pas 5 geacuteneacuteralement
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment les hydrogegravenes des chaicircnes lateacuterales s‟eacutechangent
plus vite que les hydrogegravenes d‟amide Par conseacutequent lorsque la proteacuteine ou les peptides
marqueacutes sont placeacutes dans les solvants hydrogeacuteneacutes utiliseacutes pour la digestion ou l‟analyse
chromatographique tous les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales redeviennent rapidement des
hydrogegravenes Ainsi un increacutement de masse pourra ecirctre associeacute agrave l‟incorporation d‟un
deuteacuterium sur une fonction amide du squelette polypeptidique Le problegraveme est un peu plus
compliqueacute pour les proteacuteines ou les peptides riches en arginine car comme nous l‟avons vu
l‟arginine possegravede sur sa chaicircne lateacuterale deux hydrogegravenes qui eacutechangent agrave la vitesse des
hydrogegravenes d‟amide et pour lesquels l‟eacutetape de lavage (substitution de D en H) sera donc
moins efficace
Notons eacutegalement que les conditions de l‟eacutechange inverse (pH acide solvant organique)
favorisent a priori une forme deacutenatureacutee pour la proteacuteine initiale conduisant agrave un eacutechange
inverse moins deacutependant des structures secondaire tertiaire et quaternaire Par conseacutequent les
vitesses d‟eacutechange ne deacutependent globalement que de la seacutequence primaire Pour des peptides
typiques cette seacutequence conduit agrave une vitesse d‟eacutechange globalement proche pour tous les
sites conduisant agrave un eacutechange inverse de type laquo aleacuteatoire raquo Ceci rend en partie compte de la
forme gaussienne des distributions isotopiques obtenues pour les peptides deuteacutereacutes
155
Finalement le choix d‟une approche laquo top-down raquo semblerait ecirctre la meilleure solution
pour minimiser l‟eacutechange inverse Dans ce cas la proteacuteine entiegravere apregraves arrecirct de la reacuteaction
d‟eacutechange par diminution du pH et de la tempeacuterature est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse Cette approche offre donc la possibiliteacute unique de reacuteduire consideacuterablement l‟effet
du laquo back-exchange raquo voire mecircme de presque l‟eacuteliminer dans des conditions expeacuterimentales
strictes (6) Ceci est ducirc au fait qu‟il n‟y a pas d‟eacutetape preacutealable agrave l‟analyse par spectromeacutetrie
de masse telle qu‟une digestion enzymatique agrave la pepsine ou une seacuteparation
chromatographique en phase liquide Cependant il faut noter le fait qu‟il n‟est pas toujours
possible d‟opter pour une approche laquo top-down raquo En effet pour des systegravemes de taille trop
importante par exemple l‟efficaciteacute de fragmentation en ECD est trop faible pour obtenir une
reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves pour la plus grande partie de la proteacuteine
Dans tous les cas apregraves le laquo quench raquo de la reacuteaction de marquage l‟eacutechantillon doit ecirctre
injecteacute si possible agrave froid et le plus rapidement dans la source du spectromegravetre de masse pour
limiter le laquo back-exchange raquo
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction
Plusieurs modes d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse ont
eacuteteacute deacuteveloppeacutes en fonction de l‟approche MS adopteacutee laquo bottom-up raquo ou laquo top-down raquo La
mise au point de ces diffeacuterents systegravemes d‟injection doit eacutegalement prendre en compte la
technique d‟ionisation utiliseacutee La technique d‟analyse par MS la plus communeacutement utiliseacutee
pour les expeacuteriences HDX est l‟eacutelectrospray (ESI) tandis que la meacutethode MALDI est plus
rarement employeacutee (7-11) Cela s‟explique par le fait que contrairement agrave la technique ESI
elle ne peut ecirctre coupleacutee en ligne avec des systegravemes de chromatographie liquide qui sont tregraves
utiles pour l‟analyse de meacutelanges complexes
Autrement dit seule l‟eacutelectrospray autorise le couplage avec une chromatographie liquide
en phase inverse (HPLC-ESI-MS) permettant l‟isolation de peptides et de proteacuteines en
meacutelange complexe Cette eacutetape de seacuteparation est indispensable dans beaucoup d‟eacutetudes
d‟identification et de caracteacuterisation de biomoleacutecules par spectromeacutetrie de masse Elle est
d‟autant plus neacutecessaire dans le cas d‟analyses de systegravemes proteacuteiques de grande taille en
HDXMS En effet la superposition des nombreux massifs isotopiques qui ont eacuteteacute deacuteplaceacutes et
eacutelargis par le marquage complique eacutenormeacutement l‟analyse En pratique apregraves avoir arrecircteacute la
156
reacuteaction d‟eacutechange l‟eacutechantillon est directement introduit dans la source eacutelectrospray via une
HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo)
La technique HPLC-ESI-MS preacutesente donc plusieurs avantages Elle est tout d‟abord
particuliegraverement bien adapteacutee pour la seacuteparation temporelle d‟un grand nombre de peptides
L‟eacutetape de seacuteparation en HPLC participe eacutegalement au lavage des chaicircnes lateacuterales des
acides amineacutes (12) Elle est compatible avec la plupart des tampons et avec la preacutesence
d‟agents deacutenaturants et offre la possibiliteacute de concentrer rapidement des eacutechantillons dilueacutes
En contre partie l‟avantage du MALDI-MS par rapport agrave l‟ESI-MS est qu‟un grand nombre
d‟eacutechantillons peuvent ecirctre analyseacutes dans une courte peacuteriode de temps De plus cette
technique est plus toleacuterante aux sels que l‟eacutelectrospray et ne requiert donc pas d‟eacutetape
preacutealable de dessalage de l‟eacutechantillon Bien que l‟ionisation MALDI soit plus facilement
reacutealisable et interpreacutetable elle conduit neacuteanmoins agrave une perte en deuteacuteriums significativement
plus eacuteleveacutee par rapport agrave la meacutethode ESI mecircme si des essais ont eacuteteacute meneacutes pour reacuteduire ces
pertes (13) De plus il n‟est pas envisageable d‟utiliser la technique MALDI pour l‟analyse de
systegravemes proteacuteiques complexes de hauts poids moleacuteculaires En effet les informations de tous
les peptides sont fournies dans un mecircme spectre de masse le rendant laquo illisible raquo et il n‟est pas
possible de reacutealiser preacutealablement agrave l‟analyse une seacuteparation par HPLC qui serait pourtant
indispensable pour ce type d‟eacutechantillon
Les deux sous-paragraphes suivants constitueront un bilan des diffeacuterents systegravemes
d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse qui ont eacuteteacute deacuteveloppeacutes
avant mon arriveacutee au laboratoire des Meacutecanismes Reacuteactionnels Ils ont eacuteteacute mis au point par
l‟eacutequipe ou par d‟autres groupes dans un contexte de minimisation de l‟eacutechange inverse
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo
Une extension eacutevidente de la meacutethode HDXESI-MS est l‟utilisation du nano-deacutebit bien
qu‟elle ne soit pas encore systeacutematique En effet ce choix est particuliegraverement pertinent pour
des proteacuteines qui sont difficiles agrave obtenir (eacutechantillons biologiques preacutecieux) ainsi que pour
celles qui forment des agreacutegats proteacuteiques agrave forte concentration Ces derniegraveres suscitent un vif
inteacuterecirct car elles sont pour la plupart responsables de maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives telles que
les maladies agrave prion dAlzheimer ou de Parkinson Dans la litteacuterature on trouve quelques
eacutetudes HDX utilisant la technique d‟analyse nano-ESI-MS laquo off-line raquo (14-15) ou coupleacutee en
157
ligne aux eacutetapes de digestion enzymatique et de seacuteparation chromatographique (16) Par la
reacuteduction du systegraveme il a eacuteteacute obtenu une sensibiliteacute supeacuterieure d‟un facteur cent tout en
conservant la deuteacuteration
Lors de la thegravese de Thorsten Daubenfeld (17) notre eacutequipe a valideacute un systegraveme par
injection directe nano-ESI-FTMS pour l‟eacutetude structurale de proteacuteines par HDX En effet les
tregraves hautes performances d‟un instrument de type FT-ICR tant au niveau de la reacutesolution que
de la preacutecision sur la mesure de masse ont permis de s‟affranchir d‟une seacuteparation
chromatographique pour les proteacuteines eacutetudieacutees (18) L‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape a
ainsi eacuteteacute eacutelimineacute Cependant comme le systegraveme n‟eacutetait pas refroidi une aiguille nanospray
autorisait un temps d‟analyse de trois minutes seulement avant le reacutechauffement de la solution
menant au pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse Il faut noter ici que plus le temps d‟analyse est
faible moins il est aiseacute de deacutetecter des peptides deuteacutereacutes couvrant une gamme dynamique
importante seule l‟accumulation d‟un nombre important de spectres permet de gagner en
gamme dynamique Par ailleurs plus la taille du systegraveme proteacuteique est grande moins il est
facile de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums des peptides car leur nombre croicirct fortement et
leurs massifs isotopiques deacuteplaceacutes et eacutelargis se superposent
Ce problegraveme de superposition des massifs isotopiques est classiquement reacutesolu par le
couplage du spectromegravetre de masse avec une technique de seacuteparation chromatographique (16
19) permettant d‟isoler les diffeacuterents peptides preacutesents dans l‟analyte dans une seconde
dimension Cette seacuteparation doit dans le cas d‟eacutetudes en HDXMS respecter les contraintes
lieacutees agrave la technique ie qu‟elle doit limiter les eacutechanges inverses Pour cela plusieurs
meacutethodes ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees Elles utilisent soit des solvants protiques auquel cas la
seacuteparation doit se faire agrave froid en conditions acides et rapidement soit des solvants non-
protiques Par exemple la chromatographie supercritique a eacuteteacute proposeacutee comme alternative
aux gradients sur phase inverse classiques permettant de s‟affranchir des problegravemes de
tempeacuterature et de dureacutee d‟eacutelution (20) De plus le temps de reacutetention associeacute agrave un peptide
reste inchangeacute quel que soit son degreacute de deuteacuteration En effet l‟incorporation en deuteacuteriums
des peptides n‟altegravere que tregraves peu leur temps de reacutetention (21-22) Par conseacutequent ils
serviront de reacutefeacuterence pour identifier les peptides apregraves eacutechanges HD
158
Lors de la thegravese de Magalie Duchateau (23) notre eacutequipe a mis au point et optimiseacute un
systegraveme nano-LC-ESI-FTMS refroidi pour l‟analyse structurale de proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire et de complexes proteacuteiques tels que des complexes d‟initiation de la traduction
chez les archeacutees et les eucaryotes par HDX Le montage comprenant deux vannes nano une
preacute-colonne et une colonne est immergeacute dans de l‟eau glaceacutee pendant toute la dureacutee de
l‟analyse pour refroidir un maximum le systegraveme et ainsi minimiser les eacutechanges inverses Il
est coupleacute agrave une chaicircne de nano-chromatographie liquide
Notons eacutegalement que Waters commercialise deacutesormais un systegraveme complegravetement inteacutegreacute
pour les eacutetudes HDXMS appeleacute laquo nanoACQUITY UPLC System with HDX Technology raquo
qui peut ecirctre coupleacute agrave un spectromegravetre de masse du mecircme constructeur Le systegraveme integravegre
eacutegalement une proteacuteolyse laquo on-line raquo Les vannes et colonnes sont refroidies agrave 0degC par des
modules agrave effet Peltier
IV22 Avec une approche laquo top-down raquo
Une meacutethode populaire consiste agrave geacuteneacuterer et agrave envoyer un flux continu de solution
contenant la proteacuteine deuteacutereacutee vers la source d‟ionisation Ce dernier reacutesulte du meacutelange de la
solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange avec celle d‟arrecirct de la reacuteaction Sur ce
principe un dispositif avec deux seringues relieacutees ensemble et connecteacutees eacutegalement avec le
spectromegravetre de masse a eacuteteacute imagineacute (24) (Fig IV 1) Les deux seringues contiennent les
deux solutions agrave meacutelanger donneacutees ci-dessus Ce montage permet de proceacuteder agrave l‟arrecirct de la
reacuteaction d‟eacutechange au point de connexion des deux seringues Cette eacutetape s‟effectue laquo on-
line raquo puisque le flux reacutesultant du meacutelange des deux solutions est directement dirigeacute vers
l‟entreacutee du spectromegravetre de masse Dans ces conditions le temps pendant lequel peut avoir
lieu le laquo back-exchange raquo correspond uniquement agrave la courte dureacutee de reacutesidence dans le tube
capillaire (eg une minute) qui s‟eacutetend du nœud de connexion reliant les deux seringues agrave la
source d‟ionisation eacutelectrospray (scheacutematiseacute en violet sur la Fig IV 1) De cette faccedilon le
laquo back-exchange raquo peut ecirctre efficacement reacuteduit
159
Seringue 1 proteacuteine dans D2O
Seringue 2 solution H2O (pH 25 0degC)
Source drsquoionisation
eacutelectrospray
Arrecirct de la
reacuteaction drsquoeacutechange
Fig IV 1 Scheacutema drsquoun dispositif drsquointroduction des eacutechantillons dans une approche laquo top-
down raquo HDX mettant en œuvre le flux continu
Une autre meacutethode d‟introduction minimisant le laquo back-exchange raquo consiste agrave deacutesolvater et
ioniser directement la solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange sans passer par une
eacutetape preacutealable d‟arrecirct de la reacuteaction (25) (Fig IV 2) La reacuteaction d‟eacutechange HD est alors
arrecircteacutee au moment mecircme ougrave la proteacuteine est deacutesolvateacutee Des ions en phase gazeuse sont alors
geacuteneacutereacutes
Source ESI
Spectromegravetre
de masse
Aiguille nanospray avec solution de
proteacuteine dans tampon drsquoeacutechange
+ 1 NBA (reacuteactif superchargeacute)
Fig IV 2 Scheacutema du mode drsquointroduction des eacutechantillons par spray direct dans une
approche laquo top-down raquo HDX
Le profil de deuteacuteration en phase gazeuse devant impeacuterativement refleacuteter celui en solution
ces deux modes d‟injection sont privileacutegieacutes car ils permettent de reacuteduire le laquo back-exchange raquo
D‟autre part l‟ajout d‟une solution acide pour l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD ou
l‟utilisation d‟un reacuteactif superchargeacute tel que le NBA (laquo nitrobenzyl alcohol raquo) augmente de
faccedilon significative l‟eacutetat de charge de la proteacuteine Cela se traduit donc par une ameacutelioration
consideacuterable de l‟efficaciteacute de fragmentation par ECD (ou ETD) meacutethode choisie pour limiter
le laquo scrambling raquo Toutefois notons que ces deux montages excluent la possibiliteacute de reacutealiser
une eacutetape de dessalage preacutealable agrave l‟injection dans le spectromegravetre de masse Or dans le cas
d‟eacutechantillons reacuteels les proteacuteines sont initialement conserveacutees en conditions natives dans leur
160
tampon de purification qui est riche en sels L‟eacutelectrospray eacutetant tregraves sensible agrave la preacutesence de
sels ou d‟additifs qui contribuent agrave la suppression du signal une eacutetape de dessalage est alors
neacutecessaire avant leur analyse Par conseacutequent afin de pouvoir analyser des eacutechantillons
proteacuteiques reacuteels le deacuteveloppement de nouveaux dispositifs d‟introduction laquo off-line raquo s‟est
reacuteveacuteleacute indispensable Il est donc tregraves important de travailler agrave froid
Le systegraveme d‟injection que j‟ai utiliseacute au deacutebut de ma thegravese a eacuteteacute mis en place au sein du
laboratoire trois mois avant mon arriveacutee avec la collaboration du Professeur Joslashrgensen Il
s‟agit eacutegalement d‟un montage en flux continu mais laquo off-line raquo constitueacute d‟une seule
seringue (Fig IV 3)
Proteacuteine deuteacutereacutee dans
solution H2O (pH 25 0degC)
Source ESI
Carboglace
(-78degC)Spectromegravetre
de masse
Gaz de neacutebulisation
N2 (TdegC ambiante)
Fig IV 3 Scheacutema de notre ancien dispositif drsquointroduction des eacutechantillons en flux continu
laquo off-line raquo la seringue refroidie
Avec ce type de dispositif la preacuteparation de l‟eacutechantillon correspondant agrave son marquage et
agrave son dessalage peut ecirctre reacutealiseacutee en amont Elle se deacutecline en trois eacutetapes qui sont les
suivantes (1) initiation de la reacuteaction d‟eacutechange HD en diluant la proteacuteine dans son tampon
de purification deuteacutereacute puis (2) fixation du marquage apregraves un temps d‟incubation t donneacute en
ajoutant une solution acide (pH final de 25) agrave basse tempeacuterature (0degC) et enfin (3) dessalage
et concentration de l‟eacutechantillon agrave l‟aide d‟une colonne de phase inverse C8 Cette derniegravere
eacutetape doit ecirctre reacutealiseacutee dans la glace et pendant un temps tregraves court (une minute environ) afin
de limiter l‟eacutechange inverse L‟eacutechantillon est ensuite chargeacute immeacutediatement dans la seringue
preacutealablement refroidie agrave 0degC puis injecteacute dans la source eacutelectrospray du spectromegravetre de
masse FT-ICR
161
refroidie
Longueur minimale
Carboglace
deuteacutereacutee
Agrave 0 C
(pH 25 0 C)
Fig IV 4 Photographie de notre systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons marqueacutes la
seringue refroidie
La photographie de notre systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes est preacutesenteacutee ci-
dessus (Fig IV 4) Ce dernier a eacuteteacute minutieusement optimiseacute afin de reacuteduire au maximum le
laquo back-exchange raquo Pour cela la seringue d‟injection est preacutealablement refroidie agrave 0degC entre
deux sachets de glace Au terme de la dureacutee d‟eacutechange HD preacutedeacutefinie la reacuteaction est arrecircteacutee
en diluant l‟eacutechantillon dans une solution acidifieacutee (pH final de 25) agrave 0degC L‟eacutechantillon est
conserveacute dans la glace Pour des eacutechantillons reacuteels une eacutetape de dessalage est reacutealiseacutee sous
ces mecircmes conditions strictes L‟eacutechantillon est alors preacuteleveacute gracircce agrave la seringue refroidie et
injecteacute dans la source du spectromegravetre de masse FT-ICR Pendant toute la dureacutee de l‟analyse
il est lui-mecircme refroidi par un sachet de carboglace surplombant la seringue Il est transfeacutereacute
par un capillaire en PEEK qui lui est agrave tempeacuterature ambiante et dont la longueur a par
conseacutequent eacuteteacute rendue minimale Pour des raisons techniques le capillaire ne mesure pas
moins de trente et un centimegravetres Un deacutebit d‟injection important eacutegal agrave 10 microLmin a donc
eacuteteacute utiliseacute Dans ces conditions il avait eacuteteacute montreacute que ce dispositif permettait un maintien
des deuteacuteriums agrave leur place pendant au moins dix minutes d‟acquisition de donneacutees Ainsi
l‟analyse d‟un point de cineacutetique de l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD agrave la fin de
l‟acquisition en MS durait environ douze minutes Le dispositif d‟analyse ideacuteal combinerait
la consommation d‟une faible quantiteacute d‟eacutechantillon tout en minimisant les eacutechanges inverses
avec un temps d‟acquisition le plus long possible
162
Apregraves quelques mois d‟expeacuterimentation de ce systegraveme j‟ai pu dresser un rapide bilan des
difficulteacutes lieacutees agrave son utilisation La premiegravere surprise a eacuteteacute le nombre de seringues que l‟on
peut fecircler ou casser avec ce dispositif En effet bien que le modegravele de seringue choisi
(seringues Hamilton seacuterie 800) propose un piston renforceacute l‟eacutechantillon refroidi par la
carboglace a tendance agrave congeler Il forme alors un glaccedilon Tandis que le pousse-seringue
continue agrave fonctionner et agrave envoyer l‟eacutechantillon vers le spectromegravetre de masse une
surpression finit par ecirctre exerceacutee au niveau du verre de la seringue jusqu‟agrave sa fecirclure si
l‟analyse n‟est pas interrompue ou l‟eacutechantillon reacutechauffeacute Par ailleurs les deacutebits d‟injection
utiliseacutes impliquent de disposer d‟importantes quantiteacutes d‟eacutechantillon Dans le cas de l‟analyse
d‟eacutechantillons biologiques preacutecieux cette technique ne pourrait pas ecirctre utiliseacutee De plus
comme nous l‟avons vu dans le chapitre preacuteceacutedent les expeacuteriences sont difficilement
reproductibles Ayant pour objectif d‟ameacuteliorer le systegraveme j‟ai testeacute l‟effet du refroidissement
de l‟eacutechantillon par la carboglace lors de l‟analyse par MS et l‟influence du deacutebit d‟injection
sur le laquo back-exchange raquo
Pour cela j‟ai utiliseacute un systegraveme modegravele l‟ubiquitine Il s‟agit d‟une petite proteacuteine de 76
reacutesidus (86 kDa) dont la structure a eacuteteacute complegravetement deacutecrite dans la litteacuterature et qui est
souvent utiliseacutee dans la mise au point d‟approches par eacutechange HD Apregraves avoir deuteacutereacute
complegravetement l‟ubiquitine par incubation dans D2O (Annexe Mateacuteriel et meacutethodes) elle est
dilueacutee au centiegraveme dans une solution acidifieacutee H2OMeOH (4060) agrave environ 0degC Des
meacutelanges H2OACN (5050) eacutetaient auparavant utiliseacutes Le fait de choisir le meacutethanol comme
solvant et de l‟utiliser en plus grande proportion permet d‟une part d‟ameacuteliorer le processus
d‟ionisation par eacutelectrospray et d‟autre part de diminuer consideacuterablement le point de
congeacutelation de la solution agrave analyser Cela empecircche la formation systeacutematique de glaccedilons dus
au refroidissement de la solution par la carboglace L‟ubiquitine est ensuite directement
preacuteleveacutee par la seringue refroidie et injecteacutee dans la source ESI du spectromegravetre de masse FT-
ICR L‟analyse MS est reacutealiseacutee avec ou sans le sachet de carboglace surplombant la seringue
puis en testant diffeacuterents deacutebits d‟injection Le pourcentage de deuteacuteration de l‟ubiquitine est
suivi au cours des dix minutes d‟analyse autoriseacutes par le systegraveme de seringue refroidie afin de
mesurer l‟eacutechange inverse Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees en duplicats ou triplicats pour
estimer l‟erreur de mesure
En theacuteorie en absence d‟eacutechange inverse la valeur du pourcentage de deuteacuteration devrait
rester constante et maximale en fonction du temps Dans la situation ideacuteale l‟ensemble des
hydrogegravenes d‟amide devraient ecirctre marqueacutes et aucun autre site ne devrait ecirctre deuteacutereacute
163
deacutefinissant ainsi un 100 theacuteorique En pratique ce pourcentage doit ecirctre corrigeacute pour
prendre en compte la preacutesence de deuteacuteriums dilueacutes dans la solution d‟eau leacutegegravere acidifieacutee On
peut par conseacutequent corriger le ratio maximal par la formule suivante
ougrave Ntot est le nombre total de sites eacutechangeables (hydrogegravenes d‟amide et chaicircnes lateacuterales)
Namide est le nombre de liaisons peptidiques R est le pourcentage de deuteacuteriums dans la
solution dilueacutee rapporteacute au nombre total d‟hydrogegravenes et de deuteacuteriums Damide est le taux de
deuteacuteration reacuteel des hydrogegravenes d‟amide ducirc au marquage et Dexp est le ratio de deuteacuteration
expeacuterimental donneacute par la formule suivante
ougrave nD est le nombre de deuteacuteriums (mesureacute par spectromeacutetrie de masse par exemple) Du fait
de la preacutesence de deuteacuteriums dans la solution on s‟attend donc agrave une surestimation du taux de
deuteacuteration Ainsi par exemple si on considegravere une dilution au 1100e dans une solution 6040
meacutethanoleau on trouve un ratio de deuteacuteration R de 19
ougrave 18 et 32 sont les masses molaires de l‟eau et du meacutethanol 079 est la densiteacute du meacutethanol
(celle de l‟eau est prise agrave 1) 4060 sont les proportions d‟eau et de meacutethanol
On s‟attend par conseacutequent agrave un taux de deuteacuteration maximal (avec Ntot = 146 Namide = 72)
d‟environ 102
De plus un excegraves de deuteacuteration suppleacutementaire peut ecirctre ducirc au non reacute-eacutechange d‟un
hydrogegravene pour les chaicircnes lateacuterales d‟arginine or l‟ubiquitine comporte 4 arginines dans sa
seacutequence Dans la suite de ce manuscrit une reacutefeacuterence agrave 105 sera prise qui correspond au
maximum expeacuterimentalement observeacute pour les diffeacuterents montages qui seront tenteacutes
164
Dans le cas des injections utilisant le montage d‟origine l‟eacutevolution preacutesenteacutee ci-dessous
est observeacutee (Fig IV 5)
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Avec carboglace Sans carboglace
Fig IV 5 Evolution du taux de deuteacuteration de lrsquoubiquitine mesureacute en fonction du temps apregraves
le deacutebut de lrsquoinjection Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI
par le systegraveme de seringue refroidie Bleu pas de carboglace placeacute sur la seringue rouge
avec carboglace
Lors des cinq premiegraveres minutes les courbes avec et sans carboglace preacutesentent la mecircme
allure et se confondent presque La solution d‟ubiquitine agrave 0degC injecteacutee agrave 10 microLmin par la
seringue refroidie n‟a pas le temps de se reacutechauffer mecircme en l‟absence de carboglace Au
bout de cinq minutes la solution d‟ubiquitine se reacutechauffe en l‟absence de carboglace Ils
s‟opegraverent alors des eacutechanges inverses faisant chuter le pourcentage de deuteacuteration Par
conseacutequent en l‟absence de carboglace on divise le temps d‟analyse par deux au moins dans
des expeacuteriences HDXMS La partie initiale avec un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
correspond agrave la combinaison d‟une perte de deuteacuteriums au cours du temps avec un effet de
deacutebit car initialement la seringue est maintenue agrave un deacutebit eacuteleveacute jusqu‟agrave apparition du signal agrave
t=0
L‟effet du deacutebit d‟injection de l‟eacutechantillon sur l‟eacutechange inverse (Fig IV 6) a ensuite eacuteteacute
testeacute pour le deacutebit de reacutefeacuterence de 10 microLmin et pour un deacutebit diviseacute par cinq de 2 microLmin
165
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie 10 microLmin 2 microLmin
Fig IV 6 Effet du deacutebit drsquoinjection sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse
MS Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI par le systegraveme de
seringue refroidie surplombeacutee de carboglace Rouge deacutebit de 10 microLmin-1
violet deacutebit de
2 microLmin-1
Avec un faible deacutebit d‟injection (2 microLmin) de l‟eacutechantillon marqueacute le pourcentage de
deuteacuteration de l‟ubiquitine diminue consideacuterablement au cours de l‟analyse MS Les eacutechanges
inverses sont donc plus nombreux dans ces conditions expeacuterimentales On enregistre un
laquo back-exchange raquo moyen apregraves eacutequilibration de 35
Les graphes des Fig IV 5 et Fig IV 6 montrent que le systegraveme de seringue refroidie
permet de reacuteduire au maximum le laquo back-exchange raquo si l‟eacutechantillon est lui-mecircme refroidi par
la carboglace lors de l‟analyse MS et qu‟il est injecteacute agrave un deacutebit eacuteleveacute (10 microLmin)
Cependant le laquo back-exchange raquo moyen reste non neacutegligeable eacutegal agrave 20 Ayant eacutetudieacute
l‟ensemble des paramegravetres possibles en restant sur la base de ce systegraveme nous ne pouvons
guegravere plus l‟ameacuteliorer Nous avons donc deacutecideacute d‟inventer et de deacutevelopper un nouveau
systegraveme d‟introduction
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection
L‟ideacutee a eacuteteacute d‟imaginer un dispositif capable de stocker l‟eacutechantillon marqueacute aux
deuteacuteriums agrave tregraves basse tempeacuterature en dessous de zeacutero degreacute avant son analyse finale par
spectromeacutetrie de masse
166
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo
La laquo cryosource raquo est le nom que nous avons donneacute agrave notre dispositif d‟injection (Fig IV
7) Il s‟agit d‟une enceinte close thermostateacutee agrave tempeacuterature controcircleacutee avec comme objectif
initial une plage de tempeacuterature allant de la tempeacuterature ambiante agrave -100degC C‟est une boicircte
thermiquement isoleacutee issue de la transformation d‟une glaciegravere Elle se branche directement
sur la source ESI Elle est traverseacutee par un flux reacuteguleacute de gaz refroidi agrave l‟azote liquide (78 K)
La tempeacuterature interne de la boicircte est mesureacutee en continu par une sonde thermique et ajusteacutee
par un reacutegulateur de tempeacuterature controcirclant une reacutesistance chauffante L‟eacutechantillon est
introduit dans la laquo cryosource raquo puis injecteacute dans la source ESI du FT-ICR par un systegraveme de
vanne et boucle d‟injection Il est entraicircneacute vers le spectromegravetre de masse gracircce agrave l‟entreacutee d‟un
flux continu de solvant geacuteneacutereacute par un pousse-seringue situeacute agrave l‟exteacuterieur de la laquo cryosource raquo
deuteacutereacute agrave pH 25 et agrave 0 C
-30 C
Reacutegulateur de tempeacuterature
N2 (-30 C)
Azote liquide
Fig IV 7 Photographie de la laquo cryosource raquo
IV32 Mateacuteriel et meacutethodes
IV321 Instrumentation
Dans un premier temps voici la description de la version optimiseacutee de la laquo cryosource raquo et
des conditions expeacuterimentales neacutecessaires agrave la reacutealisation d‟expeacuteriences pour l‟eacutetude de la
167
structure de petites proteacuteines en HDXMS Elle est illustreacutee dans le scheacutema ci-apregraves (Fig IV
8)
L‟enceinte inteacuterieure de la laquo cryosource raquo est refroidie agrave une tempeacuterature de -30degC par
l‟arriveacutee d‟un gaz froid via un tuyau en cuivre Celui-ci forme un serpentin plongeacute dans un
reacutecipient rempli d‟azote liquide (78 K) qui permet le refroidissement du flux continu de gaz
entrant dans le systegraveme Une partie du gaz froid est envoyeacutee dans la laquo cryosource raquo agrave l‟aide
d‟un raccord en T tandis que l‟autre partie traverse le systegraveme et vient refroidir la ligne de
transfert de l‟eacutechantillon qui est introduit dans la source ESI
L‟inteacuterieur de la boicircte est maintenu agrave une tempeacuterature constante par un reacutegulateur de
tempeacuterature eacutequipeacute d‟une sonde thermique et d‟un ruban chauffant La sonde thermique de
type K est positionneacutee au niveau de la boucle contenant l‟eacutechantillon tandis que le ruban
chauffant entoure les tuyaux en cuivre deacuteposeacutes au fond de la boicircte Un ventilateur placeacute dans
l‟enceinte assure l‟homogeacuteneacuteiteacute de la tempeacuterature dans celle-ci
L‟eacutechantillon introduit dans une boucle de 75 microL par une vanne d‟injection est pousseacute vers
la source ESI du spectromegravetre de masse FT-ICR par le solvant agrave l‟aide d‟un pousse-seringue
Il est programmeacute agrave 2 microLmin correspondant agrave la valeur minimale du deacutebit pour laquelle le
spray est stable pour notre montage Les deacutebits infeacuterieurs deviennent instables lors du
refroidissement du montage probablement agrave cause de l‟augmentation de la viscositeacute des
solvants agrave -30degC Le volume injecteacute pour le remplissage de la boucle est de 100 microL
Finalement le gaz de neacutebulisation est eacutegalement refroidi par l‟azote liquide Il est envoyeacute agrave
l‟inteacuterieur du dispositif par un second tuyau en cuivre et est relieacute agrave l‟aiguille de neacutebulisation
de la source ESI permettant son refroidissement
168
Fig IV 8 Scheacutema du principe de la laquo cryosource raquo
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de l‟ubiquitine proteacuteine modegravele et de peptides de reacutefeacuterence que l‟on peut deuteacuterer de
maniegravere seacutelective (peptides modegraveles conccedilus par le Prof T Joslashrgensen Universiteacute dOdense
Danemark)
L‟ubiquitine (100 microM) et les peptides modegraveles (1 mM) sont complegravetement deuteacutereacutes par
incubation dans D2O Ils sont ensuite dilueacutes (au 1100e) dans une solution H2OMeOH
(4060) agrave basse tempeacuterature contenant de l‟acide formique (2) pour l‟ubiquitine et de
l‟acide aceacutetique pour les peptides (05 M pH=23) L‟ubiquitine est alors immeacutediatement
analyseacutee par FT-ICR MS Les peptides quant agrave eux sont analyseacutes apregraves une incubation dans
H2O glaceacutee pendant un temps agrave deacuteterminer (environ 10 min avec le systegraveme de seringue
refroidie) afin de deacutemarquer seacutelectivement l‟extreacutemiteacute N-terminale et conserver un nombre
moyen de 45 deuteacuteriums du cocircteacute C-terminal (26-27)
L‟eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee manuellement sur colonne Une cartouche Sep-Paktrade
C8 a eacuteteacute utiliseacutee
169
IV33 Reacutesultats
IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine
IV3311 Reacutealisation de la maquette
Cette phase de reacutealisation de la maquette initiale a permis une grande creacuteativiteacute de notre
part et a deacutetermineacute la faisabiliteacute technologique des choix de conception Elle a eacuteteacute conccedilue agrave
l‟aide d‟un bac agrave glace isotherme et de son couvercle Cette boicircte en polystyregravene a montreacute de
bonnes capaciteacutes de stockage agrave basse tempeacuterature malgreacute des fuites thermiques non
neacutegligeables causant une perte de froid En particulier elle a permis de valider la plage de
tempeacuterature atteignable (0degC agrave -100degC) et de veacuterifier la faisabiliteacute de l‟utilisation de meacutelanges
eausolvant organique agrave ces tempeacuteratures On notera en particulier que bien que les
tempeacuteratures de cristallisation des meacutelanges eaumeacutethanol et eauaceacutetonitrile soient connues
la viscositeacute de ceux-ci ne l‟est pas Pour les meacutelanges eaumeacutethanol qui preacutesentent des
tempeacuteratures de cristallisation infeacuterieures agrave -100degC agrave forts rapports meacutethanoleau il s‟est
aveacutereacute impossible d‟obtenir un deacutebit stable agrave des tempeacuteratures infeacuterieures agrave -80degC Pour les
meacutelanges eauaceacutetonitrile la limite se situe vers -25degC pour un minimum theacuteorique agrave -43degC
IV3312 Reacutealisation des prototypes
Le produit a ensuite eacuteteacute deacuteveloppeacute et des prototypes ont eacuteteacute reacutealiseacutes pour permettre sa
validation apregraves une seacuterie de tests
Pour cela une glaciegravere de la marque Campingaz qui preacutesentait l‟avantage d‟avoir des
joints d‟eacutetancheacuteiteacute ainsi qu‟une reacutesistance garantie agrave des tempeacuteratures de -78degC a eacuteteacute
transformeacutee en laquo cryosource raquo Dans la premiegravere version de notre dispositif d‟introduction agrave
froid des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse le gaz de neacutebulisation a eacuteteacute
laisseacute agrave tempeacuterature ambiante (Fig IV 9)
170
Fig IV 9 Scheacutema du prototype de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave
tempeacuterature ambiante
Afin de valider le prototype nous lavons compareacute agrave l‟ancien systegraveme d‟injection la
seringue refroidie Les reacutesultats obtenus avec la premiegravere version de la laquo cryosource raquo (courbe
en violet) sont assez similaires agrave ceux enregistreacutes avec la seringue refroidie (courbe en rouge)
(Fig IV 10) L‟ubiquitine preacutesente un taux de deuteacuteration un peu plus eacuteleveacute lorsqu‟elle est
introduite par la laquo cryosource raquo par rapport agrave la seringue refroidie Par contre le pourcentage
de deuteacuteration est instable au cours de l‟analyse MS La laquo cryosource raquo dans cette
configuration n‟apporte pas de valeur ajouteacutee agrave la seringue refroidie Elle doit donc ecirctre
ameacutelioreacutee pour ecirctre valideacutee
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (Ta) Seringue refroidie
Fig IV 10 Effet du systegraveme drsquoinjection utiliseacute sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de
lrsquoanalyse MS Les dispositifs ici compareacutes sont le systegraveme de seringue refroidie et la premiegravere
version de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave tempeacuterature ambiante
Ubiquitine
171
L‟ameacutelioration de notre dispositif a porteacute sur le refroidissement du gaz de neacutebulisation par
l‟azote liquide (78 K) (Fig IV 8) Il est envoyeacute dans l‟enceinte isoleacutee agrave -30degC par un tuyau en
cuivre qui traverse la boicircte L‟extreacutemiteacute du tuyau de cuivre agrave la sortie de la laquo cryosource raquo
est brancheacutee au niveau de la source ESI L‟aiguille de spray est par ce systegraveme elle-mecircme
refroidie
On obtient alors un spray refroidi stable qui nous donne les reacutesultats suivants (courbe en
bleu fonceacute) (Fig IV 11) Dans cette configuration l‟ubiquitine preacutesente un pourcentage
moyen de deuteacuteration nettement supeacuterieur agrave celui obtenu avec les autres systegravemes (ou
versions de systegravemes) et le taux de deuteacuteration est stable tout au long de l‟analyse MS (Fig
IV 11 Tab IV 1)
Tab IV 1 Pourcentages moyens de deuteacuteration de lrsquoubiquitine obtenus agrave lrsquoaide de la
seringue refroidie et de la laquo cryosource raquo dans les versions 1 et 2 et calculeacutes agrave diffeacuterents
temps de lrsquoanalyse par MS
1 min d‟analyse 5 min d‟analyse 10 min d‟analyse
Seringue refroidie 8870 8518 8484
Cryosource version 1 9773 9167
Cryosource version 2 10388 10433 10388
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (-30degC)
Seringue refroidie Cryosource N2 (Ta)
Fig IV 11 Effet du refroidissement du gaz de neacutebulisation agrave -30degC avec la laquo cryosource raquo
sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Ubiquitine
172
La Fig IV 11 montre que la ldquocryosourcerdquo dans sa version ameacutelioreacutee (avec le gaz de
neacutebulisation refroidi) agrave -30degC et pour un deacutebit d‟injection de 2 microLmin conduit agrave un
pourcentage de deuteacuteration tregraves proche de la valeur maximale attendue (105) et qui reste
stable pendant toute la dureacutee de l‟analyse par rapport au systegraveme de seringue refroidie La
laquo cryosource raquo avec ses diffeacuterents paramegravetres optimiseacutes est alors valideacutee
Nous avons ensuite testeacute diffeacuterentes tempeacuteratures dans la cryosource pour voir l‟influence
du paramegravetre tempeacuterature sur la deuteacuteration J‟ai donc eacutegalement testeacute les tempeacuteratures de -
20degC (courbe en violet) et -10degC (courbe en rouge) (Fig IV 12) Quelle que soit la
tempeacuterature de la laquo cryosource raquo elle nous permet de maintenir constant le taux de
deuteacuteration au cours de l‟analyse Cependant plus la tempeacuterature augmente plus le laquo back-
exchange raquo est important En effet agrave -30degC il est infeacuterieur agrave 3 tandis qu‟agrave -20degC le laquo back-
exchange raquo moyen est de 25 et agrave -10degC il est de 35 Ceci peut s‟expliquer par le fait que la
partie correspondant agrave la sortie de laquo cryosource raquo juste avant l‟entreacutee dans la source ESI
n‟est pas recouverte par un manchon isolant Elle est certes refroidie par l‟arriveacutee d‟un gaz
froid agrave -30degC mais qui se reacutechauffe au contact de l‟air conduisant agrave une perte de froid
Lorsque l‟inteacuterieur de la boicircte est agrave -30degC alors la sortie de la laquo cryosource raquo enregistre une
tempeacuterature d‟environ -10degC suffisante pour eacuteviter le reacute-eacutechange des deuteacuteriums avec les
hydrogegravenes Mais lorsque la tempeacuterature de la laquo cryosource raquo est supeacuterieure agrave -30degC ie agrave -
20degC ou agrave -10degC la sortie preacutesente des tempeacuteratures positives conduisant agrave du laquo back-
exchange raquo
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie -30degC -20degC -10degC
Fig IV 12 Effet de la tempeacuterature interne de la laquo cryosource raquo sur le maintien en place des
deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
173
Les Fig IV 11 et Fig IV 12 montrent que l‟utilisation de la laquo cryosource raquo agrave -30degC et
avec le refroidissement du gaz de neacutebulisation permet de reacuteduire le deacutebit d‟injection agrave 2
microLmin avec un laquo back-exchange raquo minimal (lt 3)
Nous avons ensuite voulu quantifier le laquo back-exchange raquo imputable agrave l‟eacutetape de dessalage
En effet le but ultime de cette eacutetude est de pouvoir utiliser notre dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes pour l‟analyse structurale de proteacuteines et de complexes proteacuteiques reacuteels
D‟apregraves le graphe de la Fig IV 13 nous concluons que l‟eacutetape de dessalage conduit agrave une
perte de 20 de la deuteacuteration lui aussi tregraves stable au cours du temps
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Sans dessalage Avec dessalage
Fig IV 13 Effet du dessalage sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Nous avons deacuteveloppeacute un dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
spectromegravetre de masse qui reacuteduit consideacuterablement le laquo back-exchange raquo Nous avons
deacutetermineacute un ensemble de paramegravetres optimiseacutes conduisant agrave moins de 3 d‟eacutechange inverse
en solution Pour cela il est indispensable d‟utiliser la laquo cryosource raquo pour refroidir
l‟eacutechantillon la tempeacuterature optimale du systegraveme eacutetant de -30degC pour un deacutebit d‟injection de
l‟analyte de 2 microLmin Le gaz de neacutebulisation doit ecirctre eacutegalement refroidi agrave -30degC La
laquo cryosource raquo preacutesente plusieurs avantages Elle permet de refroidir l‟eacutechantillon agrave tregraves basse
tempeacuterature agrave une valeur bien au-dessous de zeacutero degreacute Celsius ce qui allonge
consideacuterablement le temps d‟analyse La tempeacuterature est en effet stable pendant des temps
longs allant jusqu‟agrave une heure Et elle autorise de plus faibles deacutebits d‟injection Les diffeacuterents
paramegravetres optimiseacutes au niveau de l‟ancien et du nouveau dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes sont reacutecapituleacutes et compareacutes dans le tableau (Tab IV 2) Le dessalage
174
est maintenant l‟eacutetape critique pour la minimisation du laquo back-exchange raquo Il faudrait ecirctre
capable de le reacutealiser eacutegalement agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo
Tab IV 2 Comparaison des paramegravetres optimiseacutes pour les systegravemes de seringue refroidie et
de laquo cryosource raquo
Finalement il convient de noter qu‟une derniegravere ameacutelioration a eacuteteacute apporteacutee agrave la
laquo cryosource raquo suite agrave l‟observation de problegravemes de reproductibiliteacute preacutesenteacutes ci-dessous Il
apparaissait reacuteguliegraverement des problegravemes de bouchage du montage ougrave apregraves injection le
montage se retrouvait agrave monter en pression au-delagrave de la limite permise par le pousse-
seringue Apregraves recherche de l‟origine de ce problegraveme reacutecurrent nous avons pu identifier ce
problegraveme comme eacutetant arriveacute lors de l‟ajout du gaz de neacutebulisation refroidi et eacutetant lieacute agrave une
tempeacuterature du tuyau d‟ameneacutee de ce gaz largement infeacuterieure agrave celle de l‟enceinte (-65degC
mesureacutes agrave la jonction avec la source ESI) L‟augmentation de viscositeacute voire la cristallisation
au niveau de ces points froids pourrait ecirctre agrave l‟origine de ces pheacutenomegravenes de bouchage Ce
problegraveme a eacuteteacute reacutegleacute en ameacuteliorant les eacutechanges thermiques dans l‟enceinte agrave la fois par
l‟augmentation du contact tuyau du gaz de neacutebulisationruban chauffant mais eacutegalement par
l‟ajout d‟un ventilateur dans l‟enceinte Une contrepartie de ces ajouts est une perte de la
capaciteacute de refroidissement en dessous de -30degC
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides
Nous avons ensuite souhaiteacute valider notre dispositif d‟introduction des eacutechantillons
marqueacutes permettant la minimisation du laquo back-exchange raquo sur des peptides modegraveles
seacutelectivement deuteacutereacutes En effet ces peptides sont speacutecifiquement construits pour la mise au
point d‟expeacuteriences HDXMS Leur analyse permet d‟eacutetudier les pheacutenomegravenes de laquo back-
exchange raquo et plus particuliegraverement de laquo scrambling raquo
175
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK
Le peptide HHHHHHIIKIIK complegravetement deuteacutereacute est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-
terminal apregraves dilution dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes
d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide introduit par la cryosource dans le spectromegravetre de
masse FT-ICR contient bien 45 deuteacuteriums Le reacutesultat est conforme agrave la publication de T
Joslashrgensen (26) De plus au cours de l‟analyse MS le nombre de deuteacuteriums reste constant par
rapport agrave l‟utilisation du systegraveme de seringue refroidie (Fig IV 14) La laquo cryosource raquo permet
donc de reacuteduire au maximum l‟eacutechange inverse dans le cas eacutegalement de l‟analyse du peptide
HHHHHHIIKIIK par HDX Le systegraveme peptide modegravele laquo cryosource raquo permettra d‟eacutetudier
par la suite le laquo scrambling raquo avec preacutecision
0
1
2
3
4
5
6
0 100 200 300 400 500 600
No
mb
re d
e d
eu
teacuteri
um
s
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource Seringue refroidie
Fig IV 14 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse Comparaison de la
laquo cryosource raquo vs la seringue refroidie
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK
La mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee avec le peptide KKDDDDDDIIKIIK qui appartient agrave la
mecircme famille que HHHHHHIIKIIK Dans un premier temps il est complegravetement deuteacutereacute par
incubation dans D2O Puis il est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-terminal par dilution dans
une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes d‟incubation dans H2O
glaceacutee le peptide est finalement injecteacute dans la laquo cryosource raquo puis analyseacute en spectromeacutetrie
de masse Son nombre de deuteacuteriums est alors supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) (Fig IV
15) Avant de tester la stabiliteacute de la laquo cryosource raquo il nous faut deacuteterminer le temps
HHHHHHIIKIIK
176
d‟incubation dans H2O glaceacutee pour lequel le peptide aura incorporeacute 45 deuteacuteriums
Apparemment ce temps serait supeacuterieur agrave quatorze minutes
5586311
5589655
5592998
55963595599711
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000001d +MS2(5586)
0
1
2
3
4
7x10
Intens
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5596387
5599738
5603078
5606417 5609768
5613124
5616476
56198265623171
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000010d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5589678 5593021 5596386
5599737
5603078
56064175609769
5613122
5616475
56198235623167
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000017d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5593029
5596384
5599727
5603066
5606408
5609760
5613115
5616464
5619811
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000030d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
58 D
Reacutefeacuterence sans HDX
Avec HDX sans incubation dans
H2O analyse agrave t0 = 0 min
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 10 min56 D
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 14 min
50 D
(a)
(b)
(c)
(d)
Fig IV 15 Zoom du massif isotopique de lrsquoion parent [M+3H] 3+
dans les spectres MS du
peptide KKDDDDDDIIKIIK Les eacutechantillons marqueacutes sont introduits par la laquo cryosource raquo
et le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes est calculeacute apregraves diffeacuterents temps drsquoincubation dans
H2O t0=0 min (b) 10 min (c) et 14 min (d) par rapport agrave la reacutefeacuterence sans marquage (a)
IV33221 Deacutetermination du temps drsquoincubation pour le deacutemarquage seacutelectif
J‟ai donc deacutecideacute de retravailler avec le systegraveme de seringue refroidie pour pouvoir
deacuteterminer ce temps Le montage reacutealiseacute a eacuteteacute le suivant apregraves que l‟eacutechantillon ait eacuteteacute
complegravetement deuteacutereacute il a eacuteteacute dilueacute dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature pour
bloquer la reacuteaction d‟eacutechange HD Il a ensuite eacuteteacute immeacutediatement preacuteleveacute et injecteacute agrave 10
microLmin par la seringue refroidie qui a eacuteteacute entoureacutee par deux sachets de glace L‟acquisition
des donneacutees a eacuteteacute reacutealiseacutee pendant vingt-cinq minutes Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig
IV 16 Avec le systegraveme de seringue refroidie le temps requis semble ecirctre de quatorze
minutes alors qu‟il paraissait ecirctre supeacuterieur avec la laquo cryosource raquo
La difficulteacute geacuteneacuterale agrave laquelle nous n‟avions pas penseacute initialement est la suivante les
hydrogegravenes d‟amide ne se deacutemarquent pas agrave la mecircme vitesse et dans les expeacuteriences de T
Joslashrgensen la fin du deacutemarquage a lieu dans le capillaire de transfert qui est agrave tempeacuterature
177
ambiante Elle est donc incontrocirclable La laquo cryosource raquo quant agrave elle ne comporte pas de
capillaire de transfert agrave tempeacuterature ambiante pour finir le deacutemarquage Par conseacutequent il
nous faut deacuteterminer avec ce nouveau mode d‟introduction le temps d‟incubation des
peptides dans H2O pour les deacutemarquer seacutelectivement et avoir exactement le bon nombre
initial de deuteacuteriums Il semblerait que ce temps d‟incubation soit plus long dans le cas de
l‟utilisation de la laquo cryosource raquo
2
3
4
5
6
0 5 10 15 20 25
No
mb
re d
e d
eu
teacuteri
um
s
Temps danalyse (en minutes)
Fig IV 16 Nombre de deuteacuteriums de lrsquoion parent [M+3H] 3+
du peptide KKDDDDDDIIKIIK
calculeacute en fonction du temps de reacutesidence dans la seringue refroidie agrave 0degC tout au long de
lrsquoanalyse
Par conseacutequent j‟ai travailleacute de nouveau avec la laquo cryosource raquo par tacirctonnements J‟ai
reacutealiseacute plusieurs essais (Fig IV 17) Un essai correspond agrave une incubation du peptide
complegravetement marqueacute dans H2O glaceacutee et agrave une ou plusieurs injections dans la laquo cryosource raquo
agrave diffeacuterents temps D‟apregraves les reacutesultats du premier essai (points en bleu) le nombre de
deuteacuteriums retenu par le peptide seacutelectivement deacutemarqueacute apregraves vingt minutes d‟incubation est
supeacuterieur (53) agrave ce qui est attendu (45) mais apregraves trente minutes il est infeacuterieur (40) Un
deuxiegraveme essai a donc eacuteteacute reacutealiseacute apregraves vingt-cinq minutes d‟incubation (point rouge)
supposeacute ecirctre le temps que l‟on cherche agrave deacuteterminer Mais le nombre de deuteacuteriums s‟est
aveacutereacute bien supeacuterieur (68) agrave ce que nous attendions Un troisiegraveme essai (point orange) agrave trente
minutes d‟incubation a donneacute exactement le mecircme nombre de deuteacuteriums (53) qu‟une
mesure effectueacutee preacuteceacutedemment agrave vingt minutes (1er
essai) Un dernier essai a eacuteteacute reacutealiseacute pour
diffeacuterents temps d‟incubation allant de vingt agrave soixante minutes (points en violet) laissant
supposer que vingt-cinq minutes serait le temps rechercheacute Notons ici que je n‟ai pas eu de
178
signal en spectromeacutetrie de masse pour des temps d‟incubation infeacuterieurs agrave vingt minutes
Pourtant j‟ai testeacute les temps t= 0 15 min Par conseacutequent les reacutesultats ne sont pas
reproductibles et il semblerait que j‟ai rencontreacute des problegravemes de bouchage en raison de
l‟apparition de points froids dans le montage
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Theacuteorie 1er essai 2e essai 3e essai 4e essai
Fig IV 17 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee
J‟ai alors reacutealiseacute le mecircme type d‟expeacuterience un autre jour en augmentant le deacutebit agrave 25
microLmin (courbe noire Fig IV 18) Cela m‟a permis finalement d‟obtenir du signal pour des
temps t= 0 15 min Cependant le temps d‟incubation dans H2O glaceacutee pour avoir le bon
nombre de deuteacuteriums initial semble avoir consideacuterablement eacuteteacute reacuteduit (de 25 agrave 10 min
environ) Pour s‟assurer de la reproductibiliteacute des reacutesultats la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee un
autre jour (courbe orange) Puis j‟ai effectueacute deux autres essais (courbes bleue et rouge) le
mecircme jour apregraves avoir recouvert la sortie de la laquo cryosource raquo qui se branche sur la source
ESI du FT-ICR par un manchon isolant L‟ideacutee ici est de limiter au maximum les pertes de
froid agrave cet endroit La tempeacuterature diminue passant de -8degC agrave -15degC Ainsi le nombre de
deuteacuteriums est augmenteacute Les reacutesultats semblent reproductibles et deacutesormais un temps
d‟incubation de quinze minutes semble convenir
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Fig IV 18 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee Le
deacutebit drsquoinjection a eacuteteacute augmenteacute agrave 25 microLmin et la sortie de la laquo cryosource raquo isoleacutee
thermiquement (courbes en bleu et en rouge)
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo
Apregraves quinze minutes d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide est de nouveau injecteacute dans
la laquo cryosource raquo puis analyseacute par spectromeacutetrie de masse Son nombre de deuteacuteriums est une
nouvelle fois supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) De plus un pheacutenomegravene tout agrave fait
incompreacutehensible est observeacute le nombre de deuteacuteriums augmente lors des premiegraveres minutes
de l‟analyse alors que le peptide est stockeacute agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo Le peptide gagne
deux deuteacuteriums suppleacutementaires au bout de cinq minutes passant de 56 agrave 76 deuteacuteriums
(Fig IV 19) Dans ces conditions la minimisation du laquo scrambling raquo en utilisant le peptide
KKDDDDDDIIKIIK et la laquo cryosource raquo ne peut pas ecirctre envisageacutee
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Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource
Fig IV 19 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse
Pour s‟assurer que ce pheacutenomegravene n‟est pas un arteacutefact expeacuterimental mais qu‟il est
reproductible la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee agrave diffeacuterents temps t= 0 15 20 25 30 min
d‟incubation dans H2O glaceacutee (Fig IV 20) Les diffeacuterentes courbes preacutesentent la mecircme allure
deacutefinie par deux parties La premiegravere partie qui correspond aux cinq premiegraveres minutes
d‟analyse montre une augmentation du nombre de deuteacuteriums tandis que la seconde partie est
caracteacuteriseacutee par une diminution du nombre de deuteacuteriums Le temps d‟incubation dans H2O
glaceacutee a eacuteteacute changeacute et vingt minutes semblent maintenant convenir
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Temps danalyse (en minutes)
Theacuteorie
0 min
15 min
20 min
25 min
30 min
Fig IV 20 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents temps
drsquoincubation dans H2O glaceacutee
KKDDDDDDIIKIIK
181
Pour essayer de comprendre scientifiquement le pheacutenomegravene en utilisant le mecircme jeu de
donneacutees j‟ai traceacute le graphe suivant intensiteacute des ions formeacutes en fonction du temps
d‟analyse (Fig IV 21) Les courbes preacutesentent la mecircme allure que celles du graphe de la
figure preacuteceacutedente (Fig IV 20) L‟intensiteacute des ions semble varier comme le nombre de
deuteacuteriums
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
0 5 10 15 20 25 30
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Temps danalyse (en minutes)
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 21 Intensiteacute des ions en fonction du temps drsquoanalyse pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Nous deacutecidons alors de tracer le graphe de l‟intensiteacute des ions en fonction du nombre de
deuteacuteriums (Fig IV 22) Il apparaicirct alors clairement qu‟il existe une correacutelation entre le
nombre d‟ions formeacutes et le nombre de deuteacuteriums retenus Or les facteurs qui peuvent
influencer le nombre d‟ions formeacutes sont le pH et la concentration en analyte En effet un pH
acide et une concentration eacuteleveacutee d‟eacutechantillon favorisent la formation d‟ions Sachant que les
eacutechanges HD sont controcircleacutes non seulement par la tempeacuterature mais aussi par le paramegravetre
pH alors le pheacutenomegravene que nous observons ressemblerait agrave un effet de pH Cet effet de pH
s‟expliquerait par un effet de meacutelange entre la solution contenant l‟eacutechantillon (peptide
complegravetement deuteacutereacute dilueacute au 1100e dans une solution H2OMeOH 4060 acidifieacutee) et le
solvant (H2OMeOH 4060) qui sert agrave pousser l‟analyte vers la source du spectromegravetre de
masse (Fig IV 23)
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00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Nombre de deuteacuteriums
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 22 Intensiteacute des ions en fonction du nombre de deuteacuteriums pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Fig IV 23 Scheacutema explicatif de lrsquohypothegravese de lrsquoeffet de meacutelange observeacute
Afin de s‟affranchir de l‟effet de meacutelange nous avons deacutecideacute de modifier la composition
du solvant de faccedilon agrave avoir exactement la mecircme que pour l‟eacutechantillon Autrement dit nous
l‟avons acidifieacute et leacutegegraverement deuteacutereacute Le nouveau solvant est un meacutelange H2OMeOH 4060
auquel a eacuteteacute ajouteacute 05 M d‟acide aceacutetique et 1 de D2O Il est conserveacute agrave -20degC avant
chaque utilisation Un sachet de glace est eacutegalement deacuteposeacute sur la seringue contenant le
solvant lors de l‟analyse par MS Le lavage des capillaires en PEEK (boucle et celui
183
d‟introduction de l‟eacutechantillon dans le spectromegravetre de masse) est deacutesormais reacutealiseacute gracircce au
nouveau solvant Puis j‟ai testeacute l‟effet du deacutebit d‟injection sur la reacutetention du marquage dans
la laquo cryosource raquo (Fig IV 24 et Fig IV 25) Les reacutesultats montrent que pheacutenomegravene
s‟amplifie avec l‟augmentation du deacutebit ce qui est inattendu
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350microLh
600 microLh (10 microLmin)
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Fig IV 24 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Les analyses sont reacutealiseacutees dans lrsquoordre
croissant du deacutebit drsquoinjection
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
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Fig IV 25 Zoom de la Fig IV 24 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les mecircmes expeacuteriences ont ensuite eacuteteacute reacutealiseacutees en changeant l‟ordre des diffeacuterents deacutebits
d‟injection testeacutes (Fig IV 26 et Fig IV 27)
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
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Fig IV 26 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 600 microLh est testeacute en
premier puis celui de 150 microLh et enfin celui de 350 microLh
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600 microLh (10 microLmin)1
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Fig IV 27 Zoom de la Fig IV 26 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les reacutesultats ne sont pas reproductibles Nous deacutecidons alors de raccourcir au maximum le
capillaire en PEEK qui transfegravere le solvant dans la laquo cryosource raquo (67 cm 22 cm) et de
recommencer une nouvelle seacuterie de mesures en changeant une nouvelle fois l‟ordre des
diffeacuterents deacutebits d‟injection testeacutes (Fig IV 28) Les reacutesultats obtenus ne sont toujours pas
satisfaisants
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
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Fig IV 28 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 150 microLh est testeacute en
premier puis celui de 360 microLh et enfin celui de 350 microLh
Nous avons ensuite voulu deacutecoupler l‟effet du deacutebit agrave celui du temps en reacutealisant trois fois
conseacutecutivement la mecircme expeacuterience dans les mecircmes conditions avec le mecircme deacutebit et en
testant les deux deacutebits extrecircmes 2 microLmin et 10 microLmin (reacutealisation de triplicats) De
nouvelles conditions expeacuterimentales ont eacuteteacute deacutefinies La laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee pendant
trente minutes apregraves qu‟elle ait atteint sa tempeacuterature de -30degC Auparavant les analyses
eacutetaient lanceacutees sans l‟eacutetape de stabilisation de la laquo cryosource raquo De plus l‟ajout d‟azote
liquide dans le reacutecipient servant agrave refroidir le systegraveme n‟est deacutesormais plus effectueacute pendant
l‟analyse mais uniquement entre deux analyses Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig IV 29
Le nombre de deuteacuteriums n‟est toujours pas stable lors de l‟analyse par MS
Il semblerait que la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la laquo cryosource raquo ne soit pas homogegravene en
tout point L‟ajout d‟une seconde sonde thermique proche de la source du spectromegravetre de
masse pourrait mettre en eacutevidence le diffeacuterentiel de tempeacuterature
Une ideacutee serait de rincer la boucle d‟injection avec un solvant identique mais
complegravetement deuteacutereacute (D2OCH3ODCH3COOD) afin de comparer les reacutesultats
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150 microLh (25 microLmin)
600 microLh (10 microLmin)
Fig IV 29 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour les deacutebits drsquoinjection
de 2 microLmin et 10 microLmin sans incubation dans H2O glaceacutee
Le peptide KKDDDDDDIIKIIK semble ecirctre tregraves sensible vis-agrave-vis de la deuteacuteration agrave un
(ou plusieurs) paramegravetre(s) relatif(s) agrave l‟utilisation de la laquo cryosource raquo que nous n‟identifions
ni ne controcirclons Pour veacuterifier si ces problegravemes eacutetaient geacuteneacuteraux ou speacutecifiques de ce peptide
nous avons deacutecideacute deffectuer nos tests sur un peptide plus classique le Glufibrinopeptide
(GluF)
IV3323 Cas du peptide GluF
Le peptide GluF n‟est pas un peptide classiquement utiliseacute pour la mise au point
d‟expeacuteriences HDXMS mais il nous sert au laboratoire comme standard de calibration en
MSMS car il se fragmente pour donner de nombreux ions b et y en CID
Fort heureusement lanalyse du GluF agrave laide de la cryosource apregraves incubation dans D2O
et dilution dans les solvants hydrogeacuteneacutes indique que le marquage reste stable au cours de
l‟analyse par spectromeacutetrie de masse (Fig IV 30) Ces reacutesultats montrent que les problegravemes
que nous avons rencontreacutes preacuteceacutedemment semblent lieacutes agrave la nature du peptide K2D6IIKIIK et
permettent enfin de valider lutilisation de la laquo cryosource raquo minutieusement optimiseacutee pour
des eacutetudes HDXMS
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
Fig IV 30 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse apregraves injection du peptide
GluF deuteacutereacute dans la laquo cryosource raquo
IV34 Conclusion
Nous avons deacuteveloppeacute un nouveau systegraveme dintroduction des proteacuteines deuteacutereacutees dans le
spectromegravetre de masse que nous avons appeleacute laquo cryosource raquo Lutilisation de cette
laquo cryosource raquo permet le stockage des eacutechantillons dans une enceinte isoleacutee agrave -30degC ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs (une heure) et permet eacutegalement de travailler
avec des deacutebits faibles de lordre de 2 microLmin
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de peptides seacutelectivement marqueacutes et eacutegalement sur lubiquitine proteacuteine modegravele de 86
kDa
L‟analyse du peptide de reacutefeacuterence KKDDDDDDIIKIIK a permis une optimisation plus
fine des paramegravetres Des ameacuteliorations techniques ont eacuteteacute apporteacutees Le solvant utiliseacute pour
pousser l‟eacutechantillon jusqu‟agrave la source du spectromegravetre de masse a eacuteteacute modifieacute Il a eacuteteacute
acidifieacute (acide aceacutetique 05M) et deuteacutereacute (1 D2O) afin d‟avoir la mecircme composition que
celle de l‟eacutechantillon Il a eacutegalement eacuteteacute conserveacute agrave -20degC avant son utilisation L‟analyse est
reacutealiseacutee avec un sachet de glace sur la seringue contenant le solvant et le capillaire en PEEK
d‟entreacutee dans la laquo cryosource raquo a eacuteteacute raccourci (67 cm 22 cm) La sortie de la
laquo cryosource raquo assurant le couplage avec la source ESI a eacuteteacute quant agrave elle isoleacutee La
188
tempeacuterature optimale de la laquo cryosource raquo est de -30degC pour un deacutebit optimum de 25 microLmin
Avant le deacutebut des analyses la laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee agrave -30degC pendant trente minutes
pendant lesquelles le solvant est continuellement injecteacute permettant le rinccedilage des capillaires
Le remplissage d‟azote liquide pour le refroidissement du systegraveme est reacutealiseacute entre deux
analyses concomitamment agrave une eacutetape de lavage des capillaires de vingt minutes gracircce au
solvant
La toute derniegravere innovation apporteacutee agrave la laquo cryosource raquo est l‟ajout d‟un ventilateur afin
d‟homogeacuteneacuteiser la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la boicircte
Notre objectif final est dutiliser le dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes que
nous avons deacuteveloppeacute dans une approche HDX top-down ECD pour obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques responsables de l‟initiation de la traduction dans le
cadre dune collaboration avec laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique Et plus
geacuteneacuteralement de fournir agrave la communauteacute des biologistes structuraux une meacutethodologie
robuste pour l‟analyse de proteacuteines et complexes proteacuteiques par eacutechanges isotopiques HD et
spectromeacutetrie de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR)
J‟aimerais souligner le fait que des travaux similaires ont eacuteteacute meneacutes par l‟eacutequipe du Prof
T Joslashrgensen au Danemark pour le mecircme objectif de reacuteduire le laquo back-exchange raquo lors
d‟eacutetudes HDX par top-down ECD ou ETD Dans leur cas ils ont deacuteveloppeacute un systegraveme de
refroidissement des eacutechantillons agrave -15degC tout aussi efficace agrave partir du systegraveme TriVersa
NanoMate de la socieacuteteacute Advion (28)
189
IV4 Bibliographie
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dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange
measurements J Am Chem Soc 130 11574-11575
25 Sterling H J and Williams E R (2010) Real-Time HydrogenDeuterium Exchange
Kinetics via Supercharged Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry
Analytical Chemistry 82 9050-9057
26 Rand K D and Jorgensen T J (2007) Development of a peptide probe for the
occurrence of hydrogen (1H2H) scrambling upon gas-phase fragmentation Analytical
Chemistry 79 8686-8693
27 Bache N Rand K D Roepstorff P and Jorgensen T J (2008) Gas-phase
fragmentation of peptides by MALDI in-source decay with limited amide hydrogen
(1H2H) scrambling Analytical Chemistry 80 6431-6435
28 Amon S Trelle M B Jensen O N and Jorgensen T J (2012) Spatially resolved
protein hydrogen exchange measured by subzero-cooled chip-based nanoelectrospray
ionization tandem mass spectrometry Analytical Chemistry 84 4467-4473
191
Conclusion geacuteneacuterale
192
193
Lobjectif initial de ce travail de thegravese eacutetait de mettre au point une meacutethode robuste top-
down HDX-MSMS (cest-agrave-dire combinant eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium en solution et
fragmentation de proteacuteines entiegraveres en phase gazeuse) pour pouvoir obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques reacuteels Combiner eacutechanges HD et spectromeacutetrie de
masse nest pas nouveau mais les meacutethodes classiquement utiliseacutees dites bottom-up et
baseacutees sur une digestion enzymatique preacutesentent linconveacutenient majeur decirctre peu reacutesolutives
(5-10 acides amineacutes en moyenne) Mettre au point des approches sur proteacuteines entiegraveres
preacutesente sur le principe un grand nombre davantages le premier gain attendu est pour la
reacutesolution (qui peut atteindre un seul acide amineacute) le second est pour leacutechange inverse
(laquo back-exchange raquo) qui devrait en theacuteorie ecirctre plus limiteacute car le nombre deacutetapes lors
desquels ce pheacutenomegravene peut se produire (digestion enzymatique seacuteparation
chromatographique) est reacuteduit
Ce travail de thegravese montre cependant quil nest pas aiseacute de mettre une meacutethode top-down
HDX au point et que nous avons ducirc faire face agrave un certain nombre de problegravemes
Tout dabord les reacutesultats obtenus pour les peptides que lon peut seacutelectivement marquer
montrent quil est important doptimiser de maniegravere fine un certain nombre de paramegravetres
expeacuterimentaux que ce soit dans la source dionisation ou agrave diffeacuterents endroits de linstrument
pour eacuteviter au maximum leacutechange inverse entre deuteacuteriums et hydrogegravenes Nos reacutesultats
montrent eacutegalement que ces paramegravetres sont deacutependants du spectromegravetre de masse sur lequel
les expeacuteriences sont reacutealiseacutees et que lanalyse de peptides seacutelectivement marqueacutes devrait ecirctre
un preacute-requis pour toutes les eacutetudes par eacutechange HD Nos reacutesultats confirment eacutegalement que
lECD peut ecirctre utiliseacute pour localiser de maniegravere preacutecise les deuteacuteriums dans la seacutequence et
quune reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue ce qui est une ameacutelioration majeure
par rapport aux expeacuteriences classiques de bottom-up sans fragmentation
Sur la base du protocole optimiseacute pour des peptides nous avons souhaiteacute poursuivre
lanalyse du complexe aIF2 impliqueacute dans linitiation de la traduction chez les archeacutees Nous
avons alors fait face agrave un certain nombre de problegravemes Le premier a eacuteteacute le manque de
reproductibiliteacute de nos expeacuteriences avec des variations importantes au niveau du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes et de leur localisation Un point crucial que nous avons mis en
eacutevidence au cours de nos travaux est que pour une proteacuteine contrairement agrave un peptide le
nombre de fragments est important leur intensiteacute couvre un large domaine dynamique et la
deuteacuteration reacuteduit fortement l‟intensiteacute totale Par conseacutequent il est neacutecessaire d‟accumuler un
194
grand nombre de scans MSMS pour faire augmenter le rapport signal sur bruit des fragments
peu intenses et que dans ce cas le problegraveme de leacutechange inverse devient majeur En effet
alors que pour des peptides leacutelargissement des pics ducirc agrave la deuteacuteration ne pose pas reacuteellement
de problegraveme danalyse car les masses des fragments ne sont pas tregraves eacuteleveacutees et le nombre de
fragments nest pas tregraves important le problegraveme est tout autre quand on passe sur des systegravemes
plus grands ne serait-ce que pour une petite proteacuteine de 10 kDa Ainsi il devient tout agrave fait
crucial de pouvoir accumuler pendant un temps suffisant pour pouvoir analyser correctement
les massifs isotopiques larges qui sont obtenus (et qui seacutelargissent au fur et agrave mesure que la
cineacutetique de deuteacuteration avance) Par ailleurs le nombre de fragments obtenus pour une
proteacuteine de 10 kDa est bien supeacuterieur agrave ce que lon attend pour un peptide et le
chevauchement des massifs isotopiques dans les spectres MSMS devient eacutegalement un
problegraveme qui conduit agrave une diminution importante des couvertures de seacutequence entre
leacutechantillon non deuteacutereacute et leacutechantillon deuteacutereacute
Nos reacutesultats obtenus sur aIF2 sont neacuteanmoins prometteurs et montrent quil est reacuteellement
possible dobtenir une reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves sur certains segments de la proteacuteine et
que de nouvelles ameacuteliorations de lapproche devraient permettre darriver agrave lobjectif initial
que nous nous eacutetions fixeacutes LECD et lETD sont des meacutethodes de choix pour ces approches
mais certains reacutesultats que nous avons obtenus en CID montrent quil est sans doute possible
dutiliser ce mode de fragmentation installeacute sur tous les spectromegravetres de masse sous
certaines conditions qui restent encore agrave deacuteterminer
Lensemble de nos reacutesultats nous a ainsi conduits agrave consideacuterer que notre systegraveme
dintroduction des eacutechantillons baseacute initialement sur une seringue refroidie ne convenait pas
aux approches top-down et quil eacutetait absolument essentiel de trouver une solution
alternative permettant de maintenir le taux de deuteacuteration initial pendant un temps
suffisamment long pour quun grand nombre de scans MSMS puissent ecirctre accumuleacutes Nous
avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme complegravetement diffeacuterent de ce qui existe
aujourdhui dans les diffeacuterentes eacutequipes travaillant dans le domaine baseacute sur lutilisation dune
enceinte isoleacutee refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des
deacutebits faibles Le deacuteveloppement de cette cryosource nous a pris plusieurs mois car
maintenir une tempeacuterature de -30degC pour le stockage des eacutechantillons jusquagrave leur
introduction dans le spectromegravetre de masse induit un certain nombre de contraintes (viscositeacute
du solvant formation de bouchons difficulteacute agrave reacutealiser des meacutelanges homogegravenes sur des
195
temps courts) Neacuteanmoins les reacutesultats que nous avons obtenus avec la derniegravere version
optimiseacutee sont tregraves encourageants car ils montrent quil est deacutesormais possible de travailler
pendant des temps longs avec les eacutechantillons deuteacutereacutes sans que le taux de deuteacuteration ne
varie au cours de lanalyse Malheureusement nous navons pas eu le temps au cours de ma
thegravese de revenir sur les proteacuteines du complexe aIF2 et de les analyser avec ce nouveau
systegraveme dintroduction mais nous pensons que lutilisation de cette source devrait enfin
rendre notre approche robuste et applicable agrave des eacutechantillons reacuteels
Ainsi je considegravere que mon travail de thegravese a permis de faire un grand pas en avant pour
rendre les approches top-down HDX applicables agrave des systegravemes preacutesentant un inteacuterecirct
biologique important (ce qui nest pas exactement le cas de tout ce qui a eacuteteacute deacutecrit dans la
litteacuterature jusquici) et que dans quelques anneacutees ces approches complegraveteront de maniegravere
robuste larsenal des meacutethodes danalyse utiliseacutees en biologie structurale apportant des
informations compleacutementaires agrave ce que la RMN ou les rayons X sont capables de fournir
196
197
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes
198
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
199
A1 Instrumentation
A11 Ionisation par eacutelectrospray
La premiegravere eacutetape d‟une expeacuterience par spectromeacutetrie de masse consiste agrave vaporiser et
ioniser l‟analyte (des moleacutecules) ie agrave former agrave partir d‟un milieu gazeux liquide ou solide
des moleacutecules ioniseacutees isoleacutees manipulables dans le vide pousseacute preacutesent dans le spectromegravetre
de masse Pour cela diffeacuterentes sources d‟ionisation ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees adapteacutees agrave diffeacuterents
types d‟eacutechantillons et agrave diffeacuterents analyseurs
L‟eacutelectroneacutebulisation (ou eacutelectrospray ESI) est une meacutethode d‟ionisation agrave pression
atmospheacuterique qui permet de transfeacuterer et ioniser simultaneacutement des macromoleacutecules intactes
(eg des proteacuteines) preacutesentes en solution en phase gazeuse La formation des ions en phase
gazeuse par cette technique est reacutealiseacutee par des meacutecanismes de deacutesolvatation peu eacutenergeacutetiques
n‟induisant quasiment pas de fragmentation L‟eacutelectrospray est donc consideacutereacutee comme une
technique dionisation douce par opposition agrave d‟autres techniques comme l‟impact
eacutelectronique technique tregraves eacutenergeacutetique qui conduit agrave un grand nombre de fragmentations lors
de leacutetape dionisation De plus les ions isoleacutes sont formeacutes directement agrave partir des moleacutecules
en solution ce qui permet d‟eacuteviter une eacutetape de vaporisation par chauffage qui peut conduire
agrave la deacutegradation de l‟analyte L‟eacutelectroneacutebulisation a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par John Fenn (1) sur la
base de travaux plus anciens de Malcolm Dole (2) et John Zeleny (3) et aujourd‟hui elle est
(avec le MALDI) la meacutethode de choix pour l‟eacutetude des biomoleacutecules par spectromeacutetrie de
masse
La formation des ions en phase gazeuse par eacutelectrospray se deacuteroule en trois eacutetapes
principales (i) formation des gouttelettes chargeacutees agrave l‟extreacutemiteacute dun capillaire meacutetalliseacute (ii)
eacutevaporation du solvant et fission des gouttelettes par explosions coulombiennes successives
et finalement (iii) obtention d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir des gouttelettes
fortement chargeacutees issues des deux premiegraveres eacutetapes Les meacutecanismes preacutecis de la formation
des espegraveces ioniseacutees et deacutesolvateacutees dans les deux derniegraveres eacutetapes sont aujourd‟hui encore
assez mal deacutefinis et sujets agrave controverse
200
A111 Formation des gouttelettes chargeacutees
L‟eacutetape initiale du processus d‟eacutelectrospray est la formation de gouttelettes chargeacutees agrave
partir d‟une solution Pour cela l‟eacutechantillon est introduit dans un capillaire meacutetallique (ou
une aiguille meacutetalliseacutee) porteacute agrave un fort potentiel eacutelectrique de plusieurs kilovolts (kV)
L‟application d‟une telle diffeacuterence de potentiel entre ce capillaire et une contre-eacutelectrode
placeacutee quelques millimegravetres plus loin induit une seacuteparation des charges agrave linteacuterieur du liquide
par un pheacutenomegravene eacutelectrophoreacutetique de migration des eacutelectrolytes (cations et anions) Lorsque
le capillaire est utiliseacute comme eacutelectrode positive les espegraveces cationiques s‟accumulent alors agrave
son extreacutemiteacute tandis que les anions migrent en sens inverse en s‟accumulant agrave l‟inteacuterieur
jusqu‟agrave s‟oxyder agrave la surface du capillaire (Fig A 1)
Fig A 1 Scheacutema simplifieacute du fonctionnement drsquoune source eacutelectrospray (4)
Ainsi en mode dit positif les cations sont attireacutes par l‟eacutelectrode neacutegative (contre-
eacutelectrode) et les anions par l‟eacutelectrode positive (capillaire) La seacuteparation des charges induit
une deacuteformation du liquide agrave l‟extreacutemiteacute du capillaire deacuteformation qui met en jeu un
eacutequilibre entre les forces eacutelectrostatiques (reacutepulsives) et la tension de surface (attractive) du
liquide Lorsque les forces eacutelectrostatiques atteignent la valeur de la tension de surface du
liquide la deacuteformation est conique et porte le nom de cocircne de Taylor (5) Une faible
augmentation du champ eacutelectrique suffit alors agrave deacutestabiliser le cocircne qui se rompt agrave son
extreacutemiteacute dispersant la solution en nombreuses gouttelettes qui emportent une partie des
charges preacutesentes agrave la pointe Apregraves cette eacutetape les gouttelettes se deacuteplacent sous l‟influence
du champ eacutelectrique mais eacutegalement sous celle d‟un gradient de pression creacuteeacute par la
deacutepression agrave lentreacutee du spectromegravetre de masse
201
A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes
Les gouttelettes chargeacutees issues du cocircne de Taylor migrent donc vers l‟interface du
spectromegravetre de masse Sur leur trajet elles entrent en collision avec le gaz atmospheacuterique et
suivant les interfaces avec un gaz de seacutechage et subissent une eacutevaporation du solvant alors
que le nombre de charges reste constant L‟eacutevaporation du solvant est favoriseacutee par la
tempeacuterature souvent eacuteleveacutee de la source dionisation (80-140degC) La diminution du rayon R
des gouttelettes posseacutedant une charge constante q conduit agrave l‟augmentation de la reacutepulsion
eacutelectrostatique des charges agrave sa surface jusqu‟agrave ce que les gouttelettes atteignent la limite de
stabiliteacute de Rayleigh donneacutee par
213
0 )(8 RqRy
ougrave 0 permittiviteacute du vide R rayon de densiteacute de charges et tension de surface stabilisant
la goutte
Cette eacutequation donne les conditions pour lesquelles les forces de reacutepulsions
eacutelectrostatiques deviennent eacutegales agrave celles de tension de surface A partir de la limite de
Rayleigh la gouttelette chargeacutee devient instable ce qui conduit agrave une explosion
coulombienne correspondant agrave la fission de la gouttelette en gouttelettes de plus petites tailles
Les travaux de Rayleigh en 1882 (6) puis de Gomez et Tang en 1994 (7) ont montreacute que la
fission des gouttelettes s‟effectuait par eacutemission d‟un jet tregraves fin de gouttelettes sans reacuteelle
relation de symeacutetrie Ce pheacutenomegravene d‟eacutevaporation se reproduit jusqu‟agrave ce que les nouvelles
gouttelettes aient agrave nouveau atteint la limite de Rayleigh
A113 Formation drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites
gouttelettes fortement chargeacutees
Dans la litteacuterature deux meacutecanismes ont eacuteteacute proposeacutes pour expliquer ce pheacutenomegravene Le
premier modegravele dit modegravele des reacutesidus chargeacutes ou laquo Charged Residue Model raquo (CRM) a eacuteteacute
deacutecrit par Dole en 1968 (2) L‟hypothegravese est la suivante la succession d‟explosions
coulombiennes conduirait agrave des gouttelettes de plus en plus petites jusqu‟agrave ce que la derniegravere
gouttelette ne possegravede plus qu‟une seule et unique moleacutecule d‟analyte (Fig A 2 (a)) Dans
ce modegravele l‟eacutevaporation totale du solvant reacutesiduel accumule les charges sur l‟analyte et
permet l‟obtention d‟ions multichargeacutes en phase gazeuse
202
En 1979 une seconde theacuteorie baseacutee sur de nouveaux meacutecanismes a eacuteteacute proposeacutee par Iribarne
et Thomson (8) Il s‟agit du modegravele de l‟eacutevaporation ionique ou laquo Ion Evaporation Model raquo
(IEM) Leur theacuteorie repose comme celle de Dole sur une succession initiale de fissions de
type coulombiennes qui reacuteduit la taille des gouttelettes et augmente leur densiteacute de charge
Cependant selon la theacuteorie dIribarne et Thomson pour des gouttelettes avec un rayon tregraves
petit (de l‟ordre de 10 nm) et une densiteacute de charge tregraves eacuteleveacutee le champ eacutelectrostatique agrave leur
surface serait assez intense pour expulser directement des ions preacuteformeacutes en phase gazeuse
(Fig A 2 (b)) Ce pheacutenomegravene appeleacute eacutevaporation ionique suggegravere que l‟explosion
coulombienne ne constitue pas le meacutecanisme majoritaire pour les petites gouttelettes de rayon
R le 10 nm
Fig A 2 Les deux theacuteories de lrsquoobtention drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de
gouttelettes chargeacutees (a) Modegravele des reacutesidus chargeacutes par Dole (b) Modegravele de lrsquoeacutevaporation
ionique par Iribarne et Thomson
Cependant aujourd‟hui encore aucun de ces deux modegraveles n‟est consideacutereacute comme
applicable agrave l‟ensemble des pheacutenomegravenes observeacutes en eacutelectrospray (9) Le consensus semble
ecirctre l‟existence d‟un effet de taille de l‟analyte les grosses moleacutecules eacutetant plutocirct orienteacutees
vers une formation d‟ions en phase gazeuse par le meacutecanisme de reacutesidus chargeacutes de Dole (10-
12) John B Fenn eacutemet l‟hypothegravese que cette theacuteorie s‟applique aux moleacutecules de haut poids
moleacuteculaire agrave partir du moment ougrave les dimensions lineacuteaires de ces moleacutecules sont
sensiblement plus grandes que la gouttelette qui les contient
Quel que soit le meacutecanisme responsable de la formation des ions en phase gazeuse
leacutelectrospray est aujourdhui une meacutethode dionisation extrecircmement utiliseacutee dans des
domaines varieacutes (biologie chimie pharmaciehellip)
203
A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS)
Parmi les diffeacuterents spectromegravetres de masse commercialiseacutes les instruments FT-ICR et
Orbitrap occupent une place de choix pour l‟eacutetude de proteacuteines entiegraveres par approche laquo top-
down raquo en raison de leurs tregraves grandes performances en termes de reacutesolution et de preacutecision
sur la mesure de masse
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
Notre eacutetude sur les peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen qui est preacutesenteacutee dans le
Chap II de ce manuscrit a eacuteteacute reacutealiseacutee sur un spectromegravetre APEX III de Bruker (Brecircme
Allemagne) eacutequipeacute d‟un aimant supraconducteur de 7 Tesla d‟une cellule ICR de type
Infinity Cell et d‟une source eacutelectrospray Apollo I
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Fig A 3 Scheacutema du FT-ICR APEX III Bruker de la source eacutelectrospray agrave la cellule ICR
Infinity Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Les ions sont formeacutes au niveau de la source ESI puis transfeacutereacutes via un ensemble de
lentilles eacutelectrostatiques au centre de la cellule de pieacutegeage situeacutee au cœur de l‟eacutelectroaimant
supraconducteur (Fig A 3)
Un hexapocircle de stockage est inseacutereacute apregraves le capillaire de transfert de la source eacutelectrospray
et avant le systegraveme de transfert eacutelectrostatique afin dy accumuler les ions avant de les
envoyer dans la cellule ICR Cette derniegravere placeacutee dans un vide pousseacute (10-10
mbar environ)
repreacutesente l‟eacuteleacutement cleacute du spectromegravetre puisqu‟elle va servir d‟analyseur et de deacutetecteur par
la mesure de la freacutequence cyclotron des ions pieacutegeacutes
204
Au cours de cette thegravese notre spectromegravetre a beacuteneacuteficieacute d‟importantes eacutevolutions
instrumentales Ainsi en janvier 2011 nous avons fait l‟acquisition du chariot de la socieacuteteacute
Sanofi-Aventis de Toulouse notre APEX III devenant alors APEX-Q Les principales
diffeacuterences entre les deux instruments sont l‟ajout d‟un quadripocircle et d‟une cellule de
collision et la source d‟ionisation (Apollo I sur lAPEX III et CombiSource premier modegravele
sur l‟APEX-Q) (Fig A 4)
Ion transfer
optics
UV Laser
Lens
Windows
Mirror
Medium pressure
chamber
Movable
hexapole
PPP
MALDI
sample
plate
Second
skimmer
Ion transfer
capillary
ESI
skimmer
Funnel
Electrospray
nebulizer
End
cap
ICR trap
Attenuator Magnet
Mirrors
PP
P
Storage hexapole
Trapextractplate
Collision
gas tube
Pulsed
valve
Collision hexapole
Quadrupole
ESI
Sprayed
sample
Hollow
cathode
IRMPDECD
Fig A 4 Scheacutema du FT-ICR APEX-Q Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity
Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Puis en avril 2012 nous avons reccedilu le nouveau chariot de Bruker le SolariX (Fig A 5) Il
apporte les ameacuteliorations suivantes une combisource nouvelle geacuteneacuteration l‟ajout d‟un
module ETS (possibiliteacutes de CID ou d‟ECDETD) et d‟un hexapocircle pour acheminer les ions
de la cellule de collision agrave la cellule ICR (Fig A 6)
205
Fig A 5 Photographie du FT-ICR SolariX (Bruker)
Fig A 6 Scheacutema du FT-ICR SolariX Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity Cell
(drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Comme il a deacutejagrave eacuteteacute speacutecifieacute dans le Chap III de ce manuscrit nous avons eacutegalement eacuteteacute
ameneacutes agrave travailler sur l‟APEX-Qe d‟Orsay Les diffeacuterences majeures entre l‟APEX III et
l‟APEX-Qe sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
206
A1211 Principe physique
Le principe de la spectromeacutetrie de masse agrave reacutesonance cyclotronique ionique (laquo Ion
Cyclotron Resonance raquo ICR) repose sur le fait qu‟une particule chargeacutee animeacutee dune vitesse
v se deacuteplaccedilant dans un champ magneacutetique uniforme B subit la force de Lorentz (Eq A 1)
BvqF
(Eq A 1)
Cette force conduit la particule chargeacutee agrave adopter une trajectoire heacutelicoiumldale autour d‟un
axe parallegravele agrave celui du champ magneacutetique B (conventionnellement axe z) dont la projection
dans le plan orthogonal (xy) est un mouvement circulaire uniforme (Fig A 7)
Fig A 7 Mouvement cyclotron drsquoun ion dans un champ magneacutetique
Ce mouvement de rotation est appeleacute mouvement cyclotron et en l‟absence de champ
eacutelectrique sa freacutequence νc ne deacutepend que du champ magneacutetique et du rapport masse sur
charge (Eq A 2) On conccediloit degraves lors quune mesure de cette freacutequence de rotation permet
une deacutetermination du rapport mz de lespegravece consideacutereacutee
zm
B
m
Bqc
105356111
2
7
(Eq A 2)
A1212 Pieacutegeage des ions
Jusquici seul le mouvement dans le plan xy a eacuteteacute consideacutereacute En labsence dautres champs
la vitesse suivant laxe z reste constante et la trajectoire reacutesultante est un mouvement
heacutelicoiumldal autour dun axe parallegravele agrave z qui se poursuivra indeacutefiniment Pour construire un
piegravege une possibiliteacute est de fermer le mouvement suivant z par deux plaques de pieacutegeage
207
perpendiculaires agrave laxe z porteacutees agrave un potentiel reacutepulsif Ainsi est neacutee la cellule ICR aussi
appeleacutee piegravege de Penning et le premier modegravele en est la cellule cubique (Fig A 8)
Fig A 8 Cellule cubique simple (13)
Sil eacutetait possible dappliquer un champ eacutelectrique homogegravene parallegravele au champ
magneacutetique avec des plaques de longueurs infinies le mouvement dun ion serait heacutelicoiumldal
avec des oscillations peacuteriodiques suivant laxe z Cette freacutequence d‟oscillations ou freacutequence
de pieacutegeage νt est principalement due aux reacutepulsions successives des deux plaques de
pieacutegeage et peut ecirctre exprimeacutee par (Eq A 3)
2
2
2
1
am
Vq trap
t
(Eq A 3)
ougrave Vtrap potentiel de pieacutegeage a distance entre les deux plaques et α facteur geacuteomeacutetrique
eacutegal agrave 2 dans le cas ideacuteal
Cependant il n‟est pas possible de se situer dans le cas ideacuteal d‟un champ eacutelectrique
homogegravene qui suppose des plaques infinies Le champ eacutelectrique ne peut pas ecirctre exactement
parallegravele au champ magneacutetique et une composante radiale est alors agrave prendre en compte Par
conseacutequent un troisiegraveme mouvement propre au mouvement de deacuteplacement des charges
pieacutegeacutees s‟ajoute aux deux preacuteceacutedents mouvements (cyclotron et pieacutegeage) Ce mouvement dit
mouvement magneacutetron s‟oppose agrave la force de Lorentz et se traduit par un abaissement de la
freacutequence cyclotronique
208
Ce pieacutegeage suppose toutefois que la trajectoire des ions les ait ameneacutes agrave ecirctre confineacutes
dans la cellule Cela peut ecirctre obtenu en produisant des ions in situ (ionisation eacutelectronique
MALDI) mais des difficulteacutes suppleacutementaires sont agrave prendre en compte lorsque les ions sont
formeacutes initialement agrave l‟exteacuterieur de la cellule (cas de l‟ionisation par eacutelectrospray) En effet la
conservation de l‟eacutenergie cineacutetique impose que pour des ions transporteacutes suivant l‟axe z s‟ils
ont suffisamment d‟eacutenergie pour entrer dans la cellule et que le potentiel des plaques ne
change pas ils en ont assez pour ressortir
Le pieacutegeage dynamique est une solution agrave ce problegraveme au lieu dappliquer des tensions
continues sur les plaques de pieacutegeage on va jouer sur des variations de tension pour sassurer
du pieacutegeage des ions On synchronise les tensions sur la plaque de la cellule situeacutee cocircteacute source
avec le deacuteplacement des ions (Fig A 9) Neacuteanmoins cette technique introduit une
discrimination en masse par la diffeacuterence de temps de vol des espegraveces
Fig A 9 Principe du pieacutegeage dynamique des ions
A1213 Obtention des spectres de masse
Une fois les ions pieacutegeacutes la mesure de leur freacutequence cyclotronique n‟est pas possible
directement Bien qu‟ayant une freacutequence de rotation identique tous les ions de mecircme rapport
masse sur charge ne preacutesentent pas un mouvement coheacuterent En effet les ions ont eacuteteacute produits
agrave des temps variables et avec des eacutenergies cineacutetiques diffeacuterentes ce qui se traduit par une
209
phase (position sur l‟orbite) et un rayon variables Afin de pouvoir mesurer les freacutequences
cyclotroniques il est neacutecessaire que ce mouvement global devienne coheacuterent ie que tous les
ions de mecircme rapport masse sur charge se preacutesentent avec la mecircme phase et avec le mecircme
rayon Ce reacutesultat est obtenu par une proceacutedure d‟excitation-deacutetection deacutetailleacutee ci-apregraves
Excitation des ions
Comme cela vient d‟ecirctre dit une fois pieacutegeacutes les ions de mecircme rapport masse sur charge
ont la mecircme freacutequence cyclotronique mais ne forment pas un paquet coheacuterent En effet la
position de leur axe de rotation et la phase de leur mouvement ne sont pas eacutegales De plus le
rayon de leur orbite cyclotronique est trop faible pour induire un quelconque signal sur les
plaques de deacutetection L‟application d‟un pulse de radiofreacutequence sur les plaques d‟excitation agrave
leur freacutequence cyclotron permet de rendre le mouvement des ions coheacuterent et de les conduire
sur une trajectoire de mecircme rayon agrave proximiteacute des plaques de deacutetection En effectuant un
balayage de freacutequence il est possible d‟exciter des populations d‟ions de rapports masse sur
charge diffeacuterents qui adoptent alors une trajectoire circulaire de mecircme rayon avec des
freacutequences de rotation diffeacuterentes Cette eacutetape permet non seulement d‟obtenir des paquets
d‟ions deacutecrivant un mouvement coheacuterent mais aussi de les rapprocher des deux plaques de
deacutetection afin de pouvoir analyser ce mouvement Dans le cas ideacuteal il conviendrait d‟exciter
les ions sur une orbite la plus grande possible afin d‟augmenter le signal et la sensibiliteacute
Cependant ceci n‟est pas applicable puisque la non homogeacuteneacuteiteacute du champ eacutelectrique pregraves
des plaques conduirait agrave l‟eacutejection progressive des ions C‟est la raison pour laquelle il est
usuel de ne pas exciter les ions sur des rayons supeacuterieurs agrave 08 fois le rayon de la cellule
Plusieurs types de champs eacutelectriques sinusoiumldaux peuvent ecirctre appliqueacutes pour exciter les
ions La Fig A 10 preacutesente trois types d‟excitations diffeacuterentes
210
a)
b)
c)
a)
b)
c)
Fig A 10 Types drsquoexcitations usuellement utiliseacutees agrave gauche dans le domaine temporel et agrave
droite dans le domaine des freacutequences (a) sinusoiumlde monofreacutequence tronqueacutee (b) balayage
de freacutequence (chirp) (c) balayage par SWIFT
Le premier type permet l‟excitation des ions agrave une seule freacutequence (Fig A 10 (a))
L‟excitation monofreacutequence n‟est donc pas vraiment utile pour la deacutetection de tous les ions
preacutesents dans la cellule qui est le cas le plus couramment rencontreacute En effet dans ce cas il
faudrait reacutealiser une excitation monofreacutequence pour chacun des ions preacutesents Il est donc
preacutefeacuterable d‟utiliser un mode d‟excitation par balayage de freacutequence (Fig A 10 (b)) qui va
balayer toute la gamme de freacutequences des ions en une seule impulsion Le balayage par
SWIFT (laquo Stored-Waveform Inverse Fourier Transform raquo) (Fig A 10 (c)) permet de calculer
l‟onde d‟excitation agrave partir du domaine des rapports masse sur charge eacutetudieacute Cependant le
SWIFT n‟est employable que sur les instruments eacutequipeacutes d‟un geacuteneacuterateur arbitraire de
freacutequences
Deacutetection du courant induit
La rotation coheacuterente des ions sur une orbite large creacutee un courant induit sur les deux
plaques de deacutetection qui est deacutetectable apregraves amplification par une eacutelectronique adapteacutee Ce
courant est proportionnel agrave la charge totale du paquet d‟ions ayant un mouvement coheacuterent
et ne deacutepend pas de la freacutequence cyclotronique des ions
Forme du signal mesureacute
La collision des ions avec des moleacutecules de gaz reacutesiduelles pendant le temps de mesure
conduit agrave une perte de coheacuterence du paquet d‟ions et donc agrave une perte d‟intensiteacute du signal
211
De ce fait le signal obtenu correspond agrave une sinusoiumlde amortie exponentiellement (Fig A
11) Or la preacutecision en masse est directement lieacutee agrave la preacutecision sur la mesure de la freacutequence
de rotation cyclotron des ions pieacutegeacutes Par conseacutequent une mesure de masse preacutecise neacutecessite
une pression la plus faible possible dans la cellule
Fig A 11 Signal sinusoiumldal amorti exponentiellement (agrave gauche eacutechelle en temps) et le
reacutesultat apregraves transformation de Fourier (agrave droite eacutechelle en freacutequence)
Digitalisation et transformation de Fourier
Comme l‟indique le nom de l‟appareil c‟est la transformeacutee de Fourier (laquo Fourier
Transform raquo FT) qui permet de mesurer en une seule expeacuterience l‟ensemble des freacutequences
de rotation des ions (Fig A 12)
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
Fig A 12 Spectre de masse obtenu apregraves transformeacutee de Fourier du signal
Le courant induit mesureacute sur les plaques de deacutetection correspond agrave un interfeacuterogramme (ou
laquo Free Induction Decay raquo FID) ougrave les sinusoiumldes amorties de l‟ensemble des ions preacutesents
dans la cellule sont additionneacutees les unes aux autres La digitalisation de ce signal suivie
d‟une transformation de Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre
contenant les informations sur les freacutequences (convertibles en rapport masse sur charge via la
relation A 2) et les abondances des ions pieacutegeacutes dans la cellule En additionnant plusieurs
deacutetections successives il est possible d‟ameacuteliorer le rapport signal sur bruit du spectre
transformeacute
212
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse
La particulariteacute de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR qui consiste agrave ramener la mesure des
rapports masse sur charge agrave la mesure d‟une freacutequence lui confegravere ses caracteacuteristiques en
termes de reacutesolution Dans des conditions approprieacutees ie avec un vide tregraves pousseacute dans la
cellule permettant un enregistrement pendant un temps suffisamment long sans perte de
signal il est possible d‟atteindre des reacutesolutions supeacuterieures agrave 106 pour un ion de mz 1000
dans un champ magneacutetique de 7 Tesla En plus du temps d‟enregistrement pour obtenir de la
haute reacutesolution la principale contrainte est le transfert et le stockage d‟interfeacuterogrammes de
grande taille (jusqu‟agrave 8 Mega points) De ce fait la reacutesolution expeacuterimentale utiliseacutee est
freacutequemment de l‟ordre de 60 000 pour minimiser les temps d‟acquisition ainsi que la taille
de stockage
La preacutecision en masse deacutepend principalement de la reacutesolution mais eacutegalement de la charge
d‟espace En effet la preacutesence d‟un tregraves grand nombre d‟ions pieacutegeacutes dans la cellule modifie le
champ eacutelectrique et geacutenegravere une force de reacutepulsion entre les ions Cette force a pour
conseacutequence la deacuteviation de la trajectoire des ions ce qui biaise les mesures de masses Ce
pheacutenomegravene pose le problegraveme eacutevident de la calibration externe En effet pour que l‟eacutetalonnage
externe soit le plus preacutecis possible il faut qu‟il soit effectueacute avec une charge d‟espace
comparable agrave celle de l‟eacutechantillon ce qui est difficilement controcirclable Il est ainsi
recommandeacute de travailler avec de faibles quantiteacutes d‟ions pour limiter au maximum la
deacuteviation due agrave ce pheacutenomegravene Une preacutecision de lordre de quelques ppm est alors obtenue
Cependant l‟eacutetalonnage interne permet de saffranchir de ce problegraveme de charge d‟espace
puisque les ions calibrants sont preacutesents dans la cellule en mecircme temps que les ions de
l‟eacutechantillon et subissent la mecircme charge d‟espace On atteint alors en routine des preacutecisions
en masse de l‟ordre d‟une ppm voire moins
A1222 Sensibiliteacute
Des calculs theacuteoriques ont montreacute que le nombre de charges minimum ayant un
mouvement coheacuterent neacutecessaire pour deacutetecter un signal eacutetait de l‟ordre de 200 Ceci constitue
une limite ultime de la sensibiliteacute de ce type d‟instrument En pratique il faut tenir compte de
213
l‟efficaciteacute de chacune des eacutetapes permettant de passer de l‟analyte neutre aux ions pieacutegeacutes et
exciteacutes dans la cellule Il faut eacutegalement tenir compte des eacutetats de charge et de l‟existence de
massifs isotopiques qui augmentent le nombre de freacutequences sur lesquelles se reacutepartissent les
ions Les sensibiliteacutes records atteintes actuellement sur des peptides de masse 1000 Da sont
de l‟ordre de 10 attomoles consommeacutees en nano-eacutelectrospray Dans un instrument
commercial avec les protocoles standards on peut obtenir un signal exploitable avec environ
10 femtomoles de produit consommeacute
A1223 Gamme dynamique
Un point sur lequel la spectromeacutetrie de masse FT-ICR nest pas particuliegraverement bien
placeacutee est la gamme dynamique qui repreacutesente la capaciteacute agrave discriminer des ions
d‟abondances diffeacuterentes dans un mecircme spectre Le problegraveme est lieacute agrave celui de la charge
d‟espace dans la mesure ougrave les mouvements des ions de faible abondance sont perturbeacutes par
ceux des ions majoritairement preacutesents dans la cellule Il est admis qu‟il est difficile de
mesurer avec une bonne preacutecision la masse d‟un ion dont l‟abondance est infeacuterieure agrave 1 de
celle de l‟ion le plus abondant
A1224 Gamme de masse
La gamme de masse est quant agrave elle en theacuteorie quasiment illimiteacutee La limite de masse
infeacuterieure deacutepend uniquement de l‟eacutelectronique et plus preacuteciseacutement des capaciteacutes du
digitaliseur et du geacuteneacuterateur de freacutequences Pour un aimant de 7 Tesla eacutequipeacute d‟un
digitaliseur agrave 8 MHz cela eacutequivaut agrave une limite infeacuterieure de mz 29 En ce qui concerne la
limite supeacuterieure elle deacutepend de la capaciteacute de la cellule agrave pieacuteger les ions Dans le cas d‟un
aimant de 7 Tesla cette limite est atteinte pour un ion de mz 274 000 Malheureusement des
problegravemes apparaissent avant cette limite notamment agrave cause des limites sur les dureacutees
d‟acquisition de signal Les signaux des masses eacuteleveacutees correspondant agrave de basses freacutequences
se trouvent consideacuterablement eacutelargis (mz 274 000 eacutequivaut agrave mesurer une freacutequence de 393
Hz) De ce fait la limite expeacuterimentale couramment admise se situe agrave mz 27 000 pour un
aimant de 7 Tesla
214
A123 Technologie Orbitrap
L‟Orbitrap est une technologie relativement reacutecente (baseacutee sur le principe d‟un piegravege
orbitalaire eacutelectrostatique) inventeacutee par A Makarov (14) L‟Orbitrap repose sur le pieacutegeage
des ions par un champ eacutelectrostatique quadripolaire qui creacutee l‟oscillation des ions pieacutegeacutes Ces
oscillations proportionnelles au rapport (mz)-12
sont deacutetecteacutees par la mesure du courant
induit et traduites en spectre de masse par la transformeacutee de Fourier (Fig A 13) Il existe
donc de grandes similitudes au niveau de la deacutetection des ions par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR et Orbitrap
Fig A 13 Deacutetection des ions par la technologie Orbitrap Les courants induits correspondent
agrave un interfeacuterogramme qui est la superposition de freacutequences de plusieurs espegraveces Le
traitement du signal qui est reacutealiseacute de la mecircme maniegravere que par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR avec les mecircmes contraintes et limitations suivi eacutegalement drsquoune transformation de
Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre de freacutequence facilement
convertible en spectre de masse
De ce fait les performances de la technologie Orbitrap en termes de reacutesolution (jusque
100 000) et preacutecision sur la mesure de masse (de l‟ordre de 1-2 ppm) rivalisent avec celles de
la spectromeacutetrie de masse FT-ICR De plus la reacutesolution de l‟Orbitrap eacutetant proportionnelle
au rapport (mz)-12
elle diminue moins vite avec l‟augmentation du rapport mz que dans le
cas du FT-ICR Par ailleurs la gamme dynamique de l‟Orbitrap contrairement agrave la
spectromeacutetrie de masse FT-ICR est satisfaisante (gt 3 deacutecades) (15) L‟Orbitrap est
principalement utiliseacutee en spectromeacutetrie de masse en tandem associeacutee agrave un piegravege lineacuteaire
Le scheacutema et la photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher) que
nous avons utiliseacute pour nos expeacuteriences HDX correspondent aux Fig A 14 et Fig A 15
215
L‟instrument est composeacute d‟une source ESI de type laquo Z-spray raquo suivie d‟une optique ionique
de type laquo S-lens raquo permettant de mieux focaliser les ions et d‟ameacuteliorer la sensibiliteacute Une
optique de transfert ionique (quadripocircle octopocircle) performante en termes de stabiliteacute et
efficaciteacute de transmission des ions permet leur acheminement dans une trappe lineacuteaire Dans
cette trappe ionique il est possible de fragmenter les ions par CID ou ETD et de proceacuteder agrave
leur deacutetection Il est eacutegalement possible de les deacutetecter par transformation de Fourier dans
l‟Orbitrap avec une meilleure reacutesolution Dans ce cas les ions sont transfeacutereacutes de la trappe
lineacuteaire agrave la C-trappe via un quadripocircle puis eacutejecteacutes dans l‟analyseur Orbitrap Une cellule de
collision placeacutee agrave proximiteacute de la C-trappe permet eacutegalement de fragmenter les ions par HCD
(laquo High-energy Collisional Dissociation raquo) Les ions sont ensuite analyseacutes dans l‟Orbitrap
Fig A 14 Scheacutema du LTQ-Orbitrap Velos (drsquoapregraves la documentation de Thermo Ficher
Scientific)
Fig A 15 Photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific) de
la plateforme proteacuteomique de lInstitut Jacques-Monod (Paris 7)
216
A13 Fragmentation en phase gazeuse
La spectromeacutetrie de masse en tandem consiste (i) dans une premiegravere eacutetape agrave seacutelectionner
l‟ion d‟inteacuterecirct (appeleacute ion parent ou ion preacutecurseur) et (ii) dans une seconde eacutetape agrave
analyser les ions fragments (ou ions fils) obtenus par la dissociation de l‟ion parent Selon
les instruments utiliseacutes les eacutetapes de seacutelection et d‟analyse des fragments se font soit dans
l‟espace (tQ Q-TOF TOF-TOF) soit dans le temps (IT FT-ICR) soit en combinant des
eacutetapes dans le temps et l‟espace (q-FT-ICR IT-Orbitrap)
Comme les sources d‟ionisation dites douces (ESI MALDI) celles utiliseacutees pour
l‟analyse des biomoleacutecules conduisent agrave des ions avec peu d‟eacutenergie interne il faut induire la
fragmentation par un apport d‟eacutenergie au systegraveme Cet apport d‟eacutenergie peut se faire de
diffeacuterentes faccedilons (16) collision avec un gaz inerte (fragmentation de haute ou basse
eacutenergie) collision avec une surface irradiation par des photons irradiation par des eacutelectrons
(speacutecifique des FT-ICR) reacuteactions ion-moleacutecule ou ion-ion (dont l‟ETD) Le controcircle de
l‟eacutenergie deacuteposeacutee est un paramegravetre important comme nous avons pu le voir dans le Chap I
dans le cadre des eacutetudes HDX il est important de pouvoir controcircler l‟eacutenergie apporteacutee aux
ions pour ne pas conduire agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des hydrogegravenes et deuteacuteriums le
long du squelette polypeptidique
La spectromeacutetrie de masse en tandem permet d‟obtenir des informations de structure de
l‟ion fragmenteacute (qu‟il soit organique ou biologique) et permet dans le cas de meacutelanges
complexes de seacutelectionner speacutecifiquement une espegravece parmi les autres pour obtenir son
spectre de fragmentation
Les deux principaux types de fragmentation utilisables dans le cadre des eacutetudes HDX sont
deacutetailleacutes dans les sous-paragraphes suivants Il s‟agit des meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECDETD) preacutesenteacutees preacuteceacutedemment dans le Chap I
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR
Ce mode de dissociation consiste agrave irradier les ions multichargeacutes par un faisceau
d‟eacutelectrons La recombinaison entre un eacutelectron et l‟ion conduit agrave la formation d‟un cation
radical (Fig A 16) et permet un gain d‟eacutenergie de l‟ordre de quelques eV (2-3 eV) (17) Ce
type de fragmentation est speacutecifique des FT-ICR et a eacuteteacute preacutesenteacute dans le Chap I dans la
217
partie consacreacutee agrave la fragmentation des peptides proteacuteolytiques marqueacutes La grande diffeacuterence
avec la fragmentation CID repose sur la formation initiale d‟un radical cation dont les voies
de fragmentation seront pour des polypeptides tregraves diffeacuterentes de celles du cation Cela se
traduira en particulier par la formation de fragments de type c et z De plus comme vu dans le
Chap II l‟ECD conduit agrave une faible redistribution des deuteacuteriums avant fragmentation ce
que les proposants de meacutecanismes pour l‟ECD ont attribueacute soit agrave une vitesse de fragmentation
rapide ne permettant pas une redistribution initiale de l‟eacutenergie (hypothegravese non-ergodique)
soit plus vraisemblablement agrave une barriegravere de fragmentation suffisamment abaisseacutee pour
rendre la vitesse de rupture des liaisons amide dans le radical cation supeacuterieure agrave celles des
autres voies de fragmentation etou de transferts de protons
e-
[M nH]n+ [M nH](n-1)+bull F1m+ + F2
k+bull
Fig A 16 Capture exothermique drsquoun eacutelectron par une moleacutecule multichargeacutee (positive)
Mode drsquoactivation ECD passe par une voie de fragmentation de type radicalaire
D‟un point de vue technique les eacutelectrons sont formeacutes par une cathode chauffeacutee
indirectement qui a remplaceacute le filament afin d‟obtenir un flux suffisant pour que la capture
d‟eacutelectron soit efficace La fragmentation a lieu dans la cellule ICR ougrave les ions sont pieacutegeacutes agrave
proximiteacute du centre de la cellule Trois paramegravetres influencent l‟efficaciteacute de fragmentation
par ECD (i) le potentiel de la cathode qui controcircle l‟eacutenergie des eacutelectrons mais a eacutegalement
un effet sur le courant d‟eacutelectrons (ii) la tempeacuterature de la cathode et (iii) la dureacutee
d‟irradiation par des eacutelectrons qui controcircle le taux de fragmentation Notons que l‟efficaciteacute
de capture deacutecroicirct rapidement avec l‟eacutenergie des eacutelectrons et qu‟il est important d‟optimiser
au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les recaptures successives
tout en obtenant suffisamment de fragmentations (voir Chap III)
Lors de nos expeacuteriences ECD nous avons utiliseacute une cathode chauffeacutee agrave 16 A pour
l‟APEX III et 18 A pour l‟APEX-Qe avec une irradiation par des eacutelectrons de l‟ordre de
quelques eV d‟eacutenergie cineacutetique (de 09 eV pour l‟ubiquitine agrave 2 eV pour aIF2α3) pendant
quelques dizaines de millisecondes (optimum agrave 10 ms) Nous avons travailleacute sur tous les eacutetats
de charge sans seacutelection
218
A132 Fragmentation par ETD sur lrsquoOrbitrap
L‟ETD est un analogue de l‟ECD Il procegravede par une reacuteaction ion-moleacutecule entre un
radical anion formeacute geacuteneacuteralement dans une source CI neacutegatif et un cation multichargeacute La
difficulteacute est de maximiser le transfert d‟eacutelectron en limitant le transfert de proton Les
reacuteactifs ont eacuteteacute optimiseacutes pour cela et le fluoranthegravene utiliseacute dans ce travail est le reacuteactif
geacuteneacuteralement utiliseacute De plus il est possible via le choix du reacuteactif de controcircler la
thermochimie du transfert d‟eacutelectrons On obtient en ETD une fragmentation similaire agrave celle
en ECD mais pas identique
L‟ETD preacutesente tous les avantages de l‟ECD il ne deacutepend pas de la seacutequence
polypeptidique (nature en acides amineacutes et longueur) il permet de localiser des modifications
post-traductionnelles labiles et il permet d‟obtenir une couverture de seacutequence importante
pour les peptides non tryptiques (issus de la digestion de la proteacuteine agrave la trypsine) pour les
proteacuteines et les peptides hautement basiques La meacutethode ETD comme la technique ECD est
donc particuliegraverement bien adapteacutee aux analyses laquo top-down raquo Par ailleurs contrairement agrave
l‟ECD qui requiert un FT-ICR la fragmentation ETD peut ecirctre reacutealiseacutee dans une trappe
ionique quadripolaire radiofreacutequence voire dans un piegravege hexapolaire qui demandent une
faible maintenance et que l‟on retrouve sur une grande varieacuteteacute d‟instruments moins coucircteux
D‟un point de vue technique le fluoranthegravene est utiliseacute comme reacuteactif pour la
fragmentation ETD reacutealiseacutee agrave l‟aide du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos L‟anion radicalaire
du fluoranthegravene qui constitue donc le reacuteactif ETD est produit par la reacuteaction preacutesenteacutee dans
Fig A 17
Fig A 17 Production du reacuteactif ETD (anion radicalaire) agrave partir du fluoranthegravene
Cette reacuteaction est reacutealiseacutee dans le module ETD (Fig A 18) de l‟instrument qui est donc
constitueacute d‟une source agrave ionisation chimique utilisant
- deux reacuteservoirs indeacutependants de reacuteactifs dont un pour les reacuteactions de type transfert
d‟eacutelectron (ETD) et l‟autre pour les reacuteactions par transfert de proton (PTR)
- une ligne de transfert chauffeacutee
219
- un volume d‟ion chargeacute en eacutelectron par un filament
- une optique de transfert utilisant un quadripocircle pour filtrer le reacuteactif chargeacute en eacutelectron
Il est placeacute agrave proximiteacute de la C-trappe (Fig A 14)
Fig A 18 Module ETD de lrsquoinstrument LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific)
Le reacuteactif ETD est ensuite envoyeacute dans la trappe lineacuteaire ougrave la reacuteaction ionion entre le
peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire aura lieu conduisant agrave la fragmentation de l‟ion
peptidique consideacutereacute La dissociation est reacutealiseacutee sur un eacutetat de charge particulier qui a eacuteteacute au
preacutealable seacutelectionneacute dans la cellule de haute pression de la trappe ionique
Trois temps d‟activation (5 15 et 25 ms) correspondant agrave trois dureacutees pendant lesquelles se
deacuteroule la reacuteaction ETD ont eacuteteacute utiliseacutes conseacutecutivement sur un mecircme eacutetat de charge afin de
maximiser la couverture de seacutequence En effet des profils de fragmentation diffeacuterents sont
obtenus en fonction du temps d‟activation Pour chaque temps d‟activation une minute
environ de fragmentation a eacuteteacute enregistreacutee
L‟option laquo Supplemental Activation raquo a eacutegalement eacuteteacute utiliseacutee Elle permet d‟apporter au
systegraveme une petite quantiteacute d‟activation collisionnelle suppleacutementaire afin de faciliter la
dissociation de l‟ion preacutecurseur En effet il a eacuteteacute montreacute que dans beaucoup de cas le transfert
d‟eacutelectron avait lieu sans que la dissociation soit pour autant effective
220
A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF
Des expeacuteriences de collision avec un gaz inerte (CID) ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur le Q-ToF
Premier (Waters) (Fig A 19) Les diffeacuterents eacutetats de charge des ions multichargeacutes (positifs)
ont eacuteteacute seacutelectionneacutes dans le quadripocircle du spectromegravetre de masse avant d‟ecirctre fragmenteacutes dans
la cellule de collision L‟eacutenergie de collision est le paramegravetre agrave optimiser pour la dissociation
de chaque eacutetat de charge
Fig A 19 Scheacutema du Q-ToF Premier (Waters)
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
A21 Marquage
A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
Les peptides de synthegravese (P1 HHHHHHIIKIIK P2 KKDDDDDDIIKIIK P3
KKDDDIIKIIK P4 KKDDDIIK) ont eacuteteacute acheteacutes chez Genscript Corporation (Piscataway
NJ) Une solution stock agrave 1 mM de chaque peptide a eacuteteacute preacutepareacutee en diluant le peptide
lyophiliseacute dans D2O Afin d‟eacutechanger complegravetement tous les sites eacutechangeables (hydrogegravenes
d‟amide de la liaison peptidique et hydrogegravenes labiles des chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes) la solution est incubeacutee agrave tempeacuterature ambiante pendant au moins 1 heure Le
221
deacutemarquage (seacutelectif du cocircteacute N-terminal) est initieacute en diluant au 1100e la solution stock dans
H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05 M pH 23) MeOH 11 (vv)
A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine
L‟ubiquitine petite proteacuteine modegravele a eacuteteacute utiliseacutee (avec les peptides modegraveles de T
Joslashrgensen) pour eacutetudier le laquo back-exchange raquo Elle a donc eacuteteacute totalement marqueacutee par dilution
de sa poudre lyophiliseacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM et incubation pendant
1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
De la mecircme maniegravere la substance P et le Glu F sont deux peptides qui ont eacuteteacute
ponctuellement utiliseacutes comme sonde de l‟eacutechange inverse Leur poudre lyophiliseacutee a donc
eacuteteacute eacutegalement dilueacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM puis le meacutelange a eacuteteacute
incubeacute pendant 1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ
L‟eacutechange isotopique de la proteacuteine ou du complexe proteacuteique d‟inteacuterecirct sous sa forme
native se fait par incubation dans une solution correspondant agrave son tampon de purification
contenant des deuteacuteriums eacutechangeables Une fois le temps d‟eacutechange souhaiteacute atteint le
marquage doit ecirctre arrecircteacute dans des conditions figeant les deuteacuteriums d‟amide du squelette
polypeptidique sur leur position et en deacutemarquant les autres sites eacutechangeables (hydrogegravenes
labiles des chaicircnes lateacuterales) Pour cela il faut diminuer tregraves rapidement la tempeacuterature du
milieu et repasser en conditions acides et en milieu protoneacute Dans ces conditions seuls les
deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes seront eacutechangeacutes par des hydrogegravenes et les
deuteacuteriums sur la fonction amide de la liaison peptidique conserveront leur localisation
aIF2α3 Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique aIF2α3 agrave 178
microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave une
tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute bloqueacute
lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF 2
222
aIF2α3γ Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique agrave aIF2α3γ agrave
1156 microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave
une tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute
bloqueacute lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF2
A22 Dessalage
Le dessalage se deacuteroulant apregraves les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium il doit obligatoirement
ecirctre effectueacute agrave faible tempeacuterature (dans la glace) et pH afin de minimiser les eacutechanges
inverses Pour cette mecircme raison il est obligatoire d‟utiliser une technique de dessalage
rapide excluant de ce fait bon nombre de systegravemes
Un dessalage laquo off-line raquo a eacuteteacute reacutealiseacute imposeacute par le type d‟approche choisi (approche
laquo top-down raquo) Une Sep-Paktrade C8 (Waters) a eacuteteacute utiliseacutee
Les colonnes sont activeacutees deux fois avec 1 mL ACNMeOHAF 499 499 02 puis
rinceacutees deux fois avec 1 mL H2OAF 1 La colonne conditionneacutee est conserveacutee au
reacutefrigeacuterateur jusqubdquoagrave utilisation L‟eacutechantillon meacutelangeacute agrave eacutegal volume avec H2OAF 2 (eacutetape
d‟arrecirct de la reacuteaction) est chargeacute immeacutediatement sur la colonne Les sels sont eacutelimineacutes par
trois lavages successifs avec 1 mL H2OAF 1 glaceacute
A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse
Le mode d‟ionisation utiliseacute a eacuteteacute l‟eacutelectrospray Les eacutechantillons proteacuteiques ont eacuteteacute
injecteacutes dans le spectromegravetre de masse par le dispositif de seringue refroidie (ou par le
nouveau systegraveme d‟introduction la laquo cryosource raquo que nous avons mis au point et preacutesenteacute
dans Chap V)
Pour cela les proteacuteines dessaleacutees sont finalement eacutelueacutees avec un meacutelange H2OACNAF
49 49 2 (500 microL pour aIF2α3 concentration finale agrave 57 microM et 250 microL pour aIF2α3γ
concentration finale agrave 74 microM) et immeacutediatement analyseacutees par FT-ICR
223
Les peptides seacutelectivement marqueacutes sont analyseacutes dans H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05
M pH 23) MeOH 11 (vv) agrave la concentration finale de 10 microM
Les eacutechantillons totalement marqueacutes (ubiquitine peptides) sont dilueacutes au 1100e dans
H2OACNAF 49 49 2 pour ecirctre analyseacutes en spectromeacutetrie de masse agrave la concentration
finale de 1 microM
224
A3 Bibliographie
1 Fenn J B Mann M Meng C K Wong S F and Whitehouse C M (1989)
Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules Science 246 64-
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2 Dole M Mack L L Hines R L Mobley R C Ferguson L D and Alice M B
(1968) Molecular Beams of Macroions The Journal of Chemical Physics 49 2240-
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Method of Measuring the Electric Intensity at Their Surfaces Physical Review 3 69-
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4 Kebarle P (2000) A brief overview of the present status of the mechanisms involved
in electrospray mass spectrometry J Mass Spectrom 35 804-817
5 Taylor G (1964) Disintegration of Water Drops in an Electric Field Proceedings of
the Royal Society of London Series A Mathematical and Physical Sciences 280 383-
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6 Rayleigh L (1882) XX On the equilibrium of liquid conducting masses charged with
electricity Philosophical Magazine Series 5 14 184-186
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Physics of Fluids 6 404-414
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charged droplets The Journal of Chemical Physics 64 2287-2294
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spectrometry Journal of Mass Spectrometry 35 763-772
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species proceeds via Dole‟s charged residue mechanism Analytica Chimica Acta 406
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droplets produced by electrospray lead to gas phase ions Analytica Chimica Acta 406
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12 Fenn J B (1993) Ion formation from charged droplets roles of geometry energy
and time Journal of the American Society for Mass Spectrometry 4 524-535
13 Marshall A G Hendrickson C L and Jackson G S (1998) Fourier transform ion
cyclotron resonance mass spectrometry a primer Mass Spectrom Rev 17 1-35
14 Makarov A (2000) Electrostatic axially harmonic orbital trapping a high-
performance technique of mass analysis Anal Chem 72 1156-1162
15 Makarov A Denisov E Kholomeev A Balschun W Lange O Strupat K and
Horning S (2006) Performance evaluation of a hybrid linear ion traporbitrap mass
spectrometer Anal Chem 78 2113-2120
16 Sleno L and Volmer D A (2004) Ion activation methods for tandem mass
spectrometry J Mass Spectrom 39 1091-1112
17 Zubarev R A (2003) Reactions of polypeptide ions with electrons in the gas phase
Mass Spectrom Rev 22 57-77
THESE
Preacutesenteacutee pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE LrsquoECOLE POLYTECHNIQUE
Speacutecialiteacute Chimie
Par
Opheacutelie ROBINE
Deacuteveloppement de nouvelles meacutethodologies par spectromeacutetrie
de masse agrave tregraves haute reacutesolution pour lrsquoanalyse structurale de
complexes proteacuteiques
Directrice de thegravese Julia Chamot-Rooke
Soutenue le 28 septembre 2012 devant la commission d‟Examen composeacutee de
M Jean-Michel Camadro Preacutesident
Mme Julia Chamot-Rooke Directrice de thegravese
Mme Emmanuelle Leize Rapporteur
M Christian Rolando Rapporteur
M Guillaume van der Rest Co-directeur de thegravese
i
ii
Le geacutenie crsquoest 1 drsquoinspiration
et 99 de transpiration
Thomas Edison
So mushkil vakt comando sakth
A close friend
iii
Remerciements
Je tiens tout d‟abord agrave remercier Gilles Ohanessian Directeur du laboratoire des
Meacutecanismes Reacuteactionnels de l‟Eacutecole Polytechnique de m‟avoir accueillie au sein de son
Uniteacute de Recherche et de m‟avoir donneacute l‟opportuniteacute de reacutealiser ce travail de thegravese
Ce travail de thegravese a eacuteteacute reacutealiseacute sous la direction de Julia Chamot-Rooke et la co-direction
de Guillaume van der Rest Je vous remercie de votre aide de votre soutien et de vos
encouragements dans les moments plus difficiles qui surviennent au cours d‟une thegravese Un
grand merci agrave tous les deux de m‟avoir accompagneacutee jusqu‟au bout de cette belle aventure
J‟adresse mes plus sincegraveres remerciements agrave Madame Emmanuelle Leize et Monsieur
Christian Rolando d‟avoir accepteacute d‟ecirctre les rapporteurs de ce travail Merci eacutegalement agrave
Monsieur Jean-Michel Camadro d‟avoir participeacute agrave l‟eacutevaluation de ma Thegravese de Doctorat
Je tiens aussi agrave exprimer ma profonde reconnaissance agrave Eacutedith et Christian de m‟avoir
eacutepauleacutee quand j‟en avais besoin dans mes expeacuteriences et de m‟avoir enseigneacute les rouages des
spectromegravetres de masse du laboratoire plus ou moins capricieux Je suis d‟accord avec Eacutedith
bien que Christian ait toujours raison le FT-ICR (sous toutes ses versions) est le meilleur
instrument du monde entier J‟exprime eacutegalement ma gratitude agrave Vincent d‟Orsay et agrave
Thibaut et Manuel de Paris 7 de m‟avoir aideacutee agrave dompter leur machine
Un grand merci agrave Yves Meacutechulam Directeur du laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole
Polytechnique de m‟avoir offert l‟opportuniteacute d‟enseigner au sein de son deacutepartement et de
travailler en collaboration avec son laboratoire Merci aussi agrave Emmanuelle pour ses conseils
Un tregraves grand merci agrave toutes celles et ceux qui ont partageacutes mon bureau et mon amitieacute
pendant ces trois anneacutees de dur labeur Notamment merci agrave Yasmine Jianqing Jana et Jan
J‟adresse eacutegalement mes sincegraveres remerciements agrave Eacutedith et Julien pour vos pauses cafeacute (ou
plutocirct theacute ) que j‟ai beaucoup appreacutecieacutees en cette fin de thegravese et agrave Joe pour tes discussions agrave
n‟en plus finir et ton humour anglais Best of Luck Merci aux anciens Mag Renjiehellip
Merci enfin agrave toutes les personnes que jrsquoai cocirctoyeacutees ou croiseacutees au DCMR pendant ces
trois anneacutees meacutemorables Merci agrave Theacuteregravese Carine Sophie Steph Michel Chris Gilles
Ash P-H Vanessa Tatianahellip Et pour finir je tiens eacutegalement agrave remercier chaleureusement
mes entraineurs de boxe agrave l‟X Merci agrave Reacutemy Fred et Gilou pour votre coaching deacutecoiffant
Un exemple de prochain challenge les JO de Rio de Janeiro en 2016hellip
iv
Je nrsquooublierai pas de remercier eacutegalement
Jean-Baptiste
Je ne te remercierai jamais assez de ta preacutesence agrave mes cocircteacutes depuis maintenant quelques
anneacutees deacutejagrave et de tout ce que tu fais pour moi Notre rencontre remonte au deacutebut de notre vie
eacutetudiante et voici que nous la finissons ensemble J‟espegravere te retrouver tregraves prochainement
pour le commencement d‟une nouvelle vie agrave deux Merci pour ton soutien et ta compliciteacute
Merci de partager mon quotidien et de me remonter le moral quand il est dans les chaussettes
Merci de partager mes joies mes peines Merci de t‟ecirctre inteacuteresseacute agrave mon travail et d‟avoir
chercheacute avec moi des solutions Merci pour tes petits plats mijoteacutes avec amourhellip Un grand
merci pour TOUT ton amour avec un grand A
Mes parents et mes sœurs
Merci de m‟avoir insuffleacute la soif d‟apprendre et la curiositeacute intellectuelle de m‟avoir
donneacute l‟envie et les moyens de faire des eacutetudes Merci de m‟avoir soutenue et encourageacutee
jusqu‟au bout de ma longue formation Merci de vous ecirctre tenus au courant de l‟avanceacutee de
mon travail de recherche Merci pour votre amour votre tendresse et votre reacuteconfort de tous
les jours Merci pour tout Ma reacuteussite est eacutegalement la vocirctre
Ma famille et belle-famille
Merci agrave vous tous pour votre affection et votre bienveillance mais je tiens agrave remercier plus
particuliegraverement ma Mamie d‟ecirctre encore pregraves de moi aujourd‟hui Merci du fond du cœur de
m‟avoir toujours beaucoup aideacutee soutenue encourageacutee reacuteconforteacutee entoureacuteehellip durant toutes
ces anneacutees et encore plus ces trois derniegraveres Merci pour notre cohabitation nos fous rires nos
discussionshellip merci pour tous ces tregraves bons moments que nous avons partageacutes ensemble
Mes amis
Laurence ma sœur siamoise du hand avec laquelle j‟ai lieacute une sincegravere amitieacute il y a six
ans deacutejagrave Merci d‟avoir gardeacute le contact et de m‟avoir soutenue durant ces trois derniegraveres
anneacutees malgreacute les contraintes d‟espace et de temps imposeacutees par la thegravese et la vie active
J‟espegravere que maintenant nous allons nous revoir plus souvent autour d‟une triple Carmeacutelite
Ash my best male friend I met you in DCMR lab two years ago where you were pursuing
a post doctoral research work Thanks a lot for ALL your happiness your support your
helphellip You taught me how to be self-confident I found in you a confidant and a collaborator
Un grand merci agrave vous tous
v
Liste des abreacuteviations
AA acide formique
ACN aceacutetonitrile
AF acide formique
aIF2 facteur d‟initiation 2 chez les archeacutees
ATD distribution des temps d‟arriveacutee
ATP adeacutenosine triphosphate
ARN(mt) acide ribonucleacuteique (messagertransfert)
BN-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en condition bleue native
CI ionisation chimique
CID dissociation induite par collision
DNA acide deacutesoxyribonucleacuteique
DSG DiSuccinimidyl Glutarate
ECD dissociation par capture d‟eacutelectron
EGTA acide eacutethylegravene glycol teacutetraaceacutetique
ESI ionisation par eacutelectroneacutebulisation
ESSI ElectroSonic Spray Ionisation
ETD dissociation par transfert d‟eacutelectron
FID Free Induction Decay
FT-ICR reacutesonance cyclotronique ionique agrave transformeacutee de Fourier
FT-MS spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier
GTP guanosine triphosphate
HDX eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
HDXMS eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium analyseacute par spectromeacutetrie de masse
HIV virus de limmunodeacuteficience humaine
HMQC correacutelation quantique multiple heacuteteacuteronucleacuteaire
HPLC chromatographie en phase liquide agrave haute performance
HSQC correacutelation quantique unique heacuteteacuteronucleacuteaire
vi
IgG immunoglobulines G
IRMPD dissociation multiphotonique infrarouge
ISD In-Source Decay
LC chromatographie en phase liquide
LC-MSMS chromatographie en phase liquide coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse en
tandem
LILBID Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption
m-NBA alcool m-nitrobenzylique
MALDI deacutesorptionionisation au laser assisteacutee par matrice
MPT modification post-traductionnelle
MS spectromeacutetrie de masse
MSMS spectromeacutetrie de masse en tandem
NHS N-HydroxySuccinimide
nOe effet Overhauser nucleacuteaire
Q-ToF quadripocircle-temps de vol
RMN reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire
SAXS diffusion des rayons X aux petits angles
SDS-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en conditions deacutenaturantes contenant
du dodeacutecyl sulfate de sodium
SMI spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique
SORI Sustained Off-Resonance Irradiation
SPR reacutesonance plasmonique de surface
TAP-Tag purification par affiniteacute en tandem
TEV virus de la gravure du tabac
TROSY spectroscopie de relaxation transversale optimiseacutee
UPLC chromatographie en phase liquide ultra haute performance
UV ultraviolet
vii
Table des matiegraveres
Introduction geacuteneacuterale 1
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10 I112 Structure secondaire 12 I113 Structure tertiaire 15 I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19 I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24 I1221 Diffusion aux petits angles 24 I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24 I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26 I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27 I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40 I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42 I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43 I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43 I2133 Catalyse de la reacuteaction 46 I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46 I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et repliement
des proteacuteines 47 I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49
I221 Marquage continu 50 I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51 I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53 I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD 60 I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60 I2332 Approches top-down et HDX 62 I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
viii
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes 108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ 121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD 131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
ix
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166 IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169 IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174 IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175 IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176 IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186 IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
Conclusion geacuteneacuterale 191
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap 214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
x
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
xi
1
Introduction geacuteneacuterale
2
3
Acteurs essentiels de l‟organisation cellulaire et de la reacutegulation du meacutetabolisme les
proteacuteines sont agrave la fois des cibles theacuterapeutiques et des meacutedicaments potentiels Leacutetude de ces
proteacuteines agrave grande eacutechelle appeleacutee analyse proteacuteomique a eacuteteacute rendue possible ces derniegraveres
anneacutees par la mise au point dapproches robustes baseacutees sur des deacuteveloppements importants
en spectromeacutetrie de masse Cependant un simple inventaire de ces proteacuteines ne suffit pas agrave
comprendre les pheacutenomegravenes biologiques complexes qui reacutegissent lactiviteacute cellulaire Ainsi
appreacutehender la maniegravere dont sont organiseacutees ces proteacuteines en complexes multiproteacuteiques est
un des deacutefis actuels de la proteacuteomique Le nombre dinteractions entre proteacuteines au sein d‟une
cellule eacutetant tregraves important linvestigation de ces multiples reacuteseaux proteacuteiques neacutecessite de
nouveaux deacuteveloppements agrave la fois en spectromeacutetrie de masse mais aussi en bioinformatique
pour fournir des meacutethodologies adapteacutees ainsi que des outils puissants pour les analyser
Les interactions entre proteacuteines sont gouverneacutees par leur agencement et repliement dans
l‟espace faisant de la structure tridimensionnelle de ces complexes un eacuteleacutement-cleacute dans
l‟eacutetude et la compreacutehension de la vie de la cellule Les meacutethodes physico-chimiques les plus
couramment utiliseacutees pour ces eacutetudes structurales sont la cristallographie et la spectroscopie
RMN Bien que ces meacutethodes d‟analyse soient les piliers de la biologie structurale actuelle
elles preacutesentent toutefois des limitations majeures la cristallographie des proteacuteines
eacutegalement appeleacutee diffraction des rayons X neacutecessite de pouvoir cristalliser les proteacuteines et la
spectroscopie RMN est limiteacutee agrave des systegravemes de taille modeste Par ailleurs les deux
techniques requiegraverent des quantiteacutes relativement importantes d‟eacutechantillon et ne donnent
quune image statique qui est loin de la reacutealiteacute de la structure des proteacuteines Il est donc
devenu indispensable de deacutevelopper des meacutethodes alternatives permettant de sinteacuteresser agrave la
dynamique de ces systegravemes biologiques tout en travaillant avec des quantiteacutes les plus faibles
possibles d‟eacutechantillon
Dans ce contexte la spectromeacutetrie de masse est devenue ces derniegraveres anneacutees un outil
inteacuteressant pour la biologie structurale La spectromeacutetrie de masse preacutesente l‟avantage de
permettre des eacutetudes sur des proteacuteines non cristallisables d‟ecirctre peu consommatrice en
mateacuteriel et de permettre des analyses rapides sur des systegravemes complexes tant par la diversiteacute
que par la taille Il existe aujourd‟hui trois grandes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de
masse pour eacutetudier l‟organisation structurale d‟un complexe proteacuteique La premiegravere consiste agrave
utiliser des conditions d‟ionisation adapteacutees permettant de maintenir en phase gazeuse des
interactions non covalentes au sein de complexes proteacuteiques La deuxiegraveme approche repose
sur le pontage covalent des proteacuteines en association suivi d‟une digestion enzymatique et
4
analyse par spectromeacutetrie de masse Les agents pontants permettent dobtenir des informations
de topologie du complexe initial en creacuteant des liaisons covalentes entre des acides amineacutes
proches dans la structure tertiaire Une derniegravere technique consiste agrave effectuer un marquage de
la surface accessible du complexe qui peut ecirctre soit permanent par l‟utilisation de reacuteactifs
chimiques particuliers ou par l‟exposition aux radicaux hydroxyles soit labile Dans ce
dernier cas les eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium sont geacuteneacuteralement utiliseacutes La
vitesse deacutechange des hydrogegravenes damide dun squelette polypeptidique deacutepend de
l‟accessibiliteacute au solvant mais eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale Ainsi les
hydrogegravenes d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine telles
que les boucles et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses
d‟eacutechange rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au
contraire ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices
α et les feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent
plus lentement car ils sont proteacutegeacutes La mesure des vitesses deacutechange permet donc de sonder
localement la structure dune proteacuteine ou dun complexe L‟avantage majeur de cette approche
est qu‟elle ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas
toujours le cas avec des marquages covalents De plus elle permet de sinteacuteresser agrave des
complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire En revanche le fait que le marquage soit labile
impose des conditions expeacuterimentales strictes agrave respecter pour eacuteviter le deacutemarquage et
davantage de contraintes au niveau de la rapiditeacute de l‟analyse Malgreacute ces limitations
l‟association des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium et de la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode largement employeacutee pour l‟eacutetude structurale et
dynamique des proteacuteines et complexes proteacuteiques
L‟analyse par spectromeacutetrie de masse des proteacuteines marqueacutees au deuteacuterium est
classiquement reacutealiseacutee par une approche laquo bottom-up raquo Cette derniegravere consiste agrave analyser des
peptides obtenus par digestion enzymatique de la proteacuteine dinteacuterecirct Chaque hydrogegravene
remplaceacute par un deuteacuterium conduit agrave un increacutement en masse de 1 Da facilement deacutetectable par
spectromeacutetrie de masse Pour chaque peptide une cineacutetique d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
peut donc ecirctre obtenue Si cette approche a montreacute tout son inteacuterecirct mecircme pour des systegravemes
tregraves grands l‟inconveacutenient majeur en est la reacutesolution qui est limiteacutee par la taille des peptides
geacuteneacutereacutes (en moyenne 5-10 acides amineacutes) Une alternative qui sest deacuteveloppeacutee ces derniegraveres
anneacutees est celle qui consiste agrave introduire la proteacuteine intacte en phase gazeuse (approche laquo top-
down raquo) et agrave la fragmenter par capture ou transfert dun eacutelectron En effet contrairement aux
approches de fragmentation classiques par CID (laquo Collision Induced Dissociation raquo) qui
conduisent agrave une redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums dans la seacutequence ces approches ECD
5
ou ETD permettent de localiser les deuteacuteriums dans la seacutequence avec une reacutesolution qui peut
ecirctre agrave lacide amineacute
Ce travail de thegravese sinscrit dans cette theacutematique de deacuteveloppement dapproches top-down
apregraves eacutechanges HD pour lanalyse de complexes proteacuteiques Les systegravemes biologiques sur
lesquels nous avons choisi de travailler sont les complexes dinitiation de la traduction et ce
travail est meneacute en collaboration avec le laboratoire de Biochimie de lEacutecole Polytechnique
(E Schmitt et Y Meacutechulam) Il a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de M Duchateau (soutenue en
feacutevrier 2010)
Cette thegravese comporte quatre grands chapitres
Le premier est un chapitre bibliographique Il comprend des geacuteneacuteraliteacutes sur la structure des
proteacuteines les meacutethodes physico-chimiques classiquement utiliseacutees en biologie structurale et
fait eacutegalement le point sur les diffeacuterentes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de masse
permettant dobtenir des informations structurales sur des proteacuteines ou des complexes
proteacuteiques Le principe des eacutechanges HD et leur analyse par spectromeacutetrie de masse incluant
les derniers deacuteveloppements dans le domaine fait lobjet de la fin de ce chapitre
Le chapitre II est consacreacute agrave leacutetude de peptides modegraveles qui peuvent ecirctre seacutelectivement
marqueacutes au deuteacuterium Ces peptides ont eacuteteacute utiliseacutes comme sonde (i) du deacutemarquage (D H)
qui peut avoir lieu agrave diffeacuterents endroits du spectromegravetre de masse et (ii) du reacutearrangement
aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes dans la seacutequence polypeptidique lors dexpeacuteriences
de spectromeacutetrie de masse en tandem Lobjectif de ces eacutetudes eacutetait de mettre au point une
approche robuste par ECD ou ETD pour lanalyse de peptides deuteacutereacutes en vue de lappliquer agrave
des proteacuteines
Dans le chapitre III sont regroupeacutes les reacutesultats obtenus pour lanalyse du complexe aIF2 et
notamment toute la mise au point de lapproche top-down HDX sur une des sous-uniteacutes de ce
complexe Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave la fois en ECD sur diffeacuterents spectromegravetres de masse
FT-ICR et en ETD sur un instrument de type Orbitrap installeacute sur la plateforme proteacuteomique
de Paris Diderot dirigeacutee par J-M Camadro Ce chapitre montre toute la difficulteacute quil peut y
avoir pour rendre lapproche robuste et reproductible notamment pour des eacutechantillons reacuteels
pour lesquels de nouvelles contraintes apparaissent (quantiteacute disponible dessalage
stabiliteacute)
Sur la base des reacutesultats obtenus dans le chapitre III il nous est apparu eacutevident quun
problegraveme majeur de reproductibiliteacute eacutetait lieacute agrave leacutetape dintroduction des eacutechantillons deuteacutereacutes
dans le spectromegravetre de masse Nous avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme
complegravetement diffeacuterent de tout ce qui avait eacuteteacute deacuteveloppeacute jusquagrave preacutesent baseacute sur lutilisation
6
dune enceinte isoleacutee qui peut ecirctre maintenue agrave -30degC La mise au point de ce montage
expeacuterimental que nous avons appeleacute cryosource fait lobjet du quatriegraveme chapitre de ce
manuscrit Les diffeacuterentes modifications ayant conduit agrave la version finale de cette cryosource
les difficulteacutes rencontreacutees et la maniegravere donc nous les avons reacutesolues et les performances que
lon peut atteindre sur des peptides ou des proteacuteines sont deacutecrites dans ce chapitre
Le manuscrit se termine par une conclusion geacuteneacuterale et les perspectives lieacutees agrave ce travail et
une annexe deacutecrivant les mateacuteriels et meacutethodes
7
Chapitre I Introduction
8
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10
I112 Structure secondaire 12
I113 Structure tertiaire 15
I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19
I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24
I1221 Diffusion aux petits angles 24
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24
I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27
I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43
I2133 Catalyse de la reacuteaction 46
I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines 47
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49 I221 Marquage continu 50
I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD60
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60
I2332 Approches top-down et HDX 62
I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
9
I1 Analyse de complexes proteacuteiques
Les proteacuteines sont des composants essentiels de la cellule En effet elles assurent
l‟immense majoriteacute des fonctions cellulaires responsables de la vie Les proteacuteines sont
responsables de la catalyse enzymatique du transport des moleacutecules de la deacutefense de l‟hocircte
de la conversion eacutenergeacutetique ainsi que de beaucoup d‟autres processus cellulaires essentiels
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules biologiques de haut poids moleacuteculaire qui
comportent diffeacuterents niveaux de structuration allant de leur seacutequence en acides amineacutes agrave leur
structure tridimensionnelle au sein de complexes proteacuteiques La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine est intimement lieacutee agrave sa fonction Toute l‟information requise pour qu‟une
proteacuteine adopte une conformation native particuliegravere est contenue dans sa seacutequence en acides
amineacutes (1) Les multiples conformations que sont capables d‟adopter les proteacuteines leur
permettent de remplir la varieacuteteacute de tacircches qui leur incombent mais en font des systegravemes
complexes agrave analyser
Cependant aussi puissantes que les proteacuteines puissent ecirctre individuellement leur veacuteritable
pouvoir et leur complexiteacute deacutecoulent des interactions qu‟elles entretiennent avec d‟autres
moleacutecules Beaucoup d‟entre elles ne remplissent leur fonction que si elles sont lieacutees agrave des
ligands tels que des ions meacutetalliques des groupes prostheacutetiques ou agrave d‟autres proteacuteines (2) En
effet un grand nombre de pheacutenomegravenes biologiques implique l‟activiteacute de plusieurs proteacuteines
agrave travers la formation de complexes multi-proteacuteiques Ainsi la compreacutehension des processus
cellulaires au niveau atomique passe par la deacutetermination de la structure tridimensionnelle de
ces complexes
I11 Structure des proteacuteines
L‟analyse de la structure tridimensionnelle revient agrave deacutecrire la position relative des
diffeacuterents atomes constituant une proteacuteine donneacutee De la seacutequence de la proteacuteine agrave la
formation de complexes oligomeacuteriques il existe quatre niveaux de structuration de la
proteacuteine
10
I111 Structure primaire
Les proteacuteines sont des assemblages d‟acides amineacutes (nombre supeacuterieur agrave 50) lieacutes entre eux
par des liaisons peptidiques Il existe vingt acides amineacutes naturels reacutepondant tous agrave la mecircme
structure geacuteneacuterale (Fig I 1) Ce sont des moleacutecules organiques formeacutees d‟un atome de
carbone central (alpha) auquel sont lieacutes un atome d‟hydrogegravene un radical R appeleacute aussi
chaicircne lateacuterale (R repreacutesente un groupement fonctionnel et correspond agrave la portion variable
d‟un acide amineacute agrave l‟autre) ainsi que deux groupements terminaux conserveacutes une amine et un
acide carboxylique
Fig I 1 Structure geacuteneacuterale des acides amineacutes Agrave pH physiologique les groupements
terminaux -NH2 et -COOH sont retrouveacutes respectivement sous la forme -NH3+ et -COO
-
Les acides amineacutes peuvent ecirctre distingueacutes suivant les proprieacuteteacutes physico-chimiques de leur
chaicircne lateacuterale (Fig I 2) Un premier groupe est formeacute par les acides amineacutes preacutesentant des
chaicircnes lateacuterales aliphatiques tels que la glycine (Gly G)1 l‟alanine (Ala A) la valine (Val
V) la leucine (Leu L) l‟isoleucine (Ile I) et la proline (Pro P) Ces acides amineacutes sont
apolaires On peut classer dans une seconde cateacutegorie ceux qui sont aromatiques
pheacutenylalanine (Phe F) tyrosine (Tyr Y) et tryptophane (Trp W) On distingue eacutegalement les
acides amineacutes basiques (lysine [Lys K] arginine [Arg R] histidine [His H]) et acides (acide
aspartique [Asp D] acide glutamique [Glu E]) L‟asparagine (Asn N) et la glutamine [Gln
Q] sont deux acides amineacutes polaires non ionisables Les deux derniers groupes sont constitueacutes
des acides amineacutes hydroxyleacutes (seacuterine [Ser S] threacuteonine [Thr R]) et ceux qui contiennent du
soufre (cysteacuteine [Cys C] meacutethionine [Met M]) Chacun des vingt acides amineacutes possegravede
donc une chaicircne lateacuterale avec une fonction chimique qui lui est propre L‟existence
simultaneacutee d‟une grande diversiteacute de fonctions chimiques est en partie agrave l‟origine de la
1 Les abreacuteviations entre parenthegraveses correspondent agrave la nomenclature en trois lettres et en une lettre des acides
amineacutes Elles seront utiliseacutees dans la suite de ce manuscrit
11
multitude de fonctions biochimiques que peuvent remplir les proteacuteines dans le monde du
vivant
Fig I 2 Tableau des vingt acides amineacutes naturels Ils peuvent ecirctre apolaires (hydrophobes) et
dans ce cas ils sont retrouveacutes le plus souvent au cœur des proteacuteines ou au contraire polaires
(hydrophiles) et localiseacutes geacuteneacuteralement agrave leur surface Parmi ces derniers certains sont acides
dautre basiques dautres encore sont neutres
Les acides amineacutes peuvent se lier entre eux de maniegravere covalente par la formation d‟une
liaison amide appeleacutee aussi liaison peptidique Elle s‟eacutetablit entre le groupement acide (-
COOH) dun acide amineacute et le groupement amine (-NH2) d‟un autre et permet la formation
12
d‟un dipeptide Au cours de la reacuteaction de condensation une moleacutecule deau est eacutelimineacutee Les
polymegraveres comprenant un plus grand nombre d‟acides amineacutes (de 10 agrave 100) sont nommeacutes
polypeptides Ces derniers servent dans la synthegravese des proteacuteines qui sont de longues chaicircnes
polypeptidiques
La structure primaire d‟une proteacuteine est donneacutee par la seacutequence lineacuteaire des acides amineacutes
la constituant Elle est orienteacutee Le premier acide amineacute de la seacutequence est par convention
celui qui possegravede une extreacutemiteacute amine libre on parle dextreacutemiteacute N-terminale De maniegravere
symeacutetrique le dernier acide amineacute est celui qui possegravede une extreacutemiteacute carboxyle libre on
parle d‟extreacutemiteacute C-terminale Cette convention correspond eacutegalement agrave l‟ordre de la synthegravese
de la proteacuteine par les ribosomes Par exemple la description AGSLK correspond agrave
l‟enchaicircnement des acides amineacutes alanine-glycine-seacuterine-leucine-lysine
Cependant une proteacuteine ne peut ecirctre simplement deacutecrite par une structure primaire
lineacuteaire En effet ses proprieacuteteacutes deacutecoulent eacutegalement de sa capaciteacute agrave former des structures
plus eacutelaboreacutees
I112 Structure secondaire
La structure secondaire d‟une proteacuteine correspond au repliement local de sa chaicircne
principale2 Il s‟eacutetablit alors des liaisons hydrogegravenes entre des acides amineacutes qui sont
relativement proches dans sa seacutequence primaire donnant naissance agrave des motifs structuraux
particuliers Lexistence de structures secondaires est due au fait que les repliements
eacutenergeacutetiquement favorables de la chaicircne peptidique sont en nombres limiteacutes et que seules
certaines conformations sont possibles Ainsi une proteacuteine se deacutecrit par sa seacutequence dacides
amineacutes mais aussi par l‟enchaicircnement de ses eacuteleacutements de structure secondaire
En d‟autres termes certaines conformations se trouvent nettement favoriseacutees car
particuliegraverement stabiliseacutees par des liaisons hydrogegravene entre les groupements amide (-NH) et
carbonyle (CO) du squelette peptidique Il existe trois principaux types de structures
secondaires selon le repliement des liaisons peptidiques et l‟eacutetablissement de ponts hydrogegravene
entre les acides amineacutes les heacutelices les feuillets et les coudes
2 La chaicircne principale dune proteacuteine correspond aux atomes impliqueacutes dans la structure de base du polypeptide
(-NH-CαH-CO-) Les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (souvent noteacutees -R) nappartiennent donc pas au
squelette carboneacute
13
L‟heacutelice est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine adopte
un repliement heacutelicoiumldal peacuteriodique L‟heacutelice est dite laquo droite raquo quand elle tourne dans le sens
horaire Il s‟agit du cas rencontreacute le plus freacutequent A linverse lorsquune heacutelice tourne dans le
sens anti-horaire elle est dite laquo gauche raquo Lheacutelice droite de type alpha est un motif structural
tregraves retrouveacute au sein des proteacuteines (Fig I 3) L‟heacutelice α est une structure tregraves stable
caracteacuteriseacutee par la formation de liaisons hydrogegravene entre le groupement carbonyle dun reacutesidu
n et le groupement amide dun reacutesidu n+4 Un tour dheacutelice α moyen est constitueacute de 36
acides amineacutes Dans une heacutelice α les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes sont localiseacutees en
peacuteripheacuterie de lheacutelice et pointent vers lexteacuterieur perpendiculairement agrave l‟axe de la spirale La
structure compacte eacutenergeacutetiquement favorable de lheacutelice α a eacuteteacute preacutedite par Linus Pauling et
Robert Corey en 1951 (3) agrave partir de calculs theacuteoriques Elle a ensuite eacuteteacute observeacutee pour la
premiegravere fois en 1958 dans la myoglobine en huit exemplaires impliquant environ 75 des
acides amineacutes de la proteacuteine La structure tridimensionnelle de cette derniegravere fut la premiegravere
eacutelucideacutee par cristallographie des proteacuteines (4)
Fig I 3 Scheacutema de l‟heacutelice droite de type α tregraves reacutepandue dans le repliement des proteacuteines
Le pas de l‟heacutelice est de 54 Aring (5)
Le feuillet becircta est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine
adopte un repliement eacutetendu peacuteriodique Le feuillet β est composeacute de plusieurs brins β qui
eacutetablissent des liaisons hydrogegravene entre eux afin de stabiliser la structure De ce fait les ponts
hydrogegravenes qui le stabilisent se font entre reacutesidus distants plutocirct quentre reacutesidus conseacutecutifs
comme c‟est le cas dans une heacutelice α Dans un feuillet β les chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes sont situeacutees alternativement en dessus et en dessous du plan du feuillet Le repliement
β est favoriseacute par des acides amineacutes portant des petits groupements lateacuteraux laquoRraquo non chargeacutes
De la mecircme maniegravere que pour la structure de lheacutelice α la structure du feuillet β a eacuteteacute preacutedite
14
par Pauling et Corey en 1951 (6) Les feuillets β sont repreacutesenteacutes par des flegraveches (Fig I 4)
correspondant aux chaicircnes polypeptidiques qui les constituent Ces derniegraveres sont plisseacutees et
peuvent ecirctre aligneacutees de maniegravere parallegravele et dans ce cas elles ont la mecircme orientation ou de
maniegravere antiparallegravele avec des orientations opposeacutees Le sens est deacutetermineacute par la polariteacute des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes Lorsque deux brins β sorganisent de maniegravere
antiparallegravele les groupements -NH et -CO dun reacutesidu i du premier brin forment des liaisons
hydrogegravene avec les groupements -CO et -NH dun reacutesidu j appartenant au second
Typiquement deux brins β conseacutecutifs relieacutes par un coude forment un feuillet β antiparallegravele
Lorsque deux brins β sont orienteacutes dans le mecircme sens ils s‟organisent en un feuillet parallegravele
Les groupements -NH et -CO dun reacutesidu dun brin A forment alors des liaisons hydrogegravene
avec les groupements -CO dun premier reacutesidu et -NH d‟un second reacutesidu appartenant tous les
deux agrave un brin B Le feuillet β antiparallegravele est plus stable que le feuillet parallegravele car les ponts
hydrogegravene sont dans un alignement parfait
Fig I 4 Scheacutema du feuillet β anti-parallegravele qui est la juxtaposition de brins β ayant des
orientations opposeacutees (5)
Les coudes ne sont pas des structures reacuteguliegraveres et peacuteriodiques Il sagit plutocirct dun
repliement particulier de la chaicircne principale localiseacute sur trois ou quatre reacutesidus conseacutecutifs
Les coudes permettent bien souvent de relier deux structures secondaires peacuteriodiques telles
que les heacutelices etou les brins
15
Les heacutelices α les feuillets β et les coudes ne sont pas les seuls motifs structuraux
secondaires mais sont ceux qui sont le plus freacutequemment rencontreacutes Il existe une grande
varieacuteteacute de motifs moins courants qui ne seront pas deacutetailleacutes dans ce manuscrit
I113 Structure tertiaire
La structure tertiaire d‟une proteacuteine correspond agrave sa structure tridimensionnelle
d‟ensemble Il s‟agit de la structure finale adopteacutee par une proteacuteine apregraves le repliement dans
l‟espace des heacutelices α feuillets β et autres eacuteleacutements de la structure secondaire
Bien que la plupart des proteacuteines neacuteosyntheacutetiseacutees aient la capaciteacute de se replier
correctement certaines en sont incapables sans l‟intervention de proteacuteines dicirctes chaperonnes
Une proteacuteine chaperonne est donc une proteacuteine particuliegravere dont une des fonctions est
dassister dautres proteacuteines dans leur maturation en leur assurant un repliement
tridimensionnel adeacutequat Le repliement dans l‟espace des chaicircnes polypeptidiques est un
processus co-traductionnel (7) Les proteacuteines chaperonnes ont eacuteteacute co-deacutecouvertes en 1989 par
Arthur L Horwich et Franz-Ulrich Hartl (8-9)
La structure tertiaire donne une forme particuliegravere agrave la proteacuteine la rendant ainsi
fonctionnelle Pour cela elle faccedilonne la surface des proteacuteines de maniegravere complexe leur
permettant d‟interagir speacutecifiquement avec des ligands ou d‟autres macromoleacutecules comme
des proteacuteines partenaires (10) La structure tridimensionnelle est thermodynamiquement
stable dans un domaine restreint de tempeacuterature pH et force ionique Au-delagrave de ce domaine
une proteacuteine peut se deacuteplier et perdre son activiteacute biologique on dit alors qu‟elle est
deacutenatureacutee A l‟inteacuterieur des cellules ce sont les proteacuteines chaperonnes qui interviennent Elles
preacuteviennent les dommages potentiels causeacutes par de telles variations des conditions physico-
chimiques et regraveglent la perte de fonction due au mauvais repliement tridimensionnel pouvant
conduire agrave une varieacuteteacute de pathologies telles que la maladie d‟Alzheimer ou les maladies agrave
prion (11) L‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines est donc un eacuteleacutement cleacute
dans la compreacutehension de leurs fonctions biochimiques Son importance est aussi retrouveacutee
dans l‟industrie biopharmaceutique notamment dans le controcircle de la conception de proteacuteines
pharmaceutiques Il faut noter par ailleurs que la structure tridimensionnelle d‟une proteacuteine
en solution n‟est pas totalement rigide mais dynamique (12-13) En effet la chaicircne
polypeptidique subit des mouvements thermiques et est susceptible de se deacuteformer lors
16
d‟interactions avec d‟autres moleacutecules Ces fluctuations de conformations sont souvent
consideacutereacutees comme une condition preacutealable agrave la fonction biologique (14-15)
Cette organisation structurale dans l‟espace est obtenue et rendue possible gracircce agrave
diffeacuterents types dinteractions qui la stabilisent Ces interactions plus ou moins fortes sont
eacutetablies entre les radicaux de diffeacuterents acides amineacutes geacuteneacuteralement eacuteloigneacutes dans la structure
primaire La chaicircne principale de la proteacuteine aura donc tendance agrave se replier sur elle-mecircme
pour adopter une structure tridimensionnelle preacutecise Parmi les interactions les plus notables
sont retrouveacutees les interactions covalentes non covalentes ainsi que les interactions
hydrophobes
Les interactions covalentes eacutetablissent des liaisons fortes entre deux acides amineacutes qui
peuvent ecirctre tregraves proches dans la structure tertiaire mais tregraves eacuteloigneacutes dans la structure
primaire de la proteacuteine De ce fait la formation de cette liaison conduit agrave une stabilisation
accrue de la structure tertiaire Dans le cas des proteacuteines il s‟agit principalement de la
creacuteation d‟un pont disulfure par une reacuteaction d‟oxydation se deacuteroulant entre les fonctions
thiols de deux cysteacuteines Les interactions non covalentes regroupent quant agrave elles les liaisons
eacutelectrostatiques les liaisons hydrogegravene et les liaisons de van der Waals Elles se distinguent
par leur geacuteomeacutetrie leur longueur et leur speacutecificiteacute Elles sont affecteacutees de diffeacuterentes faccedilons
par la preacutesence d‟eau
Les liaisons eacutelectrostatiques peuvent s‟eacutetablir entre deux groupements portant une charge
nette positive ou neacutegative Cette interaction peut conduire agrave un effet reacutepulsif (charges de signe
identique) ou attractif (charges opposeacutees) Une interaction entre deux groupes de charge
opposeacutee est eacutegalement appeleacutee liaison ionique liaison saline pont salin ou paire d‟ions Il
s‟agit de l‟interaction la plus forte parmi les interactions non covalentes Elle est plus forte
dans le vide et plus faible dans un milieu tel que l‟eau
Les liaisons hydrogegravene peuvent ecirctre formeacutees aussi bien entre des moleacutecules non chargeacutees
que des moleacutecules chargeacutees Elle correspond agrave une liaison entre deux atomes eacutelectroneacutegatifs
assureacutee par un atome d‟hydrogegravene partageacute entre les deux L‟atome auquel l‟hydrogegravene est le
plus fermement lieacute est le donneur d‟hydrogegravene tandis que l‟autre est l‟accepteur d‟hydrogegravene
Avec des eacutenergies de liaison de l‟ordre de 3 agrave 7 kcalmol les liaisons hydrogegravene sont plus
fortes que celles de van der Waals Les liaisons hydrogegravene sont directionnelles Les plus
fortes sont celles dans lesquelles le donneur l‟hydrogegravene et l‟accepteur sont colineacuteaires
17
Les liaisons de van der Waals force attractive non speacutecifique entrent en jeu lorsque deux
atomes sont distants de 3 agrave 4 Aring Elle est due au fait que la distribution de la charge
eacutelectronique autour d‟un atome varie dans le temps A un instant donneacute la distribution de la
charge n‟est pas parfaitement symeacutetrique Cette asymeacutetrie transitoire de la charge eacutelectronique
autour d‟un atome induit une asymeacutetrie semblable dans la distribution eacutelectronique des
atomes voisins non lieacutes Ceci conduit donc agrave des interactions de type dipocircle-dipocircle induit
L‟eacutenergie des interactions de van der Waals est faible avec une eacutenergie de stabilisation de
l‟ordre de 06 kcalmol Comme pour les liaisons hydrogegravene le nombre de ces interactions au
sein d‟une proteacuteine peut ecirctre tregraves eacuteleveacute La somme de l‟eacutenergie mise en jeu est alors
substantielle A titre d‟exemple dans le cytochrome C de cheval et dans la myoglobine de
cachalot les interactions de van der Waals agrave l‟inteacuterieur de la proteacuteine contribuent pour
l‟essentiel agrave la stabiliteacute de la structure
Dans une solution aqueuse une moleacutecule apolaire tend agrave interagir avec d‟autres moleacutecules
apolaires plutocirct que de s‟entourer de moleacutecules d‟eau On nomme cette proprieacuteteacute
hydrophobiciteacute et cela conduit agrave des interactions entre moleacutecules qu‟on appelle des
interactions hydrophobes Ces derniegraveres engendrent dans le cas des proteacuteines un
regroupement des reacutesidus apolaires geacuteneacuteralement vers le centre formant un cœur hydrophobe
ou encore au niveau d‟autres reacutegions hydrophobes de la cellule comme dans les membranes
lipidiques Les interactions hydrophobes constituent une force essentielle dans le repliement
des proteacuteines
I114 Structure quaternaire
La structure quaternaire d‟une proteacuteine est donneacutee par l‟association des diffeacuterentes chaicircnes
polypeptidiques la constituant Elles peuvent ecirctre identiques ou diffeacuterentes et sont relieacutees par
des liaisons non covalentes (liaisons hydrogegravene liaisons ioniques interactions hydrophobes)
et plus rarement par des ponts disulfures Leffet hydrophobe est un facteur preacutepondeacuterant dans
lassemblage des eacuteleacutements structuraux y compris dans lassociation des chaicircnes Chacune de
ces chaicircnes est appeleacutee monomegravere (ou sous uniteacute) et lensemble oligomegravere ou proteacuteine
multimeacuterique
18
Seulement certaines proteacuteines preacutesentent une telle organisation Lheacutemoglobine est un
exemple de proteacuteine posseacutedant une structure quaternaire Elle est constitueacutee de quatre sous-
uniteacutes deux sous-uniteacutes α (de 141 acides amineacutes) et deux sous-uniteacutes β (de 146 acides
amineacutes)
Ces assemblages polypeptidiques peuvent ecirctre parfaitement bien deacutefinis mais certains
peuvent former des complexes multiproteacuteiques uniquement transitoires tout en eacutetant
fonctionnellement importants En effet dans l‟environnement cellulaire les proteacuteines sont
rarement isoleacutees et les interactions qu‟elles peuvent creacuteer avec d‟autres partenaires sont
essentielles agrave leur fonction Dans d‟autres cas comme dans les macroassemblages amyloiumldes
la formation d‟un complexe entre des proteacuteines peut conduire agrave la formation d‟assemblages
potentiellement pathogegravenes (16) L‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
macroassemblages est donc primordiale agrave la compreacutehension de leur fonctionnement et
dysfonctionnement
~
Nous venons de mettre en eacutevidence l‟importance de l‟eacutetude structurale des proteacuteines ainsi
que sa complexiteacute qui en font un veacuteritable deacutefi analytique La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine donneacutee n‟est pas neacutecessairement unique elle peut fluctuer temporellement ou
deacutependre des autres moleacutecules (proteacuteines ou ligands) avec lesquelles la proteacuteine interagit dans
l‟environnement cellulaire Il existe un grand nombre de techniques physico-chimiques
biophysiques ou biochimiques permettant d‟obtenir des informations structurales sur des
proteacuteines et des complexes proteacuteiques Les approches les plus couramment employeacutees pour
identifier et caracteacuteriser des interactions proteacuteine-proteacuteine combinent des meacutethodes
biochimiques et biophysiques
Parmi ces techniques deux meacutethodes physico-chimiques sont couramment utiliseacutees pour
l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines Il s‟agit de la cristallographie et de la
reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire (RMN) En ce qui concerne l‟analyse des complexes
proteacuteiques qui sont geacuteneacuteralement des eacutedifices macromoleacuteculaires bien plus importants ces
derniegraveres anneacutees ont vu le deacuteveloppement de meacutethodes alternatives telles que la cryo-
microscopie eacutelectronique la diffraction de rayons X ou de neutrons aux petits angles ou
encore diffeacuterentes techniques baseacutees sur l‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse Il est aussi
possible d‟aborder la composition des complexes proteacuteiques par des meacutethodes biochimiques
parmi lesquelles le TAP-Tag et le double hybride occupent une place de choix
19
Les paragraphes suivants seront consacreacutes agrave une description des grandes meacutethodes
d‟analyse physico-chimique et biochimique utilisables pour appreacutehender la structure des
proteacuteines mais surtout celle des complexes proteacuteiques
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique
I121 Meacutethodes classiques pour lrsquoeacutetude de la structure tridimensionnelle des
proteacuteines
I1211 Cristallographie des proteacuteines
La cristallographie est la science qui eacutetudie les systegravemes cristallins agrave leacutechelle atomique
Les macromoleacutecules dont font partie les proteacuteines sont geacuteneacuteralement trop petites pour ecirctre
observeacutees directement par microscopie optique En effet leur taille nest pas suffisante pour
diffracter la lumiegravere dans les longueurs d‟onde du domaine visible du spectre
eacutelectromagneacutetique En revanche les distances interatomiques au sein des proteacuteines (environ
15 Aring) sont du mecircme ordre de grandeur que la longueur d‟onde des rayons X Par conseacutequent
la diffraction des rayons X par les atomes d‟une proteacuteine peut quant agrave elle ecirctre envisageacutee
Dans un cristal reacutegulier les proteacuteines forment un arrangement peacuteriodique suivant des axes de
l‟espace tridimensionnel de mailles eacuteleacutementaires deacutefinies comme eacutetant le plus petit eacuteleacutement
repreacutesentant le cristal entier Des translations suivant les axes d‟une maille eacuteleacutementaire
permettent de reconstituer l‟ensemble du cristal
Chaque atome d‟une proteacuteine a donc exactement la mecircme position dans toutes les mailles
Le cristal est ainsi composeacute de plans d‟atomes Ces plans d‟atomes ou plutocirct les nuages
d‟eacutelectrons correspondants produisent un motif de diffraction lors de l‟irradiation du cristal
aux rayons X (17) Le motif de diffraction contient les informations sur la position de tous les
atomes de la maille Par conseacutequent il est possible par l‟analyse de ce motif de calculer les
angles de diffraction ainsi que les distances interatomiques pour reconstituer la structure
moleacuteculaire
La haute reacutesolution reste le principal avantage de cette technique Malgreacute des donneacutees
relativement complexes agrave analyser la diffraction des rayons X donne des informations tregraves
preacutecises sur la structure moleacuteculaire des proteacuteines souvent agrave une reacutesolution atomique
20
infeacuterieure ou eacutegale agrave 12 Aring (18) A des reacutesolutions encore plus eacuteleveacutees ie infeacuterieures ou
eacutegales agrave 08 Aring les atomes d‟hydrogegravene deviennent visibles et les atomes ne peuvent plus ecirctre
consideacutereacutes comme des sphegraveres en raison de la deacuteformation des nuages eacutelectroniques Une telle
visualisation des eacutelectrons permet de deacuteterminer la distribution des charges et la polarisation
des liaisons (19) Une image tregraves deacutetailleacutee de la structure de la proteacuteine est alors obtenue
Toutefois la technique preacutesente des limites La principale difficulteacute lieacutee agrave la meacutethode reste
l‟obtention de cristaux avec des tailles suffisantes Il est indispensable de disposer de
plusieurs cristaux identiques car ils sont souvent deacutegradeacutes en preacutesence des rayons X (par
chauffage ou par des radicaux libres) Pour faire pousser des cristaux il est neacutecessaire de
produire une proteacuteine extrecircmement pure Il est eacutegalement indispensable d‟exprimer des
quantiteacutes importantes de proteacuteine afin de trouver les conditions optimales de cristallisation
Ces derniegraveres eacutetant proteacuteines deacutependantes il est impeacuteratif d‟en tester un grand nombre Les
cristaux peuvent se former rapidement ou au contraire apparaicirctre apregraves un temps
consideacuterablement long Parfois mecircme il est malheureusement impossible d‟en obtenir Les
chaicircnes polypeptidiques partiellement replieacutees telles que le prion sont un exemple probant de
proteacuteines difficilement cristallisables (20) De plus si des cristaux sont finalement obtenus
alors les segments peptidiques qui sont non structureacutes en solution apparaicirctront soit ordonneacutes
par des liaisons intermoleacuteculaires au sein du systegraveme cristallin ou n‟apparaicirctront pas Par
conseacutequent il est important de deacutevelopper une meacutethode alternative permettant d‟eacutetudier la
structure de proteacuteines partiellement replieacutees ou mecircme deacutesordonneacutees
Par deacutefinition l‟eacutetude cristallographique est baseacutee sur des structures statiques (les cristaux)
de l‟eacutetat le plus stable Il est donc peu probable que cette technique renseigne sur la
dynamique des moleacutecules Si la proteacuteine cristalliseacutee preacutesente une dynamique sans mouvement
agrave grande eacutechelle alors des eacuteveacutenements dynamiques peuvent ecirctre caracteacuteriseacutes En revanche les
mouvements agrave grande eacutechelle sont quasiment toujours bloqueacutes dans le cristal D‟importants
deacuteveloppements technologiques ont eacuteteacute apporteacutes agrave la technique pour ameacuteliorer l‟observation
de la dynamique agrave courte eacutechelle Il s‟agit de la cryo-cristallographie (21-23) ou des meacutethodes
de cristallographie en temps reacutesolu (24-26)
L‟avegravenement du synchrotron a consideacuterablement acceacuteleacutereacute la vitesse d‟acquisition des
donneacutees En effet celle-ci a eacuteteacute reacuteduite de quelques semaines agrave quelques heures gracircce agrave la
production d‟un rayonnement X intense stable de longueur d‟onde variable et de grande
21
qualiteacute optique Actuellement la plupart des donneacutees de cristallographie sont collecteacutees agrave
partir d‟un synchrotron
La diffraction des rayons X est eacutegalement un outil de choix pour l‟eacutetude de complexes
proteacuteiques permettant d‟obtenir des informations structurales de tregraves grande qualiteacute mecircme
pour des systegravemes tregraves complexes (27) ou membranaires (28-29)
I1212 Spectroscopie RMN
La spectroscopie RMN est eacutegalement devenue une meacutethode performante pour l‟eacutetude de la
conformation des proteacuteines Deacuteveloppeacutee en 1945 elle n‟a cesseacute d‟ecirctre ameacutelioreacutee depuis sa
mise au point En raison de l‟impact scientifique exceptionnel qu‟elle a eu au fil des anneacutees
elle a eacuteteacute reacutecompenseacutee par quatre prix Nobel Le dernier en date (2002) a eacuteteacute deacutecerneacute au
Professeur Kurt Wuumlthrich pour ses deacuteveloppements porteacutes agrave la RMN qui ont permis
l‟eacutelucidation de la structure tridimensionnelle des macromoleacutecules biologiques en solution
Plus particuliegraverement il a eacuteteacute primeacute pour son eacutetude structurale de la proteacuteine prion
partiellement replieacutee (30)
Technique d‟analyse chimique et structurale non destructive elle est baseacutee sur l‟absorption
de la radiation agrave une radio freacutequence par des noyaux atomiques Les niveaux d‟eacutenergie de spin
des noyaux sont seacutepareacutes dans un champ magneacutetique (effet Zeeman) Sous l‟effet d‟une radio
freacutequence chaque noyau de la moleacutecule va reacutesonner agrave sa freacutequence speacutecifique (freacutequence de
Larmor) Chaque noyau de la proteacuteine a donc sa propre freacutequence de Larmor qui deacutepend de
l‟environnement local du noyau (par exemple protection par des champs magneacutetiques locaux)
Un spectre RMN contient ainsi des pics correspondants aux reacutesonances de tous les noyaux de
l‟eacutechantillon chacun avec une freacutequence (caracteacuteriseacutee par le deacuteplacement chimique δ)
caracteacuteristique de son environnement chimique De plus la surface sous un pic est
proportionnelle au nombre des noyaux reacutesonnant agrave cette freacutequence ce qui permet de
quantifier les reacutesidus identifieacutes et caracteacuteriseacutes
Un facteur tregraves important permettant la deacutetermination de la structure des proteacuteines est la
correacutelation entre des noyaux d‟une moleacutecule La perturbation locale des nuages d‟eacutelectrons
par le spin des noyaux conduit agrave un couplage scalaire entre des noyaux qui sont lieacutes de faccedilon
covalente avec un maximum de quatre liaisons entre eux L‟origine de ce couplage est le
22
changement des niveaux d‟eacutenergie des eacutetats de spin des noyaux en question pour conduire agrave
des nouveaux niveaux d‟eacutenergie en fonction de l‟alignement des spins des noyaux (parallegravele
ou anti-parallegravele) Le nombre et la nature des noyaux voisins produit des motifs et des
constantes de couplage speacutecifiques qui permettent d‟attribuer une structure covalente Dans
les proteacuteines chaque chaicircne lateacuterale d‟un acide amineacute preacutesente un motif de couplage scalaire
caracteacuteristique Il est alors aiseacute d‟attribuer les signaux RMN agrave la structure d‟une proteacuteine
L‟eacutetude d‟une proteacuteine peut ecirctre reacutealiseacutee par RMN homonucleacuteaire ou heacuteteacuteronucleacuteaire Les
noyaux protons sont alors observeacutes respectivement seuls ou avec les noyaux carbones etou
azotes Les expeacuteriences RMN permettent l‟observation des couplages scalaires et dipolaires
entre spins Le transfert d‟aimantation par couplage dipolaire produit des effets Overhauser
nucleacuteaires (nOe) entre noyaux situeacutes agrave moins de 5 Aring l‟un de l‟autre La mise en eacutevidence de
ces pheacutenomegravenes permet l‟estimation des distances entre les noyaux consideacutereacutes Cependant la
RMN homonucleacuteaire preacutesente certaines limites pour l‟eacutetude des proteacuteines en solution en
raison du taux de superposition des pics sur les spectres et du mauvais transfert d‟aimantation
entre protons par couplage scalaire Ces inconveacutenients qui rendaient probleacutematique l‟emploi
de la RMN pour l‟eacutetude de proteacuteines de taille supeacuterieure agrave cent acides amineacutes ont eacuteteacute
surmonteacutes par l‟utilisation des proprieacuteteacutes RMN de noyaux autres que le proton En effet des
noyaux diffeacuterents reacutesonnent dans des gammes de freacutequences diffeacuterentes ce qui permet de
reacutesoudre les superpositions de deacuteplacements chimiques De plus les constantes de couplage
heacuteteacuteronucleacuteaires ameacuteliorent la sensibiliteacute du couplage scalaire
Les trois isotopes de spin 12 naturellement preacutesents dans les proteacuteines sont 1H
15N et
13 C
Cependant les faibles abondances naturelles des isotopes 13
C du carbone (11 ) et 15
N de
l‟azote (037 ) ne permettent pas de reacutealiser des expeacuteriences de correacutelation heacuteteacuteronucleacuteaire
les impliquant Par conseacutequent un enrichissement des eacutechantillons proteacuteiques en isotopes 13
C
et 15
N preacutealable agrave l‟analyse en RMN doit ecirctre envisageacute
La preacuteparation d‟eacutechantillons marqueacutes est reacutealiseacutee le plus souvent par clonage
moleacuteculaire et par techniques de surexpression et de purification de proteacuteines La
surexpression des proteacuteines isotopiquement enrichies peut se faire agrave partir d‟une culture en
milieu minimum ou en milieu riche Le milieu minimum est preacutepareacute de faccedilon agrave ne renfermer
qu‟une seule source du noyau dont on veut enrichir la proteacuteine (eg glucose avec 13
C
chlorure d‟ammonium avec 15
N) Les cultures en milieu riche se font en utilisant un milieu
standard enrichi en isotopes Si l‟on souhaite simplement proceacuteder agrave un marquage partiel de la
23
proteacuteine sur certains types de reacutesidus alors on peut utiliser un organisme heacuteteacuterotrophe Ce
dernier incapable de syntheacutetiser certains acides amineacutes devra donc les puiser dans son milieu
de culture Ces organismes sont cultiveacutes dans un milieu contenant les acides amineacutes marqueacutes
que l‟on veut incorporer dans la proteacuteine
Les expeacuteriences de RMN heacuteteacuteronucleacuteaire peuvent ecirctre reacutealiseacutees sur des eacutechantillons
simplement marqueacutes au 15
N ou doublement marqueacutes (15
N 13
C) Dans le cas de proteacuteines
marqueacutees agrave l‟isotope lourd de l‟azote (15
N) des expeacuteriences 2D HSQC ou HMQC
(laquo Heteronuclear Single Multiple Quantum Correlation raquo) peuvent ecirctre meneacutees Elles
permettent d‟observer les pics de correacutelation dus au couplage scalaire entre l‟hydrogegravene
amide et l‟azote de chaque reacutesidu La strateacutegie d‟attribution baseacutee sur le double marquage
utilise quant agrave elle exclusivement les couplages scalaires homo- et heacuteteacuteronucleacuteaires Si l‟on
souhaite augmenter la limite de taille des systegravemes eacutetudieacutes alors en sus du marquage 15
N et
13C on peut remplacer 70 agrave 100 des protons par des deuteacuteriums En effet cela permet de
diminuer la fuite de l‟aimantation due aux interactions dipolaires entre protons La diminution
de la relaxation transverse agrave l‟aide de l‟expeacuterience TROSY (laquo Transverse Relaxation-
Optimized SpectroscopY raquo) permet eacutegalement de repousser cette limite (31) Des expeacuteriences
combinant les deux approches ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees pour l‟analyse de complexes
proteacuteiques de haut poids moleacuteculaire (gt 50 kDa) (32)
Les intermeacutediaires du repliement d‟une proteacuteine peuvent aussi ecirctre caracteacuteriseacutes par
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avec le deuteacuterium de l‟eau lourde Enfin une interpreacutetation
qualitative des deacuteplacements chimiques en fonction de la structure primaire de la moleacutecule
permet la deacutetection des structures secondaires telles que l‟heacutelice α ou le feuillet β
Si l‟avantage majeur de la RMN par rapport agrave la diffraction des rayons X est de permettre
l‟eacutetude de proteacuteines en solution elle preacutesente des limites importantes qui sont d‟une part la
quantiteacute de mateacuteriel neacutecessaire pour reacutealiser les expeacuteriences (des concentrations de l‟ordre du
millimolaire de proteacuteine sont geacuteneacuteralement utiliseacutees et d‟une centaine de micromoles avec
l‟utilisation d‟une cryosonde) mais surtout la taille des systegravemes qui peuvent ecirctre eacutetudieacutes (lt
50 kDa) Il faut par ailleurs noter que dans certains cas des concentrations d‟eacutechantillon tregraves
eacuteleveacutees peuvent induire des perturbations de la structure quaternaire des proteacuteines (agreacutegation
ou preacutecipitation de certaines proteacuteines)
24
I122 Meacutethodes pour lrsquoeacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
assemblages macromoleacuteculaires
I1221 Diffusion aux petits angles
La diffusion aux petits angles des rayons X en solution (laquo Small Angle X-ray Scattering raquo
SAXS) est une technique qui repose sur la diffusion eacutelastique des rayons X par des proteacuteines
et des macro-assemblages dans la gamme 10-1000 Aring (33) Bien qu‟il ne soit pas possible
d‟obtenir une reacutesolution atomique par cette meacutethode elle fournit des informations structurales
preacutecieuses agrave basse reacutesolution (forme globale de la proteacuteine structures tertiaire et quaternaire)
Elle permet donc d‟eacutetudier les changements conformationnels de macromoleacutecules ainsi que la
formation d‟assemblages supramoleacuteculaires dans des conditions quasi-physiologiques La
diffusion en solution qui n‟est pas soumise aux principales limitations de la cristallographie
et de la RMN apparaicirct comme une technique compleacutementaire pour l‟eacutetude structurale des
macromoleacutecules
Les eacutechantillons reacuteels sont le plus souvent complexes (co-existence de plusieurs espegraveces de
proteacuteines) et heacuteteacuterogegravenes (manque dhomogeacuteneacuteiteacute au niveau de la conformation des
moleacutecules) Leur eacutetude repreacutesente un deacutefi majeur pour cette technique En effet dans un tel
cas le profil de diffusion contiendra des contributions de tous les composants rendant
l‟analyse complexe Cette difficulteacute peut ecirctre surmonteacutee par des meacutethodes de traitement des
donneacutees afin de caracteacuteriser des conformegraveres individuels de proteacuteines (34) ou bien des
agreacutegats de proteacuteines (35)
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique
La cryomicroscopie eacutelectronique se base sur les principes geacuteneacuteraux de la microscopie
eacutelectronique agrave transmission tout en eacutevitant les eacutetapes de preacuteparation endommageant les
eacutechantillons Elle repose sur l‟observation de moleacutecules ayant eacuteteacute fixeacutees de maniegravere brutale
par congeacutelation agrave tregraves basse tempeacuterature (processus de quelques millisecondes agrave environ -
170degC) afin d‟eacuteviter la formation de cristaux de glace Les moleacutecules totalement englobeacutees
dans un fin film d‟eau vitrifieacutee sont ainsi preacuteserveacutees dans leur environnement et leur eacutetat
natifs Compleacutementaire agrave la cristallographie des proteacuteines et agrave la spectroscopie RMN cette
meacutethode permet d‟obtenir la structure de larges assemblages macromoleacuteculaires en solution
25
La microscopie eacutelectronique permet d‟obtenir des images bidimensionnelles correspondant
agrave des projections de toute leacutepaisseur de leacutechantillon Cependant elles ne possegravedent quun
contraste tregraves faible et lanalyse dimages est alors indispensable Celle-ci consiste dans un
premier temps agrave additionner des images de faible contraste afin de moyenner le bruit preacutesent
et dobtenir un meilleur rapport signal sur bruit Dans un deuxiegraveme temps ces moyennes qui
repreacutesentent des vues de leacutechantillon sous diffeacuterents angles peuvent ecirctre combineacutees de
maniegravere matheacutematique pour calculer la structure tridimensionnelle de lobjet de deacutepart (36)
Cette technique de reconstruction en 3D utilisant des images obtenues sous diffeacuterents angles
est appeleacutee tomographie
La cryomicroscopie eacutelectronique est particuliegraverement bien adapteacutee agrave l‟observation de
moleacutecules de masse moleacuteculaire supeacuterieure agrave 200 ou 300 kDa (37) En effet seuls des eacutedifices
macromoleacuteculaires de grande taille remplissent les critegraveres neacutecessaires pour ecirctre visualiseacutes au
dessus du bruit de fond Il est possible d‟obtenir une reacutesolution de l‟ordre de 10 agrave 30 Aring (38)
Pour des macro-assemblages on peut envisager de compleacuteter une structure agrave basse reacutesolution
avec des structures agrave haute reacutesolution des proteacuteines individuelles Ces derniegraveres peuvent ecirctre
obtenues par exemple par cristallographie Il est ainsi possible d‟obtenir des informations
structurales agrave une reacutesolution presque atomique de structures subcellulaires (39)
Cette technique permet l‟eacutetude du changement conformationnel d‟assemblages
macromoleacuteculaires par imagerie de complexes fixeacutes par vitrification dans diffeacuterents eacutetats
conformationnels (37 40) La microscopie eacutelectronique permet eacutegalement aujourd‟hui
d‟obtenir des informations sur des macromoleacutecules et leurs assemblages dans le contexte
cellulaire par imagerie de la structure biologique entiegravere (41-43) Ceci a eacuteteacute rendu possible par
les progregraves effectueacutes dans le deacuteveloppement de la tomographie eacutelectronique et l‟eacutelaboration
de la cryomicroscopie de sections vitreuses
Il existe de nombreuses eacutetudes de complexes macromoleacuteculaires par cryomicroscopie
eacutelectronique parmi lesquelles la structure du ribosome agrave une reacutesolution de 115 Aring (44) et celle
de virus (45) l‟environnement cytosolique total de cellules eucaryotes (46) ainsi que l‟eacutetude
d‟une interaction proteacuteine chaperone-substrat (47)
La cryomicroscopie eacutelectronique possegravede plusieurs avantages par rapport agrave la
cristallographie et agrave la RMN En effet elle requiert de plus faibles quantiteacutes de mateacuteriel
(environ 2 mL agrave une concentration de 01-10 mgmL-1
par grille) elle ne neacutecessite pas
26
l‟obtention de cristaux et elle permet l‟observation d‟objets de lordre de grandeur de 300 kDa
agrave 1000 MDa Mais cette meacutethode preacutesente aussi des limites Les eacutechantillons doivent ecirctre
purs uniformes et sans agreacutegats et contenir seulement une faible concentration de sel et de
solvants afin de maximiser le contraste entre la proteacuteine et le tampon
I1223 Chromatographie drsquoexclusion steacuterique
La chromatographie est une technique de chimie analytique quantitative et qualitative Il
s‟agit d‟une meacutethode physique de seacuteparation d‟espegraveces chimiques Le principe est le suivant
leacutechantillon renfermant une ou plusieurs espegraveces est entraicircneacute par une phase mobile le long
dune phase stationnaire Chaque espegravece a une vitesse de migration propre qui deacutepend de ses
caracteacuteristiques et de celles des deux phases
La chromatographie d‟exclusion steacuterique appeleacutee aussi filtration sur gel permet de seacuteparer
des proteacuteines ou autres moleacutecules biologiques suivant leur taille (48) tandis que la plupart des
meacutethodes chromatographiques utilisent l‟affiniteacute chimique avec un support La phase
stationnaire est un gel hydrateacute constitueacute de pores de tailles diffeacuterentes Les macromoleacutecules de
l‟eacutechantillon entrent et sortent de ces pores selon leur taille Les moleacutecules les plus petites
peuvent entrer dans un plus grand nombre de pores ce qui allonge la dureacutee de leur migration
alors que les plus grosses moleacutecules sont eacutelueacutees plus rapidement En conseacutequence les
macromoleacutecules sont seacutepareacutees selon leurs dimensions
Plus rigoureusement cette meacutethode permet de seacuteparer des macromoleacutecules en fonction de
leur taille mais aussi de leur forme ie suivant leur volume hydrodynamique Ainsi deux
macromoleacutecules de mecircme masse moleacuteculaire mais d‟architecture diffeacuterente pourront ecirctre
distingueacutees En effet une macromoleacutecule peu structureacutee aura un plus grand volume
hydrodynamique qu‟une macromoleacutecule de mecircme masse moleacuteculaire mais de structure tregraves
globulaire Par conseacutequent la premiegravere sera plus rapidement eacutelueacutee que la seconde bien que
les deux masses soient identiques
Une eacutetude reacutecente a montreacute qu‟il eacutetait possible de caracteacuteriser des macroassemblages de
tregraves grande taille jusqu‟agrave plusieurs millions de daltons par chromatographie d‟exclusion
steacuterique (49)
27
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface
La reacutesonance plasmonique de surface (laquo Surface Plasmon Resonance raquo SPR) est un
pheacutenomegravene physique baseacute sur les proprieacuteteacutes de la lumiegravere Lorsquun faisceau de lumiegravere
polariseacutee monochromatique illumine une surface placeacutee entre deux milieux dindice de
reacutefraction diffeacuterent une partie du rayon incident est reacutefleacutechie tandis que lautre partie est
reacutefracteacutee agrave travers la surface Selon langle dincidence du rayon toute la lumiegravere peut ecirctre
reacutefleacutechie Lorsquil ny a pas de reacutefraction ie sous les conditions de reacuteflexion interne totale
une des composantes eacutelectromagneacutetiques de la lumiegravere londe eacutevanescente se propage
perpendiculairement agrave la surface sur une distance eacutequivalente agrave sa longueur donde Si une
couche fine de meacutetal riche en eacutelectrons libres est deacuteposeacutee sur cette surface alors ceux-ci
entrent en reacutesonance avec les photons du faisceau incident et creacuteent la reacutesonance plasmonique
de surface Une conseacutequence eacutenergeacutetique de cette reacutesonance est visible dans le faisceau
reacutefleacutechi qui preacutesente une chute dintensiteacute agrave un angle deacutefini Cet angle pour lequel on observe
une intensiteacute minimale est langle de reacutesonance Il varie en fonction de lindice de reacutefraction
du milieu dans lequel londe eacutevanescente se propage
Depuis sa deacutecouverte par Wood en 1902 (50-51) la reacutesonance plasmonique de surface est
principalement utiliseacutee comme senseur ie comme deacutetecteur placeacute agrave la source mecircme du
pheacutenomegravene eacutetudieacute capable de deacuteceler des modifications au niveau moleacuteculaire L‟application
de cette technique pour le controcircle des interactions biomoleacuteculaires a eacuteteacute deacutemontreacutee pour la
premiegravere fois en 1983 (52) La reacutesonance plasmonique de surface permet de mettre en
eacutevidence la formation d‟une liaison entre un ligand et un reacutecepteur adsorbeacute agrave la surface
meacutetallique par mesure de la variation de lindice de reacutefraction (Fig I 5) Lanalyte est mis au
contact de la surface meacutetallique greffeacutee Les changements induits par lassociation ou la
dissociation des complexes modifient la reacutefringence du milieu et deacutecalent la position de
langle de reacutesonance Lenregistrement de la variation de langle de reacutesonance permet de suivre
en temps reacuteel la fixation des moleacutecules injecteacutees Cette technique permet donc d‟obtenir des
donneacutees cineacutetiques sur des interactions mettant en jeu deux ou plusieurs partenaires (53)
28
Fig I 5 Scheacutema du principe de la reacutesonance plasmonique de surface utiliseacute par la technologie
Biacore TM pour l‟analyse des interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans marquage
Dans un tel systegraveme les deux milieux d‟indices de reacutefraction diffeacuterents sont la solution dans
laquelle se trouvent les moleacutecules agrave analyser et le verre d‟une lame qui sert de senseur Le
film conducteur agrave l‟interface des deux est un tregraves fin film d‟or agrave la surface de la lame de verre
La reacutesonance plasmonique de surface permet donc de deacutetecter et de quantifier des
interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans avoir recours au marquage de ces derniegraveres
Par le suivi en temps reacuteel de la formation et de la dissociation des complexes il est possible
de caracteacuteriser minutieusement la force des associations et d‟obtenir les cineacutetiques des
interactions moleacuteculaires La technique ne neacutecessitant pas l‟utilisation de marquage pour la
deacutetection et eacutetant non destructrice les biomoleacutecules qui sont seacutelectivement retenues sur la
surface du capteur peuvent ecirctre par la suite reacutecupeacutereacutees et analyseacutees par spectromeacutetrie de
masse Cette combinaison de technologies offre donc une toute nouvelle gamme
d‟applications telle que l‟identification et la rapide caracteacuterisation de nouvelles interactions
proteacuteineproteacuteine entre une proteacuteine d‟inteacuterecirct et un meacutelange complexe de proteacuteines (54-55)
I1225 Spectromeacutetrie de masse
Bien que les techniques de diffraction des rayons X et de spectroscopie RMN soient les
deux meacutethodes phares pour l‟eacutelucidation structurale des proteacuteines nous avons vu
preacuteceacutedemment qu‟elles preacutesentaient des limites En effet elles sont toutes les deux peu
sensibles et la cristallographie des proteacuteines neacutecessite l‟obtention de cristaux tandis que la
spectroscopie RMN est limiteacutee en gamme de masse Ainsi le choix de ces meacutethodes
29
classiques pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques n‟est pas toujours possible En revanche
l‟apport de la spectromeacutetrie de masse dans ce domaine est en constante progression La
spectromeacutetrie de masse ne permet pas d‟obtenir des informations structurales avec la mecircme
reacutesolution spatiale que les rayons X ou la RMN mais apporte un gain important en termes de
sensibiliteacute et rapiditeacute par rapport aux deux meacutethodes preacuteceacutedentes Il existe plusieurs
approches par spectromeacutetrie de masse permettant d‟obtenir des informations de structure
L‟une d‟entre elles repose sur le pontage covalent de proteacuteines en association suivi d‟une
digestion enzymatique et analyse par spectromeacutetrie de masse Une deuxiegraveme implique des
eacutechanges isotopiques (ou un marquage covalent) permettant soit de deacuteterminer des zones de
flexibiliteacute induites par la liaison d‟un ligand agrave une proteacuteine soit des zones d‟interaction entre
macromoleacutecules au sein d‟un complexe La spectromeacutetrie de masse offre eacutegalement
l‟opportuniteacute de caracteacuteriser des complexes non covalents (proteacuteine-proteacuteine proteacuteine-ligand)
gracircce agrave l‟utilisation de modes d‟ionisation adapteacutes On peut noter pour l‟analyse de
complexes proteacuteiques intacts l‟eacutemergence de spectromegravetres de masse eacutequipeacutes d‟une cellule
de mobiliteacute ionique
Approche par pontage covalent
Les interactions proteacuteine-proteacuteine peuvent donc ecirctre analyseacutees par pontage covalent
(laquo crosslinking raquo) et spectromeacutetrie de masse L‟avantage majeur de cette approche est qu‟elle
permet d‟obtenir agrave la fois des informations sur la composition et sur la structure des
complexes gracircce agrave la grande sensibiliteacute de la spectromeacutetrie de masse Le laquo crosslinking raquo est
une technique qui permet de relier chimiquement les sous-uniteacutes d‟un complexe non covalent
ce qui permet de stabiliser les interactions au sein de l‟eacutedifice macromoleacuteculaire et d‟en
faciliter l‟eacutetude Ceci est reacutealiseacute par des agents pontants ou laquo crosslinkers raquo qui sont des
composeacutes chimiques posseacutedant un groupe reacuteactif agrave leur extreacutemiteacute capable de reacuteagir avec des
fonctions speacutecifiques des proteacuteines ou d‟autres moleacutecules (eg amines primaires
sulfhydryles hellip) Les agents pontants eacutetablissent des liaisons covalentes entre des acides
amineacutes proches dans la structure tertiaire L‟utilisation de laquo crosslinkers raquo de taille diffeacuterente
permet d‟obtenir des contraintes de distance entre les peptides des partenaires proteacuteiques du
complexe L‟analyse des peptides ponteacutes par spectromeacutetrie de masse permet d‟obtenir des
informations sur la topologie initiale du complexe Il existe maintenant une grande varieacuteteacute
d‟agents pontants multifonctionnels (homo- ou heacuteteacuterofonctionnels) disponibles dans le
commerce (wwwpiercenetcom)
30
Fig I 6 Scheacutema de la reacuteaction de pontage covalent entre deux proteacuteines utilisant le DSG
(DiSuccinimidyl Glutarate) reacuteactif homobifonctionnel Il a deux groupes identiques des
esters de NHS agrave chacune de ses extreacutemiteacutes qui reacuteagissent avec les amines primaires des
proteacuteines (extreacutemiteacute N-terminale et chaicircne lateacuterale des lysines) Son bras espaceur long de 77
Aring est constitueacute de cinq atomes
Les groupes reacuteactifs peuvent ecirctre des esters de NHS (N-HydroxySuccinimide) (Fig I 6)
ou des maleacuteimides qui ciblent les thiols des cysteacuteines ou encore des aryl azides qui s‟insegraverent
dans des liaisons C-H ou N-H sous activation UV Les esters de NHS et leurs deacuteriveacutes solubles
sulfonyleacutes sont les plus couramment utiliseacutes malgreacute les reacuteactions secondaires qu‟ils
entraicircnent compliquant l‟analyse des spectres obtenus apregraves digestion enzymatique du
complexe proteacuteique En effet si les amines primaires des lysines (ou des extreacutemiteacutes N-
terminales) sont les cibles majeures des groupements NHS il n‟est pas rare d‟observer des
reacuteactions de pontage impliquant les groupements hydroxyles des tyrosines des seacuterines ou
encore des threacuteonines (56) De plus les esters de NHS conventionnels ont une forte tendance
agrave s‟hydrolyser pendant l‟eacutetape de pontage conduisant agrave des produits de type laquo dead-end raquo
qu‟il est difficile de seacuteparer des autres (57) Par conseacutequence avec la connaissance de toutes
les cibles possibles des laquo crosslinkers raquo l‟eacutelucidation de la structure des complexes proteacuteiques
pourrait ecirctre significativement ameacutelioreacutee due agrave la plus grande fraction d‟espegraveces ponteacutees
identifieacutees
Bien que l‟association pontage covalent et spectromeacutetrie de masse soit devenue un outil
analytique performant pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques elle preacutesente des limites qui
sont (i) la faible intensiteacute dans les spectres de masse des pics correspondant aux peptides
ponteacutes et (ii) la difficulteacute agrave les identifier parmi les autres due au fait qu‟ils sont tregraves
minoritaires dans les meacutelanges obtenus Dans ce contexte le choix d‟un spectromegravetre de
masse alliant excellente reacutesolution et tregraves bonne preacutecision sur la mesure de masse (FT-ICR
orbitrap) est judicieux Il permet d‟une part de bien seacuteparer les diffeacuterents constituants obtenus
31
apregraves la digestion des complexes et d‟autre part d‟utiliser la masse exacte comme critegravere de
seacutelection Des strateacutegies permettant d‟identifier plus facilement les peptides ponteacutes dans le
meacutelange tregraves complexe obtenu apregraves digestion enzymatique ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees
ces derniegraveres anneacutees Elles sont baseacutees sur l‟utilisation d‟agents pontants posseacutedant des
isotopes stables (58) ou inteacutegrant une fonction biotine permettant un enrichissement seacutelectif
des peptides ponteacutes (59) Des agents pontants permettant une identification plus aiseacutee des
peptides ponteacutes en MSMS ont eacutegalement eacuteteacute mis au point ces derniegraveres anneacutees (60-62)
Reacutecemment l‟utilisation de laquo crosslinkers raquo photoactivables a permis de mettre en eacutevidence
des sites d‟interaction diffeacuterents entre trois activateurs de la transcription (Gal4 Gcn4 et
VP16) et le cofacteur MD15 (63) Cette eacutetude montre par ailleurs la compleacutementariteacute des
modes d‟ionisation MALDI et ESI pour retrouver un grand nombre de peptides ponteacutes Dans
un exemple un peu moins reacutecent Rappsilber et al ont proposeacute un modegravele tridimensionnel
pour un complexe du pore nucleacuteaire chez la levure (64)
Approche par marquage
Une deuxiegraveme approche consiste agrave modifier chimiquement la surface du complexe
proteacuteique accessible en solution et agrave identifier les sites de modifications par spectromeacutetrie de
masse Les segments peptidiques impliqueacutes dans des interactions proteacuteine-proteacuteine ne sont
pas accessibles en solution et a priori ne seront pas modifieacutes La comparaison des cartes
d‟accessibiliteacute pour des proteacuteines seules et associeacutees permet de remonter agrave la topologie initiale
du complexe La modification chimique peut ecirctre reacuteversible ou irreacuteversible Les eacutechanges
hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) des amides de la liaison peptidique sont un exemple de
modifications labiles (65-67) La modification chimique des chaicircnes lateacuterales par des reacuteactifs
speacutecifiques tels que l‟aceacutetanhydride le dieacutethylpyrocarbonate ou le phenylglyoxal est quant agrave
elle permanente (67-68) ce qui impose moins de contraintes au niveau de la rapiditeacute de
l‟analyse apregraves modifications La premiegravere strateacutegie qui fait l‟objet de cette thegravese sera deacutecrite
en deacutetails dans la seconde partie de cette introduction
Les radicaux hydroxyles peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutes dans une approche par marquage
covalent Leur formation peut avoir lieu de diffeacuterentes faccedilons ie par chimie Fenton
radiolyse de l‟eau eacutelectrochimie ou photolyse UV du peroxyde d‟hydrogegravene Ces techniques
aboutissent agrave des concentrations en radicaux diffeacuterentes avec des eacutechelles de temps varieacutees
mais en principe les reacuteactions avec les proteacuteines conduisent aux mecircmes produits Les produits
d‟oxydation sont nombreux puisque quatorze acides amineacutes sur vingt peuvent ecirctre modifieacutes
(Cys Met Trp Tyr Phe His Leu Ile Arg Lys Val Ser Gln et Glu) L‟analyse des
32
produits de la reacuteaction et des sites de modification est geacuteneacuteralement reacutealiseacutee par couplage LC-
MSMS apregraves digestion enzymatique La cineacutetique d‟oxydation des diffeacuterents peptides permet
d‟obtenir des informations de structure Elle est eacutetablie agrave partir de la disparition des peptides
non modifieacutes mais eacutegalement agrave partir de l‟apparition des peptides oxydeacutes Si le temps
d‟exposition aux radicaux est court (infeacuterieur agrave quelques centaines de ms) alors la vitesse
d‟oxydation enregistreacutee pour un peptide donneacute deacutependra principalement (i) de la reacuteactiviteacute
intrinsegraveque des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes et (ii) de leur accessibiliteacute au solvant dans
la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (ou du complexe) Ainsi la comparaison des
vitesses d‟oxydation mesureacutees pour deux peptides dont les acides amineacutes modifieacutes sont
identiques permettra d‟obtenir des informations en termes d‟accessibiliteacute relative agrave la surface
de deux reacutegions diffeacuterentes d‟une proteacuteine
L‟avantage majeur des approches par marquage covalent reacuteside dans le fait de pouvoir
analyser les peptides modifieacutes sans prendre de preacutecautions particuliegraveres puisque la
modification n‟est pas labile En revanche la technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium
impose de travailler dans des conditions expeacuterimentales strictes permettant de conserver le
marquage jusqu‟agrave l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Cependant cette derniegravere
approche ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas toujours
le cas avec des approches par marquage covalent En effet une alteacuteration de la structure des
macroassemblages peut ecirctre observeacutee sous l‟effet de l‟oxydation par l‟utilisation de radicaux
hydroxyles (69)
L‟approche par marquage peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour obtenir des informations sur la
dynamique structurelle des proteacuteines et complexes proteacuteiques La caracteacuterisation des
modifications dans des conditions expeacuterimentales diffeacuterentes permet de remonter aux
changements structuraux Ainsi Dumoulin et al ont eacutetudieacute le changement conformationnel
du lysozyme induisant la formation d‟agreacutegats multimeacuteriques (70) Un autre exemple est
l‟eacutetude des changements d‟interaction proteacuteine-proteacuteine lors de la maturation des capsides du
virus HIV-1 (71) Des informations sur les changements conformationnels d‟une proteacuteine lors
de la fixation d‟un ligand ont pu eacutegalement ecirctre obtenues (72-74) Par ailleurs une eacutetude
reacutecente du complexe Arp23 formeacute de sept sous-uniteacutes proteacuteiques a permis de mettre en
eacutevidence finement des modifications de structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave
l‟ATP en utilisant les radicaux hydroxyles (75)
33
Approche par proteacuteolyse meacutenageacutee
Une autre approche consiste agrave reacutealiser une proteacuteolyse meacutenageacutee Les premiers travaux
rapportant l‟eacutetude d‟une empreinte proteacuteique par proteacuteolyse meacutenageacutee datent de 1987 et sont
directement inspireacutes des travaux de laquo DNA footprint raquo (76) Le principe ici consiste agrave tester
l‟accessibiliteacute agrave diffeacuterentes proteacuteases des proteacuteines eacutetudieacutees Un profil proteacuteolytique diffeacuterent
peut traduire des surfaces accessibles qui ne sont pas identiques ou un masquage par une
moleacutecule de ligand Associeacutee agrave la spectromeacutetrie de masse la proteacuteolyse meacutenageacutee est ainsi
devenue un outil puissant dont l‟une des applications premiegraveres a eacuteteacute l‟identification preacutecise
d‟eacutepitopes agrave partir de complexes antigegravene-anticorps immobiliseacutes (77) Depuis cette technique
est largement utiliseacutee pour des eacutetudes de dynamique structurelle (78) d‟interaction proteacuteine-
ligand (79-82) de diffeacuterences conformationnelles lieacutees agrave des mutations (83-84) ou pour
l‟eacutelucidation de domaines structuraux (85-87)
Les enzymes classiquement utiliseacutees sont la trypsine qui clive apregraves les acides amineacutes
basiques tels que les reacutesidus lysine et arginine et la proteacutease V8 qui coupe speacutecifiquement
apregraves les reacutesidus acide aspartique et acide glutamique Elles ont eacuteteacute choisies
preacutefeacuterentiellement en raison de la haute freacutequence de ces reacutesidus dans les proteacuteines et de la
compleacutementariteacute des profils proteacuteolytiques obtenus Par ailleurs la proteacuteolyse doit ecirctre la plus
limiteacutee possible afin de ne pas deacutestructurer la proteacuteine conduisant agrave d‟autres sites de coupure
non repreacutesentatifs de la structure tertiaire La reacutesolution de cette meacutethode est cependant
modeste C‟est la raison pour laquelle la proteacuteolyse meacutenageacutee est tregraves souvent coupleacutee avec des
approches par eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium afin d‟obtenir des reacutesultats compleacutementaires
(88-89)
Analyse de complexes non covalents
L‟avegravenement des techniques d‟ionisation douces telles que l‟ESI (laquo ElectroSpray
Ionisation raquo) (90) et le MALDI (laquo Matrix Assisted Laser DesorptionIonisation raquo) (91) a
ouvert agrave la spectromeacutetrie de masse un nouveau champ d‟application celui de l‟analyse de
macromoleacutecules biologiques intactes (92) Pour le deacuteveloppement de ces meacutethodes qui ont
ces derniegraveres anneacutees largement participeacute agrave l‟essor de la spectromeacutetrie de masse dans le cadre
des analyses proteacuteomiques J Fenn et K Tanaka ont eacuteteacute reacutecompenseacutes en 2002 par
l‟attribution du prix Nobel de chimie
34
Par comparaison aux diffeacuterentes techniques utiliseacutees pour la caracteacuterisation des proteacuteines
la spectromeacutetrie de masse apporte plusieurs avantages Tout d‟abord elle est tregraves sensible En
effet quelques picomoles voire mecircme attomoles de peptides suffisent agrave obtenir un signal Par
ailleurs la spectromeacutetrie de masse est caracteacuteriseacutee par sa grande preacutecision en masse Elle est
ainsi capable de deacuteterminer des masses moleacuteculaires agrave moins d‟une partie par million (ppm)
pour les instruments les plus preacutecis alors que la technique de SDS-PAGE (laquo Sodium Dodecyl
Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis raquo) donne des erreurs de l‟ordre de 20 Enfin la
spectromeacutetrie de masse est une meacutethode d‟analyse rapide A titre de comparaison un spectre
de masse est enregistreacute en quelques secondes agrave minutes tandis qu‟une expeacuterience de SDS-
PAGE dure plusieurs heures
Dans le cadre de l‟eacutetude des complexes proteacuteiques la spectromeacutetrie de masse est
susceptible de fournir d‟une part des informations preacutecises sur la stœchiomeacutetrie des
macroassemblages et d‟autre part des donneacutees structurales en combinaison avec du
marquage
Une des questions souvent poseacutees aux spectromeacutetristes de masse concerne la possibiliteacute de
reacutealiser une mesure de masse directe d‟un complexe proteacuteique intact dans le but d‟obtenir des
informations sur la stœchiomeacutetrie de l‟interaction Il convient de noter que la mesure de
masse est alors effectueacutee sur le complexe en phase gazeuse alors que pour le biologiste
l‟interaction d‟inteacuterecirct est celle qui a lieu en solution Dans ces conditions une interaction non
covalente preacutesente en solution peut ne pas ecirctre deacutetecteacutee en phase gazeuse C‟est le cas par
exemple des interactions hydrophobes Des eacutetudes ont ainsi montreacute l‟impossibiliteacute de
corroborer les reacutesultats obtenus en phase gazeuse et en solution pour ce type d‟interaction (93-
94) A l‟inverse des interactions principalement eacutelectrostatiques seront renforceacutees en phase
gazeuse et un complexe mecircme peu stable en solution peut ecirctre deacutetecteacute facilement par
spectromeacutetrie de masse Compte tenu de ces eacuteleacutements il nest pas toujours facile de relier des
stabiliteacutes en phase gazeuse eacutetudieacutees par exemple en modifiant la tension agrave l‟interface aux
stabiliteacutes en solution Dans certains cas le problegraveme est encore plus complexe puisque le
type d‟interaction en phase gazeuse peut ecirctre diffeacuterent de celui en solution L‟exemple retenu
est celui des complexes entre des cyclodextrines et des acides amineacutes aromatiques (95) en
solution l‟interaction est principalement de type hydrophobe entre le groupe aromatique et la
caviteacute de la cyclodextrine alors qu‟en phase gazeuse il s‟agit d‟une interaction ion-dipocircle agrave
l‟exteacuterieur de la caviteacute Ceci implique la formation en phase gazeuse de complexes
inexistants en solution donnant ainsi naissance agrave des faux positifs
35
Malgreacute ces contraintes quelques revues reacutecentes de la litteacuterature montrent l‟inteacuterecirct de la
spectromeacutetrie de masse pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers (96-99) Actuellement il est mecircme possible de mesurer des masses
moleacuteculaires de l‟ordre de plusieurs millions de daltons Parmi les plus importantes jamais
atteintes il a celles des heacutemocyanines de 22 MDa de crabes abyssaux (100) du ribosome de
Thermus thermophilus de 233 MDa (98) des assemblages viraux des capsides du virus de
l‟heacutepatite B de 3 et 4 MDa (101) et du complexe multiproteacuteique de l‟ureacutease de Helicobacter
pylori agrave 426 MDa (98)
La technique d‟ionisation de reacutefeacuterence pour analyser les complexes proteacuteiques est
l‟eacutelectrospray (ou sa variante le nano eacutelectrospray) Dans des cas particuliers il est mecircme
possible de les eacutetudier par MALDI (102) bien que cette meacutethode ne soit probablement pas
geacuteneacuteralisable agrave tous les systegravemes Quelques techniques eacutemergentes pour l‟analyse
d‟assemblages macromoleacuteculaires ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees reacutecemment ou sont en cours de
deacuteveloppement comme la mobiliteacute ionique (SMI) (103) l‟laquo ElectroSonic Spray Ionization raquo
(ESSI) (104) ou le laquo Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption raquo (LILBID) (105) Le
processus d‟ionisation doit ecirctre reacutealiseacute en conditions non deacutenaturantes (pH controcircleacute) pour
conserver les complexes proteacuteiques dans leur conformation active Il faut donc choisir un
tampon (nature des sels) qui soit compatible agrave la fois avec la meacutethode d‟ionisation employeacutee
et le maintien de l‟inteacutegriteacute des complexes biologiques Dans le cas de l‟eacutelectrospray des sels
volatils comme l‟aceacutetate d‟ammonium (AcNH4) sont preacutefeacuterentiellement utiliseacutes Neacuteanmoins
lors de la preacuteparation des eacutechantillons une eacutetape de dessalage (par centrifugation gel
filtration hellip) est indispensable En ce qui concerne l‟analyseur du spectromegravetre de masse le
choix est porteacute sur les temps de vol (laquo Time of Flight raquo ToF et laquo Quadrupole Time of
Flight raquo Q-ToF) qui permettent d‟analyser des ions avec des rapports masse sur charge
eacuteleveacutes proprieacuteteacute inteacuteressante pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers Une optimisation des paramegravetres instrumentaux est preacutealablement requise
pour controcircler l‟eacutenergie communiqueacutee aux ions dans l‟interface du spectromegravetre de masse
Pour les complexes proteacuteiques qui restent intacts apregraves leur ionisation en phase gazeuse la
spectromeacutetrie de masse est ainsi devenue un outil tregraves puissant pour obtenir des informations
sur leur masse moleacuteculaire et donc pour deacuteterminer leur stœchiomeacutetrie
36
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment la spectromeacutetrie de masse est souvent combineacutee agrave une
autre technique pour obtenir des informations de structure On peut dans ce contexte citer les
derniers deacuteveloppements dans le domaine de la mobiliteacute ionique qui permet de seacuteparer
diffeacuterents complexes proteacuteiques en fonction de leur structure en phase gazeuse Le principe de
la Spectromeacutetrie de Mobiliteacute Ionique (SMI) est illustreacute dans la Fig I 7 L‟utilisation en
routine de la SMI a eacuteteacute rendue possible par la commercialisation par Waters de spectromegravetres
de masse eacutequipeacutes d‟une cellule de mobiliteacute ionique
Fig I 7 Scheacutema du principe de la meacutethode de spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique (SMI)
coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse (SM) Les ions produits par la source eacutelectrospray (ES)
sont introduits dans la cellule de laquo drift raquo dans laquelle regravegne un champ eacutelectrique E Le
frottement avec les moleacutecules d‟heacutelium contenues dans la cellule eacutetant plus important avec
des ions de conformation deacuteplieacutee ceux-ci arriveront plus tard au deacutetecteur Ici les ions sont
seacutelectionneacutes en masse par un quadripocircle apregraves la cellule de drift
La mobiliteacute ionique est l‟eacutequivalent en phase gazeuse de la mobiliteacute eacutelectrophoreacutetique les
ions sont agrave la fois acceacuteleacutereacutes dans le champ eacutelectrique et freineacutes par les nombreuses collisions
avec le gaz-tampon (heacutelium) Il s‟eacutetablit donc un reacutegime stationnaire les ions atteignent une
vitesse de translation constante La mobiliteacute ionique correspond au rapport entre la vitesse de
laquo drift raquo et le champ eacutelectrique appliqueacute Plus l‟ion a une conformation compacte moins sa
section efficace est grande et moins il est freineacute par des collisions donc plus sa vitesse est
eacuteleveacutee Il arrivera plus rapidement au deacutetecteur par rapport agrave un ion de conformation plus
deacuteployeacutee Un ion laquo funnel raquo ou un piegravege agrave ions quadripolaire est placeacute en amont de la cellule
de laquo drift raquo afin de focaliser les ions en paquets agrave envoyer agrave un temps zeacutero et ainsi pour
pouvoir mesurer la distribution des temps d‟arriveacutee (laquo Arrival Time Distribution raquo ou ATD)
Les premiers instruments de SMI ont eacuteteacute conccedilus par quelques groupes pionniers en la
matiegravere (Bowers (106-107) Jarrold (108) et Clemmerb (109) pour les biomoleacutecules) La
socieacuteteacute Waters (Milford Etats-Unis wwwwaterscom) a reacutecemment commercialiseacute le
systegraveme Synapttrade High Definition MS qui inclut une cellule de mobiliteacute de type laquo travelling
37
wave raquo (champ eacutelectrique oscillant entre les anneaux successifs d‟un tunnel agrave ions) entre un
filtre quadripolaire et un analyseur agrave temps de vol
L‟analyse des complexes proteacuteiques par SMIMS permet non seulement d‟obtenir des
informations sur leur taille mais eacutegalement des donneacutees de topologie (110) L‟agencement des
proteacuteines au sein des complexes peut ecirctre sondeacute suivant deux approches diffeacuterentes La
premiegravere consiste agrave dissocier le complexe en phase gazeuse les proteacuteines se trouvant agrave la
peacuteripheacuterie se deacutetachent theacuteoriquement en premier Neacuteanmoins il est difficile de fragmenter en
phase gazeuse des complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire Par ailleurs l‟activation
neacutecessaire agrave la dissociation conduit agrave une augmentation des sections efficaces de collision et
donc agrave une perturbation partielle de la conformation native des proteacuteines du complexe Il est
alors possible que les proteacuteines qui se seacuteparent du complexe en premier ne soient pas celles
qui ont initialement les surfaces d‟interaction les plus petites avec les autres partenaires
proteacuteiques (111) Neacuteanmoins l‟utilisation reacutecente de la dissociation sur surface par le groupe
de V Wysocki pour dissocier ces complexes en maintenant les structures des sous-uniteacutes
semble ouvrir des perspectives nouvelles et prometteuses dans le domaine (112) L‟autre
approche consiste agrave deacutenaturer progressivement le complexe en solution et agrave analyser les
diffeacuterents sous-complexes par SMI pour reconstruire la topologie initiale L‟avantage majeur
de cette approche est que les sous-complexes sont formeacutes en solution et reflegravetent donc de
maniegravere plus fidegravele la composition du complexe dans son eacutetat natif Le laboratoire de Carol
Robinson en Angleterre est devenu ces derniegraveres anneacutees leader pour l‟analyse structurale par
SMI de ces complexes proteacuteiques de tregraves grande taille (113)
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique
Ces meacutethodes permettent de travailler sur l‟objet biologique lui-mecircme Parmi elles le
TAP-Tag (laquo Tandem Affinity Purification-Tag raquo) et le double hybride occupent une place de
choix pour l‟eacutetude des interactions proteacuteine-proteacuteine Il s‟agit de deux techniques in-situ
La meacutethode du TAP-Tag permet d‟isoler le complexe proteacuteique eacutetudieacute qui est dans sa
conformation native par deux eacutetapes de purification successives (Fig I 8) La premiegravere
utilise une colonne constitueacutee de billes greffeacutees avec des immunoglobulines G (IgG) qui ont
une forte affiniteacute pour la proteacuteine A proteacuteine recombinante dite appacirct agrave laquelle est fixeacute le
complexe proteacuteique Le complexe retenu sur cette colonne est ensuite eacutelueacute speacutecifiquement par
38
coupure avec la proteacutease TEV Puis il est appliqueacute sur la seconde colonne constitueacutee de billes
de calmoduline En preacutesence d‟ions calcium la calmoduline est sous sa forme active
favorisant l‟attachement du complexe L‟eacutelution est reacutealiseacutee par l‟ajout d‟un cheacutelateur de
calcium (EGTA) qui rend la calmoduline inactive et donc libegravere le complexe Finalement ce
dernier pourra ecirctre analyseacute par spectromeacutetrie de masse afin de deacuteterminer ses diffeacuterents
constituants ou bien ecirctre utiliseacute pour des eacutetudes fonctionnelles
Fig I 8 Scheacutema du principe de la technique du TAP-Tag
Cette meacutethode a eacuteteacute appliqueacutee agrave l‟analyse agrave haut deacutebit du proteacuteome de la levure
Saccharomyces cerevisiae (114-116) Son utilisation chez les eucaryotes supeacuterieurs reste plus
complexe mais tout de mecircme envisageable (117) Des ameacuteliorations de l‟approche TAP-
TagMS ont eacuteteacute apporteacutees pour la possibiliteacute d‟utiliser cette meacutethode agrave haut deacutebit chez les
eucaryotes supeacuterieurs (118)
La technique du double hybride permet quant agrave elle de mettre en eacutevidence une interaction
physique entre deux proteacuteines X et Y Le principe est le suivant par geacutenie geacuteneacutetique deux
proteacuteines de fusion sont syntheacutetiseacutees puis exprimeacutees dans la levure La premiegravere est constitueacutee
de la proteacuteine X agrave laquelle est fusionneacute le domaine de liaison agrave l‟ADN (DL) d‟un facteur de
transcription tandis que la seconde est formeacutee de la proteacuteine Y et du domaine d‟activation de
39
la transcription (DA) de ce mecircme facteur Les deux domaines ont eacuteteacute dissocieacutes et le gegravene
rapporteur de la β-galactosidase est sous le controcircle de la seacutequence ougrave vient se fixer
speacutecifiquement le DL La β-galactosidase est une enzyme qui transforme un substrat soluble
et incolore en un composeacute bleu insoluble Lorsque la proteacuteine Y interagit avec la proteacuteine X
le DA est de nouveau associeacute au DL permettant alors la transcription du gegravene rapporteur Les
clones capables d‟utiliser le galactose preacutesent dans le milieu peuvent donc ecirctre seacutelectionneacutes
(colonies bleues) En effet le changement de couleur teacutemoigne de l‟interaction entre les deux
proteacuteines
Ce systegraveme a eacuteteacute agrave l‟origine mis au point pour tester l‟interaction pouvant exister entre
deux proteacuteines connues (119) De nouvelles variantes de la meacutethode double hybride ont fait
leur apparition reacutecemment permettant la deacutetection des proteacuteines impliqueacutees dans des
interactions avec l‟ADN (laquo one-hybrid system raquo) l‟ARN (laquo RNA-based three-hybrid
system raquo) de petits ligands (laquo small molecule-based threehybrid system raquo) et des proteacuteines
ayant subi des modifications post-traductionnelles (laquo tribrid system raquo) (120)
Il existe eacutegalement des techniques de seacuteparation des complexes proteacuteiques en conditions
non deacutenaturantes pour conserver intactes les interactions Ainsi l‟eacutelectrophoregravese sur gel de
polyacrylamide en condition bleue native ou BN-PAGE (laquo Blue Native-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis raquo) permet d‟isoler les macro-assemblages dans leur conformation native en
fonction de leur taille et de leur forme En combinaison avec une seconde dimension de
seacuteparation sur gel cette fois-ci en conditions deacutenaturantes les proteacuteines d‟un mecircme complexe
peuvent agrave leur tour ecirctre isoleacutees puis identifieacutees par spectromeacutetrie de masse Il est donc
possible par cette technique de mettre en eacutevidence le nombre et la masse moleacuteculaire des
proteacuteines impliqueacutees dans le complexe
Cette technique peut ecirctre utiliseacutee pour l‟isolation de complexes proteacuteiques membranaires
ou pour les complexes proteacuteiques extraits de cellules entiegraveres Un grand nombre
d‟applications pour cette technique concerne l‟analyse de complexes proteacuteiques issus de
plantes (121)
40
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la
spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique
structurelle des proteacuteines en solution
La technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) en solution s‟est reacuteveacuteleacutee tregraves
performante pour l‟eacutetude de la conformation et de la dynamique structurelle des proteacuteines La
spectroscopie RMN agrave deux dimensions a longtemps eacuteteacute choisie comme meacutethode d‟analyse de
ces eacutechanges isotopiques (32 122-123) L‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse comme
meacutethode alternative d‟analyse apregraves eacutechanges HD s‟est deacuteveloppeacutee ces derniegraveres anneacutees La
spectromeacutetrie de masse qui permet de s‟inteacuteresser agrave des complexes proteacuteiques de tregraves haut
poids moleacuteculaire ouvre ainsi de nouvelles opportuniteacutes pour l‟eacutetude de systegravemes proteacuteiques
plus importants (gtgt 50 kDa) Par ailleurs en raison de sa meilleure sensibiliteacute cette technique
requiert une quantiteacute initiale de mateacuteriel beaucoup moins importante (de l‟ordre de quelques
dizaines de nganalyse) Elle permet eacutegalement de deacutetecter la coexistence de diffeacuterents
conformegraveres proteacuteiques en solution (124)
Les premiers travaux combinant les eacutechanges HD et la spectromeacutetrie de masse datent de
1991 Ils portent alors sur l‟analyse de proteacuteines entiegraveres (125) Depuis les avantages de la
spectromeacutetrie de masse ont permis aux eacutechanges isotopiques HD d‟eacutetudier des proteacuteines
individuelles de poids moleacuteculaires plus importants (126) des proteacuteines s‟associant pour
former des polymegraveres de haut poids moleacuteculaire (127) des particules virales (71 128) ainsi
que des complexes proteacuteine-ligand (129) ou proteacuteine-proteacuteine (130) De plus l‟association
HDXMS semble prometteuse pour l‟analyse structurale de proteacuteines membranaires connues
pour ecirctre difficilement eacutetudiables par beaucoup d‟autres techniques (131-133)
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux
proteacuteines en solution
I211 Quel type drsquohydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX
Les hydrogegravenes lieacutes agrave des heacuteteacuteroatomes dans les moleacutecules biologiques telles que les
proteacuteines sont labiles Autrement dit les atomes d‟hydrogegravene appartenant aux groupements
O-H N-H et S-H peuvent s‟eacutechanger avec ceux des moleacutecules d‟eau environnantes Il s‟agit
des hydrogegravenes des proteacuteines qui sont repreacutesenteacutes en bleu et en rouge sur la Fig I 9
41
Fig I 9 Scheacutema des diffeacuterents types d‟hydrogegravene dans une proteacuteine
Si un atome d‟hydrogegravene est eacutechangeacute avec un autre atome d‟hydrogegravene alors il est eacutevident
que ce remplacement ne sera pas deacutetecteacute par spectromeacutetrie de masse En revanche
l‟exposition d‟une proteacuteine agrave de l‟eau lourde (D2O ou 2H2O) conduit agrave des remplacements
d‟hydrogegravenes (1H) par des deuteacuteriums (
2H) qui accroissent la masse totale de la proteacuteine de 1
Da par hydrogegravene eacutechangeacute Lorsque les eacutechanges isotopiques se reacutealisent dans le sens deacutecrit
preacuteceacutedemment ie 1H
2H alors on utilise l‟expression laquo exchange-in raquo Mais les eacutechanges
isotopiques peuvent ecirctre reacutealiseacutes dans les deux directions On emploie alors le terme de
laquo exchange-out raquo pour eacutevoquer les eacutechanges qui s‟opegraverent dans le sens 2H
1H quand une
proteacuteine complegravetement deuteacutereacutee est incubeacutee dans de l‟eau leacutegegravere et que des deuteacuteriums sont
alors remplaceacutes par des hydrogegravenes (134) Les eacutetudes d‟eacutechange HD sont principalement
reacutealiseacutees suivant le principe laquo exchange-in raquo En effet ce dernier ne neacutecessite pas d‟eacutetape
suppleacutementaire qui consisterait agrave deuteacuterer complegravetement les proteacuteines avant le deacutebut des
expeacuteriences HDXMS C‟est la strateacutegie que nous avons adopteacutee pour notre eacutetude structurale
de complexes proteacuteiques
Si on considegravere maintenant les hydrogegravenes qui sont lieacutes de maniegravere covalente agrave un atome
de carbone dans les proteacuteines dessineacutes en vert sur la Fig I 9 ces derniers ne subiront pas
d‟eacutechange isotopique dans nos conditions expeacuterimentales Seule une catalyse chimique
importante serait agrave envisager pour proceacuteder agrave l‟eacutechange isotopique de ces hydrogegravenes Mais il
semblerait qu‟il soit possible d‟eacutechanger l‟hydrogegravene de la liaison C(ε1)-H du groupement
imidazole de la chaicircne lateacuterale de lhistidine (Fig I 10) (135)
42
Fig I 10 Scheacutema de l‟acide amineacute histidine
Parmi les hydrogegravenes eacutechangeables des proteacuteines il y a
- ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (en bleu sur la Fig I 9) et des extreacutemiteacutes N-
et C-terminales (groupements amino et carboxy) qui ont des vitesses d‟eacutechange isotopique
tregraves rapides de l‟ordre de la milliseconde agrave la seconde Dans l‟eacutechelle de temps de nos
expeacuterimentations ces vitesses d‟eacutechange sont trop rapides pour que nous puissions les
observer
- les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques (en rouge sur la Fig I 9) qui ont des
vitesses d‟eacutechange isotopique plus lentes de l‟ordre de la minute agrave l‟heure et donc qui sont
compatibles avec une deacutetection par spectromeacutetrie de masse Au cours de nos expeacuteriences
HDXMS nous allons par conseacutequent nous inteacuteresser aux eacutechanges isotopiques de ces
hydrogegravenes
Dans une proteacuteine tous les acides amineacutes agrave l‟exception de la proline et du premier reacutesidu
de la chaicircne polypeptidique possegravedent un groupement amide N-H de liaison Il est par
conseacutequent possible d‟obtenir des informations structurales tout le long de la chaicircne
polypeptidique
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de lrsquoaccessibiliteacute
des proteacuteines
La vitesse des eacutechanges isotopiques HD deacutepend de l‟accessibiliteacute au solvant mais
eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale des proteacuteines Autrement dit les hydrogegravenes
d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine tels que les boucles
et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses d‟eacutechange plus
rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au contraire
43
ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices α et les
feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent plus
lentement car ils sont proteacutegeacutes (136)
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les
proteacuteines et peptides
I2131 Deacutefinition du facteur chimique
Il vient d‟ecirctre dit que l‟eacutechange isotopique est plus rapide quand l‟hydrogegravene d‟amide de la
liaison peptidique est complegravetement exposeacute au solvant et non impliqueacute dans des liaisons
hydrogegravene intramoleacuteculaires stables Dans ces conditions la constante de vitesse du
remplacement de N-H par N-D (laquo exchange-in raquo) est noteacutee kch Il s‟agit du facteur chimique
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique
Pour chaque hydrogegravene d‟amide du squelette polypeptidique consideacutereacute individuellement la
valeur de kch est deacutetermineacutee selon une seacuterie de facteurs le pH la tempeacuterature et la
composition du solvant la pression la force ionique du milieu et la seacutequence locale en acides
amineacutes Nous deacutetaillerons uniquement l‟influence des trois facteurs les plus repreacutesentatifs
soit le pH (ou pD en solution deuteacutereacutee) la tempeacuterature et la seacutequence locale
Les eacutechanges isotopiques HD sont fortement deacutependants du pH ce qui est un point
extrecircmement important qui est utiliseacute pour leur analyse par spectromeacutetrie de masse La
reacuteaction peut s‟effectuer par des meacutecanismes de catalyse acide ou basique (II133) Le
facteur chimique kch s‟exprime comme suit
kch = kD3O+ [D3O+] + kOD
- [OD-] + kD2O
ougrave kD3O+ et kOD- sont les constantes d‟eacutechange en catalyse acide et en catalyse basique
respectivement
Des eacutetudes sur des peptides modegraveles des polyalanines ont montreacute que kOH- est supeacuterieure
d‟un facteur 108 agrave kH3O+ (137) Le pH influence donc les vitesses d‟eacutechange qui sont
44
principalement conditionneacutees par les ions OH- pour des pH supeacuterieurs agrave 3 et par les ions H3O
+
pour des pH infeacuterieurs agrave 3
Ainsi la constante de vitesse d‟eacutechange kch peut ecirctre relieacutee au pD (Fig I 11) Le minimum
d‟eacutechange se produit pour un pD voisin de 2-3 pour lequel les eacutechanges dus agrave la catalyse
acide sont eacutequivalents agrave ceux dus agrave la catalyse basique (pDmin)
pH
T(degC)
Fig I 11 Scheacutema repreacutesentant le taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium en fonction du pH
La plupart des hydrogegravenes eacutechangeables des chaicircnes lateacuterales ont des pHmin plus grands
que ceux des hydrogegravenes d‟amide Ainsi lorsque le pH est ajusteacute agrave 25 pour minimiser
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse les hydrogegravenes
des chaicircnes lateacuterales continuent de s‟eacutechanger par catalyse acide agrave l‟exception des Hε et Hη de
l‟arginine
Les vitesses d‟eacutechange HD sont eacutegalement deacutependantes de la tempeacuterature Elles sont
multiplieacutees par trois pour chaque increacutement de 10degC (138) Ainsi lorsque l‟on veut minimiser
les eacutechanges une diminution de la tempeacuterature de 20degC agrave 0degC conduit agrave une diminution de la
vitesse d‟eacutechange d‟un facteur 10 ce qui n‟est pas neacutegligeable
Le facteur chimique kch est principalement affecteacute par des changements de tempeacuterature En
effet la constante d‟ionisation de l‟eau varie avec la tempeacuterature alteacuterant les concentrations
de catalyseurs disponibles pour l‟eacutechange Par ailleurs agrave basse tempeacuterature les coefficients de
diffusion sont eacutegalement modifieacutes et la probabiliteacute de collision entre le donneur de proton et
45
le receveur diminue conduisant agrave un nombre de transfert (et donc un taux d‟eacutechange) moins
grand Le facteur chimique kch s‟exprime donc plutocirct comme suit
kch (t) = kD3O+ (t) [D3O+] + kOD
- (t) [OD-] + kD2O (t)
Les expeacuteriences d‟eacutechange HD s‟effectuent agrave pD physiologique pendant des temps
d‟incubation dans D2O variables et agrave une tempeacuterature adapteacutee agrave la proteacuteine d‟inteacuterecirct Pour ne
garder que les deuteacuteriums eacutechangeacutes avec les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques et
donc pour s‟affranchir de ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes la proteacuteine est remise
dans de l‟eau leacutegegravere (H2O) avant analyse Les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales sont alors
rapidement reacute-eacutechangeacutes en hydrogegravenes Mais cette eacutetape doit ecirctre controcircleacutee afin de ne pas reacute-
eacutechanger eacutegalement les deuteacuteriums d‟amide en hydrogegravenes Ainsi pour diminuer au
maximum les vitesses d‟eacutechange la reacuteaction d‟eacutechange est arrecircteacutee en ajoutant de l‟eau (H2O)
agrave pH acide (25) et en diminuant brusquement la tempeacuterature de l‟eacutechantillon (0degC) C‟est
cette approche de deacutemarquage dans H2O des chaicircnes lateacuterales avant analyse que nous avons
choisie pour ma thegravese D‟autres approches peuvent neacuteanmoins ecirctre envisageacutees comme le
marquage de la proteacuteine suivie de l‟analyse de tous les deuteacuteriums (139) Dans ce dernier cas
il ny a pas d‟eacutetape de deacutemarquage
Enfin les vitesses d‟eacutechanges des hydrogegravenes d‟amide dans une proteacuteine ou dans un
peptide sont sensibles aux effets de blocage steacuterique ou inductif lieacutes agrave la preacutesence proche de
certaines chaicircnes lateacuterales (138 140) Les effets inductifs sont dus principalement agrave la
preacutesence de groupements voisins attracteurs d‟eacutelectrons (chaicircnes lateacuterales polaires) qui vont
augmenter l‟aciditeacute des protons d‟amide en diminuant le pK favorisant la deacuteprotonation
Dans le cas d‟une catalyse basique la vitesse d‟eacutechange est donc augmenteacutee Les effets
d‟encombrement steacuterique sont quant agrave eux lieacutes agrave la preacutesence de reacutesidus aliphatiques
(isoleucine par exemple) ou aromatiques Les chaicircnes lateacuterales de ces amides amineacutes bloquent
steacuteriquement l‟interaction entre le catalyseur et le squelette polypeptidique ralentissant
l‟eacutechange
L‟additiviteacute de ces deux pheacutenomegravenes a eacuteteacute eacutetudieacutee en deacutetails et a permis d‟eacutetablir une
eacutequation pour kch tenant compte de facteurs correctifs associeacutes agrave la nature des chaicircnes lateacuterales
des acides amineacutes voisins (agrave droite et agrave gauche du reacutesidu d‟inteacuterecirct) pour une catalyse acide A
ou basique B
46
kch (t) = kD3O+ (t) (Agauche x Adroite) [D3O+] + kOD
- (t) (Bgauche x Bdroite) [OD-]
+ kD2O (t) (Bgauche x Bdroite)
I2133 Catalyse de la reacuteaction
Les eacutechanges peuvent se produire soit par catalyse basique soit par catalyse acide (Fig I
12) Dans les conditions physiologiques dans lesquelles les proteacuteines et les peptides se
trouvent geacuteneacuteralement la catalyse basique est la plus freacutequente
Fig I 12 Catalyse basique ou acide permettant lrsquoeacutechange isotopique drsquoun hydrogegravene drsquoamide
sur le squelette polypeptidique
La premiegravere eacutetape en catalyse basique est l‟abstraction d‟un proton amidique par un ion
hydroxyde (OD-) et formation d‟un anion imidate Cet imidate est ensuite reprotoneacute par D2O
pour proceacuteder agrave l‟eacutechange Nous venons de voir preacuteceacutedemment que le facteur chimique kch est
minimal pour un pDasymp25 Au-delagrave d‟un pD eacutegal agrave 4 il augmente d‟un ordre de grandeur
(facteur 10) avec chaque uniteacute de pD atteignant des valeurs de l‟ordre de 103 s
-1 pour un pD
de 9 (141) (Fig I 11) La possibiliteacute de reacutegler kch en controcirclant la basiciteacute du solvant est
cruciale dans beaucoup de strateacutegies HDXMS
I2134 Cineacutetique drsquoeacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de
protection
Comme la vitesse d‟eacutechange N-H N-D est moduleacutee par les proprieacuteteacutes
conformationnelles des proteacuteines il devient alors possible d‟utiliser la technique des eacutechanges
isotopiques HD pour les eacutetudes structurales Les reacutegions structureacutees possegravedent une multitude
de liaisons hydrogegravenes intramoleacuteculaires N-Hhellip
O=C qui sont autant de sites proteacutegeacutes
difficilement accessibles par les moleacutecules de solvant Les vitesses d‟eacutechange isotopique vont
47
donc varier consideacuterablement selon l‟implication de l‟hydrogegravene concerneacute dans des structures
secondaires stables (142) ou la flexibiliteacute de la reacutegion peptidique agrave laquelle il appartient (141)
ou encore suivant sa distance par rapport agrave la surface de la proteacuteine (143) Ces diffeacuterents
facteurs contribuent agrave la protection des hydrogegravenes d‟amide telle que la constante de vitesse
globale d‟eacutechange kHDX soit bien infeacuterieure agrave kch Le facteur de protection P correspondant est
donneacute par la formule qui suit
P= kchkHDX
ougrave kHDX est la constante de vitesse globale d‟eacutechange d‟un hydrogegravene d‟amide donneacute dans la
conformation native d‟une proteacuteine et kch la constante de vitesse d‟eacutechange de l‟hydrogegravene
concerneacute si celui-ci se trouvait dans un peptide non structureacute P est la probabiliteacute que
l‟hydrogegravene en question soit proteacutegeacute agrave l‟accegraves du solvant (et aux catalyseurs) P est alors
deacutependant de l‟accessibiliteacute au solvant et de la participation de l‟hydrogegravene concerneacute agrave des
liaisons hydrogegravene Le facteur de protection peut exceacuteder parfois la valeur de 106 pour une
proteacuteine dans sa conformation native replieacutee
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique drsquoeacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines
Neacuteanmoins mecircme un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute peut ecirctre eacutechangeacute En effet une proteacuteine
en solution est une moleacutecule dynamique Autrement dit mecircme dans son eacutetat natif replieacute elle
peut subir des fluctuations conformationnelles reacutesultant de son deacutepliement pendant un temps
tregraves court L‟eacutechange isotopique d‟un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute ne peut donc avoir lieu que
lorsque la proteacuteine adopte des d‟eacutetats intermeacutediaires transitoires deacuteplieacutes Ce deacutepliement peut
ecirctre localiseacute ou impliquer la proteacuteine dans sa globaliteacute Les constantes de vitesse du
deacutepliement et du repliement sont deacutesigneacutees par k1 et k-1 respectivement et le meacutecanisme
geacuteneacuteral de l‟eacutechange peut ecirctre deacutecrit comme suit
avec l‟existence d‟une combinaison unique de valeurs de k1 k-1 et pour chaque hydrogegravene
d‟amide En accord avec ce modegravele l‟eacutechange isotopique ne peut avoir lieu qu‟apregraves une
rupture transitoire des liaisons intramoleacuteculaires de la proteacuteine replieacutee rendant les hydrogegravenes
48
d‟amide eacutechangeables Puis la proteacuteine se replie pour revenir agrave un eacutetat natif La constante de
vitesse globale d‟eacutechange kHDX est donneacutee par la formule suivante
Deux modegraveles de cineacutetique EX1 et EX2 (123 144) sont discuteacutes agrave partir de ce meacutecanisme
d‟eacutechange Le premier modegravele (EX1) (Fig I 13) est caracteacuteriseacute par
kch gtgt k-1gt k1
impliquant que tous les hydrogegravenes d‟amide sont eacutechangeacutes avant le repliement de la proteacuteine
au cours du tout premier eacuteveacutenement de deacutepliement L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc
le deacutepliement de la proteacuteine ce qui se traduit par
kHDX= k1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 13 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX1
Inversement le second modegravele (EX2) (Fig I 14) est caracteacuteriseacute par
k-1 gtgt kchgtgt k1
menant agrave l‟expression
kHDX= K1kch
ougrave K1=k1k-1 est le constante d‟eacutequilibre de deacutepliement de la proteacuteine native Comme la
proteacuteine se replie plus vite qu‟elle n‟eacutechange la probabiliteacute d‟eacutechange pendant un seul
49
eacuteveacutenement deacutepliementrepliement est faible L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc la
vitesse d‟eacutechange kch et l‟eacutechange d‟un hydrogegravene a geacuteneacuteralement lieu apregraves un grand nombre
d‟eacutetapes de deacutepliementrepliement Dans ce modegravele le facteur de protection est donneacute par
P= K1-1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 14 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX2
Dans des conditions physiologiques le premier modegravele (EX1) est moins freacutequent que le
second (EX2) Les vitesses d‟eacutechange par le meacutecanisme EX2 deacutependent de maniegravere lineacuteaire
de la concentration en catalyseurs alors que dans le meacutecanisme EX1 la vitesse ne varie pas
avec la quantiteacute de catalyseurs Ce dernier est geacuteneacuteralement forceacute par l‟utilisation de
conditions deacutenaturantes telles que des tempeacuteratures ou un pH eacuteleveacutes ou encore par
l‟utilisation de chaotropes On peut neacuteanmoins rencontrer le cas de proteacuteines pour lesquelles
diffeacuterentes reacutegions s‟eacutechangent simultaneacutement avec des cineacutetiques d‟ordre 1 (modegravele EX1) et
2 (modegravele EX2) Par ailleurs il ne faut pas perdre de vue que mecircme une proteacuteine native peut
preacutesenter des hydrogegravenes d‟amide non proteacutegeacutes de faccedilon permanente ie exposeacutes au solvant
et non impliqueacutes dans des liaisons hydrogegravene L‟eacutechange agrave ces sites est reacutealiseacute sans
deacutepliement de la proteacuteine la vitesse y est alors plus rapide (kHDXasympkch)
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines
Pour mesurer un taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans une proteacuteine en condition
laquo exchange-in raquo la premiegravere eacutetape consiste agrave l‟exposer agrave du deuteacuterium Il existe deux grandes
strateacutegies d‟incorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines L‟exposition aux deuteacuteriums
peut ecirctre reacutealiseacutee de maniegravere continue (marquage continu) ou pulseacutee (marquage pulseacute) La
meacutethode sera choisie en fonction du type d‟information que l‟on souhaite obtenir (145)
50
I221 Marquage continu
Il s‟agit de la meacutethode la plus simple utiliseacutee dans la plupart des eacutetudes HDXMS Elle
consiste agrave diluer d‟un facteur quinze agrave vingt une proteacuteine qui se trouve initialement dans son
tampon hydrogeacuteneacute dans un tampon identique mais contenant 100 de D2O (146)
L‟incorporation des deuteacuteriums est alors suivie en fonction du temps d‟exposition de la
proteacuteine en condition native dans le D2O Une dilution d‟au moins un facteur quinze permet
de s‟assurer qu‟une fois qu‟un hydrogegravene est remplaceacute par un deuteacuterium la reacuteaction ne
revient pas en arriegravere
Le marquage continu est alors poursuivi jusqu‟agrave ce que le temps maximum d‟exposition
aux deuteacuteriums choisi initialement soit atteint Typiquement il varie des minutes aux heures
(parfois mecircme aux jours) En pratique des aliquotes de la solution sont preacuteleveacutes
reacuteguliegraverement leur reacuteaction est brusquement arrecircteacutee et l‟analyse se fait par spectromeacutetrie de
masse
Au cours de l‟eacutechange la masse de la proteacuteine augmente progressivement avec
l‟incorporation en deuteacuteriums selon les paramegravetres de cineacutetique deacutecrits preacuteceacutedemment Les
reacutegions preacutesentant une conformation deacuteplieacutee pendant un temps tregraves long subiront des
eacutechanges plus rapides que d‟autres reacutegions ayant une conformation plus compacte D‟apregraves le
meacutecanisme geacuteneacuteral de l‟eacutechange le marquage continu permet d‟obtenir essentiellement des
informations sur la dynamique conformationnelle des proteacuteines dans des conditions
d‟eacutequilibre plutocirct que sur leur structure agrave proprement parler Cependant il existe un lien
eacutevident entre ces deux aspects En effet des reacutegions hautement structureacutees sont geacuteneacuteralement
moins dynamiques que des reacutegions deacutesordonneacutees
I222 Marquage pulseacute
Le marquage pulseacute est quant agrave lui essentiellement utiliseacute pour eacutetudier les meacutecanismes de
repliement des proteacuteines ainsi que pour deacutetecter et caracteacuteriser des eacutetats intermeacutediaires
transitoires (147)
Dans les expeacuteriences de marquage pulseacute une proteacuteine initialement deacutenatureacutee est
rapidement transfeacutereacutee dans un solvant approprieacute permettant le deacuteclenchement du processus de
51
repliement A des temps bien deacutefinis au cours de la reacuteaction la proteacuteine est ensuite exposeacutee agrave
du deuteacuterium pendant un temps tregraves court (typiquement 10 s ou moins) Comme le temps de
marquage est tregraves court seuls les hydrogegravenes d‟amide accessibles et eacutechangeables facilement
(ceux qui sont dans les parties non structureacutees de la proteacuteine ou dans les parties les plus
accessibles au solvant) sont deuteacutereacutes Des seacuteries de mesures sont effectueacutees en faisant varier
l‟intervalle de temps entre l‟initiation du repliement et le pulse de deuteacuterium De cette faccedilon
il est possible d‟obtenir des aperccedilus deacutetailleacutes de la seacutequence temporelle des eacuteveacutenements qui
conduisent la proteacuteine d‟un eacutetat deacuteplieacute agrave sa conformation native Les pulses de deuteacuterium
requiegraverent des conditions basiques (pD 8-10) pour s‟assurer qu‟un grand nombre d‟eacutechanges
isotopiques se produisent pendant l‟eacutetape courte de marquage La reacuteaction de marquage est
arrecircteacutee par une rapide baisse du pH et de la tempeacuterature (agrave pH 25 et agrave 0degC) de la solution ou
par l‟eacutevaporation du solvant pendant le processus d‟ionisation par eacutelectrospray lors
d‟expeacuteriences laquo on-line raquo HDXMS L‟usage d‟un systegraveme automatiseacute est neacutecessaire pour
reacutealiser des pulses sur des temps tregraves courts (lt 10 ms) et acceacuteder ainsi agrave des dynamiques tregraves
rapides
La deacutenaturation preacutealable de la proteacuteine est effectueacutee par l‟addition d‟un agent qui va
perturber sa structure (148) Ces agents sont geacuteneacuteralement des chaotropes mais peuvent
eacutegalement ecirctre des ligands qui vont venir se fixer sur la proteacuteine ou un simple changement de
tempeacuterature ou de pH
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par
spectromeacutetrie de masse
Les eacutechanges HD en solution sont donc devenus ces derniegraveres deacutecennies un outil
technique puissant pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines (149) Alors que la
plupart des eacutetudes HDX initiales utilisaient la RMN agrave haute reacutesolution (32) comme meacutethode
pour le suivi des cineacutetiques d‟eacutechange HD la spectromeacutetrie de masse occupe deacutesormais une
place de choix (150-153)
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN
C‟est le deacuteveloppement de meacutethodes de spectroscopie RMN multidimensionnelle de haute
reacutesolution (154-155) qui a permis d‟exploiter toute la puissance de la technique HDX (156)
52
La RMN est resteacutee pendant longtemps l‟outil de choix pour suivre les eacutechanges HD car de
ces deux isotopes seul l‟hydrogegravene conduit agrave un signal deacutetectable Ainsi remplacer des
hydrogegravenes d‟amide par des deuteacuteriums peut ecirctre facilement suivi en observant la disparition
des signaux correspondant dans les spectres RMN L‟analyse des eacutechanges HD par RMN
devient alors facile une fois que tous les signaux ont eacuteteacute attribueacutes Par ailleurs elle est reacutealiseacutee
en solution dans la continuiteacute du marquage rendant son interpreacutetation aiseacutee Un profil de
deuteacuteration en solution est observeacute en solution n‟engendrant pas de problegravemes quelconques
L‟eacutechange d‟un hydrogegravene par un deuteacuterium conduisant agrave un increacutement de masse de 1 Da
peut eacutegalement ecirctre suivi de maniegravere tregraves simple par spectromeacutetrie de masse Cette technique
plus reacutecente offre par ailleurs plusieurs avantages importants par rapport agrave la RMN Elle
permet des analyses plus rapides sur des systegravemes plus complexes tant par la diversiteacute que par
la taille avec moins de mateacuteriel initialement Neacuteanmoins l‟association HDXMS n‟atteint que
rarement la haute reacutesolution spatiale facilement accessible par la technique HDXRMN La
spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) est reacutecemment apparue comme une solution agrave ce
problegraveme faisant de la technique HDX-MSMS un candidat potentiel pour devenir une
meacutethode de choix pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo
Comme il a eacuteteacute dit preacuteceacutedemment la strateacutegie du marquage continu est choisie pour la
plupart des eacutetudes en HDXMS Elle consiste agrave suivre le taux de deuteacuteration des proteacuteines en
fonction de leur temps d‟exposition t agrave D2O pour deacutetecter le plus souvent des diffeacuterences en
reacuteponse agrave des modifications chimiques ou expeacuterimentales (157-158) agrave la liaison de ligands
(159-160) ou encore agrave la formation de complexes (161) L‟incorporation des deuteacuteriums peut
ecirctre mesureacutee au niveau de la proteacuteine entiegravere (eacutechange global) etou pour des courts segments
proteacuteiques (eacutechange local) Seulement la mesure de l‟eacutechange global ne preacutesente aucune
reacutesolution spatiale puisque elle est reacutealiseacutee pour l‟ensemble des hydrogegravenes d‟amide de la
proteacuteine Les expeacuteriences spatialement reacutesolues apportent quant agrave elles des informations sur
le comportement vis-agrave-vis de la deuteacuteration de reacutegions speacutecifiques de la proteacuteine
53
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS
Les expeacuteriences spatialement reacutesolues deacuterivent pour la plupart de l‟approche classique de
fragmentation enzymatique en solution (146 162-163) appeleacutee approche laquo bottom-up raquo La
digestion des proteacuteines par des proteacuteases conduisant agrave des fragments peptidiques pour
lesquels le taux d‟eacutechange peut ecirctre calculeacute a permis une premiegravere ameacutelioration de la
reacutesolution de l‟approche (164-166) La digestion proteacuteolytique a ensuite eacuteteacute associeacutee agrave une
seacuteparation chromatographique en phase liquide coupleacutee en ligne agrave la spectromeacutetrie de masse
(LC-MS) (141 167) Dans le cadre de l‟analyse des eacutechanges HD par LC-MS des meacutethodes
chromatographiques de courte dureacutee et agrave basse tempeacuterature doivent ecirctre impeacuterativement mises
au point afin de minimiser le laquo back-exchange raquo (168-169) Pour reacutealiser une analyse rapide
des colonnes courtes sont utiliseacutees Bien qu‟elles ne permettent qu‟une seacuteparation grossiegravere
des peptides elles limitent neacuteanmoins le deacutemarquage L‟utilisation de la spectromeacutetrie de
masse agrave tregraves haute reacutesolution est importante car elle peut permettre une identification plus
fiable des peptides sur la base de leur masse preacutecise L‟approche classique est dutiliser une
seacuteparation par HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo) et de placer toute la
chaicircne chromatographique dans une armoire reacutefrigeacutereacutee Notons quun systegraveme commercial
optimiseacute pour limiter leacutechange inverse a eacuteteacute deacuteveloppeacute reacutecemment par la socieacuteteacute Waters Le
choix d‟une meacutethode HPLC et non d‟une chaicircne de nano-chromatographie liquide conduit agrave
utiliser une quantiteacute importante d‟eacutechantillon C‟est la raison pour laquelle notre eacutequipe a mis
au point une approche par nano-LC pour l‟eacutetude des eacutechanges HD en solution Ce travail a
fait lobjet dune partie de la thegravese de Magalie Duchateau au laboratoire Les diffeacuterents
systegravemes d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse seront plus
deacutetailleacutes dans le Chap IV Le plus souvent les peptides sont analyseacutes en utilisant
l‟eacutelectrospray comme mode d‟ionisation (LCESI-MS) La technique MALDI-MS est moins
communeacutement utiliseacutee (170-172)
Choix des enzymes
Bien eacutevidemment la proteacuteolyse doit ecirctre reacutealiseacutee dans les conditions expeacuterimentales de
l‟arrecirct de la reacuteaction (agrave pH final 25 et agrave 0degC) afin d‟empecirccher l‟eacutechange inverse (D H)
avant l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Il est par conseacutequent neacutecessaire d‟utiliser
des proteacuteases acides L‟enzyme la plus couramment utiliseacutee pour ce type d‟expeacuteriences est la
pepsine (173) Cette enzyme est non speacutecifique contrairement agrave la trypsine ou la
chymotrypsine mais elle est active dans les conditions expeacuterimentales requises et peut geacuteneacuterer
de nombreux peptides chevauchants permettant de localiser des zones d‟inteacuterecirct avec une
54
meilleure reacutesolution Cependant cette faible speacutecificiteacute (174) rend neacutecessaire une eacutetape
preacutealable aux eacutechanges HD d‟identification des peptides obtenus par spectromeacutetrie de masse
en tandem
La reacutesolution spatiale attendue avec l‟approche de digestion enzymatique agrave la pepsine est
de l‟ordre de 5 agrave 10 acides amineacutes Elle est limiteacutee par la taille des fragments geacuteneacutereacutes par
l‟eacutetape de digestion et le nombre de peptides chevauchants En revanche l‟utilisation de
proteacuteases immobiliseacutees sur des colonnes semble permettre d‟une part de standardiser le
protocole HDXMS et d‟autre part dans certains cas d‟atteindre une reacutesolution spatiale
proche de l‟acide amineacute pregraves (175-176) Notons le deacuteveloppement reacutecent d‟une nouvelle
approche baseacutee sur une digestion agrave la pepsine mais utilisant des conditions de haute pression
(177) semblant encore ameacuteliorer les reacutesultats
D‟autres proteacuteases acides peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutees mais les conditions
expeacuterimentales imposent qu‟elles soient capables de digeacuterer leur substrat en moins de cinq
minutes afin de minimiser l‟eacutechange inverse L‟utilisation combineacutee de diffeacuterentes proteacuteases
permet de geacuteneacuterer un grand nombre de peptides chevauchants et ainsi d‟augmenter
consideacuterablement la reacutesolution spatiale (178) La proteacutease de type XIII d‟Aspergillus saitoi
(179) ainsi que celle de type XVIII extraite des diffeacuterentes espegraveces de Rhizopus (178) ou
encore plus reacutecemment la plasmepsine II de Plasmodium falciparum (180) peuvent ecirctre
utiliseacutees dans les eacutetudes HDXMS (172 179 181-182) Par ailleurs une version recombinante
de la proteacutease de type XVIII vient d‟ecirctre mise au point Elle permettrait l‟utilisation d‟un
rapport enzymeproteacuteine beaucoup plus faible qu‟avec la version sauvage (183)
Une meacutethode permettant de geacuteneacuterer un tregraves grand nombre de peptides chevauchants baseacutee
sur l‟utilisation de deux proteacuteases acides et de les identifier efficacement et preacuteciseacutement a
reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee pour les analyses HDXMS (184-185) La difficulteacute de lanalyse
du fait de la grande quantiteacute de donneacutees geacuteneacutereacutees par la proteacuteolyse (nombreux peptides
chevauchants) combineacutee agrave la complexiteacute des informations obtenues par HDX (incorporation
des deuteacuteriums perte du marquage) a encourageacute le deacuteveloppement d‟une plateforme ougrave les
expeacuteriences et le traitement de donneacutees sont totalement automatiseacutes (186)
Problegraveme de leacutechange inverse
Malgreacute une optimisation des conditions expeacuterimentales (diminution du pH et de la
tempeacuterature de l‟eacutechantillon ainsi que du temps d‟analyse) le pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse
55
reste un problegraveme crucial lors des eacutetapes de digestion proteacuteolytique et d‟analyse des
fragments peptidiques En effet chaque clivage enzymatique conduit agrave une perte
d‟information au niveau de deux sites eacutechangeables Les sites concerneacutes sont l‟hydrogegravene
d‟amide du squelette peptidique qui a eacuteteacute cliveacute et converti en amine libre et celui adjacent agrave
l‟extreacutemiteacute N-terminale (168) Par ailleurs le deacutemarquage peut eacutegalement avoir lieu au cours
de l‟eacutetape de digestion Or la perte totale de la deuteacuteration au niveau de sites particuliers tels
que ceux proteacutegeacutes par une interaction proteacuteine-partenaire signifierait que les surfaces
d‟interaction de macroassemblages ne pourraient pas ecirctre deacutetermineacutees par cette approche
C‟est la raison pour laquelle plusieurs tentatives de correction systeacutematique du laquo back-
exchange raquo ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees (187) Une meacutethode de reacuteajustement a ainsi eacuteteacute deacutecrite par
Zhang et al (141) Briegravevement elle consiste agrave mesurer le taux d‟eacutechange de peptides
complegravetement deuteacutereacutes et agrave le comparer agrave la reacutefeacuterence sans eacutechange Les analyses sont
reacutealiseacutees dans les mecircmes conditions de digestion et de seacuteparation par HPLC Le facteur de
correction du laquo back-exchange raquo relative agrave l‟expeacuterience est alors deacutetermineacute Mais cela
implique que le deacutemarquage soit identique pour tous les sites eacutechangeables ce qui n‟est pas le
cas (I2132) Le taux d‟eacutechange inverse est consideacuterablement diffeacuterent d‟un site agrave un autre
site et donc d‟un peptide agrave un autre peptide Il peut neacuteanmoins ecirctre preacutedit pour des peptides
non structureacutes en utilisant les paramegravetres de calcul de kch suivant la formule donneacutee au
I2132 (188)
Exemples de complexes proteacuteiques analyseacutes
Malgreacute les problegravemes poseacutes par l‟eacutechange inverse et la reacutesolution relativement faible de
l‟approche un des avantages majeurs des approches laquo bottom-up raquo est leur utilisation pour
l‟eacutetude de complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire puisque ce sont des peptides issus d‟une
digestion enzymatique qui sont analyseacutes Ainsi cette approche a eacuteteacute utiliseacutee par l‟eacutequipe de
V Wysocki afin d‟eacutetudier des complexes proteacuteiques proteacuteine chaperonne-substrat et ainsi de
mieux comprendre leur meacutecanisme d‟action (I113) (189) Il s‟agit de proteacuteines s‟associant
pour former des oligomegraveres de tregraves haut poids moleacuteculaire Les complexes qui ont eacuteteacute
analyseacutes par la technique HDXMS coupleacutee agrave une approche laquo bottom-up raquo sont les suivants
TaHsp169-MDH (gt 1000 kDa) et PsHsp181-MDH (~600-700 kDa) Un pourcentage de
couverture peptidique de 100 a eacuteteacute obtenu pour les deux proteacuteines Par ailleurs une eacutetude
du complexe Arp23 avait permis de mettre en eacutevidence finement des modifications de
structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave l‟ATP ou agrave des proteacuteines activatrices telles
que les proteacuteines WASp en utilisant l‟approche par marquage avec les radicaux hydroxyles
(75) (I1225) Plus reacutecemment le complexe Arp23 a eacuteteacute analyseacute par une approche
56
compleacutementaire HDXMS afin de mettre en eacutevidence des modifications de structure et de
dynamique reacutesultant de l‟activation par les proteacuteines WASp et de comparer les reacutesultats avec
les modegraveles du meacutecanisme preacuteexistants Pour autant que nous sachions le complexe Arp23
de sept sous-uniteacutes proteacuteiques avec un poids moleacuteculaire de 220 kDa est le plus important
macroassemblage jamais eacutetudieacute par HDXMS Ceci a eacuteteacute possible gracircce agrave une analyse par
laquo bottom-up raquo (190)
Comment ameacuteliorer la reacutesolution
Une faccedilon d‟augmenter la reacutesolution des approches bottom-up serait de recourir agrave la
fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques afin de localiser plus preacuteciseacutement
les deuteacuteriums dans la seacutequence D‟une maniegravere geacuteneacuterale la fragmentation peut ecirctre reacutealiseacutee
de diffeacuterentes maniegraveres dans un spectromegravetre de masse Tout d‟abord il est possible de
fragmenter les ions dans la source (laquo In-Source Decay raquo ou ISD) en les acceacuteleacuterant dans une
reacutegion de haute pression mais ce processus ne conduit agrave aucune seacutelectiviteacute et pose donc des
problegravemes quant agrave l‟analyse des meacutelanges La spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS)
peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour la dissociation des peptides Elle est adapteacutee agrave l‟eacutetude des
meacutelanges apporte des informations structurales de qualiteacute et est doteacutee d‟une grande
sensibiliteacute Elle consiste agrave seacutelectionner un ion preacutecurseur par un premier analyseur agrave le
fragmenter (par diffeacuterentes techniques d‟activation) et agrave analyser les fragments obtenus agrave
l‟aide d‟un autre analyseur (le mecircme pour les instruments de type trappe ionique)
Neacuteanmoins comme cela sera deacutetailleacute dans le paragraphe suivant le choix de la technique
d‟activation pour des peptides deuteacutereacutes est tregraves important pour obtenir des informations
valables
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques
L‟objectif des expeacuteriences de MSMS sur les peptides deuteacutereacutes est de pouvoir preacuteciseacutement
localiser les deuteacuteriums incorporeacutes dans la seacutequence au niveau des diffeacuterents hydrogegravenes
d‟amide afin d‟obtenir une reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves En theacuteorie la spectromeacutetrie de
masse en tandem constitue donc un moyen inteacuteressant et simple pour ameacuteliorer la reacutesolution
des approches HDXMS
Il existe diffeacuterents modes d‟activation susceptibles d‟ecirctre utiliseacutes pour fragmenter les
peptides Dans une approche proteacuteomique classique la meacutethode de dissociation induite par
57
collision (CID) est largement preacutefeacutereacutee Le principe consiste agrave fragmenter la moleacutecule par
collision avec un gaz inerte (heacutelium diazote argon ou xeacutenon) Malheureusement dans le
cadre d‟eacutetudes HDXMS ces meacutethodes conventionnelles de fragmentation par activation
collisionnelle de proteacuteines et peptides protoneacutes ont rapidement eacuteteacute eacutecarteacutees En effet bien que
la litteacuterature soit contradictoire il a eacuteteacute montreacute qu‟elles conduisent tregraves souvent agrave une
redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums partielle ou totale le long de la chaicircne polypeptidique
(y compris au niveau des chaicircnes lateacuterales) (191-194) pendant l‟eacutetape de fragmentation Le
processus de migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes en phase gazeuse est appeleacute
laquo scrambling raquo en anglais
En fait ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo peut se produire agrave diffeacuterents endroits du
spectromegravetre de masse Le premier est lors de la deacutesolvatation des ions encore solvateacutes dans la
source dans les toutes premiegraveres eacutetapes preacuteceacutedant leur transmission vers l‟analyseur (195-
196) Une autre possibiliteacute est donc dans la cellule de collision au moment de la
fragmentation Le laquo scrambling raquo est induit par un apport d‟eacutenergie vibrationnelle conduisant
agrave un eacutechange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums avant la dissociation Il est clair que le
meacutecanisme de fragmentation des peptides protoneacutes dit meacutecanisme du proton mobile
proposeacute par Simon Gaskell (197) et Vicky Wysocki (198-200) n‟est pas en faveur d‟une
conservation de la position des deuteacuteriums d‟amide avant la fragmentation En effet ce
meacutecanisme (Fig I 15) fait l‟hypothegravese que preacutealablement agrave la fragmentation un proton
migre des sites les plus basiques de la moleacutecule vers un azote d‟amide eacutevegravenement preacutealable agrave
une cyclisation pour former des ions b et y Cette eacutetape eacutetant a priori reacuteversible les
deuteacuteriums peuvent ecirctre meacutelangeacutes avec des hydrogegravenes agrave ce moment lagrave
HN
NHO
R1
R2
OR3
R1
O
N
O
R2
H+
HN
NH2O
R1
R2
OR3
H3N Nter+
+
Nter
Cter Cter
R3
NH2
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
NH
R3
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
H3N
R3
Cter
+
ion b ion y
Proton
Mobile
Attaque
Nucleacuteophile
Reacutearrangement
Fig I 15 Formation des ions b et y (201)
58
Le laquo scrambling raquo conduit donc agrave une perte d‟information au niveau du profil de
deuteacuteration rendant l‟analyse difficilement interpreacutetable La litteacuterature indique que ce
pheacutenomegravene semble deacutependre de la seacutequence du peptide fragmenteacute (202) mais eacutegalement de
l‟eacutenergie de collision apporteacutee et de la flexibiliteacute de la chaicircne polypeptidique en phase
gazeuse (195 203) Ces deux derniers facteurs joueraient un rocircle deacuteterminant dans le
reacutearrangement aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes le long du squelette peptidique
avant la dissociation Une faible eacutenergie de collision et donc une lente activation des ions en
phase gazeuse seraient favorables agrave une migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes En
revanche la reacuteduction de la flexibiliteacute des ions proteacuteiques pourrait diminuer la mobiliteacute du
proton dans des conditions d‟activation collisionnelle de basse eacutenergie Le pheacutenomegravene du
laquo scrambling raquo a pu ecirctre mis en eacutevidence par l‟utilisation de peptides modegraveles (204-206) Le
principe des peptides seacutelectivement deuteacutereacutes deacuteveloppeacutes par T Jorgensen sera deacutetailleacute dans
le Chap II
La conclusion des eacutetudes de fragmentation par CID de peptides deuteacutereacutes est que les
meacutethodes d‟activation conduisant agrave une augmentation progressive de l‟eacutenergie vibrationnelle
(CID IRMPD SORI-CID) (195) ne peuvent pas ecirctre utiliseacutees pour localiser les deuteacuteriums
dans la seacutequence peptidique De ce fait d‟autres meacutethodes de fragmentation en phase gazeuse
ont eacuteteacute investigueacutees Parmi elles les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons telles que l‟ECD
et l‟ETD se sont reacuteveacuteleacutees tregraves prometteuses (207-209)
L‟ECD est une technique de dissociation speacutecifique des spectromegravetres de masse FT-ICR
Son principe repose sur la capture exothermique (~4-5 eV) d‟un eacutelectron par une espegravece
multichargeacutee (210) L‟ion proteacuteique multichargeacute est irradieacute par un faisceau d‟eacutelectrons de
faible eacutenergie (lt 1 eV) Apregraves capture d‟un eacutelectron l‟ion radicalaire se fragmente La
reacuteactiviteacute est diffeacuterente par rapport aux meacutethodes par activation collisionnelle en raison de la
preacutesence d‟un eacutelectron dans le systegraveme et notamment le meacutecanisme du proton mobile n‟est
pas celui qui explique la fragmentation rendant son utilisation possible pour analyser des
peptides ou des proteacuteines deuteacutereacutes (139 207 211-212) En ECD on n‟observe pas la rupture
des liaisons peptidiques (pour conduire agrave des ions b et y) ni geacuteneacuteralement la perte de
modifications post-traductionnelles labiles comme ce qui est observeacute pour l‟activation par
CID Le site de clivage quasi-speacutecifique en ECD est la liaison N-Cα entraicircnant la formation
d‟ions fragments de type c et z le plus souvent mais aussi parfois a b et y (Fig I 16) Une
charge positive eacutetant neutraliseacutee par un eacutelectron la technique d‟ECD ne peut ecirctre utiliseacutee que
sur des ions preacutecurseurs qui sont au minimum deux fois chargeacutes (doublement protoneacutes)
59
Fig I 16 Nomenclature des fragments peptidiques issus de la spectromeacutetrie de masse en
tandem
L‟ETD qui a reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee est une technique similaire agrave l‟ECD conduisant
eacutegalement agrave la formation d‟ions fragments de type c et z (213) La fragmentation repose sur
la reacuteaction ionion qui se produit entre le peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire Cet
anion se trouve seacutequestreacute dans un piegravege agrave ions Quand les deux ions se trouvent agrave une distance
suffisante il se produit le transfert d‟un eacutelectron de l‟anion vers le peptide chargeacute
positivement ce qui induit sa fragmentation L‟avantage majeur de l‟ETD est qu‟il peut ecirctre
reacutealiseacute sur une varieacuteteacute de types d‟instruments standards utilisant la radiofreacutequence d‟un champ
eacutelectrique oscillant pour pieacuteger les ions (213-215) L‟ECD quant agrave lui neacutecessite des champs
eacutelectrique et magneacutetique stables disponibles exclusivement sur des spectromegravetres de masse
FT-ICR (207 216)
Bien que le meacutecanisme des techniques ECD et ETD ne soit pas encore complegravetement
eacutelucideacute il passe par une voie alternative de fragmentation de type radicalaire dont on a pu
discuter du caractegravere ergodique ou non (217) n‟induisant pas de laquo scrambling raquo pourvu que
les paramegravetres instrumentaux soient controcircleacutes et optimiseacutes pour la minimisation du
pheacutenomegravene Il s‟agit d‟une part de minimiser les paramegravetres des optiques de transfert ionique
tels que le potentiel de deacutesolvatation des ions et la tension des lentilles du tube de transfert et
d‟autre part de minimiser l‟excitation vibrationnelle des ions pendant leur filtration et avant
leur fragmentation en augmentant le paramegravetre fenecirctre d‟isolation (207) Il a eacuteteacute montreacute que la
fragmentation des ions par ECD se produisait avant que l‟eacutenergie puisse ecirctre redistribueacutee au
niveau du site de clivage de la liaison le plus favorable (210 218-219) Cette rapide et
efficace meacutethode d‟activation conduit donc agrave une limitation du laquo scrambling raquo et permet donc
de localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence peptidique (207) Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves de l‟incorporation des deuteacuteriums a eacutegalement pu ecirctre obtenue par
60
fragmentation ETD au niveau de peptides seacutelectivement marqueacutes (208) ainsi que de peptides
proteacuteolytiques issus de la digestion enzymatique de la β2-microglobuline deuteacutereacutee (209)
L‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu est calculeacutee en faisant la diffeacuterence des contenus en
deuteacuteriums de fragments conseacutecutifs pour les seacuteries d‟ions c (c2-c1 c3-c2 hellip) et z (z2-z1 z3-z2
hellip) Une cineacutetique deacutechange HD par acide amineacute peut eacutegalement ecirctre obtenue en suivant
l‟incorporation des deuteacuteriums des ions c ou z au cours du temps
Cette approche combinant la digestion enzymatique en solution et la fragmentation ETD en
phase gazeuse est devenue tregraves reacutecemment assez robuste pour ecirctre utiliseacutee sur de vrais
systegravemes biologiques Elle a eacuteteacute complegravetement automatiseacutee en plateforme HDX (220)
La spectromeacutetrie de masse en tandem peut donc ecirctre utiliseacutee pour ameacuteliorer la reacutesolution
des expeacuteriences utilisant les eacutechanges HD La fragmentation en phase gazeuse des ions
peptidiques obtenus apregraves digestion enzymatique du systegraveme biologique dinteacuterecirct permet donc
d‟obtenir la localisation preacutecise des deuteacuteriums dans la seacutequence Pour cela elle doit ecirctre
reacutealiseacutee en utilisant des meacutethodes alternatives d‟activation par les eacutelectrons (ECD ETD) tout
en controcirclant les processus de deacutesolvatation transfert et seacutelection des ions preacutealables agrave la
fragmentation (207-208) Ces meacutethodes ayant eacutegalement fait leur preuve pour la
fragmentation de proteacuteines entiegraveres (221-222) il est rapidement apparu qu‟il serait possible de
les utiliser dans des approches dites laquo top-down raquo pour des eacutetudes HDXMS Dans cette
derniegravere approche l‟eacutetape de digestion enzymatique n‟est plus requise
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD
L‟approche laquo top-down raquo s‟affranchit donc de l‟eacutetape de proteacuteolyse et de seacuteparation des
peptides en chromatographie liquide Au lieu de cela la proteacuteine est introduite entiegravere dans le
spectromegravetre de masse et fragmenteacutee directement en phase gazeuse (223)
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD
Il existe plusieurs modes d‟activation pour la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines
entiegraveres Les meacutethodes dissociatives par capture ou transfert deacutelectron (ECD ou ETD) sont
particuliegraverement utiliseacutees dans ce type d‟approche
61
Des couvertures de seacutequence importantes peuvent ecirctre obtenues par ces approches sur
proteacuteines entiegraveres conduisant eacutegalement agrave la localisation de modifications post-
traductionnelles (MPT) (223-225) Le laboratoire pionnier dans le domaine est celui de Neil
Kelleher aux USA qui a deacuteveloppeacute une veacuteritable approche inteacutegreacutee pour lanalyse
proteacuteomique laquo top-down raquo allant de la seacuteparation des proteacuteines entiegraveres agrave lanalyse
automatiseacutee des spectres MSMS complexes obtenus lorsque lon fragmente une proteacuteine
entiegravere Ses proteacuteines de preacutedilection sont les histones petites proteacuteines de 13 kDa que lon
peut retrouver sous un grand nombre disoformes diffeacuterentes (mecircme stucture primaire mais
modifications post-traductionnelles diffeacuterentes et dynamiques) lieacutees au code des histones
Lavantage majeur des approches laquo top-down raquo en proteacuteomique est de permettre non
seulement lidentification des isoformes de proteacuteines par simple mesure de masse mais aussi
dobtenir des informations structurales (preacutesence de MPT notamment) sur lensemble de la
seacutequence Cela nest pas possible par des approches classiques par laquo bottom-up raquo car tous les
peptides issus de la digestion ne sont pas retrouveacutes lors de lanalyse
Neacuteanmoins elles preacutesentent encore certaines limitations comme leacutetape cruciale de
seacuteparation des proteacuteines entiegraveres le poids moleacuteculaire des proteacuteines qui peuvent ecirctre
fragmenteacutees et la sensibiliteacute Le problegraveme majeur rencontreacute avec les proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire est leur propension agrave se replier en phase gazeuse formant un reacuteseau de liaisons
hydrogegravene qui conduit agrave une perte defficaciteacute au niveau de la fragmentation par ECD ou
ETD En effet bien que leacutelectron soit captureacute par un site peptidique et la liaison N-Cα
rompue les deux morceaux de la proteacuteine (parties N-terminales et C-terminales) restent
lieacutees entre elles et les fragments ne peuvent ecirctre deacutetecteacutes Une solution consiste agrave introduire
une eacutetape de chauffage lent des ions (photons infrarouge par exemple) pour rompre ce reacuteseau
de liaisons hydrogegravene avant ou apregraves la capture de leacutelectron Neacuteanmoins si lapproche
fonctionne souvent bien dans le cas de proteacuteines non deuteacutereacutees elle ne peut ecirctre envisageacutee
dans le cadre des eacutetudes HDX car le chauffage lent conduira agrave un eacutechange des hydrogegravenes et
des deuteacuteriums avant la fragmentation
62
I2332 Approches top-down et HDX
Dans les eacutetudes HDX le deacuteveloppement de l‟approche laquo top-down raquo ECD ou ETD comme
meacutethodologie alternative agrave l‟approche classique de laquo bottom-up raquo semble tregraves prometteur En
effet l‟approche laquo top-down raquo permet d‟une part d‟eacuteliminer le laquo back-exchange raquo relatif aux
eacutetapes de digestion enzymatique en solution et de seacuteparation en chromatographie liquide et
d‟autre part d‟obtenir une meilleure reacutesolution spatiale tout au moins pour des proteacuteines de
petite agrave moyenne taille (211)
La faisabiliteacute d‟expeacuteriences HDX par laquo top-down raquo ECD spatialement reacutesolues a eacuteteacute
reacutecemment deacutemontreacutee par Pan et al pour l‟eacutetude d‟une proteacuteine de 17 kDa (211) Il est
eacutegalement possible gracircce agrave cette approche d‟obtenir des informations structurales au niveau
d‟espegraveces speacutecifiques en meacutelange heacuteteacuterogegravene en isolant au preacutealable un ion preacutecurseur (212)
De plus en raison de son association avec des meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons qui
limitent le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo dans des conditions expeacuterimentales bien controcircleacutees
et conduisent agrave de bonnes couvertures de seacutequence elles permettent de localiser preacuteciseacutement
la position des deuteacuteriums dans la seacutequence (Fig I 17)
La meilleure reacutesolution spatiale obtenue par l‟approche laquo top-down raquo s‟explique de la
maniegravere suivante tandis que l‟expeacuterience laquo bottom-up raquo consiste agrave cliver la proteacuteine au
niveau de plusieurs sites geacuteneacuterant des peptides de taille relativement petite l‟eacutetude laquo top-
down raquo quant agrave elle conduit agrave un seul eacuteveacutenement de fragmentation au niveau de chaque
chaicircne polypeptidique Il en reacutesulte la formation d‟une paire d‟ions compleacutementaires cz
dans le cas de la fragmentation ECD ou ETD issus de l‟extreacutemiteacute N- et C-terminale Une
reacutesolution spatiale agrave l‟acide amineacute pregraves peut donc ecirctre obtenue avec l‟approche laquo top-down raquo
car les proteacuteines en phase gazeuse sont cliveacutees une seule fois agrave diffeacuterents sites (Fig I 17)
63
Fig I 17 Scheacutema illustrant la diffeacuterence conceptuelle entre les approches MS de laquo bottom-
up raquo et laquo top-down raquo appliqueacutees aux eacutetudes HDX (226) Lrsquoapproche par fragmentation en
phase gazeuse de la proteacuteine entiegravere dite laquo top-down raquo permet de localiser preacuteciseacutement les
deuteacuteriums dans la seacutequence proteacuteique
Dans le cadre des eacutetudes HDXMS un autre avantage des approches laquo top-down raquo par
rapport agrave celles dites de laquo bottom-up raquo est le fait qu‟il est possible en theacuteorie de reconstruire
une cineacutetique d‟eacutechange par acide amineacute Cela sera deacutetailleacute dans le Chap III de ce manuscrit
Il est eacutegalement avantageux de pouvoir saffranchir des eacutetapes de digestion enzymatique et de
seacuteparation en chromatographie liquide En effet un gain de temps et une possible reacuteduction
du laquo back-exchange raquo sont des eacuteleacutements cruciaux pour ces eacutetudes
64
I2333 Limitations des approches top-down HDX
La limitation majeure de la fragmentation des proteacuteines deuteacutereacutees par ECD reste la taille
des systegravemes comme en analyse laquo top-down raquo classique De tregraves bonnes couvertures de
seacutequence peuvent ecirctre obtenues pour des proteacuteines de faible masse moleacuteculaire (lt 20 kDa)
Au-delagrave de cette valeur l‟efficaciteacute de fragmentation diminue avec le plus souvent une reacutegion
centrale de la proteacuteine peu fragmenteacutee au contraire des extreacutemiteacutes N- et C-terminales en
raison de la structuration des proteacuteines en phase gazeuse deacutecrite preacuteceacutedemment
Un autre problegraveme est d‟arriver agrave maintenir la proteacuteine entiegravere avec ses deuteacuteriums sans
qu‟elle se deacutemarque pendant le temps de l‟analyse En effet pour obtenir des couvertures de
seacutequence importantes un grand nombre de spectres doivent ecirctre accumuleacutes (ideacutealement
pendant trente minutes agrave une heure) et le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine en termes de
position des deuteacuteriums dans la seacutequence est primordial
Enfin le dernier inconveacutenient de ces approches est l‟analyse de proteacuteines reacuteelles qui
demeure compliqueacutee En effet sans seacuteparation par chromatographie liquide un dessalage des
eacutechantillons biologiques reacuteels doit se faire indeacutependamment et preacutealablement agrave lanalyse par
spectromeacutetrie de masse Il est donc effectueacute de maniegravere laquo off-line raquo et conduit
malheureusement agrave un certain deacutemarquage Par ailleurs il doit obligatoirement ecirctre reacutealiseacute agrave
froid ce qui complique le deacuteroulement des expeacuteriences
65
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79
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles
validation de lrsquoapproche combinant
eacutechanges HD et fragmentation ECD
80
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
81
II1 Introduction
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX
Comme indiqueacute dans le chapitre preacuteceacutedent un des problegravemes expeacuterimentaux majeurs lieacute
aux eacutetudes par HDX-MSMS est le laquo scrambling raquo qui correspond agrave une redistribution
aleacuteatoire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums preacutesents dans la seacutequence peptidique par des
processus qui ont lieu en phase gazeuse
Le plus connu est celui qui intervient au moment de la fragmentation par CID et qui
sexplique par le modegravele du proton mobile (1-4) Dans ce modegravele leacutenergie apporteacutee par la
collision conduit agrave une mobiliteacute du proton qui se trouve initialement sur le site le plus basique
du peptide (Lysine Arginine ou amine N-terminale) Ce proton se met donc agrave se deacuteplacer
dans le peptide pour aller vers des sites de protonation moins basiques tels que loxygegravene ou
lazote de la liaison peptidique Bien que la protonation sur lazote de lamide soit
thermodynamiquement moins favorable que la protonation sur l‟oxygegravene des carbonyles cest
ce site protoneacute qui conduit agrave la rupture de la liaison amide et agrave la formation des ions b et y La
protonation reacuteversible des atomes dazote des diffeacuterentes fonctions amides du squelette dans
le contexte dune eacutetude HDX conduit donc si lintermeacutediaire reacuteactionnel a un temps de vie
suffisamment long et si la cineacutetique de la voie retour est comparable agrave la cineacutetique de
fragmentation agrave un eacutechantillonnage du proton sur tous les amides et donc un meacutelange
complet des hydrogegravenes et des deuteacuteriums Pour eacuteviter ce pheacutenomegravene il faut (i) soit que la
protonation sur lamide ne soit pas reacuteversible (ii) soit que la dissociation de la liaison
peptidique soit plus rapide que la deacuteprotonation de lazote damide Paizs et Suhai (5) ont
eacutevalueacute la constante de vitesse de dissociation de la liaison amide par des calculs RRKM et ont
obtenu une valeur de lordre de la microseconde pour des eacutenergies internes denviron 45
kJmol soit une vitesse relativement lente due entre autre agrave la neacutecessaire cyclisation de la
partie b et donc probablement compeacutetitive avec de simples transferts de protons Ainsi de
nombreux exemples de la litteacuterature montrent quil nest pas possible dutiliser des approches
par CID pour localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans des peptides marqueacutes car le
laquo scrambling raquo qui a lieu avant la fragmentation est total (6-11)
Neacuteanmoins il est curieux de constater que certaines eacutetudes arrivent agrave des conclusions
opposeacutees A titre dexemple il a eacuteteacute montreacute par Deng et al pour une seacuterie de peptides issus de
82
la digestion du cytochrome C de cheval (12) ou par Kim et al sur des fragments peptidiques
de thioreacutedoxine oxydeacutee et reacuteduite d‟E coli (13-14) que les ions b preacutesentaient un
laquo scrambling raquo modeacutereacute alors que les ions y correspondants preacutesentaient au contraire un
laquo scrambling raquo total Des reacutesultats similaires deacutecrivant un pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
partiel ont eacutegalement eacuteteacute obtenus sur des proteacuteines entiegraveres (15-17)
Ce qui semble ressortir de ces articles est que les conditions expeacuterimentales utiliseacutees et la
seacutequence des peptides jouent un rocircle tregraves important sur le type de reacutesultat qui est obtenu Dans
ce contexte mieux comprendre les diffeacuterents facteurs affectant le reacutearrangement aleacuteatoire des
hydrogegravenes et des deuteacuteriums dans la seacutequence avant la fragmentation semble un point crucial
pour pouvoir deacutevelopper des approches de spectromeacutetrie de masse tandem robustes en HDX
Neacuteanmoins le problegraveme majeur pour reacutealiser de telles eacutetudes est de disposer dun systegraveme
modegravele permettant de caracteacuteriser la preacutesence du meacutelange entre les hydrogegravenes et les
deuteacuteriums quil soit partiel ou total
Cest le groupe de T Joslashrgensen au Danemark qui a reacutesolu ce problegraveme en mettant au
point des peptides modegraveles qui peuvent ecirctre deuteacutereacutes seacutelectivement sur leur extreacutemiteacute N-
terminale ou C-terminale Lutilisation de ces peptides lui a ainsi permis de montrer (i) quen
controcirclant finement un certain nombre de paramegravetres expeacuterimentaux et (ii) en utilisant des
meacutethodes dactivation baseacutees sur le transfert ou la capture dun eacutelectron (ECDETD) il eacutetait
possible de limiter consideacuterablement le laquo scrambling raquo et localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums
dans la seacutequence (18-19)
II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
Les premiers travaux publieacutes par T Joslashrgensen sont baseacutes sur lutilisation dun peptide qui
peut ecirctre marqueacute au deuteacuterium de maniegravere seacutelective gracircce agrave linteraction dune partie de sa
seacutequence avec un reacutecepteur La partie en interaction avec la proteacuteine eacutetant masqueacutee ne
conduit agrave aucun eacutechange HD alors que la partie libre eacutechange facilement ses hydrogegravenes
damide pour des deuteacuteriums (20) Neacuteanmoins il est vite apparu que le modegravele eacutetait trop
compliqueacute agrave manipuler et neacutecessitait decirctre simplifieacute
83
Pour ce faire T Joslashrgensen a deacutecideacute de maniegravere tout agrave fait astucieuse de mettre agrave profit le
fait quen solution les hydrogegravenes damide du squelette peptidique ont des vitesses deacutechange
avec le solvant qui varient fortement en fonction des acides amineacutes voisins pour construire
des peptides qui peuvent ecirctre seacutelectivement deuteacutereacutes Linfluence des reacutesidus voisins peut ecirctre
soit dordre steacuterique soit dordre inductif (21) A titre dexemple lhydrogegravene dun amide se
trouvant entre deux isoleucines eacutechange dix fois moins vite quun hydrogegravene damide situeacute
entre deux alanines Ces vitesses deacutechange ont eacuteteacute mesureacutees par des expeacuteriences de
spectroscopie RMN (22) Thomas Joslashrgensen a donc utiliseacute pour eacutetablir la seacutequence de ses
peptides modegraveles des acides amineacutes qui eacutechangent tregraves rapidement (histidine ou acide
aspartique) quil a placeacutes en N-terminal et des acides amineacutes qui eacutechangent beaucoup plus
lentement (isoleucine) en C-terminal Il a eacutegalement introduit des acides amineacutes basiques
(lysine) pour sassurer de la solubiliteacute de ses peptides La seacutequence geacuteneacuterale de ses peptides
est donc (His)n(Ile-Ile-Lys)m ou (Lys)2(Asp)n(Ile-Ile-Lys)m Ainsi apregraves un eacutechange complet
dans D2O et dilution dans H2O (acide et glaceacutee) les amides de la partie N-terminale des
peptides (His)n ou (Lys)2(Asp)n se retrouvent complegravetement hydrogeacuteneacutes alors que ceux de la
partie C-terminale (Ile-Ile-Lys)m portent encore des deuteacuteriums
Lutilisation de ces peptides a permis agrave T Joslashrgensen de montrer quil eacutetait possible de
trouver des conditions en ECD (18) mais aussi en ETD (19 23-24) qui permettent de
minimiser le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Diffeacuterents instruments ont eacuteteacute utiliseacutes pour ses
expeacuteriences un spectromegravetre de masse FT-ICR (LTQ-FT) de la socieacuteteacute Thermo pour les
expeacuteriences en ECD (18) et une trappe ionique Agilent (19) ainsi qu‟un spectromegravetre de
masse LTQ-Orbitrap XL (Thermo) (23 25) pour les expeacuteriences ETD Une des conclusions
de ces eacutetudes est que quel que soit le spectromegravetre de masse utiliseacute loptimisation des
conditions expeacuterimentales de la source eacutelectrospray et notamment tous les paramegravetres lieacutes agrave
la deacutesolvatation est un paramegravetre crucial pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Ce reacutesultat nest pas
eacutetonnant dans la mesure ougrave avant leur arriveacutee dans une reacutegion de tregraves basse pression les ions
subissent un certain nombre de collisions qui peuvent augmenter leur eacutenergie interne (26) et
favoriser ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Pour les expeacuteriences ECD T Joslashrgensen a
eacutegalement montreacute que la fenecirctre de seacutelection choisie dans le piegravege lineacuteaire pour isoler lion agrave
fragmenter est eacutegalement un paramegravetre agrave controcircler finement Une fenecirctre trop eacutetroite conduit
en effet agrave une excitation de lion preacutecurseur et au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
Dans ce contexte nous avons souhaiteacute utiliser les peptides deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
comme sondes du laquo scrambling raquo sur le spectromegravetre de masse FT-ICR APEX III du
84
laboratoire afin de pouvoir deacuteterminer les conditions expeacuterimentales propres agrave reacutealiser de
lECD sur des peptides puis des proteacuteines deuteacutereacutes Ce travail a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de
Magalie Duchateau (27) mais navait pas pu ecirctre termineacute pour des problegravemes instrumentaux
Afin dassurer la coheacuterence des reacutesultats toutes expeacuteriences reacutealiseacutees preacuteceacutedemment ont eacuteteacute
dupliqueacutees et compleacuteteacutees au deacutebut de ma thegravese Une mise agrave jour de linstrument en APEX-Q
puis en SolariX nous a ensuite conduits agrave devoir reacute-optimiser certains paramegravetres Les
reacutesultats obtenus lors de ce travail font lobjet du deuxiegraveme chapitre de cette thegravese Les
peptides choisis sont les suivants
P1 HHHHHHIIKIIK
P2 KKDDDDDDIIKIIK
P3 KKDDDIIKIIK
P4 KKDDIIK
II2 Reacutesultats
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons
Le systegraveme deacuteveloppeacute par T Joslashrgensen est celui que nous avons utiliseacute Il est constitueacute
dune seringue preacutealablement placeacutee entre deux sacs de glace puis refroidie pendant la dureacutee
de lanalyse par un sachet de carboglace La longueur du capillaire en PEEK (125 microm de
diamegravetre interne) entre la sortie de la seringue et lentreacutee dans la source dionisation a eacuteteacute
minimiseacutee agrave environ 30 cm et le deacutebit utiliseacute est de 600 microLmin afin de minimiser leacutechange
inverse pendant le transfert de leacutechantillon entre la seringue refroidie et la source dionisation
(voir Chap IV) Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees pendant 10 minutes avec le mecircme eacutechantillon
et la stabiliteacute du marquage (qui doit resteacutee dans les 10 du marquage initial qui sert de
reacutefeacuterence) est suivie par lacquisition reacuteguliegravere de spectres MS
II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence
Parmi les quatre peptides que nous avons choisis deux ont deacutejagrave eacuteteacute eacutetudieacutes preacuteceacutedemment
par T Joslashrgensen (18-19 21) Notre premier objectif eacutetait donc de retrouver le mecircme nombre
de deuteacuteriums initial que ce quil avait trouveacute Les peptides ont eacuteteacute conccedilus de telle sorte que
85
seule lextreacutemiteacute C-terminale doit porter des deuteacuteriums au niveau du motif IIKIIK pour les
peptides P1 P2 et P3 En theacuteorie on sattend donc agrave cinq eacutechanges H D pour ces peptides
Les reacutesultats expeacuterimentaux montrent que lon natteint pas tout agrave fait cette valeur mais quune
moyenne de 42 D est obtenue comme lindique le Tab II 1 Cette perte de 08 D
sexplique par le fait que le marquage au niveau de lamide situeacute entre la derniegravere histidine et
la premiegravere isoleucine nest pas parfait et quil existe un meacutelange de populations de peptides
pour lesquels cest bien un D qui est agrave cette place et des peptides pour lesquels le D a eacuteteacute
remplaceacute par un H De la mecircme faccedilon on nobtient pas exactement 2 D pour le peptide P4
mais seulement 16 Les reacutesultats regroupeacutes dans le Tab II 1 montrent eacutegalement que la taille
et la nature de la partie du peptide qui eacutechange vite (seacuterie dhistidines ou enchainement
lysine-acide aspartique) nont pas dinfluence sur le marquage global du peptide
Tab II 1 Seacutequence des quatre peptides utiliseacutes dans cette eacutetude Nombre de deuteacuteriums
retenus au niveau des acides amineacutes de lrsquoextreacutemiteacute C-terminale dans les diffeacuterents eacutetats de
charge apregraves reacute-eacutechange de certains deuteacuteriums avec les hydrogegravenes du solvant protieacute dans
des conditions controcircleacutees (Chap V)
Peptide Seacutequence Masse
monoisotopique MH
1+ MH2
2+ MH3
3+ Reacutefeacuterence
P1 HHHHHHIIKIIK 15498975 -
43 39 (18 21)
P2 KKDDDDDDIIKIIK 16738956 44a
43 43 (19)
P3 KKDDDIIKIIK 13288148 40b
42 42
P4 KKDDDIIK 9745517 20 16 -
Potentiel de deacutesolvatation a entre 200 et 250 V et
b entre 150 et 250 V
II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo
Afin deacutevaluer le taux de laquo scrambling raquo ducirc agrave la source eacutelectrospray les spectres ECD des
peptides ont eacuteteacute enregistreacutes en faisant varier les conditions expeacuterimentales dans la source
Comme les peptides sont construits pour ne porter des deuteacuteriums quagrave leur extreacutemiteacute C-
terminale les ions de type c (N-terminaux) fournissent des massifs isotopiques diagnostics
simples En labsence de laquo scrambling raquo les ions c de petite taille (comme lion c4 par
exemple) doivent conserver un massif isotopique identique agrave celui obtenu pour le peptide non
deuteacutereacute En revanche sil y a eu laquo scrambling raquo les enveloppes isotopiques seront deacuteplaceacutees
vers des rapports mz plus eacuteleveacutes
86
A titre dexemple la Fig II 1 montre le deacuteplacement du massif isotopique obtenu pour
lion c4 du peptide P2 lorsque lon augmente leacutenergie de deacutesolvatation
Fig II 1 Spectres ECD du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) (a) Spectre complet du peptide
non marqueacute (b) Massif isotopique de lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave partir du peptide
seacutelectivement marqueacute pour des valeurs de potentiel de deacutesolvatation eacuteleveacutee (180 V spectre du
haut) et basse (40 V spectre du milieu) Le spectre du bas montre lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave
partir du peptide agrave lrsquoeacutequilibre (marquage homogegravene) agrave 100 V
Alors quagrave 40 V correspondant agrave une basse eacutenergie de deacutesolvatation le massif isotopique
obtenu est le mecircme que pour le peptide non deuteacutereacute on observe agrave 180 V un deacuteplacement tregraves
clair du massif vers les hauts mz signature de lincorporation de deuteacuteriums du cocircteacute N-
terminal du peptide et donc de laquo scrambling raquo
Par cette approche diffeacuterents paramegravetres de source ont eacuteteacute testeacutes le potentiel de
deacutesolvatation (laquo CapExit raquo sur notre instrument) la tempeacuterature du gaz de deacutesolvatation et le
temps daccumulation dans lhexapocircle Parmi ces trois paramegravetres seul le potentiel de
deacutesolvatation a un effet majeur sur le laquo scrambling raquo comme le montre leacutevolution du nombre
de deuteacuteriums dans les diffeacuterents ions c et z formeacutes agrave partir du peptide P2 (Fig II 2)
87
88
Fig II 2 Graphes du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment ECD obtenu agrave
partir de lrsquoion preacutecurseur trichargeacute du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) seacutelectivement
marqueacute en fonction du potentiel de deacutesolvatation
Avec un potentiel de deacutesolvatation conduisant agrave tregraves peu de laquo scrambling raquo (40 V) on
nobserve pas deffet marquant de la tempeacuterature de la source (varieacutee de 50 agrave 140degC) ni du
temps daccumulation dans lhexapocircle (varieacute de 05 agrave 2 s) Les conditions optimales ayant eacuteteacute
obtenues pour limiter le laquo scrambling raquo nous navons pas chercheacute agrave faire varier dautres
paramegravetres qui par ailleurs ont eacutegalement une influence sur lefficaciteacute de transmission des
ions
Neacuteanmoins nous avons souhaiteacute comprendre un peu mieux le rocircle de leacutenergie de
deacutesolvatation et pour ce faire les spectres MS et MSMS en ECD ont eacuteteacute enregistreacutes Pour les
peptides P1-P3 les spectres ECD obtenus agrave partir dions preacutecurseurs trichargeacutes montrent des
courbes similaires agrave celles deacutecrites sur la Fig II 2 agrave bas potentiel de deacutesolvatation les
fragments contiennent un nombre de deuteacuteriums constant mais lorsque le potentiel est
augmenteacute on observe une incorporation de deuteacuteriums croissante pour les ions c et une perte
de deuteacuteriums pour les ions z Le seuil agrave partir duquel le laquo scrambling raquo commence est le
mecircme pour les diffeacuterents fragments dun mecircme peptide mais est diffeacuterent dun peptide agrave
lautre Pour le peptide P4 aucun fragment ECD na pu ecirctre observeacute agrave partir de lion
doublement chargeacute et lion triplement chargeacute nest apparemment pas formeacute
Ces reacutesultats sont tregraves proches de ce qui avait eacuteteacute observeacute par T Joslashrgensen sur le LTQ-FT
(18) et sur la trappe ionique (19) et ne semblent pas deacutependre de la taille et de la nature de la
partie du peptide qui preacutesente un eacutechange rapide
89
Un examen des spectres MS en fonction de leacutenergie de deacutesolvatation (Fig II 3) apporte
un eacuteclairage nouveau sur ce qui se passe dans la source qui est un pheacutenomegravene indeacutependant du
laquo scrambling raquo
Fig II 3 Intensiteacute des ions des diffeacuterents eacutetats de charge du peptide KKDDDIIKIIK (P3)
ainsi que celle de ses ions fragments geacuteneacutereacutes dans la source ionique en fonction du potentiel
de deacutesolvatation Lrsquointensiteacute des fragments correspond agrave la somme des intensiteacutes des ions
fragments b et y (a) Intensiteacutes absolues (b) Intensiteacutes relatives par rapport agrave lrsquointensiteacute
totale des ions
Tout dabord le type dion observeacute (simplement doublement ou triplement chargeacute) et
lapparition de fragments sont correacuteleacutes avec les potentiels de deacutesolvatation (Fig II 3) Comme
lindique la Fig II 3 les ions triplement chargeacutes sont largement favoriseacutes agrave bas potentiels de
deacutesolvatation et la fragmentation est quasi-inexistante Pour le peptide P3 on peut observer
une chute de lintensiteacute de lion triplement chargeacute au-delagrave de 160 V avec une augmentation
concomitante de lintensiteacute de lion moleacuteculaire doublement chargeacute et de celle des fragments
En intensiteacute absolue lion (1+) deacutecroicirct quant agrave lui lentement agrave partir de 200 V Ces reacutesultats
90
sexpliquent au moins en partie par le fait que lion (3+) est le premier agrave se fragmenter
lorsque lon augmente le potentiel de deacutesolvatation car chaque collision est trois fois plus
eacutenergeacutetique que pour son eacutequivalent monochargeacute
Si lon trace leacutevolution de la deuteacuteration de lion parent en fonction de leacutenergie de
deacutesolvatation un reacutesultat surprenant est obtenu (Fig II 4) le nombre de deuteacuteriums diminue
aux hauts potentiels de deacutesolvatation
Fig II 4 Nombre de deuteacuteriums dans les diffeacuterents eacutetats de charge de lrsquoion preacutecurseur en
fonction du potentiel de deacutesolvatation (a) Peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) (b) Peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK)
Ce reacutesultat explique le comportement observeacute pour les ions c111+
et c132+
aux hauts
potentiels de deacutesolvatation la diminution du nombre de deuteacuteriums pour ces ions fragments
est correacuteleacutee agrave celle de lion preacutecurseur Par ailleurs le nombre de deuteacuteriums perdu semble lieacute
(a)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
0 50 100 150 200 250 300
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M 2+
M 3+
M 4+
(b)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
100 150 200 250 300 350
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M3+
M2+
M1+
91
agrave la fois agrave la nature et agrave leacutetat de charge du peptide Par exemple le peptide P2 trois fois
chargeacute perd 08 D alors que le peptide P3 avec le mecircme eacutetat de charge perd au moins 2 D
Cette perte de deuteacuteriums ne peut sexpliquer que par lintervention dune autre moleacutecule
posseacutedant des hydrogegravenes eacutechangeables avec laquelle un eacutechange inverse D H peut avoir
lieu Cette moleacutecule peut par exemple provenir du solvant de spray utiliseacute pour les
expeacuteriences eau meacutethanol acide aceacutetique En effet il est possible deacutemettre lhypothegravese que
des reacuteactions ionmoleacutecule dans la source dans laquelle la pression est importante conduisent
agrave cet eacutechange dhydrogegravenes et de deuteacuteriums Le fait que P1 ne subisse aucune perte de
deuteacuterium permet mecircme de postuler que les acides amineacutes responsables de cet eacutechange sont
les acides aspartiques reacutesidus que lon retrouve dans tous les peptides eacutetudieacutes agrave lexception de
P1 Compte tenu du faible nombre de peptides eacutetudieacutes il est difficile de conclure sur un
meacutecanisme geacuteneacuteral permettant dexpliquer cet eacutechange en phase gazeuse mais le meacutecanisme
de flip-flop deacutecrit par Beauchamp et al (28-29) pourrait expliquer les reacutesultats observeacutes
Il est inteacuteressant de noter que les pheacutenomegravenes deacutecrits preacuteceacutedemment (apparition de
fragments dans la source laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums) apparaissent tous agrave une limite
preacutecise (mais diffeacuterente) de potentiel de deacutesolvatation (Tab II 2) Comme le potentiel de
deacutesolvatation est directement lieacute agrave leacutenergie interne des ions produits par la source
eacutelectrospray (26) il est possible dutiliser la valeur des seuils observeacutes comme indication de
leacutenergie requise pour chaque pheacutenomegravene Bien que les seuils deacutependent du peptide (et de son
eacutetat de charge) il est possible deacutetablir un ordre dapparition de chaque pheacutenomegravene car il est
conserveacute dune seacutequence et dun eacutetat de charge agrave lautre ainsi le laquo scrambling raquo apparaicirct en
premier avec un seuil assez bas deacutenergie de deacutesolvatation suivi dune perte du marquage et
enfin de lapparition de fragments aux plus hautes eacutenergies
Tab II 2 Valeurs de potentiel de deacutesolvatation (en V) pour lrsquoapparition de chaque
pheacutenomegravene observeacute laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums et fragmentation dans la source
Peptide
Desolvation potential (V) at onset
Scrambling Loss of D atom
Fragmentation
from 3+ from 2+
P1 100
- - 150
P2 110 160 - 170
P3 100 110 180 140
P4 - - - 120
92
Lordre des deux premiers pheacutenomegravenes indique que les hydrogegravenes damide ne sont pas
directement eacutechangeables avec ceux des moleacutecules de solvant vaporiseacutees Deux meacutecanismes
diffeacuterents peuvent alors ecirctre envisageacutes soit un eacutechange direct en phase gazeuse dun atome
dhydrogegravene du solvant avec un deuteacuterium porteacute par un azote dune des liaisons peptidiques
ce qui implique une eacutenergie dactivation importante soit un eacutechange agrave un autre site labile
apregraves transfert du deuteacuterium Comme la courbe du deacutemarquage est tregraves proche de celle du
laquo scrambling raquo deacutetermineacutee par les expeacuteriences ECD on peut supposer que la reacuteaction a lieu
en deux eacutetapes reacutearrangement intramoleacuteculaire dans le peptide conduisant agrave eacutechanger les
deuteacuteriums damide avec les hydrogegravenes carboxyliques des acides aspartiques puis reacuteaction
ionmoleacutecule avec le solvant en phase gazeuse En absence de ces acides carboxyliques relais
(cas de P1) seul le laquo scrambling raquo peut avoir lieu Ce meacutecanisme ne reacutepond toutefois pas agrave
une question qui est la suivante pourquoi dans le cas de P2 et pas de P3 le deacutemarquage
conduit-il agrave un eacutechange limiteacute agrave 08 D alors qu‟on devrait s‟attendre agrave suivre la courbe du
laquo scrambling raquo Si lon revient au scheacutema de la source dionisation de linstrument utiliseacute il
convient de se souvenir quapregraves leur deacutesolvatation dans le capillaire de transfert chauffeacute les
ions sont stockeacutes pendant une seconde environ dans un hexapocircle dans lequel regravegne une
pression assez importante (10-6
mbar environ) Ainsi un eacutechange HD partiel semble indiquer
que les deux pheacutenomegravenes observeacutes ont lieu dans deux reacutegions diffeacuterentes de linstrument le
reacutearrangement aurait lieu dans linterface entre le capillaire et le premier laquo skimmer raquo qui est
une reacutegion agrave haute pression et soumise agrave un potentiel eacutelectrique important tandis que les
reacuteactions ionmoleacutecule auraient plutocirct lieu dans lhexapocircle Ainsi si tous les sites labiles du
peptide ne participent pas aux reacuteactions ionmoleacutecule avec leur environnement gazeux (ce qui
est le cas dans lhypothegravese ougrave les acides aspartiques sont lieacutes speacutecifiquement agrave cet eacutechange) le
reacutearrangement conduirait agrave un nombre fini de sites eacutechangeables portant un atome de
deuteacuterium et ceux situeacutes sur dautres sites ne pourraient donc pas participer au deacutemarquage
II3 Conclusions
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III
Lobjectif initial de ce travail eacutetait de deacuteterminer quels paramegravetres expeacuterimentaux de la
source eacutelectrospray Apollo I de lAPEX III devaient ecirctre optimiseacutes pour minimiser le
reacutearrangement intramoleacuteculaire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums qui a lieu en source Parmi
les diffeacuterents paramegravetres testeacutes les reacutesultats preacutesenteacutes preacuteceacutedemment montrent que cest le
93
potentiel de deacutesolvatation qui est le plus critique Gracircce agrave lutilisation de lECD sur des
peptides seacutelectivement marqueacutes nous avons ainsi pu montrer que le potentiel de deacutesolvatation
doit ecirctre maintenu agrave une valeur leacutegegraverement infeacuterieure agrave celle conduisant agrave un maximum
dintensiteacute pour les ions formeacutes soit entre 80 et 110 V pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Cette
valeur est sensiblement la mecircme pour tous les peptides que nous avons eacutetudieacutes
Les reacutesultats obtenus sur les peptides seacutelectivement marqueacutes montrent clairement quil faut
faire extrecircmement attention agrave optimiser ce paramegravetre avant dutiliser lECD ou lETD pour
localiser des deuteacuteriums dans des peptides ou des proteacuteines qui ont eacuteteacute marqueacutes et pouvoir
tirer des conclusions sur la preacutesence de zones structureacutees ou non Utiliser des peptides
seacutelectivement marqueacutes pour deacuteterminer les conditions expeacuterimentales de source propres agrave
reacutealiser lanalyse de peptides ou de proteacuteines deuteacutereacutes (conditions qui deacutependent de
linstrument utiliseacute) devrait ainsi ecirctre leacutetape preacuteliminaire agrave toute expeacuterience HDX-MSMS
Au cours de ce travail nous avons eacutegalement mis en eacutevidence un pheacutenomegravene de reacuteactions
ionmoleacutecule dans la source qui sont potentiellement agrave lorigine deacutechanges entre les
deuteacuteriums preacutesents sur la seacutequence peptidique et des hydrogegravenes issus fort probablement de
moleacutecules de solvant en phase gazeuse Il est apparu au cours de notre travail que ce
pheacutenomegravene eacutetait particuliegraverement marqueacute pour les peptides portant des acides aspartiques par
rapport agrave ceux portant des histidines Ce pheacutenomegravene eacutetant a priori baseacute sur une premiegravere
eacutetape qui est leacutechange entre un deuteacuterium preacutesent sur une liaison amide et un hydrogegravene
carboxylique de la chaicircne lateacuterale des Asp il peut ecirctre reacuteduit par un reacuteglage approprieacute des
paramegravetres de source (diminution de leacutenergie de deacutesolvatation)
II32 Autres instruments FT-ICR
Nous avons proceacutedeacute agrave l‟laquo upgrade raquo de nos instruments agrave deux reprises (APEX III gt
APEX-Q en janvier 2011 et APEX-Q gt SolariX en avril 2012) De la mecircme maniegravere que pour
l‟APEX III nous avons pu deacuteterminer pour l‟APEX-Q et le SolariX le paramegravetre ou les
paramegravetres critiques qu‟il faut optimiser pour limiter le laquo scrambling raquo En effet agrave chaque
changement ou modification d‟instrument une reacute-optimisation de l‟ensemble des paramegravetres
entre la source et la cellule est requise pour eacuteviter un eacutechauffement des ions lors de leur
formation ou de leur transfert Les reacutesultats sont reacutesumeacutes dans le tableau ci-apregraves (Tab II 3)
94
Tab II 3 Paramegravetre(s) critique(s) agrave optimiser pour limiter le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
en fonction de lrsquoinstrument utiliseacute
APEX III Tension agrave la sortie du capillaire de source
(Potentiel de deacutesolvatation ou laquo CapExit)
lt 80 V
APEX-Q
APEX-Qe
Tension dans la cellule de collision
(laquo CollisionVoltage raquo)
gt 0 V
(3-5 V)
SolariX Tension du premier eacutecorceur (SK1)
Conditions de la cellule de collision
collision activeacutee
tension de collision en entreacutee
lt 50 V
Non
lt 2 V
Fig II 5 Nombre de deuteacuteriums dans lrsquoion preacutecurseur triplement chargeacute du peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK) et dans les fragments c2 c6 et z6 en fonction du potentiel du premier
eacutecorceur
A titre d‟illustration la Fig II 5 reprend les reacutesultats obtenus sur le SolariX avec le
peptide P1 en faisant varier la tension du premier eacutecorceur (laquo skimmer raquo) SK1 montrant une
valeur optimale vers 40 V On notera par contre la preacutesence d‟un taux de deuteacuteration non nul
sur les fragments c2 et c6 degraves les basses tensions Il faut noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un ion preacutecurseur triplement chargeacute preacutesentant un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
que ce qui est attendu
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
o
f d
eu
teri
um
SK1 (V)
C2 C6 Z6 Parent M3+
95
Les deux versions successives (APEX-Q et SolariX) preacutesentent une eacutevolution majeure qui
est l‟introduction d‟une cellule de collision sur le chemin optique des ions (Annexe Fig A 4
et Fig A 6) En conseacutequence on observe que cette seconde reacutegion agrave pression de gaz eacuteleveacutee
ajoute une seconde reacutegion susceptible de conduire agrave un deacutepocirct d‟eacutenergie dans les ions et par
conseacutequent agrave du laquo scrambling raquo Les paramegravetres optimiseacutes concernent par conseacutequent ces
deux reacutegions L‟ajout d‟entonnoirs agrave ions (laquo ion funnels raquo) au premier eacutetage de deacutesolvatation
semble rendre la tension en sortie de capillaire (laquo CapExit raquo) nettement moins critique sans
doute parce que les distances sont plus grandes (et donc le champ eacutelectrique plus faible) Par
contre sur le SolariX de l‟eacutenergie peut ecirctre deacuteposeacutee entre le premier eacutecorceur (SK1) et le
second entonnoir qui joue un rocircle critique dans le deacutepocirct d‟eacutenergie (Annexe Fig A 6)
En conclusion dans cette partie nous avons utiliseacute un jeu de peptides speacutecifiquement
marqueacutes par des deuteacuteriums pour valider notre instrumentation et trouver les paramegravetres
optimaux par rapport au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo ou meacutelange des deuteacuteriums lors des
eacutetapes de transfert en phase gazeuse et d‟introduction dans le vide du spectromegravetre de masse
Nous avons eacutegalement valideacute au passage que l‟ECD permet effectivement de mesurer des
fragments donc le nombre de deuteacuteriums correspond agrave celui attendu apregraves deacutemarquage seacutelectif
de peptides modegraveles Dans la partie suivante nous allons transposer ces reacutesultats agrave un systegraveme
reacuteel
96
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during Electron-Transfer Dissociation of Deuterated Peptides as an Inherent Gauge of
Gas-Phase Hydrogen Scrambling Analytical Chemistry 82 9755-9762
25 Amon S Trelle M B Jensen O N and Jorgensen T J (2012) Spatially resolved
protein hydrogen exchange measured by subzero-cooled chip-based nanoelectrospray
ionization tandem mass spectrometry Anal Chem 84 4467-4473
26 Gabelica V and De Pauw E (2005) Internal energy and fragmentation of ions
produced in electrospray sources Mass Spectrom Rev 24 566-587
27 Duchateau M (2010) Deacutetermination de surface dinteraction dassemblages
biologiques macromoleacuteculaires par marquage au deuteacuterium et analyse par
spectromeacutetrie de masse FT-ICR
28 Campbell S Rodgers M T Marzluff E M and Beauchamp J L (1994)
Structural and Energetic Constraints on Gas Phase HydrogenDeuterium Exchange
Reactions of Protonated Peptides with D2O CD3OD CD3CO2D and ND3 Journal
of the American Chemical Society 116 9765-9766
29 Campbell S Rodgers M T Marzluff E M and Beauchamp J L (1995)
Deuterium Exchange Reactions as a Probe of Biomolecule Structure Fundamental
Studies of Gas Phase HD Exchange Reactions of Protonated Glycine Oligomers with
D2O CD3OD CD3CO2D and ND3 Journal of the American Chemical Society 117
12840-12854
98
99
Chapitre III Deacuteveloppement de
lrsquoapproche HDX top-down ECD
100
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
101
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo
Comme nous l‟avons vu dans le premier chapitre de ce manuscrit (voir Chap I) les
eacutechanges HD coupleacutes agrave la spectromeacutetrie de masse (HDXMS) permettent d‟obtenir des
informations sur l‟organisation structurale des proteacuteines L‟approche classique dite
laquo bottom-up raquo (Fig III 1) repose sur une digestion enzymatique de la proteacuteine d‟inteacuterecirct apregraves
marquage afin de deacuteterminer la localisation des deuteacuteriums incorporeacutes Pour cela les peptides
issus de la digestion sont analyseacutes par spectromeacutetrie de masse une eacutetape preacutealable de
seacuteparation par chromatographie liquide eacutetant le plus souvent requise Les eacutetapes de digestion
enzymatique et de seacuteparation chromatographique qui se deacuteroulent en solution doivent ecirctre
reacutealiseacutees dans les conditions de conservation du marquage Des cineacutetiques deacutechange HD
peuvent alors ecirctre calculeacutees pour chaque peptide en mesurant le deacuteplacement de leur masse
dans les spectres Ces cineacutetiques sont correacuteleacutees dune part agrave laccessibiliteacute au solvant et dautre
part agrave la structure locale de la proteacuteine
Fig III 1 Scheacutema repreacutesentant les eacutetapes des approches laquo bottom-up raquo et laquo top-down raquo dans
des eacutetudes en HDXMS Le segment en bleu correspond agrave la proteacuteine hydrogeacuteneacutee tandis que
les portions en rouge correspondent aux zones de la proteacuteine qui ont eacuteteacute deuteacutereacutees Les
flegraveches vertes repreacutesentent le moment de la fragmentation en phase gazeuse
Cependant cette approche souffre de deux limitations majeures La premiegravere est l‟eacutechange
inverse entre les deuteacuteriums et les hydrogegravenes qui a lieu en solution lors des eacutetapes de
digestion et de seacuteparation avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Bien que le laquo back-
exchange raquo puisse ecirctre minimiseacute il ne peut ecirctre eacuteviteacute (1) La seconde limitation est la
reacutesolution qui deacutepend directement de la taille des peptides issus de la fragmentation
enzymatique par la pepsine et qui est typiquement de lordre de cinq agrave dix acides amineacutes
102
Une possibiliteacute pour ameacuteliorer la reacutesolution est de combiner diffeacuterentes enzymes Une
autre est de fragmenter les peptides obtenus dans le spectromegravetre de masse pour localiser
preacuteciseacutement les deuteacuteriums (2) Il a neacuteanmoins eacuteteacute montreacute que les techniques classiques par
chauffage lent (Collision Induced Dissociation CID) ne peuvent ecirctre utiliseacutees car une
migration intramoleacuteculaire et par conseacutequent un meacutelange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums a
lieu dans la seacutequence avant la rupture des liaisons peptidiques ce qui fait perdre linformation
de leur localisation (Fig III 2) (3) En revanche comme nous l‟avons montreacute dans le chapitre
preacuteceacutedent (voir Chap II) lutilisation de meacutethodes de fragmentation baseacutees sur la capture ou
le transfert dun eacutelectron (Electron Capture Dissociation ECD ou Electron Transfer
Dissociation ETD) permet de reacuteduire consideacuterablement ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo De
plus linteacuterecirct de ces modes de fragmentation alternatifs est quils peuvent ecirctre utiliseacutes aussi
bien dans une approche laquo bottom-up raquo sur les peptides proteacuteolytiques marqueacutes (4-5) que
directement sur la proteacuteine deuteacutereacutee dans une approche dite laquo top-down raquo Dans ce dernier
cas l‟incorporation des deuteacuteriums peut alors ecirctre mesureacutee pour chaque ion fragment comme
nous l‟avons fait pour les peptides modegraveles
Avec redistribution
NH2 COOHNH2
COOH
NH2COOH
CID ETDECD
NH2
COOH
by ionscz ions
D D DDD
H HH
H
NH2
COOH
Sans redistributionActivation
Fragmentation
Fig III 2 Illustration du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo qui est freacutequent lors de la
fragmentation par activation collisionnelle (CID) Les meacutethodes drsquoactivation par les eacutelectrons
(ECD ETD) ne conduisent pas agrave de la redistribution quand les conditions sont optimales
III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo
Dans une approche laquo top-down raquo la proteacuteine entiegravere est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse (Fig III 1) On s‟affranchit alors de l‟eacutetape de digestion proteacuteolytique De cette
maniegravere une partie du laquo back-exchange raquo qui a lieu en solution notamment lors de la
103
digestion enzymatique de la proteacuteine deuteacutereacutee (1) est eacutelimineacutee De plus dans la mesure ougrave
lobjet agrave analyser nest pas coupeacute en de nombreux morceaux en solution lutilisation dune
seacuteparation chromatographique n‟est pas requise ce qui permet eacutegalement de s‟affranchir de
l‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape L‟approche laquo top-down raquo est geacuteneacuteralement combineacutee agrave
une fragmentation par ECD ou ETD Comme nous l‟avons montreacute dans les chapitres
preacuteceacutedents (voir Chap I et II) l‟utilisation de ces techniques de dissociation par capture ou
transfert d‟eacutelectron permet de limiter au maximum le laquo scrambling raquo qui peut avoir lieu en
phase gazeuse au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem Elles sont donc
particuliegraverement bien adapteacutees pour deacuteterminer la position preacutecise des deuteacuteriums incorporeacutes
le long de la seacutequence polypeptidique
Des reacutesultats obtenus tregraves reacutecemment par diffeacuterents groupes utilisant aussi bien l‟ETD que
l‟ECD sur des proteacuteines modegraveles ont ainsi montreacute que ces techniques de dissociation utiliseacutees
en combinaison avec les eacutechanges HD permettent danalyser la structure native des proteacuteines
(6) ou encore de caracteacuteriser des espegraveces transitoires ce qui est essentiel pour la
compreacutehension des meacutecanismes de repliement (7) Il a mecircme eacuteteacute montreacute au cours de ces
eacutetudes qu‟une reacutesolution agrave lrsquoacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue Les premiers reacutesultats
provenant d‟une association entre eacutechanges HD et analyse laquo top-down raquo ont eacuteteacute obtenus en
2008 par l‟eacutequipe de Lars Konermann au Canada sur une petite proteacuteine modegravele de 86 kDa
l‟ubiquitine (8) Il montre dans son article que les informations de structure quil obtient sont
tregraves proches de celles issues de la RMN (Fig III 3)
Fig III 3 Symboles pleins taux de deuteacuteration des ions fragments ECD de lrsquoubiquitine apregraves
30 min incubation dans 95 de D2O agrave 22degC Symboles vides taux de deuteacuteration obtenus
par RMN dans les mecircmes conditions HDX
104
Dans une eacutetude plus reacutecente encore Igor Kaltashov a preacutesenteacute des reacutesultats tregraves
prometteurs sur une proteacuteine de 18 kDa en utilisant un spectromegravetre de masse FT-ICR
(Bruker) sur lequel une source d‟ionisation chimique permettant de faire des expeacuteriences ETD
a eacuteteacute installeacutee (9) Il a eacutegalement montreacute tregraves reacutecemment en travaillant sur la mecircme proteacuteine
modegravele que la fragmentation par activation collisionnelle (CID) pouvait ecirctre combineacutee agrave une
approche laquo top-down raquo dans des eacutetudes HDX indiquant que le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
pouvait ecirctre controcircleacute lorsque des eacutetats de charge tregraves eacuteleveacutes eacutetaient choisis pour la
fragmentation (10) Bien que les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons pour la fragmentation
de peptides (11-12) et de petites proteacuteines (6 8 13) se soient reacuteveacuteleacutees tregraves encourageantes
pour augmenter la reacutesolution des eacutetudes en HDX-MSMS elles ne fournissent pas une
couverture de seacutequence complegravete en particulier pour les gros polypeptides C‟est pour cette
raison qu‟il serait inteacuteressant de pouvoir utiliser en compleacutement les reacutesultats de la
fragmentation par CID qui conduit agrave des ions fragments souvent compleacutementaires agrave ceux
obtenus par dissociation ECD ou ETD Ainsi la possibiliteacute d‟utiliser les meacutethodes
d‟activation collisionnelle en plus des techniques d‟activation par les eacutelectrons dans les eacutetudes
laquo top-down raquo HDX conduirait agrave une reacutesolution spatiale significativement ameacutelioreacutee
permettant de sonder la conformation et la dynamique des proteacuteines Une autre faccedilon
d‟augmenter la reacutesolution est l‟utilisation d‟un reacuteactif tel que l‟alcool m-nitrobenzylique (m-
NBA) qui augmente leacutetat de charge des ions proteacuteiques en provoquant leur rapide
deacutenaturation lors du processus d‟ionisation par ESI Il en reacutesulterait le deacutepliement de la
proteacuteine dans la goutte eacutelectrospray mais sans l‟apparition de modifications significatives de
sa structure par rapport agrave celle de la solution initiale permettant d‟ameacuteliorer l‟efficaciteacute de
fragmentation et donc la couverture de seacutequence par ECD ou ETD Ainsi dans une eacutetude
reacutecente Evan Williams (14) a montreacute que lajout de m-NBA dans le spray utiliseacute pour ioniser
lubiquitine permet de former des ions de plus hauts eacutetats de charge dont la mobiliteacute ionique a
reacuteveacuteleacute quils eacutetaient comme attendu plus deacuteplieacutes que leurs homologues de plus bas eacutetat de
charge Ainsi comme lefficaciteacute de la fragmentation ECDETD augmente avec leacutetat de
charge du preacutecurseur Williams a pu montrer dans le cas de lubiquitine quune meilleure
couverture de seacutequence pouvait ecirctre obtenue simplement par lajout de m-NBA Une autre
possibiliteacute est de combiner les reacutesultats obtenus pour diffeacuterents eacutetats de charge d‟ions
preacutecurseurs ce qui peut ameacuteliorer un peu plus la reacutesolution spatiale des expeacuteriences ETD
Ceci peut devenir d‟autant plus important que le systegraveme proteacuteique est grand dans le cas ougrave
typiquement la fragmentation par ETD est limiteacutee
105
Les diffeacuterents exemples reacutecents deacutecrits preacuteceacutedemment montrent que les approches laquo top-
down raquo ont fait l‟objet de deacuteveloppements importants dans le contexte des eacutechanges HD ces
derniegraveres anneacutees Neacuteanmoins jusquagrave maintenant seules des proteacuteines modegraveles stables et
disponibles en quantiteacute importante ont eacuteteacute lobjet de ces deacuteveloppements Dans ce contexte
lobjet de ma thegravese a eacuteteacute de poursuivre les eacutetudes reacutealiseacutees au laboratoire dans lobjectif de
mettre au point une meacutethodologie robuste combinant eacutechanges HD et approche laquo top-
down raquo pour des complexes proteacuteiques reacuteels en collaboration avec le laboratoire de
Biochimie de lEacutecole Polytechnique Notre objectif est donc (i) de disposer dune meacutethode
permettant de localiser rapidement et preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence
polypeptidique et deacuteterminer ainsi des cineacutetiques deacutechange pour chaque acide amineacute (ii) de
pouvoir appliquer cette meacutethodologie agrave leacutetude structurale des complexes d‟initiation de la
traduction La difficulteacute ici reacuteside dans le fait qu‟il s‟agit d‟eacutechantillons biologiques reacuteels et
de grande taille Cela implique des eacutetapes additionnelles dans le protocole de preacuteparation et
d‟analyse des eacutechantillons et donc des preacutecautions suppleacutementaires agrave prendre vis-agrave-vis de la
conservation du marquage Notre eacutetude HDXMS preacuteliminaire qui a eacuteteacute meneacutee sur des
peptides de reacutefeacuterence et qui a eacuteteacute preacutesenteacutee dans le chapitre preacuteceacutedent (voir Chap II) a
montreacute que l‟utilisation de meacutethodes de fragmentation telle que la dissociation par capture
d‟eacutelectron (ECD) eacutetait adapteacutee pour mesurer les taux d‟eacutechanges HD pour chaque acide
amineacute Pour cela une optimisation fine des conditions de source et des paramegravetres
instrumentaux a eacuteteacute requise preacutealablement agrave l‟analyse pour reacuteduire au maximum le
laquo scrambling raquo pendant les processus de deacutesolvatation et de transfert des ions en phase
gazeuse Nous avons dans ce troisiegraveme chapitre reacuteutiliseacute ces paramegravetres optimiseacutes pour
l‟analyse laquo top-down raquo de nos eacutechantillons proteacuteiques Dans un premier temps cette partie se
focalisera sur l‟eacutetude laquo top-down raquo HDX avec activation par ECD qui est la technique
d‟activation pour laquelle le plus de reacutesultats ont eacuteteacute obtenus Ensuite pour mieux
comprendre le rocircle des meacutethodes d‟activation sur les migrations d‟hydrogegravene le mecircme
systegraveme a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacute avec d‟autres modes d‟activation (ETD et CID)
106
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation
lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX
III211 Proteacuteines drsquoeacutetude
Nous avons travailleacute sur le complexe proteacuteique aIF2 (archaeal Initiation Factor 2) de
Sulfolobus solfataricus (Fig III 4) qui est un des complexes responsables de l‟initiation de
la traduction chez les archeacutees Son rocircle est de recruter l‟ARNt meacutethionyleacute lieacute agrave l‟ARNm au
niveau de la petite sous-uniteacute du ribosome Nous savons deacutejagrave par des donneacutees
cristallographiques qu‟il est constitueacute de trois sous-uniteacutes α β et γ La sous-uniteacute γ (45
kDa) qui constitue la proteacuteine centrale du complexe est connue pour interagir avec les deux
autres sous-uniteacutes α (30 kDa) et β (15 kDa) au sein d‟aIF2 Afin d‟obtenir des informations
structurales sur l‟organisation de ce complexe nous avons deacuteveloppeacute notre meacutethodologie agrave
partir de l‟analyse de la proteacuteine aIF2α3 de 10 kDa qui est une version tronqueacutee de la sous-
uniteacute α du complexe aIF2 mais qui contient le site d‟interaction avec γ Ce travail a eacuteteacute initieacute
lors de la thegravese de M Duchateau (15) pendant laquelle l‟eacutetude de la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute
reacutealiseacutee par HDXECD sur l‟APEX III Dans le cadre du travail actuel nous avons eacutetendu
notre eacutetude au sous-complexe aIF2α3γ et compareacute les diffeacuterents modes de fragmentation en
utilisant d‟autres spectromegravetres de masse
Fig III 4 Scheacutema du complexe heacuteteacuterotrimeacuterique aIF2αβγ
107
III212 Protocole drsquoanalyse HDXMS
L‟analyse d‟eacutechantillons biologiques reacuteels a neacutecessiteacute une optimisation du protocole mis au
point pour les peptides En effet ces eacutechantillons proteacuteiques preacutesentent des inconveacutenients
majeurs qui sont les suivants
- ils ne sont pas disponibles en grande quantiteacute
- le maintien de leur structure native neacutecessite des concentrations importantes de sels non
volatils
- ils se deacutegradent rapidement agrave tempeacuterature ambiante
L‟ensemble des eacutetapes du protocole allant des conditions de l‟eacutechange en solution (pH
tempeacuterature tampons dessalage) agrave la fragmentation par ECD a donc eacuteteacute minutieusement
optimiseacute (Fig III 5) pour tenir compte de ces limitations Au deacutebut de l‟expeacuterience la
proteacuteine aIF2α3 est dans son eacutetat natif En effet elle est conserveacutee dans son tampon de
purification qui est riche en sels (chlorure de sodium) et qui lui permet ainsi de garder sa
conformation native La premiegravere eacutetape de notre protocole qui a consisteacute agrave initier la reacuteaction
d‟eacutechange HD a eacuteteacute de diluer aIF2α3 dans un tampon deuteacutereacute riche eacutegalement en sels
(solution de NaCl agrave 330 mM dans D2O) afin de ne pas deacutenaturer la proteacuteine et donc de sonder
sa conformation active Une incubation du meacutelange agrave 37degC sous agitation est reacutealiseacutee pendant
diffeacuterents temps agrave l‟issu desquels la reacuteaction de marquage est bloqueacutee Cette eacutetape d‟arrecirct de
la reacuteaction d‟eacutechange est effectueacutee par l‟addition d‟une solution aqueuse (H2O) acide (pH
final de 25) et glaceacutee (agrave 0degC) Etant donneacute que les fortes concentrations en sels non volatils
ne sont absolument pas compatibles avec une ionisation par eacutelectrospray nous avons ducirc
ajouter et optimiser une eacutetape de dessalage dans les conditions de conservation du marquage
Apregraves cette eacutetape de dessalage dont la dureacutee totale a eacuteteacute optimiseacutee agrave seulement une minute
(15) la proteacuteine deuteacutereacutee est precircte pour l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Elle est injecteacutee
par le systegraveme de seringue refroidie ioniseacutee par eacutelectrospray et fragmenteacutee par ECD dans la
cellule ICR
108
Alpha3 dans des conditions natives Arrecirct de la reacuteaction
H2O pH 25 et 0degC
Dilution dans D2O
NaCl 330 mM
Incubation
Temps variables
1 Dessalage
2 Eacutelution dans H2OACNAF2Alpha3 deuteacutereacutee dans le solvant pour ESI
ECD
Fig III 5 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude drsquoaIF2α3 en HDXMS par
analyse laquo top-down raquo
Pour eacuteviter l‟eacutetape de dessalage et optimiser encore plus le protocole nous avons fait de
nombreux essais pour essayer de remplacer les sels non volatils par des sels volatils
compatibles avec une analyse par ESI mais dans tous les cas la proteacuteine a preacutecipiteacute ou sest
deacutegradeacutee
III213 Instruments utiliseacutes
Les fragmentations par ECD ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur des spectromegravetres de masse de type FT-
ICR Les premiegraveres expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur un spectromegravetre APEX III qui nest pas
eacutequipeacute dun quadripocircle de seacutelection avant la cellule ICR puis sur un APEX-Qe disponible agrave
Orsay (P Maicirctre Laboratoire de Chimie Physique) Les diffeacuterences majeures entre les deux
instruments sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
Les expeacuteriences ETD ont quant agrave elles eacuteteacute effectueacutees sur un instrument LTQ Orbitrap
Velos (Thermo Scientific) en collaboration avec la plateforme proteacuteomique de Paris 7 dirigeacutee
par Jean-Michel Camadro
Les expeacuteriences CID ont eacuteteacute obtenues sur un spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
(Waters) installeacute au laboratoire DCMR
109
III22 Fragmentation par ECD
III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3
III2211 Spectre de masse
Le spectre de masse d‟aIF2α3 dont la masse monoisotopique est 10422985 Da a eacuteteacute
obtenu apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes (Fig III 6)
aiF2alpha3ss1 +MS
0
2
4
6
8
6x10
Intens
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+6H]6+
mz
Intensx106
Fig III 6 Spectre MS drsquoaIF2α3 enregistreacute sur notre instrument FT-ICR APEX III
III2212 Reacutesultats obtenus en ECD
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX III du DCMR
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres pour l‟ECD afin d‟obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour cette proteacuteine de 10 kDa sans eacutechange HD
Pour cela nous avons tout d‟abord utiliseacute une autre petite proteacuteine l‟ubiquitine (86 kDa)
pour optimiser lensemble des paramegravetres expeacuterimentaux
110
Lors de la thegravese de M Duchateau (15) notre eacutequipe a montreacute que la fragmentation par
ECD d‟aIF2α3 eacutetait beaucoup plus efficace sans seacutelection d‟un eacutetat de charge Nous avons
donc proceacutedeacute de la mecircme maniegravere
Pour l‟ubiquitine les spectres ECD les plus informatifs ont eacuteteacute obtenus avec une cathode
chauffeacutee agrave 16 A et une irradiation par des eacutelectrons de 09 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 80
ms Nous utilisons eacutegalement la technique de pieacutegeage dynamique des ions dans la cellule
afin de maximiser la quantiteacute d‟ions accumuleacutes avant la fragmentation ECD En effet la
qualiteacute des spectres ECD deacutepend en grande partie de lintensiteacute des ions preacutecurseurs et il
existe un veacuteritable seuil pour le nombre dions pour obtenir des spectres ECD de qualiteacute Le
pourcentage de couverture de seacutequence ainsi obtenu est de 68 Pour obtenir un reacutesultat
similaire avec aIF2α3 l‟eacutenergie cineacutetique des eacutelectrons a eacuteteacute augmenteacutee jusqu‟agrave 2 eV
Les proteacuteines marqueacutees sont introduites dans le spectromegravetre de masse par le systegraveme de
seringue refroidie qui est deacutecrit dans le Chap IV Afin de minimiser l‟eacutechange inverse en
solution l‟analyse ne doit pas exceacuteder dix minutes Dans ce laps de temps relativement court
deux cents scans sont accumuleacutes par spectre ECD
L‟analyse du spectre ECD d‟aIF2α3 reacutealiseacute sans seacutelection d‟eacutetat de charge permet
l‟identification d‟un total de 83 ions fragments correspondant agrave 39 ions c et 44 ions z dont 18
paires d‟ions compleacutementaires Cela se traduit par un tregraves bon pourcentage de couverture de
seacutequence de 706 (Fig III 7) L‟identification des ions fragments b et y permet d‟ameacuteliorer
leacutegegraverement la couverture de seacutequence en augmentant le pourcentage de 55 (1 ion b et 4 ions
y suppleacutementaires pour lesquels il n‟y a pas d‟ions c et z correspondants) atteignant donc la
valeur de 761
111
aIF2a3_noHD_ECD_000008d +MS
0
1
2
3
4
5
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
~ ~
~
~
~
~
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+ [M+8H]8+
[M+7H]7+
~[M+6H]6+
250 300 350 400 450 500 550 mz0
1
2
3
4
5
6
6x10
Intens
+MS
z2+
z3+
z4+ z5
+
c2+
c3+
c4+
Intens
mz
Fig III 7 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX III et sa couverture de seacutequence associeacutee Un agrandissement de la reacutegion mz
250-550 a eacuteteacute ajouteacute montrant la complexiteacute du spectre
Des problegravemes de stabiliteacute du signal et de sensibiliteacute sont apparus au cours de ces
expeacuteriences ECD il arrivait freacutequemment que le taux de fragmentation diminue brutalement
sans raison apparente au cours d‟une cineacutetique d‟eacutechange Pour pouvoir poursuivre nos
expeacuteriences nous avons deacutecideacute de continuer nos travaux sur l‟APEX-Qe accessible agrave
l‟Universiteacute Paris-Sud Une reacute-optimisation des paramegravetres pour l‟ECD a donc eacuteteacute neacutecessaire
car cet instrument nest pas le mecircme que celui du DCMR et notamment le fait que les sources
dionisation soient diffeacuterentes nous laissait agrave penser que des ajustements au moins au niveau
de la source seraient neacutecessaires (voir Chap II)
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX-Qe du Laboratoire de Chimie Physique agrave Orsay
Pour aIF2α3 les nouveaux paramegravetres optimiseacutes pour maximiser la couverture de
seacutequence obtenue en ECD ont eacuteteacute les suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par des
eacutelectrons de 17 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 10 ms Contrairement aux expeacuteriences
reacutealiseacutees sur l‟APEX III nous n‟avons pas utiliseacute la technique de pieacutegeage dynamique des
ions En effet un gain de sensibiliteacute a eacuteteacute apporteacute par les laquo ion funnels raquo Dans ces conditions
expeacuterimentales l‟analyse du spectre ECD a permis l‟identification d‟un total de 59 ions
112
fragments correspondant agrave 19 ions c et 40 ions z dont 3 paires d‟ions compleacutementaires Le
pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 608 (Fig III 8)
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
00
05
10
15
20
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+6H]6+
[M+13H]13+
~
~
~
~~
~
~
~
mz
Intensx107
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
250 300 350 400 450 500 550 mz
z2+
c2+
z3+
c3+
z4+
z5+
c4+
Fig III 8 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX-Qe La couverture de seacutequence correspondante agrave la fragmentation et
lrsquoagrandissement de la reacutegion mz 250-550 sont eacutegalement montreacutes
Si l‟on compare les deux spectres ECD ci-dessus une meilleure efficaciteacute de fragmentation
a eacuteteacute obtenue sur l‟APEX III permettant d‟avoir une meilleure reacutesolution en ce qui concerne la
zone [20-55] correspondant agrave la partie de la proteacuteine aIF2α3 qui se retrouve en contact avec la
sous-uniteacute γ lorsque leur association est effective Neacuteanmoins la fragmentation ECD de la
proteacuteine sur l‟APEX-Qe permet aussi d‟avoir un bon pourcentage de couverture de seacutequence
pour deacuteterminer des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute notamment au niveau des
extreacutemiteacutes
113
III2213 Reacutesultats en HDXECD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ECD
Pour cela nous avons mis en application notre protocole de marquage pour un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure (Fig III 5)
L‟observation des spectres ECD apregraves eacutechange HD montre que les massifs isotopiques
avec l‟incorporation de deuteacuteriums se deacuteplacent vers des rapports masse sur charge plus
importants tout en s‟eacutelargissant car lincorporation progressive de deuteacuteriums ajoute des pics
isotopiques dans le massif (Fig III 9) La premiegravere conseacutequence agrave cet eacutelargissement est que
l‟intensiteacute totale du signal obtenu pour un ion fragment est reacutepartie sur un nombre plus grand
de pics composant le massif Il en reacutesulte une diminution de l‟intensiteacute globale du signal
pouvant entraicircner une perte de deacutetection Dans ce contexte le nombre de fragments pouvant
ecirctre interpreacuteteacutes de maniegravere correcte car lenveloppe isotopique preacutesente une intensiteacute
suffisante diminue par rapport agrave lexpeacuterience sans deuteacuterium Parfois mecircme certains
fragments disparaissent complegravetement dans le bruit de fond contribuant agrave son augmentation
En effet les ions fragments c et z de faible intensiteacute avant l‟eacutechange ne sont plus deacutetectables
dans les spectres apregraves eacutechange Une autre conseacutequence de l‟eacutelargissement des massifs
isotopiques ayant incorporeacute des deuteacuteriums est leur superposition compliquant aussi fortement
l‟analyse des reacutesultats Plus le nombre de fragments est grand et moins il est facile de suivre
l‟incorporation des deuteacuteriums Par ailleurs pour les hauts rapports mz on note eacutegalement
l‟apparition de pics intenses agrave toutes les uniteacutes de masse perturbant davantage l‟interpreacutetation
des reacutesultats Ce pheacutenomegravene indeacutesirable reacutesultant de la recapture successive d‟un eacutelectron
avait eacutegalement eacuteteacute observeacute lors de la thegravese de M Duchateau (15) Une solution pour le
limiter a eacuteteacute d‟optimiser au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les
recaptures successives tout en obtenant suffisamment de fragmentations (eacutenergie cineacutetique
des eacutelectrons de 17 eV pendant 10 ms)
114
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
000
025
050
075
100
125
7x10
Intens
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
6x10
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
[M+12H]12+
[M+12H]12+
z324+
z324+
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
Fig III 9 Comparaison des spectres ECD drsquoaIF2α3 sans HDX (en bleu) et avec HDX t=1h
(en rouge) Agrandissements des reacutegions du spectre mz 869-884 (a) et mz 1080-1150 (b)
L‟analyse des spectres ECD montre donc une perte importante de sensibiliteacute apregraves eacutechange
HD essentiellement pour les hauts rapports mz La conseacutequence immeacutediate est une
diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD ce qui n‟est pas
favorable pour obtenir une bonne reacutesolution Nous avons identifieacute au total 43 ions fragments
correspondant agrave 23 ions c et 20 ions z dont une paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage
de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 456 (Fig III 10)
(a)
(b)
115
Fig III 10 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ECD
Lanalyse de la Fig III 10 montre clairement que si lanalyse des petits fragments
(extreacutemiteacutes N- et C-terminales) ne pose pas de problegraveme lanalyse dions fragments plus gros
correspondant agrave une rupture plutocirct au niveau du milieu de la seacutequence polypeptidique est
bien plus probleacutematique A la diffeacuterence de l‟APEX III en pieacutegeage dynamique il semble que
sur l‟APEX-Qe la capaciteacute de pieacutegeage du piegravege hexapolaire soit limitante et ne permette pas
d‟accumuler autant d‟ions dans la cellule Pour eacuteviter ce problegraveme il faudrait pouvoir
accumuler plus de temps pour faire sortir les pics peu intenses du bruit de fond (mais ce nest
pas possible avec notre systegraveme de seringue refroidie car leacutechange inverse devient trop grand
au bout de 10 minutes) Une autre solution agrave ce problegraveme aurait pu eacutegalement ecirctre une
augmentation du champ magneacutetique qui aurait permis d‟augmenter la gamme dynamique
ainsi que la vitesse de balayage
III2214 Analyse des donneacutees
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Data Analysis (Bruker Daltonics)
L‟analyse des spectres de fragmentation MSMS est effectueacutee entiegraverement manuellement ce
qui la rend longue et fastidieuse
La premiegravere eacutetape de l‟analyse consiste agrave identifier les ions fragments c et z preacutesents dans
le spectre enregistreacute avant l‟eacutechange HD Une liste de pics est alors geacuteneacutereacutee Elle contient
tous les pics des massifs isotopiques correspondant aux ions fragments identifieacutes Cette liste
reacutepertorie le rapport mz et l‟intensiteacute de chaque pic A partir de celle-ci les masses moyennes
pondeacutereacutees des fragments n‟ayant pas incorporeacute de deuteacuteriums sont calculeacutees Il s‟agit ensuite
de proceacuteder de la mecircme maniegravere pour les fragments ayant incorporeacute des deuteacuteriums apregraves
eacutechange Pour la seacuteparation des massifs isotopiques eacutelargis et la deacutetermination de leur masse
moyenne pondeacutereacutee la preacutecision sur la mesure de masse et la reacutesolution de l‟instrument sont
deux critegraveres essentiels Afin de cartographier les eacutechanges isotopiques des hydrogegravenes
d‟amide le choix de spectromegravetres de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR et Orbitrap) est
116
justifieacute Enfin le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour chaque ion fragment peut ecirctre
deacutetermineacute Il est obtenu en faisant la diffeacuterence entre la masse moyenne pondeacutereacutee d‟un ion
fragment donneacute apregraves eacutechange isotopique avec celle obtenue sans eacutechange et en multipliant
par la charge Le taux de deuteacuteration correspondant est deacuteduit en divisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le nombre d‟hydrogegravenes d‟amide eacutechangeables (multiplieacute par cent)
La repreacutesentation la plus directe des reacutesultats consiste agrave tracer le graphe du nombre total de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment en fonction de sa position (numeacutero de reacutesidu)
dans la seacutequence Pour un temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O donneacute deux graphes
peuvent alors ecirctre reacutealiseacutes correspondant agrave l‟analyse des deux seacuteries d‟ions c et z (Fig III 11)
La ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la seacutequence de tous les deuteacuteriums
incorporeacutes dans la proteacuteine Cette courbe theacuteorique correspond donc agrave l‟incorporation
moyenne en deuteacuteriums pour chaque ion fragment Elle tient compte du contenu maximal de
deuteacuteriums incorporeacutes par la proteacuteine Dans le cas que nous preacutesentons qui correspond agrave un
temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte eacutetait marqueacutee agrave 61 Chaque
point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de 061 deuteacuterium par reacutesidu Les
deacutecrochements de la courbe sont dus agrave la preacutesence de proline dans la seacutequence de la proteacuteine
qui est le seul acide amineacute qui ne possegravede pas de groupement amide N-H de liaison Si notre
expeacuterience avait abouti agrave un reacutearrangement total des deuteacuteriums sur les hydrogegravenes d‟amide le
long de la chaicircne peptidique tous les points expeacuterimentaux en rose et en bleu se situeraient
sur la courbe noire Or ce n‟est pas le cas Par conseacutequence nous pouvons conclure que nous
n‟avons pas de redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD
117
c-type fragments (N-terminus)
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Numeacutero de reacutesidu
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40 50 60
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Fig III 11 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment en fonction de son numeacutero de reacutesidu pour les seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure
drsquoincubation dans D2O
Une autre maniegravere de repreacutesenter ces reacutesultats est de tracer le nombre de deuteacuteriums par
reacutesidu (et non plus le nombre cumuleacute de deuteacuteriums le long de la seacutequence) (Fig III 12) Ce
nombre est calculeacute en faisant la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour deux
ions fragments conseacutecutifs Par exemple si on considegravere l‟extreacutemiteacute N-terminale le nombre
de deuteacuteriums incorporeacutes par le reacutesidu numeacutero dix a eacuteteacute deacutetermineacute en faisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le fragment c10 moins celui du fragment c9 Le taux de deuteacuteration
obtenu pour ce reacutesidu a eacuteteacute de 68 Lorsqu‟il manquait des ions fragments une moyenne
d‟incorporation des deuteacuteriums entre les deux reacutesidus les plus proches a alors eacuteteacute calculeacutee
Dans ce cas la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour les deux fragments
correspondants a donc eacuteteacute diviseacutee par le nombre de reacutesidus les seacuteparant Ainsi entre les
reacutesidus 33 et 44 le taux moyen de 70 a eacuteteacute calculeacute en faisant le nombre de deuteacuteriums
incorporeacutes dans c44 moins celui dans c33 diviseacute par 11
118
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero de reacutesidu
Fig III 12 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O
L‟ensemble des points se situe en dessous de un qui est la valeur maximale de deuteacuteration
attendue correspondant exactement agrave l‟incorporation d‟un deuteacuterium par hydrogegravene d‟amide
Plus le taux de deuteacuteration s‟eacuteloigne de la valeur de un plus la zone correspondante de la
proteacuteine est structureacutee Inversement plus le taux est proche de un moins la proteacuteine est
structureacutee Ces reacutesultats peuvent donc ecirctre exploiteacutes pour obtenir des informations structurales
sur la sous-uniteacute α3 du complexe d‟initiation de la traduction aIF2 chez Sulfolobus
solfataricus Ils ont eacuteteacute reporteacutes sur la structure primaire d‟aIF2α3 dans laquelle des eacuteleacutements
de structure connus (heacutelices feuillets et boucles) ont eacuteteacute indiqueacutes (Fig III 13) Les zones en
bleu caracteacuteriseacutees par une incorporation faible de deuteacuteriums indiquent une zone tregraves
structureacutee de la proteacuteine Le passage de bleu agrave rouge (avec des zones intermeacutediaires en vert
jaune ou orange) montre des segments de la proteacuteine de moins en moins structureacutes
119
Fig III 13 Repreacutesentation scheacutematique sur la structure primaire et secondaire drsquoaIF2α3 du
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu Ce nombre a eacuteteacute calculeacute agrave partir des taux de
deuteacuteration drsquoions fragments conseacutecutifs ou proches pour les seacuteries c et z apregraves une heure
drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O
Malgreacute la diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD des
informations de structure sont deacuteduites sur une grande partie de la proteacuteine Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves est principalement obtenue au niveau des extreacutemiteacutes et dans des zones non
structureacutees de la proteacuteine Notons que la zone pour laquelle agrave la fois des ions c et z sont
obtenus preacutesente une parfaite correacutelation entre nos reacutesultats ce qui constitue une validation
suppleacutementaire de notre approche Neacuteanmoins nous n‟observons pas toujours une tregraves bonne
correacutelation entre les taux d‟incorporation des deuteacuteriums que nous avons calculeacutes et les
eacuteleacutements structuraux proposeacutes par la cristallographie et notamment en ce qui concerne la
zone [20-55] Cette zone qui comprend l‟heacutelice α1 le feuillet β2 et le deacutebut du feuillet β3
correspond agrave la partie de la proteacuteine qui interagit avec la sous-uniteacute γ lorsqu‟il y a formation
du complexe
Il est eacutegalement possible de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums dans la proteacuteine entiegravere
ou au niveau des ions fragments au cours du temps en reacutealisant des cineacutetiques d‟eacutechange HD
En faisant varier le temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O il est alors possible
d‟obtenir diffeacuterents points de cineacutetique et donc de tracer une courbe de cineacutetique
d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) Elle nous renseigne sur la vitesse
d‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine et sur le taux de deuteacuteration maximal atteint
120
Dans le cas de la proteacuteine aIF2α3 la vitesse d‟eacutechange HD est tregraves rapide Un plateau est
atteint degraves trente minutes d‟incubation correspondant agrave un marquage maximal d‟environ 66
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
d
eu
teri
ation
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
Temps (minutes)
Po
urc
enta
ge
de
deu
teacutera
tio
n
Fig III 14 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la proteacuteine entiegravere
Les vitesses d‟eacutechange pour les diffeacuterents ions fragments peuvent eacutegalement ecirctre traceacutees
(Fig III 15) Une autre maniegravere simple (autre que celle discuteacutee dans III2214) de s‟assurer
qu‟il n‟y a pas eu un reacutearrangement aleacuteatoire total des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique est de veacuterifier que les pourcentages de deuteacuteration observeacutes pour les ions
fragments c et z de mecircme taille ne sont pas identiques En effet deux cineacutetiques d‟eacutechange
identiques pour des ions fragments c et z comportant le mecircme nombre d‟hydrogegravenes
eacutechangeables seraient la signature d‟une redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums ayant
eu lieu avant la formation de ces ions
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500
c13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
9193319575m1
0053075008066m2
9422930195m3
045244084732m4
NA12581Chisq
NA097786R
0
10
20
30
40
50
60
70
0 500 1000 1500
z13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
1007264506m1
3463903455m2
11624-095451m3
095437m4
NA93538Chisq
NA099061R
Fig III 15 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour les ions fragments c13 et z13
dichargeacutes
121
Nous avons donc geacuteneacutereacute un important jeu de donneacutees par la reacutealisation d‟une cineacutetique
d‟eacutechange HD combineacutee agrave une fragmentation par ECD Nous avons montreacute que notre
approche permettait de limiter la redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique en phase gazeuse et d‟obtenir des informations de structure sur une grande partie
de la proteacuteine Neacuteanmoins la comparaison de nos reacutesultats de HDX avec les donneacutees obtenues
par cristallographie montre des diffeacuterences que l‟on peut peut-ecirctre expliquer par le fait que les
donneacutees de cristallographie sont issues du complexe (16) La proteacuteine adopterait une
conformation particuliegravere (en heacutelice et feuillets) lorsqu‟elle serait en interaction avec la sous-
uniteacute γ afin de stabiliser la formation du complexe tandis qu‟en absence de son partenaire
proteacuteique elle resterait deacutestructureacutee Une analyse du sous-complexe aIF2α3γ permettra de
confirmer cette hypothegravese
En conclusion nos reacutesultats sont encourageants mais ils doivent eacutegalement ecirctre ameacutelioreacutes
pour que nous puissions obtenir des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute pour une
grande partie de la proteacuteine qui nous permettraient de distinguer tregraves nettement des zones
structureacutees de segments deacutesordonneacutes
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ
III2221 Optimisation du protocole drsquoanalyse
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres de source et la concentration de
l‟eacutechantillon proteacuteique afin d‟obtenir une bonne intensiteacute du signal sur l‟APEX-Qe Alors que
la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute analyseacutee agrave la concentration de 57 microM une concentration de 74 microM
apregraves laquo quench raquo et deacutenaturation a eacuteteacute neacutecessaire agrave l‟obtention d‟un spectre de masse aussi
intense que celui qui avait eacuteteacute obtenu pour la proteacuteine seule De plus nous avons reacutegleacute
l‟instrument pour maximiser l‟observation de la sous-uniteacute α3 en particulier via les reacuteglages
du quadripocircle de l‟instrument car nous avions deacutejagrave un jeu de donneacutees sur cette proteacuteine Le
spectre de masse d‟aIF2α3 en complexe avec γ ainsi obtenu est donneacute dans la Fig III 16
122
aIF2a3g_ss_noHD_000003d +MS
0
1
2
3
4
7x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+13H]13+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+[M+14H]14+
mz
Intensx107
Fig III 16 Spectre MS drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HDX obtenu sur lrsquoAPEX-
Qe avec maximisation de lrsquointensiteacute de la sous-uniteacute α3
Dans une deuxiegraveme eacutetape les paramegravetres ECD ont eacuteteacute optimiseacutes pour obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ avant
l‟ajout de l‟eacutetape d‟eacutechange HD Le meilleur pourcentage de couverture de seacutequence obtenu
a eacuteteacute d‟environ 40 avec les paramegravetres suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par
des eacutelectrons de 1 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 35 ms Le spectre ECD correspondant est
donneacute dans la Fig III 17
aIF2a3g_ss_noHD_000005d +MS
0
1
2
3
6x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 mzmz
Intensx106
Fig III 17 Spectre ECD drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HD enregistreacute sur
lrsquoAPEX-Qe
123
Finalement le complexe a eacuteteacute analyseacute par HDXECD Le protocole de marquage du
complexe aIF2α3γ est identique agrave celui utiliseacute pour la proteacuteine α3 seule Le principe est
rappeleacute dans la Fig III 18 La fragmentation ECD est reacutealiseacutee sur la sous-uniteacute α3 apregraves
diffeacuterents temps d‟incubation du complexe α3γ dans D2O
Fig III 18 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude de la sous-uniteacute alpha3 en
complexe avec gamma (aIF2α3γ) en HDXMS par analyse laquo top-down raquo ECD
III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD
L‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine aIF2α3 en complexe avec γ a eacuteteacute suivie au
cours du temps et compareacutee agrave celle qui avait eacuteteacute obtenue pour la sous-uniteacute α3 seule (Fig III
19) Les deux courbes de cineacutetique d‟eacutechange HD preacutesentent la mecircme allure Neacuteanmoins
une diffeacuterence notable au niveau du taux maximal de deuteacuteration a eacuteteacute mise en eacutevidence
apregraves association de la proteacuteine En effet lorsque la proteacuteine a eacuteteacute complexeacutee la valeur
maximale atteinte a diminueacute d‟environ 20 passant de 66 (pour la proteacuteine seule) agrave 48
(pour la proteacuteine en complexe) Ce reacutesultat est encourageant dans la mesure ougrave l‟on attend une
baisse de la deuteacuteration pour α3 apregraves son association avec γ En effet une diminution des
vitesses d‟eacutechange HD est attendue dans la zone d‟interaction des deux sous-uniteacutes
124
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
Sous uniteacute alpha3 seulSous uniteacute alpha3 en complexe
d
eu
teriatio
n
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
5657830388m1
00240560048802m2
5050216726m3
5630328684m4
NA43553Chisq
NA091987R
Temps (minutes)
Pourc
enta
ge
de
deu
teacutera
tion
Fig III 19 Cineacutetiques drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la sous-uniteacute alpha3 seule
(aIF2α3 courbe en noir) et en complexe avec gamma (aIF2α3γ courbe en rouge)
Nous nous sommes ensuite inteacuteresseacutes aux diffeacuterences locales d‟incorporation des
deuteacuteriums pour la proteacuteine en complexe que nous avons compareacutees agrave celles qui avaient eacuteteacute
obtenues pour la proteacuteine seule (Fig III 12) afin de deacuteterminer la surface d‟interaction Pour
cela nous avons repreacutesenteacute comme nous l‟avions fait pour la proteacuteine seule (III2214) le
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par fragments en fonction du numeacutero de reacutesidu
correspondant ainsi que le nombre de deuteacuteriums par acide amineacute calculeacute agrave partir des ions des
deux seacuteries c et z Les reacutesultats sont preacutesenteacutes dans les Fig III 20 et Fig III 21
Ainsi nous avons pu constater que nous n‟avions toujours pas de redistribution aleacuteatoire
totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD car l‟incorporation des deuteacuteriums le long
de la seacutequence ne suit pas la moyenne statistique (Fig III 20)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero du reacutesidu
Ions fragments c
Fig III 20 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion c issu
de la fragmentation ECD drsquoaIF2α3 en fonction de son numeacutero de reacutesidu apregraves une heure
drsquoincubation du complexe aIF2α3γ dans D2O
125
De plus en comparant le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour α3 seule
et α3 en complexe avec γ on a pu mettre en eacutevidence des zones de la proteacuteine qui
eacutechangeaient moins rapidement (flegraveches descendantes Fig III 21) dans le cas de
l‟association des sous-uniteacutes Les graphes montrent eacutegalement des segments peptidiques qui
ont un taux d‟eacutechange plus important (flegraveches ascendantes) ou similaire (signes eacutegal) dans la
proteacuteine en complexe par rapport agrave la proteacuteine seule
Nous avons ensuite repreacutesenteacute les diffeacuterences de deuteacuteration obtenues par reacutesidu ou
segment peptidique entre la proteacuteine α3 seule et en complexe avec γ (deacutetermineacutees agrave partir de
Fig III 21) sur la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (Fig III 22) afin d‟eacutemettre des
hypothegraveses quant agrave la maniegravere dont les sous-uniteacutes se lient entre elles Les reacutesultats montrent
que l‟ensemble de la proteacuteine semble voir la vitesse d‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide
modifieacutee dans le complexe et qu‟il n‟est pas possible de localiser preacuteciseacutement de surface
d‟interaction On notera en particulier que la reacuteduction de vitesse d‟eacutechange aurait pu donner
la zone de contact par une baisse d‟accessibiliteacute mais que la reacuteduction de la vitesse d‟eacutechange
peut aussi ecirctre lieacutee agrave des changements conformationnels ou agrave des variations de la dynamique
de la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ
126
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mbre
de
deu
teacuteri
um
s
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Fig III 21 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus pour la
sous-uniteacute alpha3 seule (aIF2α3 points en noir) sont compareacutes agrave ceux de la sous-uniteacute
alpha3 en complexe avec gamma (aIF2α3γ points en rouge)
Sous-uniteacute 3
N-ter
Heacutelice 2
C-ter
Heacutelice 1
D
Sous-uniteacute
Sous-uniteacute
Fig III 22 Structure tridimensionnelle du complexe aIF2αβγ de S solfataricus obtenu par
cristallographie (16) Zoom sur la sous-uniteacute α3 sur laquelle ont eacuteteacute reporteacutees les diffeacuterences
de deuteacuteration entre la proteacuteine seule et en complexe
127
Nous avons ensuite voulu comparer l‟ETD agrave l‟ECD en termes de sensibiliteacute rapiditeacute et
efficaciteacute de fragmentation avec pour objectif de gagner en reacutesolution spatiale Pour cela nous
avons fragmenteacute en ETD la proteacuteine aIF2α3 et compareacute ces reacutesultats agrave ceux obtenus
auparavant en ECD
III23 Fragmentation par ETD
III231 Spectre de masse
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment ces expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un instrument de type Orbitrap (Fig III 23) Le spectre de masse d‟aIF2α3 a eacuteteacute
obtenu apregraves infusion directe via le systegraveme de seringue refroidie de la proteacuteine agrave la
concentration de 57 microM et apregraves son ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
Fig III 23 Spectre MS drsquoaIF2α3 obtenu sur un spectromegravetre de masse LTQ Orbitrap Velos
apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
128
III232 Reacutesultats obtenus en ETD
Nous avons observeacute le mecircme pheacutenomegravene en ETD qu‟en ECD la couverture de seacutequence
obtenue apregraves seacutelection d‟un eacutetat de charge particulier est moins bonne que celle obtenue sans
seacutelection Le problegraveme est que si on peut travailler sans seacutelection sur le FT-ICR ce nest pas
le cas pour lOrbitrap Nous avons eacutegalement constateacute que comme en ECD le nombre d‟ions
fragments deacutetecteacute eacutetait lieacute agrave l‟eacutetat de charge seacutelectionneacute de la proteacuteine mecircme si une meilleure
couverture de seacutequence est obtenue sans seacutelection Il est classiquement observeacute que plus l‟eacutetat
de charge seacutelectionneacute est important meilleure est la fragmentation En ETD comme en ECD
nous avons observeacute que la fragmentation eacutetait meilleure lorsqu‟un eacutetat de charge pair eacutetait
seacutelectionneacute et qu‟elle eacutetait toujours moins bonne pour les eacutetats de charge impairs Nous avons
donc deacutecideacute de fragmenter en ETD deux eacutetats de charge pairs de la proteacuteine correspondant agrave
l‟eacutetat de charge pair le plus eacuteleveacute et agrave celui le plus intense Dans notre cas les eacutetats de charge
14+ et 12+ ont eacuteteacute seacutelectionneacutes (Fig III 23) pour ecirctre ensuite fragmenteacutes (Fig III 24)
L‟eacutetude des reacutesultats de fragmentation de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 12+ a permis
l‟identification de 51 ions fragments correspondant agrave 29 ions c et 22 ions z dont deux paires
d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de
533 (Fig III 24 (a)) L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ a
quant agrave elle reacuteveacuteleacute la preacutesence de 61 ions fragments correspondant agrave 31 ions c et 30 ions z
dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Une meilleure couverture de seacutequence avec un
pourcentage de 663 a ainsi eacuteteacute obtenue (Fig III 24 (b)) Afin d‟optimiser le pourcentage
de couverture de seacutequence de la proteacuteine trois temps d‟activation (10 15 et 25 ms) d‟une
minute chacun ont eacuteteacute testeacutes conseacutecutivement Il est apparu que la combinaison de tous les
scans enregistreacutes pendant ces trois minutes de fragmentation ETD a permis d‟obtenir le
meilleur reacutesultat de recouvrement de seacutequence L‟option laquo supplemental activation raquo a eacuteteacute
utiliseacutee Sur la base de ces reacutesultats nous avons donc choisi de fragmenter l‟eacutetat de charge
14+ apregraves eacutechange avec ces trois temps d‟activation
129
1102001-01_3_110105164919 300-536 RT 349-648 AV 237 NL 254E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 86974etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
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30
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Re
lative
Ab
un
da
nce
1102001-01_3_110105164919 64-296 RT 048-344 AV 233 NL 257E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 74564etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
Fig III 24 Spectre ETD de la sous-uniteacute aIF2α3 seule sans eacutechange HD avec seacutelection de
lrsquoeacutetat de charge 12+ (a) et 14+ (b) et leur couverture de seacutequence associeacutee
III233 Reacutesultats en HDXETD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ETD De
la mecircme maniegravere qu‟en ECD nous avons proceacutedeacute au marquage d‟aIF2α3 pendant un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure
L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ reacutevegravele eacutegalement apregraves
eacutechange HD une diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence agrave 533 (Fig III
25) au lieu de 663 Nous avons identifieacute au total 49 ions fragments correspondant agrave 25 ions
c et 24 ions z dont aucune paire d‟ions compleacutementaires
(a)
(b)
130
Fig III 25 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ETD de lrsquoeacutetat de charge 14+
Le nombre de fragments identifieacutes dans les spectres ETD est leacutegegraverement plus important
que celui obtenu par ECD En revanche apregraves eacutechange HD en ETD comme en ECD une
importante perte de sensibiliteacute est observeacutee reacuteduisant consideacuterablement le pourcentage de
couverture de seacutequence (Fig III 26) Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment pour l‟ECD
une des ameacuteliorations agrave ce problegraveme serait d‟augmenter la dureacutee d‟analyse pour pouvoir
accumuler (ou combiner en ETD) un plus grand nombre de scans MSMS afin de faire sortir
les petits pics du bruit de fond Lagrave ougrave en ECD nous avions utiliseacute la totaliteacute des dix minutes
d‟analyse autoriseacutees avec le systegraveme de seringue refroidie avant que le laquo back-exchange raquo
devienne un problegraveme majeur en ETD en revanche seulement trois minutes de
fragmentation ont eacuteteacute reacutealiseacutees Ces expeacuteriences HDX eacutetant preacuteliminaires il conviendra par la
suite de profiter des dix minutes que nous disposons avec le systegraveme de seringue refroidie
pour reacutealiser la fragmentation ETD
Neacuteanmoins ces reacutesultats nous ont paru encourageants pour lutilisation de lETD plutocirct que
lECD pour ces approches laquo top-down raquo HDX car lETD est disponible sur un nombre de
spectromegravetres de masse bien plus important que lECD qui reste speacutecifique des FT-ICR
131
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
1102001-02_110111172633 11012011 172634ion transfer tube closed
1102001-02_110111172633 233-453 RT 180-470 AV 221 NL 220E3T FTMS + p ESI sa Full ms2 74973etd1000 [25000-200000]
1080 1085 1090 1095 1100 1105 1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145
mz
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Abun
danc
e
11206548
11186450
11226640
11046457
1093632811446618
1132659511096422
1137659710876289
11406533
10849925
11256479
1128648611026351
11111505
10896333
11166401
10986460
10951423
Fig III 26 Comparaison des spectres ECD (en rouge) et ETD (en noir) drsquoaIF2α3 apregraves une
heure drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O Agrandissements des reacutegions du spectre mz
1080-1150 En bleu le spectre ECD de la proteacuteine sans eacutechange HD
III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats drsquoECD
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Xcalibur (Thermo Scientific) La
fenecirctre du logiciel peut ecirctre diviseacutee en trois parties correspondant au chromatogramme au
spectre de masse et agrave la liste de pics associeacutes (Fig III 27) Le spectre ETD de l‟ion preacutecurseur
d‟eacutetat de charge 14+ agrave eacuteteacute geacuteneacutereacute agrave partir du chromatogramme Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment (III232) il reacutesulte de la combinaison des reacutesultats obtenus pour trois temps
d‟activation (10 15 et 25 ms) et correspond agrave une dureacutee d‟analyse d‟environ trois minutes
Les reacutesultats ETD peuvent eacutegalement ecirctre preacutesenteacutes sous forme d‟une liste de pics associant
chaque rapport mz d‟un ion agrave son abondance relative dans le spectre
132
[M+14H]14+
Fragmentation ETD (10 15 et 25 ms)
1 min temps d‟activation
RT ~3 min
Chromatogramme
Spectre ETDListe
des pics
Fig III 27 Preacutesentation de la fenecirctre du logiciel Xcalibur pour le traitement des spectres
ETD
Les reacutesultats ETD sont analyseacutes de la mecircme maniegravere qu‟en ECD Les ions fragments sont
identifieacutes dans les spectres sans eacutechange et apregraves eacutechange Leur masse moyenne pondeacutereacutee est
ensuite deacutetermineacutee dans les deux conditions (sans eacutechange et apregraves eacutechange) Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment est calculeacute en faisant la diffeacuterence de ses deux
masses moyennes pondeacutereacutees et en multipliant le reacutesultat par sa charge Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu est finalement deacuteduit par soustraction du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par deux ions fragments conseacutecutifs Dans le cas ougrave les ions fragments
ne sont pas conseacutecutifs cette diffeacuterence de deuteacuteriums incorporeacutes est moyenneacutee sur
l‟ensemble des acides amineacutes les seacuteparant Les reacutesultats ETD ont eacuteteacute compareacutes agrave ceux qui
avaient eacuteteacute obtenus par ECD (Fig III 28)
133
0
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0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
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Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
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04
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0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Fig III 28 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute apregraves une
heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus en ETD (points en vert) sont compareacutes agrave
ceux obtenus en ECD (points en rose et en bleu respectivement pour les seacuteries drsquoions c et z)
Le taux de deuteacuteration de la proteacuteine entiegravere est de 66 en ECD contre 60 en ETD
Le premier constat agrave l‟issue de l‟analyse des reacutesultats ETD a eacuteteacute l‟obtention de nombres de
deuteacuteriums incorporeacutes supeacuterieurs agrave la valeur maximale attendue (gt 1) pour quelques reacutesidus
Deux hypothegraveses peuvent expliquer ce reacutesultat La premiegravere consiste agrave penser que le lavage
des chaicircnes lateacuterales n‟a pas eacuteteacute total Autrement dit il resterait des deuteacuteriums au niveau des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes qui n‟auraient pas eacuteteacute reacute-eacutechangeacutes avant l‟analyse
Cependant nous avons utiliseacute le mecircme protocole de marquage et le mecircme systegraveme
d‟introduction des eacutechantillons pour l‟analyse des eacutechanges isotopiques par ETD par rapport agrave
celle qui avait eacuteteacute reacutealiseacutee en ECD Or de telles valeurs n‟ont pas eacuteteacute obtenues en ECD
Notons ici que dans le cas de l‟analyse des ions z les zones pour lesquelles on obtient des
valeurs anormales en ETD correspondent agrave des reacutegions de la proteacuteine pour lesquelles tregraves peu
134
d‟informations en ECD avaient eacuteteacute extraites (incorporation moyenne de deuteacuteriums sur une
dizaine d‟acides amineacutes) La seconde hypothegravese repose sur le fait qu‟en ETD certains ions
fragments suivis apregraves eacutechange HD n‟auraient pas eacuteteacute correctement attribueacutes Des
expeacuteriences de MSMS sur ces ions fragments (expeacuteriences de MS3) permettraient de
confirmer ou d‟infirmer cette hypothegravese Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes mais n‟ont
malheureusement pas eacuteteacute concluants La faible intensiteacute des fragments obtenus par MS3 ne
nous a pas permis d‟identifier les ions fragments issus de la MSMS Un problegraveme de fuite au
niveau du montage de seringue refroidie en a eacuteteacute probablement la cause Nous n‟avons pas eu
le temps de reproduire les expeacuteriences
Neacuteanmoins on obtient une relativement bonne correacutelation pour les ions fragments c si on
compare les reacutesultats ETD agrave ceux obtenus en ETD tandis que des diffeacuterences notoires
d‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu pour les ions fragments z sont observeacutees Les
graphes ne se superposent pas agrave l‟exception de petites zones qui s‟alignent entre elles
III235 Conclusion
Contrairement aux analyses reacutealiseacutees en ECD les expeacuteriences ETD requiegraverent la seacutelection
preacutealable d‟un eacutetat de charge Malgreacute cette contrainte une couverture de seacutequence
leacutegegraverement meilleure a eacuteteacute obtenue en ETD (sans eacutechange et apregraves eacutechange HD) Elle a eacuteteacute
deacuteduite de la combinaison de spectres enregistreacutes pour trois temps d‟activation diffeacuterents (10
15 et 25 ms) correspondant agrave trois minutes de fragmentation au total Les spectres ECD
reacutesultent quant agrave eux de l‟accumulation de scans correspondant agrave la dissociation de la
proteacuteine par un faisceau d‟eacutelectrons d‟eacutenergie cineacutetique et de temps d‟irradiation fixeacutes
pendant dix minutes d‟analyse
Nous avons ensuite deacutecideacute de comparer la fragmentation CID sur des ions preacutecurseurs de
haut eacutetat de charge afin de limiter le laquo scrambling raquo (10) vs les meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECD et ETD)
135
III24 Fragmentation par CID
III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3
III2411 Spectres de masse
La proteacuteine aIF2α3 a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacutee par une approche HDX laquo top-down raquo CID La
premiegravere eacutetape a consisteacute agrave reacutealiser les spectres de masse sans eacutechange et apregraves eacutechange HD
gracircce agrave un instrument de type Q-ToF La proteacuteine deuteacutereacutee a eacuteteacute injecteacutee dans le spectromegravetre
de masse par le systegraveme de seringue refroidie puis ioniseacutee par eacutelectrospray dans des
conditions deacutenaturantes La faible reacutesolution de l‟instrument (Fig III 29) nous a ensuite
obligeacutes agrave veacuterifier les fenecirctres d‟isolation avant la fragmentation par CID Finalement les
eacutenergies de collision ont eacuteteacute optimiseacutees pour chaque eacutetat de charge
Sans eacutechange HD
Apregraves eacutechange HD
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
Fig III 29 Spectres MS drsquoaIF2α3 obtenus sans eacutechange (courbe rouge) et apregraves eacutechange
HD pendant une heure (courbe verte) agrave lrsquoaide drsquoun spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
Un agrandissement de lrsquoion preacutecurseur drsquoeacutetat de charge 13+ a eacuteteacute ajouteacute
136
III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID
L‟analyse des spectres CID des ions preacutecurseurs d‟eacutetat de charge 10+ agrave 16+ de la proteacuteine
aIF2α3 dans H2O a permis l‟identification d‟un total de 54 ions fragments correspondant agrave 23
ions b et 31 ions y dont deux paires d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de
seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 565 (Fig III 30 (a)) Il regroupe l‟ensemble de tous les ions
fragments identifieacutes dans les spectres correspondant agrave la dissociation des diffeacuterents eacutetats de
charge Apregraves incubation de la proteacuteine dans D2O pendant une heure et fragmentation par
CID seulement 20 ions fragments au total ont pu ecirctre suivis correspondant agrave 14 ions b et 6
ions y dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de la couverture de
seacutequence a ainsi eacuteteacute reacuteduit agrave 217 apregraves eacutechange HD (Fig III 30 (b))
b ions y ions Fig III 30 Pourcentages de couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 sans eacutechange (a) et apregraves
eacutechange HD (b) obtenus par fragmentation CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave
16+
La Fig III 31 illustre la complexiteacute du traitement des donneacutees en CID De la mecircme
maniegravere qu‟en ECD ou en ETD l‟analyse a consisteacute agrave deacuteterminer des masses moyennes
pondeacutereacutees d‟ions fragments La reacutesolution relativement faible de l‟instrument ainsi que la
faible abondance de certains ions fragments ont contribueacute agrave la diminution du nombre de
fragments pouvant ecirctre suivis apregraves eacutechange HD Ainsi le fragment b375+
a pu ecirctre interpreacuteteacute
dans les spectres de fragmentation par CID des ions preacutecurseurs 12+ agrave 16+ mais pas dans
ceux des eacutetats de charge 10+ et 11+ (Fig III 31) D‟autres (eg y2+ y3
+ y4
+ hellip) n‟ont pu ecirctre
suivis dans aucun des spectres (Fig III 30)
(a)
(b)
137
b375+[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+16H]16+
[M+11H]11+
[M+13H]13+
Fig III 31 Spectres CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave 16+ Agrandissement
(a) de la reacutegion mz 832-852 permettant de suivre le massif isotopique de lrsquoion fragment b375+
dans les diffeacuterents eacutetats de charge et (b) du massif isotopique lui-mecircme dans les eacutetats de
charge 11+ et 13+ pour montrer la complexiteacute de lrsquoanalyse
Nous avons ensuite calculeacute le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par les fragments qu‟il
nous eacutetait possible de suivre apregraves eacutechange HD dans les spectres CID des diffeacuterents eacutetats de
charge Nous avons reporteacute ces valeurs en fonction du numeacutero de reacutesidu dans la seacutequence
(Fig III 32) Rappelons que la ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la
seacutequence de tous les deuteacuteriums incorporeacutes dans la proteacuteine Il s‟agit donc dune courbe
theacuteorique Elle donne le nombre moyen de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment
calculeacute agrave partir du contenu maximal en deuteacuteriums de la proteacuteine Dans le cas que nous
preacutesentons qui correspond agrave un temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte
(a)
(b)
138
eacutetait marqueacutee agrave 57 Chaque point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de
057 deuteacuterium par reacutesidu
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Courbe theacuteorique
11+
12+
13+
14+
15+
16+
Numeacutero du reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments b ( Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
11+
13+15+14+
11+
14+15+
13+
12+
Fig III 32 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment b issus de la dissociation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 11+ agrave 16+ en
fonction de son numeacutero de reacutesidu La proteacuteine a eacuteteacute incubeacutee pendant une heure dans D2O
avant analyse
A la vue de ces reacutesultats on note que tous les points expeacuterimentaux ne sont pas aligneacutes sur
la courbe theacuteorique Par conseacutequent nous pouvons conclure de ce premier constat que nos
expeacuteriences HDXCID ne semblent pas aboutir agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des
deuteacuteriums le long de la chaicircne peptidique On remarque eacutegalement que les points
correspondant agrave la fragmentation du plus petit eacutetat de charge le 11+ (points en rouge sur la
Fig III 32) sont effectivement les plus proches de la redistribution totale des deuteacuteriums
Ainsi il semble reacuteellement y avoir un rapport entre le taux de redistribution HD et leacutetat de
charge du preacutecurseur Neacuteanmoins il est curieux dobserver que cest lion chargeacute 13+ qui
conduit aux ions fragments les plus eacuteloigneacutes de cette redistribution totale
Nous avons ici voulu reproduire les expeacuteriences HDXCID meneacutees tregraves reacutecemment par
l‟eacutequipe d‟I Kaltashov (10) sur notre systegraveme d‟eacutetude Ils ont montreacute qu‟il eacutetait possible
d‟analyser les eacutechanges isotopiques HD au sein des proteacuteines par une approche laquo top-down raquo
associeacutee agrave une activation collisionnelle (CID) En effet la seacutelection et la dissociation d‟ions
139
proteacuteiques de hauts eacutetats de charge limiteraient le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Or dans son
article I Kaltashov n‟a consideacutereacute qu‟un seul fragment le b19 pour en arriver agrave cette
conclusion Il ne s‟est donc inteacuteresseacute qu‟aux reacutesultats contenus sur une verticale du graphe
Dans notre cas si on se place au niveau des deux verticales que nous avons traceacutees sur la Fig
III 32 nos reacutesultats sont coheacuterents avec ceux de l‟article En revanche la discrimination nette
entre les grands et les petits eacutetats de charge n‟est pas toujours eacutevidente et parfois les reacutesultats
contredisent ceux obtenus par I Kaltashov
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines
Pour rendre l‟eacutetude du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo plus facile agrave mettre en eacutevidence
l‟article de I Kaltashov (10) se basait sur l‟utilisation d‟une eacutetiquette poly-histidines placeacutee agrave
l‟extreacutemiteacute soit N- soit C-terminale de la proteacuteine qu‟ils ont eacutetudieacutee L‟inteacuterecirct eacutetait que ces
segments sont connus comme eacutetant non structureacutes et qu‟on peut par conseacutequent preacutedire que la
vitesse d‟eacutechange y sera maximale par rapport agrave la partie structureacutee de la proteacuteine Dans le
cadre de leurs expeacuteriences la proteacuteine est initialement totalement marqueacutee par des deuteacuteriums
par dissolution dans du D2O et l‟incubation se fait en conditions natives apregraves dilution dans un
tampon H2O 10 mM aceacutetate d‟ammonium De ce fait on attend une perte rapide de la
deuteacuteration sur l‟extreacutemiteacute poly-histidines des proteacuteines Ils observent ainsi (Fig III 33) que
l‟activation par CID conduit agrave un laquo scrambling raquo important pour les eacutetats de charge faibles (9+
agrave 11+) alors qu‟il est nettement reacuteduit pour les eacutetats de charge 14+ agrave 20+
Nous avons souhaiteacute construire un systegraveme eacutequivalent pour notre proteacuteine aIF2α3 afin de
voir si nous aussi en CID pouvions mettre en eacutevidence la preacutesence de laquo scrambling raquo ou non
Pour cela nous avons construit un mutant de la proteacuteine aIF2α3 et l‟avons exprimeacute en
collaboration avec le Laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique La seacutequence de ce
mutant est donneacutee sur la Fig III 34
140
22 D
11 D
Avec Redistribution des D
Sans redistribution des D
Segment non structureacute de 21 acides amineacutes
Fig III 33 Nombre moyen de deuteacuteriums pour le fragment b19 en fonction de lrsquoeacutetat de charge
de lrsquoion preacutecurseur Les lignes horizontales en gris indiquent le nombre moyen de deuteacuteriums
calculeacute dans le cas drsquoune redistribution aleacuteatoire totale des hydrogegravenes et deuteacuteriums labiles
au sein de lrsquoion preacutecurseur avant la dissociation (en haut) et dans le cas de lrsquoabsence de
pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo (en bas)
Fig III 34 Seacutequence drsquoaIF2α3 comportant lrsquoeacutetiquette poly-histidines (acides amineacutes en vert)
En rose les fragments eacutetudieacutes par HDXCID
Notons degraves maintenant qu‟il nous eacutetait impossible de reproduire exactement l‟expeacuterience
d‟I Kaltashov avec notre proteacuteine en effet elle est instable dans des conditions non-salines
et ne peut ecirctre lyophiliseacutee Par conseacutequent il sera neacutecessaire de proceacuteder par un double
eacutechange tel que fait jusqu‟agrave preacutesent ie commencer par diluer la proteacuteine dans une solution
D2O NaCl 330 mM puis arrecircter l‟eacutechange par une dilution frac12 dans une solution H2O acide
formique 2 avant de proceacuteder au dessalage sur colonne De ce fait on ne profite plus de
l‟aspect deacutestructureacute de la chaicircne poly-histidines (qui sera rapidement deuteacutereacutee dans l‟eacutetape
d‟eacutechange) mais de la grande vitesse de reacute-eacutechange de la chaicircne poly-histidines une fois celle-
ci placeacutee en condition d‟arrecirct tel qu‟observeacute sur les peptides de T Joslashrgensen au Chap II On
peut consideacuterer que l‟eacutechange inverse (laquo back-exchange raquo) sera de la mecircme faccedilon que pour le
141
peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) nettement plus rapide sur la partie poly-histidines que sur le
reste de la seacutequence proteacuteique
Nous avons ensuite eacutetudieacute par HDXCID les fragments b2-10 correspondant aux fragments
situeacutes dans l‟eacutetiquette poly-histidines (en vert sur Fig III 34) ainsi que les fragments
communs avec ceux de la proteacuteine sans poly-histidines soit les fragments b21-22 et b28
correspondant aux fragments b9-10 et b16 de la proteacuteine sans eacutetiquette poly-histidines Les
reacutesultats obtenus sont preacutesenteacutes dans la Fig III 35 Ils sont compareacutes agrave ceux de la Fig III 32
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 20 25 30
Courbe theacuteorique
17+
16+
15+
14+
13+17+
14+
16+15+
17+
14+
16+
15+
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Numeacutero du reacutesidu
Fig III 35 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums contenus dans les ions b issus de la
fragmentation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 13+ agrave 17+ en fonction de leur
position dans la seacutequence (numeacutero de reacutesidu) La proteacuteine laquo taggeacutee raquo a eacuteteacute incubeacutee pendant
une heure dans D2O Son analyse en MS reacutevegravele un pourcentage de deuteacuteration de 57
On constate tout d‟abord que les fragments b2 agrave b10 preacutesentent un taux de deuteacuteration
largement infeacuterieur (jusqu‟agrave 2 D d‟eacutecart pour b10) agrave la courbe de laquo scrambling raquo complet Ceci
montre deux choses Le premier reacutesultat est que le laquo scrambling raquo est tregraves loin d‟ecirctre total sur
cette reacutegion Par conseacutequent mecircme en cas de laquo scrambling raquo partiel ce reacutesultat ne peut ecirctre
obtenu que si la deuteacuteration locale est tregraves infeacuterieure agrave la moyenne sur lensemble de la
proteacuteine On peut donc en deacuteduire ce second reacutesultat comme nous lavions espeacutereacute un laquo back-
exchange raquo rapide des hydrogegravenes damide des histidines a bien eu lieu On ne peut pas par
contre savoir si ce laquo back-exchange raquo a eacuteteacute total ou pas On note par ailleurs que dans cette
142
partie de la proteacuteine l‟eacutetat de charge ne semble pas jouer un rocircle important sur la deuteacuteration
nettement moins en tout cas que les effets observeacutes pour la proteacuteine sans eacutetiquette
Si on s‟inteacuteresse maintenant aux fragments b21-22 et b28 on constate une dispersion des
niveaux de deuteacuteration nettement reacuteduite par rapport agrave celle de la proteacuteine non-marqueacutee et en
tout cas sans aucune rupture brutale similaire agrave celle preacutesenteacutee dans l‟article d‟I Kaltashov Il
est par contre difficile de comparer un agrave un les niveaux de deuteacuteration car on ne connaicirct pas a
priori le niveau de deuteacuteration restant sur la partie poly-histidines Toutefois on notera
qu‟entre les fragments b22 et b28 de la proteacuteine portant un His-tag on a 35 D de diffeacuterence On
retrouve une diffeacuterence similaire entre les fragments b10 et b16 de la proteacuteine portant un His-
tag
Pour compleacuteter ce travail il nous manque un eacuteleacutement qui est la veacuterification du taux reacuteel de
deuteacuteration sur la partie poly-histidines Ce travail reste agrave faire avec un suivi par ECD en
faisant l‟hypothegravese d‟une absence de laquo scrambling raquo dans ce cas
Mais au final une tendance nette semble neacuteanmoins se deacutegager dans une approche laquo top-
down raquo l‟activation par CID ne conduit pas neacutecessairement agrave un laquo scrambling raquo total des
deuteacuteriums d‟amide au moins dans certaines conditions L‟article d‟I Kaltashov semble avoir
identifieacute l‟eacutetat de charge comme eacutetant un facteur Dans notre cas l‟eacutetat de charge ne semble
pas jouer un rocircle aussi marqueacute Mais il faut noter d‟une part que l‟article d‟I Kaltashov
comme notre approche avec le His-tag n‟ont regardeacute le laquo scrambling raquo qu‟au niveau des
extreacutemiteacutes de la proteacuteine et d‟autre part que dans les deux cas un laquo scrambling raquo partiel
semble observeacute puisqu‟il reste une fraction de deuteacuteriums au niveau de l‟extreacutemiteacute
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en
eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse
Les expeacuteriences sont difficilement reproductibles par une mecircme technique ce qui
complique la comparaison entre les diffeacuterentes meacutethodes Plusieurs raisons permettent
d‟expliquer ce fait Tout d‟abord il est tregraves difficile d‟obtenir le mecircme pourcentage initial de
deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere De plus l‟efficaciteacute de fragmentation varie en fonction du
de l‟instrument mais aussi en fonction du temps pour un mecircme instrument N‟oublions pas de
mentionner eacutegalement les problegravemes techniques que nous avons rencontreacutes qui sont lieacutes au
143
montage de seringue refroidie et qui concernent la fuite du systegraveme Un autre fait surprenant
est que nous ne sommes pas parvenus apregraves des temps longs d‟incubation dans D2O agrave un
maximum de deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere proche des 90-95 deacutecrits dans la
litteacuterature En effet le taux maximal de deuteacuteration obtenu pour aIF2α3 si on se reacutefegravere au
laquo fit raquo de double exponentielle de sa cineacutetique d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) a
eacuteteacute de 66 seulement A partir de ce constat deux hypothegraveses peuvent ecirctre formuleacutees
- nous ne sommes pas arriveacutes au bout de la cineacutetique d‟eacutechange de la proteacuteine Dans ce cas
des temps d‟incubation dans D2O plus longs seraient neacutecessaires pour que les hydrogegravenes
d‟amide qui preacutesentent des vitesses d‟eacutechange tregraves lentes finissent par s‟eacutechanger Le laquo fit raquo
de la cineacutetique serait alors agrave revoir
- d‟importantes pertes de deuteacuteriums sont enregistreacutees ce qui n‟est pas souhaitable et pose
le problegraveme de l‟interpreacutetation des reacutesultats
Afin de deacutepartager ces deux hypothegraveses et ainsi de mieux comprendre le sens de nos
reacutesultats nous avons deacutecideacute de deacuteterminer la valeur maximale de reacutefeacuterence ie le taux
maximal de deuteacuteration pour la proteacuteine aIF2α3 Pour cela la proteacuteine a eacuteteacute analyseacutee avec le
mecircme protocole qui a eacuteteacute deacutecrit dans la Fig III 5 agrave l‟exception pregraves qu‟elle a eacuteteacute initialement
placeacutee dans des conditions deacutenaturantes et non plus natives
Afin de deacuteterminer le taux maximal de deuteacuteration de la proteacuteine aIF2α3 nous avons donc
deacutecideacute de la deacutenaturer avec du chlorure de guanidinium preacutealablement agrave l‟analyse HDXMS
Il a eacuteteacute montreacute que ce composeacute chaotropique utiliseacute agrave forte concentration eacutetait capable de
deacutenaturer totalement les proteacuteines (17) ce qui rendrait tous les hydrogegravenes d‟amide
accessibles agrave l‟eacutechange
La proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M
dans D2O agrave 50degC sous agitation pendant 24 heures Puis elle a eacuteteacute analyseacutee en MS afin de
calculer son taux de deuteacuteration Malheureusement aucun signal n‟a eacuteteacute deacutetecteacute indiquant
que la proteacuteine a eacuteteacute deacutegradeacutee ou a preacutecipiteacute suite au traitement chimique La seacutequence de la
proteacuteine aIF2α3 ne comportant que tregraves peu d‟acides amineacutes aromatiques (seulement trois
tyrosines) n‟a pas permis la mesure de la concentration de l‟eacutechantillon par
spectrophotomeacutetrie UV agrave 280 nm Par ailleurs la solution de chlorure de guanidinium quant
agrave elle absorbe agrave la longueur donde utiliseacutee pour les proteacuteines
144
Dans le but de tester si le traitement chimique pour la deacutenaturation deacutegrade la proteacuteine
nous avons deacutecideacute de reacutealiser un gel SDS-PAGE 16 permettant de tester la preacutesence
d‟aIF2α3 (10 kDa) Nous avons eacutegalement souhaiteacute tester si c‟est l‟eacutetape de dessalage qui
conduit agrave la perte de la proteacuteine Pour cela un autre eacutechantillon traiteacute mais non dessaleacute agrave eacuteteacute
preacutepareacute Malheureusement les eacutechantillons sont si visqueux qu‟il est impossible de les
deacuteposer L‟origine de cette viscositeacute n‟est pas tregraves claire neacuteanmoins un temps d‟incubation de
24 heures dans le chlorure de guanidinium semble trop long
Nous avons donc reacutealiseacute d‟autres tests dans des conditions diffeacuterentes afin de deacuteterminer le
temps maximal d‟incubation dans le chlorure de guanidinium pour lequel la proteacuteine n‟est pas
deacutegradeacutee Diffeacuterents temps d‟incubation ont eacuteteacute testeacutes t0=0s t=5h et t=24h Pour chaque
temps d‟incubation le premier eacutechantillon proteacuteique n‟a pas eacuteteacute dessaleacute tandis que le second
l‟a eacuteteacute (Fig III 36) Dans le cas ougrave une eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee (puits 4 6 et 8) la
solution d‟eacutelution correspondant agrave la proteacuteine dans H2OACNAF (49492) a eacuteteacute eacutevaporeacutee
par SpeedVac pour ecirctre ensuite resuspendue dans H2O afin de faciliter son deacutepocirct sur gel apregraves
ajout du tampon Laemmli Sans dessalage la proteacuteine traiteacutee au chlorure de guanidinium est
dilueacutee dans H2OAF2 afin de mimer l‟eacutetape d‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange (Fig III 5)
Les eacutechantillons non dessaleacutes sont ensuite preacutepareacutes avec du tampon Laemmli Neacuteanmoins agrave
l‟issue du meacutelange avec le tampon les eacutechantillons ont preacutecipiteacute empecircchant leur deacutepocirct preacutevu
dans les puits 3 5 et 7 Ce qui explique l‟absence de bandes dans ces puits et donc l‟absence
de proteacuteine Un marqueur de poids moleacuteculaire a eacuteteacute deacuteposeacute dans le premier puits Il s‟agit
d‟un meacutelange de proteacuteines de reacutefeacuterence dont la taille est connue servant agrave estimer la taille des
moleacutecules d‟inteacuterecirct Un teacutemoin positif a eacuteteacute deacuteposeacute dans le deuxiegraveme et dernier puits Il est
constitueacute de la proteacuteine aIF2α3 n‟ayant pas subi de traitement chimique ni de dessalage Une
bande intense autour de 10 kDa est observeacutee dans ces deux puits teacutemoignant de la preacutesence de
la proteacuteine Une mecircme quantiteacute de mateacuteriel (18 microg) a eacuteteacute deacuteposeacutee dans tous les puits lorsque
le deacutepocirct eacutetait possible
145
Marqueurα3H2O
α3G3M agrave t0
sans incubation
avec dessalage
α3G3M
avec incubation de 5h
et dessalage
α3G3M avec
incubation de 24h
et dessalage
α3H2O
Jour + 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
18 microg 18 microg 18 microg 18 microg 18 microg
10 kDa
Fig III 36 Image du gel SDS-PAGE 16 La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute deacutenatureacutee apregraves
diffeacuterents temps drsquoincubation dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M Pour
chaque temps drsquoincubation deux eacutechantillons sont testeacutes sans et avec lrsquoeacutetape de dessalage
La proteacuteine aIF2α3 est preacutesente dans les puits 4 et 6 alors qu‟elle a subi le traitement
chimique avec le chlorure de guanidinium et l‟eacutetape de dessalage mais elle n‟est pas retrouveacutee
dans le puits 8 Pourtant dans ce cas lagrave elle a aussi eacuteteacute traiteacutee par le chlorure de guanidinium
mais pendant un temps beaucoup plus long (24 heures) et dessaleacutee
Par conseacutequent on peut conclure que c‟est le temps du traitement chimique (incubation
dans une solution de chlorure de guanidinium 3 M agrave 50degC sous agitation) qui est critique
dans le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine En effet la proteacuteine aIF2α3 est deacutegradeacutee suite agrave
une incubation pendant une dureacutee de vingt-quatre heures tandis qu‟elle est toujours preacutesente
pour un temps d‟incubation infeacuterieur ou eacutegal agrave cinq heures
Le taux de deuteacuteration maximal de la proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute deacutetermineacute par
spectromeacutetrie de masse apregraves deacutenaturation de la proteacuteine dans une solution de chlorure de
guanidinium 3 M preacutepareacutee dans du D2O Les temps d‟incubation t=1h et t=5h ont eacuteteacute testeacutes
(Tab III 1)
Nous obtenons des pourcentages de deuteacuteration leacutegegraverement plus eacuteleveacutes dans le cas d‟une
deacutenaturation de la proteacuteine pendant des temps d‟une heure et cinq heures (73) par rapport agrave
une incubation classique dans D2O (66) Afin de s‟assurer que la proteacuteine a bien eacuteteacute
deacutenatureacutee par le traitement chimique d‟autres conditions ont eacuteteacute testeacutees tempeacuterature
146
d‟incubation de 95degC concentration en chlorure de guanidinium de 6 M Les reacutesultats sont
preacutesenteacutes dans le Tab III 2 Malgreacute diffeacuterentes conditions de deacutenaturation testeacutees nous
n‟obtenons pas de pourcentage de deuteacuteration proche de la limite supeacuterieure de 875 donneacutee
par la dilution agrave 18 de la solution H2O dans du D2O
Tab III 1 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions natives (0 M de deacutenaturant) et
deacutenaturantes (3 M de deacutenaturant) La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee soit dans un tampon
NaCl 330 mMD2O (conditions natives) soit dans une solution de chlorure de guanidinium 3
MD2O (conditions deacutenaturantes) pendant des temps variables Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee
avant drsquoecirctre analyseacutee par MS La valeur de reacutefeacuterence (66) obtenue dans des conditions
natives est indiqueacutee Une valeur moyenne (triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes
conditions deacutenaturantes
Concentration
du deacutenaturant 0 M 3 M 3 M
Conditions
drsquoincubation 1 h
37degC 600 rpm 1 h
50degC 700 rpm 5 h
50degC 700 rpm
Taux de
deuteacuteration 66 73 73
Tab III 2 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions deacutenaturantes La proteacuteine
aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidiniumD2O dans diffeacuterentes
conditions Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee avant drsquoecirctre analyseacutee par MS Une valeur moyenne
(triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes conditions
Concentration
du deacutenaturant 3 M 6 M
Conditions
drsquoincubation 5 min
95degC 700 rpm 1 h
50degC 700 rpm Taux de
deuteacuteration 70 72
En reconsideacuterant donc les deux hypothegraveses formuleacutees preacuteceacutedemment il semblerait que le
pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse soit important dans nos conditions expeacuterimentales Il a lieu en
solution avant l‟analyse finale en MS lors de la preacuteparation des eacutechantillons (eacutetape de
dessalage) et au cours de leur introduction dans le spectromegravetre de masse avec le systegraveme de
seringue refroidie utiliseacute
Afin de mettre en eacutevidence l‟influence de l‟eacutetape de dessalage sur l‟eacutechange inverse nous
avons mesureacute les pourcentages de deuteacuteration de peptide et proteacuteine modegraveles complegravetement
deuteacutereacutes avec notre systegraveme de seringue refroidie La substance P (peptide de onze reacutesidus) a
donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution ACND2O (7525) pendant une heure agrave 37degC sous
agitation La reacuteaction d‟eacutechange a eacuteteacute arrecircteacutee par diminution du pH et de la tempeacuterature puis
147
le peptide totalement marqueacute a eacuteteacute dilueacute dans H2OACNAF (49492) afin d‟ecirctre analyseacute par
MS L‟expeacuterience a eacuteteacute reconduite une seconde fois mais en incluant l‟eacutetape de dessalage
avant l‟analyse par MS Sur le FT-ICR les pourcentages moyens (triplicats) de deuteacuteration
obtenus sont les suivants 914 sans l‟eacutetape de dessalage et 77 avec l‟eacutetape de dessalage
Sur le Q-TOF le taux maximum sans dessalage n‟atteint que 856 indiquant que c‟est bien
l‟introduction dans la source qui conduisait agrave un accroissement du laquo back-exchange raquo sur
celui-ci Il semblerait que l‟eacutetape de dessalage conduise agrave une perte d‟environ 15 de la
totaliteacute du marquage pour les peptides Il convient de noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees directement agrave partir de la poudre donc sans dilution initiale Par conseacutequent si on
considegravere les 77 de deuteacuteration obtenus apregraves dessalage appliqueacutes sur une solution agrave 875
de deuteacuteriums on trouve un maximum de deuteacuteration de 67 soit assez proche des 72-73
obtenus apregraves deacutenaturation complegravete
III4 Conclusion
Nos reacutesultats montrent qu‟il est possible deacuteviter une redistribution des deuteacuteriums dans la
seacutequence polypeptidique au moment de la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines par
approches laquo top-down raquo L‟ECD et l‟ETD semblent preacutesenter une bonne capaciteacute agrave garder la
localisation initiale des deuteacuteriums Dans le cas de l‟activation par CID nos reacutesultats
rejoignent ceux de la litteacuterature en restant incertains il ne nous a pas eacuteteacute possible ni de
montrer l‟absence de laquo scrambling raquo ni de montrer un laquo scrambling raquo complet tombant ainsi
dans une zone intermeacutediaire ougrave les paramegravetres controcirclant l‟extensiviteacute du laquo scrambling raquo
restent incertains
Un autre enseignement de cette partie est qu‟un des problegravemes majeurs de notre approche
est leacutechange inverse qui a lieu en solution avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Ce
pheacutenomegravene est accentueacute dans notre cas par lobligation que nous avons deffectuer une eacutetape
de dessalage des proteacuteines avant leur analyse et la difficulteacute agrave savoir ce qui relegraveve de cette
eacutetape ou de la source dionisation Un autre problegraveme lieacute agrave celui-lagrave est quil est difficile
daccumuler un grand nombre de spectres car au bout dune dizaine de minutes leacutechange
inverse est devenu trop important
Dans ce contexte et avec lideacutee de controcircler beaucoup mieux leacutechange inverse nous avons
deacutecideacute de deacutevelopper un systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
148
spectromegravetre de masse complegravetement nouveau baseacute sur l‟utilisation d‟une enceinte isoleacutee
refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui eacutevite le
deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des deacutebits
faibles Le deacuteveloppement de cette laquo cryosource raquo et les premiers reacutesultats obtenus en
lutilisant font lobjet du dernier chapitre de cette thegravese
149
III5 Bibliographie
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151
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source
refroidie
152
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169
IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186
IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
153
IV1 Echange inverse
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment dans la partie introductive l‟association des
eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium en solution avec la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode de choix pour obtenir des informations sur la structure
tridimensionnelle d‟une proteacuteine ou sur son changement de conformation induit par la fixation
d‟un ligand ou d‟un partenaire proteacuteique Neacuteanmoins cette approche souffre de deux
limitations importantes (i) l‟eacutechange inverse ou laquo back-exchange raquo qui peut avoir lieu en
solution agrave diffeacuterentes eacutetapes de l‟expeacuterience et (ii) la migration intramoleacuteculaire des protons
et des deuteacuterons ou laquo scrambling raquo qui peut se deacuterouler en phase gazeuse particuliegraverement
au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) Ces deux processus
doivent ecirctre minimiseacutes pour obtenir des reacutesultats interpreacutetables Nous avons vu dans le Chap
II que la minimisation du laquo scrambling raquo neacutecessitait une optimisation minutieuse et speacutecifique
des potentiels de la source d‟ionisation et des optiques de transfert ionique afin de rendre
minimale l‟excitation vibrationnelle des ions peptidiques deuteacutereacutes Les paramegravetres
instrumentaux ne peuvent neacuteanmoins pas ecirctre directement transfeacutereacutes d‟un instrument agrave un
autre Il convient donc d‟optimiser individuellement les diffeacuterents reacuteglages de l‟instrument
quand on en change pour eacuteviter la redistribution aleacuteatoire des hydrogegravenes et deuteacuteriums Cela
peut ecirctre commodeacutement reacutealiseacute par l‟utilisation de peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
servant de sonde du laquo scrambling raquo pendant la fragmentation ECD ou ETD (1-3)
Ce dernier chapitre de ma thegravese est consacreacute agrave la minimisation du laquo back-exchange raquo lors
d‟expeacuteriences HDXMS En effet l‟eacutechange inverse reste et demeure une neacutecessiteacute mais
eacutegalement un problegraveme seacuterieux inheacuterent agrave la technique HDX Il conduit agrave une variation du
nombre de deuteacuteriums entre l‟eacutetape de marquage et l‟analyse finale par spectromeacutetrie de
masse En geacuteneacuteral cette variation prend la forme d‟une perte de deuteacuteration apregraves eacutechange
en solution deuteacutereacutee la reacuteaction d‟eacutechange sur les hydrogegravenes d‟amide est fortement ralentie
mais pas totalement arrecircteacutee par passage en conditions acides (pH 25) et agrave tempeacuterature reacuteduite
(0degC) geacuteneacuteralement dans un solvant majoritairement hydrogeacuteneacute Par conseacutequent ce laquo back-
exchange raquo peut avoir lieu lors des eacutetapes de preacuteparation de l‟eacutechantillon (digestion
dessalage concentration seacuteparationhellip) jusqu‟agrave son injection dans le spectromegravetre de masse
et son ionisation en phase gazeuse Ce pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse est neacutecessaire pour
assurer un retour des hydrogegravenes porteacutes par les chaicircnes lateacuterales sous forme hydrogeacuteneacutee mais
doit ecirctre controcircleacute pour maintenir en place le plus grand nombre possible des deuteacuteriums en
position amide pendant le temps neacutecessaire agrave l‟analyse
154
La maniegravere la plus simple de minimiser l‟eacutechange inverse est de maintenir un pH ougrave
l‟eacutechange est minimal et de rester agrave froid (Fig I 11) Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment le pH et la tempeacuterature sont ajusteacutes respectivement agrave 25 et agrave 0degC Sous ces
conditions de laquo quench raquo l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide est diminueacute de cinq ordres de
grandeur par rapport agrave un pH de 7 et une tempeacuterature de 25degC
La demi-vie pour l‟eacutechange inverse dans des conditions d‟arrecirct de la reacuteaction est entre
trente et cent vingt minutes en fonction de la seacutequence peptidique Par conseacutequent les eacutetapes
d‟analyse doivent ecirctre reacutealiseacutees le plus rapidement possible degraves lors que la reacuteaction est
bloqueacutee Ainsi il n‟est pas envisageable de reacutealiser une digestion enzymatique d‟une heure
suivie d‟un gradient d‟une heure suppleacutementaire pour l‟eacutetape de seacuteparation
chromatographique Des protocoles et dispositifs expeacuterimentaux ont eacuteteacute mis au point afin
d‟optimiser les eacutetapes de digestion et de seacuteparation (4-5) Si ces eacutetapes tiennent dans un
minimum de temps d‟environ trente minutes au total le recouvrement en deuteacuteriums peut ecirctre
supeacuterieur agrave 85 Il faut noter que quelques eacutechanges inverses ont lieu dans l‟interface de
l‟eacutelectrospray mais qu‟ils n‟excegravedent pas 5 geacuteneacuteralement
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment les hydrogegravenes des chaicircnes lateacuterales s‟eacutechangent
plus vite que les hydrogegravenes d‟amide Par conseacutequent lorsque la proteacuteine ou les peptides
marqueacutes sont placeacutes dans les solvants hydrogeacuteneacutes utiliseacutes pour la digestion ou l‟analyse
chromatographique tous les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales redeviennent rapidement des
hydrogegravenes Ainsi un increacutement de masse pourra ecirctre associeacute agrave l‟incorporation d‟un
deuteacuterium sur une fonction amide du squelette polypeptidique Le problegraveme est un peu plus
compliqueacute pour les proteacuteines ou les peptides riches en arginine car comme nous l‟avons vu
l‟arginine possegravede sur sa chaicircne lateacuterale deux hydrogegravenes qui eacutechangent agrave la vitesse des
hydrogegravenes d‟amide et pour lesquels l‟eacutetape de lavage (substitution de D en H) sera donc
moins efficace
Notons eacutegalement que les conditions de l‟eacutechange inverse (pH acide solvant organique)
favorisent a priori une forme deacutenatureacutee pour la proteacuteine initiale conduisant agrave un eacutechange
inverse moins deacutependant des structures secondaire tertiaire et quaternaire Par conseacutequent les
vitesses d‟eacutechange ne deacutependent globalement que de la seacutequence primaire Pour des peptides
typiques cette seacutequence conduit agrave une vitesse d‟eacutechange globalement proche pour tous les
sites conduisant agrave un eacutechange inverse de type laquo aleacuteatoire raquo Ceci rend en partie compte de la
forme gaussienne des distributions isotopiques obtenues pour les peptides deuteacutereacutes
155
Finalement le choix d‟une approche laquo top-down raquo semblerait ecirctre la meilleure solution
pour minimiser l‟eacutechange inverse Dans ce cas la proteacuteine entiegravere apregraves arrecirct de la reacuteaction
d‟eacutechange par diminution du pH et de la tempeacuterature est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse Cette approche offre donc la possibiliteacute unique de reacuteduire consideacuterablement l‟effet
du laquo back-exchange raquo voire mecircme de presque l‟eacuteliminer dans des conditions expeacuterimentales
strictes (6) Ceci est ducirc au fait qu‟il n‟y a pas d‟eacutetape preacutealable agrave l‟analyse par spectromeacutetrie
de masse telle qu‟une digestion enzymatique agrave la pepsine ou une seacuteparation
chromatographique en phase liquide Cependant il faut noter le fait qu‟il n‟est pas toujours
possible d‟opter pour une approche laquo top-down raquo En effet pour des systegravemes de taille trop
importante par exemple l‟efficaciteacute de fragmentation en ECD est trop faible pour obtenir une
reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves pour la plus grande partie de la proteacuteine
Dans tous les cas apregraves le laquo quench raquo de la reacuteaction de marquage l‟eacutechantillon doit ecirctre
injecteacute si possible agrave froid et le plus rapidement dans la source du spectromegravetre de masse pour
limiter le laquo back-exchange raquo
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction
Plusieurs modes d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse ont
eacuteteacute deacuteveloppeacutes en fonction de l‟approche MS adopteacutee laquo bottom-up raquo ou laquo top-down raquo La
mise au point de ces diffeacuterents systegravemes d‟injection doit eacutegalement prendre en compte la
technique d‟ionisation utiliseacutee La technique d‟analyse par MS la plus communeacutement utiliseacutee
pour les expeacuteriences HDX est l‟eacutelectrospray (ESI) tandis que la meacutethode MALDI est plus
rarement employeacutee (7-11) Cela s‟explique par le fait que contrairement agrave la technique ESI
elle ne peut ecirctre coupleacutee en ligne avec des systegravemes de chromatographie liquide qui sont tregraves
utiles pour l‟analyse de meacutelanges complexes
Autrement dit seule l‟eacutelectrospray autorise le couplage avec une chromatographie liquide
en phase inverse (HPLC-ESI-MS) permettant l‟isolation de peptides et de proteacuteines en
meacutelange complexe Cette eacutetape de seacuteparation est indispensable dans beaucoup d‟eacutetudes
d‟identification et de caracteacuterisation de biomoleacutecules par spectromeacutetrie de masse Elle est
d‟autant plus neacutecessaire dans le cas d‟analyses de systegravemes proteacuteiques de grande taille en
HDXMS En effet la superposition des nombreux massifs isotopiques qui ont eacuteteacute deacuteplaceacutes et
eacutelargis par le marquage complique eacutenormeacutement l‟analyse En pratique apregraves avoir arrecircteacute la
156
reacuteaction d‟eacutechange l‟eacutechantillon est directement introduit dans la source eacutelectrospray via une
HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo)
La technique HPLC-ESI-MS preacutesente donc plusieurs avantages Elle est tout d‟abord
particuliegraverement bien adapteacutee pour la seacuteparation temporelle d‟un grand nombre de peptides
L‟eacutetape de seacuteparation en HPLC participe eacutegalement au lavage des chaicircnes lateacuterales des
acides amineacutes (12) Elle est compatible avec la plupart des tampons et avec la preacutesence
d‟agents deacutenaturants et offre la possibiliteacute de concentrer rapidement des eacutechantillons dilueacutes
En contre partie l‟avantage du MALDI-MS par rapport agrave l‟ESI-MS est qu‟un grand nombre
d‟eacutechantillons peuvent ecirctre analyseacutes dans une courte peacuteriode de temps De plus cette
technique est plus toleacuterante aux sels que l‟eacutelectrospray et ne requiert donc pas d‟eacutetape
preacutealable de dessalage de l‟eacutechantillon Bien que l‟ionisation MALDI soit plus facilement
reacutealisable et interpreacutetable elle conduit neacuteanmoins agrave une perte en deuteacuteriums significativement
plus eacuteleveacutee par rapport agrave la meacutethode ESI mecircme si des essais ont eacuteteacute meneacutes pour reacuteduire ces
pertes (13) De plus il n‟est pas envisageable d‟utiliser la technique MALDI pour l‟analyse de
systegravemes proteacuteiques complexes de hauts poids moleacuteculaires En effet les informations de tous
les peptides sont fournies dans un mecircme spectre de masse le rendant laquo illisible raquo et il n‟est pas
possible de reacutealiser preacutealablement agrave l‟analyse une seacuteparation par HPLC qui serait pourtant
indispensable pour ce type d‟eacutechantillon
Les deux sous-paragraphes suivants constitueront un bilan des diffeacuterents systegravemes
d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse qui ont eacuteteacute deacuteveloppeacutes
avant mon arriveacutee au laboratoire des Meacutecanismes Reacuteactionnels Ils ont eacuteteacute mis au point par
l‟eacutequipe ou par d‟autres groupes dans un contexte de minimisation de l‟eacutechange inverse
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo
Une extension eacutevidente de la meacutethode HDXESI-MS est l‟utilisation du nano-deacutebit bien
qu‟elle ne soit pas encore systeacutematique En effet ce choix est particuliegraverement pertinent pour
des proteacuteines qui sont difficiles agrave obtenir (eacutechantillons biologiques preacutecieux) ainsi que pour
celles qui forment des agreacutegats proteacuteiques agrave forte concentration Ces derniegraveres suscitent un vif
inteacuterecirct car elles sont pour la plupart responsables de maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives telles que
les maladies agrave prion dAlzheimer ou de Parkinson Dans la litteacuterature on trouve quelques
eacutetudes HDX utilisant la technique d‟analyse nano-ESI-MS laquo off-line raquo (14-15) ou coupleacutee en
157
ligne aux eacutetapes de digestion enzymatique et de seacuteparation chromatographique (16) Par la
reacuteduction du systegraveme il a eacuteteacute obtenu une sensibiliteacute supeacuterieure d‟un facteur cent tout en
conservant la deuteacuteration
Lors de la thegravese de Thorsten Daubenfeld (17) notre eacutequipe a valideacute un systegraveme par
injection directe nano-ESI-FTMS pour l‟eacutetude structurale de proteacuteines par HDX En effet les
tregraves hautes performances d‟un instrument de type FT-ICR tant au niveau de la reacutesolution que
de la preacutecision sur la mesure de masse ont permis de s‟affranchir d‟une seacuteparation
chromatographique pour les proteacuteines eacutetudieacutees (18) L‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape a
ainsi eacuteteacute eacutelimineacute Cependant comme le systegraveme n‟eacutetait pas refroidi une aiguille nanospray
autorisait un temps d‟analyse de trois minutes seulement avant le reacutechauffement de la solution
menant au pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse Il faut noter ici que plus le temps d‟analyse est
faible moins il est aiseacute de deacutetecter des peptides deuteacutereacutes couvrant une gamme dynamique
importante seule l‟accumulation d‟un nombre important de spectres permet de gagner en
gamme dynamique Par ailleurs plus la taille du systegraveme proteacuteique est grande moins il est
facile de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums des peptides car leur nombre croicirct fortement et
leurs massifs isotopiques deacuteplaceacutes et eacutelargis se superposent
Ce problegraveme de superposition des massifs isotopiques est classiquement reacutesolu par le
couplage du spectromegravetre de masse avec une technique de seacuteparation chromatographique (16
19) permettant d‟isoler les diffeacuterents peptides preacutesents dans l‟analyte dans une seconde
dimension Cette seacuteparation doit dans le cas d‟eacutetudes en HDXMS respecter les contraintes
lieacutees agrave la technique ie qu‟elle doit limiter les eacutechanges inverses Pour cela plusieurs
meacutethodes ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees Elles utilisent soit des solvants protiques auquel cas la
seacuteparation doit se faire agrave froid en conditions acides et rapidement soit des solvants non-
protiques Par exemple la chromatographie supercritique a eacuteteacute proposeacutee comme alternative
aux gradients sur phase inverse classiques permettant de s‟affranchir des problegravemes de
tempeacuterature et de dureacutee d‟eacutelution (20) De plus le temps de reacutetention associeacute agrave un peptide
reste inchangeacute quel que soit son degreacute de deuteacuteration En effet l‟incorporation en deuteacuteriums
des peptides n‟altegravere que tregraves peu leur temps de reacutetention (21-22) Par conseacutequent ils
serviront de reacutefeacuterence pour identifier les peptides apregraves eacutechanges HD
158
Lors de la thegravese de Magalie Duchateau (23) notre eacutequipe a mis au point et optimiseacute un
systegraveme nano-LC-ESI-FTMS refroidi pour l‟analyse structurale de proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire et de complexes proteacuteiques tels que des complexes d‟initiation de la traduction
chez les archeacutees et les eucaryotes par HDX Le montage comprenant deux vannes nano une
preacute-colonne et une colonne est immergeacute dans de l‟eau glaceacutee pendant toute la dureacutee de
l‟analyse pour refroidir un maximum le systegraveme et ainsi minimiser les eacutechanges inverses Il
est coupleacute agrave une chaicircne de nano-chromatographie liquide
Notons eacutegalement que Waters commercialise deacutesormais un systegraveme complegravetement inteacutegreacute
pour les eacutetudes HDXMS appeleacute laquo nanoACQUITY UPLC System with HDX Technology raquo
qui peut ecirctre coupleacute agrave un spectromegravetre de masse du mecircme constructeur Le systegraveme integravegre
eacutegalement une proteacuteolyse laquo on-line raquo Les vannes et colonnes sont refroidies agrave 0degC par des
modules agrave effet Peltier
IV22 Avec une approche laquo top-down raquo
Une meacutethode populaire consiste agrave geacuteneacuterer et agrave envoyer un flux continu de solution
contenant la proteacuteine deuteacutereacutee vers la source d‟ionisation Ce dernier reacutesulte du meacutelange de la
solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange avec celle d‟arrecirct de la reacuteaction Sur ce
principe un dispositif avec deux seringues relieacutees ensemble et connecteacutees eacutegalement avec le
spectromegravetre de masse a eacuteteacute imagineacute (24) (Fig IV 1) Les deux seringues contiennent les
deux solutions agrave meacutelanger donneacutees ci-dessus Ce montage permet de proceacuteder agrave l‟arrecirct de la
reacuteaction d‟eacutechange au point de connexion des deux seringues Cette eacutetape s‟effectue laquo on-
line raquo puisque le flux reacutesultant du meacutelange des deux solutions est directement dirigeacute vers
l‟entreacutee du spectromegravetre de masse Dans ces conditions le temps pendant lequel peut avoir
lieu le laquo back-exchange raquo correspond uniquement agrave la courte dureacutee de reacutesidence dans le tube
capillaire (eg une minute) qui s‟eacutetend du nœud de connexion reliant les deux seringues agrave la
source d‟ionisation eacutelectrospray (scheacutematiseacute en violet sur la Fig IV 1) De cette faccedilon le
laquo back-exchange raquo peut ecirctre efficacement reacuteduit
159
Seringue 1 proteacuteine dans D2O
Seringue 2 solution H2O (pH 25 0degC)
Source drsquoionisation
eacutelectrospray
Arrecirct de la
reacuteaction drsquoeacutechange
Fig IV 1 Scheacutema drsquoun dispositif drsquointroduction des eacutechantillons dans une approche laquo top-
down raquo HDX mettant en œuvre le flux continu
Une autre meacutethode d‟introduction minimisant le laquo back-exchange raquo consiste agrave deacutesolvater et
ioniser directement la solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange sans passer par une
eacutetape preacutealable d‟arrecirct de la reacuteaction (25) (Fig IV 2) La reacuteaction d‟eacutechange HD est alors
arrecircteacutee au moment mecircme ougrave la proteacuteine est deacutesolvateacutee Des ions en phase gazeuse sont alors
geacuteneacutereacutes
Source ESI
Spectromegravetre
de masse
Aiguille nanospray avec solution de
proteacuteine dans tampon drsquoeacutechange
+ 1 NBA (reacuteactif superchargeacute)
Fig IV 2 Scheacutema du mode drsquointroduction des eacutechantillons par spray direct dans une
approche laquo top-down raquo HDX
Le profil de deuteacuteration en phase gazeuse devant impeacuterativement refleacuteter celui en solution
ces deux modes d‟injection sont privileacutegieacutes car ils permettent de reacuteduire le laquo back-exchange raquo
D‟autre part l‟ajout d‟une solution acide pour l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD ou
l‟utilisation d‟un reacuteactif superchargeacute tel que le NBA (laquo nitrobenzyl alcohol raquo) augmente de
faccedilon significative l‟eacutetat de charge de la proteacuteine Cela se traduit donc par une ameacutelioration
consideacuterable de l‟efficaciteacute de fragmentation par ECD (ou ETD) meacutethode choisie pour limiter
le laquo scrambling raquo Toutefois notons que ces deux montages excluent la possibiliteacute de reacutealiser
une eacutetape de dessalage preacutealable agrave l‟injection dans le spectromegravetre de masse Or dans le cas
d‟eacutechantillons reacuteels les proteacuteines sont initialement conserveacutees en conditions natives dans leur
160
tampon de purification qui est riche en sels L‟eacutelectrospray eacutetant tregraves sensible agrave la preacutesence de
sels ou d‟additifs qui contribuent agrave la suppression du signal une eacutetape de dessalage est alors
neacutecessaire avant leur analyse Par conseacutequent afin de pouvoir analyser des eacutechantillons
proteacuteiques reacuteels le deacuteveloppement de nouveaux dispositifs d‟introduction laquo off-line raquo s‟est
reacuteveacuteleacute indispensable Il est donc tregraves important de travailler agrave froid
Le systegraveme d‟injection que j‟ai utiliseacute au deacutebut de ma thegravese a eacuteteacute mis en place au sein du
laboratoire trois mois avant mon arriveacutee avec la collaboration du Professeur Joslashrgensen Il
s‟agit eacutegalement d‟un montage en flux continu mais laquo off-line raquo constitueacute d‟une seule
seringue (Fig IV 3)
Proteacuteine deuteacutereacutee dans
solution H2O (pH 25 0degC)
Source ESI
Carboglace
(-78degC)Spectromegravetre
de masse
Gaz de neacutebulisation
N2 (TdegC ambiante)
Fig IV 3 Scheacutema de notre ancien dispositif drsquointroduction des eacutechantillons en flux continu
laquo off-line raquo la seringue refroidie
Avec ce type de dispositif la preacuteparation de l‟eacutechantillon correspondant agrave son marquage et
agrave son dessalage peut ecirctre reacutealiseacutee en amont Elle se deacutecline en trois eacutetapes qui sont les
suivantes (1) initiation de la reacuteaction d‟eacutechange HD en diluant la proteacuteine dans son tampon
de purification deuteacutereacute puis (2) fixation du marquage apregraves un temps d‟incubation t donneacute en
ajoutant une solution acide (pH final de 25) agrave basse tempeacuterature (0degC) et enfin (3) dessalage
et concentration de l‟eacutechantillon agrave l‟aide d‟une colonne de phase inverse C8 Cette derniegravere
eacutetape doit ecirctre reacutealiseacutee dans la glace et pendant un temps tregraves court (une minute environ) afin
de limiter l‟eacutechange inverse L‟eacutechantillon est ensuite chargeacute immeacutediatement dans la seringue
preacutealablement refroidie agrave 0degC puis injecteacute dans la source eacutelectrospray du spectromegravetre de
masse FT-ICR
161
refroidie
Longueur minimale
Carboglace
deuteacutereacutee
Agrave 0 C
(pH 25 0 C)
Fig IV 4 Photographie de notre systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons marqueacutes la
seringue refroidie
La photographie de notre systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes est preacutesenteacutee ci-
dessus (Fig IV 4) Ce dernier a eacuteteacute minutieusement optimiseacute afin de reacuteduire au maximum le
laquo back-exchange raquo Pour cela la seringue d‟injection est preacutealablement refroidie agrave 0degC entre
deux sachets de glace Au terme de la dureacutee d‟eacutechange HD preacutedeacutefinie la reacuteaction est arrecircteacutee
en diluant l‟eacutechantillon dans une solution acidifieacutee (pH final de 25) agrave 0degC L‟eacutechantillon est
conserveacute dans la glace Pour des eacutechantillons reacuteels une eacutetape de dessalage est reacutealiseacutee sous
ces mecircmes conditions strictes L‟eacutechantillon est alors preacuteleveacute gracircce agrave la seringue refroidie et
injecteacute dans la source du spectromegravetre de masse FT-ICR Pendant toute la dureacutee de l‟analyse
il est lui-mecircme refroidi par un sachet de carboglace surplombant la seringue Il est transfeacutereacute
par un capillaire en PEEK qui lui est agrave tempeacuterature ambiante et dont la longueur a par
conseacutequent eacuteteacute rendue minimale Pour des raisons techniques le capillaire ne mesure pas
moins de trente et un centimegravetres Un deacutebit d‟injection important eacutegal agrave 10 microLmin a donc
eacuteteacute utiliseacute Dans ces conditions il avait eacuteteacute montreacute que ce dispositif permettait un maintien
des deuteacuteriums agrave leur place pendant au moins dix minutes d‟acquisition de donneacutees Ainsi
l‟analyse d‟un point de cineacutetique de l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD agrave la fin de
l‟acquisition en MS durait environ douze minutes Le dispositif d‟analyse ideacuteal combinerait
la consommation d‟une faible quantiteacute d‟eacutechantillon tout en minimisant les eacutechanges inverses
avec un temps d‟acquisition le plus long possible
162
Apregraves quelques mois d‟expeacuterimentation de ce systegraveme j‟ai pu dresser un rapide bilan des
difficulteacutes lieacutees agrave son utilisation La premiegravere surprise a eacuteteacute le nombre de seringues que l‟on
peut fecircler ou casser avec ce dispositif En effet bien que le modegravele de seringue choisi
(seringues Hamilton seacuterie 800) propose un piston renforceacute l‟eacutechantillon refroidi par la
carboglace a tendance agrave congeler Il forme alors un glaccedilon Tandis que le pousse-seringue
continue agrave fonctionner et agrave envoyer l‟eacutechantillon vers le spectromegravetre de masse une
surpression finit par ecirctre exerceacutee au niveau du verre de la seringue jusqu‟agrave sa fecirclure si
l‟analyse n‟est pas interrompue ou l‟eacutechantillon reacutechauffeacute Par ailleurs les deacutebits d‟injection
utiliseacutes impliquent de disposer d‟importantes quantiteacutes d‟eacutechantillon Dans le cas de l‟analyse
d‟eacutechantillons biologiques preacutecieux cette technique ne pourrait pas ecirctre utiliseacutee De plus
comme nous l‟avons vu dans le chapitre preacuteceacutedent les expeacuteriences sont difficilement
reproductibles Ayant pour objectif d‟ameacuteliorer le systegraveme j‟ai testeacute l‟effet du refroidissement
de l‟eacutechantillon par la carboglace lors de l‟analyse par MS et l‟influence du deacutebit d‟injection
sur le laquo back-exchange raquo
Pour cela j‟ai utiliseacute un systegraveme modegravele l‟ubiquitine Il s‟agit d‟une petite proteacuteine de 76
reacutesidus (86 kDa) dont la structure a eacuteteacute complegravetement deacutecrite dans la litteacuterature et qui est
souvent utiliseacutee dans la mise au point d‟approches par eacutechange HD Apregraves avoir deuteacutereacute
complegravetement l‟ubiquitine par incubation dans D2O (Annexe Mateacuteriel et meacutethodes) elle est
dilueacutee au centiegraveme dans une solution acidifieacutee H2OMeOH (4060) agrave environ 0degC Des
meacutelanges H2OACN (5050) eacutetaient auparavant utiliseacutes Le fait de choisir le meacutethanol comme
solvant et de l‟utiliser en plus grande proportion permet d‟une part d‟ameacuteliorer le processus
d‟ionisation par eacutelectrospray et d‟autre part de diminuer consideacuterablement le point de
congeacutelation de la solution agrave analyser Cela empecircche la formation systeacutematique de glaccedilons dus
au refroidissement de la solution par la carboglace L‟ubiquitine est ensuite directement
preacuteleveacutee par la seringue refroidie et injecteacutee dans la source ESI du spectromegravetre de masse FT-
ICR L‟analyse MS est reacutealiseacutee avec ou sans le sachet de carboglace surplombant la seringue
puis en testant diffeacuterents deacutebits d‟injection Le pourcentage de deuteacuteration de l‟ubiquitine est
suivi au cours des dix minutes d‟analyse autoriseacutes par le systegraveme de seringue refroidie afin de
mesurer l‟eacutechange inverse Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees en duplicats ou triplicats pour
estimer l‟erreur de mesure
En theacuteorie en absence d‟eacutechange inverse la valeur du pourcentage de deuteacuteration devrait
rester constante et maximale en fonction du temps Dans la situation ideacuteale l‟ensemble des
hydrogegravenes d‟amide devraient ecirctre marqueacutes et aucun autre site ne devrait ecirctre deuteacutereacute
163
deacutefinissant ainsi un 100 theacuteorique En pratique ce pourcentage doit ecirctre corrigeacute pour
prendre en compte la preacutesence de deuteacuteriums dilueacutes dans la solution d‟eau leacutegegravere acidifieacutee On
peut par conseacutequent corriger le ratio maximal par la formule suivante
ougrave Ntot est le nombre total de sites eacutechangeables (hydrogegravenes d‟amide et chaicircnes lateacuterales)
Namide est le nombre de liaisons peptidiques R est le pourcentage de deuteacuteriums dans la
solution dilueacutee rapporteacute au nombre total d‟hydrogegravenes et de deuteacuteriums Damide est le taux de
deuteacuteration reacuteel des hydrogegravenes d‟amide ducirc au marquage et Dexp est le ratio de deuteacuteration
expeacuterimental donneacute par la formule suivante
ougrave nD est le nombre de deuteacuteriums (mesureacute par spectromeacutetrie de masse par exemple) Du fait
de la preacutesence de deuteacuteriums dans la solution on s‟attend donc agrave une surestimation du taux de
deuteacuteration Ainsi par exemple si on considegravere une dilution au 1100e dans une solution 6040
meacutethanoleau on trouve un ratio de deuteacuteration R de 19
ougrave 18 et 32 sont les masses molaires de l‟eau et du meacutethanol 079 est la densiteacute du meacutethanol
(celle de l‟eau est prise agrave 1) 4060 sont les proportions d‟eau et de meacutethanol
On s‟attend par conseacutequent agrave un taux de deuteacuteration maximal (avec Ntot = 146 Namide = 72)
d‟environ 102
De plus un excegraves de deuteacuteration suppleacutementaire peut ecirctre ducirc au non reacute-eacutechange d‟un
hydrogegravene pour les chaicircnes lateacuterales d‟arginine or l‟ubiquitine comporte 4 arginines dans sa
seacutequence Dans la suite de ce manuscrit une reacutefeacuterence agrave 105 sera prise qui correspond au
maximum expeacuterimentalement observeacute pour les diffeacuterents montages qui seront tenteacutes
164
Dans le cas des injections utilisant le montage d‟origine l‟eacutevolution preacutesenteacutee ci-dessous
est observeacutee (Fig IV 5)
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Avec carboglace Sans carboglace
Fig IV 5 Evolution du taux de deuteacuteration de lrsquoubiquitine mesureacute en fonction du temps apregraves
le deacutebut de lrsquoinjection Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI
par le systegraveme de seringue refroidie Bleu pas de carboglace placeacute sur la seringue rouge
avec carboglace
Lors des cinq premiegraveres minutes les courbes avec et sans carboglace preacutesentent la mecircme
allure et se confondent presque La solution d‟ubiquitine agrave 0degC injecteacutee agrave 10 microLmin par la
seringue refroidie n‟a pas le temps de se reacutechauffer mecircme en l‟absence de carboglace Au
bout de cinq minutes la solution d‟ubiquitine se reacutechauffe en l‟absence de carboglace Ils
s‟opegraverent alors des eacutechanges inverses faisant chuter le pourcentage de deuteacuteration Par
conseacutequent en l‟absence de carboglace on divise le temps d‟analyse par deux au moins dans
des expeacuteriences HDXMS La partie initiale avec un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
correspond agrave la combinaison d‟une perte de deuteacuteriums au cours du temps avec un effet de
deacutebit car initialement la seringue est maintenue agrave un deacutebit eacuteleveacute jusqu‟agrave apparition du signal agrave
t=0
L‟effet du deacutebit d‟injection de l‟eacutechantillon sur l‟eacutechange inverse (Fig IV 6) a ensuite eacuteteacute
testeacute pour le deacutebit de reacutefeacuterence de 10 microLmin et pour un deacutebit diviseacute par cinq de 2 microLmin
165
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie 10 microLmin 2 microLmin
Fig IV 6 Effet du deacutebit drsquoinjection sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse
MS Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI par le systegraveme de
seringue refroidie surplombeacutee de carboglace Rouge deacutebit de 10 microLmin-1
violet deacutebit de
2 microLmin-1
Avec un faible deacutebit d‟injection (2 microLmin) de l‟eacutechantillon marqueacute le pourcentage de
deuteacuteration de l‟ubiquitine diminue consideacuterablement au cours de l‟analyse MS Les eacutechanges
inverses sont donc plus nombreux dans ces conditions expeacuterimentales On enregistre un
laquo back-exchange raquo moyen apregraves eacutequilibration de 35
Les graphes des Fig IV 5 et Fig IV 6 montrent que le systegraveme de seringue refroidie
permet de reacuteduire au maximum le laquo back-exchange raquo si l‟eacutechantillon est lui-mecircme refroidi par
la carboglace lors de l‟analyse MS et qu‟il est injecteacute agrave un deacutebit eacuteleveacute (10 microLmin)
Cependant le laquo back-exchange raquo moyen reste non neacutegligeable eacutegal agrave 20 Ayant eacutetudieacute
l‟ensemble des paramegravetres possibles en restant sur la base de ce systegraveme nous ne pouvons
guegravere plus l‟ameacuteliorer Nous avons donc deacutecideacute d‟inventer et de deacutevelopper un nouveau
systegraveme d‟introduction
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection
L‟ideacutee a eacuteteacute d‟imaginer un dispositif capable de stocker l‟eacutechantillon marqueacute aux
deuteacuteriums agrave tregraves basse tempeacuterature en dessous de zeacutero degreacute avant son analyse finale par
spectromeacutetrie de masse
166
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo
La laquo cryosource raquo est le nom que nous avons donneacute agrave notre dispositif d‟injection (Fig IV
7) Il s‟agit d‟une enceinte close thermostateacutee agrave tempeacuterature controcircleacutee avec comme objectif
initial une plage de tempeacuterature allant de la tempeacuterature ambiante agrave -100degC C‟est une boicircte
thermiquement isoleacutee issue de la transformation d‟une glaciegravere Elle se branche directement
sur la source ESI Elle est traverseacutee par un flux reacuteguleacute de gaz refroidi agrave l‟azote liquide (78 K)
La tempeacuterature interne de la boicircte est mesureacutee en continu par une sonde thermique et ajusteacutee
par un reacutegulateur de tempeacuterature controcirclant une reacutesistance chauffante L‟eacutechantillon est
introduit dans la laquo cryosource raquo puis injecteacute dans la source ESI du FT-ICR par un systegraveme de
vanne et boucle d‟injection Il est entraicircneacute vers le spectromegravetre de masse gracircce agrave l‟entreacutee d‟un
flux continu de solvant geacuteneacutereacute par un pousse-seringue situeacute agrave l‟exteacuterieur de la laquo cryosource raquo
deuteacutereacute agrave pH 25 et agrave 0 C
-30 C
Reacutegulateur de tempeacuterature
N2 (-30 C)
Azote liquide
Fig IV 7 Photographie de la laquo cryosource raquo
IV32 Mateacuteriel et meacutethodes
IV321 Instrumentation
Dans un premier temps voici la description de la version optimiseacutee de la laquo cryosource raquo et
des conditions expeacuterimentales neacutecessaires agrave la reacutealisation d‟expeacuteriences pour l‟eacutetude de la
167
structure de petites proteacuteines en HDXMS Elle est illustreacutee dans le scheacutema ci-apregraves (Fig IV
8)
L‟enceinte inteacuterieure de la laquo cryosource raquo est refroidie agrave une tempeacuterature de -30degC par
l‟arriveacutee d‟un gaz froid via un tuyau en cuivre Celui-ci forme un serpentin plongeacute dans un
reacutecipient rempli d‟azote liquide (78 K) qui permet le refroidissement du flux continu de gaz
entrant dans le systegraveme Une partie du gaz froid est envoyeacutee dans la laquo cryosource raquo agrave l‟aide
d‟un raccord en T tandis que l‟autre partie traverse le systegraveme et vient refroidir la ligne de
transfert de l‟eacutechantillon qui est introduit dans la source ESI
L‟inteacuterieur de la boicircte est maintenu agrave une tempeacuterature constante par un reacutegulateur de
tempeacuterature eacutequipeacute d‟une sonde thermique et d‟un ruban chauffant La sonde thermique de
type K est positionneacutee au niveau de la boucle contenant l‟eacutechantillon tandis que le ruban
chauffant entoure les tuyaux en cuivre deacuteposeacutes au fond de la boicircte Un ventilateur placeacute dans
l‟enceinte assure l‟homogeacuteneacuteiteacute de la tempeacuterature dans celle-ci
L‟eacutechantillon introduit dans une boucle de 75 microL par une vanne d‟injection est pousseacute vers
la source ESI du spectromegravetre de masse FT-ICR par le solvant agrave l‟aide d‟un pousse-seringue
Il est programmeacute agrave 2 microLmin correspondant agrave la valeur minimale du deacutebit pour laquelle le
spray est stable pour notre montage Les deacutebits infeacuterieurs deviennent instables lors du
refroidissement du montage probablement agrave cause de l‟augmentation de la viscositeacute des
solvants agrave -30degC Le volume injecteacute pour le remplissage de la boucle est de 100 microL
Finalement le gaz de neacutebulisation est eacutegalement refroidi par l‟azote liquide Il est envoyeacute agrave
l‟inteacuterieur du dispositif par un second tuyau en cuivre et est relieacute agrave l‟aiguille de neacutebulisation
de la source ESI permettant son refroidissement
168
Fig IV 8 Scheacutema du principe de la laquo cryosource raquo
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de l‟ubiquitine proteacuteine modegravele et de peptides de reacutefeacuterence que l‟on peut deuteacuterer de
maniegravere seacutelective (peptides modegraveles conccedilus par le Prof T Joslashrgensen Universiteacute dOdense
Danemark)
L‟ubiquitine (100 microM) et les peptides modegraveles (1 mM) sont complegravetement deuteacutereacutes par
incubation dans D2O Ils sont ensuite dilueacutes (au 1100e) dans une solution H2OMeOH
(4060) agrave basse tempeacuterature contenant de l‟acide formique (2) pour l‟ubiquitine et de
l‟acide aceacutetique pour les peptides (05 M pH=23) L‟ubiquitine est alors immeacutediatement
analyseacutee par FT-ICR MS Les peptides quant agrave eux sont analyseacutes apregraves une incubation dans
H2O glaceacutee pendant un temps agrave deacuteterminer (environ 10 min avec le systegraveme de seringue
refroidie) afin de deacutemarquer seacutelectivement l‟extreacutemiteacute N-terminale et conserver un nombre
moyen de 45 deuteacuteriums du cocircteacute C-terminal (26-27)
L‟eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee manuellement sur colonne Une cartouche Sep-Paktrade
C8 a eacuteteacute utiliseacutee
169
IV33 Reacutesultats
IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine
IV3311 Reacutealisation de la maquette
Cette phase de reacutealisation de la maquette initiale a permis une grande creacuteativiteacute de notre
part et a deacutetermineacute la faisabiliteacute technologique des choix de conception Elle a eacuteteacute conccedilue agrave
l‟aide d‟un bac agrave glace isotherme et de son couvercle Cette boicircte en polystyregravene a montreacute de
bonnes capaciteacutes de stockage agrave basse tempeacuterature malgreacute des fuites thermiques non
neacutegligeables causant une perte de froid En particulier elle a permis de valider la plage de
tempeacuterature atteignable (0degC agrave -100degC) et de veacuterifier la faisabiliteacute de l‟utilisation de meacutelanges
eausolvant organique agrave ces tempeacuteratures On notera en particulier que bien que les
tempeacuteratures de cristallisation des meacutelanges eaumeacutethanol et eauaceacutetonitrile soient connues
la viscositeacute de ceux-ci ne l‟est pas Pour les meacutelanges eaumeacutethanol qui preacutesentent des
tempeacuteratures de cristallisation infeacuterieures agrave -100degC agrave forts rapports meacutethanoleau il s‟est
aveacutereacute impossible d‟obtenir un deacutebit stable agrave des tempeacuteratures infeacuterieures agrave -80degC Pour les
meacutelanges eauaceacutetonitrile la limite se situe vers -25degC pour un minimum theacuteorique agrave -43degC
IV3312 Reacutealisation des prototypes
Le produit a ensuite eacuteteacute deacuteveloppeacute et des prototypes ont eacuteteacute reacutealiseacutes pour permettre sa
validation apregraves une seacuterie de tests
Pour cela une glaciegravere de la marque Campingaz qui preacutesentait l‟avantage d‟avoir des
joints d‟eacutetancheacuteiteacute ainsi qu‟une reacutesistance garantie agrave des tempeacuteratures de -78degC a eacuteteacute
transformeacutee en laquo cryosource raquo Dans la premiegravere version de notre dispositif d‟introduction agrave
froid des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse le gaz de neacutebulisation a eacuteteacute
laisseacute agrave tempeacuterature ambiante (Fig IV 9)
170
Fig IV 9 Scheacutema du prototype de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave
tempeacuterature ambiante
Afin de valider le prototype nous lavons compareacute agrave l‟ancien systegraveme d‟injection la
seringue refroidie Les reacutesultats obtenus avec la premiegravere version de la laquo cryosource raquo (courbe
en violet) sont assez similaires agrave ceux enregistreacutes avec la seringue refroidie (courbe en rouge)
(Fig IV 10) L‟ubiquitine preacutesente un taux de deuteacuteration un peu plus eacuteleveacute lorsqu‟elle est
introduite par la laquo cryosource raquo par rapport agrave la seringue refroidie Par contre le pourcentage
de deuteacuteration est instable au cours de l‟analyse MS La laquo cryosource raquo dans cette
configuration n‟apporte pas de valeur ajouteacutee agrave la seringue refroidie Elle doit donc ecirctre
ameacutelioreacutee pour ecirctre valideacutee
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (Ta) Seringue refroidie
Fig IV 10 Effet du systegraveme drsquoinjection utiliseacute sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de
lrsquoanalyse MS Les dispositifs ici compareacutes sont le systegraveme de seringue refroidie et la premiegravere
version de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave tempeacuterature ambiante
Ubiquitine
171
L‟ameacutelioration de notre dispositif a porteacute sur le refroidissement du gaz de neacutebulisation par
l‟azote liquide (78 K) (Fig IV 8) Il est envoyeacute dans l‟enceinte isoleacutee agrave -30degC par un tuyau en
cuivre qui traverse la boicircte L‟extreacutemiteacute du tuyau de cuivre agrave la sortie de la laquo cryosource raquo
est brancheacutee au niveau de la source ESI L‟aiguille de spray est par ce systegraveme elle-mecircme
refroidie
On obtient alors un spray refroidi stable qui nous donne les reacutesultats suivants (courbe en
bleu fonceacute) (Fig IV 11) Dans cette configuration l‟ubiquitine preacutesente un pourcentage
moyen de deuteacuteration nettement supeacuterieur agrave celui obtenu avec les autres systegravemes (ou
versions de systegravemes) et le taux de deuteacuteration est stable tout au long de l‟analyse MS (Fig
IV 11 Tab IV 1)
Tab IV 1 Pourcentages moyens de deuteacuteration de lrsquoubiquitine obtenus agrave lrsquoaide de la
seringue refroidie et de la laquo cryosource raquo dans les versions 1 et 2 et calculeacutes agrave diffeacuterents
temps de lrsquoanalyse par MS
1 min d‟analyse 5 min d‟analyse 10 min d‟analyse
Seringue refroidie 8870 8518 8484
Cryosource version 1 9773 9167
Cryosource version 2 10388 10433 10388
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (-30degC)
Seringue refroidie Cryosource N2 (Ta)
Fig IV 11 Effet du refroidissement du gaz de neacutebulisation agrave -30degC avec la laquo cryosource raquo
sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Ubiquitine
172
La Fig IV 11 montre que la ldquocryosourcerdquo dans sa version ameacutelioreacutee (avec le gaz de
neacutebulisation refroidi) agrave -30degC et pour un deacutebit d‟injection de 2 microLmin conduit agrave un
pourcentage de deuteacuteration tregraves proche de la valeur maximale attendue (105) et qui reste
stable pendant toute la dureacutee de l‟analyse par rapport au systegraveme de seringue refroidie La
laquo cryosource raquo avec ses diffeacuterents paramegravetres optimiseacutes est alors valideacutee
Nous avons ensuite testeacute diffeacuterentes tempeacuteratures dans la cryosource pour voir l‟influence
du paramegravetre tempeacuterature sur la deuteacuteration J‟ai donc eacutegalement testeacute les tempeacuteratures de -
20degC (courbe en violet) et -10degC (courbe en rouge) (Fig IV 12) Quelle que soit la
tempeacuterature de la laquo cryosource raquo elle nous permet de maintenir constant le taux de
deuteacuteration au cours de l‟analyse Cependant plus la tempeacuterature augmente plus le laquo back-
exchange raquo est important En effet agrave -30degC il est infeacuterieur agrave 3 tandis qu‟agrave -20degC le laquo back-
exchange raquo moyen est de 25 et agrave -10degC il est de 35 Ceci peut s‟expliquer par le fait que la
partie correspondant agrave la sortie de laquo cryosource raquo juste avant l‟entreacutee dans la source ESI
n‟est pas recouverte par un manchon isolant Elle est certes refroidie par l‟arriveacutee d‟un gaz
froid agrave -30degC mais qui se reacutechauffe au contact de l‟air conduisant agrave une perte de froid
Lorsque l‟inteacuterieur de la boicircte est agrave -30degC alors la sortie de la laquo cryosource raquo enregistre une
tempeacuterature d‟environ -10degC suffisante pour eacuteviter le reacute-eacutechange des deuteacuteriums avec les
hydrogegravenes Mais lorsque la tempeacuterature de la laquo cryosource raquo est supeacuterieure agrave -30degC ie agrave -
20degC ou agrave -10degC la sortie preacutesente des tempeacuteratures positives conduisant agrave du laquo back-
exchange raquo
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie -30degC -20degC -10degC
Fig IV 12 Effet de la tempeacuterature interne de la laquo cryosource raquo sur le maintien en place des
deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
173
Les Fig IV 11 et Fig IV 12 montrent que l‟utilisation de la laquo cryosource raquo agrave -30degC et
avec le refroidissement du gaz de neacutebulisation permet de reacuteduire le deacutebit d‟injection agrave 2
microLmin avec un laquo back-exchange raquo minimal (lt 3)
Nous avons ensuite voulu quantifier le laquo back-exchange raquo imputable agrave l‟eacutetape de dessalage
En effet le but ultime de cette eacutetude est de pouvoir utiliser notre dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes pour l‟analyse structurale de proteacuteines et de complexes proteacuteiques reacuteels
D‟apregraves le graphe de la Fig IV 13 nous concluons que l‟eacutetape de dessalage conduit agrave une
perte de 20 de la deuteacuteration lui aussi tregraves stable au cours du temps
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Sans dessalage Avec dessalage
Fig IV 13 Effet du dessalage sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Nous avons deacuteveloppeacute un dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
spectromegravetre de masse qui reacuteduit consideacuterablement le laquo back-exchange raquo Nous avons
deacutetermineacute un ensemble de paramegravetres optimiseacutes conduisant agrave moins de 3 d‟eacutechange inverse
en solution Pour cela il est indispensable d‟utiliser la laquo cryosource raquo pour refroidir
l‟eacutechantillon la tempeacuterature optimale du systegraveme eacutetant de -30degC pour un deacutebit d‟injection de
l‟analyte de 2 microLmin Le gaz de neacutebulisation doit ecirctre eacutegalement refroidi agrave -30degC La
laquo cryosource raquo preacutesente plusieurs avantages Elle permet de refroidir l‟eacutechantillon agrave tregraves basse
tempeacuterature agrave une valeur bien au-dessous de zeacutero degreacute Celsius ce qui allonge
consideacuterablement le temps d‟analyse La tempeacuterature est en effet stable pendant des temps
longs allant jusqu‟agrave une heure Et elle autorise de plus faibles deacutebits d‟injection Les diffeacuterents
paramegravetres optimiseacutes au niveau de l‟ancien et du nouveau dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes sont reacutecapituleacutes et compareacutes dans le tableau (Tab IV 2) Le dessalage
174
est maintenant l‟eacutetape critique pour la minimisation du laquo back-exchange raquo Il faudrait ecirctre
capable de le reacutealiser eacutegalement agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo
Tab IV 2 Comparaison des paramegravetres optimiseacutes pour les systegravemes de seringue refroidie et
de laquo cryosource raquo
Finalement il convient de noter qu‟une derniegravere ameacutelioration a eacuteteacute apporteacutee agrave la
laquo cryosource raquo suite agrave l‟observation de problegravemes de reproductibiliteacute preacutesenteacutes ci-dessous Il
apparaissait reacuteguliegraverement des problegravemes de bouchage du montage ougrave apregraves injection le
montage se retrouvait agrave monter en pression au-delagrave de la limite permise par le pousse-
seringue Apregraves recherche de l‟origine de ce problegraveme reacutecurrent nous avons pu identifier ce
problegraveme comme eacutetant arriveacute lors de l‟ajout du gaz de neacutebulisation refroidi et eacutetant lieacute agrave une
tempeacuterature du tuyau d‟ameneacutee de ce gaz largement infeacuterieure agrave celle de l‟enceinte (-65degC
mesureacutes agrave la jonction avec la source ESI) L‟augmentation de viscositeacute voire la cristallisation
au niveau de ces points froids pourrait ecirctre agrave l‟origine de ces pheacutenomegravenes de bouchage Ce
problegraveme a eacuteteacute reacutegleacute en ameacuteliorant les eacutechanges thermiques dans l‟enceinte agrave la fois par
l‟augmentation du contact tuyau du gaz de neacutebulisationruban chauffant mais eacutegalement par
l‟ajout d‟un ventilateur dans l‟enceinte Une contrepartie de ces ajouts est une perte de la
capaciteacute de refroidissement en dessous de -30degC
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides
Nous avons ensuite souhaiteacute valider notre dispositif d‟introduction des eacutechantillons
marqueacutes permettant la minimisation du laquo back-exchange raquo sur des peptides modegraveles
seacutelectivement deuteacutereacutes En effet ces peptides sont speacutecifiquement construits pour la mise au
point d‟expeacuteriences HDXMS Leur analyse permet d‟eacutetudier les pheacutenomegravenes de laquo back-
exchange raquo et plus particuliegraverement de laquo scrambling raquo
175
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK
Le peptide HHHHHHIIKIIK complegravetement deuteacutereacute est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-
terminal apregraves dilution dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes
d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide introduit par la cryosource dans le spectromegravetre de
masse FT-ICR contient bien 45 deuteacuteriums Le reacutesultat est conforme agrave la publication de T
Joslashrgensen (26) De plus au cours de l‟analyse MS le nombre de deuteacuteriums reste constant par
rapport agrave l‟utilisation du systegraveme de seringue refroidie (Fig IV 14) La laquo cryosource raquo permet
donc de reacuteduire au maximum l‟eacutechange inverse dans le cas eacutegalement de l‟analyse du peptide
HHHHHHIIKIIK par HDX Le systegraveme peptide modegravele laquo cryosource raquo permettra d‟eacutetudier
par la suite le laquo scrambling raquo avec preacutecision
0
1
2
3
4
5
6
0 100 200 300 400 500 600
No
mb
re d
e d
eu
teacuteri
um
s
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource Seringue refroidie
Fig IV 14 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse Comparaison de la
laquo cryosource raquo vs la seringue refroidie
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK
La mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee avec le peptide KKDDDDDDIIKIIK qui appartient agrave la
mecircme famille que HHHHHHIIKIIK Dans un premier temps il est complegravetement deuteacutereacute par
incubation dans D2O Puis il est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-terminal par dilution dans
une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes d‟incubation dans H2O
glaceacutee le peptide est finalement injecteacute dans la laquo cryosource raquo puis analyseacute en spectromeacutetrie
de masse Son nombre de deuteacuteriums est alors supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) (Fig IV
15) Avant de tester la stabiliteacute de la laquo cryosource raquo il nous faut deacuteterminer le temps
HHHHHHIIKIIK
176
d‟incubation dans H2O glaceacutee pour lequel le peptide aura incorporeacute 45 deuteacuteriums
Apparemment ce temps serait supeacuterieur agrave quatorze minutes
5586311
5589655
5592998
55963595599711
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000001d +MS2(5586)
0
1
2
3
4
7x10
Intens
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5596387
5599738
5603078
5606417 5609768
5613124
5616476
56198265623171
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000010d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5589678 5593021 5596386
5599737
5603078
56064175609769
5613122
5616475
56198235623167
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000017d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5593029
5596384
5599727
5603066
5606408
5609760
5613115
5616464
5619811
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000030d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
58 D
Reacutefeacuterence sans HDX
Avec HDX sans incubation dans
H2O analyse agrave t0 = 0 min
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 10 min56 D
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 14 min
50 D
(a)
(b)
(c)
(d)
Fig IV 15 Zoom du massif isotopique de lrsquoion parent [M+3H] 3+
dans les spectres MS du
peptide KKDDDDDDIIKIIK Les eacutechantillons marqueacutes sont introduits par la laquo cryosource raquo
et le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes est calculeacute apregraves diffeacuterents temps drsquoincubation dans
H2O t0=0 min (b) 10 min (c) et 14 min (d) par rapport agrave la reacutefeacuterence sans marquage (a)
IV33221 Deacutetermination du temps drsquoincubation pour le deacutemarquage seacutelectif
J‟ai donc deacutecideacute de retravailler avec le systegraveme de seringue refroidie pour pouvoir
deacuteterminer ce temps Le montage reacutealiseacute a eacuteteacute le suivant apregraves que l‟eacutechantillon ait eacuteteacute
complegravetement deuteacutereacute il a eacuteteacute dilueacute dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature pour
bloquer la reacuteaction d‟eacutechange HD Il a ensuite eacuteteacute immeacutediatement preacuteleveacute et injecteacute agrave 10
microLmin par la seringue refroidie qui a eacuteteacute entoureacutee par deux sachets de glace L‟acquisition
des donneacutees a eacuteteacute reacutealiseacutee pendant vingt-cinq minutes Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig
IV 16 Avec le systegraveme de seringue refroidie le temps requis semble ecirctre de quatorze
minutes alors qu‟il paraissait ecirctre supeacuterieur avec la laquo cryosource raquo
La difficulteacute geacuteneacuterale agrave laquelle nous n‟avions pas penseacute initialement est la suivante les
hydrogegravenes d‟amide ne se deacutemarquent pas agrave la mecircme vitesse et dans les expeacuteriences de T
Joslashrgensen la fin du deacutemarquage a lieu dans le capillaire de transfert qui est agrave tempeacuterature
177
ambiante Elle est donc incontrocirclable La laquo cryosource raquo quant agrave elle ne comporte pas de
capillaire de transfert agrave tempeacuterature ambiante pour finir le deacutemarquage Par conseacutequent il
nous faut deacuteterminer avec ce nouveau mode d‟introduction le temps d‟incubation des
peptides dans H2O pour les deacutemarquer seacutelectivement et avoir exactement le bon nombre
initial de deuteacuteriums Il semblerait que ce temps d‟incubation soit plus long dans le cas de
l‟utilisation de la laquo cryosource raquo
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teacuteri
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s
Temps danalyse (en minutes)
Fig IV 16 Nombre de deuteacuteriums de lrsquoion parent [M+3H] 3+
du peptide KKDDDDDDIIKIIK
calculeacute en fonction du temps de reacutesidence dans la seringue refroidie agrave 0degC tout au long de
lrsquoanalyse
Par conseacutequent j‟ai travailleacute de nouveau avec la laquo cryosource raquo par tacirctonnements J‟ai
reacutealiseacute plusieurs essais (Fig IV 17) Un essai correspond agrave une incubation du peptide
complegravetement marqueacute dans H2O glaceacutee et agrave une ou plusieurs injections dans la laquo cryosource raquo
agrave diffeacuterents temps D‟apregraves les reacutesultats du premier essai (points en bleu) le nombre de
deuteacuteriums retenu par le peptide seacutelectivement deacutemarqueacute apregraves vingt minutes d‟incubation est
supeacuterieur (53) agrave ce qui est attendu (45) mais apregraves trente minutes il est infeacuterieur (40) Un
deuxiegraveme essai a donc eacuteteacute reacutealiseacute apregraves vingt-cinq minutes d‟incubation (point rouge)
supposeacute ecirctre le temps que l‟on cherche agrave deacuteterminer Mais le nombre de deuteacuteriums s‟est
aveacutereacute bien supeacuterieur (68) agrave ce que nous attendions Un troisiegraveme essai (point orange) agrave trente
minutes d‟incubation a donneacute exactement le mecircme nombre de deuteacuteriums (53) qu‟une
mesure effectueacutee preacuteceacutedemment agrave vingt minutes (1er
essai) Un dernier essai a eacuteteacute reacutealiseacute pour
diffeacuterents temps d‟incubation allant de vingt agrave soixante minutes (points en violet) laissant
supposer que vingt-cinq minutes serait le temps rechercheacute Notons ici que je n‟ai pas eu de
178
signal en spectromeacutetrie de masse pour des temps d‟incubation infeacuterieurs agrave vingt minutes
Pourtant j‟ai testeacute les temps t= 0 15 min Par conseacutequent les reacutesultats ne sont pas
reproductibles et il semblerait que j‟ai rencontreacute des problegravemes de bouchage en raison de
l‟apparition de points froids dans le montage
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10 20 30 40 50 60
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Theacuteorie 1er essai 2e essai 3e essai 4e essai
Fig IV 17 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee
J‟ai alors reacutealiseacute le mecircme type d‟expeacuterience un autre jour en augmentant le deacutebit agrave 25
microLmin (courbe noire Fig IV 18) Cela m‟a permis finalement d‟obtenir du signal pour des
temps t= 0 15 min Cependant le temps d‟incubation dans H2O glaceacutee pour avoir le bon
nombre de deuteacuteriums initial semble avoir consideacuterablement eacuteteacute reacuteduit (de 25 agrave 10 min
environ) Pour s‟assurer de la reproductibiliteacute des reacutesultats la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee un
autre jour (courbe orange) Puis j‟ai effectueacute deux autres essais (courbes bleue et rouge) le
mecircme jour apregraves avoir recouvert la sortie de la laquo cryosource raquo qui se branche sur la source
ESI du FT-ICR par un manchon isolant L‟ideacutee ici est de limiter au maximum les pertes de
froid agrave cet endroit La tempeacuterature diminue passant de -8degC agrave -15degC Ainsi le nombre de
deuteacuteriums est augmenteacute Les reacutesultats semblent reproductibles et deacutesormais un temps
d‟incubation de quinze minutes semble convenir
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Fig IV 18 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee Le
deacutebit drsquoinjection a eacuteteacute augmenteacute agrave 25 microLmin et la sortie de la laquo cryosource raquo isoleacutee
thermiquement (courbes en bleu et en rouge)
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo
Apregraves quinze minutes d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide est de nouveau injecteacute dans
la laquo cryosource raquo puis analyseacute par spectromeacutetrie de masse Son nombre de deuteacuteriums est une
nouvelle fois supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) De plus un pheacutenomegravene tout agrave fait
incompreacutehensible est observeacute le nombre de deuteacuteriums augmente lors des premiegraveres minutes
de l‟analyse alors que le peptide est stockeacute agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo Le peptide gagne
deux deuteacuteriums suppleacutementaires au bout de cinq minutes passant de 56 agrave 76 deuteacuteriums
(Fig IV 19) Dans ces conditions la minimisation du laquo scrambling raquo en utilisant le peptide
KKDDDDDDIIKIIK et la laquo cryosource raquo ne peut pas ecirctre envisageacutee
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0 100 200 300 400 500 600
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Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource
Fig IV 19 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse
Pour s‟assurer que ce pheacutenomegravene n‟est pas un arteacutefact expeacuterimental mais qu‟il est
reproductible la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee agrave diffeacuterents temps t= 0 15 20 25 30 min
d‟incubation dans H2O glaceacutee (Fig IV 20) Les diffeacuterentes courbes preacutesentent la mecircme allure
deacutefinie par deux parties La premiegravere partie qui correspond aux cinq premiegraveres minutes
d‟analyse montre une augmentation du nombre de deuteacuteriums tandis que la seconde partie est
caracteacuteriseacutee par une diminution du nombre de deuteacuteriums Le temps d‟incubation dans H2O
glaceacutee a eacuteteacute changeacute et vingt minutes semblent maintenant convenir
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0 5 10 15 20 25 30
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Temps danalyse (en minutes)
Theacuteorie
0 min
15 min
20 min
25 min
30 min
Fig IV 20 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents temps
drsquoincubation dans H2O glaceacutee
KKDDDDDDIIKIIK
181
Pour essayer de comprendre scientifiquement le pheacutenomegravene en utilisant le mecircme jeu de
donneacutees j‟ai traceacute le graphe suivant intensiteacute des ions formeacutes en fonction du temps
d‟analyse (Fig IV 21) Les courbes preacutesentent la mecircme allure que celles du graphe de la
figure preacuteceacutedente (Fig IV 20) L‟intensiteacute des ions semble varier comme le nombre de
deuteacuteriums
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
0 5 10 15 20 25 30
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Temps danalyse (en minutes)
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 21 Intensiteacute des ions en fonction du temps drsquoanalyse pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Nous deacutecidons alors de tracer le graphe de l‟intensiteacute des ions en fonction du nombre de
deuteacuteriums (Fig IV 22) Il apparaicirct alors clairement qu‟il existe une correacutelation entre le
nombre d‟ions formeacutes et le nombre de deuteacuteriums retenus Or les facteurs qui peuvent
influencer le nombre d‟ions formeacutes sont le pH et la concentration en analyte En effet un pH
acide et une concentration eacuteleveacutee d‟eacutechantillon favorisent la formation d‟ions Sachant que les
eacutechanges HD sont controcircleacutes non seulement par la tempeacuterature mais aussi par le paramegravetre
pH alors le pheacutenomegravene que nous observons ressemblerait agrave un effet de pH Cet effet de pH
s‟expliquerait par un effet de meacutelange entre la solution contenant l‟eacutechantillon (peptide
complegravetement deuteacutereacute dilueacute au 1100e dans une solution H2OMeOH 4060 acidifieacutee) et le
solvant (H2OMeOH 4060) qui sert agrave pousser l‟analyte vers la source du spectromegravetre de
masse (Fig IV 23)
182
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Nombre de deuteacuteriums
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 22 Intensiteacute des ions en fonction du nombre de deuteacuteriums pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Fig IV 23 Scheacutema explicatif de lrsquohypothegravese de lrsquoeffet de meacutelange observeacute
Afin de s‟affranchir de l‟effet de meacutelange nous avons deacutecideacute de modifier la composition
du solvant de faccedilon agrave avoir exactement la mecircme que pour l‟eacutechantillon Autrement dit nous
l‟avons acidifieacute et leacutegegraverement deuteacutereacute Le nouveau solvant est un meacutelange H2OMeOH 4060
auquel a eacuteteacute ajouteacute 05 M d‟acide aceacutetique et 1 de D2O Il est conserveacute agrave -20degC avant
chaque utilisation Un sachet de glace est eacutegalement deacuteposeacute sur la seringue contenant le
solvant lors de l‟analyse par MS Le lavage des capillaires en PEEK (boucle et celui
183
d‟introduction de l‟eacutechantillon dans le spectromegravetre de masse) est deacutesormais reacutealiseacute gracircce au
nouveau solvant Puis j‟ai testeacute l‟effet du deacutebit d‟injection sur la reacutetention du marquage dans
la laquo cryosource raquo (Fig IV 24 et Fig IV 25) Les reacutesultats montrent que pheacutenomegravene
s‟amplifie avec l‟augmentation du deacutebit ce qui est inattendu
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350microLh
600 microLh (10 microLmin)
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Fig IV 24 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Les analyses sont reacutealiseacutees dans lrsquoordre
croissant du deacutebit drsquoinjection
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
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3
Fig IV 25 Zoom de la Fig IV 24 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les mecircmes expeacuteriences ont ensuite eacuteteacute reacutealiseacutees en changeant l‟ordre des diffeacuterents deacutebits
d‟injection testeacutes (Fig IV 26 et Fig IV 27)
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
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Fig IV 26 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 600 microLh est testeacute en
premier puis celui de 150 microLh et enfin celui de 350 microLh
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150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
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Fig IV 27 Zoom de la Fig IV 26 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les reacutesultats ne sont pas reproductibles Nous deacutecidons alors de raccourcir au maximum le
capillaire en PEEK qui transfegravere le solvant dans la laquo cryosource raquo (67 cm 22 cm) et de
recommencer une nouvelle seacuterie de mesures en changeant une nouvelle fois l‟ordre des
diffeacuterents deacutebits d‟injection testeacutes (Fig IV 28) Les reacutesultats obtenus ne sont toujours pas
satisfaisants
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
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2
3
Fig IV 28 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 150 microLh est testeacute en
premier puis celui de 360 microLh et enfin celui de 350 microLh
Nous avons ensuite voulu deacutecoupler l‟effet du deacutebit agrave celui du temps en reacutealisant trois fois
conseacutecutivement la mecircme expeacuterience dans les mecircmes conditions avec le mecircme deacutebit et en
testant les deux deacutebits extrecircmes 2 microLmin et 10 microLmin (reacutealisation de triplicats) De
nouvelles conditions expeacuterimentales ont eacuteteacute deacutefinies La laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee pendant
trente minutes apregraves qu‟elle ait atteint sa tempeacuterature de -30degC Auparavant les analyses
eacutetaient lanceacutees sans l‟eacutetape de stabilisation de la laquo cryosource raquo De plus l‟ajout d‟azote
liquide dans le reacutecipient servant agrave refroidir le systegraveme n‟est deacutesormais plus effectueacute pendant
l‟analyse mais uniquement entre deux analyses Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig IV 29
Le nombre de deuteacuteriums n‟est toujours pas stable lors de l‟analyse par MS
Il semblerait que la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la laquo cryosource raquo ne soit pas homogegravene en
tout point L‟ajout d‟une seconde sonde thermique proche de la source du spectromegravetre de
masse pourrait mettre en eacutevidence le diffeacuterentiel de tempeacuterature
Une ideacutee serait de rincer la boucle d‟injection avec un solvant identique mais
complegravetement deuteacutereacute (D2OCH3ODCH3COOD) afin de comparer les reacutesultats
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
600 microLh (10 microLmin)
Fig IV 29 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour les deacutebits drsquoinjection
de 2 microLmin et 10 microLmin sans incubation dans H2O glaceacutee
Le peptide KKDDDDDDIIKIIK semble ecirctre tregraves sensible vis-agrave-vis de la deuteacuteration agrave un
(ou plusieurs) paramegravetre(s) relatif(s) agrave l‟utilisation de la laquo cryosource raquo que nous n‟identifions
ni ne controcirclons Pour veacuterifier si ces problegravemes eacutetaient geacuteneacuteraux ou speacutecifiques de ce peptide
nous avons deacutecideacute deffectuer nos tests sur un peptide plus classique le Glufibrinopeptide
(GluF)
IV3323 Cas du peptide GluF
Le peptide GluF n‟est pas un peptide classiquement utiliseacute pour la mise au point
d‟expeacuteriences HDXMS mais il nous sert au laboratoire comme standard de calibration en
MSMS car il se fragmente pour donner de nombreux ions b et y en CID
Fort heureusement lanalyse du GluF agrave laide de la cryosource apregraves incubation dans D2O
et dilution dans les solvants hydrogeacuteneacutes indique que le marquage reste stable au cours de
l‟analyse par spectromeacutetrie de masse (Fig IV 30) Ces reacutesultats montrent que les problegravemes
que nous avons rencontreacutes preacuteceacutedemment semblent lieacutes agrave la nature du peptide K2D6IIKIIK et
permettent enfin de valider lutilisation de la laquo cryosource raquo minutieusement optimiseacutee pour
des eacutetudes HDXMS
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
Fig IV 30 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse apregraves injection du peptide
GluF deuteacutereacute dans la laquo cryosource raquo
IV34 Conclusion
Nous avons deacuteveloppeacute un nouveau systegraveme dintroduction des proteacuteines deuteacutereacutees dans le
spectromegravetre de masse que nous avons appeleacute laquo cryosource raquo Lutilisation de cette
laquo cryosource raquo permet le stockage des eacutechantillons dans une enceinte isoleacutee agrave -30degC ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs (une heure) et permet eacutegalement de travailler
avec des deacutebits faibles de lordre de 2 microLmin
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de peptides seacutelectivement marqueacutes et eacutegalement sur lubiquitine proteacuteine modegravele de 86
kDa
L‟analyse du peptide de reacutefeacuterence KKDDDDDDIIKIIK a permis une optimisation plus
fine des paramegravetres Des ameacuteliorations techniques ont eacuteteacute apporteacutees Le solvant utiliseacute pour
pousser l‟eacutechantillon jusqu‟agrave la source du spectromegravetre de masse a eacuteteacute modifieacute Il a eacuteteacute
acidifieacute (acide aceacutetique 05M) et deuteacutereacute (1 D2O) afin d‟avoir la mecircme composition que
celle de l‟eacutechantillon Il a eacutegalement eacuteteacute conserveacute agrave -20degC avant son utilisation L‟analyse est
reacutealiseacutee avec un sachet de glace sur la seringue contenant le solvant et le capillaire en PEEK
d‟entreacutee dans la laquo cryosource raquo a eacuteteacute raccourci (67 cm 22 cm) La sortie de la
laquo cryosource raquo assurant le couplage avec la source ESI a eacuteteacute quant agrave elle isoleacutee La
188
tempeacuterature optimale de la laquo cryosource raquo est de -30degC pour un deacutebit optimum de 25 microLmin
Avant le deacutebut des analyses la laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee agrave -30degC pendant trente minutes
pendant lesquelles le solvant est continuellement injecteacute permettant le rinccedilage des capillaires
Le remplissage d‟azote liquide pour le refroidissement du systegraveme est reacutealiseacute entre deux
analyses concomitamment agrave une eacutetape de lavage des capillaires de vingt minutes gracircce au
solvant
La toute derniegravere innovation apporteacutee agrave la laquo cryosource raquo est l‟ajout d‟un ventilateur afin
d‟homogeacuteneacuteiser la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la boicircte
Notre objectif final est dutiliser le dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes que
nous avons deacuteveloppeacute dans une approche HDX top-down ECD pour obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques responsables de l‟initiation de la traduction dans le
cadre dune collaboration avec laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique Et plus
geacuteneacuteralement de fournir agrave la communauteacute des biologistes structuraux une meacutethodologie
robuste pour l‟analyse de proteacuteines et complexes proteacuteiques par eacutechanges isotopiques HD et
spectromeacutetrie de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR)
J‟aimerais souligner le fait que des travaux similaires ont eacuteteacute meneacutes par l‟eacutequipe du Prof
T Joslashrgensen au Danemark pour le mecircme objectif de reacuteduire le laquo back-exchange raquo lors
d‟eacutetudes HDX par top-down ECD ou ETD Dans leur cas ils ont deacuteveloppeacute un systegraveme de
refroidissement des eacutechantillons agrave -15degC tout aussi efficace agrave partir du systegraveme TriVersa
NanoMate de la socieacuteteacute Advion (28)
189
IV4 Bibliographie
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191
Conclusion geacuteneacuterale
192
193
Lobjectif initial de ce travail de thegravese eacutetait de mettre au point une meacutethode robuste top-
down HDX-MSMS (cest-agrave-dire combinant eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium en solution et
fragmentation de proteacuteines entiegraveres en phase gazeuse) pour pouvoir obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques reacuteels Combiner eacutechanges HD et spectromeacutetrie de
masse nest pas nouveau mais les meacutethodes classiquement utiliseacutees dites bottom-up et
baseacutees sur une digestion enzymatique preacutesentent linconveacutenient majeur decirctre peu reacutesolutives
(5-10 acides amineacutes en moyenne) Mettre au point des approches sur proteacuteines entiegraveres
preacutesente sur le principe un grand nombre davantages le premier gain attendu est pour la
reacutesolution (qui peut atteindre un seul acide amineacute) le second est pour leacutechange inverse
(laquo back-exchange raquo) qui devrait en theacuteorie ecirctre plus limiteacute car le nombre deacutetapes lors
desquels ce pheacutenomegravene peut se produire (digestion enzymatique seacuteparation
chromatographique) est reacuteduit
Ce travail de thegravese montre cependant quil nest pas aiseacute de mettre une meacutethode top-down
HDX au point et que nous avons ducirc faire face agrave un certain nombre de problegravemes
Tout dabord les reacutesultats obtenus pour les peptides que lon peut seacutelectivement marquer
montrent quil est important doptimiser de maniegravere fine un certain nombre de paramegravetres
expeacuterimentaux que ce soit dans la source dionisation ou agrave diffeacuterents endroits de linstrument
pour eacuteviter au maximum leacutechange inverse entre deuteacuteriums et hydrogegravenes Nos reacutesultats
montrent eacutegalement que ces paramegravetres sont deacutependants du spectromegravetre de masse sur lequel
les expeacuteriences sont reacutealiseacutees et que lanalyse de peptides seacutelectivement marqueacutes devrait ecirctre
un preacute-requis pour toutes les eacutetudes par eacutechange HD Nos reacutesultats confirment eacutegalement que
lECD peut ecirctre utiliseacute pour localiser de maniegravere preacutecise les deuteacuteriums dans la seacutequence et
quune reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue ce qui est une ameacutelioration majeure
par rapport aux expeacuteriences classiques de bottom-up sans fragmentation
Sur la base du protocole optimiseacute pour des peptides nous avons souhaiteacute poursuivre
lanalyse du complexe aIF2 impliqueacute dans linitiation de la traduction chez les archeacutees Nous
avons alors fait face agrave un certain nombre de problegravemes Le premier a eacuteteacute le manque de
reproductibiliteacute de nos expeacuteriences avec des variations importantes au niveau du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes et de leur localisation Un point crucial que nous avons mis en
eacutevidence au cours de nos travaux est que pour une proteacuteine contrairement agrave un peptide le
nombre de fragments est important leur intensiteacute couvre un large domaine dynamique et la
deuteacuteration reacuteduit fortement l‟intensiteacute totale Par conseacutequent il est neacutecessaire d‟accumuler un
194
grand nombre de scans MSMS pour faire augmenter le rapport signal sur bruit des fragments
peu intenses et que dans ce cas le problegraveme de leacutechange inverse devient majeur En effet
alors que pour des peptides leacutelargissement des pics ducirc agrave la deuteacuteration ne pose pas reacuteellement
de problegraveme danalyse car les masses des fragments ne sont pas tregraves eacuteleveacutees et le nombre de
fragments nest pas tregraves important le problegraveme est tout autre quand on passe sur des systegravemes
plus grands ne serait-ce que pour une petite proteacuteine de 10 kDa Ainsi il devient tout agrave fait
crucial de pouvoir accumuler pendant un temps suffisant pour pouvoir analyser correctement
les massifs isotopiques larges qui sont obtenus (et qui seacutelargissent au fur et agrave mesure que la
cineacutetique de deuteacuteration avance) Par ailleurs le nombre de fragments obtenus pour une
proteacuteine de 10 kDa est bien supeacuterieur agrave ce que lon attend pour un peptide et le
chevauchement des massifs isotopiques dans les spectres MSMS devient eacutegalement un
problegraveme qui conduit agrave une diminution importante des couvertures de seacutequence entre
leacutechantillon non deuteacutereacute et leacutechantillon deuteacutereacute
Nos reacutesultats obtenus sur aIF2 sont neacuteanmoins prometteurs et montrent quil est reacuteellement
possible dobtenir une reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves sur certains segments de la proteacuteine et
que de nouvelles ameacuteliorations de lapproche devraient permettre darriver agrave lobjectif initial
que nous nous eacutetions fixeacutes LECD et lETD sont des meacutethodes de choix pour ces approches
mais certains reacutesultats que nous avons obtenus en CID montrent quil est sans doute possible
dutiliser ce mode de fragmentation installeacute sur tous les spectromegravetres de masse sous
certaines conditions qui restent encore agrave deacuteterminer
Lensemble de nos reacutesultats nous a ainsi conduits agrave consideacuterer que notre systegraveme
dintroduction des eacutechantillons baseacute initialement sur une seringue refroidie ne convenait pas
aux approches top-down et quil eacutetait absolument essentiel de trouver une solution
alternative permettant de maintenir le taux de deuteacuteration initial pendant un temps
suffisamment long pour quun grand nombre de scans MSMS puissent ecirctre accumuleacutes Nous
avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme complegravetement diffeacuterent de ce qui existe
aujourdhui dans les diffeacuterentes eacutequipes travaillant dans le domaine baseacute sur lutilisation dune
enceinte isoleacutee refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des
deacutebits faibles Le deacuteveloppement de cette cryosource nous a pris plusieurs mois car
maintenir une tempeacuterature de -30degC pour le stockage des eacutechantillons jusquagrave leur
introduction dans le spectromegravetre de masse induit un certain nombre de contraintes (viscositeacute
du solvant formation de bouchons difficulteacute agrave reacutealiser des meacutelanges homogegravenes sur des
195
temps courts) Neacuteanmoins les reacutesultats que nous avons obtenus avec la derniegravere version
optimiseacutee sont tregraves encourageants car ils montrent quil est deacutesormais possible de travailler
pendant des temps longs avec les eacutechantillons deuteacutereacutes sans que le taux de deuteacuteration ne
varie au cours de lanalyse Malheureusement nous navons pas eu le temps au cours de ma
thegravese de revenir sur les proteacuteines du complexe aIF2 et de les analyser avec ce nouveau
systegraveme dintroduction mais nous pensons que lutilisation de cette source devrait enfin
rendre notre approche robuste et applicable agrave des eacutechantillons reacuteels
Ainsi je considegravere que mon travail de thegravese a permis de faire un grand pas en avant pour
rendre les approches top-down HDX applicables agrave des systegravemes preacutesentant un inteacuterecirct
biologique important (ce qui nest pas exactement le cas de tout ce qui a eacuteteacute deacutecrit dans la
litteacuterature jusquici) et que dans quelques anneacutees ces approches complegraveteront de maniegravere
robuste larsenal des meacutethodes danalyse utiliseacutees en biologie structurale apportant des
informations compleacutementaires agrave ce que la RMN ou les rayons X sont capables de fournir
196
197
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes
198
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
199
A1 Instrumentation
A11 Ionisation par eacutelectrospray
La premiegravere eacutetape d‟une expeacuterience par spectromeacutetrie de masse consiste agrave vaporiser et
ioniser l‟analyte (des moleacutecules) ie agrave former agrave partir d‟un milieu gazeux liquide ou solide
des moleacutecules ioniseacutees isoleacutees manipulables dans le vide pousseacute preacutesent dans le spectromegravetre
de masse Pour cela diffeacuterentes sources d‟ionisation ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees adapteacutees agrave diffeacuterents
types d‟eacutechantillons et agrave diffeacuterents analyseurs
L‟eacutelectroneacutebulisation (ou eacutelectrospray ESI) est une meacutethode d‟ionisation agrave pression
atmospheacuterique qui permet de transfeacuterer et ioniser simultaneacutement des macromoleacutecules intactes
(eg des proteacuteines) preacutesentes en solution en phase gazeuse La formation des ions en phase
gazeuse par cette technique est reacutealiseacutee par des meacutecanismes de deacutesolvatation peu eacutenergeacutetiques
n‟induisant quasiment pas de fragmentation L‟eacutelectrospray est donc consideacutereacutee comme une
technique dionisation douce par opposition agrave d‟autres techniques comme l‟impact
eacutelectronique technique tregraves eacutenergeacutetique qui conduit agrave un grand nombre de fragmentations lors
de leacutetape dionisation De plus les ions isoleacutes sont formeacutes directement agrave partir des moleacutecules
en solution ce qui permet d‟eacuteviter une eacutetape de vaporisation par chauffage qui peut conduire
agrave la deacutegradation de l‟analyte L‟eacutelectroneacutebulisation a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par John Fenn (1) sur la
base de travaux plus anciens de Malcolm Dole (2) et John Zeleny (3) et aujourd‟hui elle est
(avec le MALDI) la meacutethode de choix pour l‟eacutetude des biomoleacutecules par spectromeacutetrie de
masse
La formation des ions en phase gazeuse par eacutelectrospray se deacuteroule en trois eacutetapes
principales (i) formation des gouttelettes chargeacutees agrave l‟extreacutemiteacute dun capillaire meacutetalliseacute (ii)
eacutevaporation du solvant et fission des gouttelettes par explosions coulombiennes successives
et finalement (iii) obtention d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir des gouttelettes
fortement chargeacutees issues des deux premiegraveres eacutetapes Les meacutecanismes preacutecis de la formation
des espegraveces ioniseacutees et deacutesolvateacutees dans les deux derniegraveres eacutetapes sont aujourd‟hui encore
assez mal deacutefinis et sujets agrave controverse
200
A111 Formation des gouttelettes chargeacutees
L‟eacutetape initiale du processus d‟eacutelectrospray est la formation de gouttelettes chargeacutees agrave
partir d‟une solution Pour cela l‟eacutechantillon est introduit dans un capillaire meacutetallique (ou
une aiguille meacutetalliseacutee) porteacute agrave un fort potentiel eacutelectrique de plusieurs kilovolts (kV)
L‟application d‟une telle diffeacuterence de potentiel entre ce capillaire et une contre-eacutelectrode
placeacutee quelques millimegravetres plus loin induit une seacuteparation des charges agrave linteacuterieur du liquide
par un pheacutenomegravene eacutelectrophoreacutetique de migration des eacutelectrolytes (cations et anions) Lorsque
le capillaire est utiliseacute comme eacutelectrode positive les espegraveces cationiques s‟accumulent alors agrave
son extreacutemiteacute tandis que les anions migrent en sens inverse en s‟accumulant agrave l‟inteacuterieur
jusqu‟agrave s‟oxyder agrave la surface du capillaire (Fig A 1)
Fig A 1 Scheacutema simplifieacute du fonctionnement drsquoune source eacutelectrospray (4)
Ainsi en mode dit positif les cations sont attireacutes par l‟eacutelectrode neacutegative (contre-
eacutelectrode) et les anions par l‟eacutelectrode positive (capillaire) La seacuteparation des charges induit
une deacuteformation du liquide agrave l‟extreacutemiteacute du capillaire deacuteformation qui met en jeu un
eacutequilibre entre les forces eacutelectrostatiques (reacutepulsives) et la tension de surface (attractive) du
liquide Lorsque les forces eacutelectrostatiques atteignent la valeur de la tension de surface du
liquide la deacuteformation est conique et porte le nom de cocircne de Taylor (5) Une faible
augmentation du champ eacutelectrique suffit alors agrave deacutestabiliser le cocircne qui se rompt agrave son
extreacutemiteacute dispersant la solution en nombreuses gouttelettes qui emportent une partie des
charges preacutesentes agrave la pointe Apregraves cette eacutetape les gouttelettes se deacuteplacent sous l‟influence
du champ eacutelectrique mais eacutegalement sous celle d‟un gradient de pression creacuteeacute par la
deacutepression agrave lentreacutee du spectromegravetre de masse
201
A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes
Les gouttelettes chargeacutees issues du cocircne de Taylor migrent donc vers l‟interface du
spectromegravetre de masse Sur leur trajet elles entrent en collision avec le gaz atmospheacuterique et
suivant les interfaces avec un gaz de seacutechage et subissent une eacutevaporation du solvant alors
que le nombre de charges reste constant L‟eacutevaporation du solvant est favoriseacutee par la
tempeacuterature souvent eacuteleveacutee de la source dionisation (80-140degC) La diminution du rayon R
des gouttelettes posseacutedant une charge constante q conduit agrave l‟augmentation de la reacutepulsion
eacutelectrostatique des charges agrave sa surface jusqu‟agrave ce que les gouttelettes atteignent la limite de
stabiliteacute de Rayleigh donneacutee par
213
0 )(8 RqRy
ougrave 0 permittiviteacute du vide R rayon de densiteacute de charges et tension de surface stabilisant
la goutte
Cette eacutequation donne les conditions pour lesquelles les forces de reacutepulsions
eacutelectrostatiques deviennent eacutegales agrave celles de tension de surface A partir de la limite de
Rayleigh la gouttelette chargeacutee devient instable ce qui conduit agrave une explosion
coulombienne correspondant agrave la fission de la gouttelette en gouttelettes de plus petites tailles
Les travaux de Rayleigh en 1882 (6) puis de Gomez et Tang en 1994 (7) ont montreacute que la
fission des gouttelettes s‟effectuait par eacutemission d‟un jet tregraves fin de gouttelettes sans reacuteelle
relation de symeacutetrie Ce pheacutenomegravene d‟eacutevaporation se reproduit jusqu‟agrave ce que les nouvelles
gouttelettes aient agrave nouveau atteint la limite de Rayleigh
A113 Formation drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites
gouttelettes fortement chargeacutees
Dans la litteacuterature deux meacutecanismes ont eacuteteacute proposeacutes pour expliquer ce pheacutenomegravene Le
premier modegravele dit modegravele des reacutesidus chargeacutes ou laquo Charged Residue Model raquo (CRM) a eacuteteacute
deacutecrit par Dole en 1968 (2) L‟hypothegravese est la suivante la succession d‟explosions
coulombiennes conduirait agrave des gouttelettes de plus en plus petites jusqu‟agrave ce que la derniegravere
gouttelette ne possegravede plus qu‟une seule et unique moleacutecule d‟analyte (Fig A 2 (a)) Dans
ce modegravele l‟eacutevaporation totale du solvant reacutesiduel accumule les charges sur l‟analyte et
permet l‟obtention d‟ions multichargeacutes en phase gazeuse
202
En 1979 une seconde theacuteorie baseacutee sur de nouveaux meacutecanismes a eacuteteacute proposeacutee par Iribarne
et Thomson (8) Il s‟agit du modegravele de l‟eacutevaporation ionique ou laquo Ion Evaporation Model raquo
(IEM) Leur theacuteorie repose comme celle de Dole sur une succession initiale de fissions de
type coulombiennes qui reacuteduit la taille des gouttelettes et augmente leur densiteacute de charge
Cependant selon la theacuteorie dIribarne et Thomson pour des gouttelettes avec un rayon tregraves
petit (de l‟ordre de 10 nm) et une densiteacute de charge tregraves eacuteleveacutee le champ eacutelectrostatique agrave leur
surface serait assez intense pour expulser directement des ions preacuteformeacutes en phase gazeuse
(Fig A 2 (b)) Ce pheacutenomegravene appeleacute eacutevaporation ionique suggegravere que l‟explosion
coulombienne ne constitue pas le meacutecanisme majoritaire pour les petites gouttelettes de rayon
R le 10 nm
Fig A 2 Les deux theacuteories de lrsquoobtention drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de
gouttelettes chargeacutees (a) Modegravele des reacutesidus chargeacutes par Dole (b) Modegravele de lrsquoeacutevaporation
ionique par Iribarne et Thomson
Cependant aujourd‟hui encore aucun de ces deux modegraveles n‟est consideacutereacute comme
applicable agrave l‟ensemble des pheacutenomegravenes observeacutes en eacutelectrospray (9) Le consensus semble
ecirctre l‟existence d‟un effet de taille de l‟analyte les grosses moleacutecules eacutetant plutocirct orienteacutees
vers une formation d‟ions en phase gazeuse par le meacutecanisme de reacutesidus chargeacutes de Dole (10-
12) John B Fenn eacutemet l‟hypothegravese que cette theacuteorie s‟applique aux moleacutecules de haut poids
moleacuteculaire agrave partir du moment ougrave les dimensions lineacuteaires de ces moleacutecules sont
sensiblement plus grandes que la gouttelette qui les contient
Quel que soit le meacutecanisme responsable de la formation des ions en phase gazeuse
leacutelectrospray est aujourdhui une meacutethode dionisation extrecircmement utiliseacutee dans des
domaines varieacutes (biologie chimie pharmaciehellip)
203
A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS)
Parmi les diffeacuterents spectromegravetres de masse commercialiseacutes les instruments FT-ICR et
Orbitrap occupent une place de choix pour l‟eacutetude de proteacuteines entiegraveres par approche laquo top-
down raquo en raison de leurs tregraves grandes performances en termes de reacutesolution et de preacutecision
sur la mesure de masse
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
Notre eacutetude sur les peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen qui est preacutesenteacutee dans le
Chap II de ce manuscrit a eacuteteacute reacutealiseacutee sur un spectromegravetre APEX III de Bruker (Brecircme
Allemagne) eacutequipeacute d‟un aimant supraconducteur de 7 Tesla d‟une cellule ICR de type
Infinity Cell et d‟une source eacutelectrospray Apollo I
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Fig A 3 Scheacutema du FT-ICR APEX III Bruker de la source eacutelectrospray agrave la cellule ICR
Infinity Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Les ions sont formeacutes au niveau de la source ESI puis transfeacutereacutes via un ensemble de
lentilles eacutelectrostatiques au centre de la cellule de pieacutegeage situeacutee au cœur de l‟eacutelectroaimant
supraconducteur (Fig A 3)
Un hexapocircle de stockage est inseacutereacute apregraves le capillaire de transfert de la source eacutelectrospray
et avant le systegraveme de transfert eacutelectrostatique afin dy accumuler les ions avant de les
envoyer dans la cellule ICR Cette derniegravere placeacutee dans un vide pousseacute (10-10
mbar environ)
repreacutesente l‟eacuteleacutement cleacute du spectromegravetre puisqu‟elle va servir d‟analyseur et de deacutetecteur par
la mesure de la freacutequence cyclotron des ions pieacutegeacutes
204
Au cours de cette thegravese notre spectromegravetre a beacuteneacuteficieacute d‟importantes eacutevolutions
instrumentales Ainsi en janvier 2011 nous avons fait l‟acquisition du chariot de la socieacuteteacute
Sanofi-Aventis de Toulouse notre APEX III devenant alors APEX-Q Les principales
diffeacuterences entre les deux instruments sont l‟ajout d‟un quadripocircle et d‟une cellule de
collision et la source d‟ionisation (Apollo I sur lAPEX III et CombiSource premier modegravele
sur l‟APEX-Q) (Fig A 4)
Ion transfer
optics
UV Laser
Lens
Windows
Mirror
Medium pressure
chamber
Movable
hexapole
PPP
MALDI
sample
plate
Second
skimmer
Ion transfer
capillary
ESI
skimmer
Funnel
Electrospray
nebulizer
End
cap
ICR trap
Attenuator Magnet
Mirrors
PP
P
Storage hexapole
Trapextractplate
Collision
gas tube
Pulsed
valve
Collision hexapole
Quadrupole
ESI
Sprayed
sample
Hollow
cathode
IRMPDECD
Fig A 4 Scheacutema du FT-ICR APEX-Q Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity
Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Puis en avril 2012 nous avons reccedilu le nouveau chariot de Bruker le SolariX (Fig A 5) Il
apporte les ameacuteliorations suivantes une combisource nouvelle geacuteneacuteration l‟ajout d‟un
module ETS (possibiliteacutes de CID ou d‟ECDETD) et d‟un hexapocircle pour acheminer les ions
de la cellule de collision agrave la cellule ICR (Fig A 6)
205
Fig A 5 Photographie du FT-ICR SolariX (Bruker)
Fig A 6 Scheacutema du FT-ICR SolariX Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity Cell
(drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Comme il a deacutejagrave eacuteteacute speacutecifieacute dans le Chap III de ce manuscrit nous avons eacutegalement eacuteteacute
ameneacutes agrave travailler sur l‟APEX-Qe d‟Orsay Les diffeacuterences majeures entre l‟APEX III et
l‟APEX-Qe sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
206
A1211 Principe physique
Le principe de la spectromeacutetrie de masse agrave reacutesonance cyclotronique ionique (laquo Ion
Cyclotron Resonance raquo ICR) repose sur le fait qu‟une particule chargeacutee animeacutee dune vitesse
v se deacuteplaccedilant dans un champ magneacutetique uniforme B subit la force de Lorentz (Eq A 1)
BvqF
(Eq A 1)
Cette force conduit la particule chargeacutee agrave adopter une trajectoire heacutelicoiumldale autour d‟un
axe parallegravele agrave celui du champ magneacutetique B (conventionnellement axe z) dont la projection
dans le plan orthogonal (xy) est un mouvement circulaire uniforme (Fig A 7)
Fig A 7 Mouvement cyclotron drsquoun ion dans un champ magneacutetique
Ce mouvement de rotation est appeleacute mouvement cyclotron et en l‟absence de champ
eacutelectrique sa freacutequence νc ne deacutepend que du champ magneacutetique et du rapport masse sur
charge (Eq A 2) On conccediloit degraves lors quune mesure de cette freacutequence de rotation permet
une deacutetermination du rapport mz de lespegravece consideacutereacutee
zm
B
m
Bqc
105356111
2
7
(Eq A 2)
A1212 Pieacutegeage des ions
Jusquici seul le mouvement dans le plan xy a eacuteteacute consideacutereacute En labsence dautres champs
la vitesse suivant laxe z reste constante et la trajectoire reacutesultante est un mouvement
heacutelicoiumldal autour dun axe parallegravele agrave z qui se poursuivra indeacutefiniment Pour construire un
piegravege une possibiliteacute est de fermer le mouvement suivant z par deux plaques de pieacutegeage
207
perpendiculaires agrave laxe z porteacutees agrave un potentiel reacutepulsif Ainsi est neacutee la cellule ICR aussi
appeleacutee piegravege de Penning et le premier modegravele en est la cellule cubique (Fig A 8)
Fig A 8 Cellule cubique simple (13)
Sil eacutetait possible dappliquer un champ eacutelectrique homogegravene parallegravele au champ
magneacutetique avec des plaques de longueurs infinies le mouvement dun ion serait heacutelicoiumldal
avec des oscillations peacuteriodiques suivant laxe z Cette freacutequence d‟oscillations ou freacutequence
de pieacutegeage νt est principalement due aux reacutepulsions successives des deux plaques de
pieacutegeage et peut ecirctre exprimeacutee par (Eq A 3)
2
2
2
1
am
Vq trap
t
(Eq A 3)
ougrave Vtrap potentiel de pieacutegeage a distance entre les deux plaques et α facteur geacuteomeacutetrique
eacutegal agrave 2 dans le cas ideacuteal
Cependant il n‟est pas possible de se situer dans le cas ideacuteal d‟un champ eacutelectrique
homogegravene qui suppose des plaques infinies Le champ eacutelectrique ne peut pas ecirctre exactement
parallegravele au champ magneacutetique et une composante radiale est alors agrave prendre en compte Par
conseacutequent un troisiegraveme mouvement propre au mouvement de deacuteplacement des charges
pieacutegeacutees s‟ajoute aux deux preacuteceacutedents mouvements (cyclotron et pieacutegeage) Ce mouvement dit
mouvement magneacutetron s‟oppose agrave la force de Lorentz et se traduit par un abaissement de la
freacutequence cyclotronique
208
Ce pieacutegeage suppose toutefois que la trajectoire des ions les ait ameneacutes agrave ecirctre confineacutes
dans la cellule Cela peut ecirctre obtenu en produisant des ions in situ (ionisation eacutelectronique
MALDI) mais des difficulteacutes suppleacutementaires sont agrave prendre en compte lorsque les ions sont
formeacutes initialement agrave l‟exteacuterieur de la cellule (cas de l‟ionisation par eacutelectrospray) En effet la
conservation de l‟eacutenergie cineacutetique impose que pour des ions transporteacutes suivant l‟axe z s‟ils
ont suffisamment d‟eacutenergie pour entrer dans la cellule et que le potentiel des plaques ne
change pas ils en ont assez pour ressortir
Le pieacutegeage dynamique est une solution agrave ce problegraveme au lieu dappliquer des tensions
continues sur les plaques de pieacutegeage on va jouer sur des variations de tension pour sassurer
du pieacutegeage des ions On synchronise les tensions sur la plaque de la cellule situeacutee cocircteacute source
avec le deacuteplacement des ions (Fig A 9) Neacuteanmoins cette technique introduit une
discrimination en masse par la diffeacuterence de temps de vol des espegraveces
Fig A 9 Principe du pieacutegeage dynamique des ions
A1213 Obtention des spectres de masse
Une fois les ions pieacutegeacutes la mesure de leur freacutequence cyclotronique n‟est pas possible
directement Bien qu‟ayant une freacutequence de rotation identique tous les ions de mecircme rapport
masse sur charge ne preacutesentent pas un mouvement coheacuterent En effet les ions ont eacuteteacute produits
agrave des temps variables et avec des eacutenergies cineacutetiques diffeacuterentes ce qui se traduit par une
209
phase (position sur l‟orbite) et un rayon variables Afin de pouvoir mesurer les freacutequences
cyclotroniques il est neacutecessaire que ce mouvement global devienne coheacuterent ie que tous les
ions de mecircme rapport masse sur charge se preacutesentent avec la mecircme phase et avec le mecircme
rayon Ce reacutesultat est obtenu par une proceacutedure d‟excitation-deacutetection deacutetailleacutee ci-apregraves
Excitation des ions
Comme cela vient d‟ecirctre dit une fois pieacutegeacutes les ions de mecircme rapport masse sur charge
ont la mecircme freacutequence cyclotronique mais ne forment pas un paquet coheacuterent En effet la
position de leur axe de rotation et la phase de leur mouvement ne sont pas eacutegales De plus le
rayon de leur orbite cyclotronique est trop faible pour induire un quelconque signal sur les
plaques de deacutetection L‟application d‟un pulse de radiofreacutequence sur les plaques d‟excitation agrave
leur freacutequence cyclotron permet de rendre le mouvement des ions coheacuterent et de les conduire
sur une trajectoire de mecircme rayon agrave proximiteacute des plaques de deacutetection En effectuant un
balayage de freacutequence il est possible d‟exciter des populations d‟ions de rapports masse sur
charge diffeacuterents qui adoptent alors une trajectoire circulaire de mecircme rayon avec des
freacutequences de rotation diffeacuterentes Cette eacutetape permet non seulement d‟obtenir des paquets
d‟ions deacutecrivant un mouvement coheacuterent mais aussi de les rapprocher des deux plaques de
deacutetection afin de pouvoir analyser ce mouvement Dans le cas ideacuteal il conviendrait d‟exciter
les ions sur une orbite la plus grande possible afin d‟augmenter le signal et la sensibiliteacute
Cependant ceci n‟est pas applicable puisque la non homogeacuteneacuteiteacute du champ eacutelectrique pregraves
des plaques conduirait agrave l‟eacutejection progressive des ions C‟est la raison pour laquelle il est
usuel de ne pas exciter les ions sur des rayons supeacuterieurs agrave 08 fois le rayon de la cellule
Plusieurs types de champs eacutelectriques sinusoiumldaux peuvent ecirctre appliqueacutes pour exciter les
ions La Fig A 10 preacutesente trois types d‟excitations diffeacuterentes
210
a)
b)
c)
a)
b)
c)
Fig A 10 Types drsquoexcitations usuellement utiliseacutees agrave gauche dans le domaine temporel et agrave
droite dans le domaine des freacutequences (a) sinusoiumlde monofreacutequence tronqueacutee (b) balayage
de freacutequence (chirp) (c) balayage par SWIFT
Le premier type permet l‟excitation des ions agrave une seule freacutequence (Fig A 10 (a))
L‟excitation monofreacutequence n‟est donc pas vraiment utile pour la deacutetection de tous les ions
preacutesents dans la cellule qui est le cas le plus couramment rencontreacute En effet dans ce cas il
faudrait reacutealiser une excitation monofreacutequence pour chacun des ions preacutesents Il est donc
preacutefeacuterable d‟utiliser un mode d‟excitation par balayage de freacutequence (Fig A 10 (b)) qui va
balayer toute la gamme de freacutequences des ions en une seule impulsion Le balayage par
SWIFT (laquo Stored-Waveform Inverse Fourier Transform raquo) (Fig A 10 (c)) permet de calculer
l‟onde d‟excitation agrave partir du domaine des rapports masse sur charge eacutetudieacute Cependant le
SWIFT n‟est employable que sur les instruments eacutequipeacutes d‟un geacuteneacuterateur arbitraire de
freacutequences
Deacutetection du courant induit
La rotation coheacuterente des ions sur une orbite large creacutee un courant induit sur les deux
plaques de deacutetection qui est deacutetectable apregraves amplification par une eacutelectronique adapteacutee Ce
courant est proportionnel agrave la charge totale du paquet d‟ions ayant un mouvement coheacuterent
et ne deacutepend pas de la freacutequence cyclotronique des ions
Forme du signal mesureacute
La collision des ions avec des moleacutecules de gaz reacutesiduelles pendant le temps de mesure
conduit agrave une perte de coheacuterence du paquet d‟ions et donc agrave une perte d‟intensiteacute du signal
211
De ce fait le signal obtenu correspond agrave une sinusoiumlde amortie exponentiellement (Fig A
11) Or la preacutecision en masse est directement lieacutee agrave la preacutecision sur la mesure de la freacutequence
de rotation cyclotron des ions pieacutegeacutes Par conseacutequent une mesure de masse preacutecise neacutecessite
une pression la plus faible possible dans la cellule
Fig A 11 Signal sinusoiumldal amorti exponentiellement (agrave gauche eacutechelle en temps) et le
reacutesultat apregraves transformation de Fourier (agrave droite eacutechelle en freacutequence)
Digitalisation et transformation de Fourier
Comme l‟indique le nom de l‟appareil c‟est la transformeacutee de Fourier (laquo Fourier
Transform raquo FT) qui permet de mesurer en une seule expeacuterience l‟ensemble des freacutequences
de rotation des ions (Fig A 12)
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
Fig A 12 Spectre de masse obtenu apregraves transformeacutee de Fourier du signal
Le courant induit mesureacute sur les plaques de deacutetection correspond agrave un interfeacuterogramme (ou
laquo Free Induction Decay raquo FID) ougrave les sinusoiumldes amorties de l‟ensemble des ions preacutesents
dans la cellule sont additionneacutees les unes aux autres La digitalisation de ce signal suivie
d‟une transformation de Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre
contenant les informations sur les freacutequences (convertibles en rapport masse sur charge via la
relation A 2) et les abondances des ions pieacutegeacutes dans la cellule En additionnant plusieurs
deacutetections successives il est possible d‟ameacuteliorer le rapport signal sur bruit du spectre
transformeacute
212
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse
La particulariteacute de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR qui consiste agrave ramener la mesure des
rapports masse sur charge agrave la mesure d‟une freacutequence lui confegravere ses caracteacuteristiques en
termes de reacutesolution Dans des conditions approprieacutees ie avec un vide tregraves pousseacute dans la
cellule permettant un enregistrement pendant un temps suffisamment long sans perte de
signal il est possible d‟atteindre des reacutesolutions supeacuterieures agrave 106 pour un ion de mz 1000
dans un champ magneacutetique de 7 Tesla En plus du temps d‟enregistrement pour obtenir de la
haute reacutesolution la principale contrainte est le transfert et le stockage d‟interfeacuterogrammes de
grande taille (jusqu‟agrave 8 Mega points) De ce fait la reacutesolution expeacuterimentale utiliseacutee est
freacutequemment de l‟ordre de 60 000 pour minimiser les temps d‟acquisition ainsi que la taille
de stockage
La preacutecision en masse deacutepend principalement de la reacutesolution mais eacutegalement de la charge
d‟espace En effet la preacutesence d‟un tregraves grand nombre d‟ions pieacutegeacutes dans la cellule modifie le
champ eacutelectrique et geacutenegravere une force de reacutepulsion entre les ions Cette force a pour
conseacutequence la deacuteviation de la trajectoire des ions ce qui biaise les mesures de masses Ce
pheacutenomegravene pose le problegraveme eacutevident de la calibration externe En effet pour que l‟eacutetalonnage
externe soit le plus preacutecis possible il faut qu‟il soit effectueacute avec une charge d‟espace
comparable agrave celle de l‟eacutechantillon ce qui est difficilement controcirclable Il est ainsi
recommandeacute de travailler avec de faibles quantiteacutes d‟ions pour limiter au maximum la
deacuteviation due agrave ce pheacutenomegravene Une preacutecision de lordre de quelques ppm est alors obtenue
Cependant l‟eacutetalonnage interne permet de saffranchir de ce problegraveme de charge d‟espace
puisque les ions calibrants sont preacutesents dans la cellule en mecircme temps que les ions de
l‟eacutechantillon et subissent la mecircme charge d‟espace On atteint alors en routine des preacutecisions
en masse de l‟ordre d‟une ppm voire moins
A1222 Sensibiliteacute
Des calculs theacuteoriques ont montreacute que le nombre de charges minimum ayant un
mouvement coheacuterent neacutecessaire pour deacutetecter un signal eacutetait de l‟ordre de 200 Ceci constitue
une limite ultime de la sensibiliteacute de ce type d‟instrument En pratique il faut tenir compte de
213
l‟efficaciteacute de chacune des eacutetapes permettant de passer de l‟analyte neutre aux ions pieacutegeacutes et
exciteacutes dans la cellule Il faut eacutegalement tenir compte des eacutetats de charge et de l‟existence de
massifs isotopiques qui augmentent le nombre de freacutequences sur lesquelles se reacutepartissent les
ions Les sensibiliteacutes records atteintes actuellement sur des peptides de masse 1000 Da sont
de l‟ordre de 10 attomoles consommeacutees en nano-eacutelectrospray Dans un instrument
commercial avec les protocoles standards on peut obtenir un signal exploitable avec environ
10 femtomoles de produit consommeacute
A1223 Gamme dynamique
Un point sur lequel la spectromeacutetrie de masse FT-ICR nest pas particuliegraverement bien
placeacutee est la gamme dynamique qui repreacutesente la capaciteacute agrave discriminer des ions
d‟abondances diffeacuterentes dans un mecircme spectre Le problegraveme est lieacute agrave celui de la charge
d‟espace dans la mesure ougrave les mouvements des ions de faible abondance sont perturbeacutes par
ceux des ions majoritairement preacutesents dans la cellule Il est admis qu‟il est difficile de
mesurer avec une bonne preacutecision la masse d‟un ion dont l‟abondance est infeacuterieure agrave 1 de
celle de l‟ion le plus abondant
A1224 Gamme de masse
La gamme de masse est quant agrave elle en theacuteorie quasiment illimiteacutee La limite de masse
infeacuterieure deacutepend uniquement de l‟eacutelectronique et plus preacuteciseacutement des capaciteacutes du
digitaliseur et du geacuteneacuterateur de freacutequences Pour un aimant de 7 Tesla eacutequipeacute d‟un
digitaliseur agrave 8 MHz cela eacutequivaut agrave une limite infeacuterieure de mz 29 En ce qui concerne la
limite supeacuterieure elle deacutepend de la capaciteacute de la cellule agrave pieacuteger les ions Dans le cas d‟un
aimant de 7 Tesla cette limite est atteinte pour un ion de mz 274 000 Malheureusement des
problegravemes apparaissent avant cette limite notamment agrave cause des limites sur les dureacutees
d‟acquisition de signal Les signaux des masses eacuteleveacutees correspondant agrave de basses freacutequences
se trouvent consideacuterablement eacutelargis (mz 274 000 eacutequivaut agrave mesurer une freacutequence de 393
Hz) De ce fait la limite expeacuterimentale couramment admise se situe agrave mz 27 000 pour un
aimant de 7 Tesla
214
A123 Technologie Orbitrap
L‟Orbitrap est une technologie relativement reacutecente (baseacutee sur le principe d‟un piegravege
orbitalaire eacutelectrostatique) inventeacutee par A Makarov (14) L‟Orbitrap repose sur le pieacutegeage
des ions par un champ eacutelectrostatique quadripolaire qui creacutee l‟oscillation des ions pieacutegeacutes Ces
oscillations proportionnelles au rapport (mz)-12
sont deacutetecteacutees par la mesure du courant
induit et traduites en spectre de masse par la transformeacutee de Fourier (Fig A 13) Il existe
donc de grandes similitudes au niveau de la deacutetection des ions par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR et Orbitrap
Fig A 13 Deacutetection des ions par la technologie Orbitrap Les courants induits correspondent
agrave un interfeacuterogramme qui est la superposition de freacutequences de plusieurs espegraveces Le
traitement du signal qui est reacutealiseacute de la mecircme maniegravere que par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR avec les mecircmes contraintes et limitations suivi eacutegalement drsquoune transformation de
Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre de freacutequence facilement
convertible en spectre de masse
De ce fait les performances de la technologie Orbitrap en termes de reacutesolution (jusque
100 000) et preacutecision sur la mesure de masse (de l‟ordre de 1-2 ppm) rivalisent avec celles de
la spectromeacutetrie de masse FT-ICR De plus la reacutesolution de l‟Orbitrap eacutetant proportionnelle
au rapport (mz)-12
elle diminue moins vite avec l‟augmentation du rapport mz que dans le
cas du FT-ICR Par ailleurs la gamme dynamique de l‟Orbitrap contrairement agrave la
spectromeacutetrie de masse FT-ICR est satisfaisante (gt 3 deacutecades) (15) L‟Orbitrap est
principalement utiliseacutee en spectromeacutetrie de masse en tandem associeacutee agrave un piegravege lineacuteaire
Le scheacutema et la photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher) que
nous avons utiliseacute pour nos expeacuteriences HDX correspondent aux Fig A 14 et Fig A 15
215
L‟instrument est composeacute d‟une source ESI de type laquo Z-spray raquo suivie d‟une optique ionique
de type laquo S-lens raquo permettant de mieux focaliser les ions et d‟ameacuteliorer la sensibiliteacute Une
optique de transfert ionique (quadripocircle octopocircle) performante en termes de stabiliteacute et
efficaciteacute de transmission des ions permet leur acheminement dans une trappe lineacuteaire Dans
cette trappe ionique il est possible de fragmenter les ions par CID ou ETD et de proceacuteder agrave
leur deacutetection Il est eacutegalement possible de les deacutetecter par transformation de Fourier dans
l‟Orbitrap avec une meilleure reacutesolution Dans ce cas les ions sont transfeacutereacutes de la trappe
lineacuteaire agrave la C-trappe via un quadripocircle puis eacutejecteacutes dans l‟analyseur Orbitrap Une cellule de
collision placeacutee agrave proximiteacute de la C-trappe permet eacutegalement de fragmenter les ions par HCD
(laquo High-energy Collisional Dissociation raquo) Les ions sont ensuite analyseacutes dans l‟Orbitrap
Fig A 14 Scheacutema du LTQ-Orbitrap Velos (drsquoapregraves la documentation de Thermo Ficher
Scientific)
Fig A 15 Photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific) de
la plateforme proteacuteomique de lInstitut Jacques-Monod (Paris 7)
216
A13 Fragmentation en phase gazeuse
La spectromeacutetrie de masse en tandem consiste (i) dans une premiegravere eacutetape agrave seacutelectionner
l‟ion d‟inteacuterecirct (appeleacute ion parent ou ion preacutecurseur) et (ii) dans une seconde eacutetape agrave
analyser les ions fragments (ou ions fils) obtenus par la dissociation de l‟ion parent Selon
les instruments utiliseacutes les eacutetapes de seacutelection et d‟analyse des fragments se font soit dans
l‟espace (tQ Q-TOF TOF-TOF) soit dans le temps (IT FT-ICR) soit en combinant des
eacutetapes dans le temps et l‟espace (q-FT-ICR IT-Orbitrap)
Comme les sources d‟ionisation dites douces (ESI MALDI) celles utiliseacutees pour
l‟analyse des biomoleacutecules conduisent agrave des ions avec peu d‟eacutenergie interne il faut induire la
fragmentation par un apport d‟eacutenergie au systegraveme Cet apport d‟eacutenergie peut se faire de
diffeacuterentes faccedilons (16) collision avec un gaz inerte (fragmentation de haute ou basse
eacutenergie) collision avec une surface irradiation par des photons irradiation par des eacutelectrons
(speacutecifique des FT-ICR) reacuteactions ion-moleacutecule ou ion-ion (dont l‟ETD) Le controcircle de
l‟eacutenergie deacuteposeacutee est un paramegravetre important comme nous avons pu le voir dans le Chap I
dans le cadre des eacutetudes HDX il est important de pouvoir controcircler l‟eacutenergie apporteacutee aux
ions pour ne pas conduire agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des hydrogegravenes et deuteacuteriums le
long du squelette polypeptidique
La spectromeacutetrie de masse en tandem permet d‟obtenir des informations de structure de
l‟ion fragmenteacute (qu‟il soit organique ou biologique) et permet dans le cas de meacutelanges
complexes de seacutelectionner speacutecifiquement une espegravece parmi les autres pour obtenir son
spectre de fragmentation
Les deux principaux types de fragmentation utilisables dans le cadre des eacutetudes HDX sont
deacutetailleacutes dans les sous-paragraphes suivants Il s‟agit des meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECDETD) preacutesenteacutees preacuteceacutedemment dans le Chap I
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR
Ce mode de dissociation consiste agrave irradier les ions multichargeacutes par un faisceau
d‟eacutelectrons La recombinaison entre un eacutelectron et l‟ion conduit agrave la formation d‟un cation
radical (Fig A 16) et permet un gain d‟eacutenergie de l‟ordre de quelques eV (2-3 eV) (17) Ce
type de fragmentation est speacutecifique des FT-ICR et a eacuteteacute preacutesenteacute dans le Chap I dans la
217
partie consacreacutee agrave la fragmentation des peptides proteacuteolytiques marqueacutes La grande diffeacuterence
avec la fragmentation CID repose sur la formation initiale d‟un radical cation dont les voies
de fragmentation seront pour des polypeptides tregraves diffeacuterentes de celles du cation Cela se
traduira en particulier par la formation de fragments de type c et z De plus comme vu dans le
Chap II l‟ECD conduit agrave une faible redistribution des deuteacuteriums avant fragmentation ce
que les proposants de meacutecanismes pour l‟ECD ont attribueacute soit agrave une vitesse de fragmentation
rapide ne permettant pas une redistribution initiale de l‟eacutenergie (hypothegravese non-ergodique)
soit plus vraisemblablement agrave une barriegravere de fragmentation suffisamment abaisseacutee pour
rendre la vitesse de rupture des liaisons amide dans le radical cation supeacuterieure agrave celles des
autres voies de fragmentation etou de transferts de protons
e-
[M nH]n+ [M nH](n-1)+bull F1m+ + F2
k+bull
Fig A 16 Capture exothermique drsquoun eacutelectron par une moleacutecule multichargeacutee (positive)
Mode drsquoactivation ECD passe par une voie de fragmentation de type radicalaire
D‟un point de vue technique les eacutelectrons sont formeacutes par une cathode chauffeacutee
indirectement qui a remplaceacute le filament afin d‟obtenir un flux suffisant pour que la capture
d‟eacutelectron soit efficace La fragmentation a lieu dans la cellule ICR ougrave les ions sont pieacutegeacutes agrave
proximiteacute du centre de la cellule Trois paramegravetres influencent l‟efficaciteacute de fragmentation
par ECD (i) le potentiel de la cathode qui controcircle l‟eacutenergie des eacutelectrons mais a eacutegalement
un effet sur le courant d‟eacutelectrons (ii) la tempeacuterature de la cathode et (iii) la dureacutee
d‟irradiation par des eacutelectrons qui controcircle le taux de fragmentation Notons que l‟efficaciteacute
de capture deacutecroicirct rapidement avec l‟eacutenergie des eacutelectrons et qu‟il est important d‟optimiser
au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les recaptures successives
tout en obtenant suffisamment de fragmentations (voir Chap III)
Lors de nos expeacuteriences ECD nous avons utiliseacute une cathode chauffeacutee agrave 16 A pour
l‟APEX III et 18 A pour l‟APEX-Qe avec une irradiation par des eacutelectrons de l‟ordre de
quelques eV d‟eacutenergie cineacutetique (de 09 eV pour l‟ubiquitine agrave 2 eV pour aIF2α3) pendant
quelques dizaines de millisecondes (optimum agrave 10 ms) Nous avons travailleacute sur tous les eacutetats
de charge sans seacutelection
218
A132 Fragmentation par ETD sur lrsquoOrbitrap
L‟ETD est un analogue de l‟ECD Il procegravede par une reacuteaction ion-moleacutecule entre un
radical anion formeacute geacuteneacuteralement dans une source CI neacutegatif et un cation multichargeacute La
difficulteacute est de maximiser le transfert d‟eacutelectron en limitant le transfert de proton Les
reacuteactifs ont eacuteteacute optimiseacutes pour cela et le fluoranthegravene utiliseacute dans ce travail est le reacuteactif
geacuteneacuteralement utiliseacute De plus il est possible via le choix du reacuteactif de controcircler la
thermochimie du transfert d‟eacutelectrons On obtient en ETD une fragmentation similaire agrave celle
en ECD mais pas identique
L‟ETD preacutesente tous les avantages de l‟ECD il ne deacutepend pas de la seacutequence
polypeptidique (nature en acides amineacutes et longueur) il permet de localiser des modifications
post-traductionnelles labiles et il permet d‟obtenir une couverture de seacutequence importante
pour les peptides non tryptiques (issus de la digestion de la proteacuteine agrave la trypsine) pour les
proteacuteines et les peptides hautement basiques La meacutethode ETD comme la technique ECD est
donc particuliegraverement bien adapteacutee aux analyses laquo top-down raquo Par ailleurs contrairement agrave
l‟ECD qui requiert un FT-ICR la fragmentation ETD peut ecirctre reacutealiseacutee dans une trappe
ionique quadripolaire radiofreacutequence voire dans un piegravege hexapolaire qui demandent une
faible maintenance et que l‟on retrouve sur une grande varieacuteteacute d‟instruments moins coucircteux
D‟un point de vue technique le fluoranthegravene est utiliseacute comme reacuteactif pour la
fragmentation ETD reacutealiseacutee agrave l‟aide du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos L‟anion radicalaire
du fluoranthegravene qui constitue donc le reacuteactif ETD est produit par la reacuteaction preacutesenteacutee dans
Fig A 17
Fig A 17 Production du reacuteactif ETD (anion radicalaire) agrave partir du fluoranthegravene
Cette reacuteaction est reacutealiseacutee dans le module ETD (Fig A 18) de l‟instrument qui est donc
constitueacute d‟une source agrave ionisation chimique utilisant
- deux reacuteservoirs indeacutependants de reacuteactifs dont un pour les reacuteactions de type transfert
d‟eacutelectron (ETD) et l‟autre pour les reacuteactions par transfert de proton (PTR)
- une ligne de transfert chauffeacutee
219
- un volume d‟ion chargeacute en eacutelectron par un filament
- une optique de transfert utilisant un quadripocircle pour filtrer le reacuteactif chargeacute en eacutelectron
Il est placeacute agrave proximiteacute de la C-trappe (Fig A 14)
Fig A 18 Module ETD de lrsquoinstrument LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific)
Le reacuteactif ETD est ensuite envoyeacute dans la trappe lineacuteaire ougrave la reacuteaction ionion entre le
peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire aura lieu conduisant agrave la fragmentation de l‟ion
peptidique consideacutereacute La dissociation est reacutealiseacutee sur un eacutetat de charge particulier qui a eacuteteacute au
preacutealable seacutelectionneacute dans la cellule de haute pression de la trappe ionique
Trois temps d‟activation (5 15 et 25 ms) correspondant agrave trois dureacutees pendant lesquelles se
deacuteroule la reacuteaction ETD ont eacuteteacute utiliseacutes conseacutecutivement sur un mecircme eacutetat de charge afin de
maximiser la couverture de seacutequence En effet des profils de fragmentation diffeacuterents sont
obtenus en fonction du temps d‟activation Pour chaque temps d‟activation une minute
environ de fragmentation a eacuteteacute enregistreacutee
L‟option laquo Supplemental Activation raquo a eacutegalement eacuteteacute utiliseacutee Elle permet d‟apporter au
systegraveme une petite quantiteacute d‟activation collisionnelle suppleacutementaire afin de faciliter la
dissociation de l‟ion preacutecurseur En effet il a eacuteteacute montreacute que dans beaucoup de cas le transfert
d‟eacutelectron avait lieu sans que la dissociation soit pour autant effective
220
A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF
Des expeacuteriences de collision avec un gaz inerte (CID) ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur le Q-ToF
Premier (Waters) (Fig A 19) Les diffeacuterents eacutetats de charge des ions multichargeacutes (positifs)
ont eacuteteacute seacutelectionneacutes dans le quadripocircle du spectromegravetre de masse avant d‟ecirctre fragmenteacutes dans
la cellule de collision L‟eacutenergie de collision est le paramegravetre agrave optimiser pour la dissociation
de chaque eacutetat de charge
Fig A 19 Scheacutema du Q-ToF Premier (Waters)
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
A21 Marquage
A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
Les peptides de synthegravese (P1 HHHHHHIIKIIK P2 KKDDDDDDIIKIIK P3
KKDDDIIKIIK P4 KKDDDIIK) ont eacuteteacute acheteacutes chez Genscript Corporation (Piscataway
NJ) Une solution stock agrave 1 mM de chaque peptide a eacuteteacute preacutepareacutee en diluant le peptide
lyophiliseacute dans D2O Afin d‟eacutechanger complegravetement tous les sites eacutechangeables (hydrogegravenes
d‟amide de la liaison peptidique et hydrogegravenes labiles des chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes) la solution est incubeacutee agrave tempeacuterature ambiante pendant au moins 1 heure Le
221
deacutemarquage (seacutelectif du cocircteacute N-terminal) est initieacute en diluant au 1100e la solution stock dans
H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05 M pH 23) MeOH 11 (vv)
A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine
L‟ubiquitine petite proteacuteine modegravele a eacuteteacute utiliseacutee (avec les peptides modegraveles de T
Joslashrgensen) pour eacutetudier le laquo back-exchange raquo Elle a donc eacuteteacute totalement marqueacutee par dilution
de sa poudre lyophiliseacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM et incubation pendant
1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
De la mecircme maniegravere la substance P et le Glu F sont deux peptides qui ont eacuteteacute
ponctuellement utiliseacutes comme sonde de l‟eacutechange inverse Leur poudre lyophiliseacutee a donc
eacuteteacute eacutegalement dilueacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM puis le meacutelange a eacuteteacute
incubeacute pendant 1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ
L‟eacutechange isotopique de la proteacuteine ou du complexe proteacuteique d‟inteacuterecirct sous sa forme
native se fait par incubation dans une solution correspondant agrave son tampon de purification
contenant des deuteacuteriums eacutechangeables Une fois le temps d‟eacutechange souhaiteacute atteint le
marquage doit ecirctre arrecircteacute dans des conditions figeant les deuteacuteriums d‟amide du squelette
polypeptidique sur leur position et en deacutemarquant les autres sites eacutechangeables (hydrogegravenes
labiles des chaicircnes lateacuterales) Pour cela il faut diminuer tregraves rapidement la tempeacuterature du
milieu et repasser en conditions acides et en milieu protoneacute Dans ces conditions seuls les
deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes seront eacutechangeacutes par des hydrogegravenes et les
deuteacuteriums sur la fonction amide de la liaison peptidique conserveront leur localisation
aIF2α3 Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique aIF2α3 agrave 178
microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave une
tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute bloqueacute
lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF 2
222
aIF2α3γ Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique agrave aIF2α3γ agrave
1156 microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave
une tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute
bloqueacute lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF2
A22 Dessalage
Le dessalage se deacuteroulant apregraves les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium il doit obligatoirement
ecirctre effectueacute agrave faible tempeacuterature (dans la glace) et pH afin de minimiser les eacutechanges
inverses Pour cette mecircme raison il est obligatoire d‟utiliser une technique de dessalage
rapide excluant de ce fait bon nombre de systegravemes
Un dessalage laquo off-line raquo a eacuteteacute reacutealiseacute imposeacute par le type d‟approche choisi (approche
laquo top-down raquo) Une Sep-Paktrade C8 (Waters) a eacuteteacute utiliseacutee
Les colonnes sont activeacutees deux fois avec 1 mL ACNMeOHAF 499 499 02 puis
rinceacutees deux fois avec 1 mL H2OAF 1 La colonne conditionneacutee est conserveacutee au
reacutefrigeacuterateur jusqubdquoagrave utilisation L‟eacutechantillon meacutelangeacute agrave eacutegal volume avec H2OAF 2 (eacutetape
d‟arrecirct de la reacuteaction) est chargeacute immeacutediatement sur la colonne Les sels sont eacutelimineacutes par
trois lavages successifs avec 1 mL H2OAF 1 glaceacute
A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse
Le mode d‟ionisation utiliseacute a eacuteteacute l‟eacutelectrospray Les eacutechantillons proteacuteiques ont eacuteteacute
injecteacutes dans le spectromegravetre de masse par le dispositif de seringue refroidie (ou par le
nouveau systegraveme d‟introduction la laquo cryosource raquo que nous avons mis au point et preacutesenteacute
dans Chap V)
Pour cela les proteacuteines dessaleacutees sont finalement eacutelueacutees avec un meacutelange H2OACNAF
49 49 2 (500 microL pour aIF2α3 concentration finale agrave 57 microM et 250 microL pour aIF2α3γ
concentration finale agrave 74 microM) et immeacutediatement analyseacutees par FT-ICR
223
Les peptides seacutelectivement marqueacutes sont analyseacutes dans H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05
M pH 23) MeOH 11 (vv) agrave la concentration finale de 10 microM
Les eacutechantillons totalement marqueacutes (ubiquitine peptides) sont dilueacutes au 1100e dans
H2OACNAF 49 49 2 pour ecirctre analyseacutes en spectromeacutetrie de masse agrave la concentration
finale de 1 microM
224
A3 Bibliographie
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Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules Science 246 64-
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spectrometry Journal of Mass Spectrometry 35 763-772
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species proceeds via Dole‟s charged residue mechanism Analytica Chimica Acta 406
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spectrometry J Mass Spectrom 39 1091-1112
17 Zubarev R A (2003) Reactions of polypeptide ions with electrons in the gas phase
Mass Spectrom Rev 22 57-77
i
ii
Le geacutenie crsquoest 1 drsquoinspiration
et 99 de transpiration
Thomas Edison
So mushkil vakt comando sakth
A close friend
iii
Remerciements
Je tiens tout d‟abord agrave remercier Gilles Ohanessian Directeur du laboratoire des
Meacutecanismes Reacuteactionnels de l‟Eacutecole Polytechnique de m‟avoir accueillie au sein de son
Uniteacute de Recherche et de m‟avoir donneacute l‟opportuniteacute de reacutealiser ce travail de thegravese
Ce travail de thegravese a eacuteteacute reacutealiseacute sous la direction de Julia Chamot-Rooke et la co-direction
de Guillaume van der Rest Je vous remercie de votre aide de votre soutien et de vos
encouragements dans les moments plus difficiles qui surviennent au cours d‟une thegravese Un
grand merci agrave tous les deux de m‟avoir accompagneacutee jusqu‟au bout de cette belle aventure
J‟adresse mes plus sincegraveres remerciements agrave Madame Emmanuelle Leize et Monsieur
Christian Rolando d‟avoir accepteacute d‟ecirctre les rapporteurs de ce travail Merci eacutegalement agrave
Monsieur Jean-Michel Camadro d‟avoir participeacute agrave l‟eacutevaluation de ma Thegravese de Doctorat
Je tiens aussi agrave exprimer ma profonde reconnaissance agrave Eacutedith et Christian de m‟avoir
eacutepauleacutee quand j‟en avais besoin dans mes expeacuteriences et de m‟avoir enseigneacute les rouages des
spectromegravetres de masse du laboratoire plus ou moins capricieux Je suis d‟accord avec Eacutedith
bien que Christian ait toujours raison le FT-ICR (sous toutes ses versions) est le meilleur
instrument du monde entier J‟exprime eacutegalement ma gratitude agrave Vincent d‟Orsay et agrave
Thibaut et Manuel de Paris 7 de m‟avoir aideacutee agrave dompter leur machine
Un grand merci agrave Yves Meacutechulam Directeur du laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole
Polytechnique de m‟avoir offert l‟opportuniteacute d‟enseigner au sein de son deacutepartement et de
travailler en collaboration avec son laboratoire Merci aussi agrave Emmanuelle pour ses conseils
Un tregraves grand merci agrave toutes celles et ceux qui ont partageacutes mon bureau et mon amitieacute
pendant ces trois anneacutees de dur labeur Notamment merci agrave Yasmine Jianqing Jana et Jan
J‟adresse eacutegalement mes sincegraveres remerciements agrave Eacutedith et Julien pour vos pauses cafeacute (ou
plutocirct theacute ) que j‟ai beaucoup appreacutecieacutees en cette fin de thegravese et agrave Joe pour tes discussions agrave
n‟en plus finir et ton humour anglais Best of Luck Merci aux anciens Mag Renjiehellip
Merci enfin agrave toutes les personnes que jrsquoai cocirctoyeacutees ou croiseacutees au DCMR pendant ces
trois anneacutees meacutemorables Merci agrave Theacuteregravese Carine Sophie Steph Michel Chris Gilles
Ash P-H Vanessa Tatianahellip Et pour finir je tiens eacutegalement agrave remercier chaleureusement
mes entraineurs de boxe agrave l‟X Merci agrave Reacutemy Fred et Gilou pour votre coaching deacutecoiffant
Un exemple de prochain challenge les JO de Rio de Janeiro en 2016hellip
iv
Je nrsquooublierai pas de remercier eacutegalement
Jean-Baptiste
Je ne te remercierai jamais assez de ta preacutesence agrave mes cocircteacutes depuis maintenant quelques
anneacutees deacutejagrave et de tout ce que tu fais pour moi Notre rencontre remonte au deacutebut de notre vie
eacutetudiante et voici que nous la finissons ensemble J‟espegravere te retrouver tregraves prochainement
pour le commencement d‟une nouvelle vie agrave deux Merci pour ton soutien et ta compliciteacute
Merci de partager mon quotidien et de me remonter le moral quand il est dans les chaussettes
Merci de partager mes joies mes peines Merci de t‟ecirctre inteacuteresseacute agrave mon travail et d‟avoir
chercheacute avec moi des solutions Merci pour tes petits plats mijoteacutes avec amourhellip Un grand
merci pour TOUT ton amour avec un grand A
Mes parents et mes sœurs
Merci de m‟avoir insuffleacute la soif d‟apprendre et la curiositeacute intellectuelle de m‟avoir
donneacute l‟envie et les moyens de faire des eacutetudes Merci de m‟avoir soutenue et encourageacutee
jusqu‟au bout de ma longue formation Merci de vous ecirctre tenus au courant de l‟avanceacutee de
mon travail de recherche Merci pour votre amour votre tendresse et votre reacuteconfort de tous
les jours Merci pour tout Ma reacuteussite est eacutegalement la vocirctre
Ma famille et belle-famille
Merci agrave vous tous pour votre affection et votre bienveillance mais je tiens agrave remercier plus
particuliegraverement ma Mamie d‟ecirctre encore pregraves de moi aujourd‟hui Merci du fond du cœur de
m‟avoir toujours beaucoup aideacutee soutenue encourageacutee reacuteconforteacutee entoureacuteehellip durant toutes
ces anneacutees et encore plus ces trois derniegraveres Merci pour notre cohabitation nos fous rires nos
discussionshellip merci pour tous ces tregraves bons moments que nous avons partageacutes ensemble
Mes amis
Laurence ma sœur siamoise du hand avec laquelle j‟ai lieacute une sincegravere amitieacute il y a six
ans deacutejagrave Merci d‟avoir gardeacute le contact et de m‟avoir soutenue durant ces trois derniegraveres
anneacutees malgreacute les contraintes d‟espace et de temps imposeacutees par la thegravese et la vie active
J‟espegravere que maintenant nous allons nous revoir plus souvent autour d‟une triple Carmeacutelite
Ash my best male friend I met you in DCMR lab two years ago where you were pursuing
a post doctoral research work Thanks a lot for ALL your happiness your support your
helphellip You taught me how to be self-confident I found in you a confidant and a collaborator
Un grand merci agrave vous tous
v
Liste des abreacuteviations
AA acide formique
ACN aceacutetonitrile
AF acide formique
aIF2 facteur d‟initiation 2 chez les archeacutees
ATD distribution des temps d‟arriveacutee
ATP adeacutenosine triphosphate
ARN(mt) acide ribonucleacuteique (messagertransfert)
BN-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en condition bleue native
CI ionisation chimique
CID dissociation induite par collision
DNA acide deacutesoxyribonucleacuteique
DSG DiSuccinimidyl Glutarate
ECD dissociation par capture d‟eacutelectron
EGTA acide eacutethylegravene glycol teacutetraaceacutetique
ESI ionisation par eacutelectroneacutebulisation
ESSI ElectroSonic Spray Ionisation
ETD dissociation par transfert d‟eacutelectron
FID Free Induction Decay
FT-ICR reacutesonance cyclotronique ionique agrave transformeacutee de Fourier
FT-MS spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier
GTP guanosine triphosphate
HDX eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
HDXMS eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium analyseacute par spectromeacutetrie de masse
HIV virus de limmunodeacuteficience humaine
HMQC correacutelation quantique multiple heacuteteacuteronucleacuteaire
HPLC chromatographie en phase liquide agrave haute performance
HSQC correacutelation quantique unique heacuteteacuteronucleacuteaire
vi
IgG immunoglobulines G
IRMPD dissociation multiphotonique infrarouge
ISD In-Source Decay
LC chromatographie en phase liquide
LC-MSMS chromatographie en phase liquide coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse en
tandem
LILBID Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption
m-NBA alcool m-nitrobenzylique
MALDI deacutesorptionionisation au laser assisteacutee par matrice
MPT modification post-traductionnelle
MS spectromeacutetrie de masse
MSMS spectromeacutetrie de masse en tandem
NHS N-HydroxySuccinimide
nOe effet Overhauser nucleacuteaire
Q-ToF quadripocircle-temps de vol
RMN reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire
SAXS diffusion des rayons X aux petits angles
SDS-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en conditions deacutenaturantes contenant
du dodeacutecyl sulfate de sodium
SMI spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique
SORI Sustained Off-Resonance Irradiation
SPR reacutesonance plasmonique de surface
TAP-Tag purification par affiniteacute en tandem
TEV virus de la gravure du tabac
TROSY spectroscopie de relaxation transversale optimiseacutee
UPLC chromatographie en phase liquide ultra haute performance
UV ultraviolet
vii
Table des matiegraveres
Introduction geacuteneacuterale 1
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10 I112 Structure secondaire 12 I113 Structure tertiaire 15 I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19 I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24 I1221 Diffusion aux petits angles 24 I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24 I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26 I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27 I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40 I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42 I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43 I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43 I2133 Catalyse de la reacuteaction 46 I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46 I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et repliement
des proteacuteines 47 I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49
I221 Marquage continu 50 I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51 I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53 I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD 60 I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60 I2332 Approches top-down et HDX 62 I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
viii
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes 108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ 121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD 131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
ix
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166 IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169 IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174 IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175 IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176 IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186 IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
Conclusion geacuteneacuterale 191
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap 214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
x
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
xi
1
Introduction geacuteneacuterale
2
3
Acteurs essentiels de l‟organisation cellulaire et de la reacutegulation du meacutetabolisme les
proteacuteines sont agrave la fois des cibles theacuterapeutiques et des meacutedicaments potentiels Leacutetude de ces
proteacuteines agrave grande eacutechelle appeleacutee analyse proteacuteomique a eacuteteacute rendue possible ces derniegraveres
anneacutees par la mise au point dapproches robustes baseacutees sur des deacuteveloppements importants
en spectromeacutetrie de masse Cependant un simple inventaire de ces proteacuteines ne suffit pas agrave
comprendre les pheacutenomegravenes biologiques complexes qui reacutegissent lactiviteacute cellulaire Ainsi
appreacutehender la maniegravere dont sont organiseacutees ces proteacuteines en complexes multiproteacuteiques est
un des deacutefis actuels de la proteacuteomique Le nombre dinteractions entre proteacuteines au sein d‟une
cellule eacutetant tregraves important linvestigation de ces multiples reacuteseaux proteacuteiques neacutecessite de
nouveaux deacuteveloppements agrave la fois en spectromeacutetrie de masse mais aussi en bioinformatique
pour fournir des meacutethodologies adapteacutees ainsi que des outils puissants pour les analyser
Les interactions entre proteacuteines sont gouverneacutees par leur agencement et repliement dans
l‟espace faisant de la structure tridimensionnelle de ces complexes un eacuteleacutement-cleacute dans
l‟eacutetude et la compreacutehension de la vie de la cellule Les meacutethodes physico-chimiques les plus
couramment utiliseacutees pour ces eacutetudes structurales sont la cristallographie et la spectroscopie
RMN Bien que ces meacutethodes d‟analyse soient les piliers de la biologie structurale actuelle
elles preacutesentent toutefois des limitations majeures la cristallographie des proteacuteines
eacutegalement appeleacutee diffraction des rayons X neacutecessite de pouvoir cristalliser les proteacuteines et la
spectroscopie RMN est limiteacutee agrave des systegravemes de taille modeste Par ailleurs les deux
techniques requiegraverent des quantiteacutes relativement importantes d‟eacutechantillon et ne donnent
quune image statique qui est loin de la reacutealiteacute de la structure des proteacuteines Il est donc
devenu indispensable de deacutevelopper des meacutethodes alternatives permettant de sinteacuteresser agrave la
dynamique de ces systegravemes biologiques tout en travaillant avec des quantiteacutes les plus faibles
possibles d‟eacutechantillon
Dans ce contexte la spectromeacutetrie de masse est devenue ces derniegraveres anneacutees un outil
inteacuteressant pour la biologie structurale La spectromeacutetrie de masse preacutesente l‟avantage de
permettre des eacutetudes sur des proteacuteines non cristallisables d‟ecirctre peu consommatrice en
mateacuteriel et de permettre des analyses rapides sur des systegravemes complexes tant par la diversiteacute
que par la taille Il existe aujourd‟hui trois grandes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de
masse pour eacutetudier l‟organisation structurale d‟un complexe proteacuteique La premiegravere consiste agrave
utiliser des conditions d‟ionisation adapteacutees permettant de maintenir en phase gazeuse des
interactions non covalentes au sein de complexes proteacuteiques La deuxiegraveme approche repose
sur le pontage covalent des proteacuteines en association suivi d‟une digestion enzymatique et
4
analyse par spectromeacutetrie de masse Les agents pontants permettent dobtenir des informations
de topologie du complexe initial en creacuteant des liaisons covalentes entre des acides amineacutes
proches dans la structure tertiaire Une derniegravere technique consiste agrave effectuer un marquage de
la surface accessible du complexe qui peut ecirctre soit permanent par l‟utilisation de reacuteactifs
chimiques particuliers ou par l‟exposition aux radicaux hydroxyles soit labile Dans ce
dernier cas les eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium sont geacuteneacuteralement utiliseacutes La
vitesse deacutechange des hydrogegravenes damide dun squelette polypeptidique deacutepend de
l‟accessibiliteacute au solvant mais eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale Ainsi les
hydrogegravenes d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine telles
que les boucles et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses
d‟eacutechange rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au
contraire ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices
α et les feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent
plus lentement car ils sont proteacutegeacutes La mesure des vitesses deacutechange permet donc de sonder
localement la structure dune proteacuteine ou dun complexe L‟avantage majeur de cette approche
est qu‟elle ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas
toujours le cas avec des marquages covalents De plus elle permet de sinteacuteresser agrave des
complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire En revanche le fait que le marquage soit labile
impose des conditions expeacuterimentales strictes agrave respecter pour eacuteviter le deacutemarquage et
davantage de contraintes au niveau de la rapiditeacute de l‟analyse Malgreacute ces limitations
l‟association des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium et de la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode largement employeacutee pour l‟eacutetude structurale et
dynamique des proteacuteines et complexes proteacuteiques
L‟analyse par spectromeacutetrie de masse des proteacuteines marqueacutees au deuteacuterium est
classiquement reacutealiseacutee par une approche laquo bottom-up raquo Cette derniegravere consiste agrave analyser des
peptides obtenus par digestion enzymatique de la proteacuteine dinteacuterecirct Chaque hydrogegravene
remplaceacute par un deuteacuterium conduit agrave un increacutement en masse de 1 Da facilement deacutetectable par
spectromeacutetrie de masse Pour chaque peptide une cineacutetique d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
peut donc ecirctre obtenue Si cette approche a montreacute tout son inteacuterecirct mecircme pour des systegravemes
tregraves grands l‟inconveacutenient majeur en est la reacutesolution qui est limiteacutee par la taille des peptides
geacuteneacutereacutes (en moyenne 5-10 acides amineacutes) Une alternative qui sest deacuteveloppeacutee ces derniegraveres
anneacutees est celle qui consiste agrave introduire la proteacuteine intacte en phase gazeuse (approche laquo top-
down raquo) et agrave la fragmenter par capture ou transfert dun eacutelectron En effet contrairement aux
approches de fragmentation classiques par CID (laquo Collision Induced Dissociation raquo) qui
conduisent agrave une redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums dans la seacutequence ces approches ECD
5
ou ETD permettent de localiser les deuteacuteriums dans la seacutequence avec une reacutesolution qui peut
ecirctre agrave lacide amineacute
Ce travail de thegravese sinscrit dans cette theacutematique de deacuteveloppement dapproches top-down
apregraves eacutechanges HD pour lanalyse de complexes proteacuteiques Les systegravemes biologiques sur
lesquels nous avons choisi de travailler sont les complexes dinitiation de la traduction et ce
travail est meneacute en collaboration avec le laboratoire de Biochimie de lEacutecole Polytechnique
(E Schmitt et Y Meacutechulam) Il a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de M Duchateau (soutenue en
feacutevrier 2010)
Cette thegravese comporte quatre grands chapitres
Le premier est un chapitre bibliographique Il comprend des geacuteneacuteraliteacutes sur la structure des
proteacuteines les meacutethodes physico-chimiques classiquement utiliseacutees en biologie structurale et
fait eacutegalement le point sur les diffeacuterentes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de masse
permettant dobtenir des informations structurales sur des proteacuteines ou des complexes
proteacuteiques Le principe des eacutechanges HD et leur analyse par spectromeacutetrie de masse incluant
les derniers deacuteveloppements dans le domaine fait lobjet de la fin de ce chapitre
Le chapitre II est consacreacute agrave leacutetude de peptides modegraveles qui peuvent ecirctre seacutelectivement
marqueacutes au deuteacuterium Ces peptides ont eacuteteacute utiliseacutes comme sonde (i) du deacutemarquage (D H)
qui peut avoir lieu agrave diffeacuterents endroits du spectromegravetre de masse et (ii) du reacutearrangement
aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes dans la seacutequence polypeptidique lors dexpeacuteriences
de spectromeacutetrie de masse en tandem Lobjectif de ces eacutetudes eacutetait de mettre au point une
approche robuste par ECD ou ETD pour lanalyse de peptides deuteacutereacutes en vue de lappliquer agrave
des proteacuteines
Dans le chapitre III sont regroupeacutes les reacutesultats obtenus pour lanalyse du complexe aIF2 et
notamment toute la mise au point de lapproche top-down HDX sur une des sous-uniteacutes de ce
complexe Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave la fois en ECD sur diffeacuterents spectromegravetres de masse
FT-ICR et en ETD sur un instrument de type Orbitrap installeacute sur la plateforme proteacuteomique
de Paris Diderot dirigeacutee par J-M Camadro Ce chapitre montre toute la difficulteacute quil peut y
avoir pour rendre lapproche robuste et reproductible notamment pour des eacutechantillons reacuteels
pour lesquels de nouvelles contraintes apparaissent (quantiteacute disponible dessalage
stabiliteacute)
Sur la base des reacutesultats obtenus dans le chapitre III il nous est apparu eacutevident quun
problegraveme majeur de reproductibiliteacute eacutetait lieacute agrave leacutetape dintroduction des eacutechantillons deuteacutereacutes
dans le spectromegravetre de masse Nous avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme
complegravetement diffeacuterent de tout ce qui avait eacuteteacute deacuteveloppeacute jusquagrave preacutesent baseacute sur lutilisation
6
dune enceinte isoleacutee qui peut ecirctre maintenue agrave -30degC La mise au point de ce montage
expeacuterimental que nous avons appeleacute cryosource fait lobjet du quatriegraveme chapitre de ce
manuscrit Les diffeacuterentes modifications ayant conduit agrave la version finale de cette cryosource
les difficulteacutes rencontreacutees et la maniegravere donc nous les avons reacutesolues et les performances que
lon peut atteindre sur des peptides ou des proteacuteines sont deacutecrites dans ce chapitre
Le manuscrit se termine par une conclusion geacuteneacuterale et les perspectives lieacutees agrave ce travail et
une annexe deacutecrivant les mateacuteriels et meacutethodes
7
Chapitre I Introduction
8
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10
I112 Structure secondaire 12
I113 Structure tertiaire 15
I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19
I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24
I1221 Diffusion aux petits angles 24
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24
I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27
I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43
I2133 Catalyse de la reacuteaction 46
I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines 47
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49 I221 Marquage continu 50
I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD60
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60
I2332 Approches top-down et HDX 62
I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
9
I1 Analyse de complexes proteacuteiques
Les proteacuteines sont des composants essentiels de la cellule En effet elles assurent
l‟immense majoriteacute des fonctions cellulaires responsables de la vie Les proteacuteines sont
responsables de la catalyse enzymatique du transport des moleacutecules de la deacutefense de l‟hocircte
de la conversion eacutenergeacutetique ainsi que de beaucoup d‟autres processus cellulaires essentiels
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules biologiques de haut poids moleacuteculaire qui
comportent diffeacuterents niveaux de structuration allant de leur seacutequence en acides amineacutes agrave leur
structure tridimensionnelle au sein de complexes proteacuteiques La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine est intimement lieacutee agrave sa fonction Toute l‟information requise pour qu‟une
proteacuteine adopte une conformation native particuliegravere est contenue dans sa seacutequence en acides
amineacutes (1) Les multiples conformations que sont capables d‟adopter les proteacuteines leur
permettent de remplir la varieacuteteacute de tacircches qui leur incombent mais en font des systegravemes
complexes agrave analyser
Cependant aussi puissantes que les proteacuteines puissent ecirctre individuellement leur veacuteritable
pouvoir et leur complexiteacute deacutecoulent des interactions qu‟elles entretiennent avec d‟autres
moleacutecules Beaucoup d‟entre elles ne remplissent leur fonction que si elles sont lieacutees agrave des
ligands tels que des ions meacutetalliques des groupes prostheacutetiques ou agrave d‟autres proteacuteines (2) En
effet un grand nombre de pheacutenomegravenes biologiques implique l‟activiteacute de plusieurs proteacuteines
agrave travers la formation de complexes multi-proteacuteiques Ainsi la compreacutehension des processus
cellulaires au niveau atomique passe par la deacutetermination de la structure tridimensionnelle de
ces complexes
I11 Structure des proteacuteines
L‟analyse de la structure tridimensionnelle revient agrave deacutecrire la position relative des
diffeacuterents atomes constituant une proteacuteine donneacutee De la seacutequence de la proteacuteine agrave la
formation de complexes oligomeacuteriques il existe quatre niveaux de structuration de la
proteacuteine
10
I111 Structure primaire
Les proteacuteines sont des assemblages d‟acides amineacutes (nombre supeacuterieur agrave 50) lieacutes entre eux
par des liaisons peptidiques Il existe vingt acides amineacutes naturels reacutepondant tous agrave la mecircme
structure geacuteneacuterale (Fig I 1) Ce sont des moleacutecules organiques formeacutees d‟un atome de
carbone central (alpha) auquel sont lieacutes un atome d‟hydrogegravene un radical R appeleacute aussi
chaicircne lateacuterale (R repreacutesente un groupement fonctionnel et correspond agrave la portion variable
d‟un acide amineacute agrave l‟autre) ainsi que deux groupements terminaux conserveacutes une amine et un
acide carboxylique
Fig I 1 Structure geacuteneacuterale des acides amineacutes Agrave pH physiologique les groupements
terminaux -NH2 et -COOH sont retrouveacutes respectivement sous la forme -NH3+ et -COO
-
Les acides amineacutes peuvent ecirctre distingueacutes suivant les proprieacuteteacutes physico-chimiques de leur
chaicircne lateacuterale (Fig I 2) Un premier groupe est formeacute par les acides amineacutes preacutesentant des
chaicircnes lateacuterales aliphatiques tels que la glycine (Gly G)1 l‟alanine (Ala A) la valine (Val
V) la leucine (Leu L) l‟isoleucine (Ile I) et la proline (Pro P) Ces acides amineacutes sont
apolaires On peut classer dans une seconde cateacutegorie ceux qui sont aromatiques
pheacutenylalanine (Phe F) tyrosine (Tyr Y) et tryptophane (Trp W) On distingue eacutegalement les
acides amineacutes basiques (lysine [Lys K] arginine [Arg R] histidine [His H]) et acides (acide
aspartique [Asp D] acide glutamique [Glu E]) L‟asparagine (Asn N) et la glutamine [Gln
Q] sont deux acides amineacutes polaires non ionisables Les deux derniers groupes sont constitueacutes
des acides amineacutes hydroxyleacutes (seacuterine [Ser S] threacuteonine [Thr R]) et ceux qui contiennent du
soufre (cysteacuteine [Cys C] meacutethionine [Met M]) Chacun des vingt acides amineacutes possegravede
donc une chaicircne lateacuterale avec une fonction chimique qui lui est propre L‟existence
simultaneacutee d‟une grande diversiteacute de fonctions chimiques est en partie agrave l‟origine de la
1 Les abreacuteviations entre parenthegraveses correspondent agrave la nomenclature en trois lettres et en une lettre des acides
amineacutes Elles seront utiliseacutees dans la suite de ce manuscrit
11
multitude de fonctions biochimiques que peuvent remplir les proteacuteines dans le monde du
vivant
Fig I 2 Tableau des vingt acides amineacutes naturels Ils peuvent ecirctre apolaires (hydrophobes) et
dans ce cas ils sont retrouveacutes le plus souvent au cœur des proteacuteines ou au contraire polaires
(hydrophiles) et localiseacutes geacuteneacuteralement agrave leur surface Parmi ces derniers certains sont acides
dautre basiques dautres encore sont neutres
Les acides amineacutes peuvent se lier entre eux de maniegravere covalente par la formation d‟une
liaison amide appeleacutee aussi liaison peptidique Elle s‟eacutetablit entre le groupement acide (-
COOH) dun acide amineacute et le groupement amine (-NH2) d‟un autre et permet la formation
12
d‟un dipeptide Au cours de la reacuteaction de condensation une moleacutecule deau est eacutelimineacutee Les
polymegraveres comprenant un plus grand nombre d‟acides amineacutes (de 10 agrave 100) sont nommeacutes
polypeptides Ces derniers servent dans la synthegravese des proteacuteines qui sont de longues chaicircnes
polypeptidiques
La structure primaire d‟une proteacuteine est donneacutee par la seacutequence lineacuteaire des acides amineacutes
la constituant Elle est orienteacutee Le premier acide amineacute de la seacutequence est par convention
celui qui possegravede une extreacutemiteacute amine libre on parle dextreacutemiteacute N-terminale De maniegravere
symeacutetrique le dernier acide amineacute est celui qui possegravede une extreacutemiteacute carboxyle libre on
parle d‟extreacutemiteacute C-terminale Cette convention correspond eacutegalement agrave l‟ordre de la synthegravese
de la proteacuteine par les ribosomes Par exemple la description AGSLK correspond agrave
l‟enchaicircnement des acides amineacutes alanine-glycine-seacuterine-leucine-lysine
Cependant une proteacuteine ne peut ecirctre simplement deacutecrite par une structure primaire
lineacuteaire En effet ses proprieacuteteacutes deacutecoulent eacutegalement de sa capaciteacute agrave former des structures
plus eacutelaboreacutees
I112 Structure secondaire
La structure secondaire d‟une proteacuteine correspond au repliement local de sa chaicircne
principale2 Il s‟eacutetablit alors des liaisons hydrogegravenes entre des acides amineacutes qui sont
relativement proches dans sa seacutequence primaire donnant naissance agrave des motifs structuraux
particuliers Lexistence de structures secondaires est due au fait que les repliements
eacutenergeacutetiquement favorables de la chaicircne peptidique sont en nombres limiteacutes et que seules
certaines conformations sont possibles Ainsi une proteacuteine se deacutecrit par sa seacutequence dacides
amineacutes mais aussi par l‟enchaicircnement de ses eacuteleacutements de structure secondaire
En d‟autres termes certaines conformations se trouvent nettement favoriseacutees car
particuliegraverement stabiliseacutees par des liaisons hydrogegravene entre les groupements amide (-NH) et
carbonyle (CO) du squelette peptidique Il existe trois principaux types de structures
secondaires selon le repliement des liaisons peptidiques et l‟eacutetablissement de ponts hydrogegravene
entre les acides amineacutes les heacutelices les feuillets et les coudes
2 La chaicircne principale dune proteacuteine correspond aux atomes impliqueacutes dans la structure de base du polypeptide
(-NH-CαH-CO-) Les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (souvent noteacutees -R) nappartiennent donc pas au
squelette carboneacute
13
L‟heacutelice est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine adopte
un repliement heacutelicoiumldal peacuteriodique L‟heacutelice est dite laquo droite raquo quand elle tourne dans le sens
horaire Il s‟agit du cas rencontreacute le plus freacutequent A linverse lorsquune heacutelice tourne dans le
sens anti-horaire elle est dite laquo gauche raquo Lheacutelice droite de type alpha est un motif structural
tregraves retrouveacute au sein des proteacuteines (Fig I 3) L‟heacutelice α est une structure tregraves stable
caracteacuteriseacutee par la formation de liaisons hydrogegravene entre le groupement carbonyle dun reacutesidu
n et le groupement amide dun reacutesidu n+4 Un tour dheacutelice α moyen est constitueacute de 36
acides amineacutes Dans une heacutelice α les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes sont localiseacutees en
peacuteripheacuterie de lheacutelice et pointent vers lexteacuterieur perpendiculairement agrave l‟axe de la spirale La
structure compacte eacutenergeacutetiquement favorable de lheacutelice α a eacuteteacute preacutedite par Linus Pauling et
Robert Corey en 1951 (3) agrave partir de calculs theacuteoriques Elle a ensuite eacuteteacute observeacutee pour la
premiegravere fois en 1958 dans la myoglobine en huit exemplaires impliquant environ 75 des
acides amineacutes de la proteacuteine La structure tridimensionnelle de cette derniegravere fut la premiegravere
eacutelucideacutee par cristallographie des proteacuteines (4)
Fig I 3 Scheacutema de l‟heacutelice droite de type α tregraves reacutepandue dans le repliement des proteacuteines
Le pas de l‟heacutelice est de 54 Aring (5)
Le feuillet becircta est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine
adopte un repliement eacutetendu peacuteriodique Le feuillet β est composeacute de plusieurs brins β qui
eacutetablissent des liaisons hydrogegravene entre eux afin de stabiliser la structure De ce fait les ponts
hydrogegravenes qui le stabilisent se font entre reacutesidus distants plutocirct quentre reacutesidus conseacutecutifs
comme c‟est le cas dans une heacutelice α Dans un feuillet β les chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes sont situeacutees alternativement en dessus et en dessous du plan du feuillet Le repliement
β est favoriseacute par des acides amineacutes portant des petits groupements lateacuteraux laquoRraquo non chargeacutes
De la mecircme maniegravere que pour la structure de lheacutelice α la structure du feuillet β a eacuteteacute preacutedite
14
par Pauling et Corey en 1951 (6) Les feuillets β sont repreacutesenteacutes par des flegraveches (Fig I 4)
correspondant aux chaicircnes polypeptidiques qui les constituent Ces derniegraveres sont plisseacutees et
peuvent ecirctre aligneacutees de maniegravere parallegravele et dans ce cas elles ont la mecircme orientation ou de
maniegravere antiparallegravele avec des orientations opposeacutees Le sens est deacutetermineacute par la polariteacute des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes Lorsque deux brins β sorganisent de maniegravere
antiparallegravele les groupements -NH et -CO dun reacutesidu i du premier brin forment des liaisons
hydrogegravene avec les groupements -CO et -NH dun reacutesidu j appartenant au second
Typiquement deux brins β conseacutecutifs relieacutes par un coude forment un feuillet β antiparallegravele
Lorsque deux brins β sont orienteacutes dans le mecircme sens ils s‟organisent en un feuillet parallegravele
Les groupements -NH et -CO dun reacutesidu dun brin A forment alors des liaisons hydrogegravene
avec les groupements -CO dun premier reacutesidu et -NH d‟un second reacutesidu appartenant tous les
deux agrave un brin B Le feuillet β antiparallegravele est plus stable que le feuillet parallegravele car les ponts
hydrogegravene sont dans un alignement parfait
Fig I 4 Scheacutema du feuillet β anti-parallegravele qui est la juxtaposition de brins β ayant des
orientations opposeacutees (5)
Les coudes ne sont pas des structures reacuteguliegraveres et peacuteriodiques Il sagit plutocirct dun
repliement particulier de la chaicircne principale localiseacute sur trois ou quatre reacutesidus conseacutecutifs
Les coudes permettent bien souvent de relier deux structures secondaires peacuteriodiques telles
que les heacutelices etou les brins
15
Les heacutelices α les feuillets β et les coudes ne sont pas les seuls motifs structuraux
secondaires mais sont ceux qui sont le plus freacutequemment rencontreacutes Il existe une grande
varieacuteteacute de motifs moins courants qui ne seront pas deacutetailleacutes dans ce manuscrit
I113 Structure tertiaire
La structure tertiaire d‟une proteacuteine correspond agrave sa structure tridimensionnelle
d‟ensemble Il s‟agit de la structure finale adopteacutee par une proteacuteine apregraves le repliement dans
l‟espace des heacutelices α feuillets β et autres eacuteleacutements de la structure secondaire
Bien que la plupart des proteacuteines neacuteosyntheacutetiseacutees aient la capaciteacute de se replier
correctement certaines en sont incapables sans l‟intervention de proteacuteines dicirctes chaperonnes
Une proteacuteine chaperonne est donc une proteacuteine particuliegravere dont une des fonctions est
dassister dautres proteacuteines dans leur maturation en leur assurant un repliement
tridimensionnel adeacutequat Le repliement dans l‟espace des chaicircnes polypeptidiques est un
processus co-traductionnel (7) Les proteacuteines chaperonnes ont eacuteteacute co-deacutecouvertes en 1989 par
Arthur L Horwich et Franz-Ulrich Hartl (8-9)
La structure tertiaire donne une forme particuliegravere agrave la proteacuteine la rendant ainsi
fonctionnelle Pour cela elle faccedilonne la surface des proteacuteines de maniegravere complexe leur
permettant d‟interagir speacutecifiquement avec des ligands ou d‟autres macromoleacutecules comme
des proteacuteines partenaires (10) La structure tridimensionnelle est thermodynamiquement
stable dans un domaine restreint de tempeacuterature pH et force ionique Au-delagrave de ce domaine
une proteacuteine peut se deacuteplier et perdre son activiteacute biologique on dit alors qu‟elle est
deacutenatureacutee A l‟inteacuterieur des cellules ce sont les proteacuteines chaperonnes qui interviennent Elles
preacuteviennent les dommages potentiels causeacutes par de telles variations des conditions physico-
chimiques et regraveglent la perte de fonction due au mauvais repliement tridimensionnel pouvant
conduire agrave une varieacuteteacute de pathologies telles que la maladie d‟Alzheimer ou les maladies agrave
prion (11) L‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines est donc un eacuteleacutement cleacute
dans la compreacutehension de leurs fonctions biochimiques Son importance est aussi retrouveacutee
dans l‟industrie biopharmaceutique notamment dans le controcircle de la conception de proteacuteines
pharmaceutiques Il faut noter par ailleurs que la structure tridimensionnelle d‟une proteacuteine
en solution n‟est pas totalement rigide mais dynamique (12-13) En effet la chaicircne
polypeptidique subit des mouvements thermiques et est susceptible de se deacuteformer lors
16
d‟interactions avec d‟autres moleacutecules Ces fluctuations de conformations sont souvent
consideacutereacutees comme une condition preacutealable agrave la fonction biologique (14-15)
Cette organisation structurale dans l‟espace est obtenue et rendue possible gracircce agrave
diffeacuterents types dinteractions qui la stabilisent Ces interactions plus ou moins fortes sont
eacutetablies entre les radicaux de diffeacuterents acides amineacutes geacuteneacuteralement eacuteloigneacutes dans la structure
primaire La chaicircne principale de la proteacuteine aura donc tendance agrave se replier sur elle-mecircme
pour adopter une structure tridimensionnelle preacutecise Parmi les interactions les plus notables
sont retrouveacutees les interactions covalentes non covalentes ainsi que les interactions
hydrophobes
Les interactions covalentes eacutetablissent des liaisons fortes entre deux acides amineacutes qui
peuvent ecirctre tregraves proches dans la structure tertiaire mais tregraves eacuteloigneacutes dans la structure
primaire de la proteacuteine De ce fait la formation de cette liaison conduit agrave une stabilisation
accrue de la structure tertiaire Dans le cas des proteacuteines il s‟agit principalement de la
creacuteation d‟un pont disulfure par une reacuteaction d‟oxydation se deacuteroulant entre les fonctions
thiols de deux cysteacuteines Les interactions non covalentes regroupent quant agrave elles les liaisons
eacutelectrostatiques les liaisons hydrogegravene et les liaisons de van der Waals Elles se distinguent
par leur geacuteomeacutetrie leur longueur et leur speacutecificiteacute Elles sont affecteacutees de diffeacuterentes faccedilons
par la preacutesence d‟eau
Les liaisons eacutelectrostatiques peuvent s‟eacutetablir entre deux groupements portant une charge
nette positive ou neacutegative Cette interaction peut conduire agrave un effet reacutepulsif (charges de signe
identique) ou attractif (charges opposeacutees) Une interaction entre deux groupes de charge
opposeacutee est eacutegalement appeleacutee liaison ionique liaison saline pont salin ou paire d‟ions Il
s‟agit de l‟interaction la plus forte parmi les interactions non covalentes Elle est plus forte
dans le vide et plus faible dans un milieu tel que l‟eau
Les liaisons hydrogegravene peuvent ecirctre formeacutees aussi bien entre des moleacutecules non chargeacutees
que des moleacutecules chargeacutees Elle correspond agrave une liaison entre deux atomes eacutelectroneacutegatifs
assureacutee par un atome d‟hydrogegravene partageacute entre les deux L‟atome auquel l‟hydrogegravene est le
plus fermement lieacute est le donneur d‟hydrogegravene tandis que l‟autre est l‟accepteur d‟hydrogegravene
Avec des eacutenergies de liaison de l‟ordre de 3 agrave 7 kcalmol les liaisons hydrogegravene sont plus
fortes que celles de van der Waals Les liaisons hydrogegravene sont directionnelles Les plus
fortes sont celles dans lesquelles le donneur l‟hydrogegravene et l‟accepteur sont colineacuteaires
17
Les liaisons de van der Waals force attractive non speacutecifique entrent en jeu lorsque deux
atomes sont distants de 3 agrave 4 Aring Elle est due au fait que la distribution de la charge
eacutelectronique autour d‟un atome varie dans le temps A un instant donneacute la distribution de la
charge n‟est pas parfaitement symeacutetrique Cette asymeacutetrie transitoire de la charge eacutelectronique
autour d‟un atome induit une asymeacutetrie semblable dans la distribution eacutelectronique des
atomes voisins non lieacutes Ceci conduit donc agrave des interactions de type dipocircle-dipocircle induit
L‟eacutenergie des interactions de van der Waals est faible avec une eacutenergie de stabilisation de
l‟ordre de 06 kcalmol Comme pour les liaisons hydrogegravene le nombre de ces interactions au
sein d‟une proteacuteine peut ecirctre tregraves eacuteleveacute La somme de l‟eacutenergie mise en jeu est alors
substantielle A titre d‟exemple dans le cytochrome C de cheval et dans la myoglobine de
cachalot les interactions de van der Waals agrave l‟inteacuterieur de la proteacuteine contribuent pour
l‟essentiel agrave la stabiliteacute de la structure
Dans une solution aqueuse une moleacutecule apolaire tend agrave interagir avec d‟autres moleacutecules
apolaires plutocirct que de s‟entourer de moleacutecules d‟eau On nomme cette proprieacuteteacute
hydrophobiciteacute et cela conduit agrave des interactions entre moleacutecules qu‟on appelle des
interactions hydrophobes Ces derniegraveres engendrent dans le cas des proteacuteines un
regroupement des reacutesidus apolaires geacuteneacuteralement vers le centre formant un cœur hydrophobe
ou encore au niveau d‟autres reacutegions hydrophobes de la cellule comme dans les membranes
lipidiques Les interactions hydrophobes constituent une force essentielle dans le repliement
des proteacuteines
I114 Structure quaternaire
La structure quaternaire d‟une proteacuteine est donneacutee par l‟association des diffeacuterentes chaicircnes
polypeptidiques la constituant Elles peuvent ecirctre identiques ou diffeacuterentes et sont relieacutees par
des liaisons non covalentes (liaisons hydrogegravene liaisons ioniques interactions hydrophobes)
et plus rarement par des ponts disulfures Leffet hydrophobe est un facteur preacutepondeacuterant dans
lassemblage des eacuteleacutements structuraux y compris dans lassociation des chaicircnes Chacune de
ces chaicircnes est appeleacutee monomegravere (ou sous uniteacute) et lensemble oligomegravere ou proteacuteine
multimeacuterique
18
Seulement certaines proteacuteines preacutesentent une telle organisation Lheacutemoglobine est un
exemple de proteacuteine posseacutedant une structure quaternaire Elle est constitueacutee de quatre sous-
uniteacutes deux sous-uniteacutes α (de 141 acides amineacutes) et deux sous-uniteacutes β (de 146 acides
amineacutes)
Ces assemblages polypeptidiques peuvent ecirctre parfaitement bien deacutefinis mais certains
peuvent former des complexes multiproteacuteiques uniquement transitoires tout en eacutetant
fonctionnellement importants En effet dans l‟environnement cellulaire les proteacuteines sont
rarement isoleacutees et les interactions qu‟elles peuvent creacuteer avec d‟autres partenaires sont
essentielles agrave leur fonction Dans d‟autres cas comme dans les macroassemblages amyloiumldes
la formation d‟un complexe entre des proteacuteines peut conduire agrave la formation d‟assemblages
potentiellement pathogegravenes (16) L‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
macroassemblages est donc primordiale agrave la compreacutehension de leur fonctionnement et
dysfonctionnement
~
Nous venons de mettre en eacutevidence l‟importance de l‟eacutetude structurale des proteacuteines ainsi
que sa complexiteacute qui en font un veacuteritable deacutefi analytique La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine donneacutee n‟est pas neacutecessairement unique elle peut fluctuer temporellement ou
deacutependre des autres moleacutecules (proteacuteines ou ligands) avec lesquelles la proteacuteine interagit dans
l‟environnement cellulaire Il existe un grand nombre de techniques physico-chimiques
biophysiques ou biochimiques permettant d‟obtenir des informations structurales sur des
proteacuteines et des complexes proteacuteiques Les approches les plus couramment employeacutees pour
identifier et caracteacuteriser des interactions proteacuteine-proteacuteine combinent des meacutethodes
biochimiques et biophysiques
Parmi ces techniques deux meacutethodes physico-chimiques sont couramment utiliseacutees pour
l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines Il s‟agit de la cristallographie et de la
reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire (RMN) En ce qui concerne l‟analyse des complexes
proteacuteiques qui sont geacuteneacuteralement des eacutedifices macromoleacuteculaires bien plus importants ces
derniegraveres anneacutees ont vu le deacuteveloppement de meacutethodes alternatives telles que la cryo-
microscopie eacutelectronique la diffraction de rayons X ou de neutrons aux petits angles ou
encore diffeacuterentes techniques baseacutees sur l‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse Il est aussi
possible d‟aborder la composition des complexes proteacuteiques par des meacutethodes biochimiques
parmi lesquelles le TAP-Tag et le double hybride occupent une place de choix
19
Les paragraphes suivants seront consacreacutes agrave une description des grandes meacutethodes
d‟analyse physico-chimique et biochimique utilisables pour appreacutehender la structure des
proteacuteines mais surtout celle des complexes proteacuteiques
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique
I121 Meacutethodes classiques pour lrsquoeacutetude de la structure tridimensionnelle des
proteacuteines
I1211 Cristallographie des proteacuteines
La cristallographie est la science qui eacutetudie les systegravemes cristallins agrave leacutechelle atomique
Les macromoleacutecules dont font partie les proteacuteines sont geacuteneacuteralement trop petites pour ecirctre
observeacutees directement par microscopie optique En effet leur taille nest pas suffisante pour
diffracter la lumiegravere dans les longueurs d‟onde du domaine visible du spectre
eacutelectromagneacutetique En revanche les distances interatomiques au sein des proteacuteines (environ
15 Aring) sont du mecircme ordre de grandeur que la longueur d‟onde des rayons X Par conseacutequent
la diffraction des rayons X par les atomes d‟une proteacuteine peut quant agrave elle ecirctre envisageacutee
Dans un cristal reacutegulier les proteacuteines forment un arrangement peacuteriodique suivant des axes de
l‟espace tridimensionnel de mailles eacuteleacutementaires deacutefinies comme eacutetant le plus petit eacuteleacutement
repreacutesentant le cristal entier Des translations suivant les axes d‟une maille eacuteleacutementaire
permettent de reconstituer l‟ensemble du cristal
Chaque atome d‟une proteacuteine a donc exactement la mecircme position dans toutes les mailles
Le cristal est ainsi composeacute de plans d‟atomes Ces plans d‟atomes ou plutocirct les nuages
d‟eacutelectrons correspondants produisent un motif de diffraction lors de l‟irradiation du cristal
aux rayons X (17) Le motif de diffraction contient les informations sur la position de tous les
atomes de la maille Par conseacutequent il est possible par l‟analyse de ce motif de calculer les
angles de diffraction ainsi que les distances interatomiques pour reconstituer la structure
moleacuteculaire
La haute reacutesolution reste le principal avantage de cette technique Malgreacute des donneacutees
relativement complexes agrave analyser la diffraction des rayons X donne des informations tregraves
preacutecises sur la structure moleacuteculaire des proteacuteines souvent agrave une reacutesolution atomique
20
infeacuterieure ou eacutegale agrave 12 Aring (18) A des reacutesolutions encore plus eacuteleveacutees ie infeacuterieures ou
eacutegales agrave 08 Aring les atomes d‟hydrogegravene deviennent visibles et les atomes ne peuvent plus ecirctre
consideacutereacutes comme des sphegraveres en raison de la deacuteformation des nuages eacutelectroniques Une telle
visualisation des eacutelectrons permet de deacuteterminer la distribution des charges et la polarisation
des liaisons (19) Une image tregraves deacutetailleacutee de la structure de la proteacuteine est alors obtenue
Toutefois la technique preacutesente des limites La principale difficulteacute lieacutee agrave la meacutethode reste
l‟obtention de cristaux avec des tailles suffisantes Il est indispensable de disposer de
plusieurs cristaux identiques car ils sont souvent deacutegradeacutes en preacutesence des rayons X (par
chauffage ou par des radicaux libres) Pour faire pousser des cristaux il est neacutecessaire de
produire une proteacuteine extrecircmement pure Il est eacutegalement indispensable d‟exprimer des
quantiteacutes importantes de proteacuteine afin de trouver les conditions optimales de cristallisation
Ces derniegraveres eacutetant proteacuteines deacutependantes il est impeacuteratif d‟en tester un grand nombre Les
cristaux peuvent se former rapidement ou au contraire apparaicirctre apregraves un temps
consideacuterablement long Parfois mecircme il est malheureusement impossible d‟en obtenir Les
chaicircnes polypeptidiques partiellement replieacutees telles que le prion sont un exemple probant de
proteacuteines difficilement cristallisables (20) De plus si des cristaux sont finalement obtenus
alors les segments peptidiques qui sont non structureacutes en solution apparaicirctront soit ordonneacutes
par des liaisons intermoleacuteculaires au sein du systegraveme cristallin ou n‟apparaicirctront pas Par
conseacutequent il est important de deacutevelopper une meacutethode alternative permettant d‟eacutetudier la
structure de proteacuteines partiellement replieacutees ou mecircme deacutesordonneacutees
Par deacutefinition l‟eacutetude cristallographique est baseacutee sur des structures statiques (les cristaux)
de l‟eacutetat le plus stable Il est donc peu probable que cette technique renseigne sur la
dynamique des moleacutecules Si la proteacuteine cristalliseacutee preacutesente une dynamique sans mouvement
agrave grande eacutechelle alors des eacuteveacutenements dynamiques peuvent ecirctre caracteacuteriseacutes En revanche les
mouvements agrave grande eacutechelle sont quasiment toujours bloqueacutes dans le cristal D‟importants
deacuteveloppements technologiques ont eacuteteacute apporteacutes agrave la technique pour ameacuteliorer l‟observation
de la dynamique agrave courte eacutechelle Il s‟agit de la cryo-cristallographie (21-23) ou des meacutethodes
de cristallographie en temps reacutesolu (24-26)
L‟avegravenement du synchrotron a consideacuterablement acceacuteleacutereacute la vitesse d‟acquisition des
donneacutees En effet celle-ci a eacuteteacute reacuteduite de quelques semaines agrave quelques heures gracircce agrave la
production d‟un rayonnement X intense stable de longueur d‟onde variable et de grande
21
qualiteacute optique Actuellement la plupart des donneacutees de cristallographie sont collecteacutees agrave
partir d‟un synchrotron
La diffraction des rayons X est eacutegalement un outil de choix pour l‟eacutetude de complexes
proteacuteiques permettant d‟obtenir des informations structurales de tregraves grande qualiteacute mecircme
pour des systegravemes tregraves complexes (27) ou membranaires (28-29)
I1212 Spectroscopie RMN
La spectroscopie RMN est eacutegalement devenue une meacutethode performante pour l‟eacutetude de la
conformation des proteacuteines Deacuteveloppeacutee en 1945 elle n‟a cesseacute d‟ecirctre ameacutelioreacutee depuis sa
mise au point En raison de l‟impact scientifique exceptionnel qu‟elle a eu au fil des anneacutees
elle a eacuteteacute reacutecompenseacutee par quatre prix Nobel Le dernier en date (2002) a eacuteteacute deacutecerneacute au
Professeur Kurt Wuumlthrich pour ses deacuteveloppements porteacutes agrave la RMN qui ont permis
l‟eacutelucidation de la structure tridimensionnelle des macromoleacutecules biologiques en solution
Plus particuliegraverement il a eacuteteacute primeacute pour son eacutetude structurale de la proteacuteine prion
partiellement replieacutee (30)
Technique d‟analyse chimique et structurale non destructive elle est baseacutee sur l‟absorption
de la radiation agrave une radio freacutequence par des noyaux atomiques Les niveaux d‟eacutenergie de spin
des noyaux sont seacutepareacutes dans un champ magneacutetique (effet Zeeman) Sous l‟effet d‟une radio
freacutequence chaque noyau de la moleacutecule va reacutesonner agrave sa freacutequence speacutecifique (freacutequence de
Larmor) Chaque noyau de la proteacuteine a donc sa propre freacutequence de Larmor qui deacutepend de
l‟environnement local du noyau (par exemple protection par des champs magneacutetiques locaux)
Un spectre RMN contient ainsi des pics correspondants aux reacutesonances de tous les noyaux de
l‟eacutechantillon chacun avec une freacutequence (caracteacuteriseacutee par le deacuteplacement chimique δ)
caracteacuteristique de son environnement chimique De plus la surface sous un pic est
proportionnelle au nombre des noyaux reacutesonnant agrave cette freacutequence ce qui permet de
quantifier les reacutesidus identifieacutes et caracteacuteriseacutes
Un facteur tregraves important permettant la deacutetermination de la structure des proteacuteines est la
correacutelation entre des noyaux d‟une moleacutecule La perturbation locale des nuages d‟eacutelectrons
par le spin des noyaux conduit agrave un couplage scalaire entre des noyaux qui sont lieacutes de faccedilon
covalente avec un maximum de quatre liaisons entre eux L‟origine de ce couplage est le
22
changement des niveaux d‟eacutenergie des eacutetats de spin des noyaux en question pour conduire agrave
des nouveaux niveaux d‟eacutenergie en fonction de l‟alignement des spins des noyaux (parallegravele
ou anti-parallegravele) Le nombre et la nature des noyaux voisins produit des motifs et des
constantes de couplage speacutecifiques qui permettent d‟attribuer une structure covalente Dans
les proteacuteines chaque chaicircne lateacuterale d‟un acide amineacute preacutesente un motif de couplage scalaire
caracteacuteristique Il est alors aiseacute d‟attribuer les signaux RMN agrave la structure d‟une proteacuteine
L‟eacutetude d‟une proteacuteine peut ecirctre reacutealiseacutee par RMN homonucleacuteaire ou heacuteteacuteronucleacuteaire Les
noyaux protons sont alors observeacutes respectivement seuls ou avec les noyaux carbones etou
azotes Les expeacuteriences RMN permettent l‟observation des couplages scalaires et dipolaires
entre spins Le transfert d‟aimantation par couplage dipolaire produit des effets Overhauser
nucleacuteaires (nOe) entre noyaux situeacutes agrave moins de 5 Aring l‟un de l‟autre La mise en eacutevidence de
ces pheacutenomegravenes permet l‟estimation des distances entre les noyaux consideacutereacutes Cependant la
RMN homonucleacuteaire preacutesente certaines limites pour l‟eacutetude des proteacuteines en solution en
raison du taux de superposition des pics sur les spectres et du mauvais transfert d‟aimantation
entre protons par couplage scalaire Ces inconveacutenients qui rendaient probleacutematique l‟emploi
de la RMN pour l‟eacutetude de proteacuteines de taille supeacuterieure agrave cent acides amineacutes ont eacuteteacute
surmonteacutes par l‟utilisation des proprieacuteteacutes RMN de noyaux autres que le proton En effet des
noyaux diffeacuterents reacutesonnent dans des gammes de freacutequences diffeacuterentes ce qui permet de
reacutesoudre les superpositions de deacuteplacements chimiques De plus les constantes de couplage
heacuteteacuteronucleacuteaires ameacuteliorent la sensibiliteacute du couplage scalaire
Les trois isotopes de spin 12 naturellement preacutesents dans les proteacuteines sont 1H
15N et
13 C
Cependant les faibles abondances naturelles des isotopes 13
C du carbone (11 ) et 15
N de
l‟azote (037 ) ne permettent pas de reacutealiser des expeacuteriences de correacutelation heacuteteacuteronucleacuteaire
les impliquant Par conseacutequent un enrichissement des eacutechantillons proteacuteiques en isotopes 13
C
et 15
N preacutealable agrave l‟analyse en RMN doit ecirctre envisageacute
La preacuteparation d‟eacutechantillons marqueacutes est reacutealiseacutee le plus souvent par clonage
moleacuteculaire et par techniques de surexpression et de purification de proteacuteines La
surexpression des proteacuteines isotopiquement enrichies peut se faire agrave partir d‟une culture en
milieu minimum ou en milieu riche Le milieu minimum est preacutepareacute de faccedilon agrave ne renfermer
qu‟une seule source du noyau dont on veut enrichir la proteacuteine (eg glucose avec 13
C
chlorure d‟ammonium avec 15
N) Les cultures en milieu riche se font en utilisant un milieu
standard enrichi en isotopes Si l‟on souhaite simplement proceacuteder agrave un marquage partiel de la
23
proteacuteine sur certains types de reacutesidus alors on peut utiliser un organisme heacuteteacuterotrophe Ce
dernier incapable de syntheacutetiser certains acides amineacutes devra donc les puiser dans son milieu
de culture Ces organismes sont cultiveacutes dans un milieu contenant les acides amineacutes marqueacutes
que l‟on veut incorporer dans la proteacuteine
Les expeacuteriences de RMN heacuteteacuteronucleacuteaire peuvent ecirctre reacutealiseacutees sur des eacutechantillons
simplement marqueacutes au 15
N ou doublement marqueacutes (15
N 13
C) Dans le cas de proteacuteines
marqueacutees agrave l‟isotope lourd de l‟azote (15
N) des expeacuteriences 2D HSQC ou HMQC
(laquo Heteronuclear Single Multiple Quantum Correlation raquo) peuvent ecirctre meneacutees Elles
permettent d‟observer les pics de correacutelation dus au couplage scalaire entre l‟hydrogegravene
amide et l‟azote de chaque reacutesidu La strateacutegie d‟attribution baseacutee sur le double marquage
utilise quant agrave elle exclusivement les couplages scalaires homo- et heacuteteacuteronucleacuteaires Si l‟on
souhaite augmenter la limite de taille des systegravemes eacutetudieacutes alors en sus du marquage 15
N et
13C on peut remplacer 70 agrave 100 des protons par des deuteacuteriums En effet cela permet de
diminuer la fuite de l‟aimantation due aux interactions dipolaires entre protons La diminution
de la relaxation transverse agrave l‟aide de l‟expeacuterience TROSY (laquo Transverse Relaxation-
Optimized SpectroscopY raquo) permet eacutegalement de repousser cette limite (31) Des expeacuteriences
combinant les deux approches ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees pour l‟analyse de complexes
proteacuteiques de haut poids moleacuteculaire (gt 50 kDa) (32)
Les intermeacutediaires du repliement d‟une proteacuteine peuvent aussi ecirctre caracteacuteriseacutes par
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avec le deuteacuterium de l‟eau lourde Enfin une interpreacutetation
qualitative des deacuteplacements chimiques en fonction de la structure primaire de la moleacutecule
permet la deacutetection des structures secondaires telles que l‟heacutelice α ou le feuillet β
Si l‟avantage majeur de la RMN par rapport agrave la diffraction des rayons X est de permettre
l‟eacutetude de proteacuteines en solution elle preacutesente des limites importantes qui sont d‟une part la
quantiteacute de mateacuteriel neacutecessaire pour reacutealiser les expeacuteriences (des concentrations de l‟ordre du
millimolaire de proteacuteine sont geacuteneacuteralement utiliseacutees et d‟une centaine de micromoles avec
l‟utilisation d‟une cryosonde) mais surtout la taille des systegravemes qui peuvent ecirctre eacutetudieacutes (lt
50 kDa) Il faut par ailleurs noter que dans certains cas des concentrations d‟eacutechantillon tregraves
eacuteleveacutees peuvent induire des perturbations de la structure quaternaire des proteacuteines (agreacutegation
ou preacutecipitation de certaines proteacuteines)
24
I122 Meacutethodes pour lrsquoeacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
assemblages macromoleacuteculaires
I1221 Diffusion aux petits angles
La diffusion aux petits angles des rayons X en solution (laquo Small Angle X-ray Scattering raquo
SAXS) est une technique qui repose sur la diffusion eacutelastique des rayons X par des proteacuteines
et des macro-assemblages dans la gamme 10-1000 Aring (33) Bien qu‟il ne soit pas possible
d‟obtenir une reacutesolution atomique par cette meacutethode elle fournit des informations structurales
preacutecieuses agrave basse reacutesolution (forme globale de la proteacuteine structures tertiaire et quaternaire)
Elle permet donc d‟eacutetudier les changements conformationnels de macromoleacutecules ainsi que la
formation d‟assemblages supramoleacuteculaires dans des conditions quasi-physiologiques La
diffusion en solution qui n‟est pas soumise aux principales limitations de la cristallographie
et de la RMN apparaicirct comme une technique compleacutementaire pour l‟eacutetude structurale des
macromoleacutecules
Les eacutechantillons reacuteels sont le plus souvent complexes (co-existence de plusieurs espegraveces de
proteacuteines) et heacuteteacuterogegravenes (manque dhomogeacuteneacuteiteacute au niveau de la conformation des
moleacutecules) Leur eacutetude repreacutesente un deacutefi majeur pour cette technique En effet dans un tel
cas le profil de diffusion contiendra des contributions de tous les composants rendant
l‟analyse complexe Cette difficulteacute peut ecirctre surmonteacutee par des meacutethodes de traitement des
donneacutees afin de caracteacuteriser des conformegraveres individuels de proteacuteines (34) ou bien des
agreacutegats de proteacuteines (35)
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique
La cryomicroscopie eacutelectronique se base sur les principes geacuteneacuteraux de la microscopie
eacutelectronique agrave transmission tout en eacutevitant les eacutetapes de preacuteparation endommageant les
eacutechantillons Elle repose sur l‟observation de moleacutecules ayant eacuteteacute fixeacutees de maniegravere brutale
par congeacutelation agrave tregraves basse tempeacuterature (processus de quelques millisecondes agrave environ -
170degC) afin d‟eacuteviter la formation de cristaux de glace Les moleacutecules totalement englobeacutees
dans un fin film d‟eau vitrifieacutee sont ainsi preacuteserveacutees dans leur environnement et leur eacutetat
natifs Compleacutementaire agrave la cristallographie des proteacuteines et agrave la spectroscopie RMN cette
meacutethode permet d‟obtenir la structure de larges assemblages macromoleacuteculaires en solution
25
La microscopie eacutelectronique permet d‟obtenir des images bidimensionnelles correspondant
agrave des projections de toute leacutepaisseur de leacutechantillon Cependant elles ne possegravedent quun
contraste tregraves faible et lanalyse dimages est alors indispensable Celle-ci consiste dans un
premier temps agrave additionner des images de faible contraste afin de moyenner le bruit preacutesent
et dobtenir un meilleur rapport signal sur bruit Dans un deuxiegraveme temps ces moyennes qui
repreacutesentent des vues de leacutechantillon sous diffeacuterents angles peuvent ecirctre combineacutees de
maniegravere matheacutematique pour calculer la structure tridimensionnelle de lobjet de deacutepart (36)
Cette technique de reconstruction en 3D utilisant des images obtenues sous diffeacuterents angles
est appeleacutee tomographie
La cryomicroscopie eacutelectronique est particuliegraverement bien adapteacutee agrave l‟observation de
moleacutecules de masse moleacuteculaire supeacuterieure agrave 200 ou 300 kDa (37) En effet seuls des eacutedifices
macromoleacuteculaires de grande taille remplissent les critegraveres neacutecessaires pour ecirctre visualiseacutes au
dessus du bruit de fond Il est possible d‟obtenir une reacutesolution de l‟ordre de 10 agrave 30 Aring (38)
Pour des macro-assemblages on peut envisager de compleacuteter une structure agrave basse reacutesolution
avec des structures agrave haute reacutesolution des proteacuteines individuelles Ces derniegraveres peuvent ecirctre
obtenues par exemple par cristallographie Il est ainsi possible d‟obtenir des informations
structurales agrave une reacutesolution presque atomique de structures subcellulaires (39)
Cette technique permet l‟eacutetude du changement conformationnel d‟assemblages
macromoleacuteculaires par imagerie de complexes fixeacutes par vitrification dans diffeacuterents eacutetats
conformationnels (37 40) La microscopie eacutelectronique permet eacutegalement aujourd‟hui
d‟obtenir des informations sur des macromoleacutecules et leurs assemblages dans le contexte
cellulaire par imagerie de la structure biologique entiegravere (41-43) Ceci a eacuteteacute rendu possible par
les progregraves effectueacutes dans le deacuteveloppement de la tomographie eacutelectronique et l‟eacutelaboration
de la cryomicroscopie de sections vitreuses
Il existe de nombreuses eacutetudes de complexes macromoleacuteculaires par cryomicroscopie
eacutelectronique parmi lesquelles la structure du ribosome agrave une reacutesolution de 115 Aring (44) et celle
de virus (45) l‟environnement cytosolique total de cellules eucaryotes (46) ainsi que l‟eacutetude
d‟une interaction proteacuteine chaperone-substrat (47)
La cryomicroscopie eacutelectronique possegravede plusieurs avantages par rapport agrave la
cristallographie et agrave la RMN En effet elle requiert de plus faibles quantiteacutes de mateacuteriel
(environ 2 mL agrave une concentration de 01-10 mgmL-1
par grille) elle ne neacutecessite pas
26
l‟obtention de cristaux et elle permet l‟observation d‟objets de lordre de grandeur de 300 kDa
agrave 1000 MDa Mais cette meacutethode preacutesente aussi des limites Les eacutechantillons doivent ecirctre
purs uniformes et sans agreacutegats et contenir seulement une faible concentration de sel et de
solvants afin de maximiser le contraste entre la proteacuteine et le tampon
I1223 Chromatographie drsquoexclusion steacuterique
La chromatographie est une technique de chimie analytique quantitative et qualitative Il
s‟agit d‟une meacutethode physique de seacuteparation d‟espegraveces chimiques Le principe est le suivant
leacutechantillon renfermant une ou plusieurs espegraveces est entraicircneacute par une phase mobile le long
dune phase stationnaire Chaque espegravece a une vitesse de migration propre qui deacutepend de ses
caracteacuteristiques et de celles des deux phases
La chromatographie d‟exclusion steacuterique appeleacutee aussi filtration sur gel permet de seacuteparer
des proteacuteines ou autres moleacutecules biologiques suivant leur taille (48) tandis que la plupart des
meacutethodes chromatographiques utilisent l‟affiniteacute chimique avec un support La phase
stationnaire est un gel hydrateacute constitueacute de pores de tailles diffeacuterentes Les macromoleacutecules de
l‟eacutechantillon entrent et sortent de ces pores selon leur taille Les moleacutecules les plus petites
peuvent entrer dans un plus grand nombre de pores ce qui allonge la dureacutee de leur migration
alors que les plus grosses moleacutecules sont eacutelueacutees plus rapidement En conseacutequence les
macromoleacutecules sont seacutepareacutees selon leurs dimensions
Plus rigoureusement cette meacutethode permet de seacuteparer des macromoleacutecules en fonction de
leur taille mais aussi de leur forme ie suivant leur volume hydrodynamique Ainsi deux
macromoleacutecules de mecircme masse moleacuteculaire mais d‟architecture diffeacuterente pourront ecirctre
distingueacutees En effet une macromoleacutecule peu structureacutee aura un plus grand volume
hydrodynamique qu‟une macromoleacutecule de mecircme masse moleacuteculaire mais de structure tregraves
globulaire Par conseacutequent la premiegravere sera plus rapidement eacutelueacutee que la seconde bien que
les deux masses soient identiques
Une eacutetude reacutecente a montreacute qu‟il eacutetait possible de caracteacuteriser des macroassemblages de
tregraves grande taille jusqu‟agrave plusieurs millions de daltons par chromatographie d‟exclusion
steacuterique (49)
27
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface
La reacutesonance plasmonique de surface (laquo Surface Plasmon Resonance raquo SPR) est un
pheacutenomegravene physique baseacute sur les proprieacuteteacutes de la lumiegravere Lorsquun faisceau de lumiegravere
polariseacutee monochromatique illumine une surface placeacutee entre deux milieux dindice de
reacutefraction diffeacuterent une partie du rayon incident est reacutefleacutechie tandis que lautre partie est
reacutefracteacutee agrave travers la surface Selon langle dincidence du rayon toute la lumiegravere peut ecirctre
reacutefleacutechie Lorsquil ny a pas de reacutefraction ie sous les conditions de reacuteflexion interne totale
une des composantes eacutelectromagneacutetiques de la lumiegravere londe eacutevanescente se propage
perpendiculairement agrave la surface sur une distance eacutequivalente agrave sa longueur donde Si une
couche fine de meacutetal riche en eacutelectrons libres est deacuteposeacutee sur cette surface alors ceux-ci
entrent en reacutesonance avec les photons du faisceau incident et creacuteent la reacutesonance plasmonique
de surface Une conseacutequence eacutenergeacutetique de cette reacutesonance est visible dans le faisceau
reacutefleacutechi qui preacutesente une chute dintensiteacute agrave un angle deacutefini Cet angle pour lequel on observe
une intensiteacute minimale est langle de reacutesonance Il varie en fonction de lindice de reacutefraction
du milieu dans lequel londe eacutevanescente se propage
Depuis sa deacutecouverte par Wood en 1902 (50-51) la reacutesonance plasmonique de surface est
principalement utiliseacutee comme senseur ie comme deacutetecteur placeacute agrave la source mecircme du
pheacutenomegravene eacutetudieacute capable de deacuteceler des modifications au niveau moleacuteculaire L‟application
de cette technique pour le controcircle des interactions biomoleacuteculaires a eacuteteacute deacutemontreacutee pour la
premiegravere fois en 1983 (52) La reacutesonance plasmonique de surface permet de mettre en
eacutevidence la formation d‟une liaison entre un ligand et un reacutecepteur adsorbeacute agrave la surface
meacutetallique par mesure de la variation de lindice de reacutefraction (Fig I 5) Lanalyte est mis au
contact de la surface meacutetallique greffeacutee Les changements induits par lassociation ou la
dissociation des complexes modifient la reacutefringence du milieu et deacutecalent la position de
langle de reacutesonance Lenregistrement de la variation de langle de reacutesonance permet de suivre
en temps reacuteel la fixation des moleacutecules injecteacutees Cette technique permet donc d‟obtenir des
donneacutees cineacutetiques sur des interactions mettant en jeu deux ou plusieurs partenaires (53)
28
Fig I 5 Scheacutema du principe de la reacutesonance plasmonique de surface utiliseacute par la technologie
Biacore TM pour l‟analyse des interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans marquage
Dans un tel systegraveme les deux milieux d‟indices de reacutefraction diffeacuterents sont la solution dans
laquelle se trouvent les moleacutecules agrave analyser et le verre d‟une lame qui sert de senseur Le
film conducteur agrave l‟interface des deux est un tregraves fin film d‟or agrave la surface de la lame de verre
La reacutesonance plasmonique de surface permet donc de deacutetecter et de quantifier des
interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans avoir recours au marquage de ces derniegraveres
Par le suivi en temps reacuteel de la formation et de la dissociation des complexes il est possible
de caracteacuteriser minutieusement la force des associations et d‟obtenir les cineacutetiques des
interactions moleacuteculaires La technique ne neacutecessitant pas l‟utilisation de marquage pour la
deacutetection et eacutetant non destructrice les biomoleacutecules qui sont seacutelectivement retenues sur la
surface du capteur peuvent ecirctre par la suite reacutecupeacutereacutees et analyseacutees par spectromeacutetrie de
masse Cette combinaison de technologies offre donc une toute nouvelle gamme
d‟applications telle que l‟identification et la rapide caracteacuterisation de nouvelles interactions
proteacuteineproteacuteine entre une proteacuteine d‟inteacuterecirct et un meacutelange complexe de proteacuteines (54-55)
I1225 Spectromeacutetrie de masse
Bien que les techniques de diffraction des rayons X et de spectroscopie RMN soient les
deux meacutethodes phares pour l‟eacutelucidation structurale des proteacuteines nous avons vu
preacuteceacutedemment qu‟elles preacutesentaient des limites En effet elles sont toutes les deux peu
sensibles et la cristallographie des proteacuteines neacutecessite l‟obtention de cristaux tandis que la
spectroscopie RMN est limiteacutee en gamme de masse Ainsi le choix de ces meacutethodes
29
classiques pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques n‟est pas toujours possible En revanche
l‟apport de la spectromeacutetrie de masse dans ce domaine est en constante progression La
spectromeacutetrie de masse ne permet pas d‟obtenir des informations structurales avec la mecircme
reacutesolution spatiale que les rayons X ou la RMN mais apporte un gain important en termes de
sensibiliteacute et rapiditeacute par rapport aux deux meacutethodes preacuteceacutedentes Il existe plusieurs
approches par spectromeacutetrie de masse permettant d‟obtenir des informations de structure
L‟une d‟entre elles repose sur le pontage covalent de proteacuteines en association suivi d‟une
digestion enzymatique et analyse par spectromeacutetrie de masse Une deuxiegraveme implique des
eacutechanges isotopiques (ou un marquage covalent) permettant soit de deacuteterminer des zones de
flexibiliteacute induites par la liaison d‟un ligand agrave une proteacuteine soit des zones d‟interaction entre
macromoleacutecules au sein d‟un complexe La spectromeacutetrie de masse offre eacutegalement
l‟opportuniteacute de caracteacuteriser des complexes non covalents (proteacuteine-proteacuteine proteacuteine-ligand)
gracircce agrave l‟utilisation de modes d‟ionisation adapteacutes On peut noter pour l‟analyse de
complexes proteacuteiques intacts l‟eacutemergence de spectromegravetres de masse eacutequipeacutes d‟une cellule
de mobiliteacute ionique
Approche par pontage covalent
Les interactions proteacuteine-proteacuteine peuvent donc ecirctre analyseacutees par pontage covalent
(laquo crosslinking raquo) et spectromeacutetrie de masse L‟avantage majeur de cette approche est qu‟elle
permet d‟obtenir agrave la fois des informations sur la composition et sur la structure des
complexes gracircce agrave la grande sensibiliteacute de la spectromeacutetrie de masse Le laquo crosslinking raquo est
une technique qui permet de relier chimiquement les sous-uniteacutes d‟un complexe non covalent
ce qui permet de stabiliser les interactions au sein de l‟eacutedifice macromoleacuteculaire et d‟en
faciliter l‟eacutetude Ceci est reacutealiseacute par des agents pontants ou laquo crosslinkers raquo qui sont des
composeacutes chimiques posseacutedant un groupe reacuteactif agrave leur extreacutemiteacute capable de reacuteagir avec des
fonctions speacutecifiques des proteacuteines ou d‟autres moleacutecules (eg amines primaires
sulfhydryles hellip) Les agents pontants eacutetablissent des liaisons covalentes entre des acides
amineacutes proches dans la structure tertiaire L‟utilisation de laquo crosslinkers raquo de taille diffeacuterente
permet d‟obtenir des contraintes de distance entre les peptides des partenaires proteacuteiques du
complexe L‟analyse des peptides ponteacutes par spectromeacutetrie de masse permet d‟obtenir des
informations sur la topologie initiale du complexe Il existe maintenant une grande varieacuteteacute
d‟agents pontants multifonctionnels (homo- ou heacuteteacuterofonctionnels) disponibles dans le
commerce (wwwpiercenetcom)
30
Fig I 6 Scheacutema de la reacuteaction de pontage covalent entre deux proteacuteines utilisant le DSG
(DiSuccinimidyl Glutarate) reacuteactif homobifonctionnel Il a deux groupes identiques des
esters de NHS agrave chacune de ses extreacutemiteacutes qui reacuteagissent avec les amines primaires des
proteacuteines (extreacutemiteacute N-terminale et chaicircne lateacuterale des lysines) Son bras espaceur long de 77
Aring est constitueacute de cinq atomes
Les groupes reacuteactifs peuvent ecirctre des esters de NHS (N-HydroxySuccinimide) (Fig I 6)
ou des maleacuteimides qui ciblent les thiols des cysteacuteines ou encore des aryl azides qui s‟insegraverent
dans des liaisons C-H ou N-H sous activation UV Les esters de NHS et leurs deacuteriveacutes solubles
sulfonyleacutes sont les plus couramment utiliseacutes malgreacute les reacuteactions secondaires qu‟ils
entraicircnent compliquant l‟analyse des spectres obtenus apregraves digestion enzymatique du
complexe proteacuteique En effet si les amines primaires des lysines (ou des extreacutemiteacutes N-
terminales) sont les cibles majeures des groupements NHS il n‟est pas rare d‟observer des
reacuteactions de pontage impliquant les groupements hydroxyles des tyrosines des seacuterines ou
encore des threacuteonines (56) De plus les esters de NHS conventionnels ont une forte tendance
agrave s‟hydrolyser pendant l‟eacutetape de pontage conduisant agrave des produits de type laquo dead-end raquo
qu‟il est difficile de seacuteparer des autres (57) Par conseacutequence avec la connaissance de toutes
les cibles possibles des laquo crosslinkers raquo l‟eacutelucidation de la structure des complexes proteacuteiques
pourrait ecirctre significativement ameacutelioreacutee due agrave la plus grande fraction d‟espegraveces ponteacutees
identifieacutees
Bien que l‟association pontage covalent et spectromeacutetrie de masse soit devenue un outil
analytique performant pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques elle preacutesente des limites qui
sont (i) la faible intensiteacute dans les spectres de masse des pics correspondant aux peptides
ponteacutes et (ii) la difficulteacute agrave les identifier parmi les autres due au fait qu‟ils sont tregraves
minoritaires dans les meacutelanges obtenus Dans ce contexte le choix d‟un spectromegravetre de
masse alliant excellente reacutesolution et tregraves bonne preacutecision sur la mesure de masse (FT-ICR
orbitrap) est judicieux Il permet d‟une part de bien seacuteparer les diffeacuterents constituants obtenus
31
apregraves la digestion des complexes et d‟autre part d‟utiliser la masse exacte comme critegravere de
seacutelection Des strateacutegies permettant d‟identifier plus facilement les peptides ponteacutes dans le
meacutelange tregraves complexe obtenu apregraves digestion enzymatique ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees
ces derniegraveres anneacutees Elles sont baseacutees sur l‟utilisation d‟agents pontants posseacutedant des
isotopes stables (58) ou inteacutegrant une fonction biotine permettant un enrichissement seacutelectif
des peptides ponteacutes (59) Des agents pontants permettant une identification plus aiseacutee des
peptides ponteacutes en MSMS ont eacutegalement eacuteteacute mis au point ces derniegraveres anneacutees (60-62)
Reacutecemment l‟utilisation de laquo crosslinkers raquo photoactivables a permis de mettre en eacutevidence
des sites d‟interaction diffeacuterents entre trois activateurs de la transcription (Gal4 Gcn4 et
VP16) et le cofacteur MD15 (63) Cette eacutetude montre par ailleurs la compleacutementariteacute des
modes d‟ionisation MALDI et ESI pour retrouver un grand nombre de peptides ponteacutes Dans
un exemple un peu moins reacutecent Rappsilber et al ont proposeacute un modegravele tridimensionnel
pour un complexe du pore nucleacuteaire chez la levure (64)
Approche par marquage
Une deuxiegraveme approche consiste agrave modifier chimiquement la surface du complexe
proteacuteique accessible en solution et agrave identifier les sites de modifications par spectromeacutetrie de
masse Les segments peptidiques impliqueacutes dans des interactions proteacuteine-proteacuteine ne sont
pas accessibles en solution et a priori ne seront pas modifieacutes La comparaison des cartes
d‟accessibiliteacute pour des proteacuteines seules et associeacutees permet de remonter agrave la topologie initiale
du complexe La modification chimique peut ecirctre reacuteversible ou irreacuteversible Les eacutechanges
hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) des amides de la liaison peptidique sont un exemple de
modifications labiles (65-67) La modification chimique des chaicircnes lateacuterales par des reacuteactifs
speacutecifiques tels que l‟aceacutetanhydride le dieacutethylpyrocarbonate ou le phenylglyoxal est quant agrave
elle permanente (67-68) ce qui impose moins de contraintes au niveau de la rapiditeacute de
l‟analyse apregraves modifications La premiegravere strateacutegie qui fait l‟objet de cette thegravese sera deacutecrite
en deacutetails dans la seconde partie de cette introduction
Les radicaux hydroxyles peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutes dans une approche par marquage
covalent Leur formation peut avoir lieu de diffeacuterentes faccedilons ie par chimie Fenton
radiolyse de l‟eau eacutelectrochimie ou photolyse UV du peroxyde d‟hydrogegravene Ces techniques
aboutissent agrave des concentrations en radicaux diffeacuterentes avec des eacutechelles de temps varieacutees
mais en principe les reacuteactions avec les proteacuteines conduisent aux mecircmes produits Les produits
d‟oxydation sont nombreux puisque quatorze acides amineacutes sur vingt peuvent ecirctre modifieacutes
(Cys Met Trp Tyr Phe His Leu Ile Arg Lys Val Ser Gln et Glu) L‟analyse des
32
produits de la reacuteaction et des sites de modification est geacuteneacuteralement reacutealiseacutee par couplage LC-
MSMS apregraves digestion enzymatique La cineacutetique d‟oxydation des diffeacuterents peptides permet
d‟obtenir des informations de structure Elle est eacutetablie agrave partir de la disparition des peptides
non modifieacutes mais eacutegalement agrave partir de l‟apparition des peptides oxydeacutes Si le temps
d‟exposition aux radicaux est court (infeacuterieur agrave quelques centaines de ms) alors la vitesse
d‟oxydation enregistreacutee pour un peptide donneacute deacutependra principalement (i) de la reacuteactiviteacute
intrinsegraveque des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes et (ii) de leur accessibiliteacute au solvant dans
la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (ou du complexe) Ainsi la comparaison des
vitesses d‟oxydation mesureacutees pour deux peptides dont les acides amineacutes modifieacutes sont
identiques permettra d‟obtenir des informations en termes d‟accessibiliteacute relative agrave la surface
de deux reacutegions diffeacuterentes d‟une proteacuteine
L‟avantage majeur des approches par marquage covalent reacuteside dans le fait de pouvoir
analyser les peptides modifieacutes sans prendre de preacutecautions particuliegraveres puisque la
modification n‟est pas labile En revanche la technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium
impose de travailler dans des conditions expeacuterimentales strictes permettant de conserver le
marquage jusqu‟agrave l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Cependant cette derniegravere
approche ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas toujours
le cas avec des approches par marquage covalent En effet une alteacuteration de la structure des
macroassemblages peut ecirctre observeacutee sous l‟effet de l‟oxydation par l‟utilisation de radicaux
hydroxyles (69)
L‟approche par marquage peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour obtenir des informations sur la
dynamique structurelle des proteacuteines et complexes proteacuteiques La caracteacuterisation des
modifications dans des conditions expeacuterimentales diffeacuterentes permet de remonter aux
changements structuraux Ainsi Dumoulin et al ont eacutetudieacute le changement conformationnel
du lysozyme induisant la formation d‟agreacutegats multimeacuteriques (70) Un autre exemple est
l‟eacutetude des changements d‟interaction proteacuteine-proteacuteine lors de la maturation des capsides du
virus HIV-1 (71) Des informations sur les changements conformationnels d‟une proteacuteine lors
de la fixation d‟un ligand ont pu eacutegalement ecirctre obtenues (72-74) Par ailleurs une eacutetude
reacutecente du complexe Arp23 formeacute de sept sous-uniteacutes proteacuteiques a permis de mettre en
eacutevidence finement des modifications de structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave
l‟ATP en utilisant les radicaux hydroxyles (75)
33
Approche par proteacuteolyse meacutenageacutee
Une autre approche consiste agrave reacutealiser une proteacuteolyse meacutenageacutee Les premiers travaux
rapportant l‟eacutetude d‟une empreinte proteacuteique par proteacuteolyse meacutenageacutee datent de 1987 et sont
directement inspireacutes des travaux de laquo DNA footprint raquo (76) Le principe ici consiste agrave tester
l‟accessibiliteacute agrave diffeacuterentes proteacuteases des proteacuteines eacutetudieacutees Un profil proteacuteolytique diffeacuterent
peut traduire des surfaces accessibles qui ne sont pas identiques ou un masquage par une
moleacutecule de ligand Associeacutee agrave la spectromeacutetrie de masse la proteacuteolyse meacutenageacutee est ainsi
devenue un outil puissant dont l‟une des applications premiegraveres a eacuteteacute l‟identification preacutecise
d‟eacutepitopes agrave partir de complexes antigegravene-anticorps immobiliseacutes (77) Depuis cette technique
est largement utiliseacutee pour des eacutetudes de dynamique structurelle (78) d‟interaction proteacuteine-
ligand (79-82) de diffeacuterences conformationnelles lieacutees agrave des mutations (83-84) ou pour
l‟eacutelucidation de domaines structuraux (85-87)
Les enzymes classiquement utiliseacutees sont la trypsine qui clive apregraves les acides amineacutes
basiques tels que les reacutesidus lysine et arginine et la proteacutease V8 qui coupe speacutecifiquement
apregraves les reacutesidus acide aspartique et acide glutamique Elles ont eacuteteacute choisies
preacutefeacuterentiellement en raison de la haute freacutequence de ces reacutesidus dans les proteacuteines et de la
compleacutementariteacute des profils proteacuteolytiques obtenus Par ailleurs la proteacuteolyse doit ecirctre la plus
limiteacutee possible afin de ne pas deacutestructurer la proteacuteine conduisant agrave d‟autres sites de coupure
non repreacutesentatifs de la structure tertiaire La reacutesolution de cette meacutethode est cependant
modeste C‟est la raison pour laquelle la proteacuteolyse meacutenageacutee est tregraves souvent coupleacutee avec des
approches par eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium afin d‟obtenir des reacutesultats compleacutementaires
(88-89)
Analyse de complexes non covalents
L‟avegravenement des techniques d‟ionisation douces telles que l‟ESI (laquo ElectroSpray
Ionisation raquo) (90) et le MALDI (laquo Matrix Assisted Laser DesorptionIonisation raquo) (91) a
ouvert agrave la spectromeacutetrie de masse un nouveau champ d‟application celui de l‟analyse de
macromoleacutecules biologiques intactes (92) Pour le deacuteveloppement de ces meacutethodes qui ont
ces derniegraveres anneacutees largement participeacute agrave l‟essor de la spectromeacutetrie de masse dans le cadre
des analyses proteacuteomiques J Fenn et K Tanaka ont eacuteteacute reacutecompenseacutes en 2002 par
l‟attribution du prix Nobel de chimie
34
Par comparaison aux diffeacuterentes techniques utiliseacutees pour la caracteacuterisation des proteacuteines
la spectromeacutetrie de masse apporte plusieurs avantages Tout d‟abord elle est tregraves sensible En
effet quelques picomoles voire mecircme attomoles de peptides suffisent agrave obtenir un signal Par
ailleurs la spectromeacutetrie de masse est caracteacuteriseacutee par sa grande preacutecision en masse Elle est
ainsi capable de deacuteterminer des masses moleacuteculaires agrave moins d‟une partie par million (ppm)
pour les instruments les plus preacutecis alors que la technique de SDS-PAGE (laquo Sodium Dodecyl
Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis raquo) donne des erreurs de l‟ordre de 20 Enfin la
spectromeacutetrie de masse est une meacutethode d‟analyse rapide A titre de comparaison un spectre
de masse est enregistreacute en quelques secondes agrave minutes tandis qu‟une expeacuterience de SDS-
PAGE dure plusieurs heures
Dans le cadre de l‟eacutetude des complexes proteacuteiques la spectromeacutetrie de masse est
susceptible de fournir d‟une part des informations preacutecises sur la stœchiomeacutetrie des
macroassemblages et d‟autre part des donneacutees structurales en combinaison avec du
marquage
Une des questions souvent poseacutees aux spectromeacutetristes de masse concerne la possibiliteacute de
reacutealiser une mesure de masse directe d‟un complexe proteacuteique intact dans le but d‟obtenir des
informations sur la stœchiomeacutetrie de l‟interaction Il convient de noter que la mesure de
masse est alors effectueacutee sur le complexe en phase gazeuse alors que pour le biologiste
l‟interaction d‟inteacuterecirct est celle qui a lieu en solution Dans ces conditions une interaction non
covalente preacutesente en solution peut ne pas ecirctre deacutetecteacutee en phase gazeuse C‟est le cas par
exemple des interactions hydrophobes Des eacutetudes ont ainsi montreacute l‟impossibiliteacute de
corroborer les reacutesultats obtenus en phase gazeuse et en solution pour ce type d‟interaction (93-
94) A l‟inverse des interactions principalement eacutelectrostatiques seront renforceacutees en phase
gazeuse et un complexe mecircme peu stable en solution peut ecirctre deacutetecteacute facilement par
spectromeacutetrie de masse Compte tenu de ces eacuteleacutements il nest pas toujours facile de relier des
stabiliteacutes en phase gazeuse eacutetudieacutees par exemple en modifiant la tension agrave l‟interface aux
stabiliteacutes en solution Dans certains cas le problegraveme est encore plus complexe puisque le
type d‟interaction en phase gazeuse peut ecirctre diffeacuterent de celui en solution L‟exemple retenu
est celui des complexes entre des cyclodextrines et des acides amineacutes aromatiques (95) en
solution l‟interaction est principalement de type hydrophobe entre le groupe aromatique et la
caviteacute de la cyclodextrine alors qu‟en phase gazeuse il s‟agit d‟une interaction ion-dipocircle agrave
l‟exteacuterieur de la caviteacute Ceci implique la formation en phase gazeuse de complexes
inexistants en solution donnant ainsi naissance agrave des faux positifs
35
Malgreacute ces contraintes quelques revues reacutecentes de la litteacuterature montrent l‟inteacuterecirct de la
spectromeacutetrie de masse pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers (96-99) Actuellement il est mecircme possible de mesurer des masses
moleacuteculaires de l‟ordre de plusieurs millions de daltons Parmi les plus importantes jamais
atteintes il a celles des heacutemocyanines de 22 MDa de crabes abyssaux (100) du ribosome de
Thermus thermophilus de 233 MDa (98) des assemblages viraux des capsides du virus de
l‟heacutepatite B de 3 et 4 MDa (101) et du complexe multiproteacuteique de l‟ureacutease de Helicobacter
pylori agrave 426 MDa (98)
La technique d‟ionisation de reacutefeacuterence pour analyser les complexes proteacuteiques est
l‟eacutelectrospray (ou sa variante le nano eacutelectrospray) Dans des cas particuliers il est mecircme
possible de les eacutetudier par MALDI (102) bien que cette meacutethode ne soit probablement pas
geacuteneacuteralisable agrave tous les systegravemes Quelques techniques eacutemergentes pour l‟analyse
d‟assemblages macromoleacuteculaires ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees reacutecemment ou sont en cours de
deacuteveloppement comme la mobiliteacute ionique (SMI) (103) l‟laquo ElectroSonic Spray Ionization raquo
(ESSI) (104) ou le laquo Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption raquo (LILBID) (105) Le
processus d‟ionisation doit ecirctre reacutealiseacute en conditions non deacutenaturantes (pH controcircleacute) pour
conserver les complexes proteacuteiques dans leur conformation active Il faut donc choisir un
tampon (nature des sels) qui soit compatible agrave la fois avec la meacutethode d‟ionisation employeacutee
et le maintien de l‟inteacutegriteacute des complexes biologiques Dans le cas de l‟eacutelectrospray des sels
volatils comme l‟aceacutetate d‟ammonium (AcNH4) sont preacutefeacuterentiellement utiliseacutes Neacuteanmoins
lors de la preacuteparation des eacutechantillons une eacutetape de dessalage (par centrifugation gel
filtration hellip) est indispensable En ce qui concerne l‟analyseur du spectromegravetre de masse le
choix est porteacute sur les temps de vol (laquo Time of Flight raquo ToF et laquo Quadrupole Time of
Flight raquo Q-ToF) qui permettent d‟analyser des ions avec des rapports masse sur charge
eacuteleveacutes proprieacuteteacute inteacuteressante pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers Une optimisation des paramegravetres instrumentaux est preacutealablement requise
pour controcircler l‟eacutenergie communiqueacutee aux ions dans l‟interface du spectromegravetre de masse
Pour les complexes proteacuteiques qui restent intacts apregraves leur ionisation en phase gazeuse la
spectromeacutetrie de masse est ainsi devenue un outil tregraves puissant pour obtenir des informations
sur leur masse moleacuteculaire et donc pour deacuteterminer leur stœchiomeacutetrie
36
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment la spectromeacutetrie de masse est souvent combineacutee agrave une
autre technique pour obtenir des informations de structure On peut dans ce contexte citer les
derniers deacuteveloppements dans le domaine de la mobiliteacute ionique qui permet de seacuteparer
diffeacuterents complexes proteacuteiques en fonction de leur structure en phase gazeuse Le principe de
la Spectromeacutetrie de Mobiliteacute Ionique (SMI) est illustreacute dans la Fig I 7 L‟utilisation en
routine de la SMI a eacuteteacute rendue possible par la commercialisation par Waters de spectromegravetres
de masse eacutequipeacutes d‟une cellule de mobiliteacute ionique
Fig I 7 Scheacutema du principe de la meacutethode de spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique (SMI)
coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse (SM) Les ions produits par la source eacutelectrospray (ES)
sont introduits dans la cellule de laquo drift raquo dans laquelle regravegne un champ eacutelectrique E Le
frottement avec les moleacutecules d‟heacutelium contenues dans la cellule eacutetant plus important avec
des ions de conformation deacuteplieacutee ceux-ci arriveront plus tard au deacutetecteur Ici les ions sont
seacutelectionneacutes en masse par un quadripocircle apregraves la cellule de drift
La mobiliteacute ionique est l‟eacutequivalent en phase gazeuse de la mobiliteacute eacutelectrophoreacutetique les
ions sont agrave la fois acceacuteleacutereacutes dans le champ eacutelectrique et freineacutes par les nombreuses collisions
avec le gaz-tampon (heacutelium) Il s‟eacutetablit donc un reacutegime stationnaire les ions atteignent une
vitesse de translation constante La mobiliteacute ionique correspond au rapport entre la vitesse de
laquo drift raquo et le champ eacutelectrique appliqueacute Plus l‟ion a une conformation compacte moins sa
section efficace est grande et moins il est freineacute par des collisions donc plus sa vitesse est
eacuteleveacutee Il arrivera plus rapidement au deacutetecteur par rapport agrave un ion de conformation plus
deacuteployeacutee Un ion laquo funnel raquo ou un piegravege agrave ions quadripolaire est placeacute en amont de la cellule
de laquo drift raquo afin de focaliser les ions en paquets agrave envoyer agrave un temps zeacutero et ainsi pour
pouvoir mesurer la distribution des temps d‟arriveacutee (laquo Arrival Time Distribution raquo ou ATD)
Les premiers instruments de SMI ont eacuteteacute conccedilus par quelques groupes pionniers en la
matiegravere (Bowers (106-107) Jarrold (108) et Clemmerb (109) pour les biomoleacutecules) La
socieacuteteacute Waters (Milford Etats-Unis wwwwaterscom) a reacutecemment commercialiseacute le
systegraveme Synapttrade High Definition MS qui inclut une cellule de mobiliteacute de type laquo travelling
37
wave raquo (champ eacutelectrique oscillant entre les anneaux successifs d‟un tunnel agrave ions) entre un
filtre quadripolaire et un analyseur agrave temps de vol
L‟analyse des complexes proteacuteiques par SMIMS permet non seulement d‟obtenir des
informations sur leur taille mais eacutegalement des donneacutees de topologie (110) L‟agencement des
proteacuteines au sein des complexes peut ecirctre sondeacute suivant deux approches diffeacuterentes La
premiegravere consiste agrave dissocier le complexe en phase gazeuse les proteacuteines se trouvant agrave la
peacuteripheacuterie se deacutetachent theacuteoriquement en premier Neacuteanmoins il est difficile de fragmenter en
phase gazeuse des complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire Par ailleurs l‟activation
neacutecessaire agrave la dissociation conduit agrave une augmentation des sections efficaces de collision et
donc agrave une perturbation partielle de la conformation native des proteacuteines du complexe Il est
alors possible que les proteacuteines qui se seacuteparent du complexe en premier ne soient pas celles
qui ont initialement les surfaces d‟interaction les plus petites avec les autres partenaires
proteacuteiques (111) Neacuteanmoins l‟utilisation reacutecente de la dissociation sur surface par le groupe
de V Wysocki pour dissocier ces complexes en maintenant les structures des sous-uniteacutes
semble ouvrir des perspectives nouvelles et prometteuses dans le domaine (112) L‟autre
approche consiste agrave deacutenaturer progressivement le complexe en solution et agrave analyser les
diffeacuterents sous-complexes par SMI pour reconstruire la topologie initiale L‟avantage majeur
de cette approche est que les sous-complexes sont formeacutes en solution et reflegravetent donc de
maniegravere plus fidegravele la composition du complexe dans son eacutetat natif Le laboratoire de Carol
Robinson en Angleterre est devenu ces derniegraveres anneacutees leader pour l‟analyse structurale par
SMI de ces complexes proteacuteiques de tregraves grande taille (113)
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique
Ces meacutethodes permettent de travailler sur l‟objet biologique lui-mecircme Parmi elles le
TAP-Tag (laquo Tandem Affinity Purification-Tag raquo) et le double hybride occupent une place de
choix pour l‟eacutetude des interactions proteacuteine-proteacuteine Il s‟agit de deux techniques in-situ
La meacutethode du TAP-Tag permet d‟isoler le complexe proteacuteique eacutetudieacute qui est dans sa
conformation native par deux eacutetapes de purification successives (Fig I 8) La premiegravere
utilise une colonne constitueacutee de billes greffeacutees avec des immunoglobulines G (IgG) qui ont
une forte affiniteacute pour la proteacuteine A proteacuteine recombinante dite appacirct agrave laquelle est fixeacute le
complexe proteacuteique Le complexe retenu sur cette colonne est ensuite eacutelueacute speacutecifiquement par
38
coupure avec la proteacutease TEV Puis il est appliqueacute sur la seconde colonne constitueacutee de billes
de calmoduline En preacutesence d‟ions calcium la calmoduline est sous sa forme active
favorisant l‟attachement du complexe L‟eacutelution est reacutealiseacutee par l‟ajout d‟un cheacutelateur de
calcium (EGTA) qui rend la calmoduline inactive et donc libegravere le complexe Finalement ce
dernier pourra ecirctre analyseacute par spectromeacutetrie de masse afin de deacuteterminer ses diffeacuterents
constituants ou bien ecirctre utiliseacute pour des eacutetudes fonctionnelles
Fig I 8 Scheacutema du principe de la technique du TAP-Tag
Cette meacutethode a eacuteteacute appliqueacutee agrave l‟analyse agrave haut deacutebit du proteacuteome de la levure
Saccharomyces cerevisiae (114-116) Son utilisation chez les eucaryotes supeacuterieurs reste plus
complexe mais tout de mecircme envisageable (117) Des ameacuteliorations de l‟approche TAP-
TagMS ont eacuteteacute apporteacutees pour la possibiliteacute d‟utiliser cette meacutethode agrave haut deacutebit chez les
eucaryotes supeacuterieurs (118)
La technique du double hybride permet quant agrave elle de mettre en eacutevidence une interaction
physique entre deux proteacuteines X et Y Le principe est le suivant par geacutenie geacuteneacutetique deux
proteacuteines de fusion sont syntheacutetiseacutees puis exprimeacutees dans la levure La premiegravere est constitueacutee
de la proteacuteine X agrave laquelle est fusionneacute le domaine de liaison agrave l‟ADN (DL) d‟un facteur de
transcription tandis que la seconde est formeacutee de la proteacuteine Y et du domaine d‟activation de
39
la transcription (DA) de ce mecircme facteur Les deux domaines ont eacuteteacute dissocieacutes et le gegravene
rapporteur de la β-galactosidase est sous le controcircle de la seacutequence ougrave vient se fixer
speacutecifiquement le DL La β-galactosidase est une enzyme qui transforme un substrat soluble
et incolore en un composeacute bleu insoluble Lorsque la proteacuteine Y interagit avec la proteacuteine X
le DA est de nouveau associeacute au DL permettant alors la transcription du gegravene rapporteur Les
clones capables d‟utiliser le galactose preacutesent dans le milieu peuvent donc ecirctre seacutelectionneacutes
(colonies bleues) En effet le changement de couleur teacutemoigne de l‟interaction entre les deux
proteacuteines
Ce systegraveme a eacuteteacute agrave l‟origine mis au point pour tester l‟interaction pouvant exister entre
deux proteacuteines connues (119) De nouvelles variantes de la meacutethode double hybride ont fait
leur apparition reacutecemment permettant la deacutetection des proteacuteines impliqueacutees dans des
interactions avec l‟ADN (laquo one-hybrid system raquo) l‟ARN (laquo RNA-based three-hybrid
system raquo) de petits ligands (laquo small molecule-based threehybrid system raquo) et des proteacuteines
ayant subi des modifications post-traductionnelles (laquo tribrid system raquo) (120)
Il existe eacutegalement des techniques de seacuteparation des complexes proteacuteiques en conditions
non deacutenaturantes pour conserver intactes les interactions Ainsi l‟eacutelectrophoregravese sur gel de
polyacrylamide en condition bleue native ou BN-PAGE (laquo Blue Native-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis raquo) permet d‟isoler les macro-assemblages dans leur conformation native en
fonction de leur taille et de leur forme En combinaison avec une seconde dimension de
seacuteparation sur gel cette fois-ci en conditions deacutenaturantes les proteacuteines d‟un mecircme complexe
peuvent agrave leur tour ecirctre isoleacutees puis identifieacutees par spectromeacutetrie de masse Il est donc
possible par cette technique de mettre en eacutevidence le nombre et la masse moleacuteculaire des
proteacuteines impliqueacutees dans le complexe
Cette technique peut ecirctre utiliseacutee pour l‟isolation de complexes proteacuteiques membranaires
ou pour les complexes proteacuteiques extraits de cellules entiegraveres Un grand nombre
d‟applications pour cette technique concerne l‟analyse de complexes proteacuteiques issus de
plantes (121)
40
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la
spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique
structurelle des proteacuteines en solution
La technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) en solution s‟est reacuteveacuteleacutee tregraves
performante pour l‟eacutetude de la conformation et de la dynamique structurelle des proteacuteines La
spectroscopie RMN agrave deux dimensions a longtemps eacuteteacute choisie comme meacutethode d‟analyse de
ces eacutechanges isotopiques (32 122-123) L‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse comme
meacutethode alternative d‟analyse apregraves eacutechanges HD s‟est deacuteveloppeacutee ces derniegraveres anneacutees La
spectromeacutetrie de masse qui permet de s‟inteacuteresser agrave des complexes proteacuteiques de tregraves haut
poids moleacuteculaire ouvre ainsi de nouvelles opportuniteacutes pour l‟eacutetude de systegravemes proteacuteiques
plus importants (gtgt 50 kDa) Par ailleurs en raison de sa meilleure sensibiliteacute cette technique
requiert une quantiteacute initiale de mateacuteriel beaucoup moins importante (de l‟ordre de quelques
dizaines de nganalyse) Elle permet eacutegalement de deacutetecter la coexistence de diffeacuterents
conformegraveres proteacuteiques en solution (124)
Les premiers travaux combinant les eacutechanges HD et la spectromeacutetrie de masse datent de
1991 Ils portent alors sur l‟analyse de proteacuteines entiegraveres (125) Depuis les avantages de la
spectromeacutetrie de masse ont permis aux eacutechanges isotopiques HD d‟eacutetudier des proteacuteines
individuelles de poids moleacuteculaires plus importants (126) des proteacuteines s‟associant pour
former des polymegraveres de haut poids moleacuteculaire (127) des particules virales (71 128) ainsi
que des complexes proteacuteine-ligand (129) ou proteacuteine-proteacuteine (130) De plus l‟association
HDXMS semble prometteuse pour l‟analyse structurale de proteacuteines membranaires connues
pour ecirctre difficilement eacutetudiables par beaucoup d‟autres techniques (131-133)
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux
proteacuteines en solution
I211 Quel type drsquohydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX
Les hydrogegravenes lieacutes agrave des heacuteteacuteroatomes dans les moleacutecules biologiques telles que les
proteacuteines sont labiles Autrement dit les atomes d‟hydrogegravene appartenant aux groupements
O-H N-H et S-H peuvent s‟eacutechanger avec ceux des moleacutecules d‟eau environnantes Il s‟agit
des hydrogegravenes des proteacuteines qui sont repreacutesenteacutes en bleu et en rouge sur la Fig I 9
41
Fig I 9 Scheacutema des diffeacuterents types d‟hydrogegravene dans une proteacuteine
Si un atome d‟hydrogegravene est eacutechangeacute avec un autre atome d‟hydrogegravene alors il est eacutevident
que ce remplacement ne sera pas deacutetecteacute par spectromeacutetrie de masse En revanche
l‟exposition d‟une proteacuteine agrave de l‟eau lourde (D2O ou 2H2O) conduit agrave des remplacements
d‟hydrogegravenes (1H) par des deuteacuteriums (
2H) qui accroissent la masse totale de la proteacuteine de 1
Da par hydrogegravene eacutechangeacute Lorsque les eacutechanges isotopiques se reacutealisent dans le sens deacutecrit
preacuteceacutedemment ie 1H
2H alors on utilise l‟expression laquo exchange-in raquo Mais les eacutechanges
isotopiques peuvent ecirctre reacutealiseacutes dans les deux directions On emploie alors le terme de
laquo exchange-out raquo pour eacutevoquer les eacutechanges qui s‟opegraverent dans le sens 2H
1H quand une
proteacuteine complegravetement deuteacutereacutee est incubeacutee dans de l‟eau leacutegegravere et que des deuteacuteriums sont
alors remplaceacutes par des hydrogegravenes (134) Les eacutetudes d‟eacutechange HD sont principalement
reacutealiseacutees suivant le principe laquo exchange-in raquo En effet ce dernier ne neacutecessite pas d‟eacutetape
suppleacutementaire qui consisterait agrave deuteacuterer complegravetement les proteacuteines avant le deacutebut des
expeacuteriences HDXMS C‟est la strateacutegie que nous avons adopteacutee pour notre eacutetude structurale
de complexes proteacuteiques
Si on considegravere maintenant les hydrogegravenes qui sont lieacutes de maniegravere covalente agrave un atome
de carbone dans les proteacuteines dessineacutes en vert sur la Fig I 9 ces derniers ne subiront pas
d‟eacutechange isotopique dans nos conditions expeacuterimentales Seule une catalyse chimique
importante serait agrave envisager pour proceacuteder agrave l‟eacutechange isotopique de ces hydrogegravenes Mais il
semblerait qu‟il soit possible d‟eacutechanger l‟hydrogegravene de la liaison C(ε1)-H du groupement
imidazole de la chaicircne lateacuterale de lhistidine (Fig I 10) (135)
42
Fig I 10 Scheacutema de l‟acide amineacute histidine
Parmi les hydrogegravenes eacutechangeables des proteacuteines il y a
- ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (en bleu sur la Fig I 9) et des extreacutemiteacutes N-
et C-terminales (groupements amino et carboxy) qui ont des vitesses d‟eacutechange isotopique
tregraves rapides de l‟ordre de la milliseconde agrave la seconde Dans l‟eacutechelle de temps de nos
expeacuterimentations ces vitesses d‟eacutechange sont trop rapides pour que nous puissions les
observer
- les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques (en rouge sur la Fig I 9) qui ont des
vitesses d‟eacutechange isotopique plus lentes de l‟ordre de la minute agrave l‟heure et donc qui sont
compatibles avec une deacutetection par spectromeacutetrie de masse Au cours de nos expeacuteriences
HDXMS nous allons par conseacutequent nous inteacuteresser aux eacutechanges isotopiques de ces
hydrogegravenes
Dans une proteacuteine tous les acides amineacutes agrave l‟exception de la proline et du premier reacutesidu
de la chaicircne polypeptidique possegravedent un groupement amide N-H de liaison Il est par
conseacutequent possible d‟obtenir des informations structurales tout le long de la chaicircne
polypeptidique
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de lrsquoaccessibiliteacute
des proteacuteines
La vitesse des eacutechanges isotopiques HD deacutepend de l‟accessibiliteacute au solvant mais
eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale des proteacuteines Autrement dit les hydrogegravenes
d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine tels que les boucles
et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses d‟eacutechange plus
rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au contraire
43
ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices α et les
feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent plus
lentement car ils sont proteacutegeacutes (136)
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les
proteacuteines et peptides
I2131 Deacutefinition du facteur chimique
Il vient d‟ecirctre dit que l‟eacutechange isotopique est plus rapide quand l‟hydrogegravene d‟amide de la
liaison peptidique est complegravetement exposeacute au solvant et non impliqueacute dans des liaisons
hydrogegravene intramoleacuteculaires stables Dans ces conditions la constante de vitesse du
remplacement de N-H par N-D (laquo exchange-in raquo) est noteacutee kch Il s‟agit du facteur chimique
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique
Pour chaque hydrogegravene d‟amide du squelette polypeptidique consideacutereacute individuellement la
valeur de kch est deacutetermineacutee selon une seacuterie de facteurs le pH la tempeacuterature et la
composition du solvant la pression la force ionique du milieu et la seacutequence locale en acides
amineacutes Nous deacutetaillerons uniquement l‟influence des trois facteurs les plus repreacutesentatifs
soit le pH (ou pD en solution deuteacutereacutee) la tempeacuterature et la seacutequence locale
Les eacutechanges isotopiques HD sont fortement deacutependants du pH ce qui est un point
extrecircmement important qui est utiliseacute pour leur analyse par spectromeacutetrie de masse La
reacuteaction peut s‟effectuer par des meacutecanismes de catalyse acide ou basique (II133) Le
facteur chimique kch s‟exprime comme suit
kch = kD3O+ [D3O+] + kOD
- [OD-] + kD2O
ougrave kD3O+ et kOD- sont les constantes d‟eacutechange en catalyse acide et en catalyse basique
respectivement
Des eacutetudes sur des peptides modegraveles des polyalanines ont montreacute que kOH- est supeacuterieure
d‟un facteur 108 agrave kH3O+ (137) Le pH influence donc les vitesses d‟eacutechange qui sont
44
principalement conditionneacutees par les ions OH- pour des pH supeacuterieurs agrave 3 et par les ions H3O
+
pour des pH infeacuterieurs agrave 3
Ainsi la constante de vitesse d‟eacutechange kch peut ecirctre relieacutee au pD (Fig I 11) Le minimum
d‟eacutechange se produit pour un pD voisin de 2-3 pour lequel les eacutechanges dus agrave la catalyse
acide sont eacutequivalents agrave ceux dus agrave la catalyse basique (pDmin)
pH
T(degC)
Fig I 11 Scheacutema repreacutesentant le taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium en fonction du pH
La plupart des hydrogegravenes eacutechangeables des chaicircnes lateacuterales ont des pHmin plus grands
que ceux des hydrogegravenes d‟amide Ainsi lorsque le pH est ajusteacute agrave 25 pour minimiser
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse les hydrogegravenes
des chaicircnes lateacuterales continuent de s‟eacutechanger par catalyse acide agrave l‟exception des Hε et Hη de
l‟arginine
Les vitesses d‟eacutechange HD sont eacutegalement deacutependantes de la tempeacuterature Elles sont
multiplieacutees par trois pour chaque increacutement de 10degC (138) Ainsi lorsque l‟on veut minimiser
les eacutechanges une diminution de la tempeacuterature de 20degC agrave 0degC conduit agrave une diminution de la
vitesse d‟eacutechange d‟un facteur 10 ce qui n‟est pas neacutegligeable
Le facteur chimique kch est principalement affecteacute par des changements de tempeacuterature En
effet la constante d‟ionisation de l‟eau varie avec la tempeacuterature alteacuterant les concentrations
de catalyseurs disponibles pour l‟eacutechange Par ailleurs agrave basse tempeacuterature les coefficients de
diffusion sont eacutegalement modifieacutes et la probabiliteacute de collision entre le donneur de proton et
45
le receveur diminue conduisant agrave un nombre de transfert (et donc un taux d‟eacutechange) moins
grand Le facteur chimique kch s‟exprime donc plutocirct comme suit
kch (t) = kD3O+ (t) [D3O+] + kOD
- (t) [OD-] + kD2O (t)
Les expeacuteriences d‟eacutechange HD s‟effectuent agrave pD physiologique pendant des temps
d‟incubation dans D2O variables et agrave une tempeacuterature adapteacutee agrave la proteacuteine d‟inteacuterecirct Pour ne
garder que les deuteacuteriums eacutechangeacutes avec les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques et
donc pour s‟affranchir de ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes la proteacuteine est remise
dans de l‟eau leacutegegravere (H2O) avant analyse Les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales sont alors
rapidement reacute-eacutechangeacutes en hydrogegravenes Mais cette eacutetape doit ecirctre controcircleacutee afin de ne pas reacute-
eacutechanger eacutegalement les deuteacuteriums d‟amide en hydrogegravenes Ainsi pour diminuer au
maximum les vitesses d‟eacutechange la reacuteaction d‟eacutechange est arrecircteacutee en ajoutant de l‟eau (H2O)
agrave pH acide (25) et en diminuant brusquement la tempeacuterature de l‟eacutechantillon (0degC) C‟est
cette approche de deacutemarquage dans H2O des chaicircnes lateacuterales avant analyse que nous avons
choisie pour ma thegravese D‟autres approches peuvent neacuteanmoins ecirctre envisageacutees comme le
marquage de la proteacuteine suivie de l‟analyse de tous les deuteacuteriums (139) Dans ce dernier cas
il ny a pas d‟eacutetape de deacutemarquage
Enfin les vitesses d‟eacutechanges des hydrogegravenes d‟amide dans une proteacuteine ou dans un
peptide sont sensibles aux effets de blocage steacuterique ou inductif lieacutes agrave la preacutesence proche de
certaines chaicircnes lateacuterales (138 140) Les effets inductifs sont dus principalement agrave la
preacutesence de groupements voisins attracteurs d‟eacutelectrons (chaicircnes lateacuterales polaires) qui vont
augmenter l‟aciditeacute des protons d‟amide en diminuant le pK favorisant la deacuteprotonation
Dans le cas d‟une catalyse basique la vitesse d‟eacutechange est donc augmenteacutee Les effets
d‟encombrement steacuterique sont quant agrave eux lieacutes agrave la preacutesence de reacutesidus aliphatiques
(isoleucine par exemple) ou aromatiques Les chaicircnes lateacuterales de ces amides amineacutes bloquent
steacuteriquement l‟interaction entre le catalyseur et le squelette polypeptidique ralentissant
l‟eacutechange
L‟additiviteacute de ces deux pheacutenomegravenes a eacuteteacute eacutetudieacutee en deacutetails et a permis d‟eacutetablir une
eacutequation pour kch tenant compte de facteurs correctifs associeacutes agrave la nature des chaicircnes lateacuterales
des acides amineacutes voisins (agrave droite et agrave gauche du reacutesidu d‟inteacuterecirct) pour une catalyse acide A
ou basique B
46
kch (t) = kD3O+ (t) (Agauche x Adroite) [D3O+] + kOD
- (t) (Bgauche x Bdroite) [OD-]
+ kD2O (t) (Bgauche x Bdroite)
I2133 Catalyse de la reacuteaction
Les eacutechanges peuvent se produire soit par catalyse basique soit par catalyse acide (Fig I
12) Dans les conditions physiologiques dans lesquelles les proteacuteines et les peptides se
trouvent geacuteneacuteralement la catalyse basique est la plus freacutequente
Fig I 12 Catalyse basique ou acide permettant lrsquoeacutechange isotopique drsquoun hydrogegravene drsquoamide
sur le squelette polypeptidique
La premiegravere eacutetape en catalyse basique est l‟abstraction d‟un proton amidique par un ion
hydroxyde (OD-) et formation d‟un anion imidate Cet imidate est ensuite reprotoneacute par D2O
pour proceacuteder agrave l‟eacutechange Nous venons de voir preacuteceacutedemment que le facteur chimique kch est
minimal pour un pDasymp25 Au-delagrave d‟un pD eacutegal agrave 4 il augmente d‟un ordre de grandeur
(facteur 10) avec chaque uniteacute de pD atteignant des valeurs de l‟ordre de 103 s
-1 pour un pD
de 9 (141) (Fig I 11) La possibiliteacute de reacutegler kch en controcirclant la basiciteacute du solvant est
cruciale dans beaucoup de strateacutegies HDXMS
I2134 Cineacutetique drsquoeacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de
protection
Comme la vitesse d‟eacutechange N-H N-D est moduleacutee par les proprieacuteteacutes
conformationnelles des proteacuteines il devient alors possible d‟utiliser la technique des eacutechanges
isotopiques HD pour les eacutetudes structurales Les reacutegions structureacutees possegravedent une multitude
de liaisons hydrogegravenes intramoleacuteculaires N-Hhellip
O=C qui sont autant de sites proteacutegeacutes
difficilement accessibles par les moleacutecules de solvant Les vitesses d‟eacutechange isotopique vont
47
donc varier consideacuterablement selon l‟implication de l‟hydrogegravene concerneacute dans des structures
secondaires stables (142) ou la flexibiliteacute de la reacutegion peptidique agrave laquelle il appartient (141)
ou encore suivant sa distance par rapport agrave la surface de la proteacuteine (143) Ces diffeacuterents
facteurs contribuent agrave la protection des hydrogegravenes d‟amide telle que la constante de vitesse
globale d‟eacutechange kHDX soit bien infeacuterieure agrave kch Le facteur de protection P correspondant est
donneacute par la formule qui suit
P= kchkHDX
ougrave kHDX est la constante de vitesse globale d‟eacutechange d‟un hydrogegravene d‟amide donneacute dans la
conformation native d‟une proteacuteine et kch la constante de vitesse d‟eacutechange de l‟hydrogegravene
concerneacute si celui-ci se trouvait dans un peptide non structureacute P est la probabiliteacute que
l‟hydrogegravene en question soit proteacutegeacute agrave l‟accegraves du solvant (et aux catalyseurs) P est alors
deacutependant de l‟accessibiliteacute au solvant et de la participation de l‟hydrogegravene concerneacute agrave des
liaisons hydrogegravene Le facteur de protection peut exceacuteder parfois la valeur de 106 pour une
proteacuteine dans sa conformation native replieacutee
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique drsquoeacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines
Neacuteanmoins mecircme un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute peut ecirctre eacutechangeacute En effet une proteacuteine
en solution est une moleacutecule dynamique Autrement dit mecircme dans son eacutetat natif replieacute elle
peut subir des fluctuations conformationnelles reacutesultant de son deacutepliement pendant un temps
tregraves court L‟eacutechange isotopique d‟un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute ne peut donc avoir lieu que
lorsque la proteacuteine adopte des d‟eacutetats intermeacutediaires transitoires deacuteplieacutes Ce deacutepliement peut
ecirctre localiseacute ou impliquer la proteacuteine dans sa globaliteacute Les constantes de vitesse du
deacutepliement et du repliement sont deacutesigneacutees par k1 et k-1 respectivement et le meacutecanisme
geacuteneacuteral de l‟eacutechange peut ecirctre deacutecrit comme suit
avec l‟existence d‟une combinaison unique de valeurs de k1 k-1 et pour chaque hydrogegravene
d‟amide En accord avec ce modegravele l‟eacutechange isotopique ne peut avoir lieu qu‟apregraves une
rupture transitoire des liaisons intramoleacuteculaires de la proteacuteine replieacutee rendant les hydrogegravenes
48
d‟amide eacutechangeables Puis la proteacuteine se replie pour revenir agrave un eacutetat natif La constante de
vitesse globale d‟eacutechange kHDX est donneacutee par la formule suivante
Deux modegraveles de cineacutetique EX1 et EX2 (123 144) sont discuteacutes agrave partir de ce meacutecanisme
d‟eacutechange Le premier modegravele (EX1) (Fig I 13) est caracteacuteriseacute par
kch gtgt k-1gt k1
impliquant que tous les hydrogegravenes d‟amide sont eacutechangeacutes avant le repliement de la proteacuteine
au cours du tout premier eacuteveacutenement de deacutepliement L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc
le deacutepliement de la proteacuteine ce qui se traduit par
kHDX= k1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 13 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX1
Inversement le second modegravele (EX2) (Fig I 14) est caracteacuteriseacute par
k-1 gtgt kchgtgt k1
menant agrave l‟expression
kHDX= K1kch
ougrave K1=k1k-1 est le constante d‟eacutequilibre de deacutepliement de la proteacuteine native Comme la
proteacuteine se replie plus vite qu‟elle n‟eacutechange la probabiliteacute d‟eacutechange pendant un seul
49
eacuteveacutenement deacutepliementrepliement est faible L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc la
vitesse d‟eacutechange kch et l‟eacutechange d‟un hydrogegravene a geacuteneacuteralement lieu apregraves un grand nombre
d‟eacutetapes de deacutepliementrepliement Dans ce modegravele le facteur de protection est donneacute par
P= K1-1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 14 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX2
Dans des conditions physiologiques le premier modegravele (EX1) est moins freacutequent que le
second (EX2) Les vitesses d‟eacutechange par le meacutecanisme EX2 deacutependent de maniegravere lineacuteaire
de la concentration en catalyseurs alors que dans le meacutecanisme EX1 la vitesse ne varie pas
avec la quantiteacute de catalyseurs Ce dernier est geacuteneacuteralement forceacute par l‟utilisation de
conditions deacutenaturantes telles que des tempeacuteratures ou un pH eacuteleveacutes ou encore par
l‟utilisation de chaotropes On peut neacuteanmoins rencontrer le cas de proteacuteines pour lesquelles
diffeacuterentes reacutegions s‟eacutechangent simultaneacutement avec des cineacutetiques d‟ordre 1 (modegravele EX1) et
2 (modegravele EX2) Par ailleurs il ne faut pas perdre de vue que mecircme une proteacuteine native peut
preacutesenter des hydrogegravenes d‟amide non proteacutegeacutes de faccedilon permanente ie exposeacutes au solvant
et non impliqueacutes dans des liaisons hydrogegravene L‟eacutechange agrave ces sites est reacutealiseacute sans
deacutepliement de la proteacuteine la vitesse y est alors plus rapide (kHDXasympkch)
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines
Pour mesurer un taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans une proteacuteine en condition
laquo exchange-in raquo la premiegravere eacutetape consiste agrave l‟exposer agrave du deuteacuterium Il existe deux grandes
strateacutegies d‟incorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines L‟exposition aux deuteacuteriums
peut ecirctre reacutealiseacutee de maniegravere continue (marquage continu) ou pulseacutee (marquage pulseacute) La
meacutethode sera choisie en fonction du type d‟information que l‟on souhaite obtenir (145)
50
I221 Marquage continu
Il s‟agit de la meacutethode la plus simple utiliseacutee dans la plupart des eacutetudes HDXMS Elle
consiste agrave diluer d‟un facteur quinze agrave vingt une proteacuteine qui se trouve initialement dans son
tampon hydrogeacuteneacute dans un tampon identique mais contenant 100 de D2O (146)
L‟incorporation des deuteacuteriums est alors suivie en fonction du temps d‟exposition de la
proteacuteine en condition native dans le D2O Une dilution d‟au moins un facteur quinze permet
de s‟assurer qu‟une fois qu‟un hydrogegravene est remplaceacute par un deuteacuterium la reacuteaction ne
revient pas en arriegravere
Le marquage continu est alors poursuivi jusqu‟agrave ce que le temps maximum d‟exposition
aux deuteacuteriums choisi initialement soit atteint Typiquement il varie des minutes aux heures
(parfois mecircme aux jours) En pratique des aliquotes de la solution sont preacuteleveacutes
reacuteguliegraverement leur reacuteaction est brusquement arrecircteacutee et l‟analyse se fait par spectromeacutetrie de
masse
Au cours de l‟eacutechange la masse de la proteacuteine augmente progressivement avec
l‟incorporation en deuteacuteriums selon les paramegravetres de cineacutetique deacutecrits preacuteceacutedemment Les
reacutegions preacutesentant une conformation deacuteplieacutee pendant un temps tregraves long subiront des
eacutechanges plus rapides que d‟autres reacutegions ayant une conformation plus compacte D‟apregraves le
meacutecanisme geacuteneacuteral de l‟eacutechange le marquage continu permet d‟obtenir essentiellement des
informations sur la dynamique conformationnelle des proteacuteines dans des conditions
d‟eacutequilibre plutocirct que sur leur structure agrave proprement parler Cependant il existe un lien
eacutevident entre ces deux aspects En effet des reacutegions hautement structureacutees sont geacuteneacuteralement
moins dynamiques que des reacutegions deacutesordonneacutees
I222 Marquage pulseacute
Le marquage pulseacute est quant agrave lui essentiellement utiliseacute pour eacutetudier les meacutecanismes de
repliement des proteacuteines ainsi que pour deacutetecter et caracteacuteriser des eacutetats intermeacutediaires
transitoires (147)
Dans les expeacuteriences de marquage pulseacute une proteacuteine initialement deacutenatureacutee est
rapidement transfeacutereacutee dans un solvant approprieacute permettant le deacuteclenchement du processus de
51
repliement A des temps bien deacutefinis au cours de la reacuteaction la proteacuteine est ensuite exposeacutee agrave
du deuteacuterium pendant un temps tregraves court (typiquement 10 s ou moins) Comme le temps de
marquage est tregraves court seuls les hydrogegravenes d‟amide accessibles et eacutechangeables facilement
(ceux qui sont dans les parties non structureacutees de la proteacuteine ou dans les parties les plus
accessibles au solvant) sont deuteacutereacutes Des seacuteries de mesures sont effectueacutees en faisant varier
l‟intervalle de temps entre l‟initiation du repliement et le pulse de deuteacuterium De cette faccedilon
il est possible d‟obtenir des aperccedilus deacutetailleacutes de la seacutequence temporelle des eacuteveacutenements qui
conduisent la proteacuteine d‟un eacutetat deacuteplieacute agrave sa conformation native Les pulses de deuteacuterium
requiegraverent des conditions basiques (pD 8-10) pour s‟assurer qu‟un grand nombre d‟eacutechanges
isotopiques se produisent pendant l‟eacutetape courte de marquage La reacuteaction de marquage est
arrecircteacutee par une rapide baisse du pH et de la tempeacuterature (agrave pH 25 et agrave 0degC) de la solution ou
par l‟eacutevaporation du solvant pendant le processus d‟ionisation par eacutelectrospray lors
d‟expeacuteriences laquo on-line raquo HDXMS L‟usage d‟un systegraveme automatiseacute est neacutecessaire pour
reacutealiser des pulses sur des temps tregraves courts (lt 10 ms) et acceacuteder ainsi agrave des dynamiques tregraves
rapides
La deacutenaturation preacutealable de la proteacuteine est effectueacutee par l‟addition d‟un agent qui va
perturber sa structure (148) Ces agents sont geacuteneacuteralement des chaotropes mais peuvent
eacutegalement ecirctre des ligands qui vont venir se fixer sur la proteacuteine ou un simple changement de
tempeacuterature ou de pH
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par
spectromeacutetrie de masse
Les eacutechanges HD en solution sont donc devenus ces derniegraveres deacutecennies un outil
technique puissant pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines (149) Alors que la
plupart des eacutetudes HDX initiales utilisaient la RMN agrave haute reacutesolution (32) comme meacutethode
pour le suivi des cineacutetiques d‟eacutechange HD la spectromeacutetrie de masse occupe deacutesormais une
place de choix (150-153)
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN
C‟est le deacuteveloppement de meacutethodes de spectroscopie RMN multidimensionnelle de haute
reacutesolution (154-155) qui a permis d‟exploiter toute la puissance de la technique HDX (156)
52
La RMN est resteacutee pendant longtemps l‟outil de choix pour suivre les eacutechanges HD car de
ces deux isotopes seul l‟hydrogegravene conduit agrave un signal deacutetectable Ainsi remplacer des
hydrogegravenes d‟amide par des deuteacuteriums peut ecirctre facilement suivi en observant la disparition
des signaux correspondant dans les spectres RMN L‟analyse des eacutechanges HD par RMN
devient alors facile une fois que tous les signaux ont eacuteteacute attribueacutes Par ailleurs elle est reacutealiseacutee
en solution dans la continuiteacute du marquage rendant son interpreacutetation aiseacutee Un profil de
deuteacuteration en solution est observeacute en solution n‟engendrant pas de problegravemes quelconques
L‟eacutechange d‟un hydrogegravene par un deuteacuterium conduisant agrave un increacutement de masse de 1 Da
peut eacutegalement ecirctre suivi de maniegravere tregraves simple par spectromeacutetrie de masse Cette technique
plus reacutecente offre par ailleurs plusieurs avantages importants par rapport agrave la RMN Elle
permet des analyses plus rapides sur des systegravemes plus complexes tant par la diversiteacute que par
la taille avec moins de mateacuteriel initialement Neacuteanmoins l‟association HDXMS n‟atteint que
rarement la haute reacutesolution spatiale facilement accessible par la technique HDXRMN La
spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) est reacutecemment apparue comme une solution agrave ce
problegraveme faisant de la technique HDX-MSMS un candidat potentiel pour devenir une
meacutethode de choix pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo
Comme il a eacuteteacute dit preacuteceacutedemment la strateacutegie du marquage continu est choisie pour la
plupart des eacutetudes en HDXMS Elle consiste agrave suivre le taux de deuteacuteration des proteacuteines en
fonction de leur temps d‟exposition t agrave D2O pour deacutetecter le plus souvent des diffeacuterences en
reacuteponse agrave des modifications chimiques ou expeacuterimentales (157-158) agrave la liaison de ligands
(159-160) ou encore agrave la formation de complexes (161) L‟incorporation des deuteacuteriums peut
ecirctre mesureacutee au niveau de la proteacuteine entiegravere (eacutechange global) etou pour des courts segments
proteacuteiques (eacutechange local) Seulement la mesure de l‟eacutechange global ne preacutesente aucune
reacutesolution spatiale puisque elle est reacutealiseacutee pour l‟ensemble des hydrogegravenes d‟amide de la
proteacuteine Les expeacuteriences spatialement reacutesolues apportent quant agrave elles des informations sur
le comportement vis-agrave-vis de la deuteacuteration de reacutegions speacutecifiques de la proteacuteine
53
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS
Les expeacuteriences spatialement reacutesolues deacuterivent pour la plupart de l‟approche classique de
fragmentation enzymatique en solution (146 162-163) appeleacutee approche laquo bottom-up raquo La
digestion des proteacuteines par des proteacuteases conduisant agrave des fragments peptidiques pour
lesquels le taux d‟eacutechange peut ecirctre calculeacute a permis une premiegravere ameacutelioration de la
reacutesolution de l‟approche (164-166) La digestion proteacuteolytique a ensuite eacuteteacute associeacutee agrave une
seacuteparation chromatographique en phase liquide coupleacutee en ligne agrave la spectromeacutetrie de masse
(LC-MS) (141 167) Dans le cadre de l‟analyse des eacutechanges HD par LC-MS des meacutethodes
chromatographiques de courte dureacutee et agrave basse tempeacuterature doivent ecirctre impeacuterativement mises
au point afin de minimiser le laquo back-exchange raquo (168-169) Pour reacutealiser une analyse rapide
des colonnes courtes sont utiliseacutees Bien qu‟elles ne permettent qu‟une seacuteparation grossiegravere
des peptides elles limitent neacuteanmoins le deacutemarquage L‟utilisation de la spectromeacutetrie de
masse agrave tregraves haute reacutesolution est importante car elle peut permettre une identification plus
fiable des peptides sur la base de leur masse preacutecise L‟approche classique est dutiliser une
seacuteparation par HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo) et de placer toute la
chaicircne chromatographique dans une armoire reacutefrigeacutereacutee Notons quun systegraveme commercial
optimiseacute pour limiter leacutechange inverse a eacuteteacute deacuteveloppeacute reacutecemment par la socieacuteteacute Waters Le
choix d‟une meacutethode HPLC et non d‟une chaicircne de nano-chromatographie liquide conduit agrave
utiliser une quantiteacute importante d‟eacutechantillon C‟est la raison pour laquelle notre eacutequipe a mis
au point une approche par nano-LC pour l‟eacutetude des eacutechanges HD en solution Ce travail a
fait lobjet dune partie de la thegravese de Magalie Duchateau au laboratoire Les diffeacuterents
systegravemes d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse seront plus
deacutetailleacutes dans le Chap IV Le plus souvent les peptides sont analyseacutes en utilisant
l‟eacutelectrospray comme mode d‟ionisation (LCESI-MS) La technique MALDI-MS est moins
communeacutement utiliseacutee (170-172)
Choix des enzymes
Bien eacutevidemment la proteacuteolyse doit ecirctre reacutealiseacutee dans les conditions expeacuterimentales de
l‟arrecirct de la reacuteaction (agrave pH final 25 et agrave 0degC) afin d‟empecirccher l‟eacutechange inverse (D H)
avant l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Il est par conseacutequent neacutecessaire d‟utiliser
des proteacuteases acides L‟enzyme la plus couramment utiliseacutee pour ce type d‟expeacuteriences est la
pepsine (173) Cette enzyme est non speacutecifique contrairement agrave la trypsine ou la
chymotrypsine mais elle est active dans les conditions expeacuterimentales requises et peut geacuteneacuterer
de nombreux peptides chevauchants permettant de localiser des zones d‟inteacuterecirct avec une
54
meilleure reacutesolution Cependant cette faible speacutecificiteacute (174) rend neacutecessaire une eacutetape
preacutealable aux eacutechanges HD d‟identification des peptides obtenus par spectromeacutetrie de masse
en tandem
La reacutesolution spatiale attendue avec l‟approche de digestion enzymatique agrave la pepsine est
de l‟ordre de 5 agrave 10 acides amineacutes Elle est limiteacutee par la taille des fragments geacuteneacutereacutes par
l‟eacutetape de digestion et le nombre de peptides chevauchants En revanche l‟utilisation de
proteacuteases immobiliseacutees sur des colonnes semble permettre d‟une part de standardiser le
protocole HDXMS et d‟autre part dans certains cas d‟atteindre une reacutesolution spatiale
proche de l‟acide amineacute pregraves (175-176) Notons le deacuteveloppement reacutecent d‟une nouvelle
approche baseacutee sur une digestion agrave la pepsine mais utilisant des conditions de haute pression
(177) semblant encore ameacuteliorer les reacutesultats
D‟autres proteacuteases acides peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutees mais les conditions
expeacuterimentales imposent qu‟elles soient capables de digeacuterer leur substrat en moins de cinq
minutes afin de minimiser l‟eacutechange inverse L‟utilisation combineacutee de diffeacuterentes proteacuteases
permet de geacuteneacuterer un grand nombre de peptides chevauchants et ainsi d‟augmenter
consideacuterablement la reacutesolution spatiale (178) La proteacutease de type XIII d‟Aspergillus saitoi
(179) ainsi que celle de type XVIII extraite des diffeacuterentes espegraveces de Rhizopus (178) ou
encore plus reacutecemment la plasmepsine II de Plasmodium falciparum (180) peuvent ecirctre
utiliseacutees dans les eacutetudes HDXMS (172 179 181-182) Par ailleurs une version recombinante
de la proteacutease de type XVIII vient d‟ecirctre mise au point Elle permettrait l‟utilisation d‟un
rapport enzymeproteacuteine beaucoup plus faible qu‟avec la version sauvage (183)
Une meacutethode permettant de geacuteneacuterer un tregraves grand nombre de peptides chevauchants baseacutee
sur l‟utilisation de deux proteacuteases acides et de les identifier efficacement et preacuteciseacutement a
reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee pour les analyses HDXMS (184-185) La difficulteacute de lanalyse
du fait de la grande quantiteacute de donneacutees geacuteneacutereacutees par la proteacuteolyse (nombreux peptides
chevauchants) combineacutee agrave la complexiteacute des informations obtenues par HDX (incorporation
des deuteacuteriums perte du marquage) a encourageacute le deacuteveloppement d‟une plateforme ougrave les
expeacuteriences et le traitement de donneacutees sont totalement automatiseacutes (186)
Problegraveme de leacutechange inverse
Malgreacute une optimisation des conditions expeacuterimentales (diminution du pH et de la
tempeacuterature de l‟eacutechantillon ainsi que du temps d‟analyse) le pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse
55
reste un problegraveme crucial lors des eacutetapes de digestion proteacuteolytique et d‟analyse des
fragments peptidiques En effet chaque clivage enzymatique conduit agrave une perte
d‟information au niveau de deux sites eacutechangeables Les sites concerneacutes sont l‟hydrogegravene
d‟amide du squelette peptidique qui a eacuteteacute cliveacute et converti en amine libre et celui adjacent agrave
l‟extreacutemiteacute N-terminale (168) Par ailleurs le deacutemarquage peut eacutegalement avoir lieu au cours
de l‟eacutetape de digestion Or la perte totale de la deuteacuteration au niveau de sites particuliers tels
que ceux proteacutegeacutes par une interaction proteacuteine-partenaire signifierait que les surfaces
d‟interaction de macroassemblages ne pourraient pas ecirctre deacutetermineacutees par cette approche
C‟est la raison pour laquelle plusieurs tentatives de correction systeacutematique du laquo back-
exchange raquo ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees (187) Une meacutethode de reacuteajustement a ainsi eacuteteacute deacutecrite par
Zhang et al (141) Briegravevement elle consiste agrave mesurer le taux d‟eacutechange de peptides
complegravetement deuteacutereacutes et agrave le comparer agrave la reacutefeacuterence sans eacutechange Les analyses sont
reacutealiseacutees dans les mecircmes conditions de digestion et de seacuteparation par HPLC Le facteur de
correction du laquo back-exchange raquo relative agrave l‟expeacuterience est alors deacutetermineacute Mais cela
implique que le deacutemarquage soit identique pour tous les sites eacutechangeables ce qui n‟est pas le
cas (I2132) Le taux d‟eacutechange inverse est consideacuterablement diffeacuterent d‟un site agrave un autre
site et donc d‟un peptide agrave un autre peptide Il peut neacuteanmoins ecirctre preacutedit pour des peptides
non structureacutes en utilisant les paramegravetres de calcul de kch suivant la formule donneacutee au
I2132 (188)
Exemples de complexes proteacuteiques analyseacutes
Malgreacute les problegravemes poseacutes par l‟eacutechange inverse et la reacutesolution relativement faible de
l‟approche un des avantages majeurs des approches laquo bottom-up raquo est leur utilisation pour
l‟eacutetude de complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire puisque ce sont des peptides issus d‟une
digestion enzymatique qui sont analyseacutes Ainsi cette approche a eacuteteacute utiliseacutee par l‟eacutequipe de
V Wysocki afin d‟eacutetudier des complexes proteacuteiques proteacuteine chaperonne-substrat et ainsi de
mieux comprendre leur meacutecanisme d‟action (I113) (189) Il s‟agit de proteacuteines s‟associant
pour former des oligomegraveres de tregraves haut poids moleacuteculaire Les complexes qui ont eacuteteacute
analyseacutes par la technique HDXMS coupleacutee agrave une approche laquo bottom-up raquo sont les suivants
TaHsp169-MDH (gt 1000 kDa) et PsHsp181-MDH (~600-700 kDa) Un pourcentage de
couverture peptidique de 100 a eacuteteacute obtenu pour les deux proteacuteines Par ailleurs une eacutetude
du complexe Arp23 avait permis de mettre en eacutevidence finement des modifications de
structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave l‟ATP ou agrave des proteacuteines activatrices telles
que les proteacuteines WASp en utilisant l‟approche par marquage avec les radicaux hydroxyles
(75) (I1225) Plus reacutecemment le complexe Arp23 a eacuteteacute analyseacute par une approche
56
compleacutementaire HDXMS afin de mettre en eacutevidence des modifications de structure et de
dynamique reacutesultant de l‟activation par les proteacuteines WASp et de comparer les reacutesultats avec
les modegraveles du meacutecanisme preacuteexistants Pour autant que nous sachions le complexe Arp23
de sept sous-uniteacutes proteacuteiques avec un poids moleacuteculaire de 220 kDa est le plus important
macroassemblage jamais eacutetudieacute par HDXMS Ceci a eacuteteacute possible gracircce agrave une analyse par
laquo bottom-up raquo (190)
Comment ameacuteliorer la reacutesolution
Une faccedilon d‟augmenter la reacutesolution des approches bottom-up serait de recourir agrave la
fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques afin de localiser plus preacuteciseacutement
les deuteacuteriums dans la seacutequence D‟une maniegravere geacuteneacuterale la fragmentation peut ecirctre reacutealiseacutee
de diffeacuterentes maniegraveres dans un spectromegravetre de masse Tout d‟abord il est possible de
fragmenter les ions dans la source (laquo In-Source Decay raquo ou ISD) en les acceacuteleacuterant dans une
reacutegion de haute pression mais ce processus ne conduit agrave aucune seacutelectiviteacute et pose donc des
problegravemes quant agrave l‟analyse des meacutelanges La spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS)
peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour la dissociation des peptides Elle est adapteacutee agrave l‟eacutetude des
meacutelanges apporte des informations structurales de qualiteacute et est doteacutee d‟une grande
sensibiliteacute Elle consiste agrave seacutelectionner un ion preacutecurseur par un premier analyseur agrave le
fragmenter (par diffeacuterentes techniques d‟activation) et agrave analyser les fragments obtenus agrave
l‟aide d‟un autre analyseur (le mecircme pour les instruments de type trappe ionique)
Neacuteanmoins comme cela sera deacutetailleacute dans le paragraphe suivant le choix de la technique
d‟activation pour des peptides deuteacutereacutes est tregraves important pour obtenir des informations
valables
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques
L‟objectif des expeacuteriences de MSMS sur les peptides deuteacutereacutes est de pouvoir preacuteciseacutement
localiser les deuteacuteriums incorporeacutes dans la seacutequence au niveau des diffeacuterents hydrogegravenes
d‟amide afin d‟obtenir une reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves En theacuteorie la spectromeacutetrie de
masse en tandem constitue donc un moyen inteacuteressant et simple pour ameacuteliorer la reacutesolution
des approches HDXMS
Il existe diffeacuterents modes d‟activation susceptibles d‟ecirctre utiliseacutes pour fragmenter les
peptides Dans une approche proteacuteomique classique la meacutethode de dissociation induite par
57
collision (CID) est largement preacutefeacutereacutee Le principe consiste agrave fragmenter la moleacutecule par
collision avec un gaz inerte (heacutelium diazote argon ou xeacutenon) Malheureusement dans le
cadre d‟eacutetudes HDXMS ces meacutethodes conventionnelles de fragmentation par activation
collisionnelle de proteacuteines et peptides protoneacutes ont rapidement eacuteteacute eacutecarteacutees En effet bien que
la litteacuterature soit contradictoire il a eacuteteacute montreacute qu‟elles conduisent tregraves souvent agrave une
redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums partielle ou totale le long de la chaicircne polypeptidique
(y compris au niveau des chaicircnes lateacuterales) (191-194) pendant l‟eacutetape de fragmentation Le
processus de migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes en phase gazeuse est appeleacute
laquo scrambling raquo en anglais
En fait ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo peut se produire agrave diffeacuterents endroits du
spectromegravetre de masse Le premier est lors de la deacutesolvatation des ions encore solvateacutes dans la
source dans les toutes premiegraveres eacutetapes preacuteceacutedant leur transmission vers l‟analyseur (195-
196) Une autre possibiliteacute est donc dans la cellule de collision au moment de la
fragmentation Le laquo scrambling raquo est induit par un apport d‟eacutenergie vibrationnelle conduisant
agrave un eacutechange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums avant la dissociation Il est clair que le
meacutecanisme de fragmentation des peptides protoneacutes dit meacutecanisme du proton mobile
proposeacute par Simon Gaskell (197) et Vicky Wysocki (198-200) n‟est pas en faveur d‟une
conservation de la position des deuteacuteriums d‟amide avant la fragmentation En effet ce
meacutecanisme (Fig I 15) fait l‟hypothegravese que preacutealablement agrave la fragmentation un proton
migre des sites les plus basiques de la moleacutecule vers un azote d‟amide eacutevegravenement preacutealable agrave
une cyclisation pour former des ions b et y Cette eacutetape eacutetant a priori reacuteversible les
deuteacuteriums peuvent ecirctre meacutelangeacutes avec des hydrogegravenes agrave ce moment lagrave
HN
NHO
R1
R2
OR3
R1
O
N
O
R2
H+
HN
NH2O
R1
R2
OR3
H3N Nter+
+
Nter
Cter Cter
R3
NH2
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
NH
R3
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
H3N
R3
Cter
+
ion b ion y
Proton
Mobile
Attaque
Nucleacuteophile
Reacutearrangement
Fig I 15 Formation des ions b et y (201)
58
Le laquo scrambling raquo conduit donc agrave une perte d‟information au niveau du profil de
deuteacuteration rendant l‟analyse difficilement interpreacutetable La litteacuterature indique que ce
pheacutenomegravene semble deacutependre de la seacutequence du peptide fragmenteacute (202) mais eacutegalement de
l‟eacutenergie de collision apporteacutee et de la flexibiliteacute de la chaicircne polypeptidique en phase
gazeuse (195 203) Ces deux derniers facteurs joueraient un rocircle deacuteterminant dans le
reacutearrangement aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes le long du squelette peptidique
avant la dissociation Une faible eacutenergie de collision et donc une lente activation des ions en
phase gazeuse seraient favorables agrave une migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes En
revanche la reacuteduction de la flexibiliteacute des ions proteacuteiques pourrait diminuer la mobiliteacute du
proton dans des conditions d‟activation collisionnelle de basse eacutenergie Le pheacutenomegravene du
laquo scrambling raquo a pu ecirctre mis en eacutevidence par l‟utilisation de peptides modegraveles (204-206) Le
principe des peptides seacutelectivement deuteacutereacutes deacuteveloppeacutes par T Jorgensen sera deacutetailleacute dans
le Chap II
La conclusion des eacutetudes de fragmentation par CID de peptides deuteacutereacutes est que les
meacutethodes d‟activation conduisant agrave une augmentation progressive de l‟eacutenergie vibrationnelle
(CID IRMPD SORI-CID) (195) ne peuvent pas ecirctre utiliseacutees pour localiser les deuteacuteriums
dans la seacutequence peptidique De ce fait d‟autres meacutethodes de fragmentation en phase gazeuse
ont eacuteteacute investigueacutees Parmi elles les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons telles que l‟ECD
et l‟ETD se sont reacuteveacuteleacutees tregraves prometteuses (207-209)
L‟ECD est une technique de dissociation speacutecifique des spectromegravetres de masse FT-ICR
Son principe repose sur la capture exothermique (~4-5 eV) d‟un eacutelectron par une espegravece
multichargeacutee (210) L‟ion proteacuteique multichargeacute est irradieacute par un faisceau d‟eacutelectrons de
faible eacutenergie (lt 1 eV) Apregraves capture d‟un eacutelectron l‟ion radicalaire se fragmente La
reacuteactiviteacute est diffeacuterente par rapport aux meacutethodes par activation collisionnelle en raison de la
preacutesence d‟un eacutelectron dans le systegraveme et notamment le meacutecanisme du proton mobile n‟est
pas celui qui explique la fragmentation rendant son utilisation possible pour analyser des
peptides ou des proteacuteines deuteacutereacutes (139 207 211-212) En ECD on n‟observe pas la rupture
des liaisons peptidiques (pour conduire agrave des ions b et y) ni geacuteneacuteralement la perte de
modifications post-traductionnelles labiles comme ce qui est observeacute pour l‟activation par
CID Le site de clivage quasi-speacutecifique en ECD est la liaison N-Cα entraicircnant la formation
d‟ions fragments de type c et z le plus souvent mais aussi parfois a b et y (Fig I 16) Une
charge positive eacutetant neutraliseacutee par un eacutelectron la technique d‟ECD ne peut ecirctre utiliseacutee que
sur des ions preacutecurseurs qui sont au minimum deux fois chargeacutes (doublement protoneacutes)
59
Fig I 16 Nomenclature des fragments peptidiques issus de la spectromeacutetrie de masse en
tandem
L‟ETD qui a reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee est une technique similaire agrave l‟ECD conduisant
eacutegalement agrave la formation d‟ions fragments de type c et z (213) La fragmentation repose sur
la reacuteaction ionion qui se produit entre le peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire Cet
anion se trouve seacutequestreacute dans un piegravege agrave ions Quand les deux ions se trouvent agrave une distance
suffisante il se produit le transfert d‟un eacutelectron de l‟anion vers le peptide chargeacute
positivement ce qui induit sa fragmentation L‟avantage majeur de l‟ETD est qu‟il peut ecirctre
reacutealiseacute sur une varieacuteteacute de types d‟instruments standards utilisant la radiofreacutequence d‟un champ
eacutelectrique oscillant pour pieacuteger les ions (213-215) L‟ECD quant agrave lui neacutecessite des champs
eacutelectrique et magneacutetique stables disponibles exclusivement sur des spectromegravetres de masse
FT-ICR (207 216)
Bien que le meacutecanisme des techniques ECD et ETD ne soit pas encore complegravetement
eacutelucideacute il passe par une voie alternative de fragmentation de type radicalaire dont on a pu
discuter du caractegravere ergodique ou non (217) n‟induisant pas de laquo scrambling raquo pourvu que
les paramegravetres instrumentaux soient controcircleacutes et optimiseacutes pour la minimisation du
pheacutenomegravene Il s‟agit d‟une part de minimiser les paramegravetres des optiques de transfert ionique
tels que le potentiel de deacutesolvatation des ions et la tension des lentilles du tube de transfert et
d‟autre part de minimiser l‟excitation vibrationnelle des ions pendant leur filtration et avant
leur fragmentation en augmentant le paramegravetre fenecirctre d‟isolation (207) Il a eacuteteacute montreacute que la
fragmentation des ions par ECD se produisait avant que l‟eacutenergie puisse ecirctre redistribueacutee au
niveau du site de clivage de la liaison le plus favorable (210 218-219) Cette rapide et
efficace meacutethode d‟activation conduit donc agrave une limitation du laquo scrambling raquo et permet donc
de localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence peptidique (207) Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves de l‟incorporation des deuteacuteriums a eacutegalement pu ecirctre obtenue par
60
fragmentation ETD au niveau de peptides seacutelectivement marqueacutes (208) ainsi que de peptides
proteacuteolytiques issus de la digestion enzymatique de la β2-microglobuline deuteacutereacutee (209)
L‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu est calculeacutee en faisant la diffeacuterence des contenus en
deuteacuteriums de fragments conseacutecutifs pour les seacuteries d‟ions c (c2-c1 c3-c2 hellip) et z (z2-z1 z3-z2
hellip) Une cineacutetique deacutechange HD par acide amineacute peut eacutegalement ecirctre obtenue en suivant
l‟incorporation des deuteacuteriums des ions c ou z au cours du temps
Cette approche combinant la digestion enzymatique en solution et la fragmentation ETD en
phase gazeuse est devenue tregraves reacutecemment assez robuste pour ecirctre utiliseacutee sur de vrais
systegravemes biologiques Elle a eacuteteacute complegravetement automatiseacutee en plateforme HDX (220)
La spectromeacutetrie de masse en tandem peut donc ecirctre utiliseacutee pour ameacuteliorer la reacutesolution
des expeacuteriences utilisant les eacutechanges HD La fragmentation en phase gazeuse des ions
peptidiques obtenus apregraves digestion enzymatique du systegraveme biologique dinteacuterecirct permet donc
d‟obtenir la localisation preacutecise des deuteacuteriums dans la seacutequence Pour cela elle doit ecirctre
reacutealiseacutee en utilisant des meacutethodes alternatives d‟activation par les eacutelectrons (ECD ETD) tout
en controcirclant les processus de deacutesolvatation transfert et seacutelection des ions preacutealables agrave la
fragmentation (207-208) Ces meacutethodes ayant eacutegalement fait leur preuve pour la
fragmentation de proteacuteines entiegraveres (221-222) il est rapidement apparu qu‟il serait possible de
les utiliser dans des approches dites laquo top-down raquo pour des eacutetudes HDXMS Dans cette
derniegravere approche l‟eacutetape de digestion enzymatique n‟est plus requise
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD
L‟approche laquo top-down raquo s‟affranchit donc de l‟eacutetape de proteacuteolyse et de seacuteparation des
peptides en chromatographie liquide Au lieu de cela la proteacuteine est introduite entiegravere dans le
spectromegravetre de masse et fragmenteacutee directement en phase gazeuse (223)
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD
Il existe plusieurs modes d‟activation pour la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines
entiegraveres Les meacutethodes dissociatives par capture ou transfert deacutelectron (ECD ou ETD) sont
particuliegraverement utiliseacutees dans ce type d‟approche
61
Des couvertures de seacutequence importantes peuvent ecirctre obtenues par ces approches sur
proteacuteines entiegraveres conduisant eacutegalement agrave la localisation de modifications post-
traductionnelles (MPT) (223-225) Le laboratoire pionnier dans le domaine est celui de Neil
Kelleher aux USA qui a deacuteveloppeacute une veacuteritable approche inteacutegreacutee pour lanalyse
proteacuteomique laquo top-down raquo allant de la seacuteparation des proteacuteines entiegraveres agrave lanalyse
automatiseacutee des spectres MSMS complexes obtenus lorsque lon fragmente une proteacuteine
entiegravere Ses proteacuteines de preacutedilection sont les histones petites proteacuteines de 13 kDa que lon
peut retrouver sous un grand nombre disoformes diffeacuterentes (mecircme stucture primaire mais
modifications post-traductionnelles diffeacuterentes et dynamiques) lieacutees au code des histones
Lavantage majeur des approches laquo top-down raquo en proteacuteomique est de permettre non
seulement lidentification des isoformes de proteacuteines par simple mesure de masse mais aussi
dobtenir des informations structurales (preacutesence de MPT notamment) sur lensemble de la
seacutequence Cela nest pas possible par des approches classiques par laquo bottom-up raquo car tous les
peptides issus de la digestion ne sont pas retrouveacutes lors de lanalyse
Neacuteanmoins elles preacutesentent encore certaines limitations comme leacutetape cruciale de
seacuteparation des proteacuteines entiegraveres le poids moleacuteculaire des proteacuteines qui peuvent ecirctre
fragmenteacutees et la sensibiliteacute Le problegraveme majeur rencontreacute avec les proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire est leur propension agrave se replier en phase gazeuse formant un reacuteseau de liaisons
hydrogegravene qui conduit agrave une perte defficaciteacute au niveau de la fragmentation par ECD ou
ETD En effet bien que leacutelectron soit captureacute par un site peptidique et la liaison N-Cα
rompue les deux morceaux de la proteacuteine (parties N-terminales et C-terminales) restent
lieacutees entre elles et les fragments ne peuvent ecirctre deacutetecteacutes Une solution consiste agrave introduire
une eacutetape de chauffage lent des ions (photons infrarouge par exemple) pour rompre ce reacuteseau
de liaisons hydrogegravene avant ou apregraves la capture de leacutelectron Neacuteanmoins si lapproche
fonctionne souvent bien dans le cas de proteacuteines non deuteacutereacutees elle ne peut ecirctre envisageacutee
dans le cadre des eacutetudes HDX car le chauffage lent conduira agrave un eacutechange des hydrogegravenes et
des deuteacuteriums avant la fragmentation
62
I2332 Approches top-down et HDX
Dans les eacutetudes HDX le deacuteveloppement de l‟approche laquo top-down raquo ECD ou ETD comme
meacutethodologie alternative agrave l‟approche classique de laquo bottom-up raquo semble tregraves prometteur En
effet l‟approche laquo top-down raquo permet d‟une part d‟eacuteliminer le laquo back-exchange raquo relatif aux
eacutetapes de digestion enzymatique en solution et de seacuteparation en chromatographie liquide et
d‟autre part d‟obtenir une meilleure reacutesolution spatiale tout au moins pour des proteacuteines de
petite agrave moyenne taille (211)
La faisabiliteacute d‟expeacuteriences HDX par laquo top-down raquo ECD spatialement reacutesolues a eacuteteacute
reacutecemment deacutemontreacutee par Pan et al pour l‟eacutetude d‟une proteacuteine de 17 kDa (211) Il est
eacutegalement possible gracircce agrave cette approche d‟obtenir des informations structurales au niveau
d‟espegraveces speacutecifiques en meacutelange heacuteteacuterogegravene en isolant au preacutealable un ion preacutecurseur (212)
De plus en raison de son association avec des meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons qui
limitent le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo dans des conditions expeacuterimentales bien controcircleacutees
et conduisent agrave de bonnes couvertures de seacutequence elles permettent de localiser preacuteciseacutement
la position des deuteacuteriums dans la seacutequence (Fig I 17)
La meilleure reacutesolution spatiale obtenue par l‟approche laquo top-down raquo s‟explique de la
maniegravere suivante tandis que l‟expeacuterience laquo bottom-up raquo consiste agrave cliver la proteacuteine au
niveau de plusieurs sites geacuteneacuterant des peptides de taille relativement petite l‟eacutetude laquo top-
down raquo quant agrave elle conduit agrave un seul eacuteveacutenement de fragmentation au niveau de chaque
chaicircne polypeptidique Il en reacutesulte la formation d‟une paire d‟ions compleacutementaires cz
dans le cas de la fragmentation ECD ou ETD issus de l‟extreacutemiteacute N- et C-terminale Une
reacutesolution spatiale agrave l‟acide amineacute pregraves peut donc ecirctre obtenue avec l‟approche laquo top-down raquo
car les proteacuteines en phase gazeuse sont cliveacutees une seule fois agrave diffeacuterents sites (Fig I 17)
63
Fig I 17 Scheacutema illustrant la diffeacuterence conceptuelle entre les approches MS de laquo bottom-
up raquo et laquo top-down raquo appliqueacutees aux eacutetudes HDX (226) Lrsquoapproche par fragmentation en
phase gazeuse de la proteacuteine entiegravere dite laquo top-down raquo permet de localiser preacuteciseacutement les
deuteacuteriums dans la seacutequence proteacuteique
Dans le cadre des eacutetudes HDXMS un autre avantage des approches laquo top-down raquo par
rapport agrave celles dites de laquo bottom-up raquo est le fait qu‟il est possible en theacuteorie de reconstruire
une cineacutetique d‟eacutechange par acide amineacute Cela sera deacutetailleacute dans le Chap III de ce manuscrit
Il est eacutegalement avantageux de pouvoir saffranchir des eacutetapes de digestion enzymatique et de
seacuteparation en chromatographie liquide En effet un gain de temps et une possible reacuteduction
du laquo back-exchange raquo sont des eacuteleacutements cruciaux pour ces eacutetudes
64
I2333 Limitations des approches top-down HDX
La limitation majeure de la fragmentation des proteacuteines deuteacutereacutees par ECD reste la taille
des systegravemes comme en analyse laquo top-down raquo classique De tregraves bonnes couvertures de
seacutequence peuvent ecirctre obtenues pour des proteacuteines de faible masse moleacuteculaire (lt 20 kDa)
Au-delagrave de cette valeur l‟efficaciteacute de fragmentation diminue avec le plus souvent une reacutegion
centrale de la proteacuteine peu fragmenteacutee au contraire des extreacutemiteacutes N- et C-terminales en
raison de la structuration des proteacuteines en phase gazeuse deacutecrite preacuteceacutedemment
Un autre problegraveme est d‟arriver agrave maintenir la proteacuteine entiegravere avec ses deuteacuteriums sans
qu‟elle se deacutemarque pendant le temps de l‟analyse En effet pour obtenir des couvertures de
seacutequence importantes un grand nombre de spectres doivent ecirctre accumuleacutes (ideacutealement
pendant trente minutes agrave une heure) et le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine en termes de
position des deuteacuteriums dans la seacutequence est primordial
Enfin le dernier inconveacutenient de ces approches est l‟analyse de proteacuteines reacuteelles qui
demeure compliqueacutee En effet sans seacuteparation par chromatographie liquide un dessalage des
eacutechantillons biologiques reacuteels doit se faire indeacutependamment et preacutealablement agrave lanalyse par
spectromeacutetrie de masse Il est donc effectueacute de maniegravere laquo off-line raquo et conduit
malheureusement agrave un certain deacutemarquage Par ailleurs il doit obligatoirement ecirctre reacutealiseacute agrave
froid ce qui complique le deacuteroulement des expeacuteriences
65
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Chapitre II Analyse de peptides modegraveles
validation de lrsquoapproche combinant
eacutechanges HD et fragmentation ECD
80
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
81
II1 Introduction
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX
Comme indiqueacute dans le chapitre preacuteceacutedent un des problegravemes expeacuterimentaux majeurs lieacute
aux eacutetudes par HDX-MSMS est le laquo scrambling raquo qui correspond agrave une redistribution
aleacuteatoire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums preacutesents dans la seacutequence peptidique par des
processus qui ont lieu en phase gazeuse
Le plus connu est celui qui intervient au moment de la fragmentation par CID et qui
sexplique par le modegravele du proton mobile (1-4) Dans ce modegravele leacutenergie apporteacutee par la
collision conduit agrave une mobiliteacute du proton qui se trouve initialement sur le site le plus basique
du peptide (Lysine Arginine ou amine N-terminale) Ce proton se met donc agrave se deacuteplacer
dans le peptide pour aller vers des sites de protonation moins basiques tels que loxygegravene ou
lazote de la liaison peptidique Bien que la protonation sur lazote de lamide soit
thermodynamiquement moins favorable que la protonation sur l‟oxygegravene des carbonyles cest
ce site protoneacute qui conduit agrave la rupture de la liaison amide et agrave la formation des ions b et y La
protonation reacuteversible des atomes dazote des diffeacuterentes fonctions amides du squelette dans
le contexte dune eacutetude HDX conduit donc si lintermeacutediaire reacuteactionnel a un temps de vie
suffisamment long et si la cineacutetique de la voie retour est comparable agrave la cineacutetique de
fragmentation agrave un eacutechantillonnage du proton sur tous les amides et donc un meacutelange
complet des hydrogegravenes et des deuteacuteriums Pour eacuteviter ce pheacutenomegravene il faut (i) soit que la
protonation sur lamide ne soit pas reacuteversible (ii) soit que la dissociation de la liaison
peptidique soit plus rapide que la deacuteprotonation de lazote damide Paizs et Suhai (5) ont
eacutevalueacute la constante de vitesse de dissociation de la liaison amide par des calculs RRKM et ont
obtenu une valeur de lordre de la microseconde pour des eacutenergies internes denviron 45
kJmol soit une vitesse relativement lente due entre autre agrave la neacutecessaire cyclisation de la
partie b et donc probablement compeacutetitive avec de simples transferts de protons Ainsi de
nombreux exemples de la litteacuterature montrent quil nest pas possible dutiliser des approches
par CID pour localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans des peptides marqueacutes car le
laquo scrambling raquo qui a lieu avant la fragmentation est total (6-11)
Neacuteanmoins il est curieux de constater que certaines eacutetudes arrivent agrave des conclusions
opposeacutees A titre dexemple il a eacuteteacute montreacute par Deng et al pour une seacuterie de peptides issus de
82
la digestion du cytochrome C de cheval (12) ou par Kim et al sur des fragments peptidiques
de thioreacutedoxine oxydeacutee et reacuteduite d‟E coli (13-14) que les ions b preacutesentaient un
laquo scrambling raquo modeacutereacute alors que les ions y correspondants preacutesentaient au contraire un
laquo scrambling raquo total Des reacutesultats similaires deacutecrivant un pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
partiel ont eacutegalement eacuteteacute obtenus sur des proteacuteines entiegraveres (15-17)
Ce qui semble ressortir de ces articles est que les conditions expeacuterimentales utiliseacutees et la
seacutequence des peptides jouent un rocircle tregraves important sur le type de reacutesultat qui est obtenu Dans
ce contexte mieux comprendre les diffeacuterents facteurs affectant le reacutearrangement aleacuteatoire des
hydrogegravenes et des deuteacuteriums dans la seacutequence avant la fragmentation semble un point crucial
pour pouvoir deacutevelopper des approches de spectromeacutetrie de masse tandem robustes en HDX
Neacuteanmoins le problegraveme majeur pour reacutealiser de telles eacutetudes est de disposer dun systegraveme
modegravele permettant de caracteacuteriser la preacutesence du meacutelange entre les hydrogegravenes et les
deuteacuteriums quil soit partiel ou total
Cest le groupe de T Joslashrgensen au Danemark qui a reacutesolu ce problegraveme en mettant au
point des peptides modegraveles qui peuvent ecirctre deuteacutereacutes seacutelectivement sur leur extreacutemiteacute N-
terminale ou C-terminale Lutilisation de ces peptides lui a ainsi permis de montrer (i) quen
controcirclant finement un certain nombre de paramegravetres expeacuterimentaux et (ii) en utilisant des
meacutethodes dactivation baseacutees sur le transfert ou la capture dun eacutelectron (ECDETD) il eacutetait
possible de limiter consideacuterablement le laquo scrambling raquo et localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums
dans la seacutequence (18-19)
II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
Les premiers travaux publieacutes par T Joslashrgensen sont baseacutes sur lutilisation dun peptide qui
peut ecirctre marqueacute au deuteacuterium de maniegravere seacutelective gracircce agrave linteraction dune partie de sa
seacutequence avec un reacutecepteur La partie en interaction avec la proteacuteine eacutetant masqueacutee ne
conduit agrave aucun eacutechange HD alors que la partie libre eacutechange facilement ses hydrogegravenes
damide pour des deuteacuteriums (20) Neacuteanmoins il est vite apparu que le modegravele eacutetait trop
compliqueacute agrave manipuler et neacutecessitait decirctre simplifieacute
83
Pour ce faire T Joslashrgensen a deacutecideacute de maniegravere tout agrave fait astucieuse de mettre agrave profit le
fait quen solution les hydrogegravenes damide du squelette peptidique ont des vitesses deacutechange
avec le solvant qui varient fortement en fonction des acides amineacutes voisins pour construire
des peptides qui peuvent ecirctre seacutelectivement deuteacutereacutes Linfluence des reacutesidus voisins peut ecirctre
soit dordre steacuterique soit dordre inductif (21) A titre dexemple lhydrogegravene dun amide se
trouvant entre deux isoleucines eacutechange dix fois moins vite quun hydrogegravene damide situeacute
entre deux alanines Ces vitesses deacutechange ont eacuteteacute mesureacutees par des expeacuteriences de
spectroscopie RMN (22) Thomas Joslashrgensen a donc utiliseacute pour eacutetablir la seacutequence de ses
peptides modegraveles des acides amineacutes qui eacutechangent tregraves rapidement (histidine ou acide
aspartique) quil a placeacutes en N-terminal et des acides amineacutes qui eacutechangent beaucoup plus
lentement (isoleucine) en C-terminal Il a eacutegalement introduit des acides amineacutes basiques
(lysine) pour sassurer de la solubiliteacute de ses peptides La seacutequence geacuteneacuterale de ses peptides
est donc (His)n(Ile-Ile-Lys)m ou (Lys)2(Asp)n(Ile-Ile-Lys)m Ainsi apregraves un eacutechange complet
dans D2O et dilution dans H2O (acide et glaceacutee) les amides de la partie N-terminale des
peptides (His)n ou (Lys)2(Asp)n se retrouvent complegravetement hydrogeacuteneacutes alors que ceux de la
partie C-terminale (Ile-Ile-Lys)m portent encore des deuteacuteriums
Lutilisation de ces peptides a permis agrave T Joslashrgensen de montrer quil eacutetait possible de
trouver des conditions en ECD (18) mais aussi en ETD (19 23-24) qui permettent de
minimiser le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Diffeacuterents instruments ont eacuteteacute utiliseacutes pour ses
expeacuteriences un spectromegravetre de masse FT-ICR (LTQ-FT) de la socieacuteteacute Thermo pour les
expeacuteriences en ECD (18) et une trappe ionique Agilent (19) ainsi qu‟un spectromegravetre de
masse LTQ-Orbitrap XL (Thermo) (23 25) pour les expeacuteriences ETD Une des conclusions
de ces eacutetudes est que quel que soit le spectromegravetre de masse utiliseacute loptimisation des
conditions expeacuterimentales de la source eacutelectrospray et notamment tous les paramegravetres lieacutes agrave
la deacutesolvatation est un paramegravetre crucial pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Ce reacutesultat nest pas
eacutetonnant dans la mesure ougrave avant leur arriveacutee dans une reacutegion de tregraves basse pression les ions
subissent un certain nombre de collisions qui peuvent augmenter leur eacutenergie interne (26) et
favoriser ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Pour les expeacuteriences ECD T Joslashrgensen a
eacutegalement montreacute que la fenecirctre de seacutelection choisie dans le piegravege lineacuteaire pour isoler lion agrave
fragmenter est eacutegalement un paramegravetre agrave controcircler finement Une fenecirctre trop eacutetroite conduit
en effet agrave une excitation de lion preacutecurseur et au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
Dans ce contexte nous avons souhaiteacute utiliser les peptides deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
comme sondes du laquo scrambling raquo sur le spectromegravetre de masse FT-ICR APEX III du
84
laboratoire afin de pouvoir deacuteterminer les conditions expeacuterimentales propres agrave reacutealiser de
lECD sur des peptides puis des proteacuteines deuteacutereacutes Ce travail a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de
Magalie Duchateau (27) mais navait pas pu ecirctre termineacute pour des problegravemes instrumentaux
Afin dassurer la coheacuterence des reacutesultats toutes expeacuteriences reacutealiseacutees preacuteceacutedemment ont eacuteteacute
dupliqueacutees et compleacuteteacutees au deacutebut de ma thegravese Une mise agrave jour de linstrument en APEX-Q
puis en SolariX nous a ensuite conduits agrave devoir reacute-optimiser certains paramegravetres Les
reacutesultats obtenus lors de ce travail font lobjet du deuxiegraveme chapitre de cette thegravese Les
peptides choisis sont les suivants
P1 HHHHHHIIKIIK
P2 KKDDDDDDIIKIIK
P3 KKDDDIIKIIK
P4 KKDDIIK
II2 Reacutesultats
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons
Le systegraveme deacuteveloppeacute par T Joslashrgensen est celui que nous avons utiliseacute Il est constitueacute
dune seringue preacutealablement placeacutee entre deux sacs de glace puis refroidie pendant la dureacutee
de lanalyse par un sachet de carboglace La longueur du capillaire en PEEK (125 microm de
diamegravetre interne) entre la sortie de la seringue et lentreacutee dans la source dionisation a eacuteteacute
minimiseacutee agrave environ 30 cm et le deacutebit utiliseacute est de 600 microLmin afin de minimiser leacutechange
inverse pendant le transfert de leacutechantillon entre la seringue refroidie et la source dionisation
(voir Chap IV) Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees pendant 10 minutes avec le mecircme eacutechantillon
et la stabiliteacute du marquage (qui doit resteacutee dans les 10 du marquage initial qui sert de
reacutefeacuterence) est suivie par lacquisition reacuteguliegravere de spectres MS
II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence
Parmi les quatre peptides que nous avons choisis deux ont deacutejagrave eacuteteacute eacutetudieacutes preacuteceacutedemment
par T Joslashrgensen (18-19 21) Notre premier objectif eacutetait donc de retrouver le mecircme nombre
de deuteacuteriums initial que ce quil avait trouveacute Les peptides ont eacuteteacute conccedilus de telle sorte que
85
seule lextreacutemiteacute C-terminale doit porter des deuteacuteriums au niveau du motif IIKIIK pour les
peptides P1 P2 et P3 En theacuteorie on sattend donc agrave cinq eacutechanges H D pour ces peptides
Les reacutesultats expeacuterimentaux montrent que lon natteint pas tout agrave fait cette valeur mais quune
moyenne de 42 D est obtenue comme lindique le Tab II 1 Cette perte de 08 D
sexplique par le fait que le marquage au niveau de lamide situeacute entre la derniegravere histidine et
la premiegravere isoleucine nest pas parfait et quil existe un meacutelange de populations de peptides
pour lesquels cest bien un D qui est agrave cette place et des peptides pour lesquels le D a eacuteteacute
remplaceacute par un H De la mecircme faccedilon on nobtient pas exactement 2 D pour le peptide P4
mais seulement 16 Les reacutesultats regroupeacutes dans le Tab II 1 montrent eacutegalement que la taille
et la nature de la partie du peptide qui eacutechange vite (seacuterie dhistidines ou enchainement
lysine-acide aspartique) nont pas dinfluence sur le marquage global du peptide
Tab II 1 Seacutequence des quatre peptides utiliseacutes dans cette eacutetude Nombre de deuteacuteriums
retenus au niveau des acides amineacutes de lrsquoextreacutemiteacute C-terminale dans les diffeacuterents eacutetats de
charge apregraves reacute-eacutechange de certains deuteacuteriums avec les hydrogegravenes du solvant protieacute dans
des conditions controcircleacutees (Chap V)
Peptide Seacutequence Masse
monoisotopique MH
1+ MH2
2+ MH3
3+ Reacutefeacuterence
P1 HHHHHHIIKIIK 15498975 -
43 39 (18 21)
P2 KKDDDDDDIIKIIK 16738956 44a
43 43 (19)
P3 KKDDDIIKIIK 13288148 40b
42 42
P4 KKDDDIIK 9745517 20 16 -
Potentiel de deacutesolvatation a entre 200 et 250 V et
b entre 150 et 250 V
II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo
Afin deacutevaluer le taux de laquo scrambling raquo ducirc agrave la source eacutelectrospray les spectres ECD des
peptides ont eacuteteacute enregistreacutes en faisant varier les conditions expeacuterimentales dans la source
Comme les peptides sont construits pour ne porter des deuteacuteriums quagrave leur extreacutemiteacute C-
terminale les ions de type c (N-terminaux) fournissent des massifs isotopiques diagnostics
simples En labsence de laquo scrambling raquo les ions c de petite taille (comme lion c4 par
exemple) doivent conserver un massif isotopique identique agrave celui obtenu pour le peptide non
deuteacutereacute En revanche sil y a eu laquo scrambling raquo les enveloppes isotopiques seront deacuteplaceacutees
vers des rapports mz plus eacuteleveacutes
86
A titre dexemple la Fig II 1 montre le deacuteplacement du massif isotopique obtenu pour
lion c4 du peptide P2 lorsque lon augmente leacutenergie de deacutesolvatation
Fig II 1 Spectres ECD du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) (a) Spectre complet du peptide
non marqueacute (b) Massif isotopique de lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave partir du peptide
seacutelectivement marqueacute pour des valeurs de potentiel de deacutesolvatation eacuteleveacutee (180 V spectre du
haut) et basse (40 V spectre du milieu) Le spectre du bas montre lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave
partir du peptide agrave lrsquoeacutequilibre (marquage homogegravene) agrave 100 V
Alors quagrave 40 V correspondant agrave une basse eacutenergie de deacutesolvatation le massif isotopique
obtenu est le mecircme que pour le peptide non deuteacutereacute on observe agrave 180 V un deacuteplacement tregraves
clair du massif vers les hauts mz signature de lincorporation de deuteacuteriums du cocircteacute N-
terminal du peptide et donc de laquo scrambling raquo
Par cette approche diffeacuterents paramegravetres de source ont eacuteteacute testeacutes le potentiel de
deacutesolvatation (laquo CapExit raquo sur notre instrument) la tempeacuterature du gaz de deacutesolvatation et le
temps daccumulation dans lhexapocircle Parmi ces trois paramegravetres seul le potentiel de
deacutesolvatation a un effet majeur sur le laquo scrambling raquo comme le montre leacutevolution du nombre
de deuteacuteriums dans les diffeacuterents ions c et z formeacutes agrave partir du peptide P2 (Fig II 2)
87
88
Fig II 2 Graphes du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment ECD obtenu agrave
partir de lrsquoion preacutecurseur trichargeacute du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) seacutelectivement
marqueacute en fonction du potentiel de deacutesolvatation
Avec un potentiel de deacutesolvatation conduisant agrave tregraves peu de laquo scrambling raquo (40 V) on
nobserve pas deffet marquant de la tempeacuterature de la source (varieacutee de 50 agrave 140degC) ni du
temps daccumulation dans lhexapocircle (varieacute de 05 agrave 2 s) Les conditions optimales ayant eacuteteacute
obtenues pour limiter le laquo scrambling raquo nous navons pas chercheacute agrave faire varier dautres
paramegravetres qui par ailleurs ont eacutegalement une influence sur lefficaciteacute de transmission des
ions
Neacuteanmoins nous avons souhaiteacute comprendre un peu mieux le rocircle de leacutenergie de
deacutesolvatation et pour ce faire les spectres MS et MSMS en ECD ont eacuteteacute enregistreacutes Pour les
peptides P1-P3 les spectres ECD obtenus agrave partir dions preacutecurseurs trichargeacutes montrent des
courbes similaires agrave celles deacutecrites sur la Fig II 2 agrave bas potentiel de deacutesolvatation les
fragments contiennent un nombre de deuteacuteriums constant mais lorsque le potentiel est
augmenteacute on observe une incorporation de deuteacuteriums croissante pour les ions c et une perte
de deuteacuteriums pour les ions z Le seuil agrave partir duquel le laquo scrambling raquo commence est le
mecircme pour les diffeacuterents fragments dun mecircme peptide mais est diffeacuterent dun peptide agrave
lautre Pour le peptide P4 aucun fragment ECD na pu ecirctre observeacute agrave partir de lion
doublement chargeacute et lion triplement chargeacute nest apparemment pas formeacute
Ces reacutesultats sont tregraves proches de ce qui avait eacuteteacute observeacute par T Joslashrgensen sur le LTQ-FT
(18) et sur la trappe ionique (19) et ne semblent pas deacutependre de la taille et de la nature de la
partie du peptide qui preacutesente un eacutechange rapide
89
Un examen des spectres MS en fonction de leacutenergie de deacutesolvatation (Fig II 3) apporte
un eacuteclairage nouveau sur ce qui se passe dans la source qui est un pheacutenomegravene indeacutependant du
laquo scrambling raquo
Fig II 3 Intensiteacute des ions des diffeacuterents eacutetats de charge du peptide KKDDDIIKIIK (P3)
ainsi que celle de ses ions fragments geacuteneacutereacutes dans la source ionique en fonction du potentiel
de deacutesolvatation Lrsquointensiteacute des fragments correspond agrave la somme des intensiteacutes des ions
fragments b et y (a) Intensiteacutes absolues (b) Intensiteacutes relatives par rapport agrave lrsquointensiteacute
totale des ions
Tout dabord le type dion observeacute (simplement doublement ou triplement chargeacute) et
lapparition de fragments sont correacuteleacutes avec les potentiels de deacutesolvatation (Fig II 3) Comme
lindique la Fig II 3 les ions triplement chargeacutes sont largement favoriseacutes agrave bas potentiels de
deacutesolvatation et la fragmentation est quasi-inexistante Pour le peptide P3 on peut observer
une chute de lintensiteacute de lion triplement chargeacute au-delagrave de 160 V avec une augmentation
concomitante de lintensiteacute de lion moleacuteculaire doublement chargeacute et de celle des fragments
En intensiteacute absolue lion (1+) deacutecroicirct quant agrave lui lentement agrave partir de 200 V Ces reacutesultats
90
sexpliquent au moins en partie par le fait que lion (3+) est le premier agrave se fragmenter
lorsque lon augmente le potentiel de deacutesolvatation car chaque collision est trois fois plus
eacutenergeacutetique que pour son eacutequivalent monochargeacute
Si lon trace leacutevolution de la deuteacuteration de lion parent en fonction de leacutenergie de
deacutesolvatation un reacutesultat surprenant est obtenu (Fig II 4) le nombre de deuteacuteriums diminue
aux hauts potentiels de deacutesolvatation
Fig II 4 Nombre de deuteacuteriums dans les diffeacuterents eacutetats de charge de lrsquoion preacutecurseur en
fonction du potentiel de deacutesolvatation (a) Peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) (b) Peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK)
Ce reacutesultat explique le comportement observeacute pour les ions c111+
et c132+
aux hauts
potentiels de deacutesolvatation la diminution du nombre de deuteacuteriums pour ces ions fragments
est correacuteleacutee agrave celle de lion preacutecurseur Par ailleurs le nombre de deuteacuteriums perdu semble lieacute
(a)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
0 50 100 150 200 250 300
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M 2+
M 3+
M 4+
(b)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
100 150 200 250 300 350
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M3+
M2+
M1+
91
agrave la fois agrave la nature et agrave leacutetat de charge du peptide Par exemple le peptide P2 trois fois
chargeacute perd 08 D alors que le peptide P3 avec le mecircme eacutetat de charge perd au moins 2 D
Cette perte de deuteacuteriums ne peut sexpliquer que par lintervention dune autre moleacutecule
posseacutedant des hydrogegravenes eacutechangeables avec laquelle un eacutechange inverse D H peut avoir
lieu Cette moleacutecule peut par exemple provenir du solvant de spray utiliseacute pour les
expeacuteriences eau meacutethanol acide aceacutetique En effet il est possible deacutemettre lhypothegravese que
des reacuteactions ionmoleacutecule dans la source dans laquelle la pression est importante conduisent
agrave cet eacutechange dhydrogegravenes et de deuteacuteriums Le fait que P1 ne subisse aucune perte de
deuteacuterium permet mecircme de postuler que les acides amineacutes responsables de cet eacutechange sont
les acides aspartiques reacutesidus que lon retrouve dans tous les peptides eacutetudieacutes agrave lexception de
P1 Compte tenu du faible nombre de peptides eacutetudieacutes il est difficile de conclure sur un
meacutecanisme geacuteneacuteral permettant dexpliquer cet eacutechange en phase gazeuse mais le meacutecanisme
de flip-flop deacutecrit par Beauchamp et al (28-29) pourrait expliquer les reacutesultats observeacutes
Il est inteacuteressant de noter que les pheacutenomegravenes deacutecrits preacuteceacutedemment (apparition de
fragments dans la source laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums) apparaissent tous agrave une limite
preacutecise (mais diffeacuterente) de potentiel de deacutesolvatation (Tab II 2) Comme le potentiel de
deacutesolvatation est directement lieacute agrave leacutenergie interne des ions produits par la source
eacutelectrospray (26) il est possible dutiliser la valeur des seuils observeacutes comme indication de
leacutenergie requise pour chaque pheacutenomegravene Bien que les seuils deacutependent du peptide (et de son
eacutetat de charge) il est possible deacutetablir un ordre dapparition de chaque pheacutenomegravene car il est
conserveacute dune seacutequence et dun eacutetat de charge agrave lautre ainsi le laquo scrambling raquo apparaicirct en
premier avec un seuil assez bas deacutenergie de deacutesolvatation suivi dune perte du marquage et
enfin de lapparition de fragments aux plus hautes eacutenergies
Tab II 2 Valeurs de potentiel de deacutesolvatation (en V) pour lrsquoapparition de chaque
pheacutenomegravene observeacute laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums et fragmentation dans la source
Peptide
Desolvation potential (V) at onset
Scrambling Loss of D atom
Fragmentation
from 3+ from 2+
P1 100
- - 150
P2 110 160 - 170
P3 100 110 180 140
P4 - - - 120
92
Lordre des deux premiers pheacutenomegravenes indique que les hydrogegravenes damide ne sont pas
directement eacutechangeables avec ceux des moleacutecules de solvant vaporiseacutees Deux meacutecanismes
diffeacuterents peuvent alors ecirctre envisageacutes soit un eacutechange direct en phase gazeuse dun atome
dhydrogegravene du solvant avec un deuteacuterium porteacute par un azote dune des liaisons peptidiques
ce qui implique une eacutenergie dactivation importante soit un eacutechange agrave un autre site labile
apregraves transfert du deuteacuterium Comme la courbe du deacutemarquage est tregraves proche de celle du
laquo scrambling raquo deacutetermineacutee par les expeacuteriences ECD on peut supposer que la reacuteaction a lieu
en deux eacutetapes reacutearrangement intramoleacuteculaire dans le peptide conduisant agrave eacutechanger les
deuteacuteriums damide avec les hydrogegravenes carboxyliques des acides aspartiques puis reacuteaction
ionmoleacutecule avec le solvant en phase gazeuse En absence de ces acides carboxyliques relais
(cas de P1) seul le laquo scrambling raquo peut avoir lieu Ce meacutecanisme ne reacutepond toutefois pas agrave
une question qui est la suivante pourquoi dans le cas de P2 et pas de P3 le deacutemarquage
conduit-il agrave un eacutechange limiteacute agrave 08 D alors qu‟on devrait s‟attendre agrave suivre la courbe du
laquo scrambling raquo Si lon revient au scheacutema de la source dionisation de linstrument utiliseacute il
convient de se souvenir quapregraves leur deacutesolvatation dans le capillaire de transfert chauffeacute les
ions sont stockeacutes pendant une seconde environ dans un hexapocircle dans lequel regravegne une
pression assez importante (10-6
mbar environ) Ainsi un eacutechange HD partiel semble indiquer
que les deux pheacutenomegravenes observeacutes ont lieu dans deux reacutegions diffeacuterentes de linstrument le
reacutearrangement aurait lieu dans linterface entre le capillaire et le premier laquo skimmer raquo qui est
une reacutegion agrave haute pression et soumise agrave un potentiel eacutelectrique important tandis que les
reacuteactions ionmoleacutecule auraient plutocirct lieu dans lhexapocircle Ainsi si tous les sites labiles du
peptide ne participent pas aux reacuteactions ionmoleacutecule avec leur environnement gazeux (ce qui
est le cas dans lhypothegravese ougrave les acides aspartiques sont lieacutes speacutecifiquement agrave cet eacutechange) le
reacutearrangement conduirait agrave un nombre fini de sites eacutechangeables portant un atome de
deuteacuterium et ceux situeacutes sur dautres sites ne pourraient donc pas participer au deacutemarquage
II3 Conclusions
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III
Lobjectif initial de ce travail eacutetait de deacuteterminer quels paramegravetres expeacuterimentaux de la
source eacutelectrospray Apollo I de lAPEX III devaient ecirctre optimiseacutes pour minimiser le
reacutearrangement intramoleacuteculaire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums qui a lieu en source Parmi
les diffeacuterents paramegravetres testeacutes les reacutesultats preacutesenteacutes preacuteceacutedemment montrent que cest le
93
potentiel de deacutesolvatation qui est le plus critique Gracircce agrave lutilisation de lECD sur des
peptides seacutelectivement marqueacutes nous avons ainsi pu montrer que le potentiel de deacutesolvatation
doit ecirctre maintenu agrave une valeur leacutegegraverement infeacuterieure agrave celle conduisant agrave un maximum
dintensiteacute pour les ions formeacutes soit entre 80 et 110 V pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Cette
valeur est sensiblement la mecircme pour tous les peptides que nous avons eacutetudieacutes
Les reacutesultats obtenus sur les peptides seacutelectivement marqueacutes montrent clairement quil faut
faire extrecircmement attention agrave optimiser ce paramegravetre avant dutiliser lECD ou lETD pour
localiser des deuteacuteriums dans des peptides ou des proteacuteines qui ont eacuteteacute marqueacutes et pouvoir
tirer des conclusions sur la preacutesence de zones structureacutees ou non Utiliser des peptides
seacutelectivement marqueacutes pour deacuteterminer les conditions expeacuterimentales de source propres agrave
reacutealiser lanalyse de peptides ou de proteacuteines deuteacutereacutes (conditions qui deacutependent de
linstrument utiliseacute) devrait ainsi ecirctre leacutetape preacuteliminaire agrave toute expeacuterience HDX-MSMS
Au cours de ce travail nous avons eacutegalement mis en eacutevidence un pheacutenomegravene de reacuteactions
ionmoleacutecule dans la source qui sont potentiellement agrave lorigine deacutechanges entre les
deuteacuteriums preacutesents sur la seacutequence peptidique et des hydrogegravenes issus fort probablement de
moleacutecules de solvant en phase gazeuse Il est apparu au cours de notre travail que ce
pheacutenomegravene eacutetait particuliegraverement marqueacute pour les peptides portant des acides aspartiques par
rapport agrave ceux portant des histidines Ce pheacutenomegravene eacutetant a priori baseacute sur une premiegravere
eacutetape qui est leacutechange entre un deuteacuterium preacutesent sur une liaison amide et un hydrogegravene
carboxylique de la chaicircne lateacuterale des Asp il peut ecirctre reacuteduit par un reacuteglage approprieacute des
paramegravetres de source (diminution de leacutenergie de deacutesolvatation)
II32 Autres instruments FT-ICR
Nous avons proceacutedeacute agrave l‟laquo upgrade raquo de nos instruments agrave deux reprises (APEX III gt
APEX-Q en janvier 2011 et APEX-Q gt SolariX en avril 2012) De la mecircme maniegravere que pour
l‟APEX III nous avons pu deacuteterminer pour l‟APEX-Q et le SolariX le paramegravetre ou les
paramegravetres critiques qu‟il faut optimiser pour limiter le laquo scrambling raquo En effet agrave chaque
changement ou modification d‟instrument une reacute-optimisation de l‟ensemble des paramegravetres
entre la source et la cellule est requise pour eacuteviter un eacutechauffement des ions lors de leur
formation ou de leur transfert Les reacutesultats sont reacutesumeacutes dans le tableau ci-apregraves (Tab II 3)
94
Tab II 3 Paramegravetre(s) critique(s) agrave optimiser pour limiter le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
en fonction de lrsquoinstrument utiliseacute
APEX III Tension agrave la sortie du capillaire de source
(Potentiel de deacutesolvatation ou laquo CapExit)
lt 80 V
APEX-Q
APEX-Qe
Tension dans la cellule de collision
(laquo CollisionVoltage raquo)
gt 0 V
(3-5 V)
SolariX Tension du premier eacutecorceur (SK1)
Conditions de la cellule de collision
collision activeacutee
tension de collision en entreacutee
lt 50 V
Non
lt 2 V
Fig II 5 Nombre de deuteacuteriums dans lrsquoion preacutecurseur triplement chargeacute du peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK) et dans les fragments c2 c6 et z6 en fonction du potentiel du premier
eacutecorceur
A titre d‟illustration la Fig II 5 reprend les reacutesultats obtenus sur le SolariX avec le
peptide P1 en faisant varier la tension du premier eacutecorceur (laquo skimmer raquo) SK1 montrant une
valeur optimale vers 40 V On notera par contre la preacutesence d‟un taux de deuteacuteration non nul
sur les fragments c2 et c6 degraves les basses tensions Il faut noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un ion preacutecurseur triplement chargeacute preacutesentant un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
que ce qui est attendu
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
o
f d
eu
teri
um
SK1 (V)
C2 C6 Z6 Parent M3+
95
Les deux versions successives (APEX-Q et SolariX) preacutesentent une eacutevolution majeure qui
est l‟introduction d‟une cellule de collision sur le chemin optique des ions (Annexe Fig A 4
et Fig A 6) En conseacutequence on observe que cette seconde reacutegion agrave pression de gaz eacuteleveacutee
ajoute une seconde reacutegion susceptible de conduire agrave un deacutepocirct d‟eacutenergie dans les ions et par
conseacutequent agrave du laquo scrambling raquo Les paramegravetres optimiseacutes concernent par conseacutequent ces
deux reacutegions L‟ajout d‟entonnoirs agrave ions (laquo ion funnels raquo) au premier eacutetage de deacutesolvatation
semble rendre la tension en sortie de capillaire (laquo CapExit raquo) nettement moins critique sans
doute parce que les distances sont plus grandes (et donc le champ eacutelectrique plus faible) Par
contre sur le SolariX de l‟eacutenergie peut ecirctre deacuteposeacutee entre le premier eacutecorceur (SK1) et le
second entonnoir qui joue un rocircle critique dans le deacutepocirct d‟eacutenergie (Annexe Fig A 6)
En conclusion dans cette partie nous avons utiliseacute un jeu de peptides speacutecifiquement
marqueacutes par des deuteacuteriums pour valider notre instrumentation et trouver les paramegravetres
optimaux par rapport au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo ou meacutelange des deuteacuteriums lors des
eacutetapes de transfert en phase gazeuse et d‟introduction dans le vide du spectromegravetre de masse
Nous avons eacutegalement valideacute au passage que l‟ECD permet effectivement de mesurer des
fragments donc le nombre de deuteacuteriums correspond agrave celui attendu apregraves deacutemarquage seacutelectif
de peptides modegraveles Dans la partie suivante nous allons transposer ces reacutesultats agrave un systegraveme
reacuteel
96
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98
99
Chapitre III Deacuteveloppement de
lrsquoapproche HDX top-down ECD
100
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
101
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo
Comme nous l‟avons vu dans le premier chapitre de ce manuscrit (voir Chap I) les
eacutechanges HD coupleacutes agrave la spectromeacutetrie de masse (HDXMS) permettent d‟obtenir des
informations sur l‟organisation structurale des proteacuteines L‟approche classique dite
laquo bottom-up raquo (Fig III 1) repose sur une digestion enzymatique de la proteacuteine d‟inteacuterecirct apregraves
marquage afin de deacuteterminer la localisation des deuteacuteriums incorporeacutes Pour cela les peptides
issus de la digestion sont analyseacutes par spectromeacutetrie de masse une eacutetape preacutealable de
seacuteparation par chromatographie liquide eacutetant le plus souvent requise Les eacutetapes de digestion
enzymatique et de seacuteparation chromatographique qui se deacuteroulent en solution doivent ecirctre
reacutealiseacutees dans les conditions de conservation du marquage Des cineacutetiques deacutechange HD
peuvent alors ecirctre calculeacutees pour chaque peptide en mesurant le deacuteplacement de leur masse
dans les spectres Ces cineacutetiques sont correacuteleacutees dune part agrave laccessibiliteacute au solvant et dautre
part agrave la structure locale de la proteacuteine
Fig III 1 Scheacutema repreacutesentant les eacutetapes des approches laquo bottom-up raquo et laquo top-down raquo dans
des eacutetudes en HDXMS Le segment en bleu correspond agrave la proteacuteine hydrogeacuteneacutee tandis que
les portions en rouge correspondent aux zones de la proteacuteine qui ont eacuteteacute deuteacutereacutees Les
flegraveches vertes repreacutesentent le moment de la fragmentation en phase gazeuse
Cependant cette approche souffre de deux limitations majeures La premiegravere est l‟eacutechange
inverse entre les deuteacuteriums et les hydrogegravenes qui a lieu en solution lors des eacutetapes de
digestion et de seacuteparation avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Bien que le laquo back-
exchange raquo puisse ecirctre minimiseacute il ne peut ecirctre eacuteviteacute (1) La seconde limitation est la
reacutesolution qui deacutepend directement de la taille des peptides issus de la fragmentation
enzymatique par la pepsine et qui est typiquement de lordre de cinq agrave dix acides amineacutes
102
Une possibiliteacute pour ameacuteliorer la reacutesolution est de combiner diffeacuterentes enzymes Une
autre est de fragmenter les peptides obtenus dans le spectromegravetre de masse pour localiser
preacuteciseacutement les deuteacuteriums (2) Il a neacuteanmoins eacuteteacute montreacute que les techniques classiques par
chauffage lent (Collision Induced Dissociation CID) ne peuvent ecirctre utiliseacutees car une
migration intramoleacuteculaire et par conseacutequent un meacutelange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums a
lieu dans la seacutequence avant la rupture des liaisons peptidiques ce qui fait perdre linformation
de leur localisation (Fig III 2) (3) En revanche comme nous l‟avons montreacute dans le chapitre
preacuteceacutedent (voir Chap II) lutilisation de meacutethodes de fragmentation baseacutees sur la capture ou
le transfert dun eacutelectron (Electron Capture Dissociation ECD ou Electron Transfer
Dissociation ETD) permet de reacuteduire consideacuterablement ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo De
plus linteacuterecirct de ces modes de fragmentation alternatifs est quils peuvent ecirctre utiliseacutes aussi
bien dans une approche laquo bottom-up raquo sur les peptides proteacuteolytiques marqueacutes (4-5) que
directement sur la proteacuteine deuteacutereacutee dans une approche dite laquo top-down raquo Dans ce dernier
cas l‟incorporation des deuteacuteriums peut alors ecirctre mesureacutee pour chaque ion fragment comme
nous l‟avons fait pour les peptides modegraveles
Avec redistribution
NH2 COOHNH2
COOH
NH2COOH
CID ETDECD
NH2
COOH
by ionscz ions
D D DDD
H HH
H
NH2
COOH
Sans redistributionActivation
Fragmentation
Fig III 2 Illustration du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo qui est freacutequent lors de la
fragmentation par activation collisionnelle (CID) Les meacutethodes drsquoactivation par les eacutelectrons
(ECD ETD) ne conduisent pas agrave de la redistribution quand les conditions sont optimales
III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo
Dans une approche laquo top-down raquo la proteacuteine entiegravere est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse (Fig III 1) On s‟affranchit alors de l‟eacutetape de digestion proteacuteolytique De cette
maniegravere une partie du laquo back-exchange raquo qui a lieu en solution notamment lors de la
103
digestion enzymatique de la proteacuteine deuteacutereacutee (1) est eacutelimineacutee De plus dans la mesure ougrave
lobjet agrave analyser nest pas coupeacute en de nombreux morceaux en solution lutilisation dune
seacuteparation chromatographique n‟est pas requise ce qui permet eacutegalement de s‟affranchir de
l‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape L‟approche laquo top-down raquo est geacuteneacuteralement combineacutee agrave
une fragmentation par ECD ou ETD Comme nous l‟avons montreacute dans les chapitres
preacuteceacutedents (voir Chap I et II) l‟utilisation de ces techniques de dissociation par capture ou
transfert d‟eacutelectron permet de limiter au maximum le laquo scrambling raquo qui peut avoir lieu en
phase gazeuse au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem Elles sont donc
particuliegraverement bien adapteacutees pour deacuteterminer la position preacutecise des deuteacuteriums incorporeacutes
le long de la seacutequence polypeptidique
Des reacutesultats obtenus tregraves reacutecemment par diffeacuterents groupes utilisant aussi bien l‟ETD que
l‟ECD sur des proteacuteines modegraveles ont ainsi montreacute que ces techniques de dissociation utiliseacutees
en combinaison avec les eacutechanges HD permettent danalyser la structure native des proteacuteines
(6) ou encore de caracteacuteriser des espegraveces transitoires ce qui est essentiel pour la
compreacutehension des meacutecanismes de repliement (7) Il a mecircme eacuteteacute montreacute au cours de ces
eacutetudes qu‟une reacutesolution agrave lrsquoacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue Les premiers reacutesultats
provenant d‟une association entre eacutechanges HD et analyse laquo top-down raquo ont eacuteteacute obtenus en
2008 par l‟eacutequipe de Lars Konermann au Canada sur une petite proteacuteine modegravele de 86 kDa
l‟ubiquitine (8) Il montre dans son article que les informations de structure quil obtient sont
tregraves proches de celles issues de la RMN (Fig III 3)
Fig III 3 Symboles pleins taux de deuteacuteration des ions fragments ECD de lrsquoubiquitine apregraves
30 min incubation dans 95 de D2O agrave 22degC Symboles vides taux de deuteacuteration obtenus
par RMN dans les mecircmes conditions HDX
104
Dans une eacutetude plus reacutecente encore Igor Kaltashov a preacutesenteacute des reacutesultats tregraves
prometteurs sur une proteacuteine de 18 kDa en utilisant un spectromegravetre de masse FT-ICR
(Bruker) sur lequel une source d‟ionisation chimique permettant de faire des expeacuteriences ETD
a eacuteteacute installeacutee (9) Il a eacutegalement montreacute tregraves reacutecemment en travaillant sur la mecircme proteacuteine
modegravele que la fragmentation par activation collisionnelle (CID) pouvait ecirctre combineacutee agrave une
approche laquo top-down raquo dans des eacutetudes HDX indiquant que le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
pouvait ecirctre controcircleacute lorsque des eacutetats de charge tregraves eacuteleveacutes eacutetaient choisis pour la
fragmentation (10) Bien que les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons pour la fragmentation
de peptides (11-12) et de petites proteacuteines (6 8 13) se soient reacuteveacuteleacutees tregraves encourageantes
pour augmenter la reacutesolution des eacutetudes en HDX-MSMS elles ne fournissent pas une
couverture de seacutequence complegravete en particulier pour les gros polypeptides C‟est pour cette
raison qu‟il serait inteacuteressant de pouvoir utiliser en compleacutement les reacutesultats de la
fragmentation par CID qui conduit agrave des ions fragments souvent compleacutementaires agrave ceux
obtenus par dissociation ECD ou ETD Ainsi la possibiliteacute d‟utiliser les meacutethodes
d‟activation collisionnelle en plus des techniques d‟activation par les eacutelectrons dans les eacutetudes
laquo top-down raquo HDX conduirait agrave une reacutesolution spatiale significativement ameacutelioreacutee
permettant de sonder la conformation et la dynamique des proteacuteines Une autre faccedilon
d‟augmenter la reacutesolution est l‟utilisation d‟un reacuteactif tel que l‟alcool m-nitrobenzylique (m-
NBA) qui augmente leacutetat de charge des ions proteacuteiques en provoquant leur rapide
deacutenaturation lors du processus d‟ionisation par ESI Il en reacutesulterait le deacutepliement de la
proteacuteine dans la goutte eacutelectrospray mais sans l‟apparition de modifications significatives de
sa structure par rapport agrave celle de la solution initiale permettant d‟ameacuteliorer l‟efficaciteacute de
fragmentation et donc la couverture de seacutequence par ECD ou ETD Ainsi dans une eacutetude
reacutecente Evan Williams (14) a montreacute que lajout de m-NBA dans le spray utiliseacute pour ioniser
lubiquitine permet de former des ions de plus hauts eacutetats de charge dont la mobiliteacute ionique a
reacuteveacuteleacute quils eacutetaient comme attendu plus deacuteplieacutes que leurs homologues de plus bas eacutetat de
charge Ainsi comme lefficaciteacute de la fragmentation ECDETD augmente avec leacutetat de
charge du preacutecurseur Williams a pu montrer dans le cas de lubiquitine quune meilleure
couverture de seacutequence pouvait ecirctre obtenue simplement par lajout de m-NBA Une autre
possibiliteacute est de combiner les reacutesultats obtenus pour diffeacuterents eacutetats de charge d‟ions
preacutecurseurs ce qui peut ameacuteliorer un peu plus la reacutesolution spatiale des expeacuteriences ETD
Ceci peut devenir d‟autant plus important que le systegraveme proteacuteique est grand dans le cas ougrave
typiquement la fragmentation par ETD est limiteacutee
105
Les diffeacuterents exemples reacutecents deacutecrits preacuteceacutedemment montrent que les approches laquo top-
down raquo ont fait l‟objet de deacuteveloppements importants dans le contexte des eacutechanges HD ces
derniegraveres anneacutees Neacuteanmoins jusquagrave maintenant seules des proteacuteines modegraveles stables et
disponibles en quantiteacute importante ont eacuteteacute lobjet de ces deacuteveloppements Dans ce contexte
lobjet de ma thegravese a eacuteteacute de poursuivre les eacutetudes reacutealiseacutees au laboratoire dans lobjectif de
mettre au point une meacutethodologie robuste combinant eacutechanges HD et approche laquo top-
down raquo pour des complexes proteacuteiques reacuteels en collaboration avec le laboratoire de
Biochimie de lEacutecole Polytechnique Notre objectif est donc (i) de disposer dune meacutethode
permettant de localiser rapidement et preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence
polypeptidique et deacuteterminer ainsi des cineacutetiques deacutechange pour chaque acide amineacute (ii) de
pouvoir appliquer cette meacutethodologie agrave leacutetude structurale des complexes d‟initiation de la
traduction La difficulteacute ici reacuteside dans le fait qu‟il s‟agit d‟eacutechantillons biologiques reacuteels et
de grande taille Cela implique des eacutetapes additionnelles dans le protocole de preacuteparation et
d‟analyse des eacutechantillons et donc des preacutecautions suppleacutementaires agrave prendre vis-agrave-vis de la
conservation du marquage Notre eacutetude HDXMS preacuteliminaire qui a eacuteteacute meneacutee sur des
peptides de reacutefeacuterence et qui a eacuteteacute preacutesenteacutee dans le chapitre preacuteceacutedent (voir Chap II) a
montreacute que l‟utilisation de meacutethodes de fragmentation telle que la dissociation par capture
d‟eacutelectron (ECD) eacutetait adapteacutee pour mesurer les taux d‟eacutechanges HD pour chaque acide
amineacute Pour cela une optimisation fine des conditions de source et des paramegravetres
instrumentaux a eacuteteacute requise preacutealablement agrave l‟analyse pour reacuteduire au maximum le
laquo scrambling raquo pendant les processus de deacutesolvatation et de transfert des ions en phase
gazeuse Nous avons dans ce troisiegraveme chapitre reacuteutiliseacute ces paramegravetres optimiseacutes pour
l‟analyse laquo top-down raquo de nos eacutechantillons proteacuteiques Dans un premier temps cette partie se
focalisera sur l‟eacutetude laquo top-down raquo HDX avec activation par ECD qui est la technique
d‟activation pour laquelle le plus de reacutesultats ont eacuteteacute obtenus Ensuite pour mieux
comprendre le rocircle des meacutethodes d‟activation sur les migrations d‟hydrogegravene le mecircme
systegraveme a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacute avec d‟autres modes d‟activation (ETD et CID)
106
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation
lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX
III211 Proteacuteines drsquoeacutetude
Nous avons travailleacute sur le complexe proteacuteique aIF2 (archaeal Initiation Factor 2) de
Sulfolobus solfataricus (Fig III 4) qui est un des complexes responsables de l‟initiation de
la traduction chez les archeacutees Son rocircle est de recruter l‟ARNt meacutethionyleacute lieacute agrave l‟ARNm au
niveau de la petite sous-uniteacute du ribosome Nous savons deacutejagrave par des donneacutees
cristallographiques qu‟il est constitueacute de trois sous-uniteacutes α β et γ La sous-uniteacute γ (45
kDa) qui constitue la proteacuteine centrale du complexe est connue pour interagir avec les deux
autres sous-uniteacutes α (30 kDa) et β (15 kDa) au sein d‟aIF2 Afin d‟obtenir des informations
structurales sur l‟organisation de ce complexe nous avons deacuteveloppeacute notre meacutethodologie agrave
partir de l‟analyse de la proteacuteine aIF2α3 de 10 kDa qui est une version tronqueacutee de la sous-
uniteacute α du complexe aIF2 mais qui contient le site d‟interaction avec γ Ce travail a eacuteteacute initieacute
lors de la thegravese de M Duchateau (15) pendant laquelle l‟eacutetude de la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute
reacutealiseacutee par HDXECD sur l‟APEX III Dans le cadre du travail actuel nous avons eacutetendu
notre eacutetude au sous-complexe aIF2α3γ et compareacute les diffeacuterents modes de fragmentation en
utilisant d‟autres spectromegravetres de masse
Fig III 4 Scheacutema du complexe heacuteteacuterotrimeacuterique aIF2αβγ
107
III212 Protocole drsquoanalyse HDXMS
L‟analyse d‟eacutechantillons biologiques reacuteels a neacutecessiteacute une optimisation du protocole mis au
point pour les peptides En effet ces eacutechantillons proteacuteiques preacutesentent des inconveacutenients
majeurs qui sont les suivants
- ils ne sont pas disponibles en grande quantiteacute
- le maintien de leur structure native neacutecessite des concentrations importantes de sels non
volatils
- ils se deacutegradent rapidement agrave tempeacuterature ambiante
L‟ensemble des eacutetapes du protocole allant des conditions de l‟eacutechange en solution (pH
tempeacuterature tampons dessalage) agrave la fragmentation par ECD a donc eacuteteacute minutieusement
optimiseacute (Fig III 5) pour tenir compte de ces limitations Au deacutebut de l‟expeacuterience la
proteacuteine aIF2α3 est dans son eacutetat natif En effet elle est conserveacutee dans son tampon de
purification qui est riche en sels (chlorure de sodium) et qui lui permet ainsi de garder sa
conformation native La premiegravere eacutetape de notre protocole qui a consisteacute agrave initier la reacuteaction
d‟eacutechange HD a eacuteteacute de diluer aIF2α3 dans un tampon deuteacutereacute riche eacutegalement en sels
(solution de NaCl agrave 330 mM dans D2O) afin de ne pas deacutenaturer la proteacuteine et donc de sonder
sa conformation active Une incubation du meacutelange agrave 37degC sous agitation est reacutealiseacutee pendant
diffeacuterents temps agrave l‟issu desquels la reacuteaction de marquage est bloqueacutee Cette eacutetape d‟arrecirct de
la reacuteaction d‟eacutechange est effectueacutee par l‟addition d‟une solution aqueuse (H2O) acide (pH
final de 25) et glaceacutee (agrave 0degC) Etant donneacute que les fortes concentrations en sels non volatils
ne sont absolument pas compatibles avec une ionisation par eacutelectrospray nous avons ducirc
ajouter et optimiser une eacutetape de dessalage dans les conditions de conservation du marquage
Apregraves cette eacutetape de dessalage dont la dureacutee totale a eacuteteacute optimiseacutee agrave seulement une minute
(15) la proteacuteine deuteacutereacutee est precircte pour l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Elle est injecteacutee
par le systegraveme de seringue refroidie ioniseacutee par eacutelectrospray et fragmenteacutee par ECD dans la
cellule ICR
108
Alpha3 dans des conditions natives Arrecirct de la reacuteaction
H2O pH 25 et 0degC
Dilution dans D2O
NaCl 330 mM
Incubation
Temps variables
1 Dessalage
2 Eacutelution dans H2OACNAF2Alpha3 deuteacutereacutee dans le solvant pour ESI
ECD
Fig III 5 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude drsquoaIF2α3 en HDXMS par
analyse laquo top-down raquo
Pour eacuteviter l‟eacutetape de dessalage et optimiser encore plus le protocole nous avons fait de
nombreux essais pour essayer de remplacer les sels non volatils par des sels volatils
compatibles avec une analyse par ESI mais dans tous les cas la proteacuteine a preacutecipiteacute ou sest
deacutegradeacutee
III213 Instruments utiliseacutes
Les fragmentations par ECD ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur des spectromegravetres de masse de type FT-
ICR Les premiegraveres expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur un spectromegravetre APEX III qui nest pas
eacutequipeacute dun quadripocircle de seacutelection avant la cellule ICR puis sur un APEX-Qe disponible agrave
Orsay (P Maicirctre Laboratoire de Chimie Physique) Les diffeacuterences majeures entre les deux
instruments sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
Les expeacuteriences ETD ont quant agrave elles eacuteteacute effectueacutees sur un instrument LTQ Orbitrap
Velos (Thermo Scientific) en collaboration avec la plateforme proteacuteomique de Paris 7 dirigeacutee
par Jean-Michel Camadro
Les expeacuteriences CID ont eacuteteacute obtenues sur un spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
(Waters) installeacute au laboratoire DCMR
109
III22 Fragmentation par ECD
III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3
III2211 Spectre de masse
Le spectre de masse d‟aIF2α3 dont la masse monoisotopique est 10422985 Da a eacuteteacute
obtenu apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes (Fig III 6)
aiF2alpha3ss1 +MS
0
2
4
6
8
6x10
Intens
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+6H]6+
mz
Intensx106
Fig III 6 Spectre MS drsquoaIF2α3 enregistreacute sur notre instrument FT-ICR APEX III
III2212 Reacutesultats obtenus en ECD
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX III du DCMR
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres pour l‟ECD afin d‟obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour cette proteacuteine de 10 kDa sans eacutechange HD
Pour cela nous avons tout d‟abord utiliseacute une autre petite proteacuteine l‟ubiquitine (86 kDa)
pour optimiser lensemble des paramegravetres expeacuterimentaux
110
Lors de la thegravese de M Duchateau (15) notre eacutequipe a montreacute que la fragmentation par
ECD d‟aIF2α3 eacutetait beaucoup plus efficace sans seacutelection d‟un eacutetat de charge Nous avons
donc proceacutedeacute de la mecircme maniegravere
Pour l‟ubiquitine les spectres ECD les plus informatifs ont eacuteteacute obtenus avec une cathode
chauffeacutee agrave 16 A et une irradiation par des eacutelectrons de 09 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 80
ms Nous utilisons eacutegalement la technique de pieacutegeage dynamique des ions dans la cellule
afin de maximiser la quantiteacute d‟ions accumuleacutes avant la fragmentation ECD En effet la
qualiteacute des spectres ECD deacutepend en grande partie de lintensiteacute des ions preacutecurseurs et il
existe un veacuteritable seuil pour le nombre dions pour obtenir des spectres ECD de qualiteacute Le
pourcentage de couverture de seacutequence ainsi obtenu est de 68 Pour obtenir un reacutesultat
similaire avec aIF2α3 l‟eacutenergie cineacutetique des eacutelectrons a eacuteteacute augmenteacutee jusqu‟agrave 2 eV
Les proteacuteines marqueacutees sont introduites dans le spectromegravetre de masse par le systegraveme de
seringue refroidie qui est deacutecrit dans le Chap IV Afin de minimiser l‟eacutechange inverse en
solution l‟analyse ne doit pas exceacuteder dix minutes Dans ce laps de temps relativement court
deux cents scans sont accumuleacutes par spectre ECD
L‟analyse du spectre ECD d‟aIF2α3 reacutealiseacute sans seacutelection d‟eacutetat de charge permet
l‟identification d‟un total de 83 ions fragments correspondant agrave 39 ions c et 44 ions z dont 18
paires d‟ions compleacutementaires Cela se traduit par un tregraves bon pourcentage de couverture de
seacutequence de 706 (Fig III 7) L‟identification des ions fragments b et y permet d‟ameacuteliorer
leacutegegraverement la couverture de seacutequence en augmentant le pourcentage de 55 (1 ion b et 4 ions
y suppleacutementaires pour lesquels il n‟y a pas d‟ions c et z correspondants) atteignant donc la
valeur de 761
111
aIF2a3_noHD_ECD_000008d +MS
0
1
2
3
4
5
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
~ ~
~
~
~
~
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+ [M+8H]8+
[M+7H]7+
~[M+6H]6+
250 300 350 400 450 500 550 mz0
1
2
3
4
5
6
6x10
Intens
+MS
z2+
z3+
z4+ z5
+
c2+
c3+
c4+
Intens
mz
Fig III 7 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX III et sa couverture de seacutequence associeacutee Un agrandissement de la reacutegion mz
250-550 a eacuteteacute ajouteacute montrant la complexiteacute du spectre
Des problegravemes de stabiliteacute du signal et de sensibiliteacute sont apparus au cours de ces
expeacuteriences ECD il arrivait freacutequemment que le taux de fragmentation diminue brutalement
sans raison apparente au cours d‟une cineacutetique d‟eacutechange Pour pouvoir poursuivre nos
expeacuteriences nous avons deacutecideacute de continuer nos travaux sur l‟APEX-Qe accessible agrave
l‟Universiteacute Paris-Sud Une reacute-optimisation des paramegravetres pour l‟ECD a donc eacuteteacute neacutecessaire
car cet instrument nest pas le mecircme que celui du DCMR et notamment le fait que les sources
dionisation soient diffeacuterentes nous laissait agrave penser que des ajustements au moins au niveau
de la source seraient neacutecessaires (voir Chap II)
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX-Qe du Laboratoire de Chimie Physique agrave Orsay
Pour aIF2α3 les nouveaux paramegravetres optimiseacutes pour maximiser la couverture de
seacutequence obtenue en ECD ont eacuteteacute les suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par des
eacutelectrons de 17 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 10 ms Contrairement aux expeacuteriences
reacutealiseacutees sur l‟APEX III nous n‟avons pas utiliseacute la technique de pieacutegeage dynamique des
ions En effet un gain de sensibiliteacute a eacuteteacute apporteacute par les laquo ion funnels raquo Dans ces conditions
expeacuterimentales l‟analyse du spectre ECD a permis l‟identification d‟un total de 59 ions
112
fragments correspondant agrave 19 ions c et 40 ions z dont 3 paires d‟ions compleacutementaires Le
pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 608 (Fig III 8)
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
00
05
10
15
20
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+6H]6+
[M+13H]13+
~
~
~
~~
~
~
~
mz
Intensx107
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
250 300 350 400 450 500 550 mz
z2+
c2+
z3+
c3+
z4+
z5+
c4+
Fig III 8 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX-Qe La couverture de seacutequence correspondante agrave la fragmentation et
lrsquoagrandissement de la reacutegion mz 250-550 sont eacutegalement montreacutes
Si l‟on compare les deux spectres ECD ci-dessus une meilleure efficaciteacute de fragmentation
a eacuteteacute obtenue sur l‟APEX III permettant d‟avoir une meilleure reacutesolution en ce qui concerne la
zone [20-55] correspondant agrave la partie de la proteacuteine aIF2α3 qui se retrouve en contact avec la
sous-uniteacute γ lorsque leur association est effective Neacuteanmoins la fragmentation ECD de la
proteacuteine sur l‟APEX-Qe permet aussi d‟avoir un bon pourcentage de couverture de seacutequence
pour deacuteterminer des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute notamment au niveau des
extreacutemiteacutes
113
III2213 Reacutesultats en HDXECD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ECD
Pour cela nous avons mis en application notre protocole de marquage pour un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure (Fig III 5)
L‟observation des spectres ECD apregraves eacutechange HD montre que les massifs isotopiques
avec l‟incorporation de deuteacuteriums se deacuteplacent vers des rapports masse sur charge plus
importants tout en s‟eacutelargissant car lincorporation progressive de deuteacuteriums ajoute des pics
isotopiques dans le massif (Fig III 9) La premiegravere conseacutequence agrave cet eacutelargissement est que
l‟intensiteacute totale du signal obtenu pour un ion fragment est reacutepartie sur un nombre plus grand
de pics composant le massif Il en reacutesulte une diminution de l‟intensiteacute globale du signal
pouvant entraicircner une perte de deacutetection Dans ce contexte le nombre de fragments pouvant
ecirctre interpreacuteteacutes de maniegravere correcte car lenveloppe isotopique preacutesente une intensiteacute
suffisante diminue par rapport agrave lexpeacuterience sans deuteacuterium Parfois mecircme certains
fragments disparaissent complegravetement dans le bruit de fond contribuant agrave son augmentation
En effet les ions fragments c et z de faible intensiteacute avant l‟eacutechange ne sont plus deacutetectables
dans les spectres apregraves eacutechange Une autre conseacutequence de l‟eacutelargissement des massifs
isotopiques ayant incorporeacute des deuteacuteriums est leur superposition compliquant aussi fortement
l‟analyse des reacutesultats Plus le nombre de fragments est grand et moins il est facile de suivre
l‟incorporation des deuteacuteriums Par ailleurs pour les hauts rapports mz on note eacutegalement
l‟apparition de pics intenses agrave toutes les uniteacutes de masse perturbant davantage l‟interpreacutetation
des reacutesultats Ce pheacutenomegravene indeacutesirable reacutesultant de la recapture successive d‟un eacutelectron
avait eacutegalement eacuteteacute observeacute lors de la thegravese de M Duchateau (15) Une solution pour le
limiter a eacuteteacute d‟optimiser au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les
recaptures successives tout en obtenant suffisamment de fragmentations (eacutenergie cineacutetique
des eacutelectrons de 17 eV pendant 10 ms)
114
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
000
025
050
075
100
125
7x10
Intens
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
6x10
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
[M+12H]12+
[M+12H]12+
z324+
z324+
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
Fig III 9 Comparaison des spectres ECD drsquoaIF2α3 sans HDX (en bleu) et avec HDX t=1h
(en rouge) Agrandissements des reacutegions du spectre mz 869-884 (a) et mz 1080-1150 (b)
L‟analyse des spectres ECD montre donc une perte importante de sensibiliteacute apregraves eacutechange
HD essentiellement pour les hauts rapports mz La conseacutequence immeacutediate est une
diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD ce qui n‟est pas
favorable pour obtenir une bonne reacutesolution Nous avons identifieacute au total 43 ions fragments
correspondant agrave 23 ions c et 20 ions z dont une paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage
de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 456 (Fig III 10)
(a)
(b)
115
Fig III 10 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ECD
Lanalyse de la Fig III 10 montre clairement que si lanalyse des petits fragments
(extreacutemiteacutes N- et C-terminales) ne pose pas de problegraveme lanalyse dions fragments plus gros
correspondant agrave une rupture plutocirct au niveau du milieu de la seacutequence polypeptidique est
bien plus probleacutematique A la diffeacuterence de l‟APEX III en pieacutegeage dynamique il semble que
sur l‟APEX-Qe la capaciteacute de pieacutegeage du piegravege hexapolaire soit limitante et ne permette pas
d‟accumuler autant d‟ions dans la cellule Pour eacuteviter ce problegraveme il faudrait pouvoir
accumuler plus de temps pour faire sortir les pics peu intenses du bruit de fond (mais ce nest
pas possible avec notre systegraveme de seringue refroidie car leacutechange inverse devient trop grand
au bout de 10 minutes) Une autre solution agrave ce problegraveme aurait pu eacutegalement ecirctre une
augmentation du champ magneacutetique qui aurait permis d‟augmenter la gamme dynamique
ainsi que la vitesse de balayage
III2214 Analyse des donneacutees
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Data Analysis (Bruker Daltonics)
L‟analyse des spectres de fragmentation MSMS est effectueacutee entiegraverement manuellement ce
qui la rend longue et fastidieuse
La premiegravere eacutetape de l‟analyse consiste agrave identifier les ions fragments c et z preacutesents dans
le spectre enregistreacute avant l‟eacutechange HD Une liste de pics est alors geacuteneacutereacutee Elle contient
tous les pics des massifs isotopiques correspondant aux ions fragments identifieacutes Cette liste
reacutepertorie le rapport mz et l‟intensiteacute de chaque pic A partir de celle-ci les masses moyennes
pondeacutereacutees des fragments n‟ayant pas incorporeacute de deuteacuteriums sont calculeacutees Il s‟agit ensuite
de proceacuteder de la mecircme maniegravere pour les fragments ayant incorporeacute des deuteacuteriums apregraves
eacutechange Pour la seacuteparation des massifs isotopiques eacutelargis et la deacutetermination de leur masse
moyenne pondeacutereacutee la preacutecision sur la mesure de masse et la reacutesolution de l‟instrument sont
deux critegraveres essentiels Afin de cartographier les eacutechanges isotopiques des hydrogegravenes
d‟amide le choix de spectromegravetres de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR et Orbitrap) est
116
justifieacute Enfin le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour chaque ion fragment peut ecirctre
deacutetermineacute Il est obtenu en faisant la diffeacuterence entre la masse moyenne pondeacutereacutee d‟un ion
fragment donneacute apregraves eacutechange isotopique avec celle obtenue sans eacutechange et en multipliant
par la charge Le taux de deuteacuteration correspondant est deacuteduit en divisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le nombre d‟hydrogegravenes d‟amide eacutechangeables (multiplieacute par cent)
La repreacutesentation la plus directe des reacutesultats consiste agrave tracer le graphe du nombre total de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment en fonction de sa position (numeacutero de reacutesidu)
dans la seacutequence Pour un temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O donneacute deux graphes
peuvent alors ecirctre reacutealiseacutes correspondant agrave l‟analyse des deux seacuteries d‟ions c et z (Fig III 11)
La ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la seacutequence de tous les deuteacuteriums
incorporeacutes dans la proteacuteine Cette courbe theacuteorique correspond donc agrave l‟incorporation
moyenne en deuteacuteriums pour chaque ion fragment Elle tient compte du contenu maximal de
deuteacuteriums incorporeacutes par la proteacuteine Dans le cas que nous preacutesentons qui correspond agrave un
temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte eacutetait marqueacutee agrave 61 Chaque
point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de 061 deuteacuterium par reacutesidu Les
deacutecrochements de la courbe sont dus agrave la preacutesence de proline dans la seacutequence de la proteacuteine
qui est le seul acide amineacute qui ne possegravede pas de groupement amide N-H de liaison Si notre
expeacuterience avait abouti agrave un reacutearrangement total des deuteacuteriums sur les hydrogegravenes d‟amide le
long de la chaicircne peptidique tous les points expeacuterimentaux en rose et en bleu se situeraient
sur la courbe noire Or ce n‟est pas le cas Par conseacutequence nous pouvons conclure que nous
n‟avons pas de redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD
117
c-type fragments (N-terminus)
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Numeacutero de reacutesidu
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40 50 60
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Fig III 11 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment en fonction de son numeacutero de reacutesidu pour les seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure
drsquoincubation dans D2O
Une autre maniegravere de repreacutesenter ces reacutesultats est de tracer le nombre de deuteacuteriums par
reacutesidu (et non plus le nombre cumuleacute de deuteacuteriums le long de la seacutequence) (Fig III 12) Ce
nombre est calculeacute en faisant la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour deux
ions fragments conseacutecutifs Par exemple si on considegravere l‟extreacutemiteacute N-terminale le nombre
de deuteacuteriums incorporeacutes par le reacutesidu numeacutero dix a eacuteteacute deacutetermineacute en faisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le fragment c10 moins celui du fragment c9 Le taux de deuteacuteration
obtenu pour ce reacutesidu a eacuteteacute de 68 Lorsqu‟il manquait des ions fragments une moyenne
d‟incorporation des deuteacuteriums entre les deux reacutesidus les plus proches a alors eacuteteacute calculeacutee
Dans ce cas la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour les deux fragments
correspondants a donc eacuteteacute diviseacutee par le nombre de reacutesidus les seacuteparant Ainsi entre les
reacutesidus 33 et 44 le taux moyen de 70 a eacuteteacute calculeacute en faisant le nombre de deuteacuteriums
incorporeacutes dans c44 moins celui dans c33 diviseacute par 11
118
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero de reacutesidu
Fig III 12 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O
L‟ensemble des points se situe en dessous de un qui est la valeur maximale de deuteacuteration
attendue correspondant exactement agrave l‟incorporation d‟un deuteacuterium par hydrogegravene d‟amide
Plus le taux de deuteacuteration s‟eacuteloigne de la valeur de un plus la zone correspondante de la
proteacuteine est structureacutee Inversement plus le taux est proche de un moins la proteacuteine est
structureacutee Ces reacutesultats peuvent donc ecirctre exploiteacutes pour obtenir des informations structurales
sur la sous-uniteacute α3 du complexe d‟initiation de la traduction aIF2 chez Sulfolobus
solfataricus Ils ont eacuteteacute reporteacutes sur la structure primaire d‟aIF2α3 dans laquelle des eacuteleacutements
de structure connus (heacutelices feuillets et boucles) ont eacuteteacute indiqueacutes (Fig III 13) Les zones en
bleu caracteacuteriseacutees par une incorporation faible de deuteacuteriums indiquent une zone tregraves
structureacutee de la proteacuteine Le passage de bleu agrave rouge (avec des zones intermeacutediaires en vert
jaune ou orange) montre des segments de la proteacuteine de moins en moins structureacutes
119
Fig III 13 Repreacutesentation scheacutematique sur la structure primaire et secondaire drsquoaIF2α3 du
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu Ce nombre a eacuteteacute calculeacute agrave partir des taux de
deuteacuteration drsquoions fragments conseacutecutifs ou proches pour les seacuteries c et z apregraves une heure
drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O
Malgreacute la diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD des
informations de structure sont deacuteduites sur une grande partie de la proteacuteine Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves est principalement obtenue au niveau des extreacutemiteacutes et dans des zones non
structureacutees de la proteacuteine Notons que la zone pour laquelle agrave la fois des ions c et z sont
obtenus preacutesente une parfaite correacutelation entre nos reacutesultats ce qui constitue une validation
suppleacutementaire de notre approche Neacuteanmoins nous n‟observons pas toujours une tregraves bonne
correacutelation entre les taux d‟incorporation des deuteacuteriums que nous avons calculeacutes et les
eacuteleacutements structuraux proposeacutes par la cristallographie et notamment en ce qui concerne la
zone [20-55] Cette zone qui comprend l‟heacutelice α1 le feuillet β2 et le deacutebut du feuillet β3
correspond agrave la partie de la proteacuteine qui interagit avec la sous-uniteacute γ lorsqu‟il y a formation
du complexe
Il est eacutegalement possible de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums dans la proteacuteine entiegravere
ou au niveau des ions fragments au cours du temps en reacutealisant des cineacutetiques d‟eacutechange HD
En faisant varier le temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O il est alors possible
d‟obtenir diffeacuterents points de cineacutetique et donc de tracer une courbe de cineacutetique
d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) Elle nous renseigne sur la vitesse
d‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine et sur le taux de deuteacuteration maximal atteint
120
Dans le cas de la proteacuteine aIF2α3 la vitesse d‟eacutechange HD est tregraves rapide Un plateau est
atteint degraves trente minutes d‟incubation correspondant agrave un marquage maximal d‟environ 66
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
d
eu
teri
ation
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
Temps (minutes)
Po
urc
enta
ge
de
deu
teacutera
tio
n
Fig III 14 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la proteacuteine entiegravere
Les vitesses d‟eacutechange pour les diffeacuterents ions fragments peuvent eacutegalement ecirctre traceacutees
(Fig III 15) Une autre maniegravere simple (autre que celle discuteacutee dans III2214) de s‟assurer
qu‟il n‟y a pas eu un reacutearrangement aleacuteatoire total des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique est de veacuterifier que les pourcentages de deuteacuteration observeacutes pour les ions
fragments c et z de mecircme taille ne sont pas identiques En effet deux cineacutetiques d‟eacutechange
identiques pour des ions fragments c et z comportant le mecircme nombre d‟hydrogegravenes
eacutechangeables seraient la signature d‟une redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums ayant
eu lieu avant la formation de ces ions
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500
c13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
9193319575m1
0053075008066m2
9422930195m3
045244084732m4
NA12581Chisq
NA097786R
0
10
20
30
40
50
60
70
0 500 1000 1500
z13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
1007264506m1
3463903455m2
11624-095451m3
095437m4
NA93538Chisq
NA099061R
Fig III 15 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour les ions fragments c13 et z13
dichargeacutes
121
Nous avons donc geacuteneacutereacute un important jeu de donneacutees par la reacutealisation d‟une cineacutetique
d‟eacutechange HD combineacutee agrave une fragmentation par ECD Nous avons montreacute que notre
approche permettait de limiter la redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique en phase gazeuse et d‟obtenir des informations de structure sur une grande partie
de la proteacuteine Neacuteanmoins la comparaison de nos reacutesultats de HDX avec les donneacutees obtenues
par cristallographie montre des diffeacuterences que l‟on peut peut-ecirctre expliquer par le fait que les
donneacutees de cristallographie sont issues du complexe (16) La proteacuteine adopterait une
conformation particuliegravere (en heacutelice et feuillets) lorsqu‟elle serait en interaction avec la sous-
uniteacute γ afin de stabiliser la formation du complexe tandis qu‟en absence de son partenaire
proteacuteique elle resterait deacutestructureacutee Une analyse du sous-complexe aIF2α3γ permettra de
confirmer cette hypothegravese
En conclusion nos reacutesultats sont encourageants mais ils doivent eacutegalement ecirctre ameacutelioreacutes
pour que nous puissions obtenir des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute pour une
grande partie de la proteacuteine qui nous permettraient de distinguer tregraves nettement des zones
structureacutees de segments deacutesordonneacutes
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ
III2221 Optimisation du protocole drsquoanalyse
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres de source et la concentration de
l‟eacutechantillon proteacuteique afin d‟obtenir une bonne intensiteacute du signal sur l‟APEX-Qe Alors que
la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute analyseacutee agrave la concentration de 57 microM une concentration de 74 microM
apregraves laquo quench raquo et deacutenaturation a eacuteteacute neacutecessaire agrave l‟obtention d‟un spectre de masse aussi
intense que celui qui avait eacuteteacute obtenu pour la proteacuteine seule De plus nous avons reacutegleacute
l‟instrument pour maximiser l‟observation de la sous-uniteacute α3 en particulier via les reacuteglages
du quadripocircle de l‟instrument car nous avions deacutejagrave un jeu de donneacutees sur cette proteacuteine Le
spectre de masse d‟aIF2α3 en complexe avec γ ainsi obtenu est donneacute dans la Fig III 16
122
aIF2a3g_ss_noHD_000003d +MS
0
1
2
3
4
7x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+13H]13+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+[M+14H]14+
mz
Intensx107
Fig III 16 Spectre MS drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HDX obtenu sur lrsquoAPEX-
Qe avec maximisation de lrsquointensiteacute de la sous-uniteacute α3
Dans une deuxiegraveme eacutetape les paramegravetres ECD ont eacuteteacute optimiseacutes pour obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ avant
l‟ajout de l‟eacutetape d‟eacutechange HD Le meilleur pourcentage de couverture de seacutequence obtenu
a eacuteteacute d‟environ 40 avec les paramegravetres suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par
des eacutelectrons de 1 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 35 ms Le spectre ECD correspondant est
donneacute dans la Fig III 17
aIF2a3g_ss_noHD_000005d +MS
0
1
2
3
6x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 mzmz
Intensx106
Fig III 17 Spectre ECD drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HD enregistreacute sur
lrsquoAPEX-Qe
123
Finalement le complexe a eacuteteacute analyseacute par HDXECD Le protocole de marquage du
complexe aIF2α3γ est identique agrave celui utiliseacute pour la proteacuteine α3 seule Le principe est
rappeleacute dans la Fig III 18 La fragmentation ECD est reacutealiseacutee sur la sous-uniteacute α3 apregraves
diffeacuterents temps d‟incubation du complexe α3γ dans D2O
Fig III 18 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude de la sous-uniteacute alpha3 en
complexe avec gamma (aIF2α3γ) en HDXMS par analyse laquo top-down raquo ECD
III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD
L‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine aIF2α3 en complexe avec γ a eacuteteacute suivie au
cours du temps et compareacutee agrave celle qui avait eacuteteacute obtenue pour la sous-uniteacute α3 seule (Fig III
19) Les deux courbes de cineacutetique d‟eacutechange HD preacutesentent la mecircme allure Neacuteanmoins
une diffeacuterence notable au niveau du taux maximal de deuteacuteration a eacuteteacute mise en eacutevidence
apregraves association de la proteacuteine En effet lorsque la proteacuteine a eacuteteacute complexeacutee la valeur
maximale atteinte a diminueacute d‟environ 20 passant de 66 (pour la proteacuteine seule) agrave 48
(pour la proteacuteine en complexe) Ce reacutesultat est encourageant dans la mesure ougrave l‟on attend une
baisse de la deuteacuteration pour α3 apregraves son association avec γ En effet une diminution des
vitesses d‟eacutechange HD est attendue dans la zone d‟interaction des deux sous-uniteacutes
124
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
Sous uniteacute alpha3 seulSous uniteacute alpha3 en complexe
d
eu
teriatio
n
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
5657830388m1
00240560048802m2
5050216726m3
5630328684m4
NA43553Chisq
NA091987R
Temps (minutes)
Pourc
enta
ge
de
deu
teacutera
tion
Fig III 19 Cineacutetiques drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la sous-uniteacute alpha3 seule
(aIF2α3 courbe en noir) et en complexe avec gamma (aIF2α3γ courbe en rouge)
Nous nous sommes ensuite inteacuteresseacutes aux diffeacuterences locales d‟incorporation des
deuteacuteriums pour la proteacuteine en complexe que nous avons compareacutees agrave celles qui avaient eacuteteacute
obtenues pour la proteacuteine seule (Fig III 12) afin de deacuteterminer la surface d‟interaction Pour
cela nous avons repreacutesenteacute comme nous l‟avions fait pour la proteacuteine seule (III2214) le
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par fragments en fonction du numeacutero de reacutesidu
correspondant ainsi que le nombre de deuteacuteriums par acide amineacute calculeacute agrave partir des ions des
deux seacuteries c et z Les reacutesultats sont preacutesenteacutes dans les Fig III 20 et Fig III 21
Ainsi nous avons pu constater que nous n‟avions toujours pas de redistribution aleacuteatoire
totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD car l‟incorporation des deuteacuteriums le long
de la seacutequence ne suit pas la moyenne statistique (Fig III 20)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero du reacutesidu
Ions fragments c
Fig III 20 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion c issu
de la fragmentation ECD drsquoaIF2α3 en fonction de son numeacutero de reacutesidu apregraves une heure
drsquoincubation du complexe aIF2α3γ dans D2O
125
De plus en comparant le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour α3 seule
et α3 en complexe avec γ on a pu mettre en eacutevidence des zones de la proteacuteine qui
eacutechangeaient moins rapidement (flegraveches descendantes Fig III 21) dans le cas de
l‟association des sous-uniteacutes Les graphes montrent eacutegalement des segments peptidiques qui
ont un taux d‟eacutechange plus important (flegraveches ascendantes) ou similaire (signes eacutegal) dans la
proteacuteine en complexe par rapport agrave la proteacuteine seule
Nous avons ensuite repreacutesenteacute les diffeacuterences de deuteacuteration obtenues par reacutesidu ou
segment peptidique entre la proteacuteine α3 seule et en complexe avec γ (deacutetermineacutees agrave partir de
Fig III 21) sur la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (Fig III 22) afin d‟eacutemettre des
hypothegraveses quant agrave la maniegravere dont les sous-uniteacutes se lient entre elles Les reacutesultats montrent
que l‟ensemble de la proteacuteine semble voir la vitesse d‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide
modifieacutee dans le complexe et qu‟il n‟est pas possible de localiser preacuteciseacutement de surface
d‟interaction On notera en particulier que la reacuteduction de vitesse d‟eacutechange aurait pu donner
la zone de contact par une baisse d‟accessibiliteacute mais que la reacuteduction de la vitesse d‟eacutechange
peut aussi ecirctre lieacutee agrave des changements conformationnels ou agrave des variations de la dynamique
de la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ
126
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mbre
de
deu
teacuteri
um
s
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Fig III 21 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus pour la
sous-uniteacute alpha3 seule (aIF2α3 points en noir) sont compareacutes agrave ceux de la sous-uniteacute
alpha3 en complexe avec gamma (aIF2α3γ points en rouge)
Sous-uniteacute 3
N-ter
Heacutelice 2
C-ter
Heacutelice 1
D
Sous-uniteacute
Sous-uniteacute
Fig III 22 Structure tridimensionnelle du complexe aIF2αβγ de S solfataricus obtenu par
cristallographie (16) Zoom sur la sous-uniteacute α3 sur laquelle ont eacuteteacute reporteacutees les diffeacuterences
de deuteacuteration entre la proteacuteine seule et en complexe
127
Nous avons ensuite voulu comparer l‟ETD agrave l‟ECD en termes de sensibiliteacute rapiditeacute et
efficaciteacute de fragmentation avec pour objectif de gagner en reacutesolution spatiale Pour cela nous
avons fragmenteacute en ETD la proteacuteine aIF2α3 et compareacute ces reacutesultats agrave ceux obtenus
auparavant en ECD
III23 Fragmentation par ETD
III231 Spectre de masse
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment ces expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un instrument de type Orbitrap (Fig III 23) Le spectre de masse d‟aIF2α3 a eacuteteacute
obtenu apregraves infusion directe via le systegraveme de seringue refroidie de la proteacuteine agrave la
concentration de 57 microM et apregraves son ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
Fig III 23 Spectre MS drsquoaIF2α3 obtenu sur un spectromegravetre de masse LTQ Orbitrap Velos
apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
128
III232 Reacutesultats obtenus en ETD
Nous avons observeacute le mecircme pheacutenomegravene en ETD qu‟en ECD la couverture de seacutequence
obtenue apregraves seacutelection d‟un eacutetat de charge particulier est moins bonne que celle obtenue sans
seacutelection Le problegraveme est que si on peut travailler sans seacutelection sur le FT-ICR ce nest pas
le cas pour lOrbitrap Nous avons eacutegalement constateacute que comme en ECD le nombre d‟ions
fragments deacutetecteacute eacutetait lieacute agrave l‟eacutetat de charge seacutelectionneacute de la proteacuteine mecircme si une meilleure
couverture de seacutequence est obtenue sans seacutelection Il est classiquement observeacute que plus l‟eacutetat
de charge seacutelectionneacute est important meilleure est la fragmentation En ETD comme en ECD
nous avons observeacute que la fragmentation eacutetait meilleure lorsqu‟un eacutetat de charge pair eacutetait
seacutelectionneacute et qu‟elle eacutetait toujours moins bonne pour les eacutetats de charge impairs Nous avons
donc deacutecideacute de fragmenter en ETD deux eacutetats de charge pairs de la proteacuteine correspondant agrave
l‟eacutetat de charge pair le plus eacuteleveacute et agrave celui le plus intense Dans notre cas les eacutetats de charge
14+ et 12+ ont eacuteteacute seacutelectionneacutes (Fig III 23) pour ecirctre ensuite fragmenteacutes (Fig III 24)
L‟eacutetude des reacutesultats de fragmentation de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 12+ a permis
l‟identification de 51 ions fragments correspondant agrave 29 ions c et 22 ions z dont deux paires
d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de
533 (Fig III 24 (a)) L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ a
quant agrave elle reacuteveacuteleacute la preacutesence de 61 ions fragments correspondant agrave 31 ions c et 30 ions z
dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Une meilleure couverture de seacutequence avec un
pourcentage de 663 a ainsi eacuteteacute obtenue (Fig III 24 (b)) Afin d‟optimiser le pourcentage
de couverture de seacutequence de la proteacuteine trois temps d‟activation (10 15 et 25 ms) d‟une
minute chacun ont eacuteteacute testeacutes conseacutecutivement Il est apparu que la combinaison de tous les
scans enregistreacutes pendant ces trois minutes de fragmentation ETD a permis d‟obtenir le
meilleur reacutesultat de recouvrement de seacutequence L‟option laquo supplemental activation raquo a eacuteteacute
utiliseacutee Sur la base de ces reacutesultats nous avons donc choisi de fragmenter l‟eacutetat de charge
14+ apregraves eacutechange avec ces trois temps d‟activation
129
1102001-01_3_110105164919 300-536 RT 349-648 AV 237 NL 254E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 86974etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
1102001-01_3_110105164919 64-296 RT 048-344 AV 233 NL 257E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 74564etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
Fig III 24 Spectre ETD de la sous-uniteacute aIF2α3 seule sans eacutechange HD avec seacutelection de
lrsquoeacutetat de charge 12+ (a) et 14+ (b) et leur couverture de seacutequence associeacutee
III233 Reacutesultats en HDXETD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ETD De
la mecircme maniegravere qu‟en ECD nous avons proceacutedeacute au marquage d‟aIF2α3 pendant un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure
L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ reacutevegravele eacutegalement apregraves
eacutechange HD une diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence agrave 533 (Fig III
25) au lieu de 663 Nous avons identifieacute au total 49 ions fragments correspondant agrave 25 ions
c et 24 ions z dont aucune paire d‟ions compleacutementaires
(a)
(b)
130
Fig III 25 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ETD de lrsquoeacutetat de charge 14+
Le nombre de fragments identifieacutes dans les spectres ETD est leacutegegraverement plus important
que celui obtenu par ECD En revanche apregraves eacutechange HD en ETD comme en ECD une
importante perte de sensibiliteacute est observeacutee reacuteduisant consideacuterablement le pourcentage de
couverture de seacutequence (Fig III 26) Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment pour l‟ECD
une des ameacuteliorations agrave ce problegraveme serait d‟augmenter la dureacutee d‟analyse pour pouvoir
accumuler (ou combiner en ETD) un plus grand nombre de scans MSMS afin de faire sortir
les petits pics du bruit de fond Lagrave ougrave en ECD nous avions utiliseacute la totaliteacute des dix minutes
d‟analyse autoriseacutees avec le systegraveme de seringue refroidie avant que le laquo back-exchange raquo
devienne un problegraveme majeur en ETD en revanche seulement trois minutes de
fragmentation ont eacuteteacute reacutealiseacutees Ces expeacuteriences HDX eacutetant preacuteliminaires il conviendra par la
suite de profiter des dix minutes que nous disposons avec le systegraveme de seringue refroidie
pour reacutealiser la fragmentation ETD
Neacuteanmoins ces reacutesultats nous ont paru encourageants pour lutilisation de lETD plutocirct que
lECD pour ces approches laquo top-down raquo HDX car lETD est disponible sur un nombre de
spectromegravetres de masse bien plus important que lECD qui reste speacutecifique des FT-ICR
131
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
1102001-02_110111172633 11012011 172634ion transfer tube closed
1102001-02_110111172633 233-453 RT 180-470 AV 221 NL 220E3T FTMS + p ESI sa Full ms2 74973etd1000 [25000-200000]
1080 1085 1090 1095 1100 1105 1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145
mz
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
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85
90
95
100
Rela
tive
Abun
danc
e
11206548
11186450
11226640
11046457
1093632811446618
1132659511096422
1137659710876289
11406533
10849925
11256479
1128648611026351
11111505
10896333
11166401
10986460
10951423
Fig III 26 Comparaison des spectres ECD (en rouge) et ETD (en noir) drsquoaIF2α3 apregraves une
heure drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O Agrandissements des reacutegions du spectre mz
1080-1150 En bleu le spectre ECD de la proteacuteine sans eacutechange HD
III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats drsquoECD
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Xcalibur (Thermo Scientific) La
fenecirctre du logiciel peut ecirctre diviseacutee en trois parties correspondant au chromatogramme au
spectre de masse et agrave la liste de pics associeacutes (Fig III 27) Le spectre ETD de l‟ion preacutecurseur
d‟eacutetat de charge 14+ agrave eacuteteacute geacuteneacutereacute agrave partir du chromatogramme Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment (III232) il reacutesulte de la combinaison des reacutesultats obtenus pour trois temps
d‟activation (10 15 et 25 ms) et correspond agrave une dureacutee d‟analyse d‟environ trois minutes
Les reacutesultats ETD peuvent eacutegalement ecirctre preacutesenteacutes sous forme d‟une liste de pics associant
chaque rapport mz d‟un ion agrave son abondance relative dans le spectre
132
[M+14H]14+
Fragmentation ETD (10 15 et 25 ms)
1 min temps d‟activation
RT ~3 min
Chromatogramme
Spectre ETDListe
des pics
Fig III 27 Preacutesentation de la fenecirctre du logiciel Xcalibur pour le traitement des spectres
ETD
Les reacutesultats ETD sont analyseacutes de la mecircme maniegravere qu‟en ECD Les ions fragments sont
identifieacutes dans les spectres sans eacutechange et apregraves eacutechange Leur masse moyenne pondeacutereacutee est
ensuite deacutetermineacutee dans les deux conditions (sans eacutechange et apregraves eacutechange) Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment est calculeacute en faisant la diffeacuterence de ses deux
masses moyennes pondeacutereacutees et en multipliant le reacutesultat par sa charge Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu est finalement deacuteduit par soustraction du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par deux ions fragments conseacutecutifs Dans le cas ougrave les ions fragments
ne sont pas conseacutecutifs cette diffeacuterence de deuteacuteriums incorporeacutes est moyenneacutee sur
l‟ensemble des acides amineacutes les seacuteparant Les reacutesultats ETD ont eacuteteacute compareacutes agrave ceux qui
avaient eacuteteacute obtenus par ECD (Fig III 28)
133
0
02
04
06
08
1
12
14
0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
0
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04
06
08
1
12
14
0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Fig III 28 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute apregraves une
heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus en ETD (points en vert) sont compareacutes agrave
ceux obtenus en ECD (points en rose et en bleu respectivement pour les seacuteries drsquoions c et z)
Le taux de deuteacuteration de la proteacuteine entiegravere est de 66 en ECD contre 60 en ETD
Le premier constat agrave l‟issue de l‟analyse des reacutesultats ETD a eacuteteacute l‟obtention de nombres de
deuteacuteriums incorporeacutes supeacuterieurs agrave la valeur maximale attendue (gt 1) pour quelques reacutesidus
Deux hypothegraveses peuvent expliquer ce reacutesultat La premiegravere consiste agrave penser que le lavage
des chaicircnes lateacuterales n‟a pas eacuteteacute total Autrement dit il resterait des deuteacuteriums au niveau des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes qui n‟auraient pas eacuteteacute reacute-eacutechangeacutes avant l‟analyse
Cependant nous avons utiliseacute le mecircme protocole de marquage et le mecircme systegraveme
d‟introduction des eacutechantillons pour l‟analyse des eacutechanges isotopiques par ETD par rapport agrave
celle qui avait eacuteteacute reacutealiseacutee en ECD Or de telles valeurs n‟ont pas eacuteteacute obtenues en ECD
Notons ici que dans le cas de l‟analyse des ions z les zones pour lesquelles on obtient des
valeurs anormales en ETD correspondent agrave des reacutegions de la proteacuteine pour lesquelles tregraves peu
134
d‟informations en ECD avaient eacuteteacute extraites (incorporation moyenne de deuteacuteriums sur une
dizaine d‟acides amineacutes) La seconde hypothegravese repose sur le fait qu‟en ETD certains ions
fragments suivis apregraves eacutechange HD n‟auraient pas eacuteteacute correctement attribueacutes Des
expeacuteriences de MSMS sur ces ions fragments (expeacuteriences de MS3) permettraient de
confirmer ou d‟infirmer cette hypothegravese Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes mais n‟ont
malheureusement pas eacuteteacute concluants La faible intensiteacute des fragments obtenus par MS3 ne
nous a pas permis d‟identifier les ions fragments issus de la MSMS Un problegraveme de fuite au
niveau du montage de seringue refroidie en a eacuteteacute probablement la cause Nous n‟avons pas eu
le temps de reproduire les expeacuteriences
Neacuteanmoins on obtient une relativement bonne correacutelation pour les ions fragments c si on
compare les reacutesultats ETD agrave ceux obtenus en ETD tandis que des diffeacuterences notoires
d‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu pour les ions fragments z sont observeacutees Les
graphes ne se superposent pas agrave l‟exception de petites zones qui s‟alignent entre elles
III235 Conclusion
Contrairement aux analyses reacutealiseacutees en ECD les expeacuteriences ETD requiegraverent la seacutelection
preacutealable d‟un eacutetat de charge Malgreacute cette contrainte une couverture de seacutequence
leacutegegraverement meilleure a eacuteteacute obtenue en ETD (sans eacutechange et apregraves eacutechange HD) Elle a eacuteteacute
deacuteduite de la combinaison de spectres enregistreacutes pour trois temps d‟activation diffeacuterents (10
15 et 25 ms) correspondant agrave trois minutes de fragmentation au total Les spectres ECD
reacutesultent quant agrave eux de l‟accumulation de scans correspondant agrave la dissociation de la
proteacuteine par un faisceau d‟eacutelectrons d‟eacutenergie cineacutetique et de temps d‟irradiation fixeacutes
pendant dix minutes d‟analyse
Nous avons ensuite deacutecideacute de comparer la fragmentation CID sur des ions preacutecurseurs de
haut eacutetat de charge afin de limiter le laquo scrambling raquo (10) vs les meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECD et ETD)
135
III24 Fragmentation par CID
III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3
III2411 Spectres de masse
La proteacuteine aIF2α3 a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacutee par une approche HDX laquo top-down raquo CID La
premiegravere eacutetape a consisteacute agrave reacutealiser les spectres de masse sans eacutechange et apregraves eacutechange HD
gracircce agrave un instrument de type Q-ToF La proteacuteine deuteacutereacutee a eacuteteacute injecteacutee dans le spectromegravetre
de masse par le systegraveme de seringue refroidie puis ioniseacutee par eacutelectrospray dans des
conditions deacutenaturantes La faible reacutesolution de l‟instrument (Fig III 29) nous a ensuite
obligeacutes agrave veacuterifier les fenecirctres d‟isolation avant la fragmentation par CID Finalement les
eacutenergies de collision ont eacuteteacute optimiseacutees pour chaque eacutetat de charge
Sans eacutechange HD
Apregraves eacutechange HD
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
Fig III 29 Spectres MS drsquoaIF2α3 obtenus sans eacutechange (courbe rouge) et apregraves eacutechange
HD pendant une heure (courbe verte) agrave lrsquoaide drsquoun spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
Un agrandissement de lrsquoion preacutecurseur drsquoeacutetat de charge 13+ a eacuteteacute ajouteacute
136
III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID
L‟analyse des spectres CID des ions preacutecurseurs d‟eacutetat de charge 10+ agrave 16+ de la proteacuteine
aIF2α3 dans H2O a permis l‟identification d‟un total de 54 ions fragments correspondant agrave 23
ions b et 31 ions y dont deux paires d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de
seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 565 (Fig III 30 (a)) Il regroupe l‟ensemble de tous les ions
fragments identifieacutes dans les spectres correspondant agrave la dissociation des diffeacuterents eacutetats de
charge Apregraves incubation de la proteacuteine dans D2O pendant une heure et fragmentation par
CID seulement 20 ions fragments au total ont pu ecirctre suivis correspondant agrave 14 ions b et 6
ions y dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de la couverture de
seacutequence a ainsi eacuteteacute reacuteduit agrave 217 apregraves eacutechange HD (Fig III 30 (b))
b ions y ions Fig III 30 Pourcentages de couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 sans eacutechange (a) et apregraves
eacutechange HD (b) obtenus par fragmentation CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave
16+
La Fig III 31 illustre la complexiteacute du traitement des donneacutees en CID De la mecircme
maniegravere qu‟en ECD ou en ETD l‟analyse a consisteacute agrave deacuteterminer des masses moyennes
pondeacutereacutees d‟ions fragments La reacutesolution relativement faible de l‟instrument ainsi que la
faible abondance de certains ions fragments ont contribueacute agrave la diminution du nombre de
fragments pouvant ecirctre suivis apregraves eacutechange HD Ainsi le fragment b375+
a pu ecirctre interpreacuteteacute
dans les spectres de fragmentation par CID des ions preacutecurseurs 12+ agrave 16+ mais pas dans
ceux des eacutetats de charge 10+ et 11+ (Fig III 31) D‟autres (eg y2+ y3
+ y4
+ hellip) n‟ont pu ecirctre
suivis dans aucun des spectres (Fig III 30)
(a)
(b)
137
b375+[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+16H]16+
[M+11H]11+
[M+13H]13+
Fig III 31 Spectres CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave 16+ Agrandissement
(a) de la reacutegion mz 832-852 permettant de suivre le massif isotopique de lrsquoion fragment b375+
dans les diffeacuterents eacutetats de charge et (b) du massif isotopique lui-mecircme dans les eacutetats de
charge 11+ et 13+ pour montrer la complexiteacute de lrsquoanalyse
Nous avons ensuite calculeacute le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par les fragments qu‟il
nous eacutetait possible de suivre apregraves eacutechange HD dans les spectres CID des diffeacuterents eacutetats de
charge Nous avons reporteacute ces valeurs en fonction du numeacutero de reacutesidu dans la seacutequence
(Fig III 32) Rappelons que la ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la
seacutequence de tous les deuteacuteriums incorporeacutes dans la proteacuteine Il s‟agit donc dune courbe
theacuteorique Elle donne le nombre moyen de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment
calculeacute agrave partir du contenu maximal en deuteacuteriums de la proteacuteine Dans le cas que nous
preacutesentons qui correspond agrave un temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte
(a)
(b)
138
eacutetait marqueacutee agrave 57 Chaque point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de
057 deuteacuterium par reacutesidu
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Courbe theacuteorique
11+
12+
13+
14+
15+
16+
Numeacutero du reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments b ( Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
11+
13+15+14+
11+
14+15+
13+
12+
Fig III 32 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment b issus de la dissociation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 11+ agrave 16+ en
fonction de son numeacutero de reacutesidu La proteacuteine a eacuteteacute incubeacutee pendant une heure dans D2O
avant analyse
A la vue de ces reacutesultats on note que tous les points expeacuterimentaux ne sont pas aligneacutes sur
la courbe theacuteorique Par conseacutequent nous pouvons conclure de ce premier constat que nos
expeacuteriences HDXCID ne semblent pas aboutir agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des
deuteacuteriums le long de la chaicircne peptidique On remarque eacutegalement que les points
correspondant agrave la fragmentation du plus petit eacutetat de charge le 11+ (points en rouge sur la
Fig III 32) sont effectivement les plus proches de la redistribution totale des deuteacuteriums
Ainsi il semble reacuteellement y avoir un rapport entre le taux de redistribution HD et leacutetat de
charge du preacutecurseur Neacuteanmoins il est curieux dobserver que cest lion chargeacute 13+ qui
conduit aux ions fragments les plus eacuteloigneacutes de cette redistribution totale
Nous avons ici voulu reproduire les expeacuteriences HDXCID meneacutees tregraves reacutecemment par
l‟eacutequipe d‟I Kaltashov (10) sur notre systegraveme d‟eacutetude Ils ont montreacute qu‟il eacutetait possible
d‟analyser les eacutechanges isotopiques HD au sein des proteacuteines par une approche laquo top-down raquo
associeacutee agrave une activation collisionnelle (CID) En effet la seacutelection et la dissociation d‟ions
139
proteacuteiques de hauts eacutetats de charge limiteraient le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Or dans son
article I Kaltashov n‟a consideacutereacute qu‟un seul fragment le b19 pour en arriver agrave cette
conclusion Il ne s‟est donc inteacuteresseacute qu‟aux reacutesultats contenus sur une verticale du graphe
Dans notre cas si on se place au niveau des deux verticales que nous avons traceacutees sur la Fig
III 32 nos reacutesultats sont coheacuterents avec ceux de l‟article En revanche la discrimination nette
entre les grands et les petits eacutetats de charge n‟est pas toujours eacutevidente et parfois les reacutesultats
contredisent ceux obtenus par I Kaltashov
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines
Pour rendre l‟eacutetude du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo plus facile agrave mettre en eacutevidence
l‟article de I Kaltashov (10) se basait sur l‟utilisation d‟une eacutetiquette poly-histidines placeacutee agrave
l‟extreacutemiteacute soit N- soit C-terminale de la proteacuteine qu‟ils ont eacutetudieacutee L‟inteacuterecirct eacutetait que ces
segments sont connus comme eacutetant non structureacutes et qu‟on peut par conseacutequent preacutedire que la
vitesse d‟eacutechange y sera maximale par rapport agrave la partie structureacutee de la proteacuteine Dans le
cadre de leurs expeacuteriences la proteacuteine est initialement totalement marqueacutee par des deuteacuteriums
par dissolution dans du D2O et l‟incubation se fait en conditions natives apregraves dilution dans un
tampon H2O 10 mM aceacutetate d‟ammonium De ce fait on attend une perte rapide de la
deuteacuteration sur l‟extreacutemiteacute poly-histidines des proteacuteines Ils observent ainsi (Fig III 33) que
l‟activation par CID conduit agrave un laquo scrambling raquo important pour les eacutetats de charge faibles (9+
agrave 11+) alors qu‟il est nettement reacuteduit pour les eacutetats de charge 14+ agrave 20+
Nous avons souhaiteacute construire un systegraveme eacutequivalent pour notre proteacuteine aIF2α3 afin de
voir si nous aussi en CID pouvions mettre en eacutevidence la preacutesence de laquo scrambling raquo ou non
Pour cela nous avons construit un mutant de la proteacuteine aIF2α3 et l‟avons exprimeacute en
collaboration avec le Laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique La seacutequence de ce
mutant est donneacutee sur la Fig III 34
140
22 D
11 D
Avec Redistribution des D
Sans redistribution des D
Segment non structureacute de 21 acides amineacutes
Fig III 33 Nombre moyen de deuteacuteriums pour le fragment b19 en fonction de lrsquoeacutetat de charge
de lrsquoion preacutecurseur Les lignes horizontales en gris indiquent le nombre moyen de deuteacuteriums
calculeacute dans le cas drsquoune redistribution aleacuteatoire totale des hydrogegravenes et deuteacuteriums labiles
au sein de lrsquoion preacutecurseur avant la dissociation (en haut) et dans le cas de lrsquoabsence de
pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo (en bas)
Fig III 34 Seacutequence drsquoaIF2α3 comportant lrsquoeacutetiquette poly-histidines (acides amineacutes en vert)
En rose les fragments eacutetudieacutes par HDXCID
Notons degraves maintenant qu‟il nous eacutetait impossible de reproduire exactement l‟expeacuterience
d‟I Kaltashov avec notre proteacuteine en effet elle est instable dans des conditions non-salines
et ne peut ecirctre lyophiliseacutee Par conseacutequent il sera neacutecessaire de proceacuteder par un double
eacutechange tel que fait jusqu‟agrave preacutesent ie commencer par diluer la proteacuteine dans une solution
D2O NaCl 330 mM puis arrecircter l‟eacutechange par une dilution frac12 dans une solution H2O acide
formique 2 avant de proceacuteder au dessalage sur colonne De ce fait on ne profite plus de
l‟aspect deacutestructureacute de la chaicircne poly-histidines (qui sera rapidement deuteacutereacutee dans l‟eacutetape
d‟eacutechange) mais de la grande vitesse de reacute-eacutechange de la chaicircne poly-histidines une fois celle-
ci placeacutee en condition d‟arrecirct tel qu‟observeacute sur les peptides de T Joslashrgensen au Chap II On
peut consideacuterer que l‟eacutechange inverse (laquo back-exchange raquo) sera de la mecircme faccedilon que pour le
141
peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) nettement plus rapide sur la partie poly-histidines que sur le
reste de la seacutequence proteacuteique
Nous avons ensuite eacutetudieacute par HDXCID les fragments b2-10 correspondant aux fragments
situeacutes dans l‟eacutetiquette poly-histidines (en vert sur Fig III 34) ainsi que les fragments
communs avec ceux de la proteacuteine sans poly-histidines soit les fragments b21-22 et b28
correspondant aux fragments b9-10 et b16 de la proteacuteine sans eacutetiquette poly-histidines Les
reacutesultats obtenus sont preacutesenteacutes dans la Fig III 35 Ils sont compareacutes agrave ceux de la Fig III 32
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 20 25 30
Courbe theacuteorique
17+
16+
15+
14+
13+17+
14+
16+15+
17+
14+
16+
15+
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Numeacutero du reacutesidu
Fig III 35 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums contenus dans les ions b issus de la
fragmentation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 13+ agrave 17+ en fonction de leur
position dans la seacutequence (numeacutero de reacutesidu) La proteacuteine laquo taggeacutee raquo a eacuteteacute incubeacutee pendant
une heure dans D2O Son analyse en MS reacutevegravele un pourcentage de deuteacuteration de 57
On constate tout d‟abord que les fragments b2 agrave b10 preacutesentent un taux de deuteacuteration
largement infeacuterieur (jusqu‟agrave 2 D d‟eacutecart pour b10) agrave la courbe de laquo scrambling raquo complet Ceci
montre deux choses Le premier reacutesultat est que le laquo scrambling raquo est tregraves loin d‟ecirctre total sur
cette reacutegion Par conseacutequent mecircme en cas de laquo scrambling raquo partiel ce reacutesultat ne peut ecirctre
obtenu que si la deuteacuteration locale est tregraves infeacuterieure agrave la moyenne sur lensemble de la
proteacuteine On peut donc en deacuteduire ce second reacutesultat comme nous lavions espeacutereacute un laquo back-
exchange raquo rapide des hydrogegravenes damide des histidines a bien eu lieu On ne peut pas par
contre savoir si ce laquo back-exchange raquo a eacuteteacute total ou pas On note par ailleurs que dans cette
142
partie de la proteacuteine l‟eacutetat de charge ne semble pas jouer un rocircle important sur la deuteacuteration
nettement moins en tout cas que les effets observeacutes pour la proteacuteine sans eacutetiquette
Si on s‟inteacuteresse maintenant aux fragments b21-22 et b28 on constate une dispersion des
niveaux de deuteacuteration nettement reacuteduite par rapport agrave celle de la proteacuteine non-marqueacutee et en
tout cas sans aucune rupture brutale similaire agrave celle preacutesenteacutee dans l‟article d‟I Kaltashov Il
est par contre difficile de comparer un agrave un les niveaux de deuteacuteration car on ne connaicirct pas a
priori le niveau de deuteacuteration restant sur la partie poly-histidines Toutefois on notera
qu‟entre les fragments b22 et b28 de la proteacuteine portant un His-tag on a 35 D de diffeacuterence On
retrouve une diffeacuterence similaire entre les fragments b10 et b16 de la proteacuteine portant un His-
tag
Pour compleacuteter ce travail il nous manque un eacuteleacutement qui est la veacuterification du taux reacuteel de
deuteacuteration sur la partie poly-histidines Ce travail reste agrave faire avec un suivi par ECD en
faisant l‟hypothegravese d‟une absence de laquo scrambling raquo dans ce cas
Mais au final une tendance nette semble neacuteanmoins se deacutegager dans une approche laquo top-
down raquo l‟activation par CID ne conduit pas neacutecessairement agrave un laquo scrambling raquo total des
deuteacuteriums d‟amide au moins dans certaines conditions L‟article d‟I Kaltashov semble avoir
identifieacute l‟eacutetat de charge comme eacutetant un facteur Dans notre cas l‟eacutetat de charge ne semble
pas jouer un rocircle aussi marqueacute Mais il faut noter d‟une part que l‟article d‟I Kaltashov
comme notre approche avec le His-tag n‟ont regardeacute le laquo scrambling raquo qu‟au niveau des
extreacutemiteacutes de la proteacuteine et d‟autre part que dans les deux cas un laquo scrambling raquo partiel
semble observeacute puisqu‟il reste une fraction de deuteacuteriums au niveau de l‟extreacutemiteacute
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en
eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse
Les expeacuteriences sont difficilement reproductibles par une mecircme technique ce qui
complique la comparaison entre les diffeacuterentes meacutethodes Plusieurs raisons permettent
d‟expliquer ce fait Tout d‟abord il est tregraves difficile d‟obtenir le mecircme pourcentage initial de
deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere De plus l‟efficaciteacute de fragmentation varie en fonction du
de l‟instrument mais aussi en fonction du temps pour un mecircme instrument N‟oublions pas de
mentionner eacutegalement les problegravemes techniques que nous avons rencontreacutes qui sont lieacutes au
143
montage de seringue refroidie et qui concernent la fuite du systegraveme Un autre fait surprenant
est que nous ne sommes pas parvenus apregraves des temps longs d‟incubation dans D2O agrave un
maximum de deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere proche des 90-95 deacutecrits dans la
litteacuterature En effet le taux maximal de deuteacuteration obtenu pour aIF2α3 si on se reacutefegravere au
laquo fit raquo de double exponentielle de sa cineacutetique d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) a
eacuteteacute de 66 seulement A partir de ce constat deux hypothegraveses peuvent ecirctre formuleacutees
- nous ne sommes pas arriveacutes au bout de la cineacutetique d‟eacutechange de la proteacuteine Dans ce cas
des temps d‟incubation dans D2O plus longs seraient neacutecessaires pour que les hydrogegravenes
d‟amide qui preacutesentent des vitesses d‟eacutechange tregraves lentes finissent par s‟eacutechanger Le laquo fit raquo
de la cineacutetique serait alors agrave revoir
- d‟importantes pertes de deuteacuteriums sont enregistreacutees ce qui n‟est pas souhaitable et pose
le problegraveme de l‟interpreacutetation des reacutesultats
Afin de deacutepartager ces deux hypothegraveses et ainsi de mieux comprendre le sens de nos
reacutesultats nous avons deacutecideacute de deacuteterminer la valeur maximale de reacutefeacuterence ie le taux
maximal de deuteacuteration pour la proteacuteine aIF2α3 Pour cela la proteacuteine a eacuteteacute analyseacutee avec le
mecircme protocole qui a eacuteteacute deacutecrit dans la Fig III 5 agrave l‟exception pregraves qu‟elle a eacuteteacute initialement
placeacutee dans des conditions deacutenaturantes et non plus natives
Afin de deacuteterminer le taux maximal de deuteacuteration de la proteacuteine aIF2α3 nous avons donc
deacutecideacute de la deacutenaturer avec du chlorure de guanidinium preacutealablement agrave l‟analyse HDXMS
Il a eacuteteacute montreacute que ce composeacute chaotropique utiliseacute agrave forte concentration eacutetait capable de
deacutenaturer totalement les proteacuteines (17) ce qui rendrait tous les hydrogegravenes d‟amide
accessibles agrave l‟eacutechange
La proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M
dans D2O agrave 50degC sous agitation pendant 24 heures Puis elle a eacuteteacute analyseacutee en MS afin de
calculer son taux de deuteacuteration Malheureusement aucun signal n‟a eacuteteacute deacutetecteacute indiquant
que la proteacuteine a eacuteteacute deacutegradeacutee ou a preacutecipiteacute suite au traitement chimique La seacutequence de la
proteacuteine aIF2α3 ne comportant que tregraves peu d‟acides amineacutes aromatiques (seulement trois
tyrosines) n‟a pas permis la mesure de la concentration de l‟eacutechantillon par
spectrophotomeacutetrie UV agrave 280 nm Par ailleurs la solution de chlorure de guanidinium quant
agrave elle absorbe agrave la longueur donde utiliseacutee pour les proteacuteines
144
Dans le but de tester si le traitement chimique pour la deacutenaturation deacutegrade la proteacuteine
nous avons deacutecideacute de reacutealiser un gel SDS-PAGE 16 permettant de tester la preacutesence
d‟aIF2α3 (10 kDa) Nous avons eacutegalement souhaiteacute tester si c‟est l‟eacutetape de dessalage qui
conduit agrave la perte de la proteacuteine Pour cela un autre eacutechantillon traiteacute mais non dessaleacute agrave eacuteteacute
preacutepareacute Malheureusement les eacutechantillons sont si visqueux qu‟il est impossible de les
deacuteposer L‟origine de cette viscositeacute n‟est pas tregraves claire neacuteanmoins un temps d‟incubation de
24 heures dans le chlorure de guanidinium semble trop long
Nous avons donc reacutealiseacute d‟autres tests dans des conditions diffeacuterentes afin de deacuteterminer le
temps maximal d‟incubation dans le chlorure de guanidinium pour lequel la proteacuteine n‟est pas
deacutegradeacutee Diffeacuterents temps d‟incubation ont eacuteteacute testeacutes t0=0s t=5h et t=24h Pour chaque
temps d‟incubation le premier eacutechantillon proteacuteique n‟a pas eacuteteacute dessaleacute tandis que le second
l‟a eacuteteacute (Fig III 36) Dans le cas ougrave une eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee (puits 4 6 et 8) la
solution d‟eacutelution correspondant agrave la proteacuteine dans H2OACNAF (49492) a eacuteteacute eacutevaporeacutee
par SpeedVac pour ecirctre ensuite resuspendue dans H2O afin de faciliter son deacutepocirct sur gel apregraves
ajout du tampon Laemmli Sans dessalage la proteacuteine traiteacutee au chlorure de guanidinium est
dilueacutee dans H2OAF2 afin de mimer l‟eacutetape d‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange (Fig III 5)
Les eacutechantillons non dessaleacutes sont ensuite preacutepareacutes avec du tampon Laemmli Neacuteanmoins agrave
l‟issue du meacutelange avec le tampon les eacutechantillons ont preacutecipiteacute empecircchant leur deacutepocirct preacutevu
dans les puits 3 5 et 7 Ce qui explique l‟absence de bandes dans ces puits et donc l‟absence
de proteacuteine Un marqueur de poids moleacuteculaire a eacuteteacute deacuteposeacute dans le premier puits Il s‟agit
d‟un meacutelange de proteacuteines de reacutefeacuterence dont la taille est connue servant agrave estimer la taille des
moleacutecules d‟inteacuterecirct Un teacutemoin positif a eacuteteacute deacuteposeacute dans le deuxiegraveme et dernier puits Il est
constitueacute de la proteacuteine aIF2α3 n‟ayant pas subi de traitement chimique ni de dessalage Une
bande intense autour de 10 kDa est observeacutee dans ces deux puits teacutemoignant de la preacutesence de
la proteacuteine Une mecircme quantiteacute de mateacuteriel (18 microg) a eacuteteacute deacuteposeacutee dans tous les puits lorsque
le deacutepocirct eacutetait possible
145
Marqueurα3H2O
α3G3M agrave t0
sans incubation
avec dessalage
α3G3M
avec incubation de 5h
et dessalage
α3G3M avec
incubation de 24h
et dessalage
α3H2O
Jour + 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
18 microg 18 microg 18 microg 18 microg 18 microg
10 kDa
Fig III 36 Image du gel SDS-PAGE 16 La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute deacutenatureacutee apregraves
diffeacuterents temps drsquoincubation dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M Pour
chaque temps drsquoincubation deux eacutechantillons sont testeacutes sans et avec lrsquoeacutetape de dessalage
La proteacuteine aIF2α3 est preacutesente dans les puits 4 et 6 alors qu‟elle a subi le traitement
chimique avec le chlorure de guanidinium et l‟eacutetape de dessalage mais elle n‟est pas retrouveacutee
dans le puits 8 Pourtant dans ce cas lagrave elle a aussi eacuteteacute traiteacutee par le chlorure de guanidinium
mais pendant un temps beaucoup plus long (24 heures) et dessaleacutee
Par conseacutequent on peut conclure que c‟est le temps du traitement chimique (incubation
dans une solution de chlorure de guanidinium 3 M agrave 50degC sous agitation) qui est critique
dans le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine En effet la proteacuteine aIF2α3 est deacutegradeacutee suite agrave
une incubation pendant une dureacutee de vingt-quatre heures tandis qu‟elle est toujours preacutesente
pour un temps d‟incubation infeacuterieur ou eacutegal agrave cinq heures
Le taux de deuteacuteration maximal de la proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute deacutetermineacute par
spectromeacutetrie de masse apregraves deacutenaturation de la proteacuteine dans une solution de chlorure de
guanidinium 3 M preacutepareacutee dans du D2O Les temps d‟incubation t=1h et t=5h ont eacuteteacute testeacutes
(Tab III 1)
Nous obtenons des pourcentages de deuteacuteration leacutegegraverement plus eacuteleveacutes dans le cas d‟une
deacutenaturation de la proteacuteine pendant des temps d‟une heure et cinq heures (73) par rapport agrave
une incubation classique dans D2O (66) Afin de s‟assurer que la proteacuteine a bien eacuteteacute
deacutenatureacutee par le traitement chimique d‟autres conditions ont eacuteteacute testeacutees tempeacuterature
146
d‟incubation de 95degC concentration en chlorure de guanidinium de 6 M Les reacutesultats sont
preacutesenteacutes dans le Tab III 2 Malgreacute diffeacuterentes conditions de deacutenaturation testeacutees nous
n‟obtenons pas de pourcentage de deuteacuteration proche de la limite supeacuterieure de 875 donneacutee
par la dilution agrave 18 de la solution H2O dans du D2O
Tab III 1 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions natives (0 M de deacutenaturant) et
deacutenaturantes (3 M de deacutenaturant) La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee soit dans un tampon
NaCl 330 mMD2O (conditions natives) soit dans une solution de chlorure de guanidinium 3
MD2O (conditions deacutenaturantes) pendant des temps variables Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee
avant drsquoecirctre analyseacutee par MS La valeur de reacutefeacuterence (66) obtenue dans des conditions
natives est indiqueacutee Une valeur moyenne (triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes
conditions deacutenaturantes
Concentration
du deacutenaturant 0 M 3 M 3 M
Conditions
drsquoincubation 1 h
37degC 600 rpm 1 h
50degC 700 rpm 5 h
50degC 700 rpm
Taux de
deuteacuteration 66 73 73
Tab III 2 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions deacutenaturantes La proteacuteine
aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidiniumD2O dans diffeacuterentes
conditions Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee avant drsquoecirctre analyseacutee par MS Une valeur moyenne
(triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes conditions
Concentration
du deacutenaturant 3 M 6 M
Conditions
drsquoincubation 5 min
95degC 700 rpm 1 h
50degC 700 rpm Taux de
deuteacuteration 70 72
En reconsideacuterant donc les deux hypothegraveses formuleacutees preacuteceacutedemment il semblerait que le
pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse soit important dans nos conditions expeacuterimentales Il a lieu en
solution avant l‟analyse finale en MS lors de la preacuteparation des eacutechantillons (eacutetape de
dessalage) et au cours de leur introduction dans le spectromegravetre de masse avec le systegraveme de
seringue refroidie utiliseacute
Afin de mettre en eacutevidence l‟influence de l‟eacutetape de dessalage sur l‟eacutechange inverse nous
avons mesureacute les pourcentages de deuteacuteration de peptide et proteacuteine modegraveles complegravetement
deuteacutereacutes avec notre systegraveme de seringue refroidie La substance P (peptide de onze reacutesidus) a
donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution ACND2O (7525) pendant une heure agrave 37degC sous
agitation La reacuteaction d‟eacutechange a eacuteteacute arrecircteacutee par diminution du pH et de la tempeacuterature puis
147
le peptide totalement marqueacute a eacuteteacute dilueacute dans H2OACNAF (49492) afin d‟ecirctre analyseacute par
MS L‟expeacuterience a eacuteteacute reconduite une seconde fois mais en incluant l‟eacutetape de dessalage
avant l‟analyse par MS Sur le FT-ICR les pourcentages moyens (triplicats) de deuteacuteration
obtenus sont les suivants 914 sans l‟eacutetape de dessalage et 77 avec l‟eacutetape de dessalage
Sur le Q-TOF le taux maximum sans dessalage n‟atteint que 856 indiquant que c‟est bien
l‟introduction dans la source qui conduisait agrave un accroissement du laquo back-exchange raquo sur
celui-ci Il semblerait que l‟eacutetape de dessalage conduise agrave une perte d‟environ 15 de la
totaliteacute du marquage pour les peptides Il convient de noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees directement agrave partir de la poudre donc sans dilution initiale Par conseacutequent si on
considegravere les 77 de deuteacuteration obtenus apregraves dessalage appliqueacutes sur une solution agrave 875
de deuteacuteriums on trouve un maximum de deuteacuteration de 67 soit assez proche des 72-73
obtenus apregraves deacutenaturation complegravete
III4 Conclusion
Nos reacutesultats montrent qu‟il est possible deacuteviter une redistribution des deuteacuteriums dans la
seacutequence polypeptidique au moment de la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines par
approches laquo top-down raquo L‟ECD et l‟ETD semblent preacutesenter une bonne capaciteacute agrave garder la
localisation initiale des deuteacuteriums Dans le cas de l‟activation par CID nos reacutesultats
rejoignent ceux de la litteacuterature en restant incertains il ne nous a pas eacuteteacute possible ni de
montrer l‟absence de laquo scrambling raquo ni de montrer un laquo scrambling raquo complet tombant ainsi
dans une zone intermeacutediaire ougrave les paramegravetres controcirclant l‟extensiviteacute du laquo scrambling raquo
restent incertains
Un autre enseignement de cette partie est qu‟un des problegravemes majeurs de notre approche
est leacutechange inverse qui a lieu en solution avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Ce
pheacutenomegravene est accentueacute dans notre cas par lobligation que nous avons deffectuer une eacutetape
de dessalage des proteacuteines avant leur analyse et la difficulteacute agrave savoir ce qui relegraveve de cette
eacutetape ou de la source dionisation Un autre problegraveme lieacute agrave celui-lagrave est quil est difficile
daccumuler un grand nombre de spectres car au bout dune dizaine de minutes leacutechange
inverse est devenu trop important
Dans ce contexte et avec lideacutee de controcircler beaucoup mieux leacutechange inverse nous avons
deacutecideacute de deacutevelopper un systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
148
spectromegravetre de masse complegravetement nouveau baseacute sur l‟utilisation d‟une enceinte isoleacutee
refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui eacutevite le
deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des deacutebits
faibles Le deacuteveloppement de cette laquo cryosource raquo et les premiers reacutesultats obtenus en
lutilisant font lobjet du dernier chapitre de cette thegravese
149
III5 Bibliographie
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12808
7 Pan J Han J Borchers C H and Konermann L (2010) Characterizing short-lived
protein folding intermediates by top-down hydrogen exchange mass spectrometry
Anal Chem 82 8591-8597
8 Pan J Han J Borchers C H and Konermann L (2008) Electron capture
dissociation of electrosprayed protein ions for spatially resolved hydrogen exchange
measurements J Am Chem Soc 130 11574-11575
9 Abzalimov R R Kaplan D A Easterling M L and Kaltashov I A (2009)
Protein conformations can be probed in top-down HDX MS experiments utilizing
electron transfer dissociation of protein ions without hydrogen scrambling J Am Soc
Mass Spectrom 20 1514-1517
10 Abzalimov R R and Kaltashov I A (2010) Controlling hydrogen scrambling in
multiply charged protein ions during collisional activation implications for top-down
hydrogendeuterium exchange MS utilizing collisional activation in the gas phase
Anal Chem 82 942-950
11 Rand K D Adams C M Zubarev R A and Jorgensen T J (2008) Electron
capture dissociation proceeds with a low degree of intramolecular migration of peptide
amide hydrogens J Am Chem Soc 130 1341-1349
12 Zehl M Rand K D Jensen O N and Jorgensen T J (2008) Electron transfer
dissociation facilitates the measurement of deuterium incorporation into selectively
labeled peptides with single residue resolution J Am Chem Soc 130 17453-17459
13 Kaltashov I A Bobst C E and Abzalimov R R (2009) HD exchange and mass
spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics is there a need for a
top-down approach Anal Chem 81 7892-7899
14 Sterling H J and Williams E R (2010) Real-Time HydrogenDeuterium Exchange
Kinetics via Supercharged Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry
Analytical Chemistry 82 9050-9057
15 Duchateau M (2010) Deacutetermination de surface dinteraction dassemblages
biologiques macromoleacuteculaires par marquage au deuteacuterium et analyse par
spectromeacutetrie de masse FT-ICR
150
16 Yatime L Mechulam Y Blanquet S and Schmitt E (2007) Structure of an
archaeal heterotrimeric initiation factor 2 reveals a nucleotide state between the GTP
and the GDP states P Natl Acad Sci USA 104 18445-18450
17 Tanford C (1968) Protein denaturation Adv Protein Chem 23 121-282
151
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source
refroidie
152
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169
IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186
IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
153
IV1 Echange inverse
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment dans la partie introductive l‟association des
eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium en solution avec la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode de choix pour obtenir des informations sur la structure
tridimensionnelle d‟une proteacuteine ou sur son changement de conformation induit par la fixation
d‟un ligand ou d‟un partenaire proteacuteique Neacuteanmoins cette approche souffre de deux
limitations importantes (i) l‟eacutechange inverse ou laquo back-exchange raquo qui peut avoir lieu en
solution agrave diffeacuterentes eacutetapes de l‟expeacuterience et (ii) la migration intramoleacuteculaire des protons
et des deuteacuterons ou laquo scrambling raquo qui peut se deacuterouler en phase gazeuse particuliegraverement
au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) Ces deux processus
doivent ecirctre minimiseacutes pour obtenir des reacutesultats interpreacutetables Nous avons vu dans le Chap
II que la minimisation du laquo scrambling raquo neacutecessitait une optimisation minutieuse et speacutecifique
des potentiels de la source d‟ionisation et des optiques de transfert ionique afin de rendre
minimale l‟excitation vibrationnelle des ions peptidiques deuteacutereacutes Les paramegravetres
instrumentaux ne peuvent neacuteanmoins pas ecirctre directement transfeacutereacutes d‟un instrument agrave un
autre Il convient donc d‟optimiser individuellement les diffeacuterents reacuteglages de l‟instrument
quand on en change pour eacuteviter la redistribution aleacuteatoire des hydrogegravenes et deuteacuteriums Cela
peut ecirctre commodeacutement reacutealiseacute par l‟utilisation de peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
servant de sonde du laquo scrambling raquo pendant la fragmentation ECD ou ETD (1-3)
Ce dernier chapitre de ma thegravese est consacreacute agrave la minimisation du laquo back-exchange raquo lors
d‟expeacuteriences HDXMS En effet l‟eacutechange inverse reste et demeure une neacutecessiteacute mais
eacutegalement un problegraveme seacuterieux inheacuterent agrave la technique HDX Il conduit agrave une variation du
nombre de deuteacuteriums entre l‟eacutetape de marquage et l‟analyse finale par spectromeacutetrie de
masse En geacuteneacuteral cette variation prend la forme d‟une perte de deuteacuteration apregraves eacutechange
en solution deuteacutereacutee la reacuteaction d‟eacutechange sur les hydrogegravenes d‟amide est fortement ralentie
mais pas totalement arrecircteacutee par passage en conditions acides (pH 25) et agrave tempeacuterature reacuteduite
(0degC) geacuteneacuteralement dans un solvant majoritairement hydrogeacuteneacute Par conseacutequent ce laquo back-
exchange raquo peut avoir lieu lors des eacutetapes de preacuteparation de l‟eacutechantillon (digestion
dessalage concentration seacuteparationhellip) jusqu‟agrave son injection dans le spectromegravetre de masse
et son ionisation en phase gazeuse Ce pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse est neacutecessaire pour
assurer un retour des hydrogegravenes porteacutes par les chaicircnes lateacuterales sous forme hydrogeacuteneacutee mais
doit ecirctre controcircleacute pour maintenir en place le plus grand nombre possible des deuteacuteriums en
position amide pendant le temps neacutecessaire agrave l‟analyse
154
La maniegravere la plus simple de minimiser l‟eacutechange inverse est de maintenir un pH ougrave
l‟eacutechange est minimal et de rester agrave froid (Fig I 11) Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment le pH et la tempeacuterature sont ajusteacutes respectivement agrave 25 et agrave 0degC Sous ces
conditions de laquo quench raquo l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide est diminueacute de cinq ordres de
grandeur par rapport agrave un pH de 7 et une tempeacuterature de 25degC
La demi-vie pour l‟eacutechange inverse dans des conditions d‟arrecirct de la reacuteaction est entre
trente et cent vingt minutes en fonction de la seacutequence peptidique Par conseacutequent les eacutetapes
d‟analyse doivent ecirctre reacutealiseacutees le plus rapidement possible degraves lors que la reacuteaction est
bloqueacutee Ainsi il n‟est pas envisageable de reacutealiser une digestion enzymatique d‟une heure
suivie d‟un gradient d‟une heure suppleacutementaire pour l‟eacutetape de seacuteparation
chromatographique Des protocoles et dispositifs expeacuterimentaux ont eacuteteacute mis au point afin
d‟optimiser les eacutetapes de digestion et de seacuteparation (4-5) Si ces eacutetapes tiennent dans un
minimum de temps d‟environ trente minutes au total le recouvrement en deuteacuteriums peut ecirctre
supeacuterieur agrave 85 Il faut noter que quelques eacutechanges inverses ont lieu dans l‟interface de
l‟eacutelectrospray mais qu‟ils n‟excegravedent pas 5 geacuteneacuteralement
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment les hydrogegravenes des chaicircnes lateacuterales s‟eacutechangent
plus vite que les hydrogegravenes d‟amide Par conseacutequent lorsque la proteacuteine ou les peptides
marqueacutes sont placeacutes dans les solvants hydrogeacuteneacutes utiliseacutes pour la digestion ou l‟analyse
chromatographique tous les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales redeviennent rapidement des
hydrogegravenes Ainsi un increacutement de masse pourra ecirctre associeacute agrave l‟incorporation d‟un
deuteacuterium sur une fonction amide du squelette polypeptidique Le problegraveme est un peu plus
compliqueacute pour les proteacuteines ou les peptides riches en arginine car comme nous l‟avons vu
l‟arginine possegravede sur sa chaicircne lateacuterale deux hydrogegravenes qui eacutechangent agrave la vitesse des
hydrogegravenes d‟amide et pour lesquels l‟eacutetape de lavage (substitution de D en H) sera donc
moins efficace
Notons eacutegalement que les conditions de l‟eacutechange inverse (pH acide solvant organique)
favorisent a priori une forme deacutenatureacutee pour la proteacuteine initiale conduisant agrave un eacutechange
inverse moins deacutependant des structures secondaire tertiaire et quaternaire Par conseacutequent les
vitesses d‟eacutechange ne deacutependent globalement que de la seacutequence primaire Pour des peptides
typiques cette seacutequence conduit agrave une vitesse d‟eacutechange globalement proche pour tous les
sites conduisant agrave un eacutechange inverse de type laquo aleacuteatoire raquo Ceci rend en partie compte de la
forme gaussienne des distributions isotopiques obtenues pour les peptides deuteacutereacutes
155
Finalement le choix d‟une approche laquo top-down raquo semblerait ecirctre la meilleure solution
pour minimiser l‟eacutechange inverse Dans ce cas la proteacuteine entiegravere apregraves arrecirct de la reacuteaction
d‟eacutechange par diminution du pH et de la tempeacuterature est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse Cette approche offre donc la possibiliteacute unique de reacuteduire consideacuterablement l‟effet
du laquo back-exchange raquo voire mecircme de presque l‟eacuteliminer dans des conditions expeacuterimentales
strictes (6) Ceci est ducirc au fait qu‟il n‟y a pas d‟eacutetape preacutealable agrave l‟analyse par spectromeacutetrie
de masse telle qu‟une digestion enzymatique agrave la pepsine ou une seacuteparation
chromatographique en phase liquide Cependant il faut noter le fait qu‟il n‟est pas toujours
possible d‟opter pour une approche laquo top-down raquo En effet pour des systegravemes de taille trop
importante par exemple l‟efficaciteacute de fragmentation en ECD est trop faible pour obtenir une
reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves pour la plus grande partie de la proteacuteine
Dans tous les cas apregraves le laquo quench raquo de la reacuteaction de marquage l‟eacutechantillon doit ecirctre
injecteacute si possible agrave froid et le plus rapidement dans la source du spectromegravetre de masse pour
limiter le laquo back-exchange raquo
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction
Plusieurs modes d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse ont
eacuteteacute deacuteveloppeacutes en fonction de l‟approche MS adopteacutee laquo bottom-up raquo ou laquo top-down raquo La
mise au point de ces diffeacuterents systegravemes d‟injection doit eacutegalement prendre en compte la
technique d‟ionisation utiliseacutee La technique d‟analyse par MS la plus communeacutement utiliseacutee
pour les expeacuteriences HDX est l‟eacutelectrospray (ESI) tandis que la meacutethode MALDI est plus
rarement employeacutee (7-11) Cela s‟explique par le fait que contrairement agrave la technique ESI
elle ne peut ecirctre coupleacutee en ligne avec des systegravemes de chromatographie liquide qui sont tregraves
utiles pour l‟analyse de meacutelanges complexes
Autrement dit seule l‟eacutelectrospray autorise le couplage avec une chromatographie liquide
en phase inverse (HPLC-ESI-MS) permettant l‟isolation de peptides et de proteacuteines en
meacutelange complexe Cette eacutetape de seacuteparation est indispensable dans beaucoup d‟eacutetudes
d‟identification et de caracteacuterisation de biomoleacutecules par spectromeacutetrie de masse Elle est
d‟autant plus neacutecessaire dans le cas d‟analyses de systegravemes proteacuteiques de grande taille en
HDXMS En effet la superposition des nombreux massifs isotopiques qui ont eacuteteacute deacuteplaceacutes et
eacutelargis par le marquage complique eacutenormeacutement l‟analyse En pratique apregraves avoir arrecircteacute la
156
reacuteaction d‟eacutechange l‟eacutechantillon est directement introduit dans la source eacutelectrospray via une
HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo)
La technique HPLC-ESI-MS preacutesente donc plusieurs avantages Elle est tout d‟abord
particuliegraverement bien adapteacutee pour la seacuteparation temporelle d‟un grand nombre de peptides
L‟eacutetape de seacuteparation en HPLC participe eacutegalement au lavage des chaicircnes lateacuterales des
acides amineacutes (12) Elle est compatible avec la plupart des tampons et avec la preacutesence
d‟agents deacutenaturants et offre la possibiliteacute de concentrer rapidement des eacutechantillons dilueacutes
En contre partie l‟avantage du MALDI-MS par rapport agrave l‟ESI-MS est qu‟un grand nombre
d‟eacutechantillons peuvent ecirctre analyseacutes dans une courte peacuteriode de temps De plus cette
technique est plus toleacuterante aux sels que l‟eacutelectrospray et ne requiert donc pas d‟eacutetape
preacutealable de dessalage de l‟eacutechantillon Bien que l‟ionisation MALDI soit plus facilement
reacutealisable et interpreacutetable elle conduit neacuteanmoins agrave une perte en deuteacuteriums significativement
plus eacuteleveacutee par rapport agrave la meacutethode ESI mecircme si des essais ont eacuteteacute meneacutes pour reacuteduire ces
pertes (13) De plus il n‟est pas envisageable d‟utiliser la technique MALDI pour l‟analyse de
systegravemes proteacuteiques complexes de hauts poids moleacuteculaires En effet les informations de tous
les peptides sont fournies dans un mecircme spectre de masse le rendant laquo illisible raquo et il n‟est pas
possible de reacutealiser preacutealablement agrave l‟analyse une seacuteparation par HPLC qui serait pourtant
indispensable pour ce type d‟eacutechantillon
Les deux sous-paragraphes suivants constitueront un bilan des diffeacuterents systegravemes
d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse qui ont eacuteteacute deacuteveloppeacutes
avant mon arriveacutee au laboratoire des Meacutecanismes Reacuteactionnels Ils ont eacuteteacute mis au point par
l‟eacutequipe ou par d‟autres groupes dans un contexte de minimisation de l‟eacutechange inverse
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo
Une extension eacutevidente de la meacutethode HDXESI-MS est l‟utilisation du nano-deacutebit bien
qu‟elle ne soit pas encore systeacutematique En effet ce choix est particuliegraverement pertinent pour
des proteacuteines qui sont difficiles agrave obtenir (eacutechantillons biologiques preacutecieux) ainsi que pour
celles qui forment des agreacutegats proteacuteiques agrave forte concentration Ces derniegraveres suscitent un vif
inteacuterecirct car elles sont pour la plupart responsables de maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives telles que
les maladies agrave prion dAlzheimer ou de Parkinson Dans la litteacuterature on trouve quelques
eacutetudes HDX utilisant la technique d‟analyse nano-ESI-MS laquo off-line raquo (14-15) ou coupleacutee en
157
ligne aux eacutetapes de digestion enzymatique et de seacuteparation chromatographique (16) Par la
reacuteduction du systegraveme il a eacuteteacute obtenu une sensibiliteacute supeacuterieure d‟un facteur cent tout en
conservant la deuteacuteration
Lors de la thegravese de Thorsten Daubenfeld (17) notre eacutequipe a valideacute un systegraveme par
injection directe nano-ESI-FTMS pour l‟eacutetude structurale de proteacuteines par HDX En effet les
tregraves hautes performances d‟un instrument de type FT-ICR tant au niveau de la reacutesolution que
de la preacutecision sur la mesure de masse ont permis de s‟affranchir d‟une seacuteparation
chromatographique pour les proteacuteines eacutetudieacutees (18) L‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape a
ainsi eacuteteacute eacutelimineacute Cependant comme le systegraveme n‟eacutetait pas refroidi une aiguille nanospray
autorisait un temps d‟analyse de trois minutes seulement avant le reacutechauffement de la solution
menant au pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse Il faut noter ici que plus le temps d‟analyse est
faible moins il est aiseacute de deacutetecter des peptides deuteacutereacutes couvrant une gamme dynamique
importante seule l‟accumulation d‟un nombre important de spectres permet de gagner en
gamme dynamique Par ailleurs plus la taille du systegraveme proteacuteique est grande moins il est
facile de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums des peptides car leur nombre croicirct fortement et
leurs massifs isotopiques deacuteplaceacutes et eacutelargis se superposent
Ce problegraveme de superposition des massifs isotopiques est classiquement reacutesolu par le
couplage du spectromegravetre de masse avec une technique de seacuteparation chromatographique (16
19) permettant d‟isoler les diffeacuterents peptides preacutesents dans l‟analyte dans une seconde
dimension Cette seacuteparation doit dans le cas d‟eacutetudes en HDXMS respecter les contraintes
lieacutees agrave la technique ie qu‟elle doit limiter les eacutechanges inverses Pour cela plusieurs
meacutethodes ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees Elles utilisent soit des solvants protiques auquel cas la
seacuteparation doit se faire agrave froid en conditions acides et rapidement soit des solvants non-
protiques Par exemple la chromatographie supercritique a eacuteteacute proposeacutee comme alternative
aux gradients sur phase inverse classiques permettant de s‟affranchir des problegravemes de
tempeacuterature et de dureacutee d‟eacutelution (20) De plus le temps de reacutetention associeacute agrave un peptide
reste inchangeacute quel que soit son degreacute de deuteacuteration En effet l‟incorporation en deuteacuteriums
des peptides n‟altegravere que tregraves peu leur temps de reacutetention (21-22) Par conseacutequent ils
serviront de reacutefeacuterence pour identifier les peptides apregraves eacutechanges HD
158
Lors de la thegravese de Magalie Duchateau (23) notre eacutequipe a mis au point et optimiseacute un
systegraveme nano-LC-ESI-FTMS refroidi pour l‟analyse structurale de proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire et de complexes proteacuteiques tels que des complexes d‟initiation de la traduction
chez les archeacutees et les eucaryotes par HDX Le montage comprenant deux vannes nano une
preacute-colonne et une colonne est immergeacute dans de l‟eau glaceacutee pendant toute la dureacutee de
l‟analyse pour refroidir un maximum le systegraveme et ainsi minimiser les eacutechanges inverses Il
est coupleacute agrave une chaicircne de nano-chromatographie liquide
Notons eacutegalement que Waters commercialise deacutesormais un systegraveme complegravetement inteacutegreacute
pour les eacutetudes HDXMS appeleacute laquo nanoACQUITY UPLC System with HDX Technology raquo
qui peut ecirctre coupleacute agrave un spectromegravetre de masse du mecircme constructeur Le systegraveme integravegre
eacutegalement une proteacuteolyse laquo on-line raquo Les vannes et colonnes sont refroidies agrave 0degC par des
modules agrave effet Peltier
IV22 Avec une approche laquo top-down raquo
Une meacutethode populaire consiste agrave geacuteneacuterer et agrave envoyer un flux continu de solution
contenant la proteacuteine deuteacutereacutee vers la source d‟ionisation Ce dernier reacutesulte du meacutelange de la
solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange avec celle d‟arrecirct de la reacuteaction Sur ce
principe un dispositif avec deux seringues relieacutees ensemble et connecteacutees eacutegalement avec le
spectromegravetre de masse a eacuteteacute imagineacute (24) (Fig IV 1) Les deux seringues contiennent les
deux solutions agrave meacutelanger donneacutees ci-dessus Ce montage permet de proceacuteder agrave l‟arrecirct de la
reacuteaction d‟eacutechange au point de connexion des deux seringues Cette eacutetape s‟effectue laquo on-
line raquo puisque le flux reacutesultant du meacutelange des deux solutions est directement dirigeacute vers
l‟entreacutee du spectromegravetre de masse Dans ces conditions le temps pendant lequel peut avoir
lieu le laquo back-exchange raquo correspond uniquement agrave la courte dureacutee de reacutesidence dans le tube
capillaire (eg une minute) qui s‟eacutetend du nœud de connexion reliant les deux seringues agrave la
source d‟ionisation eacutelectrospray (scheacutematiseacute en violet sur la Fig IV 1) De cette faccedilon le
laquo back-exchange raquo peut ecirctre efficacement reacuteduit
159
Seringue 1 proteacuteine dans D2O
Seringue 2 solution H2O (pH 25 0degC)
Source drsquoionisation
eacutelectrospray
Arrecirct de la
reacuteaction drsquoeacutechange
Fig IV 1 Scheacutema drsquoun dispositif drsquointroduction des eacutechantillons dans une approche laquo top-
down raquo HDX mettant en œuvre le flux continu
Une autre meacutethode d‟introduction minimisant le laquo back-exchange raquo consiste agrave deacutesolvater et
ioniser directement la solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange sans passer par une
eacutetape preacutealable d‟arrecirct de la reacuteaction (25) (Fig IV 2) La reacuteaction d‟eacutechange HD est alors
arrecircteacutee au moment mecircme ougrave la proteacuteine est deacutesolvateacutee Des ions en phase gazeuse sont alors
geacuteneacutereacutes
Source ESI
Spectromegravetre
de masse
Aiguille nanospray avec solution de
proteacuteine dans tampon drsquoeacutechange
+ 1 NBA (reacuteactif superchargeacute)
Fig IV 2 Scheacutema du mode drsquointroduction des eacutechantillons par spray direct dans une
approche laquo top-down raquo HDX
Le profil de deuteacuteration en phase gazeuse devant impeacuterativement refleacuteter celui en solution
ces deux modes d‟injection sont privileacutegieacutes car ils permettent de reacuteduire le laquo back-exchange raquo
D‟autre part l‟ajout d‟une solution acide pour l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD ou
l‟utilisation d‟un reacuteactif superchargeacute tel que le NBA (laquo nitrobenzyl alcohol raquo) augmente de
faccedilon significative l‟eacutetat de charge de la proteacuteine Cela se traduit donc par une ameacutelioration
consideacuterable de l‟efficaciteacute de fragmentation par ECD (ou ETD) meacutethode choisie pour limiter
le laquo scrambling raquo Toutefois notons que ces deux montages excluent la possibiliteacute de reacutealiser
une eacutetape de dessalage preacutealable agrave l‟injection dans le spectromegravetre de masse Or dans le cas
d‟eacutechantillons reacuteels les proteacuteines sont initialement conserveacutees en conditions natives dans leur
160
tampon de purification qui est riche en sels L‟eacutelectrospray eacutetant tregraves sensible agrave la preacutesence de
sels ou d‟additifs qui contribuent agrave la suppression du signal une eacutetape de dessalage est alors
neacutecessaire avant leur analyse Par conseacutequent afin de pouvoir analyser des eacutechantillons
proteacuteiques reacuteels le deacuteveloppement de nouveaux dispositifs d‟introduction laquo off-line raquo s‟est
reacuteveacuteleacute indispensable Il est donc tregraves important de travailler agrave froid
Le systegraveme d‟injection que j‟ai utiliseacute au deacutebut de ma thegravese a eacuteteacute mis en place au sein du
laboratoire trois mois avant mon arriveacutee avec la collaboration du Professeur Joslashrgensen Il
s‟agit eacutegalement d‟un montage en flux continu mais laquo off-line raquo constitueacute d‟une seule
seringue (Fig IV 3)
Proteacuteine deuteacutereacutee dans
solution H2O (pH 25 0degC)
Source ESI
Carboglace
(-78degC)Spectromegravetre
de masse
Gaz de neacutebulisation
N2 (TdegC ambiante)
Fig IV 3 Scheacutema de notre ancien dispositif drsquointroduction des eacutechantillons en flux continu
laquo off-line raquo la seringue refroidie
Avec ce type de dispositif la preacuteparation de l‟eacutechantillon correspondant agrave son marquage et
agrave son dessalage peut ecirctre reacutealiseacutee en amont Elle se deacutecline en trois eacutetapes qui sont les
suivantes (1) initiation de la reacuteaction d‟eacutechange HD en diluant la proteacuteine dans son tampon
de purification deuteacutereacute puis (2) fixation du marquage apregraves un temps d‟incubation t donneacute en
ajoutant une solution acide (pH final de 25) agrave basse tempeacuterature (0degC) et enfin (3) dessalage
et concentration de l‟eacutechantillon agrave l‟aide d‟une colonne de phase inverse C8 Cette derniegravere
eacutetape doit ecirctre reacutealiseacutee dans la glace et pendant un temps tregraves court (une minute environ) afin
de limiter l‟eacutechange inverse L‟eacutechantillon est ensuite chargeacute immeacutediatement dans la seringue
preacutealablement refroidie agrave 0degC puis injecteacute dans la source eacutelectrospray du spectromegravetre de
masse FT-ICR
161
refroidie
Longueur minimale
Carboglace
deuteacutereacutee
Agrave 0 C
(pH 25 0 C)
Fig IV 4 Photographie de notre systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons marqueacutes la
seringue refroidie
La photographie de notre systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes est preacutesenteacutee ci-
dessus (Fig IV 4) Ce dernier a eacuteteacute minutieusement optimiseacute afin de reacuteduire au maximum le
laquo back-exchange raquo Pour cela la seringue d‟injection est preacutealablement refroidie agrave 0degC entre
deux sachets de glace Au terme de la dureacutee d‟eacutechange HD preacutedeacutefinie la reacuteaction est arrecircteacutee
en diluant l‟eacutechantillon dans une solution acidifieacutee (pH final de 25) agrave 0degC L‟eacutechantillon est
conserveacute dans la glace Pour des eacutechantillons reacuteels une eacutetape de dessalage est reacutealiseacutee sous
ces mecircmes conditions strictes L‟eacutechantillon est alors preacuteleveacute gracircce agrave la seringue refroidie et
injecteacute dans la source du spectromegravetre de masse FT-ICR Pendant toute la dureacutee de l‟analyse
il est lui-mecircme refroidi par un sachet de carboglace surplombant la seringue Il est transfeacutereacute
par un capillaire en PEEK qui lui est agrave tempeacuterature ambiante et dont la longueur a par
conseacutequent eacuteteacute rendue minimale Pour des raisons techniques le capillaire ne mesure pas
moins de trente et un centimegravetres Un deacutebit d‟injection important eacutegal agrave 10 microLmin a donc
eacuteteacute utiliseacute Dans ces conditions il avait eacuteteacute montreacute que ce dispositif permettait un maintien
des deuteacuteriums agrave leur place pendant au moins dix minutes d‟acquisition de donneacutees Ainsi
l‟analyse d‟un point de cineacutetique de l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD agrave la fin de
l‟acquisition en MS durait environ douze minutes Le dispositif d‟analyse ideacuteal combinerait
la consommation d‟une faible quantiteacute d‟eacutechantillon tout en minimisant les eacutechanges inverses
avec un temps d‟acquisition le plus long possible
162
Apregraves quelques mois d‟expeacuterimentation de ce systegraveme j‟ai pu dresser un rapide bilan des
difficulteacutes lieacutees agrave son utilisation La premiegravere surprise a eacuteteacute le nombre de seringues que l‟on
peut fecircler ou casser avec ce dispositif En effet bien que le modegravele de seringue choisi
(seringues Hamilton seacuterie 800) propose un piston renforceacute l‟eacutechantillon refroidi par la
carboglace a tendance agrave congeler Il forme alors un glaccedilon Tandis que le pousse-seringue
continue agrave fonctionner et agrave envoyer l‟eacutechantillon vers le spectromegravetre de masse une
surpression finit par ecirctre exerceacutee au niveau du verre de la seringue jusqu‟agrave sa fecirclure si
l‟analyse n‟est pas interrompue ou l‟eacutechantillon reacutechauffeacute Par ailleurs les deacutebits d‟injection
utiliseacutes impliquent de disposer d‟importantes quantiteacutes d‟eacutechantillon Dans le cas de l‟analyse
d‟eacutechantillons biologiques preacutecieux cette technique ne pourrait pas ecirctre utiliseacutee De plus
comme nous l‟avons vu dans le chapitre preacuteceacutedent les expeacuteriences sont difficilement
reproductibles Ayant pour objectif d‟ameacuteliorer le systegraveme j‟ai testeacute l‟effet du refroidissement
de l‟eacutechantillon par la carboglace lors de l‟analyse par MS et l‟influence du deacutebit d‟injection
sur le laquo back-exchange raquo
Pour cela j‟ai utiliseacute un systegraveme modegravele l‟ubiquitine Il s‟agit d‟une petite proteacuteine de 76
reacutesidus (86 kDa) dont la structure a eacuteteacute complegravetement deacutecrite dans la litteacuterature et qui est
souvent utiliseacutee dans la mise au point d‟approches par eacutechange HD Apregraves avoir deuteacutereacute
complegravetement l‟ubiquitine par incubation dans D2O (Annexe Mateacuteriel et meacutethodes) elle est
dilueacutee au centiegraveme dans une solution acidifieacutee H2OMeOH (4060) agrave environ 0degC Des
meacutelanges H2OACN (5050) eacutetaient auparavant utiliseacutes Le fait de choisir le meacutethanol comme
solvant et de l‟utiliser en plus grande proportion permet d‟une part d‟ameacuteliorer le processus
d‟ionisation par eacutelectrospray et d‟autre part de diminuer consideacuterablement le point de
congeacutelation de la solution agrave analyser Cela empecircche la formation systeacutematique de glaccedilons dus
au refroidissement de la solution par la carboglace L‟ubiquitine est ensuite directement
preacuteleveacutee par la seringue refroidie et injecteacutee dans la source ESI du spectromegravetre de masse FT-
ICR L‟analyse MS est reacutealiseacutee avec ou sans le sachet de carboglace surplombant la seringue
puis en testant diffeacuterents deacutebits d‟injection Le pourcentage de deuteacuteration de l‟ubiquitine est
suivi au cours des dix minutes d‟analyse autoriseacutes par le systegraveme de seringue refroidie afin de
mesurer l‟eacutechange inverse Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees en duplicats ou triplicats pour
estimer l‟erreur de mesure
En theacuteorie en absence d‟eacutechange inverse la valeur du pourcentage de deuteacuteration devrait
rester constante et maximale en fonction du temps Dans la situation ideacuteale l‟ensemble des
hydrogegravenes d‟amide devraient ecirctre marqueacutes et aucun autre site ne devrait ecirctre deuteacutereacute
163
deacutefinissant ainsi un 100 theacuteorique En pratique ce pourcentage doit ecirctre corrigeacute pour
prendre en compte la preacutesence de deuteacuteriums dilueacutes dans la solution d‟eau leacutegegravere acidifieacutee On
peut par conseacutequent corriger le ratio maximal par la formule suivante
ougrave Ntot est le nombre total de sites eacutechangeables (hydrogegravenes d‟amide et chaicircnes lateacuterales)
Namide est le nombre de liaisons peptidiques R est le pourcentage de deuteacuteriums dans la
solution dilueacutee rapporteacute au nombre total d‟hydrogegravenes et de deuteacuteriums Damide est le taux de
deuteacuteration reacuteel des hydrogegravenes d‟amide ducirc au marquage et Dexp est le ratio de deuteacuteration
expeacuterimental donneacute par la formule suivante
ougrave nD est le nombre de deuteacuteriums (mesureacute par spectromeacutetrie de masse par exemple) Du fait
de la preacutesence de deuteacuteriums dans la solution on s‟attend donc agrave une surestimation du taux de
deuteacuteration Ainsi par exemple si on considegravere une dilution au 1100e dans une solution 6040
meacutethanoleau on trouve un ratio de deuteacuteration R de 19
ougrave 18 et 32 sont les masses molaires de l‟eau et du meacutethanol 079 est la densiteacute du meacutethanol
(celle de l‟eau est prise agrave 1) 4060 sont les proportions d‟eau et de meacutethanol
On s‟attend par conseacutequent agrave un taux de deuteacuteration maximal (avec Ntot = 146 Namide = 72)
d‟environ 102
De plus un excegraves de deuteacuteration suppleacutementaire peut ecirctre ducirc au non reacute-eacutechange d‟un
hydrogegravene pour les chaicircnes lateacuterales d‟arginine or l‟ubiquitine comporte 4 arginines dans sa
seacutequence Dans la suite de ce manuscrit une reacutefeacuterence agrave 105 sera prise qui correspond au
maximum expeacuterimentalement observeacute pour les diffeacuterents montages qui seront tenteacutes
164
Dans le cas des injections utilisant le montage d‟origine l‟eacutevolution preacutesenteacutee ci-dessous
est observeacutee (Fig IV 5)
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Avec carboglace Sans carboglace
Fig IV 5 Evolution du taux de deuteacuteration de lrsquoubiquitine mesureacute en fonction du temps apregraves
le deacutebut de lrsquoinjection Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI
par le systegraveme de seringue refroidie Bleu pas de carboglace placeacute sur la seringue rouge
avec carboglace
Lors des cinq premiegraveres minutes les courbes avec et sans carboglace preacutesentent la mecircme
allure et se confondent presque La solution d‟ubiquitine agrave 0degC injecteacutee agrave 10 microLmin par la
seringue refroidie n‟a pas le temps de se reacutechauffer mecircme en l‟absence de carboglace Au
bout de cinq minutes la solution d‟ubiquitine se reacutechauffe en l‟absence de carboglace Ils
s‟opegraverent alors des eacutechanges inverses faisant chuter le pourcentage de deuteacuteration Par
conseacutequent en l‟absence de carboglace on divise le temps d‟analyse par deux au moins dans
des expeacuteriences HDXMS La partie initiale avec un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
correspond agrave la combinaison d‟une perte de deuteacuteriums au cours du temps avec un effet de
deacutebit car initialement la seringue est maintenue agrave un deacutebit eacuteleveacute jusqu‟agrave apparition du signal agrave
t=0
L‟effet du deacutebit d‟injection de l‟eacutechantillon sur l‟eacutechange inverse (Fig IV 6) a ensuite eacuteteacute
testeacute pour le deacutebit de reacutefeacuterence de 10 microLmin et pour un deacutebit diviseacute par cinq de 2 microLmin
165
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie 10 microLmin 2 microLmin
Fig IV 6 Effet du deacutebit drsquoinjection sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse
MS Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI par le systegraveme de
seringue refroidie surplombeacutee de carboglace Rouge deacutebit de 10 microLmin-1
violet deacutebit de
2 microLmin-1
Avec un faible deacutebit d‟injection (2 microLmin) de l‟eacutechantillon marqueacute le pourcentage de
deuteacuteration de l‟ubiquitine diminue consideacuterablement au cours de l‟analyse MS Les eacutechanges
inverses sont donc plus nombreux dans ces conditions expeacuterimentales On enregistre un
laquo back-exchange raquo moyen apregraves eacutequilibration de 35
Les graphes des Fig IV 5 et Fig IV 6 montrent que le systegraveme de seringue refroidie
permet de reacuteduire au maximum le laquo back-exchange raquo si l‟eacutechantillon est lui-mecircme refroidi par
la carboglace lors de l‟analyse MS et qu‟il est injecteacute agrave un deacutebit eacuteleveacute (10 microLmin)
Cependant le laquo back-exchange raquo moyen reste non neacutegligeable eacutegal agrave 20 Ayant eacutetudieacute
l‟ensemble des paramegravetres possibles en restant sur la base de ce systegraveme nous ne pouvons
guegravere plus l‟ameacuteliorer Nous avons donc deacutecideacute d‟inventer et de deacutevelopper un nouveau
systegraveme d‟introduction
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection
L‟ideacutee a eacuteteacute d‟imaginer un dispositif capable de stocker l‟eacutechantillon marqueacute aux
deuteacuteriums agrave tregraves basse tempeacuterature en dessous de zeacutero degreacute avant son analyse finale par
spectromeacutetrie de masse
166
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo
La laquo cryosource raquo est le nom que nous avons donneacute agrave notre dispositif d‟injection (Fig IV
7) Il s‟agit d‟une enceinte close thermostateacutee agrave tempeacuterature controcircleacutee avec comme objectif
initial une plage de tempeacuterature allant de la tempeacuterature ambiante agrave -100degC C‟est une boicircte
thermiquement isoleacutee issue de la transformation d‟une glaciegravere Elle se branche directement
sur la source ESI Elle est traverseacutee par un flux reacuteguleacute de gaz refroidi agrave l‟azote liquide (78 K)
La tempeacuterature interne de la boicircte est mesureacutee en continu par une sonde thermique et ajusteacutee
par un reacutegulateur de tempeacuterature controcirclant une reacutesistance chauffante L‟eacutechantillon est
introduit dans la laquo cryosource raquo puis injecteacute dans la source ESI du FT-ICR par un systegraveme de
vanne et boucle d‟injection Il est entraicircneacute vers le spectromegravetre de masse gracircce agrave l‟entreacutee d‟un
flux continu de solvant geacuteneacutereacute par un pousse-seringue situeacute agrave l‟exteacuterieur de la laquo cryosource raquo
deuteacutereacute agrave pH 25 et agrave 0 C
-30 C
Reacutegulateur de tempeacuterature
N2 (-30 C)
Azote liquide
Fig IV 7 Photographie de la laquo cryosource raquo
IV32 Mateacuteriel et meacutethodes
IV321 Instrumentation
Dans un premier temps voici la description de la version optimiseacutee de la laquo cryosource raquo et
des conditions expeacuterimentales neacutecessaires agrave la reacutealisation d‟expeacuteriences pour l‟eacutetude de la
167
structure de petites proteacuteines en HDXMS Elle est illustreacutee dans le scheacutema ci-apregraves (Fig IV
8)
L‟enceinte inteacuterieure de la laquo cryosource raquo est refroidie agrave une tempeacuterature de -30degC par
l‟arriveacutee d‟un gaz froid via un tuyau en cuivre Celui-ci forme un serpentin plongeacute dans un
reacutecipient rempli d‟azote liquide (78 K) qui permet le refroidissement du flux continu de gaz
entrant dans le systegraveme Une partie du gaz froid est envoyeacutee dans la laquo cryosource raquo agrave l‟aide
d‟un raccord en T tandis que l‟autre partie traverse le systegraveme et vient refroidir la ligne de
transfert de l‟eacutechantillon qui est introduit dans la source ESI
L‟inteacuterieur de la boicircte est maintenu agrave une tempeacuterature constante par un reacutegulateur de
tempeacuterature eacutequipeacute d‟une sonde thermique et d‟un ruban chauffant La sonde thermique de
type K est positionneacutee au niveau de la boucle contenant l‟eacutechantillon tandis que le ruban
chauffant entoure les tuyaux en cuivre deacuteposeacutes au fond de la boicircte Un ventilateur placeacute dans
l‟enceinte assure l‟homogeacuteneacuteiteacute de la tempeacuterature dans celle-ci
L‟eacutechantillon introduit dans une boucle de 75 microL par une vanne d‟injection est pousseacute vers
la source ESI du spectromegravetre de masse FT-ICR par le solvant agrave l‟aide d‟un pousse-seringue
Il est programmeacute agrave 2 microLmin correspondant agrave la valeur minimale du deacutebit pour laquelle le
spray est stable pour notre montage Les deacutebits infeacuterieurs deviennent instables lors du
refroidissement du montage probablement agrave cause de l‟augmentation de la viscositeacute des
solvants agrave -30degC Le volume injecteacute pour le remplissage de la boucle est de 100 microL
Finalement le gaz de neacutebulisation est eacutegalement refroidi par l‟azote liquide Il est envoyeacute agrave
l‟inteacuterieur du dispositif par un second tuyau en cuivre et est relieacute agrave l‟aiguille de neacutebulisation
de la source ESI permettant son refroidissement
168
Fig IV 8 Scheacutema du principe de la laquo cryosource raquo
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de l‟ubiquitine proteacuteine modegravele et de peptides de reacutefeacuterence que l‟on peut deuteacuterer de
maniegravere seacutelective (peptides modegraveles conccedilus par le Prof T Joslashrgensen Universiteacute dOdense
Danemark)
L‟ubiquitine (100 microM) et les peptides modegraveles (1 mM) sont complegravetement deuteacutereacutes par
incubation dans D2O Ils sont ensuite dilueacutes (au 1100e) dans une solution H2OMeOH
(4060) agrave basse tempeacuterature contenant de l‟acide formique (2) pour l‟ubiquitine et de
l‟acide aceacutetique pour les peptides (05 M pH=23) L‟ubiquitine est alors immeacutediatement
analyseacutee par FT-ICR MS Les peptides quant agrave eux sont analyseacutes apregraves une incubation dans
H2O glaceacutee pendant un temps agrave deacuteterminer (environ 10 min avec le systegraveme de seringue
refroidie) afin de deacutemarquer seacutelectivement l‟extreacutemiteacute N-terminale et conserver un nombre
moyen de 45 deuteacuteriums du cocircteacute C-terminal (26-27)
L‟eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee manuellement sur colonne Une cartouche Sep-Paktrade
C8 a eacuteteacute utiliseacutee
169
IV33 Reacutesultats
IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine
IV3311 Reacutealisation de la maquette
Cette phase de reacutealisation de la maquette initiale a permis une grande creacuteativiteacute de notre
part et a deacutetermineacute la faisabiliteacute technologique des choix de conception Elle a eacuteteacute conccedilue agrave
l‟aide d‟un bac agrave glace isotherme et de son couvercle Cette boicircte en polystyregravene a montreacute de
bonnes capaciteacutes de stockage agrave basse tempeacuterature malgreacute des fuites thermiques non
neacutegligeables causant une perte de froid En particulier elle a permis de valider la plage de
tempeacuterature atteignable (0degC agrave -100degC) et de veacuterifier la faisabiliteacute de l‟utilisation de meacutelanges
eausolvant organique agrave ces tempeacuteratures On notera en particulier que bien que les
tempeacuteratures de cristallisation des meacutelanges eaumeacutethanol et eauaceacutetonitrile soient connues
la viscositeacute de ceux-ci ne l‟est pas Pour les meacutelanges eaumeacutethanol qui preacutesentent des
tempeacuteratures de cristallisation infeacuterieures agrave -100degC agrave forts rapports meacutethanoleau il s‟est
aveacutereacute impossible d‟obtenir un deacutebit stable agrave des tempeacuteratures infeacuterieures agrave -80degC Pour les
meacutelanges eauaceacutetonitrile la limite se situe vers -25degC pour un minimum theacuteorique agrave -43degC
IV3312 Reacutealisation des prototypes
Le produit a ensuite eacuteteacute deacuteveloppeacute et des prototypes ont eacuteteacute reacutealiseacutes pour permettre sa
validation apregraves une seacuterie de tests
Pour cela une glaciegravere de la marque Campingaz qui preacutesentait l‟avantage d‟avoir des
joints d‟eacutetancheacuteiteacute ainsi qu‟une reacutesistance garantie agrave des tempeacuteratures de -78degC a eacuteteacute
transformeacutee en laquo cryosource raquo Dans la premiegravere version de notre dispositif d‟introduction agrave
froid des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse le gaz de neacutebulisation a eacuteteacute
laisseacute agrave tempeacuterature ambiante (Fig IV 9)
170
Fig IV 9 Scheacutema du prototype de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave
tempeacuterature ambiante
Afin de valider le prototype nous lavons compareacute agrave l‟ancien systegraveme d‟injection la
seringue refroidie Les reacutesultats obtenus avec la premiegravere version de la laquo cryosource raquo (courbe
en violet) sont assez similaires agrave ceux enregistreacutes avec la seringue refroidie (courbe en rouge)
(Fig IV 10) L‟ubiquitine preacutesente un taux de deuteacuteration un peu plus eacuteleveacute lorsqu‟elle est
introduite par la laquo cryosource raquo par rapport agrave la seringue refroidie Par contre le pourcentage
de deuteacuteration est instable au cours de l‟analyse MS La laquo cryosource raquo dans cette
configuration n‟apporte pas de valeur ajouteacutee agrave la seringue refroidie Elle doit donc ecirctre
ameacutelioreacutee pour ecirctre valideacutee
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (Ta) Seringue refroidie
Fig IV 10 Effet du systegraveme drsquoinjection utiliseacute sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de
lrsquoanalyse MS Les dispositifs ici compareacutes sont le systegraveme de seringue refroidie et la premiegravere
version de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave tempeacuterature ambiante
Ubiquitine
171
L‟ameacutelioration de notre dispositif a porteacute sur le refroidissement du gaz de neacutebulisation par
l‟azote liquide (78 K) (Fig IV 8) Il est envoyeacute dans l‟enceinte isoleacutee agrave -30degC par un tuyau en
cuivre qui traverse la boicircte L‟extreacutemiteacute du tuyau de cuivre agrave la sortie de la laquo cryosource raquo
est brancheacutee au niveau de la source ESI L‟aiguille de spray est par ce systegraveme elle-mecircme
refroidie
On obtient alors un spray refroidi stable qui nous donne les reacutesultats suivants (courbe en
bleu fonceacute) (Fig IV 11) Dans cette configuration l‟ubiquitine preacutesente un pourcentage
moyen de deuteacuteration nettement supeacuterieur agrave celui obtenu avec les autres systegravemes (ou
versions de systegravemes) et le taux de deuteacuteration est stable tout au long de l‟analyse MS (Fig
IV 11 Tab IV 1)
Tab IV 1 Pourcentages moyens de deuteacuteration de lrsquoubiquitine obtenus agrave lrsquoaide de la
seringue refroidie et de la laquo cryosource raquo dans les versions 1 et 2 et calculeacutes agrave diffeacuterents
temps de lrsquoanalyse par MS
1 min d‟analyse 5 min d‟analyse 10 min d‟analyse
Seringue refroidie 8870 8518 8484
Cryosource version 1 9773 9167
Cryosource version 2 10388 10433 10388
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (-30degC)
Seringue refroidie Cryosource N2 (Ta)
Fig IV 11 Effet du refroidissement du gaz de neacutebulisation agrave -30degC avec la laquo cryosource raquo
sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Ubiquitine
172
La Fig IV 11 montre que la ldquocryosourcerdquo dans sa version ameacutelioreacutee (avec le gaz de
neacutebulisation refroidi) agrave -30degC et pour un deacutebit d‟injection de 2 microLmin conduit agrave un
pourcentage de deuteacuteration tregraves proche de la valeur maximale attendue (105) et qui reste
stable pendant toute la dureacutee de l‟analyse par rapport au systegraveme de seringue refroidie La
laquo cryosource raquo avec ses diffeacuterents paramegravetres optimiseacutes est alors valideacutee
Nous avons ensuite testeacute diffeacuterentes tempeacuteratures dans la cryosource pour voir l‟influence
du paramegravetre tempeacuterature sur la deuteacuteration J‟ai donc eacutegalement testeacute les tempeacuteratures de -
20degC (courbe en violet) et -10degC (courbe en rouge) (Fig IV 12) Quelle que soit la
tempeacuterature de la laquo cryosource raquo elle nous permet de maintenir constant le taux de
deuteacuteration au cours de l‟analyse Cependant plus la tempeacuterature augmente plus le laquo back-
exchange raquo est important En effet agrave -30degC il est infeacuterieur agrave 3 tandis qu‟agrave -20degC le laquo back-
exchange raquo moyen est de 25 et agrave -10degC il est de 35 Ceci peut s‟expliquer par le fait que la
partie correspondant agrave la sortie de laquo cryosource raquo juste avant l‟entreacutee dans la source ESI
n‟est pas recouverte par un manchon isolant Elle est certes refroidie par l‟arriveacutee d‟un gaz
froid agrave -30degC mais qui se reacutechauffe au contact de l‟air conduisant agrave une perte de froid
Lorsque l‟inteacuterieur de la boicircte est agrave -30degC alors la sortie de la laquo cryosource raquo enregistre une
tempeacuterature d‟environ -10degC suffisante pour eacuteviter le reacute-eacutechange des deuteacuteriums avec les
hydrogegravenes Mais lorsque la tempeacuterature de la laquo cryosource raquo est supeacuterieure agrave -30degC ie agrave -
20degC ou agrave -10degC la sortie preacutesente des tempeacuteratures positives conduisant agrave du laquo back-
exchange raquo
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie -30degC -20degC -10degC
Fig IV 12 Effet de la tempeacuterature interne de la laquo cryosource raquo sur le maintien en place des
deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
173
Les Fig IV 11 et Fig IV 12 montrent que l‟utilisation de la laquo cryosource raquo agrave -30degC et
avec le refroidissement du gaz de neacutebulisation permet de reacuteduire le deacutebit d‟injection agrave 2
microLmin avec un laquo back-exchange raquo minimal (lt 3)
Nous avons ensuite voulu quantifier le laquo back-exchange raquo imputable agrave l‟eacutetape de dessalage
En effet le but ultime de cette eacutetude est de pouvoir utiliser notre dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes pour l‟analyse structurale de proteacuteines et de complexes proteacuteiques reacuteels
D‟apregraves le graphe de la Fig IV 13 nous concluons que l‟eacutetape de dessalage conduit agrave une
perte de 20 de la deuteacuteration lui aussi tregraves stable au cours du temps
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Sans dessalage Avec dessalage
Fig IV 13 Effet du dessalage sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Nous avons deacuteveloppeacute un dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
spectromegravetre de masse qui reacuteduit consideacuterablement le laquo back-exchange raquo Nous avons
deacutetermineacute un ensemble de paramegravetres optimiseacutes conduisant agrave moins de 3 d‟eacutechange inverse
en solution Pour cela il est indispensable d‟utiliser la laquo cryosource raquo pour refroidir
l‟eacutechantillon la tempeacuterature optimale du systegraveme eacutetant de -30degC pour un deacutebit d‟injection de
l‟analyte de 2 microLmin Le gaz de neacutebulisation doit ecirctre eacutegalement refroidi agrave -30degC La
laquo cryosource raquo preacutesente plusieurs avantages Elle permet de refroidir l‟eacutechantillon agrave tregraves basse
tempeacuterature agrave une valeur bien au-dessous de zeacutero degreacute Celsius ce qui allonge
consideacuterablement le temps d‟analyse La tempeacuterature est en effet stable pendant des temps
longs allant jusqu‟agrave une heure Et elle autorise de plus faibles deacutebits d‟injection Les diffeacuterents
paramegravetres optimiseacutes au niveau de l‟ancien et du nouveau dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes sont reacutecapituleacutes et compareacutes dans le tableau (Tab IV 2) Le dessalage
174
est maintenant l‟eacutetape critique pour la minimisation du laquo back-exchange raquo Il faudrait ecirctre
capable de le reacutealiser eacutegalement agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo
Tab IV 2 Comparaison des paramegravetres optimiseacutes pour les systegravemes de seringue refroidie et
de laquo cryosource raquo
Finalement il convient de noter qu‟une derniegravere ameacutelioration a eacuteteacute apporteacutee agrave la
laquo cryosource raquo suite agrave l‟observation de problegravemes de reproductibiliteacute preacutesenteacutes ci-dessous Il
apparaissait reacuteguliegraverement des problegravemes de bouchage du montage ougrave apregraves injection le
montage se retrouvait agrave monter en pression au-delagrave de la limite permise par le pousse-
seringue Apregraves recherche de l‟origine de ce problegraveme reacutecurrent nous avons pu identifier ce
problegraveme comme eacutetant arriveacute lors de l‟ajout du gaz de neacutebulisation refroidi et eacutetant lieacute agrave une
tempeacuterature du tuyau d‟ameneacutee de ce gaz largement infeacuterieure agrave celle de l‟enceinte (-65degC
mesureacutes agrave la jonction avec la source ESI) L‟augmentation de viscositeacute voire la cristallisation
au niveau de ces points froids pourrait ecirctre agrave l‟origine de ces pheacutenomegravenes de bouchage Ce
problegraveme a eacuteteacute reacutegleacute en ameacuteliorant les eacutechanges thermiques dans l‟enceinte agrave la fois par
l‟augmentation du contact tuyau du gaz de neacutebulisationruban chauffant mais eacutegalement par
l‟ajout d‟un ventilateur dans l‟enceinte Une contrepartie de ces ajouts est une perte de la
capaciteacute de refroidissement en dessous de -30degC
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides
Nous avons ensuite souhaiteacute valider notre dispositif d‟introduction des eacutechantillons
marqueacutes permettant la minimisation du laquo back-exchange raquo sur des peptides modegraveles
seacutelectivement deuteacutereacutes En effet ces peptides sont speacutecifiquement construits pour la mise au
point d‟expeacuteriences HDXMS Leur analyse permet d‟eacutetudier les pheacutenomegravenes de laquo back-
exchange raquo et plus particuliegraverement de laquo scrambling raquo
175
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK
Le peptide HHHHHHIIKIIK complegravetement deuteacutereacute est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-
terminal apregraves dilution dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes
d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide introduit par la cryosource dans le spectromegravetre de
masse FT-ICR contient bien 45 deuteacuteriums Le reacutesultat est conforme agrave la publication de T
Joslashrgensen (26) De plus au cours de l‟analyse MS le nombre de deuteacuteriums reste constant par
rapport agrave l‟utilisation du systegraveme de seringue refroidie (Fig IV 14) La laquo cryosource raquo permet
donc de reacuteduire au maximum l‟eacutechange inverse dans le cas eacutegalement de l‟analyse du peptide
HHHHHHIIKIIK par HDX Le systegraveme peptide modegravele laquo cryosource raquo permettra d‟eacutetudier
par la suite le laquo scrambling raquo avec preacutecision
0
1
2
3
4
5
6
0 100 200 300 400 500 600
No
mb
re d
e d
eu
teacuteri
um
s
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource Seringue refroidie
Fig IV 14 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse Comparaison de la
laquo cryosource raquo vs la seringue refroidie
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK
La mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee avec le peptide KKDDDDDDIIKIIK qui appartient agrave la
mecircme famille que HHHHHHIIKIIK Dans un premier temps il est complegravetement deuteacutereacute par
incubation dans D2O Puis il est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-terminal par dilution dans
une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes d‟incubation dans H2O
glaceacutee le peptide est finalement injecteacute dans la laquo cryosource raquo puis analyseacute en spectromeacutetrie
de masse Son nombre de deuteacuteriums est alors supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) (Fig IV
15) Avant de tester la stabiliteacute de la laquo cryosource raquo il nous faut deacuteterminer le temps
HHHHHHIIKIIK
176
d‟incubation dans H2O glaceacutee pour lequel le peptide aura incorporeacute 45 deuteacuteriums
Apparemment ce temps serait supeacuterieur agrave quatorze minutes
5586311
5589655
5592998
55963595599711
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000001d +MS2(5586)
0
1
2
3
4
7x10
Intens
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5596387
5599738
5603078
5606417 5609768
5613124
5616476
56198265623171
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000010d +MS2(5609)
00
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10
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20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5589678 5593021 5596386
5599737
5603078
56064175609769
5613122
5616475
56198235623167
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000017d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5593029
5596384
5599727
5603066
5606408
5609760
5613115
5616464
5619811
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000030d +MS2(5609)
00
05
10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
58 D
Reacutefeacuterence sans HDX
Avec HDX sans incubation dans
H2O analyse agrave t0 = 0 min
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 10 min56 D
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 14 min
50 D
(a)
(b)
(c)
(d)
Fig IV 15 Zoom du massif isotopique de lrsquoion parent [M+3H] 3+
dans les spectres MS du
peptide KKDDDDDDIIKIIK Les eacutechantillons marqueacutes sont introduits par la laquo cryosource raquo
et le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes est calculeacute apregraves diffeacuterents temps drsquoincubation dans
H2O t0=0 min (b) 10 min (c) et 14 min (d) par rapport agrave la reacutefeacuterence sans marquage (a)
IV33221 Deacutetermination du temps drsquoincubation pour le deacutemarquage seacutelectif
J‟ai donc deacutecideacute de retravailler avec le systegraveme de seringue refroidie pour pouvoir
deacuteterminer ce temps Le montage reacutealiseacute a eacuteteacute le suivant apregraves que l‟eacutechantillon ait eacuteteacute
complegravetement deuteacutereacute il a eacuteteacute dilueacute dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature pour
bloquer la reacuteaction d‟eacutechange HD Il a ensuite eacuteteacute immeacutediatement preacuteleveacute et injecteacute agrave 10
microLmin par la seringue refroidie qui a eacuteteacute entoureacutee par deux sachets de glace L‟acquisition
des donneacutees a eacuteteacute reacutealiseacutee pendant vingt-cinq minutes Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig
IV 16 Avec le systegraveme de seringue refroidie le temps requis semble ecirctre de quatorze
minutes alors qu‟il paraissait ecirctre supeacuterieur avec la laquo cryosource raquo
La difficulteacute geacuteneacuterale agrave laquelle nous n‟avions pas penseacute initialement est la suivante les
hydrogegravenes d‟amide ne se deacutemarquent pas agrave la mecircme vitesse et dans les expeacuteriences de T
Joslashrgensen la fin du deacutemarquage a lieu dans le capillaire de transfert qui est agrave tempeacuterature
177
ambiante Elle est donc incontrocirclable La laquo cryosource raquo quant agrave elle ne comporte pas de
capillaire de transfert agrave tempeacuterature ambiante pour finir le deacutemarquage Par conseacutequent il
nous faut deacuteterminer avec ce nouveau mode d‟introduction le temps d‟incubation des
peptides dans H2O pour les deacutemarquer seacutelectivement et avoir exactement le bon nombre
initial de deuteacuteriums Il semblerait que ce temps d‟incubation soit plus long dans le cas de
l‟utilisation de la laquo cryosource raquo
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3
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0 5 10 15 20 25
No
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teacuteri
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s
Temps danalyse (en minutes)
Fig IV 16 Nombre de deuteacuteriums de lrsquoion parent [M+3H] 3+
du peptide KKDDDDDDIIKIIK
calculeacute en fonction du temps de reacutesidence dans la seringue refroidie agrave 0degC tout au long de
lrsquoanalyse
Par conseacutequent j‟ai travailleacute de nouveau avec la laquo cryosource raquo par tacirctonnements J‟ai
reacutealiseacute plusieurs essais (Fig IV 17) Un essai correspond agrave une incubation du peptide
complegravetement marqueacute dans H2O glaceacutee et agrave une ou plusieurs injections dans la laquo cryosource raquo
agrave diffeacuterents temps D‟apregraves les reacutesultats du premier essai (points en bleu) le nombre de
deuteacuteriums retenu par le peptide seacutelectivement deacutemarqueacute apregraves vingt minutes d‟incubation est
supeacuterieur (53) agrave ce qui est attendu (45) mais apregraves trente minutes il est infeacuterieur (40) Un
deuxiegraveme essai a donc eacuteteacute reacutealiseacute apregraves vingt-cinq minutes d‟incubation (point rouge)
supposeacute ecirctre le temps que l‟on cherche agrave deacuteterminer Mais le nombre de deuteacuteriums s‟est
aveacutereacute bien supeacuterieur (68) agrave ce que nous attendions Un troisiegraveme essai (point orange) agrave trente
minutes d‟incubation a donneacute exactement le mecircme nombre de deuteacuteriums (53) qu‟une
mesure effectueacutee preacuteceacutedemment agrave vingt minutes (1er
essai) Un dernier essai a eacuteteacute reacutealiseacute pour
diffeacuterents temps d‟incubation allant de vingt agrave soixante minutes (points en violet) laissant
supposer que vingt-cinq minutes serait le temps rechercheacute Notons ici que je n‟ai pas eu de
178
signal en spectromeacutetrie de masse pour des temps d‟incubation infeacuterieurs agrave vingt minutes
Pourtant j‟ai testeacute les temps t= 0 15 min Par conseacutequent les reacutesultats ne sont pas
reproductibles et il semblerait que j‟ai rencontreacute des problegravemes de bouchage en raison de
l‟apparition de points froids dans le montage
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10 20 30 40 50 60
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Theacuteorie 1er essai 2e essai 3e essai 4e essai
Fig IV 17 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee
J‟ai alors reacutealiseacute le mecircme type d‟expeacuterience un autre jour en augmentant le deacutebit agrave 25
microLmin (courbe noire Fig IV 18) Cela m‟a permis finalement d‟obtenir du signal pour des
temps t= 0 15 min Cependant le temps d‟incubation dans H2O glaceacutee pour avoir le bon
nombre de deuteacuteriums initial semble avoir consideacuterablement eacuteteacute reacuteduit (de 25 agrave 10 min
environ) Pour s‟assurer de la reproductibiliteacute des reacutesultats la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee un
autre jour (courbe orange) Puis j‟ai effectueacute deux autres essais (courbes bleue et rouge) le
mecircme jour apregraves avoir recouvert la sortie de la laquo cryosource raquo qui se branche sur la source
ESI du FT-ICR par un manchon isolant L‟ideacutee ici est de limiter au maximum les pertes de
froid agrave cet endroit La tempeacuterature diminue passant de -8degC agrave -15degC Ainsi le nombre de
deuteacuteriums est augmenteacute Les reacutesultats semblent reproductibles et deacutesormais un temps
d‟incubation de quinze minutes semble convenir
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Fig IV 18 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee Le
deacutebit drsquoinjection a eacuteteacute augmenteacute agrave 25 microLmin et la sortie de la laquo cryosource raquo isoleacutee
thermiquement (courbes en bleu et en rouge)
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo
Apregraves quinze minutes d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide est de nouveau injecteacute dans
la laquo cryosource raquo puis analyseacute par spectromeacutetrie de masse Son nombre de deuteacuteriums est une
nouvelle fois supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) De plus un pheacutenomegravene tout agrave fait
incompreacutehensible est observeacute le nombre de deuteacuteriums augmente lors des premiegraveres minutes
de l‟analyse alors que le peptide est stockeacute agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo Le peptide gagne
deux deuteacuteriums suppleacutementaires au bout de cinq minutes passant de 56 agrave 76 deuteacuteriums
(Fig IV 19) Dans ces conditions la minimisation du laquo scrambling raquo en utilisant le peptide
KKDDDDDDIIKIIK et la laquo cryosource raquo ne peut pas ecirctre envisageacutee
180
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0 100 200 300 400 500 600
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Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource
Fig IV 19 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse
Pour s‟assurer que ce pheacutenomegravene n‟est pas un arteacutefact expeacuterimental mais qu‟il est
reproductible la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee agrave diffeacuterents temps t= 0 15 20 25 30 min
d‟incubation dans H2O glaceacutee (Fig IV 20) Les diffeacuterentes courbes preacutesentent la mecircme allure
deacutefinie par deux parties La premiegravere partie qui correspond aux cinq premiegraveres minutes
d‟analyse montre une augmentation du nombre de deuteacuteriums tandis que la seconde partie est
caracteacuteriseacutee par une diminution du nombre de deuteacuteriums Le temps d‟incubation dans H2O
glaceacutee a eacuteteacute changeacute et vingt minutes semblent maintenant convenir
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0 5 10 15 20 25 30
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Temps danalyse (en minutes)
Theacuteorie
0 min
15 min
20 min
25 min
30 min
Fig IV 20 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents temps
drsquoincubation dans H2O glaceacutee
KKDDDDDDIIKIIK
181
Pour essayer de comprendre scientifiquement le pheacutenomegravene en utilisant le mecircme jeu de
donneacutees j‟ai traceacute le graphe suivant intensiteacute des ions formeacutes en fonction du temps
d‟analyse (Fig IV 21) Les courbes preacutesentent la mecircme allure que celles du graphe de la
figure preacuteceacutedente (Fig IV 20) L‟intensiteacute des ions semble varier comme le nombre de
deuteacuteriums
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
0 5 10 15 20 25 30
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Temps danalyse (en minutes)
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 21 Intensiteacute des ions en fonction du temps drsquoanalyse pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Nous deacutecidons alors de tracer le graphe de l‟intensiteacute des ions en fonction du nombre de
deuteacuteriums (Fig IV 22) Il apparaicirct alors clairement qu‟il existe une correacutelation entre le
nombre d‟ions formeacutes et le nombre de deuteacuteriums retenus Or les facteurs qui peuvent
influencer le nombre d‟ions formeacutes sont le pH et la concentration en analyte En effet un pH
acide et une concentration eacuteleveacutee d‟eacutechantillon favorisent la formation d‟ions Sachant que les
eacutechanges HD sont controcircleacutes non seulement par la tempeacuterature mais aussi par le paramegravetre
pH alors le pheacutenomegravene que nous observons ressemblerait agrave un effet de pH Cet effet de pH
s‟expliquerait par un effet de meacutelange entre la solution contenant l‟eacutechantillon (peptide
complegravetement deuteacutereacute dilueacute au 1100e dans une solution H2OMeOH 4060 acidifieacutee) et le
solvant (H2OMeOH 4060) qui sert agrave pousser l‟analyte vers la source du spectromegravetre de
masse (Fig IV 23)
182
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Nombre de deuteacuteriums
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 22 Intensiteacute des ions en fonction du nombre de deuteacuteriums pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Fig IV 23 Scheacutema explicatif de lrsquohypothegravese de lrsquoeffet de meacutelange observeacute
Afin de s‟affranchir de l‟effet de meacutelange nous avons deacutecideacute de modifier la composition
du solvant de faccedilon agrave avoir exactement la mecircme que pour l‟eacutechantillon Autrement dit nous
l‟avons acidifieacute et leacutegegraverement deuteacutereacute Le nouveau solvant est un meacutelange H2OMeOH 4060
auquel a eacuteteacute ajouteacute 05 M d‟acide aceacutetique et 1 de D2O Il est conserveacute agrave -20degC avant
chaque utilisation Un sachet de glace est eacutegalement deacuteposeacute sur la seringue contenant le
solvant lors de l‟analyse par MS Le lavage des capillaires en PEEK (boucle et celui
183
d‟introduction de l‟eacutechantillon dans le spectromegravetre de masse) est deacutesormais reacutealiseacute gracircce au
nouveau solvant Puis j‟ai testeacute l‟effet du deacutebit d‟injection sur la reacutetention du marquage dans
la laquo cryosource raquo (Fig IV 24 et Fig IV 25) Les reacutesultats montrent que pheacutenomegravene
s‟amplifie avec l‟augmentation du deacutebit ce qui est inattendu
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350microLh
600 microLh (10 microLmin)
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3
Fig IV 24 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Les analyses sont reacutealiseacutees dans lrsquoordre
croissant du deacutebit drsquoinjection
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
1
2
3
Fig IV 25 Zoom de la Fig IV 24 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les mecircmes expeacuteriences ont ensuite eacuteteacute reacutealiseacutees en changeant l‟ordre des diffeacuterents deacutebits
d‟injection testeacutes (Fig IV 26 et Fig IV 27)
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
23
Fig IV 26 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 600 microLh est testeacute en
premier puis celui de 150 microLh et enfin celui de 350 microLh
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150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
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3
Fig IV 27 Zoom de la Fig IV 26 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les reacutesultats ne sont pas reproductibles Nous deacutecidons alors de raccourcir au maximum le
capillaire en PEEK qui transfegravere le solvant dans la laquo cryosource raquo (67 cm 22 cm) et de
recommencer une nouvelle seacuterie de mesures en changeant une nouvelle fois l‟ordre des
diffeacuterents deacutebits d‟injection testeacutes (Fig IV 28) Les reacutesultats obtenus ne sont toujours pas
satisfaisants
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
1
2
3
Fig IV 28 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 150 microLh est testeacute en
premier puis celui de 360 microLh et enfin celui de 350 microLh
Nous avons ensuite voulu deacutecoupler l‟effet du deacutebit agrave celui du temps en reacutealisant trois fois
conseacutecutivement la mecircme expeacuterience dans les mecircmes conditions avec le mecircme deacutebit et en
testant les deux deacutebits extrecircmes 2 microLmin et 10 microLmin (reacutealisation de triplicats) De
nouvelles conditions expeacuterimentales ont eacuteteacute deacutefinies La laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee pendant
trente minutes apregraves qu‟elle ait atteint sa tempeacuterature de -30degC Auparavant les analyses
eacutetaient lanceacutees sans l‟eacutetape de stabilisation de la laquo cryosource raquo De plus l‟ajout d‟azote
liquide dans le reacutecipient servant agrave refroidir le systegraveme n‟est deacutesormais plus effectueacute pendant
l‟analyse mais uniquement entre deux analyses Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig IV 29
Le nombre de deuteacuteriums n‟est toujours pas stable lors de l‟analyse par MS
Il semblerait que la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la laquo cryosource raquo ne soit pas homogegravene en
tout point L‟ajout d‟une seconde sonde thermique proche de la source du spectromegravetre de
masse pourrait mettre en eacutevidence le diffeacuterentiel de tempeacuterature
Une ideacutee serait de rincer la boucle d‟injection avec un solvant identique mais
complegravetement deuteacutereacute (D2OCH3ODCH3COOD) afin de comparer les reacutesultats
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
600 microLh (10 microLmin)
Fig IV 29 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour les deacutebits drsquoinjection
de 2 microLmin et 10 microLmin sans incubation dans H2O glaceacutee
Le peptide KKDDDDDDIIKIIK semble ecirctre tregraves sensible vis-agrave-vis de la deuteacuteration agrave un
(ou plusieurs) paramegravetre(s) relatif(s) agrave l‟utilisation de la laquo cryosource raquo que nous n‟identifions
ni ne controcirclons Pour veacuterifier si ces problegravemes eacutetaient geacuteneacuteraux ou speacutecifiques de ce peptide
nous avons deacutecideacute deffectuer nos tests sur un peptide plus classique le Glufibrinopeptide
(GluF)
IV3323 Cas du peptide GluF
Le peptide GluF n‟est pas un peptide classiquement utiliseacute pour la mise au point
d‟expeacuteriences HDXMS mais il nous sert au laboratoire comme standard de calibration en
MSMS car il se fragmente pour donner de nombreux ions b et y en CID
Fort heureusement lanalyse du GluF agrave laide de la cryosource apregraves incubation dans D2O
et dilution dans les solvants hydrogeacuteneacutes indique que le marquage reste stable au cours de
l‟analyse par spectromeacutetrie de masse (Fig IV 30) Ces reacutesultats montrent que les problegravemes
que nous avons rencontreacutes preacuteceacutedemment semblent lieacutes agrave la nature du peptide K2D6IIKIIK et
permettent enfin de valider lutilisation de la laquo cryosource raquo minutieusement optimiseacutee pour
des eacutetudes HDXMS
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
Fig IV 30 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse apregraves injection du peptide
GluF deuteacutereacute dans la laquo cryosource raquo
IV34 Conclusion
Nous avons deacuteveloppeacute un nouveau systegraveme dintroduction des proteacuteines deuteacutereacutees dans le
spectromegravetre de masse que nous avons appeleacute laquo cryosource raquo Lutilisation de cette
laquo cryosource raquo permet le stockage des eacutechantillons dans une enceinte isoleacutee agrave -30degC ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs (une heure) et permet eacutegalement de travailler
avec des deacutebits faibles de lordre de 2 microLmin
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de peptides seacutelectivement marqueacutes et eacutegalement sur lubiquitine proteacuteine modegravele de 86
kDa
L‟analyse du peptide de reacutefeacuterence KKDDDDDDIIKIIK a permis une optimisation plus
fine des paramegravetres Des ameacuteliorations techniques ont eacuteteacute apporteacutees Le solvant utiliseacute pour
pousser l‟eacutechantillon jusqu‟agrave la source du spectromegravetre de masse a eacuteteacute modifieacute Il a eacuteteacute
acidifieacute (acide aceacutetique 05M) et deuteacutereacute (1 D2O) afin d‟avoir la mecircme composition que
celle de l‟eacutechantillon Il a eacutegalement eacuteteacute conserveacute agrave -20degC avant son utilisation L‟analyse est
reacutealiseacutee avec un sachet de glace sur la seringue contenant le solvant et le capillaire en PEEK
d‟entreacutee dans la laquo cryosource raquo a eacuteteacute raccourci (67 cm 22 cm) La sortie de la
laquo cryosource raquo assurant le couplage avec la source ESI a eacuteteacute quant agrave elle isoleacutee La
188
tempeacuterature optimale de la laquo cryosource raquo est de -30degC pour un deacutebit optimum de 25 microLmin
Avant le deacutebut des analyses la laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee agrave -30degC pendant trente minutes
pendant lesquelles le solvant est continuellement injecteacute permettant le rinccedilage des capillaires
Le remplissage d‟azote liquide pour le refroidissement du systegraveme est reacutealiseacute entre deux
analyses concomitamment agrave une eacutetape de lavage des capillaires de vingt minutes gracircce au
solvant
La toute derniegravere innovation apporteacutee agrave la laquo cryosource raquo est l‟ajout d‟un ventilateur afin
d‟homogeacuteneacuteiser la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la boicircte
Notre objectif final est dutiliser le dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes que
nous avons deacuteveloppeacute dans une approche HDX top-down ECD pour obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques responsables de l‟initiation de la traduction dans le
cadre dune collaboration avec laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique Et plus
geacuteneacuteralement de fournir agrave la communauteacute des biologistes structuraux une meacutethodologie
robuste pour l‟analyse de proteacuteines et complexes proteacuteiques par eacutechanges isotopiques HD et
spectromeacutetrie de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR)
J‟aimerais souligner le fait que des travaux similaires ont eacuteteacute meneacutes par l‟eacutequipe du Prof
T Joslashrgensen au Danemark pour le mecircme objectif de reacuteduire le laquo back-exchange raquo lors
d‟eacutetudes HDX par top-down ECD ou ETD Dans leur cas ils ont deacuteveloppeacute un systegraveme de
refroidissement des eacutechantillons agrave -15degC tout aussi efficace agrave partir du systegraveme TriVersa
NanoMate de la socieacuteteacute Advion (28)
189
IV4 Bibliographie
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191
Conclusion geacuteneacuterale
192
193
Lobjectif initial de ce travail de thegravese eacutetait de mettre au point une meacutethode robuste top-
down HDX-MSMS (cest-agrave-dire combinant eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium en solution et
fragmentation de proteacuteines entiegraveres en phase gazeuse) pour pouvoir obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques reacuteels Combiner eacutechanges HD et spectromeacutetrie de
masse nest pas nouveau mais les meacutethodes classiquement utiliseacutees dites bottom-up et
baseacutees sur une digestion enzymatique preacutesentent linconveacutenient majeur decirctre peu reacutesolutives
(5-10 acides amineacutes en moyenne) Mettre au point des approches sur proteacuteines entiegraveres
preacutesente sur le principe un grand nombre davantages le premier gain attendu est pour la
reacutesolution (qui peut atteindre un seul acide amineacute) le second est pour leacutechange inverse
(laquo back-exchange raquo) qui devrait en theacuteorie ecirctre plus limiteacute car le nombre deacutetapes lors
desquels ce pheacutenomegravene peut se produire (digestion enzymatique seacuteparation
chromatographique) est reacuteduit
Ce travail de thegravese montre cependant quil nest pas aiseacute de mettre une meacutethode top-down
HDX au point et que nous avons ducirc faire face agrave un certain nombre de problegravemes
Tout dabord les reacutesultats obtenus pour les peptides que lon peut seacutelectivement marquer
montrent quil est important doptimiser de maniegravere fine un certain nombre de paramegravetres
expeacuterimentaux que ce soit dans la source dionisation ou agrave diffeacuterents endroits de linstrument
pour eacuteviter au maximum leacutechange inverse entre deuteacuteriums et hydrogegravenes Nos reacutesultats
montrent eacutegalement que ces paramegravetres sont deacutependants du spectromegravetre de masse sur lequel
les expeacuteriences sont reacutealiseacutees et que lanalyse de peptides seacutelectivement marqueacutes devrait ecirctre
un preacute-requis pour toutes les eacutetudes par eacutechange HD Nos reacutesultats confirment eacutegalement que
lECD peut ecirctre utiliseacute pour localiser de maniegravere preacutecise les deuteacuteriums dans la seacutequence et
quune reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue ce qui est une ameacutelioration majeure
par rapport aux expeacuteriences classiques de bottom-up sans fragmentation
Sur la base du protocole optimiseacute pour des peptides nous avons souhaiteacute poursuivre
lanalyse du complexe aIF2 impliqueacute dans linitiation de la traduction chez les archeacutees Nous
avons alors fait face agrave un certain nombre de problegravemes Le premier a eacuteteacute le manque de
reproductibiliteacute de nos expeacuteriences avec des variations importantes au niveau du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes et de leur localisation Un point crucial que nous avons mis en
eacutevidence au cours de nos travaux est que pour une proteacuteine contrairement agrave un peptide le
nombre de fragments est important leur intensiteacute couvre un large domaine dynamique et la
deuteacuteration reacuteduit fortement l‟intensiteacute totale Par conseacutequent il est neacutecessaire d‟accumuler un
194
grand nombre de scans MSMS pour faire augmenter le rapport signal sur bruit des fragments
peu intenses et que dans ce cas le problegraveme de leacutechange inverse devient majeur En effet
alors que pour des peptides leacutelargissement des pics ducirc agrave la deuteacuteration ne pose pas reacuteellement
de problegraveme danalyse car les masses des fragments ne sont pas tregraves eacuteleveacutees et le nombre de
fragments nest pas tregraves important le problegraveme est tout autre quand on passe sur des systegravemes
plus grands ne serait-ce que pour une petite proteacuteine de 10 kDa Ainsi il devient tout agrave fait
crucial de pouvoir accumuler pendant un temps suffisant pour pouvoir analyser correctement
les massifs isotopiques larges qui sont obtenus (et qui seacutelargissent au fur et agrave mesure que la
cineacutetique de deuteacuteration avance) Par ailleurs le nombre de fragments obtenus pour une
proteacuteine de 10 kDa est bien supeacuterieur agrave ce que lon attend pour un peptide et le
chevauchement des massifs isotopiques dans les spectres MSMS devient eacutegalement un
problegraveme qui conduit agrave une diminution importante des couvertures de seacutequence entre
leacutechantillon non deuteacutereacute et leacutechantillon deuteacutereacute
Nos reacutesultats obtenus sur aIF2 sont neacuteanmoins prometteurs et montrent quil est reacuteellement
possible dobtenir une reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves sur certains segments de la proteacuteine et
que de nouvelles ameacuteliorations de lapproche devraient permettre darriver agrave lobjectif initial
que nous nous eacutetions fixeacutes LECD et lETD sont des meacutethodes de choix pour ces approches
mais certains reacutesultats que nous avons obtenus en CID montrent quil est sans doute possible
dutiliser ce mode de fragmentation installeacute sur tous les spectromegravetres de masse sous
certaines conditions qui restent encore agrave deacuteterminer
Lensemble de nos reacutesultats nous a ainsi conduits agrave consideacuterer que notre systegraveme
dintroduction des eacutechantillons baseacute initialement sur une seringue refroidie ne convenait pas
aux approches top-down et quil eacutetait absolument essentiel de trouver une solution
alternative permettant de maintenir le taux de deuteacuteration initial pendant un temps
suffisamment long pour quun grand nombre de scans MSMS puissent ecirctre accumuleacutes Nous
avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme complegravetement diffeacuterent de ce qui existe
aujourdhui dans les diffeacuterentes eacutequipes travaillant dans le domaine baseacute sur lutilisation dune
enceinte isoleacutee refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des
deacutebits faibles Le deacuteveloppement de cette cryosource nous a pris plusieurs mois car
maintenir une tempeacuterature de -30degC pour le stockage des eacutechantillons jusquagrave leur
introduction dans le spectromegravetre de masse induit un certain nombre de contraintes (viscositeacute
du solvant formation de bouchons difficulteacute agrave reacutealiser des meacutelanges homogegravenes sur des
195
temps courts) Neacuteanmoins les reacutesultats que nous avons obtenus avec la derniegravere version
optimiseacutee sont tregraves encourageants car ils montrent quil est deacutesormais possible de travailler
pendant des temps longs avec les eacutechantillons deuteacutereacutes sans que le taux de deuteacuteration ne
varie au cours de lanalyse Malheureusement nous navons pas eu le temps au cours de ma
thegravese de revenir sur les proteacuteines du complexe aIF2 et de les analyser avec ce nouveau
systegraveme dintroduction mais nous pensons que lutilisation de cette source devrait enfin
rendre notre approche robuste et applicable agrave des eacutechantillons reacuteels
Ainsi je considegravere que mon travail de thegravese a permis de faire un grand pas en avant pour
rendre les approches top-down HDX applicables agrave des systegravemes preacutesentant un inteacuterecirct
biologique important (ce qui nest pas exactement le cas de tout ce qui a eacuteteacute deacutecrit dans la
litteacuterature jusquici) et que dans quelques anneacutees ces approches complegraveteront de maniegravere
robuste larsenal des meacutethodes danalyse utiliseacutees en biologie structurale apportant des
informations compleacutementaires agrave ce que la RMN ou les rayons X sont capables de fournir
196
197
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes
198
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
199
A1 Instrumentation
A11 Ionisation par eacutelectrospray
La premiegravere eacutetape d‟une expeacuterience par spectromeacutetrie de masse consiste agrave vaporiser et
ioniser l‟analyte (des moleacutecules) ie agrave former agrave partir d‟un milieu gazeux liquide ou solide
des moleacutecules ioniseacutees isoleacutees manipulables dans le vide pousseacute preacutesent dans le spectromegravetre
de masse Pour cela diffeacuterentes sources d‟ionisation ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees adapteacutees agrave diffeacuterents
types d‟eacutechantillons et agrave diffeacuterents analyseurs
L‟eacutelectroneacutebulisation (ou eacutelectrospray ESI) est une meacutethode d‟ionisation agrave pression
atmospheacuterique qui permet de transfeacuterer et ioniser simultaneacutement des macromoleacutecules intactes
(eg des proteacuteines) preacutesentes en solution en phase gazeuse La formation des ions en phase
gazeuse par cette technique est reacutealiseacutee par des meacutecanismes de deacutesolvatation peu eacutenergeacutetiques
n‟induisant quasiment pas de fragmentation L‟eacutelectrospray est donc consideacutereacutee comme une
technique dionisation douce par opposition agrave d‟autres techniques comme l‟impact
eacutelectronique technique tregraves eacutenergeacutetique qui conduit agrave un grand nombre de fragmentations lors
de leacutetape dionisation De plus les ions isoleacutes sont formeacutes directement agrave partir des moleacutecules
en solution ce qui permet d‟eacuteviter une eacutetape de vaporisation par chauffage qui peut conduire
agrave la deacutegradation de l‟analyte L‟eacutelectroneacutebulisation a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par John Fenn (1) sur la
base de travaux plus anciens de Malcolm Dole (2) et John Zeleny (3) et aujourd‟hui elle est
(avec le MALDI) la meacutethode de choix pour l‟eacutetude des biomoleacutecules par spectromeacutetrie de
masse
La formation des ions en phase gazeuse par eacutelectrospray se deacuteroule en trois eacutetapes
principales (i) formation des gouttelettes chargeacutees agrave l‟extreacutemiteacute dun capillaire meacutetalliseacute (ii)
eacutevaporation du solvant et fission des gouttelettes par explosions coulombiennes successives
et finalement (iii) obtention d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir des gouttelettes
fortement chargeacutees issues des deux premiegraveres eacutetapes Les meacutecanismes preacutecis de la formation
des espegraveces ioniseacutees et deacutesolvateacutees dans les deux derniegraveres eacutetapes sont aujourd‟hui encore
assez mal deacutefinis et sujets agrave controverse
200
A111 Formation des gouttelettes chargeacutees
L‟eacutetape initiale du processus d‟eacutelectrospray est la formation de gouttelettes chargeacutees agrave
partir d‟une solution Pour cela l‟eacutechantillon est introduit dans un capillaire meacutetallique (ou
une aiguille meacutetalliseacutee) porteacute agrave un fort potentiel eacutelectrique de plusieurs kilovolts (kV)
L‟application d‟une telle diffeacuterence de potentiel entre ce capillaire et une contre-eacutelectrode
placeacutee quelques millimegravetres plus loin induit une seacuteparation des charges agrave linteacuterieur du liquide
par un pheacutenomegravene eacutelectrophoreacutetique de migration des eacutelectrolytes (cations et anions) Lorsque
le capillaire est utiliseacute comme eacutelectrode positive les espegraveces cationiques s‟accumulent alors agrave
son extreacutemiteacute tandis que les anions migrent en sens inverse en s‟accumulant agrave l‟inteacuterieur
jusqu‟agrave s‟oxyder agrave la surface du capillaire (Fig A 1)
Fig A 1 Scheacutema simplifieacute du fonctionnement drsquoune source eacutelectrospray (4)
Ainsi en mode dit positif les cations sont attireacutes par l‟eacutelectrode neacutegative (contre-
eacutelectrode) et les anions par l‟eacutelectrode positive (capillaire) La seacuteparation des charges induit
une deacuteformation du liquide agrave l‟extreacutemiteacute du capillaire deacuteformation qui met en jeu un
eacutequilibre entre les forces eacutelectrostatiques (reacutepulsives) et la tension de surface (attractive) du
liquide Lorsque les forces eacutelectrostatiques atteignent la valeur de la tension de surface du
liquide la deacuteformation est conique et porte le nom de cocircne de Taylor (5) Une faible
augmentation du champ eacutelectrique suffit alors agrave deacutestabiliser le cocircne qui se rompt agrave son
extreacutemiteacute dispersant la solution en nombreuses gouttelettes qui emportent une partie des
charges preacutesentes agrave la pointe Apregraves cette eacutetape les gouttelettes se deacuteplacent sous l‟influence
du champ eacutelectrique mais eacutegalement sous celle d‟un gradient de pression creacuteeacute par la
deacutepression agrave lentreacutee du spectromegravetre de masse
201
A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes
Les gouttelettes chargeacutees issues du cocircne de Taylor migrent donc vers l‟interface du
spectromegravetre de masse Sur leur trajet elles entrent en collision avec le gaz atmospheacuterique et
suivant les interfaces avec un gaz de seacutechage et subissent une eacutevaporation du solvant alors
que le nombre de charges reste constant L‟eacutevaporation du solvant est favoriseacutee par la
tempeacuterature souvent eacuteleveacutee de la source dionisation (80-140degC) La diminution du rayon R
des gouttelettes posseacutedant une charge constante q conduit agrave l‟augmentation de la reacutepulsion
eacutelectrostatique des charges agrave sa surface jusqu‟agrave ce que les gouttelettes atteignent la limite de
stabiliteacute de Rayleigh donneacutee par
213
0 )(8 RqRy
ougrave 0 permittiviteacute du vide R rayon de densiteacute de charges et tension de surface stabilisant
la goutte
Cette eacutequation donne les conditions pour lesquelles les forces de reacutepulsions
eacutelectrostatiques deviennent eacutegales agrave celles de tension de surface A partir de la limite de
Rayleigh la gouttelette chargeacutee devient instable ce qui conduit agrave une explosion
coulombienne correspondant agrave la fission de la gouttelette en gouttelettes de plus petites tailles
Les travaux de Rayleigh en 1882 (6) puis de Gomez et Tang en 1994 (7) ont montreacute que la
fission des gouttelettes s‟effectuait par eacutemission d‟un jet tregraves fin de gouttelettes sans reacuteelle
relation de symeacutetrie Ce pheacutenomegravene d‟eacutevaporation se reproduit jusqu‟agrave ce que les nouvelles
gouttelettes aient agrave nouveau atteint la limite de Rayleigh
A113 Formation drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites
gouttelettes fortement chargeacutees
Dans la litteacuterature deux meacutecanismes ont eacuteteacute proposeacutes pour expliquer ce pheacutenomegravene Le
premier modegravele dit modegravele des reacutesidus chargeacutes ou laquo Charged Residue Model raquo (CRM) a eacuteteacute
deacutecrit par Dole en 1968 (2) L‟hypothegravese est la suivante la succession d‟explosions
coulombiennes conduirait agrave des gouttelettes de plus en plus petites jusqu‟agrave ce que la derniegravere
gouttelette ne possegravede plus qu‟une seule et unique moleacutecule d‟analyte (Fig A 2 (a)) Dans
ce modegravele l‟eacutevaporation totale du solvant reacutesiduel accumule les charges sur l‟analyte et
permet l‟obtention d‟ions multichargeacutes en phase gazeuse
202
En 1979 une seconde theacuteorie baseacutee sur de nouveaux meacutecanismes a eacuteteacute proposeacutee par Iribarne
et Thomson (8) Il s‟agit du modegravele de l‟eacutevaporation ionique ou laquo Ion Evaporation Model raquo
(IEM) Leur theacuteorie repose comme celle de Dole sur une succession initiale de fissions de
type coulombiennes qui reacuteduit la taille des gouttelettes et augmente leur densiteacute de charge
Cependant selon la theacuteorie dIribarne et Thomson pour des gouttelettes avec un rayon tregraves
petit (de l‟ordre de 10 nm) et une densiteacute de charge tregraves eacuteleveacutee le champ eacutelectrostatique agrave leur
surface serait assez intense pour expulser directement des ions preacuteformeacutes en phase gazeuse
(Fig A 2 (b)) Ce pheacutenomegravene appeleacute eacutevaporation ionique suggegravere que l‟explosion
coulombienne ne constitue pas le meacutecanisme majoritaire pour les petites gouttelettes de rayon
R le 10 nm
Fig A 2 Les deux theacuteories de lrsquoobtention drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de
gouttelettes chargeacutees (a) Modegravele des reacutesidus chargeacutes par Dole (b) Modegravele de lrsquoeacutevaporation
ionique par Iribarne et Thomson
Cependant aujourd‟hui encore aucun de ces deux modegraveles n‟est consideacutereacute comme
applicable agrave l‟ensemble des pheacutenomegravenes observeacutes en eacutelectrospray (9) Le consensus semble
ecirctre l‟existence d‟un effet de taille de l‟analyte les grosses moleacutecules eacutetant plutocirct orienteacutees
vers une formation d‟ions en phase gazeuse par le meacutecanisme de reacutesidus chargeacutes de Dole (10-
12) John B Fenn eacutemet l‟hypothegravese que cette theacuteorie s‟applique aux moleacutecules de haut poids
moleacuteculaire agrave partir du moment ougrave les dimensions lineacuteaires de ces moleacutecules sont
sensiblement plus grandes que la gouttelette qui les contient
Quel que soit le meacutecanisme responsable de la formation des ions en phase gazeuse
leacutelectrospray est aujourdhui une meacutethode dionisation extrecircmement utiliseacutee dans des
domaines varieacutes (biologie chimie pharmaciehellip)
203
A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS)
Parmi les diffeacuterents spectromegravetres de masse commercialiseacutes les instruments FT-ICR et
Orbitrap occupent une place de choix pour l‟eacutetude de proteacuteines entiegraveres par approche laquo top-
down raquo en raison de leurs tregraves grandes performances en termes de reacutesolution et de preacutecision
sur la mesure de masse
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
Notre eacutetude sur les peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen qui est preacutesenteacutee dans le
Chap II de ce manuscrit a eacuteteacute reacutealiseacutee sur un spectromegravetre APEX III de Bruker (Brecircme
Allemagne) eacutequipeacute d‟un aimant supraconducteur de 7 Tesla d‟une cellule ICR de type
Infinity Cell et d‟une source eacutelectrospray Apollo I
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Fig A 3 Scheacutema du FT-ICR APEX III Bruker de la source eacutelectrospray agrave la cellule ICR
Infinity Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Les ions sont formeacutes au niveau de la source ESI puis transfeacutereacutes via un ensemble de
lentilles eacutelectrostatiques au centre de la cellule de pieacutegeage situeacutee au cœur de l‟eacutelectroaimant
supraconducteur (Fig A 3)
Un hexapocircle de stockage est inseacutereacute apregraves le capillaire de transfert de la source eacutelectrospray
et avant le systegraveme de transfert eacutelectrostatique afin dy accumuler les ions avant de les
envoyer dans la cellule ICR Cette derniegravere placeacutee dans un vide pousseacute (10-10
mbar environ)
repreacutesente l‟eacuteleacutement cleacute du spectromegravetre puisqu‟elle va servir d‟analyseur et de deacutetecteur par
la mesure de la freacutequence cyclotron des ions pieacutegeacutes
204
Au cours de cette thegravese notre spectromegravetre a beacuteneacuteficieacute d‟importantes eacutevolutions
instrumentales Ainsi en janvier 2011 nous avons fait l‟acquisition du chariot de la socieacuteteacute
Sanofi-Aventis de Toulouse notre APEX III devenant alors APEX-Q Les principales
diffeacuterences entre les deux instruments sont l‟ajout d‟un quadripocircle et d‟une cellule de
collision et la source d‟ionisation (Apollo I sur lAPEX III et CombiSource premier modegravele
sur l‟APEX-Q) (Fig A 4)
Ion transfer
optics
UV Laser
Lens
Windows
Mirror
Medium pressure
chamber
Movable
hexapole
PPP
MALDI
sample
plate
Second
skimmer
Ion transfer
capillary
ESI
skimmer
Funnel
Electrospray
nebulizer
End
cap
ICR trap
Attenuator Magnet
Mirrors
PP
P
Storage hexapole
Trapextractplate
Collision
gas tube
Pulsed
valve
Collision hexapole
Quadrupole
ESI
Sprayed
sample
Hollow
cathode
IRMPDECD
Fig A 4 Scheacutema du FT-ICR APEX-Q Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity
Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Puis en avril 2012 nous avons reccedilu le nouveau chariot de Bruker le SolariX (Fig A 5) Il
apporte les ameacuteliorations suivantes une combisource nouvelle geacuteneacuteration l‟ajout d‟un
module ETS (possibiliteacutes de CID ou d‟ECDETD) et d‟un hexapocircle pour acheminer les ions
de la cellule de collision agrave la cellule ICR (Fig A 6)
205
Fig A 5 Photographie du FT-ICR SolariX (Bruker)
Fig A 6 Scheacutema du FT-ICR SolariX Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity Cell
(drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Comme il a deacutejagrave eacuteteacute speacutecifieacute dans le Chap III de ce manuscrit nous avons eacutegalement eacuteteacute
ameneacutes agrave travailler sur l‟APEX-Qe d‟Orsay Les diffeacuterences majeures entre l‟APEX III et
l‟APEX-Qe sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
206
A1211 Principe physique
Le principe de la spectromeacutetrie de masse agrave reacutesonance cyclotronique ionique (laquo Ion
Cyclotron Resonance raquo ICR) repose sur le fait qu‟une particule chargeacutee animeacutee dune vitesse
v se deacuteplaccedilant dans un champ magneacutetique uniforme B subit la force de Lorentz (Eq A 1)
BvqF
(Eq A 1)
Cette force conduit la particule chargeacutee agrave adopter une trajectoire heacutelicoiumldale autour d‟un
axe parallegravele agrave celui du champ magneacutetique B (conventionnellement axe z) dont la projection
dans le plan orthogonal (xy) est un mouvement circulaire uniforme (Fig A 7)
Fig A 7 Mouvement cyclotron drsquoun ion dans un champ magneacutetique
Ce mouvement de rotation est appeleacute mouvement cyclotron et en l‟absence de champ
eacutelectrique sa freacutequence νc ne deacutepend que du champ magneacutetique et du rapport masse sur
charge (Eq A 2) On conccediloit degraves lors quune mesure de cette freacutequence de rotation permet
une deacutetermination du rapport mz de lespegravece consideacutereacutee
zm
B
m
Bqc
105356111
2
7
(Eq A 2)
A1212 Pieacutegeage des ions
Jusquici seul le mouvement dans le plan xy a eacuteteacute consideacutereacute En labsence dautres champs
la vitesse suivant laxe z reste constante et la trajectoire reacutesultante est un mouvement
heacutelicoiumldal autour dun axe parallegravele agrave z qui se poursuivra indeacutefiniment Pour construire un
piegravege une possibiliteacute est de fermer le mouvement suivant z par deux plaques de pieacutegeage
207
perpendiculaires agrave laxe z porteacutees agrave un potentiel reacutepulsif Ainsi est neacutee la cellule ICR aussi
appeleacutee piegravege de Penning et le premier modegravele en est la cellule cubique (Fig A 8)
Fig A 8 Cellule cubique simple (13)
Sil eacutetait possible dappliquer un champ eacutelectrique homogegravene parallegravele au champ
magneacutetique avec des plaques de longueurs infinies le mouvement dun ion serait heacutelicoiumldal
avec des oscillations peacuteriodiques suivant laxe z Cette freacutequence d‟oscillations ou freacutequence
de pieacutegeage νt est principalement due aux reacutepulsions successives des deux plaques de
pieacutegeage et peut ecirctre exprimeacutee par (Eq A 3)
2
2
2
1
am
Vq trap
t
(Eq A 3)
ougrave Vtrap potentiel de pieacutegeage a distance entre les deux plaques et α facteur geacuteomeacutetrique
eacutegal agrave 2 dans le cas ideacuteal
Cependant il n‟est pas possible de se situer dans le cas ideacuteal d‟un champ eacutelectrique
homogegravene qui suppose des plaques infinies Le champ eacutelectrique ne peut pas ecirctre exactement
parallegravele au champ magneacutetique et une composante radiale est alors agrave prendre en compte Par
conseacutequent un troisiegraveme mouvement propre au mouvement de deacuteplacement des charges
pieacutegeacutees s‟ajoute aux deux preacuteceacutedents mouvements (cyclotron et pieacutegeage) Ce mouvement dit
mouvement magneacutetron s‟oppose agrave la force de Lorentz et se traduit par un abaissement de la
freacutequence cyclotronique
208
Ce pieacutegeage suppose toutefois que la trajectoire des ions les ait ameneacutes agrave ecirctre confineacutes
dans la cellule Cela peut ecirctre obtenu en produisant des ions in situ (ionisation eacutelectronique
MALDI) mais des difficulteacutes suppleacutementaires sont agrave prendre en compte lorsque les ions sont
formeacutes initialement agrave l‟exteacuterieur de la cellule (cas de l‟ionisation par eacutelectrospray) En effet la
conservation de l‟eacutenergie cineacutetique impose que pour des ions transporteacutes suivant l‟axe z s‟ils
ont suffisamment d‟eacutenergie pour entrer dans la cellule et que le potentiel des plaques ne
change pas ils en ont assez pour ressortir
Le pieacutegeage dynamique est une solution agrave ce problegraveme au lieu dappliquer des tensions
continues sur les plaques de pieacutegeage on va jouer sur des variations de tension pour sassurer
du pieacutegeage des ions On synchronise les tensions sur la plaque de la cellule situeacutee cocircteacute source
avec le deacuteplacement des ions (Fig A 9) Neacuteanmoins cette technique introduit une
discrimination en masse par la diffeacuterence de temps de vol des espegraveces
Fig A 9 Principe du pieacutegeage dynamique des ions
A1213 Obtention des spectres de masse
Une fois les ions pieacutegeacutes la mesure de leur freacutequence cyclotronique n‟est pas possible
directement Bien qu‟ayant une freacutequence de rotation identique tous les ions de mecircme rapport
masse sur charge ne preacutesentent pas un mouvement coheacuterent En effet les ions ont eacuteteacute produits
agrave des temps variables et avec des eacutenergies cineacutetiques diffeacuterentes ce qui se traduit par une
209
phase (position sur l‟orbite) et un rayon variables Afin de pouvoir mesurer les freacutequences
cyclotroniques il est neacutecessaire que ce mouvement global devienne coheacuterent ie que tous les
ions de mecircme rapport masse sur charge se preacutesentent avec la mecircme phase et avec le mecircme
rayon Ce reacutesultat est obtenu par une proceacutedure d‟excitation-deacutetection deacutetailleacutee ci-apregraves
Excitation des ions
Comme cela vient d‟ecirctre dit une fois pieacutegeacutes les ions de mecircme rapport masse sur charge
ont la mecircme freacutequence cyclotronique mais ne forment pas un paquet coheacuterent En effet la
position de leur axe de rotation et la phase de leur mouvement ne sont pas eacutegales De plus le
rayon de leur orbite cyclotronique est trop faible pour induire un quelconque signal sur les
plaques de deacutetection L‟application d‟un pulse de radiofreacutequence sur les plaques d‟excitation agrave
leur freacutequence cyclotron permet de rendre le mouvement des ions coheacuterent et de les conduire
sur une trajectoire de mecircme rayon agrave proximiteacute des plaques de deacutetection En effectuant un
balayage de freacutequence il est possible d‟exciter des populations d‟ions de rapports masse sur
charge diffeacuterents qui adoptent alors une trajectoire circulaire de mecircme rayon avec des
freacutequences de rotation diffeacuterentes Cette eacutetape permet non seulement d‟obtenir des paquets
d‟ions deacutecrivant un mouvement coheacuterent mais aussi de les rapprocher des deux plaques de
deacutetection afin de pouvoir analyser ce mouvement Dans le cas ideacuteal il conviendrait d‟exciter
les ions sur une orbite la plus grande possible afin d‟augmenter le signal et la sensibiliteacute
Cependant ceci n‟est pas applicable puisque la non homogeacuteneacuteiteacute du champ eacutelectrique pregraves
des plaques conduirait agrave l‟eacutejection progressive des ions C‟est la raison pour laquelle il est
usuel de ne pas exciter les ions sur des rayons supeacuterieurs agrave 08 fois le rayon de la cellule
Plusieurs types de champs eacutelectriques sinusoiumldaux peuvent ecirctre appliqueacutes pour exciter les
ions La Fig A 10 preacutesente trois types d‟excitations diffeacuterentes
210
a)
b)
c)
a)
b)
c)
Fig A 10 Types drsquoexcitations usuellement utiliseacutees agrave gauche dans le domaine temporel et agrave
droite dans le domaine des freacutequences (a) sinusoiumlde monofreacutequence tronqueacutee (b) balayage
de freacutequence (chirp) (c) balayage par SWIFT
Le premier type permet l‟excitation des ions agrave une seule freacutequence (Fig A 10 (a))
L‟excitation monofreacutequence n‟est donc pas vraiment utile pour la deacutetection de tous les ions
preacutesents dans la cellule qui est le cas le plus couramment rencontreacute En effet dans ce cas il
faudrait reacutealiser une excitation monofreacutequence pour chacun des ions preacutesents Il est donc
preacutefeacuterable d‟utiliser un mode d‟excitation par balayage de freacutequence (Fig A 10 (b)) qui va
balayer toute la gamme de freacutequences des ions en une seule impulsion Le balayage par
SWIFT (laquo Stored-Waveform Inverse Fourier Transform raquo) (Fig A 10 (c)) permet de calculer
l‟onde d‟excitation agrave partir du domaine des rapports masse sur charge eacutetudieacute Cependant le
SWIFT n‟est employable que sur les instruments eacutequipeacutes d‟un geacuteneacuterateur arbitraire de
freacutequences
Deacutetection du courant induit
La rotation coheacuterente des ions sur une orbite large creacutee un courant induit sur les deux
plaques de deacutetection qui est deacutetectable apregraves amplification par une eacutelectronique adapteacutee Ce
courant est proportionnel agrave la charge totale du paquet d‟ions ayant un mouvement coheacuterent
et ne deacutepend pas de la freacutequence cyclotronique des ions
Forme du signal mesureacute
La collision des ions avec des moleacutecules de gaz reacutesiduelles pendant le temps de mesure
conduit agrave une perte de coheacuterence du paquet d‟ions et donc agrave une perte d‟intensiteacute du signal
211
De ce fait le signal obtenu correspond agrave une sinusoiumlde amortie exponentiellement (Fig A
11) Or la preacutecision en masse est directement lieacutee agrave la preacutecision sur la mesure de la freacutequence
de rotation cyclotron des ions pieacutegeacutes Par conseacutequent une mesure de masse preacutecise neacutecessite
une pression la plus faible possible dans la cellule
Fig A 11 Signal sinusoiumldal amorti exponentiellement (agrave gauche eacutechelle en temps) et le
reacutesultat apregraves transformation de Fourier (agrave droite eacutechelle en freacutequence)
Digitalisation et transformation de Fourier
Comme l‟indique le nom de l‟appareil c‟est la transformeacutee de Fourier (laquo Fourier
Transform raquo FT) qui permet de mesurer en une seule expeacuterience l‟ensemble des freacutequences
de rotation des ions (Fig A 12)
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
Fig A 12 Spectre de masse obtenu apregraves transformeacutee de Fourier du signal
Le courant induit mesureacute sur les plaques de deacutetection correspond agrave un interfeacuterogramme (ou
laquo Free Induction Decay raquo FID) ougrave les sinusoiumldes amorties de l‟ensemble des ions preacutesents
dans la cellule sont additionneacutees les unes aux autres La digitalisation de ce signal suivie
d‟une transformation de Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre
contenant les informations sur les freacutequences (convertibles en rapport masse sur charge via la
relation A 2) et les abondances des ions pieacutegeacutes dans la cellule En additionnant plusieurs
deacutetections successives il est possible d‟ameacuteliorer le rapport signal sur bruit du spectre
transformeacute
212
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse
La particulariteacute de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR qui consiste agrave ramener la mesure des
rapports masse sur charge agrave la mesure d‟une freacutequence lui confegravere ses caracteacuteristiques en
termes de reacutesolution Dans des conditions approprieacutees ie avec un vide tregraves pousseacute dans la
cellule permettant un enregistrement pendant un temps suffisamment long sans perte de
signal il est possible d‟atteindre des reacutesolutions supeacuterieures agrave 106 pour un ion de mz 1000
dans un champ magneacutetique de 7 Tesla En plus du temps d‟enregistrement pour obtenir de la
haute reacutesolution la principale contrainte est le transfert et le stockage d‟interfeacuterogrammes de
grande taille (jusqu‟agrave 8 Mega points) De ce fait la reacutesolution expeacuterimentale utiliseacutee est
freacutequemment de l‟ordre de 60 000 pour minimiser les temps d‟acquisition ainsi que la taille
de stockage
La preacutecision en masse deacutepend principalement de la reacutesolution mais eacutegalement de la charge
d‟espace En effet la preacutesence d‟un tregraves grand nombre d‟ions pieacutegeacutes dans la cellule modifie le
champ eacutelectrique et geacutenegravere une force de reacutepulsion entre les ions Cette force a pour
conseacutequence la deacuteviation de la trajectoire des ions ce qui biaise les mesures de masses Ce
pheacutenomegravene pose le problegraveme eacutevident de la calibration externe En effet pour que l‟eacutetalonnage
externe soit le plus preacutecis possible il faut qu‟il soit effectueacute avec une charge d‟espace
comparable agrave celle de l‟eacutechantillon ce qui est difficilement controcirclable Il est ainsi
recommandeacute de travailler avec de faibles quantiteacutes d‟ions pour limiter au maximum la
deacuteviation due agrave ce pheacutenomegravene Une preacutecision de lordre de quelques ppm est alors obtenue
Cependant l‟eacutetalonnage interne permet de saffranchir de ce problegraveme de charge d‟espace
puisque les ions calibrants sont preacutesents dans la cellule en mecircme temps que les ions de
l‟eacutechantillon et subissent la mecircme charge d‟espace On atteint alors en routine des preacutecisions
en masse de l‟ordre d‟une ppm voire moins
A1222 Sensibiliteacute
Des calculs theacuteoriques ont montreacute que le nombre de charges minimum ayant un
mouvement coheacuterent neacutecessaire pour deacutetecter un signal eacutetait de l‟ordre de 200 Ceci constitue
une limite ultime de la sensibiliteacute de ce type d‟instrument En pratique il faut tenir compte de
213
l‟efficaciteacute de chacune des eacutetapes permettant de passer de l‟analyte neutre aux ions pieacutegeacutes et
exciteacutes dans la cellule Il faut eacutegalement tenir compte des eacutetats de charge et de l‟existence de
massifs isotopiques qui augmentent le nombre de freacutequences sur lesquelles se reacutepartissent les
ions Les sensibiliteacutes records atteintes actuellement sur des peptides de masse 1000 Da sont
de l‟ordre de 10 attomoles consommeacutees en nano-eacutelectrospray Dans un instrument
commercial avec les protocoles standards on peut obtenir un signal exploitable avec environ
10 femtomoles de produit consommeacute
A1223 Gamme dynamique
Un point sur lequel la spectromeacutetrie de masse FT-ICR nest pas particuliegraverement bien
placeacutee est la gamme dynamique qui repreacutesente la capaciteacute agrave discriminer des ions
d‟abondances diffeacuterentes dans un mecircme spectre Le problegraveme est lieacute agrave celui de la charge
d‟espace dans la mesure ougrave les mouvements des ions de faible abondance sont perturbeacutes par
ceux des ions majoritairement preacutesents dans la cellule Il est admis qu‟il est difficile de
mesurer avec une bonne preacutecision la masse d‟un ion dont l‟abondance est infeacuterieure agrave 1 de
celle de l‟ion le plus abondant
A1224 Gamme de masse
La gamme de masse est quant agrave elle en theacuteorie quasiment illimiteacutee La limite de masse
infeacuterieure deacutepend uniquement de l‟eacutelectronique et plus preacuteciseacutement des capaciteacutes du
digitaliseur et du geacuteneacuterateur de freacutequences Pour un aimant de 7 Tesla eacutequipeacute d‟un
digitaliseur agrave 8 MHz cela eacutequivaut agrave une limite infeacuterieure de mz 29 En ce qui concerne la
limite supeacuterieure elle deacutepend de la capaciteacute de la cellule agrave pieacuteger les ions Dans le cas d‟un
aimant de 7 Tesla cette limite est atteinte pour un ion de mz 274 000 Malheureusement des
problegravemes apparaissent avant cette limite notamment agrave cause des limites sur les dureacutees
d‟acquisition de signal Les signaux des masses eacuteleveacutees correspondant agrave de basses freacutequences
se trouvent consideacuterablement eacutelargis (mz 274 000 eacutequivaut agrave mesurer une freacutequence de 393
Hz) De ce fait la limite expeacuterimentale couramment admise se situe agrave mz 27 000 pour un
aimant de 7 Tesla
214
A123 Technologie Orbitrap
L‟Orbitrap est une technologie relativement reacutecente (baseacutee sur le principe d‟un piegravege
orbitalaire eacutelectrostatique) inventeacutee par A Makarov (14) L‟Orbitrap repose sur le pieacutegeage
des ions par un champ eacutelectrostatique quadripolaire qui creacutee l‟oscillation des ions pieacutegeacutes Ces
oscillations proportionnelles au rapport (mz)-12
sont deacutetecteacutees par la mesure du courant
induit et traduites en spectre de masse par la transformeacutee de Fourier (Fig A 13) Il existe
donc de grandes similitudes au niveau de la deacutetection des ions par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR et Orbitrap
Fig A 13 Deacutetection des ions par la technologie Orbitrap Les courants induits correspondent
agrave un interfeacuterogramme qui est la superposition de freacutequences de plusieurs espegraveces Le
traitement du signal qui est reacutealiseacute de la mecircme maniegravere que par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR avec les mecircmes contraintes et limitations suivi eacutegalement drsquoune transformation de
Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre de freacutequence facilement
convertible en spectre de masse
De ce fait les performances de la technologie Orbitrap en termes de reacutesolution (jusque
100 000) et preacutecision sur la mesure de masse (de l‟ordre de 1-2 ppm) rivalisent avec celles de
la spectromeacutetrie de masse FT-ICR De plus la reacutesolution de l‟Orbitrap eacutetant proportionnelle
au rapport (mz)-12
elle diminue moins vite avec l‟augmentation du rapport mz que dans le
cas du FT-ICR Par ailleurs la gamme dynamique de l‟Orbitrap contrairement agrave la
spectromeacutetrie de masse FT-ICR est satisfaisante (gt 3 deacutecades) (15) L‟Orbitrap est
principalement utiliseacutee en spectromeacutetrie de masse en tandem associeacutee agrave un piegravege lineacuteaire
Le scheacutema et la photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher) que
nous avons utiliseacute pour nos expeacuteriences HDX correspondent aux Fig A 14 et Fig A 15
215
L‟instrument est composeacute d‟une source ESI de type laquo Z-spray raquo suivie d‟une optique ionique
de type laquo S-lens raquo permettant de mieux focaliser les ions et d‟ameacuteliorer la sensibiliteacute Une
optique de transfert ionique (quadripocircle octopocircle) performante en termes de stabiliteacute et
efficaciteacute de transmission des ions permet leur acheminement dans une trappe lineacuteaire Dans
cette trappe ionique il est possible de fragmenter les ions par CID ou ETD et de proceacuteder agrave
leur deacutetection Il est eacutegalement possible de les deacutetecter par transformation de Fourier dans
l‟Orbitrap avec une meilleure reacutesolution Dans ce cas les ions sont transfeacutereacutes de la trappe
lineacuteaire agrave la C-trappe via un quadripocircle puis eacutejecteacutes dans l‟analyseur Orbitrap Une cellule de
collision placeacutee agrave proximiteacute de la C-trappe permet eacutegalement de fragmenter les ions par HCD
(laquo High-energy Collisional Dissociation raquo) Les ions sont ensuite analyseacutes dans l‟Orbitrap
Fig A 14 Scheacutema du LTQ-Orbitrap Velos (drsquoapregraves la documentation de Thermo Ficher
Scientific)
Fig A 15 Photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific) de
la plateforme proteacuteomique de lInstitut Jacques-Monod (Paris 7)
216
A13 Fragmentation en phase gazeuse
La spectromeacutetrie de masse en tandem consiste (i) dans une premiegravere eacutetape agrave seacutelectionner
l‟ion d‟inteacuterecirct (appeleacute ion parent ou ion preacutecurseur) et (ii) dans une seconde eacutetape agrave
analyser les ions fragments (ou ions fils) obtenus par la dissociation de l‟ion parent Selon
les instruments utiliseacutes les eacutetapes de seacutelection et d‟analyse des fragments se font soit dans
l‟espace (tQ Q-TOF TOF-TOF) soit dans le temps (IT FT-ICR) soit en combinant des
eacutetapes dans le temps et l‟espace (q-FT-ICR IT-Orbitrap)
Comme les sources d‟ionisation dites douces (ESI MALDI) celles utiliseacutees pour
l‟analyse des biomoleacutecules conduisent agrave des ions avec peu d‟eacutenergie interne il faut induire la
fragmentation par un apport d‟eacutenergie au systegraveme Cet apport d‟eacutenergie peut se faire de
diffeacuterentes faccedilons (16) collision avec un gaz inerte (fragmentation de haute ou basse
eacutenergie) collision avec une surface irradiation par des photons irradiation par des eacutelectrons
(speacutecifique des FT-ICR) reacuteactions ion-moleacutecule ou ion-ion (dont l‟ETD) Le controcircle de
l‟eacutenergie deacuteposeacutee est un paramegravetre important comme nous avons pu le voir dans le Chap I
dans le cadre des eacutetudes HDX il est important de pouvoir controcircler l‟eacutenergie apporteacutee aux
ions pour ne pas conduire agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des hydrogegravenes et deuteacuteriums le
long du squelette polypeptidique
La spectromeacutetrie de masse en tandem permet d‟obtenir des informations de structure de
l‟ion fragmenteacute (qu‟il soit organique ou biologique) et permet dans le cas de meacutelanges
complexes de seacutelectionner speacutecifiquement une espegravece parmi les autres pour obtenir son
spectre de fragmentation
Les deux principaux types de fragmentation utilisables dans le cadre des eacutetudes HDX sont
deacutetailleacutes dans les sous-paragraphes suivants Il s‟agit des meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECDETD) preacutesenteacutees preacuteceacutedemment dans le Chap I
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR
Ce mode de dissociation consiste agrave irradier les ions multichargeacutes par un faisceau
d‟eacutelectrons La recombinaison entre un eacutelectron et l‟ion conduit agrave la formation d‟un cation
radical (Fig A 16) et permet un gain d‟eacutenergie de l‟ordre de quelques eV (2-3 eV) (17) Ce
type de fragmentation est speacutecifique des FT-ICR et a eacuteteacute preacutesenteacute dans le Chap I dans la
217
partie consacreacutee agrave la fragmentation des peptides proteacuteolytiques marqueacutes La grande diffeacuterence
avec la fragmentation CID repose sur la formation initiale d‟un radical cation dont les voies
de fragmentation seront pour des polypeptides tregraves diffeacuterentes de celles du cation Cela se
traduira en particulier par la formation de fragments de type c et z De plus comme vu dans le
Chap II l‟ECD conduit agrave une faible redistribution des deuteacuteriums avant fragmentation ce
que les proposants de meacutecanismes pour l‟ECD ont attribueacute soit agrave une vitesse de fragmentation
rapide ne permettant pas une redistribution initiale de l‟eacutenergie (hypothegravese non-ergodique)
soit plus vraisemblablement agrave une barriegravere de fragmentation suffisamment abaisseacutee pour
rendre la vitesse de rupture des liaisons amide dans le radical cation supeacuterieure agrave celles des
autres voies de fragmentation etou de transferts de protons
e-
[M nH]n+ [M nH](n-1)+bull F1m+ + F2
k+bull
Fig A 16 Capture exothermique drsquoun eacutelectron par une moleacutecule multichargeacutee (positive)
Mode drsquoactivation ECD passe par une voie de fragmentation de type radicalaire
D‟un point de vue technique les eacutelectrons sont formeacutes par une cathode chauffeacutee
indirectement qui a remplaceacute le filament afin d‟obtenir un flux suffisant pour que la capture
d‟eacutelectron soit efficace La fragmentation a lieu dans la cellule ICR ougrave les ions sont pieacutegeacutes agrave
proximiteacute du centre de la cellule Trois paramegravetres influencent l‟efficaciteacute de fragmentation
par ECD (i) le potentiel de la cathode qui controcircle l‟eacutenergie des eacutelectrons mais a eacutegalement
un effet sur le courant d‟eacutelectrons (ii) la tempeacuterature de la cathode et (iii) la dureacutee
d‟irradiation par des eacutelectrons qui controcircle le taux de fragmentation Notons que l‟efficaciteacute
de capture deacutecroicirct rapidement avec l‟eacutenergie des eacutelectrons et qu‟il est important d‟optimiser
au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les recaptures successives
tout en obtenant suffisamment de fragmentations (voir Chap III)
Lors de nos expeacuteriences ECD nous avons utiliseacute une cathode chauffeacutee agrave 16 A pour
l‟APEX III et 18 A pour l‟APEX-Qe avec une irradiation par des eacutelectrons de l‟ordre de
quelques eV d‟eacutenergie cineacutetique (de 09 eV pour l‟ubiquitine agrave 2 eV pour aIF2α3) pendant
quelques dizaines de millisecondes (optimum agrave 10 ms) Nous avons travailleacute sur tous les eacutetats
de charge sans seacutelection
218
A132 Fragmentation par ETD sur lrsquoOrbitrap
L‟ETD est un analogue de l‟ECD Il procegravede par une reacuteaction ion-moleacutecule entre un
radical anion formeacute geacuteneacuteralement dans une source CI neacutegatif et un cation multichargeacute La
difficulteacute est de maximiser le transfert d‟eacutelectron en limitant le transfert de proton Les
reacuteactifs ont eacuteteacute optimiseacutes pour cela et le fluoranthegravene utiliseacute dans ce travail est le reacuteactif
geacuteneacuteralement utiliseacute De plus il est possible via le choix du reacuteactif de controcircler la
thermochimie du transfert d‟eacutelectrons On obtient en ETD une fragmentation similaire agrave celle
en ECD mais pas identique
L‟ETD preacutesente tous les avantages de l‟ECD il ne deacutepend pas de la seacutequence
polypeptidique (nature en acides amineacutes et longueur) il permet de localiser des modifications
post-traductionnelles labiles et il permet d‟obtenir une couverture de seacutequence importante
pour les peptides non tryptiques (issus de la digestion de la proteacuteine agrave la trypsine) pour les
proteacuteines et les peptides hautement basiques La meacutethode ETD comme la technique ECD est
donc particuliegraverement bien adapteacutee aux analyses laquo top-down raquo Par ailleurs contrairement agrave
l‟ECD qui requiert un FT-ICR la fragmentation ETD peut ecirctre reacutealiseacutee dans une trappe
ionique quadripolaire radiofreacutequence voire dans un piegravege hexapolaire qui demandent une
faible maintenance et que l‟on retrouve sur une grande varieacuteteacute d‟instruments moins coucircteux
D‟un point de vue technique le fluoranthegravene est utiliseacute comme reacuteactif pour la
fragmentation ETD reacutealiseacutee agrave l‟aide du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos L‟anion radicalaire
du fluoranthegravene qui constitue donc le reacuteactif ETD est produit par la reacuteaction preacutesenteacutee dans
Fig A 17
Fig A 17 Production du reacuteactif ETD (anion radicalaire) agrave partir du fluoranthegravene
Cette reacuteaction est reacutealiseacutee dans le module ETD (Fig A 18) de l‟instrument qui est donc
constitueacute d‟une source agrave ionisation chimique utilisant
- deux reacuteservoirs indeacutependants de reacuteactifs dont un pour les reacuteactions de type transfert
d‟eacutelectron (ETD) et l‟autre pour les reacuteactions par transfert de proton (PTR)
- une ligne de transfert chauffeacutee
219
- un volume d‟ion chargeacute en eacutelectron par un filament
- une optique de transfert utilisant un quadripocircle pour filtrer le reacuteactif chargeacute en eacutelectron
Il est placeacute agrave proximiteacute de la C-trappe (Fig A 14)
Fig A 18 Module ETD de lrsquoinstrument LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific)
Le reacuteactif ETD est ensuite envoyeacute dans la trappe lineacuteaire ougrave la reacuteaction ionion entre le
peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire aura lieu conduisant agrave la fragmentation de l‟ion
peptidique consideacutereacute La dissociation est reacutealiseacutee sur un eacutetat de charge particulier qui a eacuteteacute au
preacutealable seacutelectionneacute dans la cellule de haute pression de la trappe ionique
Trois temps d‟activation (5 15 et 25 ms) correspondant agrave trois dureacutees pendant lesquelles se
deacuteroule la reacuteaction ETD ont eacuteteacute utiliseacutes conseacutecutivement sur un mecircme eacutetat de charge afin de
maximiser la couverture de seacutequence En effet des profils de fragmentation diffeacuterents sont
obtenus en fonction du temps d‟activation Pour chaque temps d‟activation une minute
environ de fragmentation a eacuteteacute enregistreacutee
L‟option laquo Supplemental Activation raquo a eacutegalement eacuteteacute utiliseacutee Elle permet d‟apporter au
systegraveme une petite quantiteacute d‟activation collisionnelle suppleacutementaire afin de faciliter la
dissociation de l‟ion preacutecurseur En effet il a eacuteteacute montreacute que dans beaucoup de cas le transfert
d‟eacutelectron avait lieu sans que la dissociation soit pour autant effective
220
A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF
Des expeacuteriences de collision avec un gaz inerte (CID) ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur le Q-ToF
Premier (Waters) (Fig A 19) Les diffeacuterents eacutetats de charge des ions multichargeacutes (positifs)
ont eacuteteacute seacutelectionneacutes dans le quadripocircle du spectromegravetre de masse avant d‟ecirctre fragmenteacutes dans
la cellule de collision L‟eacutenergie de collision est le paramegravetre agrave optimiser pour la dissociation
de chaque eacutetat de charge
Fig A 19 Scheacutema du Q-ToF Premier (Waters)
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
A21 Marquage
A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
Les peptides de synthegravese (P1 HHHHHHIIKIIK P2 KKDDDDDDIIKIIK P3
KKDDDIIKIIK P4 KKDDDIIK) ont eacuteteacute acheteacutes chez Genscript Corporation (Piscataway
NJ) Une solution stock agrave 1 mM de chaque peptide a eacuteteacute preacutepareacutee en diluant le peptide
lyophiliseacute dans D2O Afin d‟eacutechanger complegravetement tous les sites eacutechangeables (hydrogegravenes
d‟amide de la liaison peptidique et hydrogegravenes labiles des chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes) la solution est incubeacutee agrave tempeacuterature ambiante pendant au moins 1 heure Le
221
deacutemarquage (seacutelectif du cocircteacute N-terminal) est initieacute en diluant au 1100e la solution stock dans
H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05 M pH 23) MeOH 11 (vv)
A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine
L‟ubiquitine petite proteacuteine modegravele a eacuteteacute utiliseacutee (avec les peptides modegraveles de T
Joslashrgensen) pour eacutetudier le laquo back-exchange raquo Elle a donc eacuteteacute totalement marqueacutee par dilution
de sa poudre lyophiliseacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM et incubation pendant
1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
De la mecircme maniegravere la substance P et le Glu F sont deux peptides qui ont eacuteteacute
ponctuellement utiliseacutes comme sonde de l‟eacutechange inverse Leur poudre lyophiliseacutee a donc
eacuteteacute eacutegalement dilueacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM puis le meacutelange a eacuteteacute
incubeacute pendant 1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ
L‟eacutechange isotopique de la proteacuteine ou du complexe proteacuteique d‟inteacuterecirct sous sa forme
native se fait par incubation dans une solution correspondant agrave son tampon de purification
contenant des deuteacuteriums eacutechangeables Une fois le temps d‟eacutechange souhaiteacute atteint le
marquage doit ecirctre arrecircteacute dans des conditions figeant les deuteacuteriums d‟amide du squelette
polypeptidique sur leur position et en deacutemarquant les autres sites eacutechangeables (hydrogegravenes
labiles des chaicircnes lateacuterales) Pour cela il faut diminuer tregraves rapidement la tempeacuterature du
milieu et repasser en conditions acides et en milieu protoneacute Dans ces conditions seuls les
deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes seront eacutechangeacutes par des hydrogegravenes et les
deuteacuteriums sur la fonction amide de la liaison peptidique conserveront leur localisation
aIF2α3 Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique aIF2α3 agrave 178
microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave une
tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute bloqueacute
lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF 2
222
aIF2α3γ Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique agrave aIF2α3γ agrave
1156 microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave
une tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute
bloqueacute lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF2
A22 Dessalage
Le dessalage se deacuteroulant apregraves les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium il doit obligatoirement
ecirctre effectueacute agrave faible tempeacuterature (dans la glace) et pH afin de minimiser les eacutechanges
inverses Pour cette mecircme raison il est obligatoire d‟utiliser une technique de dessalage
rapide excluant de ce fait bon nombre de systegravemes
Un dessalage laquo off-line raquo a eacuteteacute reacutealiseacute imposeacute par le type d‟approche choisi (approche
laquo top-down raquo) Une Sep-Paktrade C8 (Waters) a eacuteteacute utiliseacutee
Les colonnes sont activeacutees deux fois avec 1 mL ACNMeOHAF 499 499 02 puis
rinceacutees deux fois avec 1 mL H2OAF 1 La colonne conditionneacutee est conserveacutee au
reacutefrigeacuterateur jusqubdquoagrave utilisation L‟eacutechantillon meacutelangeacute agrave eacutegal volume avec H2OAF 2 (eacutetape
d‟arrecirct de la reacuteaction) est chargeacute immeacutediatement sur la colonne Les sels sont eacutelimineacutes par
trois lavages successifs avec 1 mL H2OAF 1 glaceacute
A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse
Le mode d‟ionisation utiliseacute a eacuteteacute l‟eacutelectrospray Les eacutechantillons proteacuteiques ont eacuteteacute
injecteacutes dans le spectromegravetre de masse par le dispositif de seringue refroidie (ou par le
nouveau systegraveme d‟introduction la laquo cryosource raquo que nous avons mis au point et preacutesenteacute
dans Chap V)
Pour cela les proteacuteines dessaleacutees sont finalement eacutelueacutees avec un meacutelange H2OACNAF
49 49 2 (500 microL pour aIF2α3 concentration finale agrave 57 microM et 250 microL pour aIF2α3γ
concentration finale agrave 74 microM) et immeacutediatement analyseacutees par FT-ICR
223
Les peptides seacutelectivement marqueacutes sont analyseacutes dans H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05
M pH 23) MeOH 11 (vv) agrave la concentration finale de 10 microM
Les eacutechantillons totalement marqueacutes (ubiquitine peptides) sont dilueacutes au 1100e dans
H2OACNAF 49 49 2 pour ecirctre analyseacutes en spectromeacutetrie de masse agrave la concentration
finale de 1 microM
224
A3 Bibliographie
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Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules Science 246 64-
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spectrometry J Mass Spectrom 39 1091-1112
17 Zubarev R A (2003) Reactions of polypeptide ions with electrons in the gas phase
Mass Spectrom Rev 22 57-77
ii
Le geacutenie crsquoest 1 drsquoinspiration
et 99 de transpiration
Thomas Edison
So mushkil vakt comando sakth
A close friend
iii
Remerciements
Je tiens tout d‟abord agrave remercier Gilles Ohanessian Directeur du laboratoire des
Meacutecanismes Reacuteactionnels de l‟Eacutecole Polytechnique de m‟avoir accueillie au sein de son
Uniteacute de Recherche et de m‟avoir donneacute l‟opportuniteacute de reacutealiser ce travail de thegravese
Ce travail de thegravese a eacuteteacute reacutealiseacute sous la direction de Julia Chamot-Rooke et la co-direction
de Guillaume van der Rest Je vous remercie de votre aide de votre soutien et de vos
encouragements dans les moments plus difficiles qui surviennent au cours d‟une thegravese Un
grand merci agrave tous les deux de m‟avoir accompagneacutee jusqu‟au bout de cette belle aventure
J‟adresse mes plus sincegraveres remerciements agrave Madame Emmanuelle Leize et Monsieur
Christian Rolando d‟avoir accepteacute d‟ecirctre les rapporteurs de ce travail Merci eacutegalement agrave
Monsieur Jean-Michel Camadro d‟avoir participeacute agrave l‟eacutevaluation de ma Thegravese de Doctorat
Je tiens aussi agrave exprimer ma profonde reconnaissance agrave Eacutedith et Christian de m‟avoir
eacutepauleacutee quand j‟en avais besoin dans mes expeacuteriences et de m‟avoir enseigneacute les rouages des
spectromegravetres de masse du laboratoire plus ou moins capricieux Je suis d‟accord avec Eacutedith
bien que Christian ait toujours raison le FT-ICR (sous toutes ses versions) est le meilleur
instrument du monde entier J‟exprime eacutegalement ma gratitude agrave Vincent d‟Orsay et agrave
Thibaut et Manuel de Paris 7 de m‟avoir aideacutee agrave dompter leur machine
Un grand merci agrave Yves Meacutechulam Directeur du laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole
Polytechnique de m‟avoir offert l‟opportuniteacute d‟enseigner au sein de son deacutepartement et de
travailler en collaboration avec son laboratoire Merci aussi agrave Emmanuelle pour ses conseils
Un tregraves grand merci agrave toutes celles et ceux qui ont partageacutes mon bureau et mon amitieacute
pendant ces trois anneacutees de dur labeur Notamment merci agrave Yasmine Jianqing Jana et Jan
J‟adresse eacutegalement mes sincegraveres remerciements agrave Eacutedith et Julien pour vos pauses cafeacute (ou
plutocirct theacute ) que j‟ai beaucoup appreacutecieacutees en cette fin de thegravese et agrave Joe pour tes discussions agrave
n‟en plus finir et ton humour anglais Best of Luck Merci aux anciens Mag Renjiehellip
Merci enfin agrave toutes les personnes que jrsquoai cocirctoyeacutees ou croiseacutees au DCMR pendant ces
trois anneacutees meacutemorables Merci agrave Theacuteregravese Carine Sophie Steph Michel Chris Gilles
Ash P-H Vanessa Tatianahellip Et pour finir je tiens eacutegalement agrave remercier chaleureusement
mes entraineurs de boxe agrave l‟X Merci agrave Reacutemy Fred et Gilou pour votre coaching deacutecoiffant
Un exemple de prochain challenge les JO de Rio de Janeiro en 2016hellip
iv
Je nrsquooublierai pas de remercier eacutegalement
Jean-Baptiste
Je ne te remercierai jamais assez de ta preacutesence agrave mes cocircteacutes depuis maintenant quelques
anneacutees deacutejagrave et de tout ce que tu fais pour moi Notre rencontre remonte au deacutebut de notre vie
eacutetudiante et voici que nous la finissons ensemble J‟espegravere te retrouver tregraves prochainement
pour le commencement d‟une nouvelle vie agrave deux Merci pour ton soutien et ta compliciteacute
Merci de partager mon quotidien et de me remonter le moral quand il est dans les chaussettes
Merci de partager mes joies mes peines Merci de t‟ecirctre inteacuteresseacute agrave mon travail et d‟avoir
chercheacute avec moi des solutions Merci pour tes petits plats mijoteacutes avec amourhellip Un grand
merci pour TOUT ton amour avec un grand A
Mes parents et mes sœurs
Merci de m‟avoir insuffleacute la soif d‟apprendre et la curiositeacute intellectuelle de m‟avoir
donneacute l‟envie et les moyens de faire des eacutetudes Merci de m‟avoir soutenue et encourageacutee
jusqu‟au bout de ma longue formation Merci de vous ecirctre tenus au courant de l‟avanceacutee de
mon travail de recherche Merci pour votre amour votre tendresse et votre reacuteconfort de tous
les jours Merci pour tout Ma reacuteussite est eacutegalement la vocirctre
Ma famille et belle-famille
Merci agrave vous tous pour votre affection et votre bienveillance mais je tiens agrave remercier plus
particuliegraverement ma Mamie d‟ecirctre encore pregraves de moi aujourd‟hui Merci du fond du cœur de
m‟avoir toujours beaucoup aideacutee soutenue encourageacutee reacuteconforteacutee entoureacuteehellip durant toutes
ces anneacutees et encore plus ces trois derniegraveres Merci pour notre cohabitation nos fous rires nos
discussionshellip merci pour tous ces tregraves bons moments que nous avons partageacutes ensemble
Mes amis
Laurence ma sœur siamoise du hand avec laquelle j‟ai lieacute une sincegravere amitieacute il y a six
ans deacutejagrave Merci d‟avoir gardeacute le contact et de m‟avoir soutenue durant ces trois derniegraveres
anneacutees malgreacute les contraintes d‟espace et de temps imposeacutees par la thegravese et la vie active
J‟espegravere que maintenant nous allons nous revoir plus souvent autour d‟une triple Carmeacutelite
Ash my best male friend I met you in DCMR lab two years ago where you were pursuing
a post doctoral research work Thanks a lot for ALL your happiness your support your
helphellip You taught me how to be self-confident I found in you a confidant and a collaborator
Un grand merci agrave vous tous
v
Liste des abreacuteviations
AA acide formique
ACN aceacutetonitrile
AF acide formique
aIF2 facteur d‟initiation 2 chez les archeacutees
ATD distribution des temps d‟arriveacutee
ATP adeacutenosine triphosphate
ARN(mt) acide ribonucleacuteique (messagertransfert)
BN-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en condition bleue native
CI ionisation chimique
CID dissociation induite par collision
DNA acide deacutesoxyribonucleacuteique
DSG DiSuccinimidyl Glutarate
ECD dissociation par capture d‟eacutelectron
EGTA acide eacutethylegravene glycol teacutetraaceacutetique
ESI ionisation par eacutelectroneacutebulisation
ESSI ElectroSonic Spray Ionisation
ETD dissociation par transfert d‟eacutelectron
FID Free Induction Decay
FT-ICR reacutesonance cyclotronique ionique agrave transformeacutee de Fourier
FT-MS spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier
GTP guanosine triphosphate
HDX eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
HDXMS eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium analyseacute par spectromeacutetrie de masse
HIV virus de limmunodeacuteficience humaine
HMQC correacutelation quantique multiple heacuteteacuteronucleacuteaire
HPLC chromatographie en phase liquide agrave haute performance
HSQC correacutelation quantique unique heacuteteacuteronucleacuteaire
vi
IgG immunoglobulines G
IRMPD dissociation multiphotonique infrarouge
ISD In-Source Decay
LC chromatographie en phase liquide
LC-MSMS chromatographie en phase liquide coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse en
tandem
LILBID Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption
m-NBA alcool m-nitrobenzylique
MALDI deacutesorptionionisation au laser assisteacutee par matrice
MPT modification post-traductionnelle
MS spectromeacutetrie de masse
MSMS spectromeacutetrie de masse en tandem
NHS N-HydroxySuccinimide
nOe effet Overhauser nucleacuteaire
Q-ToF quadripocircle-temps de vol
RMN reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire
SAXS diffusion des rayons X aux petits angles
SDS-PAGE eacutelectrophoregravese sur gel de polyacrylamide en conditions deacutenaturantes contenant
du dodeacutecyl sulfate de sodium
SMI spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique
SORI Sustained Off-Resonance Irradiation
SPR reacutesonance plasmonique de surface
TAP-Tag purification par affiniteacute en tandem
TEV virus de la gravure du tabac
TROSY spectroscopie de relaxation transversale optimiseacutee
UPLC chromatographie en phase liquide ultra haute performance
UV ultraviolet
vii
Table des matiegraveres
Introduction geacuteneacuterale 1
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10 I112 Structure secondaire 12 I113 Structure tertiaire 15 I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19 I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24 I1221 Diffusion aux petits angles 24 I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24 I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26 I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27 I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40 I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42 I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43 I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43 I2133 Catalyse de la reacuteaction 46 I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46 I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et repliement
des proteacuteines 47 I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49
I221 Marquage continu 50 I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51 I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53 I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD 60 I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60 I2332 Approches top-down et HDX 62 I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
viii
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes 108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ 121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD 131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
ix
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166 IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169 IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174 IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175 IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176 IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186 IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
Conclusion geacuteneacuterale 191
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap 214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
x
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
xi
1
Introduction geacuteneacuterale
2
3
Acteurs essentiels de l‟organisation cellulaire et de la reacutegulation du meacutetabolisme les
proteacuteines sont agrave la fois des cibles theacuterapeutiques et des meacutedicaments potentiels Leacutetude de ces
proteacuteines agrave grande eacutechelle appeleacutee analyse proteacuteomique a eacuteteacute rendue possible ces derniegraveres
anneacutees par la mise au point dapproches robustes baseacutees sur des deacuteveloppements importants
en spectromeacutetrie de masse Cependant un simple inventaire de ces proteacuteines ne suffit pas agrave
comprendre les pheacutenomegravenes biologiques complexes qui reacutegissent lactiviteacute cellulaire Ainsi
appreacutehender la maniegravere dont sont organiseacutees ces proteacuteines en complexes multiproteacuteiques est
un des deacutefis actuels de la proteacuteomique Le nombre dinteractions entre proteacuteines au sein d‟une
cellule eacutetant tregraves important linvestigation de ces multiples reacuteseaux proteacuteiques neacutecessite de
nouveaux deacuteveloppements agrave la fois en spectromeacutetrie de masse mais aussi en bioinformatique
pour fournir des meacutethodologies adapteacutees ainsi que des outils puissants pour les analyser
Les interactions entre proteacuteines sont gouverneacutees par leur agencement et repliement dans
l‟espace faisant de la structure tridimensionnelle de ces complexes un eacuteleacutement-cleacute dans
l‟eacutetude et la compreacutehension de la vie de la cellule Les meacutethodes physico-chimiques les plus
couramment utiliseacutees pour ces eacutetudes structurales sont la cristallographie et la spectroscopie
RMN Bien que ces meacutethodes d‟analyse soient les piliers de la biologie structurale actuelle
elles preacutesentent toutefois des limitations majeures la cristallographie des proteacuteines
eacutegalement appeleacutee diffraction des rayons X neacutecessite de pouvoir cristalliser les proteacuteines et la
spectroscopie RMN est limiteacutee agrave des systegravemes de taille modeste Par ailleurs les deux
techniques requiegraverent des quantiteacutes relativement importantes d‟eacutechantillon et ne donnent
quune image statique qui est loin de la reacutealiteacute de la structure des proteacuteines Il est donc
devenu indispensable de deacutevelopper des meacutethodes alternatives permettant de sinteacuteresser agrave la
dynamique de ces systegravemes biologiques tout en travaillant avec des quantiteacutes les plus faibles
possibles d‟eacutechantillon
Dans ce contexte la spectromeacutetrie de masse est devenue ces derniegraveres anneacutees un outil
inteacuteressant pour la biologie structurale La spectromeacutetrie de masse preacutesente l‟avantage de
permettre des eacutetudes sur des proteacuteines non cristallisables d‟ecirctre peu consommatrice en
mateacuteriel et de permettre des analyses rapides sur des systegravemes complexes tant par la diversiteacute
que par la taille Il existe aujourd‟hui trois grandes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de
masse pour eacutetudier l‟organisation structurale d‟un complexe proteacuteique La premiegravere consiste agrave
utiliser des conditions d‟ionisation adapteacutees permettant de maintenir en phase gazeuse des
interactions non covalentes au sein de complexes proteacuteiques La deuxiegraveme approche repose
sur le pontage covalent des proteacuteines en association suivi d‟une digestion enzymatique et
4
analyse par spectromeacutetrie de masse Les agents pontants permettent dobtenir des informations
de topologie du complexe initial en creacuteant des liaisons covalentes entre des acides amineacutes
proches dans la structure tertiaire Une derniegravere technique consiste agrave effectuer un marquage de
la surface accessible du complexe qui peut ecirctre soit permanent par l‟utilisation de reacuteactifs
chimiques particuliers ou par l‟exposition aux radicaux hydroxyles soit labile Dans ce
dernier cas les eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium sont geacuteneacuteralement utiliseacutes La
vitesse deacutechange des hydrogegravenes damide dun squelette polypeptidique deacutepend de
l‟accessibiliteacute au solvant mais eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale Ainsi les
hydrogegravenes d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine telles
que les boucles et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses
d‟eacutechange rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au
contraire ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices
α et les feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent
plus lentement car ils sont proteacutegeacutes La mesure des vitesses deacutechange permet donc de sonder
localement la structure dune proteacuteine ou dun complexe L‟avantage majeur de cette approche
est qu‟elle ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas
toujours le cas avec des marquages covalents De plus elle permet de sinteacuteresser agrave des
complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire En revanche le fait que le marquage soit labile
impose des conditions expeacuterimentales strictes agrave respecter pour eacuteviter le deacutemarquage et
davantage de contraintes au niveau de la rapiditeacute de l‟analyse Malgreacute ces limitations
l‟association des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium et de la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode largement employeacutee pour l‟eacutetude structurale et
dynamique des proteacuteines et complexes proteacuteiques
L‟analyse par spectromeacutetrie de masse des proteacuteines marqueacutees au deuteacuterium est
classiquement reacutealiseacutee par une approche laquo bottom-up raquo Cette derniegravere consiste agrave analyser des
peptides obtenus par digestion enzymatique de la proteacuteine dinteacuterecirct Chaque hydrogegravene
remplaceacute par un deuteacuterium conduit agrave un increacutement en masse de 1 Da facilement deacutetectable par
spectromeacutetrie de masse Pour chaque peptide une cineacutetique d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
peut donc ecirctre obtenue Si cette approche a montreacute tout son inteacuterecirct mecircme pour des systegravemes
tregraves grands l‟inconveacutenient majeur en est la reacutesolution qui est limiteacutee par la taille des peptides
geacuteneacutereacutes (en moyenne 5-10 acides amineacutes) Une alternative qui sest deacuteveloppeacutee ces derniegraveres
anneacutees est celle qui consiste agrave introduire la proteacuteine intacte en phase gazeuse (approche laquo top-
down raquo) et agrave la fragmenter par capture ou transfert dun eacutelectron En effet contrairement aux
approches de fragmentation classiques par CID (laquo Collision Induced Dissociation raquo) qui
conduisent agrave une redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums dans la seacutequence ces approches ECD
5
ou ETD permettent de localiser les deuteacuteriums dans la seacutequence avec une reacutesolution qui peut
ecirctre agrave lacide amineacute
Ce travail de thegravese sinscrit dans cette theacutematique de deacuteveloppement dapproches top-down
apregraves eacutechanges HD pour lanalyse de complexes proteacuteiques Les systegravemes biologiques sur
lesquels nous avons choisi de travailler sont les complexes dinitiation de la traduction et ce
travail est meneacute en collaboration avec le laboratoire de Biochimie de lEacutecole Polytechnique
(E Schmitt et Y Meacutechulam) Il a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de M Duchateau (soutenue en
feacutevrier 2010)
Cette thegravese comporte quatre grands chapitres
Le premier est un chapitre bibliographique Il comprend des geacuteneacuteraliteacutes sur la structure des
proteacuteines les meacutethodes physico-chimiques classiquement utiliseacutees en biologie structurale et
fait eacutegalement le point sur les diffeacuterentes approches baseacutees sur la spectromeacutetrie de masse
permettant dobtenir des informations structurales sur des proteacuteines ou des complexes
proteacuteiques Le principe des eacutechanges HD et leur analyse par spectromeacutetrie de masse incluant
les derniers deacuteveloppements dans le domaine fait lobjet de la fin de ce chapitre
Le chapitre II est consacreacute agrave leacutetude de peptides modegraveles qui peuvent ecirctre seacutelectivement
marqueacutes au deuteacuterium Ces peptides ont eacuteteacute utiliseacutes comme sonde (i) du deacutemarquage (D H)
qui peut avoir lieu agrave diffeacuterents endroits du spectromegravetre de masse et (ii) du reacutearrangement
aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes dans la seacutequence polypeptidique lors dexpeacuteriences
de spectromeacutetrie de masse en tandem Lobjectif de ces eacutetudes eacutetait de mettre au point une
approche robuste par ECD ou ETD pour lanalyse de peptides deuteacutereacutes en vue de lappliquer agrave
des proteacuteines
Dans le chapitre III sont regroupeacutes les reacutesultats obtenus pour lanalyse du complexe aIF2 et
notamment toute la mise au point de lapproche top-down HDX sur une des sous-uniteacutes de ce
complexe Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes agrave la fois en ECD sur diffeacuterents spectromegravetres de masse
FT-ICR et en ETD sur un instrument de type Orbitrap installeacute sur la plateforme proteacuteomique
de Paris Diderot dirigeacutee par J-M Camadro Ce chapitre montre toute la difficulteacute quil peut y
avoir pour rendre lapproche robuste et reproductible notamment pour des eacutechantillons reacuteels
pour lesquels de nouvelles contraintes apparaissent (quantiteacute disponible dessalage
stabiliteacute)
Sur la base des reacutesultats obtenus dans le chapitre III il nous est apparu eacutevident quun
problegraveme majeur de reproductibiliteacute eacutetait lieacute agrave leacutetape dintroduction des eacutechantillons deuteacutereacutes
dans le spectromegravetre de masse Nous avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme
complegravetement diffeacuterent de tout ce qui avait eacuteteacute deacuteveloppeacute jusquagrave preacutesent baseacute sur lutilisation
6
dune enceinte isoleacutee qui peut ecirctre maintenue agrave -30degC La mise au point de ce montage
expeacuterimental que nous avons appeleacute cryosource fait lobjet du quatriegraveme chapitre de ce
manuscrit Les diffeacuterentes modifications ayant conduit agrave la version finale de cette cryosource
les difficulteacutes rencontreacutees et la maniegravere donc nous les avons reacutesolues et les performances que
lon peut atteindre sur des peptides ou des proteacuteines sont deacutecrites dans ce chapitre
Le manuscrit se termine par une conclusion geacuteneacuterale et les perspectives lieacutees agrave ce travail et
une annexe deacutecrivant les mateacuteriels et meacutethodes
7
Chapitre I Introduction
8
Chapitre I Introduction 7
I1 Analyse de complexes proteacuteiques 9
I11 Structure des proteacuteines 9 I111 Structure primaire 10
I112 Structure secondaire 12
I113 Structure tertiaire 15
I114 Structure quaternaire 17
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique 19 I121 Meacutethodes classiques pour l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines 19
I1211 Cristallographie des proteacuteines 19
I1212 Spectroscopie RMN 21
I122 Meacutethodes pour l‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des assemblages
macromoleacuteculaires 24
I1221 Diffusion aux petits angles 24
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique 24
I1223 Chromatographie d‟exclusion steacuterique 26
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface 27
I1225 Spectromeacutetrie de masse 28
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique 37
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique structurelle des proteacuteines en solution 40
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux proteacuteines en solution 40
I211 Quel type d‟hydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX 40
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de l‟accessibiliteacute des proteacuteines 42
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les proteacuteines et peptides 43
I2131 Deacutefinition du facteur chimique 43
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique 43
I2133 Catalyse de la reacuteaction 46
I2134 Cineacutetique d‟eacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de protection 46
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique d‟eacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines 47
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines 49 I221 Marquage continu 50
I222 Marquage pulseacute 50
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par spectromeacutetrie de masse 51
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN 51
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo 52
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS 53
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques 56
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD60
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD 60
I2332 Approches top-down et HDX 62
I2333 Limitations des approches top-down HDX 64
I3 Bibliographie 65
9
I1 Analyse de complexes proteacuteiques
Les proteacuteines sont des composants essentiels de la cellule En effet elles assurent
l‟immense majoriteacute des fonctions cellulaires responsables de la vie Les proteacuteines sont
responsables de la catalyse enzymatique du transport des moleacutecules de la deacutefense de l‟hocircte
de la conversion eacutenergeacutetique ainsi que de beaucoup d‟autres processus cellulaires essentiels
Les proteacuteines sont des macromoleacutecules biologiques de haut poids moleacuteculaire qui
comportent diffeacuterents niveaux de structuration allant de leur seacutequence en acides amineacutes agrave leur
structure tridimensionnelle au sein de complexes proteacuteiques La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine est intimement lieacutee agrave sa fonction Toute l‟information requise pour qu‟une
proteacuteine adopte une conformation native particuliegravere est contenue dans sa seacutequence en acides
amineacutes (1) Les multiples conformations que sont capables d‟adopter les proteacuteines leur
permettent de remplir la varieacuteteacute de tacircches qui leur incombent mais en font des systegravemes
complexes agrave analyser
Cependant aussi puissantes que les proteacuteines puissent ecirctre individuellement leur veacuteritable
pouvoir et leur complexiteacute deacutecoulent des interactions qu‟elles entretiennent avec d‟autres
moleacutecules Beaucoup d‟entre elles ne remplissent leur fonction que si elles sont lieacutees agrave des
ligands tels que des ions meacutetalliques des groupes prostheacutetiques ou agrave d‟autres proteacuteines (2) En
effet un grand nombre de pheacutenomegravenes biologiques implique l‟activiteacute de plusieurs proteacuteines
agrave travers la formation de complexes multi-proteacuteiques Ainsi la compreacutehension des processus
cellulaires au niveau atomique passe par la deacutetermination de la structure tridimensionnelle de
ces complexes
I11 Structure des proteacuteines
L‟analyse de la structure tridimensionnelle revient agrave deacutecrire la position relative des
diffeacuterents atomes constituant une proteacuteine donneacutee De la seacutequence de la proteacuteine agrave la
formation de complexes oligomeacuteriques il existe quatre niveaux de structuration de la
proteacuteine
10
I111 Structure primaire
Les proteacuteines sont des assemblages d‟acides amineacutes (nombre supeacuterieur agrave 50) lieacutes entre eux
par des liaisons peptidiques Il existe vingt acides amineacutes naturels reacutepondant tous agrave la mecircme
structure geacuteneacuterale (Fig I 1) Ce sont des moleacutecules organiques formeacutees d‟un atome de
carbone central (alpha) auquel sont lieacutes un atome d‟hydrogegravene un radical R appeleacute aussi
chaicircne lateacuterale (R repreacutesente un groupement fonctionnel et correspond agrave la portion variable
d‟un acide amineacute agrave l‟autre) ainsi que deux groupements terminaux conserveacutes une amine et un
acide carboxylique
Fig I 1 Structure geacuteneacuterale des acides amineacutes Agrave pH physiologique les groupements
terminaux -NH2 et -COOH sont retrouveacutes respectivement sous la forme -NH3+ et -COO
-
Les acides amineacutes peuvent ecirctre distingueacutes suivant les proprieacuteteacutes physico-chimiques de leur
chaicircne lateacuterale (Fig I 2) Un premier groupe est formeacute par les acides amineacutes preacutesentant des
chaicircnes lateacuterales aliphatiques tels que la glycine (Gly G)1 l‟alanine (Ala A) la valine (Val
V) la leucine (Leu L) l‟isoleucine (Ile I) et la proline (Pro P) Ces acides amineacutes sont
apolaires On peut classer dans une seconde cateacutegorie ceux qui sont aromatiques
pheacutenylalanine (Phe F) tyrosine (Tyr Y) et tryptophane (Trp W) On distingue eacutegalement les
acides amineacutes basiques (lysine [Lys K] arginine [Arg R] histidine [His H]) et acides (acide
aspartique [Asp D] acide glutamique [Glu E]) L‟asparagine (Asn N) et la glutamine [Gln
Q] sont deux acides amineacutes polaires non ionisables Les deux derniers groupes sont constitueacutes
des acides amineacutes hydroxyleacutes (seacuterine [Ser S] threacuteonine [Thr R]) et ceux qui contiennent du
soufre (cysteacuteine [Cys C] meacutethionine [Met M]) Chacun des vingt acides amineacutes possegravede
donc une chaicircne lateacuterale avec une fonction chimique qui lui est propre L‟existence
simultaneacutee d‟une grande diversiteacute de fonctions chimiques est en partie agrave l‟origine de la
1 Les abreacuteviations entre parenthegraveses correspondent agrave la nomenclature en trois lettres et en une lettre des acides
amineacutes Elles seront utiliseacutees dans la suite de ce manuscrit
11
multitude de fonctions biochimiques que peuvent remplir les proteacuteines dans le monde du
vivant
Fig I 2 Tableau des vingt acides amineacutes naturels Ils peuvent ecirctre apolaires (hydrophobes) et
dans ce cas ils sont retrouveacutes le plus souvent au cœur des proteacuteines ou au contraire polaires
(hydrophiles) et localiseacutes geacuteneacuteralement agrave leur surface Parmi ces derniers certains sont acides
dautre basiques dautres encore sont neutres
Les acides amineacutes peuvent se lier entre eux de maniegravere covalente par la formation d‟une
liaison amide appeleacutee aussi liaison peptidique Elle s‟eacutetablit entre le groupement acide (-
COOH) dun acide amineacute et le groupement amine (-NH2) d‟un autre et permet la formation
12
d‟un dipeptide Au cours de la reacuteaction de condensation une moleacutecule deau est eacutelimineacutee Les
polymegraveres comprenant un plus grand nombre d‟acides amineacutes (de 10 agrave 100) sont nommeacutes
polypeptides Ces derniers servent dans la synthegravese des proteacuteines qui sont de longues chaicircnes
polypeptidiques
La structure primaire d‟une proteacuteine est donneacutee par la seacutequence lineacuteaire des acides amineacutes
la constituant Elle est orienteacutee Le premier acide amineacute de la seacutequence est par convention
celui qui possegravede une extreacutemiteacute amine libre on parle dextreacutemiteacute N-terminale De maniegravere
symeacutetrique le dernier acide amineacute est celui qui possegravede une extreacutemiteacute carboxyle libre on
parle d‟extreacutemiteacute C-terminale Cette convention correspond eacutegalement agrave l‟ordre de la synthegravese
de la proteacuteine par les ribosomes Par exemple la description AGSLK correspond agrave
l‟enchaicircnement des acides amineacutes alanine-glycine-seacuterine-leucine-lysine
Cependant une proteacuteine ne peut ecirctre simplement deacutecrite par une structure primaire
lineacuteaire En effet ses proprieacuteteacutes deacutecoulent eacutegalement de sa capaciteacute agrave former des structures
plus eacutelaboreacutees
I112 Structure secondaire
La structure secondaire d‟une proteacuteine correspond au repliement local de sa chaicircne
principale2 Il s‟eacutetablit alors des liaisons hydrogegravenes entre des acides amineacutes qui sont
relativement proches dans sa seacutequence primaire donnant naissance agrave des motifs structuraux
particuliers Lexistence de structures secondaires est due au fait que les repliements
eacutenergeacutetiquement favorables de la chaicircne peptidique sont en nombres limiteacutes et que seules
certaines conformations sont possibles Ainsi une proteacuteine se deacutecrit par sa seacutequence dacides
amineacutes mais aussi par l‟enchaicircnement de ses eacuteleacutements de structure secondaire
En d‟autres termes certaines conformations se trouvent nettement favoriseacutees car
particuliegraverement stabiliseacutees par des liaisons hydrogegravene entre les groupements amide (-NH) et
carbonyle (CO) du squelette peptidique Il existe trois principaux types de structures
secondaires selon le repliement des liaisons peptidiques et l‟eacutetablissement de ponts hydrogegravene
entre les acides amineacutes les heacutelices les feuillets et les coudes
2 La chaicircne principale dune proteacuteine correspond aux atomes impliqueacutes dans la structure de base du polypeptide
(-NH-CαH-CO-) Les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (souvent noteacutees -R) nappartiennent donc pas au
squelette carboneacute
13
L‟heacutelice est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine adopte
un repliement heacutelicoiumldal peacuteriodique L‟heacutelice est dite laquo droite raquo quand elle tourne dans le sens
horaire Il s‟agit du cas rencontreacute le plus freacutequent A linverse lorsquune heacutelice tourne dans le
sens anti-horaire elle est dite laquo gauche raquo Lheacutelice droite de type alpha est un motif structural
tregraves retrouveacute au sein des proteacuteines (Fig I 3) L‟heacutelice α est une structure tregraves stable
caracteacuteriseacutee par la formation de liaisons hydrogegravene entre le groupement carbonyle dun reacutesidu
n et le groupement amide dun reacutesidu n+4 Un tour dheacutelice α moyen est constitueacute de 36
acides amineacutes Dans une heacutelice α les chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes sont localiseacutees en
peacuteripheacuterie de lheacutelice et pointent vers lexteacuterieur perpendiculairement agrave l‟axe de la spirale La
structure compacte eacutenergeacutetiquement favorable de lheacutelice α a eacuteteacute preacutedite par Linus Pauling et
Robert Corey en 1951 (3) agrave partir de calculs theacuteoriques Elle a ensuite eacuteteacute observeacutee pour la
premiegravere fois en 1958 dans la myoglobine en huit exemplaires impliquant environ 75 des
acides amineacutes de la proteacuteine La structure tridimensionnelle de cette derniegravere fut la premiegravere
eacutelucideacutee par cristallographie des proteacuteines (4)
Fig I 3 Scheacutema de l‟heacutelice droite de type α tregraves reacutepandue dans le repliement des proteacuteines
Le pas de l‟heacutelice est de 54 Aring (5)
Le feuillet becircta est une structure reacuteguliegravere dans laquelle la chaicircne principale de la proteacuteine
adopte un repliement eacutetendu peacuteriodique Le feuillet β est composeacute de plusieurs brins β qui
eacutetablissent des liaisons hydrogegravene entre eux afin de stabiliser la structure De ce fait les ponts
hydrogegravenes qui le stabilisent se font entre reacutesidus distants plutocirct quentre reacutesidus conseacutecutifs
comme c‟est le cas dans une heacutelice α Dans un feuillet β les chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes sont situeacutees alternativement en dessus et en dessous du plan du feuillet Le repliement
β est favoriseacute par des acides amineacutes portant des petits groupements lateacuteraux laquoRraquo non chargeacutes
De la mecircme maniegravere que pour la structure de lheacutelice α la structure du feuillet β a eacuteteacute preacutedite
14
par Pauling et Corey en 1951 (6) Les feuillets β sont repreacutesenteacutes par des flegraveches (Fig I 4)
correspondant aux chaicircnes polypeptidiques qui les constituent Ces derniegraveres sont plisseacutees et
peuvent ecirctre aligneacutees de maniegravere parallegravele et dans ce cas elles ont la mecircme orientation ou de
maniegravere antiparallegravele avec des orientations opposeacutees Le sens est deacutetermineacute par la polariteacute des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes Lorsque deux brins β sorganisent de maniegravere
antiparallegravele les groupements -NH et -CO dun reacutesidu i du premier brin forment des liaisons
hydrogegravene avec les groupements -CO et -NH dun reacutesidu j appartenant au second
Typiquement deux brins β conseacutecutifs relieacutes par un coude forment un feuillet β antiparallegravele
Lorsque deux brins β sont orienteacutes dans le mecircme sens ils s‟organisent en un feuillet parallegravele
Les groupements -NH et -CO dun reacutesidu dun brin A forment alors des liaisons hydrogegravene
avec les groupements -CO dun premier reacutesidu et -NH d‟un second reacutesidu appartenant tous les
deux agrave un brin B Le feuillet β antiparallegravele est plus stable que le feuillet parallegravele car les ponts
hydrogegravene sont dans un alignement parfait
Fig I 4 Scheacutema du feuillet β anti-parallegravele qui est la juxtaposition de brins β ayant des
orientations opposeacutees (5)
Les coudes ne sont pas des structures reacuteguliegraveres et peacuteriodiques Il sagit plutocirct dun
repliement particulier de la chaicircne principale localiseacute sur trois ou quatre reacutesidus conseacutecutifs
Les coudes permettent bien souvent de relier deux structures secondaires peacuteriodiques telles
que les heacutelices etou les brins
15
Les heacutelices α les feuillets β et les coudes ne sont pas les seuls motifs structuraux
secondaires mais sont ceux qui sont le plus freacutequemment rencontreacutes Il existe une grande
varieacuteteacute de motifs moins courants qui ne seront pas deacutetailleacutes dans ce manuscrit
I113 Structure tertiaire
La structure tertiaire d‟une proteacuteine correspond agrave sa structure tridimensionnelle
d‟ensemble Il s‟agit de la structure finale adopteacutee par une proteacuteine apregraves le repliement dans
l‟espace des heacutelices α feuillets β et autres eacuteleacutements de la structure secondaire
Bien que la plupart des proteacuteines neacuteosyntheacutetiseacutees aient la capaciteacute de se replier
correctement certaines en sont incapables sans l‟intervention de proteacuteines dicirctes chaperonnes
Une proteacuteine chaperonne est donc une proteacuteine particuliegravere dont une des fonctions est
dassister dautres proteacuteines dans leur maturation en leur assurant un repliement
tridimensionnel adeacutequat Le repliement dans l‟espace des chaicircnes polypeptidiques est un
processus co-traductionnel (7) Les proteacuteines chaperonnes ont eacuteteacute co-deacutecouvertes en 1989 par
Arthur L Horwich et Franz-Ulrich Hartl (8-9)
La structure tertiaire donne une forme particuliegravere agrave la proteacuteine la rendant ainsi
fonctionnelle Pour cela elle faccedilonne la surface des proteacuteines de maniegravere complexe leur
permettant d‟interagir speacutecifiquement avec des ligands ou d‟autres macromoleacutecules comme
des proteacuteines partenaires (10) La structure tridimensionnelle est thermodynamiquement
stable dans un domaine restreint de tempeacuterature pH et force ionique Au-delagrave de ce domaine
une proteacuteine peut se deacuteplier et perdre son activiteacute biologique on dit alors qu‟elle est
deacutenatureacutee A l‟inteacuterieur des cellules ce sont les proteacuteines chaperonnes qui interviennent Elles
preacuteviennent les dommages potentiels causeacutes par de telles variations des conditions physico-
chimiques et regraveglent la perte de fonction due au mauvais repliement tridimensionnel pouvant
conduire agrave une varieacuteteacute de pathologies telles que la maladie d‟Alzheimer ou les maladies agrave
prion (11) L‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines est donc un eacuteleacutement cleacute
dans la compreacutehension de leurs fonctions biochimiques Son importance est aussi retrouveacutee
dans l‟industrie biopharmaceutique notamment dans le controcircle de la conception de proteacuteines
pharmaceutiques Il faut noter par ailleurs que la structure tridimensionnelle d‟une proteacuteine
en solution n‟est pas totalement rigide mais dynamique (12-13) En effet la chaicircne
polypeptidique subit des mouvements thermiques et est susceptible de se deacuteformer lors
16
d‟interactions avec d‟autres moleacutecules Ces fluctuations de conformations sont souvent
consideacutereacutees comme une condition preacutealable agrave la fonction biologique (14-15)
Cette organisation structurale dans l‟espace est obtenue et rendue possible gracircce agrave
diffeacuterents types dinteractions qui la stabilisent Ces interactions plus ou moins fortes sont
eacutetablies entre les radicaux de diffeacuterents acides amineacutes geacuteneacuteralement eacuteloigneacutes dans la structure
primaire La chaicircne principale de la proteacuteine aura donc tendance agrave se replier sur elle-mecircme
pour adopter une structure tridimensionnelle preacutecise Parmi les interactions les plus notables
sont retrouveacutees les interactions covalentes non covalentes ainsi que les interactions
hydrophobes
Les interactions covalentes eacutetablissent des liaisons fortes entre deux acides amineacutes qui
peuvent ecirctre tregraves proches dans la structure tertiaire mais tregraves eacuteloigneacutes dans la structure
primaire de la proteacuteine De ce fait la formation de cette liaison conduit agrave une stabilisation
accrue de la structure tertiaire Dans le cas des proteacuteines il s‟agit principalement de la
creacuteation d‟un pont disulfure par une reacuteaction d‟oxydation se deacuteroulant entre les fonctions
thiols de deux cysteacuteines Les interactions non covalentes regroupent quant agrave elles les liaisons
eacutelectrostatiques les liaisons hydrogegravene et les liaisons de van der Waals Elles se distinguent
par leur geacuteomeacutetrie leur longueur et leur speacutecificiteacute Elles sont affecteacutees de diffeacuterentes faccedilons
par la preacutesence d‟eau
Les liaisons eacutelectrostatiques peuvent s‟eacutetablir entre deux groupements portant une charge
nette positive ou neacutegative Cette interaction peut conduire agrave un effet reacutepulsif (charges de signe
identique) ou attractif (charges opposeacutees) Une interaction entre deux groupes de charge
opposeacutee est eacutegalement appeleacutee liaison ionique liaison saline pont salin ou paire d‟ions Il
s‟agit de l‟interaction la plus forte parmi les interactions non covalentes Elle est plus forte
dans le vide et plus faible dans un milieu tel que l‟eau
Les liaisons hydrogegravene peuvent ecirctre formeacutees aussi bien entre des moleacutecules non chargeacutees
que des moleacutecules chargeacutees Elle correspond agrave une liaison entre deux atomes eacutelectroneacutegatifs
assureacutee par un atome d‟hydrogegravene partageacute entre les deux L‟atome auquel l‟hydrogegravene est le
plus fermement lieacute est le donneur d‟hydrogegravene tandis que l‟autre est l‟accepteur d‟hydrogegravene
Avec des eacutenergies de liaison de l‟ordre de 3 agrave 7 kcalmol les liaisons hydrogegravene sont plus
fortes que celles de van der Waals Les liaisons hydrogegravene sont directionnelles Les plus
fortes sont celles dans lesquelles le donneur l‟hydrogegravene et l‟accepteur sont colineacuteaires
17
Les liaisons de van der Waals force attractive non speacutecifique entrent en jeu lorsque deux
atomes sont distants de 3 agrave 4 Aring Elle est due au fait que la distribution de la charge
eacutelectronique autour d‟un atome varie dans le temps A un instant donneacute la distribution de la
charge n‟est pas parfaitement symeacutetrique Cette asymeacutetrie transitoire de la charge eacutelectronique
autour d‟un atome induit une asymeacutetrie semblable dans la distribution eacutelectronique des
atomes voisins non lieacutes Ceci conduit donc agrave des interactions de type dipocircle-dipocircle induit
L‟eacutenergie des interactions de van der Waals est faible avec une eacutenergie de stabilisation de
l‟ordre de 06 kcalmol Comme pour les liaisons hydrogegravene le nombre de ces interactions au
sein d‟une proteacuteine peut ecirctre tregraves eacuteleveacute La somme de l‟eacutenergie mise en jeu est alors
substantielle A titre d‟exemple dans le cytochrome C de cheval et dans la myoglobine de
cachalot les interactions de van der Waals agrave l‟inteacuterieur de la proteacuteine contribuent pour
l‟essentiel agrave la stabiliteacute de la structure
Dans une solution aqueuse une moleacutecule apolaire tend agrave interagir avec d‟autres moleacutecules
apolaires plutocirct que de s‟entourer de moleacutecules d‟eau On nomme cette proprieacuteteacute
hydrophobiciteacute et cela conduit agrave des interactions entre moleacutecules qu‟on appelle des
interactions hydrophobes Ces derniegraveres engendrent dans le cas des proteacuteines un
regroupement des reacutesidus apolaires geacuteneacuteralement vers le centre formant un cœur hydrophobe
ou encore au niveau d‟autres reacutegions hydrophobes de la cellule comme dans les membranes
lipidiques Les interactions hydrophobes constituent une force essentielle dans le repliement
des proteacuteines
I114 Structure quaternaire
La structure quaternaire d‟une proteacuteine est donneacutee par l‟association des diffeacuterentes chaicircnes
polypeptidiques la constituant Elles peuvent ecirctre identiques ou diffeacuterentes et sont relieacutees par
des liaisons non covalentes (liaisons hydrogegravene liaisons ioniques interactions hydrophobes)
et plus rarement par des ponts disulfures Leffet hydrophobe est un facteur preacutepondeacuterant dans
lassemblage des eacuteleacutements structuraux y compris dans lassociation des chaicircnes Chacune de
ces chaicircnes est appeleacutee monomegravere (ou sous uniteacute) et lensemble oligomegravere ou proteacuteine
multimeacuterique
18
Seulement certaines proteacuteines preacutesentent une telle organisation Lheacutemoglobine est un
exemple de proteacuteine posseacutedant une structure quaternaire Elle est constitueacutee de quatre sous-
uniteacutes deux sous-uniteacutes α (de 141 acides amineacutes) et deux sous-uniteacutes β (de 146 acides
amineacutes)
Ces assemblages polypeptidiques peuvent ecirctre parfaitement bien deacutefinis mais certains
peuvent former des complexes multiproteacuteiques uniquement transitoires tout en eacutetant
fonctionnellement importants En effet dans l‟environnement cellulaire les proteacuteines sont
rarement isoleacutees et les interactions qu‟elles peuvent creacuteer avec d‟autres partenaires sont
essentielles agrave leur fonction Dans d‟autres cas comme dans les macroassemblages amyloiumldes
la formation d‟un complexe entre des proteacuteines peut conduire agrave la formation d‟assemblages
potentiellement pathogegravenes (16) L‟eacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
macroassemblages est donc primordiale agrave la compreacutehension de leur fonctionnement et
dysfonctionnement
~
Nous venons de mettre en eacutevidence l‟importance de l‟eacutetude structurale des proteacuteines ainsi
que sa complexiteacute qui en font un veacuteritable deacutefi analytique La structure tridimensionnelle
d‟une proteacuteine donneacutee n‟est pas neacutecessairement unique elle peut fluctuer temporellement ou
deacutependre des autres moleacutecules (proteacuteines ou ligands) avec lesquelles la proteacuteine interagit dans
l‟environnement cellulaire Il existe un grand nombre de techniques physico-chimiques
biophysiques ou biochimiques permettant d‟obtenir des informations structurales sur des
proteacuteines et des complexes proteacuteiques Les approches les plus couramment employeacutees pour
identifier et caracteacuteriser des interactions proteacuteine-proteacuteine combinent des meacutethodes
biochimiques et biophysiques
Parmi ces techniques deux meacutethodes physico-chimiques sont couramment utiliseacutees pour
l‟eacutetude de la structure tridimensionnelle des proteacuteines Il s‟agit de la cristallographie et de la
reacutesonance magneacutetique nucleacuteaire (RMN) En ce qui concerne l‟analyse des complexes
proteacuteiques qui sont geacuteneacuteralement des eacutedifices macromoleacuteculaires bien plus importants ces
derniegraveres anneacutees ont vu le deacuteveloppement de meacutethodes alternatives telles que la cryo-
microscopie eacutelectronique la diffraction de rayons X ou de neutrons aux petits angles ou
encore diffeacuterentes techniques baseacutees sur l‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse Il est aussi
possible d‟aborder la composition des complexes proteacuteiques par des meacutethodes biochimiques
parmi lesquelles le TAP-Tag et le double hybride occupent une place de choix
19
Les paragraphes suivants seront consacreacutes agrave une description des grandes meacutethodes
d‟analyse physico-chimique et biochimique utilisables pour appreacutehender la structure des
proteacuteines mais surtout celle des complexes proteacuteiques
I12 Meacutethodes drsquoanalyse physico-chimique
I121 Meacutethodes classiques pour lrsquoeacutetude de la structure tridimensionnelle des
proteacuteines
I1211 Cristallographie des proteacuteines
La cristallographie est la science qui eacutetudie les systegravemes cristallins agrave leacutechelle atomique
Les macromoleacutecules dont font partie les proteacuteines sont geacuteneacuteralement trop petites pour ecirctre
observeacutees directement par microscopie optique En effet leur taille nest pas suffisante pour
diffracter la lumiegravere dans les longueurs d‟onde du domaine visible du spectre
eacutelectromagneacutetique En revanche les distances interatomiques au sein des proteacuteines (environ
15 Aring) sont du mecircme ordre de grandeur que la longueur d‟onde des rayons X Par conseacutequent
la diffraction des rayons X par les atomes d‟une proteacuteine peut quant agrave elle ecirctre envisageacutee
Dans un cristal reacutegulier les proteacuteines forment un arrangement peacuteriodique suivant des axes de
l‟espace tridimensionnel de mailles eacuteleacutementaires deacutefinies comme eacutetant le plus petit eacuteleacutement
repreacutesentant le cristal entier Des translations suivant les axes d‟une maille eacuteleacutementaire
permettent de reconstituer l‟ensemble du cristal
Chaque atome d‟une proteacuteine a donc exactement la mecircme position dans toutes les mailles
Le cristal est ainsi composeacute de plans d‟atomes Ces plans d‟atomes ou plutocirct les nuages
d‟eacutelectrons correspondants produisent un motif de diffraction lors de l‟irradiation du cristal
aux rayons X (17) Le motif de diffraction contient les informations sur la position de tous les
atomes de la maille Par conseacutequent il est possible par l‟analyse de ce motif de calculer les
angles de diffraction ainsi que les distances interatomiques pour reconstituer la structure
moleacuteculaire
La haute reacutesolution reste le principal avantage de cette technique Malgreacute des donneacutees
relativement complexes agrave analyser la diffraction des rayons X donne des informations tregraves
preacutecises sur la structure moleacuteculaire des proteacuteines souvent agrave une reacutesolution atomique
20
infeacuterieure ou eacutegale agrave 12 Aring (18) A des reacutesolutions encore plus eacuteleveacutees ie infeacuterieures ou
eacutegales agrave 08 Aring les atomes d‟hydrogegravene deviennent visibles et les atomes ne peuvent plus ecirctre
consideacutereacutes comme des sphegraveres en raison de la deacuteformation des nuages eacutelectroniques Une telle
visualisation des eacutelectrons permet de deacuteterminer la distribution des charges et la polarisation
des liaisons (19) Une image tregraves deacutetailleacutee de la structure de la proteacuteine est alors obtenue
Toutefois la technique preacutesente des limites La principale difficulteacute lieacutee agrave la meacutethode reste
l‟obtention de cristaux avec des tailles suffisantes Il est indispensable de disposer de
plusieurs cristaux identiques car ils sont souvent deacutegradeacutes en preacutesence des rayons X (par
chauffage ou par des radicaux libres) Pour faire pousser des cristaux il est neacutecessaire de
produire une proteacuteine extrecircmement pure Il est eacutegalement indispensable d‟exprimer des
quantiteacutes importantes de proteacuteine afin de trouver les conditions optimales de cristallisation
Ces derniegraveres eacutetant proteacuteines deacutependantes il est impeacuteratif d‟en tester un grand nombre Les
cristaux peuvent se former rapidement ou au contraire apparaicirctre apregraves un temps
consideacuterablement long Parfois mecircme il est malheureusement impossible d‟en obtenir Les
chaicircnes polypeptidiques partiellement replieacutees telles que le prion sont un exemple probant de
proteacuteines difficilement cristallisables (20) De plus si des cristaux sont finalement obtenus
alors les segments peptidiques qui sont non structureacutes en solution apparaicirctront soit ordonneacutes
par des liaisons intermoleacuteculaires au sein du systegraveme cristallin ou n‟apparaicirctront pas Par
conseacutequent il est important de deacutevelopper une meacutethode alternative permettant d‟eacutetudier la
structure de proteacuteines partiellement replieacutees ou mecircme deacutesordonneacutees
Par deacutefinition l‟eacutetude cristallographique est baseacutee sur des structures statiques (les cristaux)
de l‟eacutetat le plus stable Il est donc peu probable que cette technique renseigne sur la
dynamique des moleacutecules Si la proteacuteine cristalliseacutee preacutesente une dynamique sans mouvement
agrave grande eacutechelle alors des eacuteveacutenements dynamiques peuvent ecirctre caracteacuteriseacutes En revanche les
mouvements agrave grande eacutechelle sont quasiment toujours bloqueacutes dans le cristal D‟importants
deacuteveloppements technologiques ont eacuteteacute apporteacutes agrave la technique pour ameacuteliorer l‟observation
de la dynamique agrave courte eacutechelle Il s‟agit de la cryo-cristallographie (21-23) ou des meacutethodes
de cristallographie en temps reacutesolu (24-26)
L‟avegravenement du synchrotron a consideacuterablement acceacuteleacutereacute la vitesse d‟acquisition des
donneacutees En effet celle-ci a eacuteteacute reacuteduite de quelques semaines agrave quelques heures gracircce agrave la
production d‟un rayonnement X intense stable de longueur d‟onde variable et de grande
21
qualiteacute optique Actuellement la plupart des donneacutees de cristallographie sont collecteacutees agrave
partir d‟un synchrotron
La diffraction des rayons X est eacutegalement un outil de choix pour l‟eacutetude de complexes
proteacuteiques permettant d‟obtenir des informations structurales de tregraves grande qualiteacute mecircme
pour des systegravemes tregraves complexes (27) ou membranaires (28-29)
I1212 Spectroscopie RMN
La spectroscopie RMN est eacutegalement devenue une meacutethode performante pour l‟eacutetude de la
conformation des proteacuteines Deacuteveloppeacutee en 1945 elle n‟a cesseacute d‟ecirctre ameacutelioreacutee depuis sa
mise au point En raison de l‟impact scientifique exceptionnel qu‟elle a eu au fil des anneacutees
elle a eacuteteacute reacutecompenseacutee par quatre prix Nobel Le dernier en date (2002) a eacuteteacute deacutecerneacute au
Professeur Kurt Wuumlthrich pour ses deacuteveloppements porteacutes agrave la RMN qui ont permis
l‟eacutelucidation de la structure tridimensionnelle des macromoleacutecules biologiques en solution
Plus particuliegraverement il a eacuteteacute primeacute pour son eacutetude structurale de la proteacuteine prion
partiellement replieacutee (30)
Technique d‟analyse chimique et structurale non destructive elle est baseacutee sur l‟absorption
de la radiation agrave une radio freacutequence par des noyaux atomiques Les niveaux d‟eacutenergie de spin
des noyaux sont seacutepareacutes dans un champ magneacutetique (effet Zeeman) Sous l‟effet d‟une radio
freacutequence chaque noyau de la moleacutecule va reacutesonner agrave sa freacutequence speacutecifique (freacutequence de
Larmor) Chaque noyau de la proteacuteine a donc sa propre freacutequence de Larmor qui deacutepend de
l‟environnement local du noyau (par exemple protection par des champs magneacutetiques locaux)
Un spectre RMN contient ainsi des pics correspondants aux reacutesonances de tous les noyaux de
l‟eacutechantillon chacun avec une freacutequence (caracteacuteriseacutee par le deacuteplacement chimique δ)
caracteacuteristique de son environnement chimique De plus la surface sous un pic est
proportionnelle au nombre des noyaux reacutesonnant agrave cette freacutequence ce qui permet de
quantifier les reacutesidus identifieacutes et caracteacuteriseacutes
Un facteur tregraves important permettant la deacutetermination de la structure des proteacuteines est la
correacutelation entre des noyaux d‟une moleacutecule La perturbation locale des nuages d‟eacutelectrons
par le spin des noyaux conduit agrave un couplage scalaire entre des noyaux qui sont lieacutes de faccedilon
covalente avec un maximum de quatre liaisons entre eux L‟origine de ce couplage est le
22
changement des niveaux d‟eacutenergie des eacutetats de spin des noyaux en question pour conduire agrave
des nouveaux niveaux d‟eacutenergie en fonction de l‟alignement des spins des noyaux (parallegravele
ou anti-parallegravele) Le nombre et la nature des noyaux voisins produit des motifs et des
constantes de couplage speacutecifiques qui permettent d‟attribuer une structure covalente Dans
les proteacuteines chaque chaicircne lateacuterale d‟un acide amineacute preacutesente un motif de couplage scalaire
caracteacuteristique Il est alors aiseacute d‟attribuer les signaux RMN agrave la structure d‟une proteacuteine
L‟eacutetude d‟une proteacuteine peut ecirctre reacutealiseacutee par RMN homonucleacuteaire ou heacuteteacuteronucleacuteaire Les
noyaux protons sont alors observeacutes respectivement seuls ou avec les noyaux carbones etou
azotes Les expeacuteriences RMN permettent l‟observation des couplages scalaires et dipolaires
entre spins Le transfert d‟aimantation par couplage dipolaire produit des effets Overhauser
nucleacuteaires (nOe) entre noyaux situeacutes agrave moins de 5 Aring l‟un de l‟autre La mise en eacutevidence de
ces pheacutenomegravenes permet l‟estimation des distances entre les noyaux consideacutereacutes Cependant la
RMN homonucleacuteaire preacutesente certaines limites pour l‟eacutetude des proteacuteines en solution en
raison du taux de superposition des pics sur les spectres et du mauvais transfert d‟aimantation
entre protons par couplage scalaire Ces inconveacutenients qui rendaient probleacutematique l‟emploi
de la RMN pour l‟eacutetude de proteacuteines de taille supeacuterieure agrave cent acides amineacutes ont eacuteteacute
surmonteacutes par l‟utilisation des proprieacuteteacutes RMN de noyaux autres que le proton En effet des
noyaux diffeacuterents reacutesonnent dans des gammes de freacutequences diffeacuterentes ce qui permet de
reacutesoudre les superpositions de deacuteplacements chimiques De plus les constantes de couplage
heacuteteacuteronucleacuteaires ameacuteliorent la sensibiliteacute du couplage scalaire
Les trois isotopes de spin 12 naturellement preacutesents dans les proteacuteines sont 1H
15N et
13 C
Cependant les faibles abondances naturelles des isotopes 13
C du carbone (11 ) et 15
N de
l‟azote (037 ) ne permettent pas de reacutealiser des expeacuteriences de correacutelation heacuteteacuteronucleacuteaire
les impliquant Par conseacutequent un enrichissement des eacutechantillons proteacuteiques en isotopes 13
C
et 15
N preacutealable agrave l‟analyse en RMN doit ecirctre envisageacute
La preacuteparation d‟eacutechantillons marqueacutes est reacutealiseacutee le plus souvent par clonage
moleacuteculaire et par techniques de surexpression et de purification de proteacuteines La
surexpression des proteacuteines isotopiquement enrichies peut se faire agrave partir d‟une culture en
milieu minimum ou en milieu riche Le milieu minimum est preacutepareacute de faccedilon agrave ne renfermer
qu‟une seule source du noyau dont on veut enrichir la proteacuteine (eg glucose avec 13
C
chlorure d‟ammonium avec 15
N) Les cultures en milieu riche se font en utilisant un milieu
standard enrichi en isotopes Si l‟on souhaite simplement proceacuteder agrave un marquage partiel de la
23
proteacuteine sur certains types de reacutesidus alors on peut utiliser un organisme heacuteteacuterotrophe Ce
dernier incapable de syntheacutetiser certains acides amineacutes devra donc les puiser dans son milieu
de culture Ces organismes sont cultiveacutes dans un milieu contenant les acides amineacutes marqueacutes
que l‟on veut incorporer dans la proteacuteine
Les expeacuteriences de RMN heacuteteacuteronucleacuteaire peuvent ecirctre reacutealiseacutees sur des eacutechantillons
simplement marqueacutes au 15
N ou doublement marqueacutes (15
N 13
C) Dans le cas de proteacuteines
marqueacutees agrave l‟isotope lourd de l‟azote (15
N) des expeacuteriences 2D HSQC ou HMQC
(laquo Heteronuclear Single Multiple Quantum Correlation raquo) peuvent ecirctre meneacutees Elles
permettent d‟observer les pics de correacutelation dus au couplage scalaire entre l‟hydrogegravene
amide et l‟azote de chaque reacutesidu La strateacutegie d‟attribution baseacutee sur le double marquage
utilise quant agrave elle exclusivement les couplages scalaires homo- et heacuteteacuteronucleacuteaires Si l‟on
souhaite augmenter la limite de taille des systegravemes eacutetudieacutes alors en sus du marquage 15
N et
13C on peut remplacer 70 agrave 100 des protons par des deuteacuteriums En effet cela permet de
diminuer la fuite de l‟aimantation due aux interactions dipolaires entre protons La diminution
de la relaxation transverse agrave l‟aide de l‟expeacuterience TROSY (laquo Transverse Relaxation-
Optimized SpectroscopY raquo) permet eacutegalement de repousser cette limite (31) Des expeacuteriences
combinant les deux approches ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees pour l‟analyse de complexes
proteacuteiques de haut poids moleacuteculaire (gt 50 kDa) (32)
Les intermeacutediaires du repliement d‟une proteacuteine peuvent aussi ecirctre caracteacuteriseacutes par
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avec le deuteacuterium de l‟eau lourde Enfin une interpreacutetation
qualitative des deacuteplacements chimiques en fonction de la structure primaire de la moleacutecule
permet la deacutetection des structures secondaires telles que l‟heacutelice α ou le feuillet β
Si l‟avantage majeur de la RMN par rapport agrave la diffraction des rayons X est de permettre
l‟eacutetude de proteacuteines en solution elle preacutesente des limites importantes qui sont d‟une part la
quantiteacute de mateacuteriel neacutecessaire pour reacutealiser les expeacuteriences (des concentrations de l‟ordre du
millimolaire de proteacuteine sont geacuteneacuteralement utiliseacutees et d‟une centaine de micromoles avec
l‟utilisation d‟une cryosonde) mais surtout la taille des systegravemes qui peuvent ecirctre eacutetudieacutes (lt
50 kDa) Il faut par ailleurs noter que dans certains cas des concentrations d‟eacutechantillon tregraves
eacuteleveacutees peuvent induire des perturbations de la structure quaternaire des proteacuteines (agreacutegation
ou preacutecipitation de certaines proteacuteines)
24
I122 Meacutethodes pour lrsquoeacutetude de la structure quaternaire des proteacuteines et des
assemblages macromoleacuteculaires
I1221 Diffusion aux petits angles
La diffusion aux petits angles des rayons X en solution (laquo Small Angle X-ray Scattering raquo
SAXS) est une technique qui repose sur la diffusion eacutelastique des rayons X par des proteacuteines
et des macro-assemblages dans la gamme 10-1000 Aring (33) Bien qu‟il ne soit pas possible
d‟obtenir une reacutesolution atomique par cette meacutethode elle fournit des informations structurales
preacutecieuses agrave basse reacutesolution (forme globale de la proteacuteine structures tertiaire et quaternaire)
Elle permet donc d‟eacutetudier les changements conformationnels de macromoleacutecules ainsi que la
formation d‟assemblages supramoleacuteculaires dans des conditions quasi-physiologiques La
diffusion en solution qui n‟est pas soumise aux principales limitations de la cristallographie
et de la RMN apparaicirct comme une technique compleacutementaire pour l‟eacutetude structurale des
macromoleacutecules
Les eacutechantillons reacuteels sont le plus souvent complexes (co-existence de plusieurs espegraveces de
proteacuteines) et heacuteteacuterogegravenes (manque dhomogeacuteneacuteiteacute au niveau de la conformation des
moleacutecules) Leur eacutetude repreacutesente un deacutefi majeur pour cette technique En effet dans un tel
cas le profil de diffusion contiendra des contributions de tous les composants rendant
l‟analyse complexe Cette difficulteacute peut ecirctre surmonteacutee par des meacutethodes de traitement des
donneacutees afin de caracteacuteriser des conformegraveres individuels de proteacuteines (34) ou bien des
agreacutegats de proteacuteines (35)
I1222 Cryomicroscopie eacutelectronique
La cryomicroscopie eacutelectronique se base sur les principes geacuteneacuteraux de la microscopie
eacutelectronique agrave transmission tout en eacutevitant les eacutetapes de preacuteparation endommageant les
eacutechantillons Elle repose sur l‟observation de moleacutecules ayant eacuteteacute fixeacutees de maniegravere brutale
par congeacutelation agrave tregraves basse tempeacuterature (processus de quelques millisecondes agrave environ -
170degC) afin d‟eacuteviter la formation de cristaux de glace Les moleacutecules totalement englobeacutees
dans un fin film d‟eau vitrifieacutee sont ainsi preacuteserveacutees dans leur environnement et leur eacutetat
natifs Compleacutementaire agrave la cristallographie des proteacuteines et agrave la spectroscopie RMN cette
meacutethode permet d‟obtenir la structure de larges assemblages macromoleacuteculaires en solution
25
La microscopie eacutelectronique permet d‟obtenir des images bidimensionnelles correspondant
agrave des projections de toute leacutepaisseur de leacutechantillon Cependant elles ne possegravedent quun
contraste tregraves faible et lanalyse dimages est alors indispensable Celle-ci consiste dans un
premier temps agrave additionner des images de faible contraste afin de moyenner le bruit preacutesent
et dobtenir un meilleur rapport signal sur bruit Dans un deuxiegraveme temps ces moyennes qui
repreacutesentent des vues de leacutechantillon sous diffeacuterents angles peuvent ecirctre combineacutees de
maniegravere matheacutematique pour calculer la structure tridimensionnelle de lobjet de deacutepart (36)
Cette technique de reconstruction en 3D utilisant des images obtenues sous diffeacuterents angles
est appeleacutee tomographie
La cryomicroscopie eacutelectronique est particuliegraverement bien adapteacutee agrave l‟observation de
moleacutecules de masse moleacuteculaire supeacuterieure agrave 200 ou 300 kDa (37) En effet seuls des eacutedifices
macromoleacuteculaires de grande taille remplissent les critegraveres neacutecessaires pour ecirctre visualiseacutes au
dessus du bruit de fond Il est possible d‟obtenir une reacutesolution de l‟ordre de 10 agrave 30 Aring (38)
Pour des macro-assemblages on peut envisager de compleacuteter une structure agrave basse reacutesolution
avec des structures agrave haute reacutesolution des proteacuteines individuelles Ces derniegraveres peuvent ecirctre
obtenues par exemple par cristallographie Il est ainsi possible d‟obtenir des informations
structurales agrave une reacutesolution presque atomique de structures subcellulaires (39)
Cette technique permet l‟eacutetude du changement conformationnel d‟assemblages
macromoleacuteculaires par imagerie de complexes fixeacutes par vitrification dans diffeacuterents eacutetats
conformationnels (37 40) La microscopie eacutelectronique permet eacutegalement aujourd‟hui
d‟obtenir des informations sur des macromoleacutecules et leurs assemblages dans le contexte
cellulaire par imagerie de la structure biologique entiegravere (41-43) Ceci a eacuteteacute rendu possible par
les progregraves effectueacutes dans le deacuteveloppement de la tomographie eacutelectronique et l‟eacutelaboration
de la cryomicroscopie de sections vitreuses
Il existe de nombreuses eacutetudes de complexes macromoleacuteculaires par cryomicroscopie
eacutelectronique parmi lesquelles la structure du ribosome agrave une reacutesolution de 115 Aring (44) et celle
de virus (45) l‟environnement cytosolique total de cellules eucaryotes (46) ainsi que l‟eacutetude
d‟une interaction proteacuteine chaperone-substrat (47)
La cryomicroscopie eacutelectronique possegravede plusieurs avantages par rapport agrave la
cristallographie et agrave la RMN En effet elle requiert de plus faibles quantiteacutes de mateacuteriel
(environ 2 mL agrave une concentration de 01-10 mgmL-1
par grille) elle ne neacutecessite pas
26
l‟obtention de cristaux et elle permet l‟observation d‟objets de lordre de grandeur de 300 kDa
agrave 1000 MDa Mais cette meacutethode preacutesente aussi des limites Les eacutechantillons doivent ecirctre
purs uniformes et sans agreacutegats et contenir seulement une faible concentration de sel et de
solvants afin de maximiser le contraste entre la proteacuteine et le tampon
I1223 Chromatographie drsquoexclusion steacuterique
La chromatographie est une technique de chimie analytique quantitative et qualitative Il
s‟agit d‟une meacutethode physique de seacuteparation d‟espegraveces chimiques Le principe est le suivant
leacutechantillon renfermant une ou plusieurs espegraveces est entraicircneacute par une phase mobile le long
dune phase stationnaire Chaque espegravece a une vitesse de migration propre qui deacutepend de ses
caracteacuteristiques et de celles des deux phases
La chromatographie d‟exclusion steacuterique appeleacutee aussi filtration sur gel permet de seacuteparer
des proteacuteines ou autres moleacutecules biologiques suivant leur taille (48) tandis que la plupart des
meacutethodes chromatographiques utilisent l‟affiniteacute chimique avec un support La phase
stationnaire est un gel hydrateacute constitueacute de pores de tailles diffeacuterentes Les macromoleacutecules de
l‟eacutechantillon entrent et sortent de ces pores selon leur taille Les moleacutecules les plus petites
peuvent entrer dans un plus grand nombre de pores ce qui allonge la dureacutee de leur migration
alors que les plus grosses moleacutecules sont eacutelueacutees plus rapidement En conseacutequence les
macromoleacutecules sont seacutepareacutees selon leurs dimensions
Plus rigoureusement cette meacutethode permet de seacuteparer des macromoleacutecules en fonction de
leur taille mais aussi de leur forme ie suivant leur volume hydrodynamique Ainsi deux
macromoleacutecules de mecircme masse moleacuteculaire mais d‟architecture diffeacuterente pourront ecirctre
distingueacutees En effet une macromoleacutecule peu structureacutee aura un plus grand volume
hydrodynamique qu‟une macromoleacutecule de mecircme masse moleacuteculaire mais de structure tregraves
globulaire Par conseacutequent la premiegravere sera plus rapidement eacutelueacutee que la seconde bien que
les deux masses soient identiques
Une eacutetude reacutecente a montreacute qu‟il eacutetait possible de caracteacuteriser des macroassemblages de
tregraves grande taille jusqu‟agrave plusieurs millions de daltons par chromatographie d‟exclusion
steacuterique (49)
27
I1224 Reacutesonance plasmonique de surface
La reacutesonance plasmonique de surface (laquo Surface Plasmon Resonance raquo SPR) est un
pheacutenomegravene physique baseacute sur les proprieacuteteacutes de la lumiegravere Lorsquun faisceau de lumiegravere
polariseacutee monochromatique illumine une surface placeacutee entre deux milieux dindice de
reacutefraction diffeacuterent une partie du rayon incident est reacutefleacutechie tandis que lautre partie est
reacutefracteacutee agrave travers la surface Selon langle dincidence du rayon toute la lumiegravere peut ecirctre
reacutefleacutechie Lorsquil ny a pas de reacutefraction ie sous les conditions de reacuteflexion interne totale
une des composantes eacutelectromagneacutetiques de la lumiegravere londe eacutevanescente se propage
perpendiculairement agrave la surface sur une distance eacutequivalente agrave sa longueur donde Si une
couche fine de meacutetal riche en eacutelectrons libres est deacuteposeacutee sur cette surface alors ceux-ci
entrent en reacutesonance avec les photons du faisceau incident et creacuteent la reacutesonance plasmonique
de surface Une conseacutequence eacutenergeacutetique de cette reacutesonance est visible dans le faisceau
reacutefleacutechi qui preacutesente une chute dintensiteacute agrave un angle deacutefini Cet angle pour lequel on observe
une intensiteacute minimale est langle de reacutesonance Il varie en fonction de lindice de reacutefraction
du milieu dans lequel londe eacutevanescente se propage
Depuis sa deacutecouverte par Wood en 1902 (50-51) la reacutesonance plasmonique de surface est
principalement utiliseacutee comme senseur ie comme deacutetecteur placeacute agrave la source mecircme du
pheacutenomegravene eacutetudieacute capable de deacuteceler des modifications au niveau moleacuteculaire L‟application
de cette technique pour le controcircle des interactions biomoleacuteculaires a eacuteteacute deacutemontreacutee pour la
premiegravere fois en 1983 (52) La reacutesonance plasmonique de surface permet de mettre en
eacutevidence la formation d‟une liaison entre un ligand et un reacutecepteur adsorbeacute agrave la surface
meacutetallique par mesure de la variation de lindice de reacutefraction (Fig I 5) Lanalyte est mis au
contact de la surface meacutetallique greffeacutee Les changements induits par lassociation ou la
dissociation des complexes modifient la reacutefringence du milieu et deacutecalent la position de
langle de reacutesonance Lenregistrement de la variation de langle de reacutesonance permet de suivre
en temps reacuteel la fixation des moleacutecules injecteacutees Cette technique permet donc d‟obtenir des
donneacutees cineacutetiques sur des interactions mettant en jeu deux ou plusieurs partenaires (53)
28
Fig I 5 Scheacutema du principe de la reacutesonance plasmonique de surface utiliseacute par la technologie
Biacore TM pour l‟analyse des interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans marquage
Dans un tel systegraveme les deux milieux d‟indices de reacutefraction diffeacuterents sont la solution dans
laquelle se trouvent les moleacutecules agrave analyser et le verre d‟une lame qui sert de senseur Le
film conducteur agrave l‟interface des deux est un tregraves fin film d‟or agrave la surface de la lame de verre
La reacutesonance plasmonique de surface permet donc de deacutetecter et de quantifier des
interactions entre moleacutecules en temps reacuteel et sans avoir recours au marquage de ces derniegraveres
Par le suivi en temps reacuteel de la formation et de la dissociation des complexes il est possible
de caracteacuteriser minutieusement la force des associations et d‟obtenir les cineacutetiques des
interactions moleacuteculaires La technique ne neacutecessitant pas l‟utilisation de marquage pour la
deacutetection et eacutetant non destructrice les biomoleacutecules qui sont seacutelectivement retenues sur la
surface du capteur peuvent ecirctre par la suite reacutecupeacutereacutees et analyseacutees par spectromeacutetrie de
masse Cette combinaison de technologies offre donc une toute nouvelle gamme
d‟applications telle que l‟identification et la rapide caracteacuterisation de nouvelles interactions
proteacuteineproteacuteine entre une proteacuteine d‟inteacuterecirct et un meacutelange complexe de proteacuteines (54-55)
I1225 Spectromeacutetrie de masse
Bien que les techniques de diffraction des rayons X et de spectroscopie RMN soient les
deux meacutethodes phares pour l‟eacutelucidation structurale des proteacuteines nous avons vu
preacuteceacutedemment qu‟elles preacutesentaient des limites En effet elles sont toutes les deux peu
sensibles et la cristallographie des proteacuteines neacutecessite l‟obtention de cristaux tandis que la
spectroscopie RMN est limiteacutee en gamme de masse Ainsi le choix de ces meacutethodes
29
classiques pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques n‟est pas toujours possible En revanche
l‟apport de la spectromeacutetrie de masse dans ce domaine est en constante progression La
spectromeacutetrie de masse ne permet pas d‟obtenir des informations structurales avec la mecircme
reacutesolution spatiale que les rayons X ou la RMN mais apporte un gain important en termes de
sensibiliteacute et rapiditeacute par rapport aux deux meacutethodes preacuteceacutedentes Il existe plusieurs
approches par spectromeacutetrie de masse permettant d‟obtenir des informations de structure
L‟une d‟entre elles repose sur le pontage covalent de proteacuteines en association suivi d‟une
digestion enzymatique et analyse par spectromeacutetrie de masse Une deuxiegraveme implique des
eacutechanges isotopiques (ou un marquage covalent) permettant soit de deacuteterminer des zones de
flexibiliteacute induites par la liaison d‟un ligand agrave une proteacuteine soit des zones d‟interaction entre
macromoleacutecules au sein d‟un complexe La spectromeacutetrie de masse offre eacutegalement
l‟opportuniteacute de caracteacuteriser des complexes non covalents (proteacuteine-proteacuteine proteacuteine-ligand)
gracircce agrave l‟utilisation de modes d‟ionisation adapteacutes On peut noter pour l‟analyse de
complexes proteacuteiques intacts l‟eacutemergence de spectromegravetres de masse eacutequipeacutes d‟une cellule
de mobiliteacute ionique
Approche par pontage covalent
Les interactions proteacuteine-proteacuteine peuvent donc ecirctre analyseacutees par pontage covalent
(laquo crosslinking raquo) et spectromeacutetrie de masse L‟avantage majeur de cette approche est qu‟elle
permet d‟obtenir agrave la fois des informations sur la composition et sur la structure des
complexes gracircce agrave la grande sensibiliteacute de la spectromeacutetrie de masse Le laquo crosslinking raquo est
une technique qui permet de relier chimiquement les sous-uniteacutes d‟un complexe non covalent
ce qui permet de stabiliser les interactions au sein de l‟eacutedifice macromoleacuteculaire et d‟en
faciliter l‟eacutetude Ceci est reacutealiseacute par des agents pontants ou laquo crosslinkers raquo qui sont des
composeacutes chimiques posseacutedant un groupe reacuteactif agrave leur extreacutemiteacute capable de reacuteagir avec des
fonctions speacutecifiques des proteacuteines ou d‟autres moleacutecules (eg amines primaires
sulfhydryles hellip) Les agents pontants eacutetablissent des liaisons covalentes entre des acides
amineacutes proches dans la structure tertiaire L‟utilisation de laquo crosslinkers raquo de taille diffeacuterente
permet d‟obtenir des contraintes de distance entre les peptides des partenaires proteacuteiques du
complexe L‟analyse des peptides ponteacutes par spectromeacutetrie de masse permet d‟obtenir des
informations sur la topologie initiale du complexe Il existe maintenant une grande varieacuteteacute
d‟agents pontants multifonctionnels (homo- ou heacuteteacuterofonctionnels) disponibles dans le
commerce (wwwpiercenetcom)
30
Fig I 6 Scheacutema de la reacuteaction de pontage covalent entre deux proteacuteines utilisant le DSG
(DiSuccinimidyl Glutarate) reacuteactif homobifonctionnel Il a deux groupes identiques des
esters de NHS agrave chacune de ses extreacutemiteacutes qui reacuteagissent avec les amines primaires des
proteacuteines (extreacutemiteacute N-terminale et chaicircne lateacuterale des lysines) Son bras espaceur long de 77
Aring est constitueacute de cinq atomes
Les groupes reacuteactifs peuvent ecirctre des esters de NHS (N-HydroxySuccinimide) (Fig I 6)
ou des maleacuteimides qui ciblent les thiols des cysteacuteines ou encore des aryl azides qui s‟insegraverent
dans des liaisons C-H ou N-H sous activation UV Les esters de NHS et leurs deacuteriveacutes solubles
sulfonyleacutes sont les plus couramment utiliseacutes malgreacute les reacuteactions secondaires qu‟ils
entraicircnent compliquant l‟analyse des spectres obtenus apregraves digestion enzymatique du
complexe proteacuteique En effet si les amines primaires des lysines (ou des extreacutemiteacutes N-
terminales) sont les cibles majeures des groupements NHS il n‟est pas rare d‟observer des
reacuteactions de pontage impliquant les groupements hydroxyles des tyrosines des seacuterines ou
encore des threacuteonines (56) De plus les esters de NHS conventionnels ont une forte tendance
agrave s‟hydrolyser pendant l‟eacutetape de pontage conduisant agrave des produits de type laquo dead-end raquo
qu‟il est difficile de seacuteparer des autres (57) Par conseacutequence avec la connaissance de toutes
les cibles possibles des laquo crosslinkers raquo l‟eacutelucidation de la structure des complexes proteacuteiques
pourrait ecirctre significativement ameacutelioreacutee due agrave la plus grande fraction d‟espegraveces ponteacutees
identifieacutees
Bien que l‟association pontage covalent et spectromeacutetrie de masse soit devenue un outil
analytique performant pour l‟eacutetude des complexes proteacuteiques elle preacutesente des limites qui
sont (i) la faible intensiteacute dans les spectres de masse des pics correspondant aux peptides
ponteacutes et (ii) la difficulteacute agrave les identifier parmi les autres due au fait qu‟ils sont tregraves
minoritaires dans les meacutelanges obtenus Dans ce contexte le choix d‟un spectromegravetre de
masse alliant excellente reacutesolution et tregraves bonne preacutecision sur la mesure de masse (FT-ICR
orbitrap) est judicieux Il permet d‟une part de bien seacuteparer les diffeacuterents constituants obtenus
31
apregraves la digestion des complexes et d‟autre part d‟utiliser la masse exacte comme critegravere de
seacutelection Des strateacutegies permettant d‟identifier plus facilement les peptides ponteacutes dans le
meacutelange tregraves complexe obtenu apregraves digestion enzymatique ont eacutegalement eacuteteacute deacuteveloppeacutees
ces derniegraveres anneacutees Elles sont baseacutees sur l‟utilisation d‟agents pontants posseacutedant des
isotopes stables (58) ou inteacutegrant une fonction biotine permettant un enrichissement seacutelectif
des peptides ponteacutes (59) Des agents pontants permettant une identification plus aiseacutee des
peptides ponteacutes en MSMS ont eacutegalement eacuteteacute mis au point ces derniegraveres anneacutees (60-62)
Reacutecemment l‟utilisation de laquo crosslinkers raquo photoactivables a permis de mettre en eacutevidence
des sites d‟interaction diffeacuterents entre trois activateurs de la transcription (Gal4 Gcn4 et
VP16) et le cofacteur MD15 (63) Cette eacutetude montre par ailleurs la compleacutementariteacute des
modes d‟ionisation MALDI et ESI pour retrouver un grand nombre de peptides ponteacutes Dans
un exemple un peu moins reacutecent Rappsilber et al ont proposeacute un modegravele tridimensionnel
pour un complexe du pore nucleacuteaire chez la levure (64)
Approche par marquage
Une deuxiegraveme approche consiste agrave modifier chimiquement la surface du complexe
proteacuteique accessible en solution et agrave identifier les sites de modifications par spectromeacutetrie de
masse Les segments peptidiques impliqueacutes dans des interactions proteacuteine-proteacuteine ne sont
pas accessibles en solution et a priori ne seront pas modifieacutes La comparaison des cartes
d‟accessibiliteacute pour des proteacuteines seules et associeacutees permet de remonter agrave la topologie initiale
du complexe La modification chimique peut ecirctre reacuteversible ou irreacuteversible Les eacutechanges
hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) des amides de la liaison peptidique sont un exemple de
modifications labiles (65-67) La modification chimique des chaicircnes lateacuterales par des reacuteactifs
speacutecifiques tels que l‟aceacutetanhydride le dieacutethylpyrocarbonate ou le phenylglyoxal est quant agrave
elle permanente (67-68) ce qui impose moins de contraintes au niveau de la rapiditeacute de
l‟analyse apregraves modifications La premiegravere strateacutegie qui fait l‟objet de cette thegravese sera deacutecrite
en deacutetails dans la seconde partie de cette introduction
Les radicaux hydroxyles peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutes dans une approche par marquage
covalent Leur formation peut avoir lieu de diffeacuterentes faccedilons ie par chimie Fenton
radiolyse de l‟eau eacutelectrochimie ou photolyse UV du peroxyde d‟hydrogegravene Ces techniques
aboutissent agrave des concentrations en radicaux diffeacuterentes avec des eacutechelles de temps varieacutees
mais en principe les reacuteactions avec les proteacuteines conduisent aux mecircmes produits Les produits
d‟oxydation sont nombreux puisque quatorze acides amineacutes sur vingt peuvent ecirctre modifieacutes
(Cys Met Trp Tyr Phe His Leu Ile Arg Lys Val Ser Gln et Glu) L‟analyse des
32
produits de la reacuteaction et des sites de modification est geacuteneacuteralement reacutealiseacutee par couplage LC-
MSMS apregraves digestion enzymatique La cineacutetique d‟oxydation des diffeacuterents peptides permet
d‟obtenir des informations de structure Elle est eacutetablie agrave partir de la disparition des peptides
non modifieacutes mais eacutegalement agrave partir de l‟apparition des peptides oxydeacutes Si le temps
d‟exposition aux radicaux est court (infeacuterieur agrave quelques centaines de ms) alors la vitesse
d‟oxydation enregistreacutee pour un peptide donneacute deacutependra principalement (i) de la reacuteactiviteacute
intrinsegraveque des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes et (ii) de leur accessibiliteacute au solvant dans
la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (ou du complexe) Ainsi la comparaison des
vitesses d‟oxydation mesureacutees pour deux peptides dont les acides amineacutes modifieacutes sont
identiques permettra d‟obtenir des informations en termes d‟accessibiliteacute relative agrave la surface
de deux reacutegions diffeacuterentes d‟une proteacuteine
L‟avantage majeur des approches par marquage covalent reacuteside dans le fait de pouvoir
analyser les peptides modifieacutes sans prendre de preacutecautions particuliegraveres puisque la
modification n‟est pas labile En revanche la technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium
impose de travailler dans des conditions expeacuterimentales strictes permettant de conserver le
marquage jusqu‟agrave l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Cependant cette derniegravere
approche ne modifie pas la structure tridimensionnelle du complexe ce qui n‟est pas toujours
le cas avec des approches par marquage covalent En effet une alteacuteration de la structure des
macroassemblages peut ecirctre observeacutee sous l‟effet de l‟oxydation par l‟utilisation de radicaux
hydroxyles (69)
L‟approche par marquage peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour obtenir des informations sur la
dynamique structurelle des proteacuteines et complexes proteacuteiques La caracteacuterisation des
modifications dans des conditions expeacuterimentales diffeacuterentes permet de remonter aux
changements structuraux Ainsi Dumoulin et al ont eacutetudieacute le changement conformationnel
du lysozyme induisant la formation d‟agreacutegats multimeacuteriques (70) Un autre exemple est
l‟eacutetude des changements d‟interaction proteacuteine-proteacuteine lors de la maturation des capsides du
virus HIV-1 (71) Des informations sur les changements conformationnels d‟une proteacuteine lors
de la fixation d‟un ligand ont pu eacutegalement ecirctre obtenues (72-74) Par ailleurs une eacutetude
reacutecente du complexe Arp23 formeacute de sept sous-uniteacutes proteacuteiques a permis de mettre en
eacutevidence finement des modifications de structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave
l‟ATP en utilisant les radicaux hydroxyles (75)
33
Approche par proteacuteolyse meacutenageacutee
Une autre approche consiste agrave reacutealiser une proteacuteolyse meacutenageacutee Les premiers travaux
rapportant l‟eacutetude d‟une empreinte proteacuteique par proteacuteolyse meacutenageacutee datent de 1987 et sont
directement inspireacutes des travaux de laquo DNA footprint raquo (76) Le principe ici consiste agrave tester
l‟accessibiliteacute agrave diffeacuterentes proteacuteases des proteacuteines eacutetudieacutees Un profil proteacuteolytique diffeacuterent
peut traduire des surfaces accessibles qui ne sont pas identiques ou un masquage par une
moleacutecule de ligand Associeacutee agrave la spectromeacutetrie de masse la proteacuteolyse meacutenageacutee est ainsi
devenue un outil puissant dont l‟une des applications premiegraveres a eacuteteacute l‟identification preacutecise
d‟eacutepitopes agrave partir de complexes antigegravene-anticorps immobiliseacutes (77) Depuis cette technique
est largement utiliseacutee pour des eacutetudes de dynamique structurelle (78) d‟interaction proteacuteine-
ligand (79-82) de diffeacuterences conformationnelles lieacutees agrave des mutations (83-84) ou pour
l‟eacutelucidation de domaines structuraux (85-87)
Les enzymes classiquement utiliseacutees sont la trypsine qui clive apregraves les acides amineacutes
basiques tels que les reacutesidus lysine et arginine et la proteacutease V8 qui coupe speacutecifiquement
apregraves les reacutesidus acide aspartique et acide glutamique Elles ont eacuteteacute choisies
preacutefeacuterentiellement en raison de la haute freacutequence de ces reacutesidus dans les proteacuteines et de la
compleacutementariteacute des profils proteacuteolytiques obtenus Par ailleurs la proteacuteolyse doit ecirctre la plus
limiteacutee possible afin de ne pas deacutestructurer la proteacuteine conduisant agrave d‟autres sites de coupure
non repreacutesentatifs de la structure tertiaire La reacutesolution de cette meacutethode est cependant
modeste C‟est la raison pour laquelle la proteacuteolyse meacutenageacutee est tregraves souvent coupleacutee avec des
approches par eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium afin d‟obtenir des reacutesultats compleacutementaires
(88-89)
Analyse de complexes non covalents
L‟avegravenement des techniques d‟ionisation douces telles que l‟ESI (laquo ElectroSpray
Ionisation raquo) (90) et le MALDI (laquo Matrix Assisted Laser DesorptionIonisation raquo) (91) a
ouvert agrave la spectromeacutetrie de masse un nouveau champ d‟application celui de l‟analyse de
macromoleacutecules biologiques intactes (92) Pour le deacuteveloppement de ces meacutethodes qui ont
ces derniegraveres anneacutees largement participeacute agrave l‟essor de la spectromeacutetrie de masse dans le cadre
des analyses proteacuteomiques J Fenn et K Tanaka ont eacuteteacute reacutecompenseacutes en 2002 par
l‟attribution du prix Nobel de chimie
34
Par comparaison aux diffeacuterentes techniques utiliseacutees pour la caracteacuterisation des proteacuteines
la spectromeacutetrie de masse apporte plusieurs avantages Tout d‟abord elle est tregraves sensible En
effet quelques picomoles voire mecircme attomoles de peptides suffisent agrave obtenir un signal Par
ailleurs la spectromeacutetrie de masse est caracteacuteriseacutee par sa grande preacutecision en masse Elle est
ainsi capable de deacuteterminer des masses moleacuteculaires agrave moins d‟une partie par million (ppm)
pour les instruments les plus preacutecis alors que la technique de SDS-PAGE (laquo Sodium Dodecyl
Sulfate-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis raquo) donne des erreurs de l‟ordre de 20 Enfin la
spectromeacutetrie de masse est une meacutethode d‟analyse rapide A titre de comparaison un spectre
de masse est enregistreacute en quelques secondes agrave minutes tandis qu‟une expeacuterience de SDS-
PAGE dure plusieurs heures
Dans le cadre de l‟eacutetude des complexes proteacuteiques la spectromeacutetrie de masse est
susceptible de fournir d‟une part des informations preacutecises sur la stœchiomeacutetrie des
macroassemblages et d‟autre part des donneacutees structurales en combinaison avec du
marquage
Une des questions souvent poseacutees aux spectromeacutetristes de masse concerne la possibiliteacute de
reacutealiser une mesure de masse directe d‟un complexe proteacuteique intact dans le but d‟obtenir des
informations sur la stœchiomeacutetrie de l‟interaction Il convient de noter que la mesure de
masse est alors effectueacutee sur le complexe en phase gazeuse alors que pour le biologiste
l‟interaction d‟inteacuterecirct est celle qui a lieu en solution Dans ces conditions une interaction non
covalente preacutesente en solution peut ne pas ecirctre deacutetecteacutee en phase gazeuse C‟est le cas par
exemple des interactions hydrophobes Des eacutetudes ont ainsi montreacute l‟impossibiliteacute de
corroborer les reacutesultats obtenus en phase gazeuse et en solution pour ce type d‟interaction (93-
94) A l‟inverse des interactions principalement eacutelectrostatiques seront renforceacutees en phase
gazeuse et un complexe mecircme peu stable en solution peut ecirctre deacutetecteacute facilement par
spectromeacutetrie de masse Compte tenu de ces eacuteleacutements il nest pas toujours facile de relier des
stabiliteacutes en phase gazeuse eacutetudieacutees par exemple en modifiant la tension agrave l‟interface aux
stabiliteacutes en solution Dans certains cas le problegraveme est encore plus complexe puisque le
type d‟interaction en phase gazeuse peut ecirctre diffeacuterent de celui en solution L‟exemple retenu
est celui des complexes entre des cyclodextrines et des acides amineacutes aromatiques (95) en
solution l‟interaction est principalement de type hydrophobe entre le groupe aromatique et la
caviteacute de la cyclodextrine alors qu‟en phase gazeuse il s‟agit d‟une interaction ion-dipocircle agrave
l‟exteacuterieur de la caviteacute Ceci implique la formation en phase gazeuse de complexes
inexistants en solution donnant ainsi naissance agrave des faux positifs
35
Malgreacute ces contraintes quelques revues reacutecentes de la litteacuterature montrent l‟inteacuterecirct de la
spectromeacutetrie de masse pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers (96-99) Actuellement il est mecircme possible de mesurer des masses
moleacuteculaires de l‟ordre de plusieurs millions de daltons Parmi les plus importantes jamais
atteintes il a celles des heacutemocyanines de 22 MDa de crabes abyssaux (100) du ribosome de
Thermus thermophilus de 233 MDa (98) des assemblages viraux des capsides du virus de
l‟heacutepatite B de 3 et 4 MDa (101) et du complexe multiproteacuteique de l‟ureacutease de Helicobacter
pylori agrave 426 MDa (98)
La technique d‟ionisation de reacutefeacuterence pour analyser les complexes proteacuteiques est
l‟eacutelectrospray (ou sa variante le nano eacutelectrospray) Dans des cas particuliers il est mecircme
possible de les eacutetudier par MALDI (102) bien que cette meacutethode ne soit probablement pas
geacuteneacuteralisable agrave tous les systegravemes Quelques techniques eacutemergentes pour l‟analyse
d‟assemblages macromoleacuteculaires ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees reacutecemment ou sont en cours de
deacuteveloppement comme la mobiliteacute ionique (SMI) (103) l‟laquo ElectroSonic Spray Ionization raquo
(ESSI) (104) ou le laquo Laser-Induced Liquid Beam IonizationDesorption raquo (LILBID) (105) Le
processus d‟ionisation doit ecirctre reacutealiseacute en conditions non deacutenaturantes (pH controcircleacute) pour
conserver les complexes proteacuteiques dans leur conformation active Il faut donc choisir un
tampon (nature des sels) qui soit compatible agrave la fois avec la meacutethode d‟ionisation employeacutee
et le maintien de l‟inteacutegriteacute des complexes biologiques Dans le cas de l‟eacutelectrospray des sels
volatils comme l‟aceacutetate d‟ammonium (AcNH4) sont preacutefeacuterentiellement utiliseacutes Neacuteanmoins
lors de la preacuteparation des eacutechantillons une eacutetape de dessalage (par centrifugation gel
filtration hellip) est indispensable En ce qui concerne l‟analyseur du spectromegravetre de masse le
choix est porteacute sur les temps de vol (laquo Time of Flight raquo ToF et laquo Quadrupole Time of
Flight raquo Q-ToF) qui permettent d‟analyser des ions avec des rapports masse sur charge
eacuteleveacutes proprieacuteteacute inteacuteressante pour la deacutetermination des masses moleacuteculaires de complexes
proteacuteiques entiers Une optimisation des paramegravetres instrumentaux est preacutealablement requise
pour controcircler l‟eacutenergie communiqueacutee aux ions dans l‟interface du spectromegravetre de masse
Pour les complexes proteacuteiques qui restent intacts apregraves leur ionisation en phase gazeuse la
spectromeacutetrie de masse est ainsi devenue un outil tregraves puissant pour obtenir des informations
sur leur masse moleacuteculaire et donc pour deacuteterminer leur stœchiomeacutetrie
36
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment la spectromeacutetrie de masse est souvent combineacutee agrave une
autre technique pour obtenir des informations de structure On peut dans ce contexte citer les
derniers deacuteveloppements dans le domaine de la mobiliteacute ionique qui permet de seacuteparer
diffeacuterents complexes proteacuteiques en fonction de leur structure en phase gazeuse Le principe de
la Spectromeacutetrie de Mobiliteacute Ionique (SMI) est illustreacute dans la Fig I 7 L‟utilisation en
routine de la SMI a eacuteteacute rendue possible par la commercialisation par Waters de spectromegravetres
de masse eacutequipeacutes d‟une cellule de mobiliteacute ionique
Fig I 7 Scheacutema du principe de la meacutethode de spectromeacutetrie de mobiliteacute ionique (SMI)
coupleacutee agrave la spectromeacutetrie de masse (SM) Les ions produits par la source eacutelectrospray (ES)
sont introduits dans la cellule de laquo drift raquo dans laquelle regravegne un champ eacutelectrique E Le
frottement avec les moleacutecules d‟heacutelium contenues dans la cellule eacutetant plus important avec
des ions de conformation deacuteplieacutee ceux-ci arriveront plus tard au deacutetecteur Ici les ions sont
seacutelectionneacutes en masse par un quadripocircle apregraves la cellule de drift
La mobiliteacute ionique est l‟eacutequivalent en phase gazeuse de la mobiliteacute eacutelectrophoreacutetique les
ions sont agrave la fois acceacuteleacutereacutes dans le champ eacutelectrique et freineacutes par les nombreuses collisions
avec le gaz-tampon (heacutelium) Il s‟eacutetablit donc un reacutegime stationnaire les ions atteignent une
vitesse de translation constante La mobiliteacute ionique correspond au rapport entre la vitesse de
laquo drift raquo et le champ eacutelectrique appliqueacute Plus l‟ion a une conformation compacte moins sa
section efficace est grande et moins il est freineacute par des collisions donc plus sa vitesse est
eacuteleveacutee Il arrivera plus rapidement au deacutetecteur par rapport agrave un ion de conformation plus
deacuteployeacutee Un ion laquo funnel raquo ou un piegravege agrave ions quadripolaire est placeacute en amont de la cellule
de laquo drift raquo afin de focaliser les ions en paquets agrave envoyer agrave un temps zeacutero et ainsi pour
pouvoir mesurer la distribution des temps d‟arriveacutee (laquo Arrival Time Distribution raquo ou ATD)
Les premiers instruments de SMI ont eacuteteacute conccedilus par quelques groupes pionniers en la
matiegravere (Bowers (106-107) Jarrold (108) et Clemmerb (109) pour les biomoleacutecules) La
socieacuteteacute Waters (Milford Etats-Unis wwwwaterscom) a reacutecemment commercialiseacute le
systegraveme Synapttrade High Definition MS qui inclut une cellule de mobiliteacute de type laquo travelling
37
wave raquo (champ eacutelectrique oscillant entre les anneaux successifs d‟un tunnel agrave ions) entre un
filtre quadripolaire et un analyseur agrave temps de vol
L‟analyse des complexes proteacuteiques par SMIMS permet non seulement d‟obtenir des
informations sur leur taille mais eacutegalement des donneacutees de topologie (110) L‟agencement des
proteacuteines au sein des complexes peut ecirctre sondeacute suivant deux approches diffeacuterentes La
premiegravere consiste agrave dissocier le complexe en phase gazeuse les proteacuteines se trouvant agrave la
peacuteripheacuterie se deacutetachent theacuteoriquement en premier Neacuteanmoins il est difficile de fragmenter en
phase gazeuse des complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire Par ailleurs l‟activation
neacutecessaire agrave la dissociation conduit agrave une augmentation des sections efficaces de collision et
donc agrave une perturbation partielle de la conformation native des proteacuteines du complexe Il est
alors possible que les proteacuteines qui se seacuteparent du complexe en premier ne soient pas celles
qui ont initialement les surfaces d‟interaction les plus petites avec les autres partenaires
proteacuteiques (111) Neacuteanmoins l‟utilisation reacutecente de la dissociation sur surface par le groupe
de V Wysocki pour dissocier ces complexes en maintenant les structures des sous-uniteacutes
semble ouvrir des perspectives nouvelles et prometteuses dans le domaine (112) L‟autre
approche consiste agrave deacutenaturer progressivement le complexe en solution et agrave analyser les
diffeacuterents sous-complexes par SMI pour reconstruire la topologie initiale L‟avantage majeur
de cette approche est que les sous-complexes sont formeacutes en solution et reflegravetent donc de
maniegravere plus fidegravele la composition du complexe dans son eacutetat natif Le laboratoire de Carol
Robinson en Angleterre est devenu ces derniegraveres anneacutees leader pour l‟analyse structurale par
SMI de ces complexes proteacuteiques de tregraves grande taille (113)
I13 Meacutethodes drsquoanalyse biochimique
Ces meacutethodes permettent de travailler sur l‟objet biologique lui-mecircme Parmi elles le
TAP-Tag (laquo Tandem Affinity Purification-Tag raquo) et le double hybride occupent une place de
choix pour l‟eacutetude des interactions proteacuteine-proteacuteine Il s‟agit de deux techniques in-situ
La meacutethode du TAP-Tag permet d‟isoler le complexe proteacuteique eacutetudieacute qui est dans sa
conformation native par deux eacutetapes de purification successives (Fig I 8) La premiegravere
utilise une colonne constitueacutee de billes greffeacutees avec des immunoglobulines G (IgG) qui ont
une forte affiniteacute pour la proteacuteine A proteacuteine recombinante dite appacirct agrave laquelle est fixeacute le
complexe proteacuteique Le complexe retenu sur cette colonne est ensuite eacutelueacute speacutecifiquement par
38
coupure avec la proteacutease TEV Puis il est appliqueacute sur la seconde colonne constitueacutee de billes
de calmoduline En preacutesence d‟ions calcium la calmoduline est sous sa forme active
favorisant l‟attachement du complexe L‟eacutelution est reacutealiseacutee par l‟ajout d‟un cheacutelateur de
calcium (EGTA) qui rend la calmoduline inactive et donc libegravere le complexe Finalement ce
dernier pourra ecirctre analyseacute par spectromeacutetrie de masse afin de deacuteterminer ses diffeacuterents
constituants ou bien ecirctre utiliseacute pour des eacutetudes fonctionnelles
Fig I 8 Scheacutema du principe de la technique du TAP-Tag
Cette meacutethode a eacuteteacute appliqueacutee agrave l‟analyse agrave haut deacutebit du proteacuteome de la levure
Saccharomyces cerevisiae (114-116) Son utilisation chez les eucaryotes supeacuterieurs reste plus
complexe mais tout de mecircme envisageable (117) Des ameacuteliorations de l‟approche TAP-
TagMS ont eacuteteacute apporteacutees pour la possibiliteacute d‟utiliser cette meacutethode agrave haut deacutebit chez les
eucaryotes supeacuterieurs (118)
La technique du double hybride permet quant agrave elle de mettre en eacutevidence une interaction
physique entre deux proteacuteines X et Y Le principe est le suivant par geacutenie geacuteneacutetique deux
proteacuteines de fusion sont syntheacutetiseacutees puis exprimeacutees dans la levure La premiegravere est constitueacutee
de la proteacuteine X agrave laquelle est fusionneacute le domaine de liaison agrave l‟ADN (DL) d‟un facteur de
transcription tandis que la seconde est formeacutee de la proteacuteine Y et du domaine d‟activation de
39
la transcription (DA) de ce mecircme facteur Les deux domaines ont eacuteteacute dissocieacutes et le gegravene
rapporteur de la β-galactosidase est sous le controcircle de la seacutequence ougrave vient se fixer
speacutecifiquement le DL La β-galactosidase est une enzyme qui transforme un substrat soluble
et incolore en un composeacute bleu insoluble Lorsque la proteacuteine Y interagit avec la proteacuteine X
le DA est de nouveau associeacute au DL permettant alors la transcription du gegravene rapporteur Les
clones capables d‟utiliser le galactose preacutesent dans le milieu peuvent donc ecirctre seacutelectionneacutes
(colonies bleues) En effet le changement de couleur teacutemoigne de l‟interaction entre les deux
proteacuteines
Ce systegraveme a eacuteteacute agrave l‟origine mis au point pour tester l‟interaction pouvant exister entre
deux proteacuteines connues (119) De nouvelles variantes de la meacutethode double hybride ont fait
leur apparition reacutecemment permettant la deacutetection des proteacuteines impliqueacutees dans des
interactions avec l‟ADN (laquo one-hybrid system raquo) l‟ARN (laquo RNA-based three-hybrid
system raquo) de petits ligands (laquo small molecule-based threehybrid system raquo) et des proteacuteines
ayant subi des modifications post-traductionnelles (laquo tribrid system raquo) (120)
Il existe eacutegalement des techniques de seacuteparation des complexes proteacuteiques en conditions
non deacutenaturantes pour conserver intactes les interactions Ainsi l‟eacutelectrophoregravese sur gel de
polyacrylamide en condition bleue native ou BN-PAGE (laquo Blue Native-PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis raquo) permet d‟isoler les macro-assemblages dans leur conformation native en
fonction de leur taille et de leur forme En combinaison avec une seconde dimension de
seacuteparation sur gel cette fois-ci en conditions deacutenaturantes les proteacuteines d‟un mecircme complexe
peuvent agrave leur tour ecirctre isoleacutees puis identifieacutees par spectromeacutetrie de masse Il est donc
possible par cette technique de mettre en eacutevidence le nombre et la masse moleacuteculaire des
proteacuteines impliqueacutees dans le complexe
Cette technique peut ecirctre utiliseacutee pour l‟isolation de complexes proteacuteiques membranaires
ou pour les complexes proteacuteiques extraits de cellules entiegraveres Un grand nombre
d‟applications pour cette technique concerne l‟analyse de complexes proteacuteiques issus de
plantes (121)
40
I2 Meacutethode associant les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium agrave la
spectromeacutetrie de masse pour lrsquoeacutetude de la dynamique
structurelle des proteacuteines en solution
La technique des eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium (HDX) en solution s‟est reacuteveacuteleacutee tregraves
performante pour l‟eacutetude de la conformation et de la dynamique structurelle des proteacuteines La
spectroscopie RMN agrave deux dimensions a longtemps eacuteteacute choisie comme meacutethode d‟analyse de
ces eacutechanges isotopiques (32 122-123) L‟utilisation de la spectromeacutetrie de masse comme
meacutethode alternative d‟analyse apregraves eacutechanges HD s‟est deacuteveloppeacutee ces derniegraveres anneacutees La
spectromeacutetrie de masse qui permet de s‟inteacuteresser agrave des complexes proteacuteiques de tregraves haut
poids moleacuteculaire ouvre ainsi de nouvelles opportuniteacutes pour l‟eacutetude de systegravemes proteacuteiques
plus importants (gtgt 50 kDa) Par ailleurs en raison de sa meilleure sensibiliteacute cette technique
requiert une quantiteacute initiale de mateacuteriel beaucoup moins importante (de l‟ordre de quelques
dizaines de nganalyse) Elle permet eacutegalement de deacutetecter la coexistence de diffeacuterents
conformegraveres proteacuteiques en solution (124)
Les premiers travaux combinant les eacutechanges HD et la spectromeacutetrie de masse datent de
1991 Ils portent alors sur l‟analyse de proteacuteines entiegraveres (125) Depuis les avantages de la
spectromeacutetrie de masse ont permis aux eacutechanges isotopiques HD d‟eacutetudier des proteacuteines
individuelles de poids moleacuteculaires plus importants (126) des proteacuteines s‟associant pour
former des polymegraveres de haut poids moleacuteculaire (127) des particules virales (71 128) ainsi
que des complexes proteacuteine-ligand (129) ou proteacuteine-proteacuteine (130) De plus l‟association
HDXMS semble prometteuse pour l‟analyse structurale de proteacuteines membranaires connues
pour ecirctre difficilement eacutetudiables par beaucoup d‟autres techniques (131-133)
I21 Principe des eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium appliqueacutes aux
proteacuteines en solution
I211 Quel type drsquohydrogegravene va-t-on sonder dans nos expeacuteriences HDX
Les hydrogegravenes lieacutes agrave des heacuteteacuteroatomes dans les moleacutecules biologiques telles que les
proteacuteines sont labiles Autrement dit les atomes d‟hydrogegravene appartenant aux groupements
O-H N-H et S-H peuvent s‟eacutechanger avec ceux des moleacutecules d‟eau environnantes Il s‟agit
des hydrogegravenes des proteacuteines qui sont repreacutesenteacutes en bleu et en rouge sur la Fig I 9
41
Fig I 9 Scheacutema des diffeacuterents types d‟hydrogegravene dans une proteacuteine
Si un atome d‟hydrogegravene est eacutechangeacute avec un autre atome d‟hydrogegravene alors il est eacutevident
que ce remplacement ne sera pas deacutetecteacute par spectromeacutetrie de masse En revanche
l‟exposition d‟une proteacuteine agrave de l‟eau lourde (D2O ou 2H2O) conduit agrave des remplacements
d‟hydrogegravenes (1H) par des deuteacuteriums (
2H) qui accroissent la masse totale de la proteacuteine de 1
Da par hydrogegravene eacutechangeacute Lorsque les eacutechanges isotopiques se reacutealisent dans le sens deacutecrit
preacuteceacutedemment ie 1H
2H alors on utilise l‟expression laquo exchange-in raquo Mais les eacutechanges
isotopiques peuvent ecirctre reacutealiseacutes dans les deux directions On emploie alors le terme de
laquo exchange-out raquo pour eacutevoquer les eacutechanges qui s‟opegraverent dans le sens 2H
1H quand une
proteacuteine complegravetement deuteacutereacutee est incubeacutee dans de l‟eau leacutegegravere et que des deuteacuteriums sont
alors remplaceacutes par des hydrogegravenes (134) Les eacutetudes d‟eacutechange HD sont principalement
reacutealiseacutees suivant le principe laquo exchange-in raquo En effet ce dernier ne neacutecessite pas d‟eacutetape
suppleacutementaire qui consisterait agrave deuteacuterer complegravetement les proteacuteines avant le deacutebut des
expeacuteriences HDXMS C‟est la strateacutegie que nous avons adopteacutee pour notre eacutetude structurale
de complexes proteacuteiques
Si on considegravere maintenant les hydrogegravenes qui sont lieacutes de maniegravere covalente agrave un atome
de carbone dans les proteacuteines dessineacutes en vert sur la Fig I 9 ces derniers ne subiront pas
d‟eacutechange isotopique dans nos conditions expeacuterimentales Seule une catalyse chimique
importante serait agrave envisager pour proceacuteder agrave l‟eacutechange isotopique de ces hydrogegravenes Mais il
semblerait qu‟il soit possible d‟eacutechanger l‟hydrogegravene de la liaison C(ε1)-H du groupement
imidazole de la chaicircne lateacuterale de lhistidine (Fig I 10) (135)
42
Fig I 10 Scheacutema de l‟acide amineacute histidine
Parmi les hydrogegravenes eacutechangeables des proteacuteines il y a
- ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes (en bleu sur la Fig I 9) et des extreacutemiteacutes N-
et C-terminales (groupements amino et carboxy) qui ont des vitesses d‟eacutechange isotopique
tregraves rapides de l‟ordre de la milliseconde agrave la seconde Dans l‟eacutechelle de temps de nos
expeacuterimentations ces vitesses d‟eacutechange sont trop rapides pour que nous puissions les
observer
- les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques (en rouge sur la Fig I 9) qui ont des
vitesses d‟eacutechange isotopique plus lentes de l‟ordre de la minute agrave l‟heure et donc qui sont
compatibles avec une deacutetection par spectromeacutetrie de masse Au cours de nos expeacuteriences
HDXMS nous allons par conseacutequent nous inteacuteresser aux eacutechanges isotopiques de ces
hydrogegravenes
Dans une proteacuteine tous les acides amineacutes agrave l‟exception de la proline et du premier reacutesidu
de la chaicircne polypeptidique possegravedent un groupement amide N-H de liaison Il est par
conseacutequent possible d‟obtenir des informations structurales tout le long de la chaicircne
polypeptidique
I212 Des eacutechanges isotopiques deacutependant de la structure et de lrsquoaccessibiliteacute
des proteacuteines
La vitesse des eacutechanges isotopiques HD deacutepend de l‟accessibiliteacute au solvant mais
eacutegalement de la stabiliteacute de la structure locale des proteacuteines Autrement dit les hydrogegravenes
d‟amide situeacutes dans les reacutegions flexibles ou non structureacutees de la proteacuteine tels que les boucles
et les coudes ou dans les reacutegions accessibles au solvant ont des vitesses d‟eacutechange plus
rapides identiques agrave celles observeacutees dans le cas d‟un peptide non structureacute Au contraire
43
ceux qui sont impliqueacutes dans des structures secondaires stables comme les heacutelices α et les
feuillets β ainsi que ceux enfouis dans le cœur hydrophobe des proteacuteines s‟eacutechangent plus
lentement car ils sont proteacutegeacutes (136)
I213 Meacutecanismes de la reacuteaction drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans les
proteacuteines et peptides
I2131 Deacutefinition du facteur chimique
Il vient d‟ecirctre dit que l‟eacutechange isotopique est plus rapide quand l‟hydrogegravene d‟amide de la
liaison peptidique est complegravetement exposeacute au solvant et non impliqueacute dans des liaisons
hydrogegravene intramoleacuteculaires stables Dans ces conditions la constante de vitesse du
remplacement de N-H par N-D (laquo exchange-in raquo) est noteacutee kch Il s‟agit du facteur chimique
I2132 Facteurs influenccedilant le facteur chimique
Pour chaque hydrogegravene d‟amide du squelette polypeptidique consideacutereacute individuellement la
valeur de kch est deacutetermineacutee selon une seacuterie de facteurs le pH la tempeacuterature et la
composition du solvant la pression la force ionique du milieu et la seacutequence locale en acides
amineacutes Nous deacutetaillerons uniquement l‟influence des trois facteurs les plus repreacutesentatifs
soit le pH (ou pD en solution deuteacutereacutee) la tempeacuterature et la seacutequence locale
Les eacutechanges isotopiques HD sont fortement deacutependants du pH ce qui est un point
extrecircmement important qui est utiliseacute pour leur analyse par spectromeacutetrie de masse La
reacuteaction peut s‟effectuer par des meacutecanismes de catalyse acide ou basique (II133) Le
facteur chimique kch s‟exprime comme suit
kch = kD3O+ [D3O+] + kOD
- [OD-] + kD2O
ougrave kD3O+ et kOD- sont les constantes d‟eacutechange en catalyse acide et en catalyse basique
respectivement
Des eacutetudes sur des peptides modegraveles des polyalanines ont montreacute que kOH- est supeacuterieure
d‟un facteur 108 agrave kH3O+ (137) Le pH influence donc les vitesses d‟eacutechange qui sont
44
principalement conditionneacutees par les ions OH- pour des pH supeacuterieurs agrave 3 et par les ions H3O
+
pour des pH infeacuterieurs agrave 3
Ainsi la constante de vitesse d‟eacutechange kch peut ecirctre relieacutee au pD (Fig I 11) Le minimum
d‟eacutechange se produit pour un pD voisin de 2-3 pour lequel les eacutechanges dus agrave la catalyse
acide sont eacutequivalents agrave ceux dus agrave la catalyse basique (pDmin)
pH
T(degC)
Fig I 11 Scheacutema repreacutesentant le taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium en fonction du pH
La plupart des hydrogegravenes eacutechangeables des chaicircnes lateacuterales ont des pHmin plus grands
que ceux des hydrogegravenes d‟amide Ainsi lorsque le pH est ajusteacute agrave 25 pour minimiser
l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse les hydrogegravenes
des chaicircnes lateacuterales continuent de s‟eacutechanger par catalyse acide agrave l‟exception des Hε et Hη de
l‟arginine
Les vitesses d‟eacutechange HD sont eacutegalement deacutependantes de la tempeacuterature Elles sont
multiplieacutees par trois pour chaque increacutement de 10degC (138) Ainsi lorsque l‟on veut minimiser
les eacutechanges une diminution de la tempeacuterature de 20degC agrave 0degC conduit agrave une diminution de la
vitesse d‟eacutechange d‟un facteur 10 ce qui n‟est pas neacutegligeable
Le facteur chimique kch est principalement affecteacute par des changements de tempeacuterature En
effet la constante d‟ionisation de l‟eau varie avec la tempeacuterature alteacuterant les concentrations
de catalyseurs disponibles pour l‟eacutechange Par ailleurs agrave basse tempeacuterature les coefficients de
diffusion sont eacutegalement modifieacutes et la probabiliteacute de collision entre le donneur de proton et
45
le receveur diminue conduisant agrave un nombre de transfert (et donc un taux d‟eacutechange) moins
grand Le facteur chimique kch s‟exprime donc plutocirct comme suit
kch (t) = kD3O+ (t) [D3O+] + kOD
- (t) [OD-] + kD2O (t)
Les expeacuteriences d‟eacutechange HD s‟effectuent agrave pD physiologique pendant des temps
d‟incubation dans D2O variables et agrave une tempeacuterature adapteacutee agrave la proteacuteine d‟inteacuterecirct Pour ne
garder que les deuteacuteriums eacutechangeacutes avec les hydrogegravenes d‟amide des liaisons peptidiques et
donc pour s‟affranchir de ceux des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes la proteacuteine est remise
dans de l‟eau leacutegegravere (H2O) avant analyse Les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales sont alors
rapidement reacute-eacutechangeacutes en hydrogegravenes Mais cette eacutetape doit ecirctre controcircleacutee afin de ne pas reacute-
eacutechanger eacutegalement les deuteacuteriums d‟amide en hydrogegravenes Ainsi pour diminuer au
maximum les vitesses d‟eacutechange la reacuteaction d‟eacutechange est arrecircteacutee en ajoutant de l‟eau (H2O)
agrave pH acide (25) et en diminuant brusquement la tempeacuterature de l‟eacutechantillon (0degC) C‟est
cette approche de deacutemarquage dans H2O des chaicircnes lateacuterales avant analyse que nous avons
choisie pour ma thegravese D‟autres approches peuvent neacuteanmoins ecirctre envisageacutees comme le
marquage de la proteacuteine suivie de l‟analyse de tous les deuteacuteriums (139) Dans ce dernier cas
il ny a pas d‟eacutetape de deacutemarquage
Enfin les vitesses d‟eacutechanges des hydrogegravenes d‟amide dans une proteacuteine ou dans un
peptide sont sensibles aux effets de blocage steacuterique ou inductif lieacutes agrave la preacutesence proche de
certaines chaicircnes lateacuterales (138 140) Les effets inductifs sont dus principalement agrave la
preacutesence de groupements voisins attracteurs d‟eacutelectrons (chaicircnes lateacuterales polaires) qui vont
augmenter l‟aciditeacute des protons d‟amide en diminuant le pK favorisant la deacuteprotonation
Dans le cas d‟une catalyse basique la vitesse d‟eacutechange est donc augmenteacutee Les effets
d‟encombrement steacuterique sont quant agrave eux lieacutes agrave la preacutesence de reacutesidus aliphatiques
(isoleucine par exemple) ou aromatiques Les chaicircnes lateacuterales de ces amides amineacutes bloquent
steacuteriquement l‟interaction entre le catalyseur et le squelette polypeptidique ralentissant
l‟eacutechange
L‟additiviteacute de ces deux pheacutenomegravenes a eacuteteacute eacutetudieacutee en deacutetails et a permis d‟eacutetablir une
eacutequation pour kch tenant compte de facteurs correctifs associeacutes agrave la nature des chaicircnes lateacuterales
des acides amineacutes voisins (agrave droite et agrave gauche du reacutesidu d‟inteacuterecirct) pour une catalyse acide A
ou basique B
46
kch (t) = kD3O+ (t) (Agauche x Adroite) [D3O+] + kOD
- (t) (Bgauche x Bdroite) [OD-]
+ kD2O (t) (Bgauche x Bdroite)
I2133 Catalyse de la reacuteaction
Les eacutechanges peuvent se produire soit par catalyse basique soit par catalyse acide (Fig I
12) Dans les conditions physiologiques dans lesquelles les proteacuteines et les peptides se
trouvent geacuteneacuteralement la catalyse basique est la plus freacutequente
Fig I 12 Catalyse basique ou acide permettant lrsquoeacutechange isotopique drsquoun hydrogegravene drsquoamide
sur le squelette polypeptidique
La premiegravere eacutetape en catalyse basique est l‟abstraction d‟un proton amidique par un ion
hydroxyde (OD-) et formation d‟un anion imidate Cet imidate est ensuite reprotoneacute par D2O
pour proceacuteder agrave l‟eacutechange Nous venons de voir preacuteceacutedemment que le facteur chimique kch est
minimal pour un pDasymp25 Au-delagrave d‟un pD eacutegal agrave 4 il augmente d‟un ordre de grandeur
(facteur 10) avec chaque uniteacute de pD atteignant des valeurs de l‟ordre de 103 s
-1 pour un pD
de 9 (141) (Fig I 11) La possibiliteacute de reacutegler kch en controcirclant la basiciteacute du solvant est
cruciale dans beaucoup de strateacutegies HDXMS
I2134 Cineacutetique drsquoeacutechange au niveau de la proteacuteine et deacutefinition du facteur de
protection
Comme la vitesse d‟eacutechange N-H N-D est moduleacutee par les proprieacuteteacutes
conformationnelles des proteacuteines il devient alors possible d‟utiliser la technique des eacutechanges
isotopiques HD pour les eacutetudes structurales Les reacutegions structureacutees possegravedent une multitude
de liaisons hydrogegravenes intramoleacuteculaires N-Hhellip
O=C qui sont autant de sites proteacutegeacutes
difficilement accessibles par les moleacutecules de solvant Les vitesses d‟eacutechange isotopique vont
47
donc varier consideacuterablement selon l‟implication de l‟hydrogegravene concerneacute dans des structures
secondaires stables (142) ou la flexibiliteacute de la reacutegion peptidique agrave laquelle il appartient (141)
ou encore suivant sa distance par rapport agrave la surface de la proteacuteine (143) Ces diffeacuterents
facteurs contribuent agrave la protection des hydrogegravenes d‟amide telle que la constante de vitesse
globale d‟eacutechange kHDX soit bien infeacuterieure agrave kch Le facteur de protection P correspondant est
donneacute par la formule qui suit
P= kchkHDX
ougrave kHDX est la constante de vitesse globale d‟eacutechange d‟un hydrogegravene d‟amide donneacute dans la
conformation native d‟une proteacuteine et kch la constante de vitesse d‟eacutechange de l‟hydrogegravene
concerneacute si celui-ci se trouvait dans un peptide non structureacute P est la probabiliteacute que
l‟hydrogegravene en question soit proteacutegeacute agrave l‟accegraves du solvant (et aux catalyseurs) P est alors
deacutependant de l‟accessibiliteacute au solvant et de la participation de l‟hydrogegravene concerneacute agrave des
liaisons hydrogegravene Le facteur de protection peut exceacuteder parfois la valeur de 106 pour une
proteacuteine dans sa conformation native replieacutee
I2135 Deux modegraveles de cineacutetique drsquoeacutechange en fonction de la vitesse de deacutepliement et
repliement des proteacuteines
Neacuteanmoins mecircme un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute peut ecirctre eacutechangeacute En effet une proteacuteine
en solution est une moleacutecule dynamique Autrement dit mecircme dans son eacutetat natif replieacute elle
peut subir des fluctuations conformationnelles reacutesultant de son deacutepliement pendant un temps
tregraves court L‟eacutechange isotopique d‟un hydrogegravene d‟amide proteacutegeacute ne peut donc avoir lieu que
lorsque la proteacuteine adopte des d‟eacutetats intermeacutediaires transitoires deacuteplieacutes Ce deacutepliement peut
ecirctre localiseacute ou impliquer la proteacuteine dans sa globaliteacute Les constantes de vitesse du
deacutepliement et du repliement sont deacutesigneacutees par k1 et k-1 respectivement et le meacutecanisme
geacuteneacuteral de l‟eacutechange peut ecirctre deacutecrit comme suit
avec l‟existence d‟une combinaison unique de valeurs de k1 k-1 et pour chaque hydrogegravene
d‟amide En accord avec ce modegravele l‟eacutechange isotopique ne peut avoir lieu qu‟apregraves une
rupture transitoire des liaisons intramoleacuteculaires de la proteacuteine replieacutee rendant les hydrogegravenes
48
d‟amide eacutechangeables Puis la proteacuteine se replie pour revenir agrave un eacutetat natif La constante de
vitesse globale d‟eacutechange kHDX est donneacutee par la formule suivante
Deux modegraveles de cineacutetique EX1 et EX2 (123 144) sont discuteacutes agrave partir de ce meacutecanisme
d‟eacutechange Le premier modegravele (EX1) (Fig I 13) est caracteacuteriseacute par
kch gtgt k-1gt k1
impliquant que tous les hydrogegravenes d‟amide sont eacutechangeacutes avant le repliement de la proteacuteine
au cours du tout premier eacuteveacutenement de deacutepliement L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc
le deacutepliement de la proteacuteine ce qui se traduit par
kHDX= k1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 13 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX1
Inversement le second modegravele (EX2) (Fig I 14) est caracteacuteriseacute par
k-1 gtgt kchgtgt k1
menant agrave l‟expression
kHDX= K1kch
ougrave K1=k1k-1 est le constante d‟eacutequilibre de deacutepliement de la proteacuteine native Comme la
proteacuteine se replie plus vite qu‟elle n‟eacutechange la probabiliteacute d‟eacutechange pendant un seul
49
eacuteveacutenement deacutepliementrepliement est faible L‟eacutetape cineacutetiquement limitante est donc la
vitesse d‟eacutechange kch et l‟eacutechange d‟un hydrogegravene a geacuteneacuteralement lieu apregraves un grand nombre
d‟eacutetapes de deacutepliementrepliement Dans ce modegravele le facteur de protection est donneacute par
P= K1-1
N - Hreplieacute N - Hdeacuteplieacute N - Ddeacuteplieacute N - Dreplieacute
kch
Fig I 14 Principe de lrsquoeacutechange HD dans le cas drsquoune cineacutetique EX2
Dans des conditions physiologiques le premier modegravele (EX1) est moins freacutequent que le
second (EX2) Les vitesses d‟eacutechange par le meacutecanisme EX2 deacutependent de maniegravere lineacuteaire
de la concentration en catalyseurs alors que dans le meacutecanisme EX1 la vitesse ne varie pas
avec la quantiteacute de catalyseurs Ce dernier est geacuteneacuteralement forceacute par l‟utilisation de
conditions deacutenaturantes telles que des tempeacuteratures ou un pH eacuteleveacutes ou encore par
l‟utilisation de chaotropes On peut neacuteanmoins rencontrer le cas de proteacuteines pour lesquelles
diffeacuterentes reacutegions s‟eacutechangent simultaneacutement avec des cineacutetiques d‟ordre 1 (modegravele EX1) et
2 (modegravele EX2) Par ailleurs il ne faut pas perdre de vue que mecircme une proteacuteine native peut
preacutesenter des hydrogegravenes d‟amide non proteacutegeacutes de faccedilon permanente ie exposeacutes au solvant
et non impliqueacutes dans des liaisons hydrogegravene L‟eacutechange agrave ces sites est reacutealiseacute sans
deacutepliement de la proteacuteine la vitesse y est alors plus rapide (kHDXasympkch)
I22 Techniques drsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines
Pour mesurer un taux d‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium dans une proteacuteine en condition
laquo exchange-in raquo la premiegravere eacutetape consiste agrave l‟exposer agrave du deuteacuterium Il existe deux grandes
strateacutegies d‟incorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines L‟exposition aux deuteacuteriums
peut ecirctre reacutealiseacutee de maniegravere continue (marquage continu) ou pulseacutee (marquage pulseacute) La
meacutethode sera choisie en fonction du type d‟information que l‟on souhaite obtenir (145)
50
I221 Marquage continu
Il s‟agit de la meacutethode la plus simple utiliseacutee dans la plupart des eacutetudes HDXMS Elle
consiste agrave diluer d‟un facteur quinze agrave vingt une proteacuteine qui se trouve initialement dans son
tampon hydrogeacuteneacute dans un tampon identique mais contenant 100 de D2O (146)
L‟incorporation des deuteacuteriums est alors suivie en fonction du temps d‟exposition de la
proteacuteine en condition native dans le D2O Une dilution d‟au moins un facteur quinze permet
de s‟assurer qu‟une fois qu‟un hydrogegravene est remplaceacute par un deuteacuterium la reacuteaction ne
revient pas en arriegravere
Le marquage continu est alors poursuivi jusqu‟agrave ce que le temps maximum d‟exposition
aux deuteacuteriums choisi initialement soit atteint Typiquement il varie des minutes aux heures
(parfois mecircme aux jours) En pratique des aliquotes de la solution sont preacuteleveacutes
reacuteguliegraverement leur reacuteaction est brusquement arrecircteacutee et l‟analyse se fait par spectromeacutetrie de
masse
Au cours de l‟eacutechange la masse de la proteacuteine augmente progressivement avec
l‟incorporation en deuteacuteriums selon les paramegravetres de cineacutetique deacutecrits preacuteceacutedemment Les
reacutegions preacutesentant une conformation deacuteplieacutee pendant un temps tregraves long subiront des
eacutechanges plus rapides que d‟autres reacutegions ayant une conformation plus compacte D‟apregraves le
meacutecanisme geacuteneacuteral de l‟eacutechange le marquage continu permet d‟obtenir essentiellement des
informations sur la dynamique conformationnelle des proteacuteines dans des conditions
d‟eacutequilibre plutocirct que sur leur structure agrave proprement parler Cependant il existe un lien
eacutevident entre ces deux aspects En effet des reacutegions hautement structureacutees sont geacuteneacuteralement
moins dynamiques que des reacutegions deacutesordonneacutees
I222 Marquage pulseacute
Le marquage pulseacute est quant agrave lui essentiellement utiliseacute pour eacutetudier les meacutecanismes de
repliement des proteacuteines ainsi que pour deacutetecter et caracteacuteriser des eacutetats intermeacutediaires
transitoires (147)
Dans les expeacuteriences de marquage pulseacute une proteacuteine initialement deacutenatureacutee est
rapidement transfeacutereacutee dans un solvant approprieacute permettant le deacuteclenchement du processus de
51
repliement A des temps bien deacutefinis au cours de la reacuteaction la proteacuteine est ensuite exposeacutee agrave
du deuteacuterium pendant un temps tregraves court (typiquement 10 s ou moins) Comme le temps de
marquage est tregraves court seuls les hydrogegravenes d‟amide accessibles et eacutechangeables facilement
(ceux qui sont dans les parties non structureacutees de la proteacuteine ou dans les parties les plus
accessibles au solvant) sont deuteacutereacutes Des seacuteries de mesures sont effectueacutees en faisant varier
l‟intervalle de temps entre l‟initiation du repliement et le pulse de deuteacuterium De cette faccedilon
il est possible d‟obtenir des aperccedilus deacutetailleacutes de la seacutequence temporelle des eacuteveacutenements qui
conduisent la proteacuteine d‟un eacutetat deacuteplieacute agrave sa conformation native Les pulses de deuteacuterium
requiegraverent des conditions basiques (pD 8-10) pour s‟assurer qu‟un grand nombre d‟eacutechanges
isotopiques se produisent pendant l‟eacutetape courte de marquage La reacuteaction de marquage est
arrecircteacutee par une rapide baisse du pH et de la tempeacuterature (agrave pH 25 et agrave 0degC) de la solution ou
par l‟eacutevaporation du solvant pendant le processus d‟ionisation par eacutelectrospray lors
d‟expeacuteriences laquo on-line raquo HDXMS L‟usage d‟un systegraveme automatiseacute est neacutecessaire pour
reacutealiser des pulses sur des temps tregraves courts (lt 10 ms) et acceacuteder ainsi agrave des dynamiques tregraves
rapides
La deacutenaturation preacutealable de la proteacuteine est effectueacutee par l‟addition d‟un agent qui va
perturber sa structure (148) Ces agents sont geacuteneacuteralement des chaotropes mais peuvent
eacutegalement ecirctre des ligands qui vont venir se fixer sur la proteacuteine ou un simple changement de
tempeacuterature ou de pH
I23 Analyse de lrsquoincorporation des deuteacuteriums dans les proteacuteines par
spectromeacutetrie de masse
Les eacutechanges HD en solution sont donc devenus ces derniegraveres deacutecennies un outil
technique puissant pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines (149) Alors que la
plupart des eacutetudes HDX initiales utilisaient la RMN agrave haute reacutesolution (32) comme meacutethode
pour le suivi des cineacutetiques d‟eacutechange HD la spectromeacutetrie de masse occupe deacutesormais une
place de choix (150-153)
I231 Analyse des eacutechanges avantages de la MS vs RMN
C‟est le deacuteveloppement de meacutethodes de spectroscopie RMN multidimensionnelle de haute
reacutesolution (154-155) qui a permis d‟exploiter toute la puissance de la technique HDX (156)
52
La RMN est resteacutee pendant longtemps l‟outil de choix pour suivre les eacutechanges HD car de
ces deux isotopes seul l‟hydrogegravene conduit agrave un signal deacutetectable Ainsi remplacer des
hydrogegravenes d‟amide par des deuteacuteriums peut ecirctre facilement suivi en observant la disparition
des signaux correspondant dans les spectres RMN L‟analyse des eacutechanges HD par RMN
devient alors facile une fois que tous les signaux ont eacuteteacute attribueacutes Par ailleurs elle est reacutealiseacutee
en solution dans la continuiteacute du marquage rendant son interpreacutetation aiseacutee Un profil de
deuteacuteration en solution est observeacute en solution n‟engendrant pas de problegravemes quelconques
L‟eacutechange d‟un hydrogegravene par un deuteacuterium conduisant agrave un increacutement de masse de 1 Da
peut eacutegalement ecirctre suivi de maniegravere tregraves simple par spectromeacutetrie de masse Cette technique
plus reacutecente offre par ailleurs plusieurs avantages importants par rapport agrave la RMN Elle
permet des analyses plus rapides sur des systegravemes plus complexes tant par la diversiteacute que par
la taille avec moins de mateacuteriel initialement Neacuteanmoins l‟association HDXMS n‟atteint que
rarement la haute reacutesolution spatiale facilement accessible par la technique HDXRMN La
spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) est reacutecemment apparue comme une solution agrave ce
problegraveme faisant de la technique HDX-MSMS un candidat potentiel pour devenir une
meacutethode de choix pour l‟analyse structurale et dynamique des proteacuteines
I232 Approche classique laquo bottom-up raquo
Comme il a eacuteteacute dit preacuteceacutedemment la strateacutegie du marquage continu est choisie pour la
plupart des eacutetudes en HDXMS Elle consiste agrave suivre le taux de deuteacuteration des proteacuteines en
fonction de leur temps d‟exposition t agrave D2O pour deacutetecter le plus souvent des diffeacuterences en
reacuteponse agrave des modifications chimiques ou expeacuterimentales (157-158) agrave la liaison de ligands
(159-160) ou encore agrave la formation de complexes (161) L‟incorporation des deuteacuteriums peut
ecirctre mesureacutee au niveau de la proteacuteine entiegravere (eacutechange global) etou pour des courts segments
proteacuteiques (eacutechange local) Seulement la mesure de l‟eacutechange global ne preacutesente aucune
reacutesolution spatiale puisque elle est reacutealiseacutee pour l‟ensemble des hydrogegravenes d‟amide de la
proteacuteine Les expeacuteriences spatialement reacutesolues apportent quant agrave elles des informations sur
le comportement vis-agrave-vis de la deuteacuteration de reacutegions speacutecifiques de la proteacuteine
53
I2321 Digestion proteacuteolytique et analyse par LC-MS
Les expeacuteriences spatialement reacutesolues deacuterivent pour la plupart de l‟approche classique de
fragmentation enzymatique en solution (146 162-163) appeleacutee approche laquo bottom-up raquo La
digestion des proteacuteines par des proteacuteases conduisant agrave des fragments peptidiques pour
lesquels le taux d‟eacutechange peut ecirctre calculeacute a permis une premiegravere ameacutelioration de la
reacutesolution de l‟approche (164-166) La digestion proteacuteolytique a ensuite eacuteteacute associeacutee agrave une
seacuteparation chromatographique en phase liquide coupleacutee en ligne agrave la spectromeacutetrie de masse
(LC-MS) (141 167) Dans le cadre de l‟analyse des eacutechanges HD par LC-MS des meacutethodes
chromatographiques de courte dureacutee et agrave basse tempeacuterature doivent ecirctre impeacuterativement mises
au point afin de minimiser le laquo back-exchange raquo (168-169) Pour reacutealiser une analyse rapide
des colonnes courtes sont utiliseacutees Bien qu‟elles ne permettent qu‟une seacuteparation grossiegravere
des peptides elles limitent neacuteanmoins le deacutemarquage L‟utilisation de la spectromeacutetrie de
masse agrave tregraves haute reacutesolution est importante car elle peut permettre une identification plus
fiable des peptides sur la base de leur masse preacutecise L‟approche classique est dutiliser une
seacuteparation par HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo) et de placer toute la
chaicircne chromatographique dans une armoire reacutefrigeacutereacutee Notons quun systegraveme commercial
optimiseacute pour limiter leacutechange inverse a eacuteteacute deacuteveloppeacute reacutecemment par la socieacuteteacute Waters Le
choix d‟une meacutethode HPLC et non d‟une chaicircne de nano-chromatographie liquide conduit agrave
utiliser une quantiteacute importante d‟eacutechantillon C‟est la raison pour laquelle notre eacutequipe a mis
au point une approche par nano-LC pour l‟eacutetude des eacutechanges HD en solution Ce travail a
fait lobjet dune partie de la thegravese de Magalie Duchateau au laboratoire Les diffeacuterents
systegravemes d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse seront plus
deacutetailleacutes dans le Chap IV Le plus souvent les peptides sont analyseacutes en utilisant
l‟eacutelectrospray comme mode d‟ionisation (LCESI-MS) La technique MALDI-MS est moins
communeacutement utiliseacutee (170-172)
Choix des enzymes
Bien eacutevidemment la proteacuteolyse doit ecirctre reacutealiseacutee dans les conditions expeacuterimentales de
l‟arrecirct de la reacuteaction (agrave pH final 25 et agrave 0degC) afin d‟empecirccher l‟eacutechange inverse (D H)
avant l‟analyse finale en spectromeacutetrie de masse Il est par conseacutequent neacutecessaire d‟utiliser
des proteacuteases acides L‟enzyme la plus couramment utiliseacutee pour ce type d‟expeacuteriences est la
pepsine (173) Cette enzyme est non speacutecifique contrairement agrave la trypsine ou la
chymotrypsine mais elle est active dans les conditions expeacuterimentales requises et peut geacuteneacuterer
de nombreux peptides chevauchants permettant de localiser des zones d‟inteacuterecirct avec une
54
meilleure reacutesolution Cependant cette faible speacutecificiteacute (174) rend neacutecessaire une eacutetape
preacutealable aux eacutechanges HD d‟identification des peptides obtenus par spectromeacutetrie de masse
en tandem
La reacutesolution spatiale attendue avec l‟approche de digestion enzymatique agrave la pepsine est
de l‟ordre de 5 agrave 10 acides amineacutes Elle est limiteacutee par la taille des fragments geacuteneacutereacutes par
l‟eacutetape de digestion et le nombre de peptides chevauchants En revanche l‟utilisation de
proteacuteases immobiliseacutees sur des colonnes semble permettre d‟une part de standardiser le
protocole HDXMS et d‟autre part dans certains cas d‟atteindre une reacutesolution spatiale
proche de l‟acide amineacute pregraves (175-176) Notons le deacuteveloppement reacutecent d‟une nouvelle
approche baseacutee sur une digestion agrave la pepsine mais utilisant des conditions de haute pression
(177) semblant encore ameacuteliorer les reacutesultats
D‟autres proteacuteases acides peuvent eacutegalement ecirctre utiliseacutees mais les conditions
expeacuterimentales imposent qu‟elles soient capables de digeacuterer leur substrat en moins de cinq
minutes afin de minimiser l‟eacutechange inverse L‟utilisation combineacutee de diffeacuterentes proteacuteases
permet de geacuteneacuterer un grand nombre de peptides chevauchants et ainsi d‟augmenter
consideacuterablement la reacutesolution spatiale (178) La proteacutease de type XIII d‟Aspergillus saitoi
(179) ainsi que celle de type XVIII extraite des diffeacuterentes espegraveces de Rhizopus (178) ou
encore plus reacutecemment la plasmepsine II de Plasmodium falciparum (180) peuvent ecirctre
utiliseacutees dans les eacutetudes HDXMS (172 179 181-182) Par ailleurs une version recombinante
de la proteacutease de type XVIII vient d‟ecirctre mise au point Elle permettrait l‟utilisation d‟un
rapport enzymeproteacuteine beaucoup plus faible qu‟avec la version sauvage (183)
Une meacutethode permettant de geacuteneacuterer un tregraves grand nombre de peptides chevauchants baseacutee
sur l‟utilisation de deux proteacuteases acides et de les identifier efficacement et preacuteciseacutement a
reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee pour les analyses HDXMS (184-185) La difficulteacute de lanalyse
du fait de la grande quantiteacute de donneacutees geacuteneacutereacutees par la proteacuteolyse (nombreux peptides
chevauchants) combineacutee agrave la complexiteacute des informations obtenues par HDX (incorporation
des deuteacuteriums perte du marquage) a encourageacute le deacuteveloppement d‟une plateforme ougrave les
expeacuteriences et le traitement de donneacutees sont totalement automatiseacutes (186)
Problegraveme de leacutechange inverse
Malgreacute une optimisation des conditions expeacuterimentales (diminution du pH et de la
tempeacuterature de l‟eacutechantillon ainsi que du temps d‟analyse) le pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse
55
reste un problegraveme crucial lors des eacutetapes de digestion proteacuteolytique et d‟analyse des
fragments peptidiques En effet chaque clivage enzymatique conduit agrave une perte
d‟information au niveau de deux sites eacutechangeables Les sites concerneacutes sont l‟hydrogegravene
d‟amide du squelette peptidique qui a eacuteteacute cliveacute et converti en amine libre et celui adjacent agrave
l‟extreacutemiteacute N-terminale (168) Par ailleurs le deacutemarquage peut eacutegalement avoir lieu au cours
de l‟eacutetape de digestion Or la perte totale de la deuteacuteration au niveau de sites particuliers tels
que ceux proteacutegeacutes par une interaction proteacuteine-partenaire signifierait que les surfaces
d‟interaction de macroassemblages ne pourraient pas ecirctre deacutetermineacutees par cette approche
C‟est la raison pour laquelle plusieurs tentatives de correction systeacutematique du laquo back-
exchange raquo ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees (187) Une meacutethode de reacuteajustement a ainsi eacuteteacute deacutecrite par
Zhang et al (141) Briegravevement elle consiste agrave mesurer le taux d‟eacutechange de peptides
complegravetement deuteacutereacutes et agrave le comparer agrave la reacutefeacuterence sans eacutechange Les analyses sont
reacutealiseacutees dans les mecircmes conditions de digestion et de seacuteparation par HPLC Le facteur de
correction du laquo back-exchange raquo relative agrave l‟expeacuterience est alors deacutetermineacute Mais cela
implique que le deacutemarquage soit identique pour tous les sites eacutechangeables ce qui n‟est pas le
cas (I2132) Le taux d‟eacutechange inverse est consideacuterablement diffeacuterent d‟un site agrave un autre
site et donc d‟un peptide agrave un autre peptide Il peut neacuteanmoins ecirctre preacutedit pour des peptides
non structureacutes en utilisant les paramegravetres de calcul de kch suivant la formule donneacutee au
I2132 (188)
Exemples de complexes proteacuteiques analyseacutes
Malgreacute les problegravemes poseacutes par l‟eacutechange inverse et la reacutesolution relativement faible de
l‟approche un des avantages majeurs des approches laquo bottom-up raquo est leur utilisation pour
l‟eacutetude de complexes de tregraves haut poids moleacuteculaire puisque ce sont des peptides issus d‟une
digestion enzymatique qui sont analyseacutes Ainsi cette approche a eacuteteacute utiliseacutee par l‟eacutequipe de
V Wysocki afin d‟eacutetudier des complexes proteacuteiques proteacuteine chaperonne-substrat et ainsi de
mieux comprendre leur meacutecanisme d‟action (I113) (189) Il s‟agit de proteacuteines s‟associant
pour former des oligomegraveres de tregraves haut poids moleacuteculaire Les complexes qui ont eacuteteacute
analyseacutes par la technique HDXMS coupleacutee agrave une approche laquo bottom-up raquo sont les suivants
TaHsp169-MDH (gt 1000 kDa) et PsHsp181-MDH (~600-700 kDa) Un pourcentage de
couverture peptidique de 100 a eacuteteacute obtenu pour les deux proteacuteines Par ailleurs une eacutetude
du complexe Arp23 avait permis de mettre en eacutevidence finement des modifications de
structure tridimensionnelle induites par la liaison agrave l‟ATP ou agrave des proteacuteines activatrices telles
que les proteacuteines WASp en utilisant l‟approche par marquage avec les radicaux hydroxyles
(75) (I1225) Plus reacutecemment le complexe Arp23 a eacuteteacute analyseacute par une approche
56
compleacutementaire HDXMS afin de mettre en eacutevidence des modifications de structure et de
dynamique reacutesultant de l‟activation par les proteacuteines WASp et de comparer les reacutesultats avec
les modegraveles du meacutecanisme preacuteexistants Pour autant que nous sachions le complexe Arp23
de sept sous-uniteacutes proteacuteiques avec un poids moleacuteculaire de 220 kDa est le plus important
macroassemblage jamais eacutetudieacute par HDXMS Ceci a eacuteteacute possible gracircce agrave une analyse par
laquo bottom-up raquo (190)
Comment ameacuteliorer la reacutesolution
Une faccedilon d‟augmenter la reacutesolution des approches bottom-up serait de recourir agrave la
fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques afin de localiser plus preacuteciseacutement
les deuteacuteriums dans la seacutequence D‟une maniegravere geacuteneacuterale la fragmentation peut ecirctre reacutealiseacutee
de diffeacuterentes maniegraveres dans un spectromegravetre de masse Tout d‟abord il est possible de
fragmenter les ions dans la source (laquo In-Source Decay raquo ou ISD) en les acceacuteleacuterant dans une
reacutegion de haute pression mais ce processus ne conduit agrave aucune seacutelectiviteacute et pose donc des
problegravemes quant agrave l‟analyse des meacutelanges La spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS)
peut eacutegalement ecirctre utiliseacutee pour la dissociation des peptides Elle est adapteacutee agrave l‟eacutetude des
meacutelanges apporte des informations structurales de qualiteacute et est doteacutee d‟une grande
sensibiliteacute Elle consiste agrave seacutelectionner un ion preacutecurseur par un premier analyseur agrave le
fragmenter (par diffeacuterentes techniques d‟activation) et agrave analyser les fragments obtenus agrave
l‟aide d‟un autre analyseur (le mecircme pour les instruments de type trappe ionique)
Neacuteanmoins comme cela sera deacutetailleacute dans le paragraphe suivant le choix de la technique
d‟activation pour des peptides deuteacutereacutes est tregraves important pour obtenir des informations
valables
I2322 Fragmentation en phase gazeuse des peptides proteacuteolytiques
L‟objectif des expeacuteriences de MSMS sur les peptides deuteacutereacutes est de pouvoir preacuteciseacutement
localiser les deuteacuteriums incorporeacutes dans la seacutequence au niveau des diffeacuterents hydrogegravenes
d‟amide afin d‟obtenir une reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves En theacuteorie la spectromeacutetrie de
masse en tandem constitue donc un moyen inteacuteressant et simple pour ameacuteliorer la reacutesolution
des approches HDXMS
Il existe diffeacuterents modes d‟activation susceptibles d‟ecirctre utiliseacutes pour fragmenter les
peptides Dans une approche proteacuteomique classique la meacutethode de dissociation induite par
57
collision (CID) est largement preacutefeacutereacutee Le principe consiste agrave fragmenter la moleacutecule par
collision avec un gaz inerte (heacutelium diazote argon ou xeacutenon) Malheureusement dans le
cadre d‟eacutetudes HDXMS ces meacutethodes conventionnelles de fragmentation par activation
collisionnelle de proteacuteines et peptides protoneacutes ont rapidement eacuteteacute eacutecarteacutees En effet bien que
la litteacuterature soit contradictoire il a eacuteteacute montreacute qu‟elles conduisent tregraves souvent agrave une
redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums partielle ou totale le long de la chaicircne polypeptidique
(y compris au niveau des chaicircnes lateacuterales) (191-194) pendant l‟eacutetape de fragmentation Le
processus de migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes en phase gazeuse est appeleacute
laquo scrambling raquo en anglais
En fait ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo peut se produire agrave diffeacuterents endroits du
spectromegravetre de masse Le premier est lors de la deacutesolvatation des ions encore solvateacutes dans la
source dans les toutes premiegraveres eacutetapes preacuteceacutedant leur transmission vers l‟analyseur (195-
196) Une autre possibiliteacute est donc dans la cellule de collision au moment de la
fragmentation Le laquo scrambling raquo est induit par un apport d‟eacutenergie vibrationnelle conduisant
agrave un eacutechange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums avant la dissociation Il est clair que le
meacutecanisme de fragmentation des peptides protoneacutes dit meacutecanisme du proton mobile
proposeacute par Simon Gaskell (197) et Vicky Wysocki (198-200) n‟est pas en faveur d‟une
conservation de la position des deuteacuteriums d‟amide avant la fragmentation En effet ce
meacutecanisme (Fig I 15) fait l‟hypothegravese que preacutealablement agrave la fragmentation un proton
migre des sites les plus basiques de la moleacutecule vers un azote d‟amide eacutevegravenement preacutealable agrave
une cyclisation pour former des ions b et y Cette eacutetape eacutetant a priori reacuteversible les
deuteacuteriums peuvent ecirctre meacutelangeacutes avec des hydrogegravenes agrave ce moment lagrave
HN
NHO
R1
R2
OR3
R1
O
N
O
R2
H+
HN
NH2O
R1
R2
OR3
H3N Nter+
+
Nter
Cter Cter
R3
NH2
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
NH
R3
Cter
R1
O
N
O
R2
H+
Nter
H3N
R3
Cter
+
ion b ion y
Proton
Mobile
Attaque
Nucleacuteophile
Reacutearrangement
Fig I 15 Formation des ions b et y (201)
58
Le laquo scrambling raquo conduit donc agrave une perte d‟information au niveau du profil de
deuteacuteration rendant l‟analyse difficilement interpreacutetable La litteacuterature indique que ce
pheacutenomegravene semble deacutependre de la seacutequence du peptide fragmenteacute (202) mais eacutegalement de
l‟eacutenergie de collision apporteacutee et de la flexibiliteacute de la chaicircne polypeptidique en phase
gazeuse (195 203) Ces deux derniers facteurs joueraient un rocircle deacuteterminant dans le
reacutearrangement aleacuteatoire des deuteacuteriums et des hydrogegravenes le long du squelette peptidique
avant la dissociation Une faible eacutenergie de collision et donc une lente activation des ions en
phase gazeuse seraient favorables agrave une migration intramoleacuteculaire des hydrogegravenes En
revanche la reacuteduction de la flexibiliteacute des ions proteacuteiques pourrait diminuer la mobiliteacute du
proton dans des conditions d‟activation collisionnelle de basse eacutenergie Le pheacutenomegravene du
laquo scrambling raquo a pu ecirctre mis en eacutevidence par l‟utilisation de peptides modegraveles (204-206) Le
principe des peptides seacutelectivement deuteacutereacutes deacuteveloppeacutes par T Jorgensen sera deacutetailleacute dans
le Chap II
La conclusion des eacutetudes de fragmentation par CID de peptides deuteacutereacutes est que les
meacutethodes d‟activation conduisant agrave une augmentation progressive de l‟eacutenergie vibrationnelle
(CID IRMPD SORI-CID) (195) ne peuvent pas ecirctre utiliseacutees pour localiser les deuteacuteriums
dans la seacutequence peptidique De ce fait d‟autres meacutethodes de fragmentation en phase gazeuse
ont eacuteteacute investigueacutees Parmi elles les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons telles que l‟ECD
et l‟ETD se sont reacuteveacuteleacutees tregraves prometteuses (207-209)
L‟ECD est une technique de dissociation speacutecifique des spectromegravetres de masse FT-ICR
Son principe repose sur la capture exothermique (~4-5 eV) d‟un eacutelectron par une espegravece
multichargeacutee (210) L‟ion proteacuteique multichargeacute est irradieacute par un faisceau d‟eacutelectrons de
faible eacutenergie (lt 1 eV) Apregraves capture d‟un eacutelectron l‟ion radicalaire se fragmente La
reacuteactiviteacute est diffeacuterente par rapport aux meacutethodes par activation collisionnelle en raison de la
preacutesence d‟un eacutelectron dans le systegraveme et notamment le meacutecanisme du proton mobile n‟est
pas celui qui explique la fragmentation rendant son utilisation possible pour analyser des
peptides ou des proteacuteines deuteacutereacutes (139 207 211-212) En ECD on n‟observe pas la rupture
des liaisons peptidiques (pour conduire agrave des ions b et y) ni geacuteneacuteralement la perte de
modifications post-traductionnelles labiles comme ce qui est observeacute pour l‟activation par
CID Le site de clivage quasi-speacutecifique en ECD est la liaison N-Cα entraicircnant la formation
d‟ions fragments de type c et z le plus souvent mais aussi parfois a b et y (Fig I 16) Une
charge positive eacutetant neutraliseacutee par un eacutelectron la technique d‟ECD ne peut ecirctre utiliseacutee que
sur des ions preacutecurseurs qui sont au minimum deux fois chargeacutes (doublement protoneacutes)
59
Fig I 16 Nomenclature des fragments peptidiques issus de la spectromeacutetrie de masse en
tandem
L‟ETD qui a reacutecemment eacuteteacute deacuteveloppeacutee est une technique similaire agrave l‟ECD conduisant
eacutegalement agrave la formation d‟ions fragments de type c et z (213) La fragmentation repose sur
la reacuteaction ionion qui se produit entre le peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire Cet
anion se trouve seacutequestreacute dans un piegravege agrave ions Quand les deux ions se trouvent agrave une distance
suffisante il se produit le transfert d‟un eacutelectron de l‟anion vers le peptide chargeacute
positivement ce qui induit sa fragmentation L‟avantage majeur de l‟ETD est qu‟il peut ecirctre
reacutealiseacute sur une varieacuteteacute de types d‟instruments standards utilisant la radiofreacutequence d‟un champ
eacutelectrique oscillant pour pieacuteger les ions (213-215) L‟ECD quant agrave lui neacutecessite des champs
eacutelectrique et magneacutetique stables disponibles exclusivement sur des spectromegravetres de masse
FT-ICR (207 216)
Bien que le meacutecanisme des techniques ECD et ETD ne soit pas encore complegravetement
eacutelucideacute il passe par une voie alternative de fragmentation de type radicalaire dont on a pu
discuter du caractegravere ergodique ou non (217) n‟induisant pas de laquo scrambling raquo pourvu que
les paramegravetres instrumentaux soient controcircleacutes et optimiseacutes pour la minimisation du
pheacutenomegravene Il s‟agit d‟une part de minimiser les paramegravetres des optiques de transfert ionique
tels que le potentiel de deacutesolvatation des ions et la tension des lentilles du tube de transfert et
d‟autre part de minimiser l‟excitation vibrationnelle des ions pendant leur filtration et avant
leur fragmentation en augmentant le paramegravetre fenecirctre d‟isolation (207) Il a eacuteteacute montreacute que la
fragmentation des ions par ECD se produisait avant que l‟eacutenergie puisse ecirctre redistribueacutee au
niveau du site de clivage de la liaison le plus favorable (210 218-219) Cette rapide et
efficace meacutethode d‟activation conduit donc agrave une limitation du laquo scrambling raquo et permet donc
de localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence peptidique (207) Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves de l‟incorporation des deuteacuteriums a eacutegalement pu ecirctre obtenue par
60
fragmentation ETD au niveau de peptides seacutelectivement marqueacutes (208) ainsi que de peptides
proteacuteolytiques issus de la digestion enzymatique de la β2-microglobuline deuteacutereacutee (209)
L‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu est calculeacutee en faisant la diffeacuterence des contenus en
deuteacuteriums de fragments conseacutecutifs pour les seacuteries d‟ions c (c2-c1 c3-c2 hellip) et z (z2-z1 z3-z2
hellip) Une cineacutetique deacutechange HD par acide amineacute peut eacutegalement ecirctre obtenue en suivant
l‟incorporation des deuteacuteriums des ions c ou z au cours du temps
Cette approche combinant la digestion enzymatique en solution et la fragmentation ETD en
phase gazeuse est devenue tregraves reacutecemment assez robuste pour ecirctre utiliseacutee sur de vrais
systegravemes biologiques Elle a eacuteteacute complegravetement automatiseacutee en plateforme HDX (220)
La spectromeacutetrie de masse en tandem peut donc ecirctre utiliseacutee pour ameacuteliorer la reacutesolution
des expeacuteriences utilisant les eacutechanges HD La fragmentation en phase gazeuse des ions
peptidiques obtenus apregraves digestion enzymatique du systegraveme biologique dinteacuterecirct permet donc
d‟obtenir la localisation preacutecise des deuteacuteriums dans la seacutequence Pour cela elle doit ecirctre
reacutealiseacutee en utilisant des meacutethodes alternatives d‟activation par les eacutelectrons (ECD ETD) tout
en controcirclant les processus de deacutesolvatation transfert et seacutelection des ions preacutealables agrave la
fragmentation (207-208) Ces meacutethodes ayant eacutegalement fait leur preuve pour la
fragmentation de proteacuteines entiegraveres (221-222) il est rapidement apparu qu‟il serait possible de
les utiliser dans des approches dites laquo top-down raquo pour des eacutetudes HDXMS Dans cette
derniegravere approche l‟eacutetape de digestion enzymatique n‟est plus requise
I233 Approche moderne laquo top-down raquo ECD ou ETD
L‟approche laquo top-down raquo s‟affranchit donc de l‟eacutetape de proteacuteolyse et de seacuteparation des
peptides en chromatographie liquide Au lieu de cela la proteacuteine est introduite entiegravere dans le
spectromegravetre de masse et fragmenteacutee directement en phase gazeuse (223)
I2331 Meacutethodes de fragmentation de proteacuteines intactes par ECD ou ETD
Il existe plusieurs modes d‟activation pour la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines
entiegraveres Les meacutethodes dissociatives par capture ou transfert deacutelectron (ECD ou ETD) sont
particuliegraverement utiliseacutees dans ce type d‟approche
61
Des couvertures de seacutequence importantes peuvent ecirctre obtenues par ces approches sur
proteacuteines entiegraveres conduisant eacutegalement agrave la localisation de modifications post-
traductionnelles (MPT) (223-225) Le laboratoire pionnier dans le domaine est celui de Neil
Kelleher aux USA qui a deacuteveloppeacute une veacuteritable approche inteacutegreacutee pour lanalyse
proteacuteomique laquo top-down raquo allant de la seacuteparation des proteacuteines entiegraveres agrave lanalyse
automatiseacutee des spectres MSMS complexes obtenus lorsque lon fragmente une proteacuteine
entiegravere Ses proteacuteines de preacutedilection sont les histones petites proteacuteines de 13 kDa que lon
peut retrouver sous un grand nombre disoformes diffeacuterentes (mecircme stucture primaire mais
modifications post-traductionnelles diffeacuterentes et dynamiques) lieacutees au code des histones
Lavantage majeur des approches laquo top-down raquo en proteacuteomique est de permettre non
seulement lidentification des isoformes de proteacuteines par simple mesure de masse mais aussi
dobtenir des informations structurales (preacutesence de MPT notamment) sur lensemble de la
seacutequence Cela nest pas possible par des approches classiques par laquo bottom-up raquo car tous les
peptides issus de la digestion ne sont pas retrouveacutes lors de lanalyse
Neacuteanmoins elles preacutesentent encore certaines limitations comme leacutetape cruciale de
seacuteparation des proteacuteines entiegraveres le poids moleacuteculaire des proteacuteines qui peuvent ecirctre
fragmenteacutees et la sensibiliteacute Le problegraveme majeur rencontreacute avec les proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire est leur propension agrave se replier en phase gazeuse formant un reacuteseau de liaisons
hydrogegravene qui conduit agrave une perte defficaciteacute au niveau de la fragmentation par ECD ou
ETD En effet bien que leacutelectron soit captureacute par un site peptidique et la liaison N-Cα
rompue les deux morceaux de la proteacuteine (parties N-terminales et C-terminales) restent
lieacutees entre elles et les fragments ne peuvent ecirctre deacutetecteacutes Une solution consiste agrave introduire
une eacutetape de chauffage lent des ions (photons infrarouge par exemple) pour rompre ce reacuteseau
de liaisons hydrogegravene avant ou apregraves la capture de leacutelectron Neacuteanmoins si lapproche
fonctionne souvent bien dans le cas de proteacuteines non deuteacutereacutees elle ne peut ecirctre envisageacutee
dans le cadre des eacutetudes HDX car le chauffage lent conduira agrave un eacutechange des hydrogegravenes et
des deuteacuteriums avant la fragmentation
62
I2332 Approches top-down et HDX
Dans les eacutetudes HDX le deacuteveloppement de l‟approche laquo top-down raquo ECD ou ETD comme
meacutethodologie alternative agrave l‟approche classique de laquo bottom-up raquo semble tregraves prometteur En
effet l‟approche laquo top-down raquo permet d‟une part d‟eacuteliminer le laquo back-exchange raquo relatif aux
eacutetapes de digestion enzymatique en solution et de seacuteparation en chromatographie liquide et
d‟autre part d‟obtenir une meilleure reacutesolution spatiale tout au moins pour des proteacuteines de
petite agrave moyenne taille (211)
La faisabiliteacute d‟expeacuteriences HDX par laquo top-down raquo ECD spatialement reacutesolues a eacuteteacute
reacutecemment deacutemontreacutee par Pan et al pour l‟eacutetude d‟une proteacuteine de 17 kDa (211) Il est
eacutegalement possible gracircce agrave cette approche d‟obtenir des informations structurales au niveau
d‟espegraveces speacutecifiques en meacutelange heacuteteacuterogegravene en isolant au preacutealable un ion preacutecurseur (212)
De plus en raison de son association avec des meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons qui
limitent le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo dans des conditions expeacuterimentales bien controcircleacutees
et conduisent agrave de bonnes couvertures de seacutequence elles permettent de localiser preacuteciseacutement
la position des deuteacuteriums dans la seacutequence (Fig I 17)
La meilleure reacutesolution spatiale obtenue par l‟approche laquo top-down raquo s‟explique de la
maniegravere suivante tandis que l‟expeacuterience laquo bottom-up raquo consiste agrave cliver la proteacuteine au
niveau de plusieurs sites geacuteneacuterant des peptides de taille relativement petite l‟eacutetude laquo top-
down raquo quant agrave elle conduit agrave un seul eacuteveacutenement de fragmentation au niveau de chaque
chaicircne polypeptidique Il en reacutesulte la formation d‟une paire d‟ions compleacutementaires cz
dans le cas de la fragmentation ECD ou ETD issus de l‟extreacutemiteacute N- et C-terminale Une
reacutesolution spatiale agrave l‟acide amineacute pregraves peut donc ecirctre obtenue avec l‟approche laquo top-down raquo
car les proteacuteines en phase gazeuse sont cliveacutees une seule fois agrave diffeacuterents sites (Fig I 17)
63
Fig I 17 Scheacutema illustrant la diffeacuterence conceptuelle entre les approches MS de laquo bottom-
up raquo et laquo top-down raquo appliqueacutees aux eacutetudes HDX (226) Lrsquoapproche par fragmentation en
phase gazeuse de la proteacuteine entiegravere dite laquo top-down raquo permet de localiser preacuteciseacutement les
deuteacuteriums dans la seacutequence proteacuteique
Dans le cadre des eacutetudes HDXMS un autre avantage des approches laquo top-down raquo par
rapport agrave celles dites de laquo bottom-up raquo est le fait qu‟il est possible en theacuteorie de reconstruire
une cineacutetique d‟eacutechange par acide amineacute Cela sera deacutetailleacute dans le Chap III de ce manuscrit
Il est eacutegalement avantageux de pouvoir saffranchir des eacutetapes de digestion enzymatique et de
seacuteparation en chromatographie liquide En effet un gain de temps et une possible reacuteduction
du laquo back-exchange raquo sont des eacuteleacutements cruciaux pour ces eacutetudes
64
I2333 Limitations des approches top-down HDX
La limitation majeure de la fragmentation des proteacuteines deuteacutereacutees par ECD reste la taille
des systegravemes comme en analyse laquo top-down raquo classique De tregraves bonnes couvertures de
seacutequence peuvent ecirctre obtenues pour des proteacuteines de faible masse moleacuteculaire (lt 20 kDa)
Au-delagrave de cette valeur l‟efficaciteacute de fragmentation diminue avec le plus souvent une reacutegion
centrale de la proteacuteine peu fragmenteacutee au contraire des extreacutemiteacutes N- et C-terminales en
raison de la structuration des proteacuteines en phase gazeuse deacutecrite preacuteceacutedemment
Un autre problegraveme est d‟arriver agrave maintenir la proteacuteine entiegravere avec ses deuteacuteriums sans
qu‟elle se deacutemarque pendant le temps de l‟analyse En effet pour obtenir des couvertures de
seacutequence importantes un grand nombre de spectres doivent ecirctre accumuleacutes (ideacutealement
pendant trente minutes agrave une heure) et le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine en termes de
position des deuteacuteriums dans la seacutequence est primordial
Enfin le dernier inconveacutenient de ces approches est l‟analyse de proteacuteines reacuteelles qui
demeure compliqueacutee En effet sans seacuteparation par chromatographie liquide un dessalage des
eacutechantillons biologiques reacuteels doit se faire indeacutependamment et preacutealablement agrave lanalyse par
spectromeacutetrie de masse Il est donc effectueacute de maniegravere laquo off-line raquo et conduit
malheureusement agrave un certain deacutemarquage Par ailleurs il doit obligatoirement ecirctre reacutealiseacute agrave
froid ce qui complique le deacuteroulement des expeacuteriences
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79
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles
validation de lrsquoapproche combinant
eacutechanges HD et fragmentation ECD
80
Chapitre II Analyse de peptides modegraveles validation de lrsquoapproche combinant eacutechanges HD et fragmentation ECD 79
II1 Introduction 81
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX 81 II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen 82
II2 Reacutesultats 84
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons 84 II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence84 II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo 85
II3 Conclusions 92
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III 92 II32 Autres instruments FT-ICR 93
II4 Bibliographie 96
81
II1 Introduction
II11 Spectromeacutetrie de masse en tandem et HDX
Comme indiqueacute dans le chapitre preacuteceacutedent un des problegravemes expeacuterimentaux majeurs lieacute
aux eacutetudes par HDX-MSMS est le laquo scrambling raquo qui correspond agrave une redistribution
aleacuteatoire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums preacutesents dans la seacutequence peptidique par des
processus qui ont lieu en phase gazeuse
Le plus connu est celui qui intervient au moment de la fragmentation par CID et qui
sexplique par le modegravele du proton mobile (1-4) Dans ce modegravele leacutenergie apporteacutee par la
collision conduit agrave une mobiliteacute du proton qui se trouve initialement sur le site le plus basique
du peptide (Lysine Arginine ou amine N-terminale) Ce proton se met donc agrave se deacuteplacer
dans le peptide pour aller vers des sites de protonation moins basiques tels que loxygegravene ou
lazote de la liaison peptidique Bien que la protonation sur lazote de lamide soit
thermodynamiquement moins favorable que la protonation sur l‟oxygegravene des carbonyles cest
ce site protoneacute qui conduit agrave la rupture de la liaison amide et agrave la formation des ions b et y La
protonation reacuteversible des atomes dazote des diffeacuterentes fonctions amides du squelette dans
le contexte dune eacutetude HDX conduit donc si lintermeacutediaire reacuteactionnel a un temps de vie
suffisamment long et si la cineacutetique de la voie retour est comparable agrave la cineacutetique de
fragmentation agrave un eacutechantillonnage du proton sur tous les amides et donc un meacutelange
complet des hydrogegravenes et des deuteacuteriums Pour eacuteviter ce pheacutenomegravene il faut (i) soit que la
protonation sur lamide ne soit pas reacuteversible (ii) soit que la dissociation de la liaison
peptidique soit plus rapide que la deacuteprotonation de lazote damide Paizs et Suhai (5) ont
eacutevalueacute la constante de vitesse de dissociation de la liaison amide par des calculs RRKM et ont
obtenu une valeur de lordre de la microseconde pour des eacutenergies internes denviron 45
kJmol soit une vitesse relativement lente due entre autre agrave la neacutecessaire cyclisation de la
partie b et donc probablement compeacutetitive avec de simples transferts de protons Ainsi de
nombreux exemples de la litteacuterature montrent quil nest pas possible dutiliser des approches
par CID pour localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans des peptides marqueacutes car le
laquo scrambling raquo qui a lieu avant la fragmentation est total (6-11)
Neacuteanmoins il est curieux de constater que certaines eacutetudes arrivent agrave des conclusions
opposeacutees A titre dexemple il a eacuteteacute montreacute par Deng et al pour une seacuterie de peptides issus de
82
la digestion du cytochrome C de cheval (12) ou par Kim et al sur des fragments peptidiques
de thioreacutedoxine oxydeacutee et reacuteduite d‟E coli (13-14) que les ions b preacutesentaient un
laquo scrambling raquo modeacutereacute alors que les ions y correspondants preacutesentaient au contraire un
laquo scrambling raquo total Des reacutesultats similaires deacutecrivant un pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
partiel ont eacutegalement eacuteteacute obtenus sur des proteacuteines entiegraveres (15-17)
Ce qui semble ressortir de ces articles est que les conditions expeacuterimentales utiliseacutees et la
seacutequence des peptides jouent un rocircle tregraves important sur le type de reacutesultat qui est obtenu Dans
ce contexte mieux comprendre les diffeacuterents facteurs affectant le reacutearrangement aleacuteatoire des
hydrogegravenes et des deuteacuteriums dans la seacutequence avant la fragmentation semble un point crucial
pour pouvoir deacutevelopper des approches de spectromeacutetrie de masse tandem robustes en HDX
Neacuteanmoins le problegraveme majeur pour reacutealiser de telles eacutetudes est de disposer dun systegraveme
modegravele permettant de caracteacuteriser la preacutesence du meacutelange entre les hydrogegravenes et les
deuteacuteriums quil soit partiel ou total
Cest le groupe de T Joslashrgensen au Danemark qui a reacutesolu ce problegraveme en mettant au
point des peptides modegraveles qui peuvent ecirctre deuteacutereacutes seacutelectivement sur leur extreacutemiteacute N-
terminale ou C-terminale Lutilisation de ces peptides lui a ainsi permis de montrer (i) quen
controcirclant finement un certain nombre de paramegravetres expeacuterimentaux et (ii) en utilisant des
meacutethodes dactivation baseacutees sur le transfert ou la capture dun eacutelectron (ECDETD) il eacutetait
possible de limiter consideacuterablement le laquo scrambling raquo et localiser preacuteciseacutement les deuteacuteriums
dans la seacutequence (18-19)
II12 Principe des peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
Les premiers travaux publieacutes par T Joslashrgensen sont baseacutes sur lutilisation dun peptide qui
peut ecirctre marqueacute au deuteacuterium de maniegravere seacutelective gracircce agrave linteraction dune partie de sa
seacutequence avec un reacutecepteur La partie en interaction avec la proteacuteine eacutetant masqueacutee ne
conduit agrave aucun eacutechange HD alors que la partie libre eacutechange facilement ses hydrogegravenes
damide pour des deuteacuteriums (20) Neacuteanmoins il est vite apparu que le modegravele eacutetait trop
compliqueacute agrave manipuler et neacutecessitait decirctre simplifieacute
83
Pour ce faire T Joslashrgensen a deacutecideacute de maniegravere tout agrave fait astucieuse de mettre agrave profit le
fait quen solution les hydrogegravenes damide du squelette peptidique ont des vitesses deacutechange
avec le solvant qui varient fortement en fonction des acides amineacutes voisins pour construire
des peptides qui peuvent ecirctre seacutelectivement deuteacutereacutes Linfluence des reacutesidus voisins peut ecirctre
soit dordre steacuterique soit dordre inductif (21) A titre dexemple lhydrogegravene dun amide se
trouvant entre deux isoleucines eacutechange dix fois moins vite quun hydrogegravene damide situeacute
entre deux alanines Ces vitesses deacutechange ont eacuteteacute mesureacutees par des expeacuteriences de
spectroscopie RMN (22) Thomas Joslashrgensen a donc utiliseacute pour eacutetablir la seacutequence de ses
peptides modegraveles des acides amineacutes qui eacutechangent tregraves rapidement (histidine ou acide
aspartique) quil a placeacutes en N-terminal et des acides amineacutes qui eacutechangent beaucoup plus
lentement (isoleucine) en C-terminal Il a eacutegalement introduit des acides amineacutes basiques
(lysine) pour sassurer de la solubiliteacute de ses peptides La seacutequence geacuteneacuterale de ses peptides
est donc (His)n(Ile-Ile-Lys)m ou (Lys)2(Asp)n(Ile-Ile-Lys)m Ainsi apregraves un eacutechange complet
dans D2O et dilution dans H2O (acide et glaceacutee) les amides de la partie N-terminale des
peptides (His)n ou (Lys)2(Asp)n se retrouvent complegravetement hydrogeacuteneacutes alors que ceux de la
partie C-terminale (Ile-Ile-Lys)m portent encore des deuteacuteriums
Lutilisation de ces peptides a permis agrave T Joslashrgensen de montrer quil eacutetait possible de
trouver des conditions en ECD (18) mais aussi en ETD (19 23-24) qui permettent de
minimiser le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Diffeacuterents instruments ont eacuteteacute utiliseacutes pour ses
expeacuteriences un spectromegravetre de masse FT-ICR (LTQ-FT) de la socieacuteteacute Thermo pour les
expeacuteriences en ECD (18) et une trappe ionique Agilent (19) ainsi qu‟un spectromegravetre de
masse LTQ-Orbitrap XL (Thermo) (23 25) pour les expeacuteriences ETD Une des conclusions
de ces eacutetudes est que quel que soit le spectromegravetre de masse utiliseacute loptimisation des
conditions expeacuterimentales de la source eacutelectrospray et notamment tous les paramegravetres lieacutes agrave
la deacutesolvatation est un paramegravetre crucial pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Ce reacutesultat nest pas
eacutetonnant dans la mesure ougrave avant leur arriveacutee dans une reacutegion de tregraves basse pression les ions
subissent un certain nombre de collisions qui peuvent augmenter leur eacutenergie interne (26) et
favoriser ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Pour les expeacuteriences ECD T Joslashrgensen a
eacutegalement montreacute que la fenecirctre de seacutelection choisie dans le piegravege lineacuteaire pour isoler lion agrave
fragmenter est eacutegalement un paramegravetre agrave controcircler finement Une fenecirctre trop eacutetroite conduit
en effet agrave une excitation de lion preacutecurseur et au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
Dans ce contexte nous avons souhaiteacute utiliser les peptides deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen
comme sondes du laquo scrambling raquo sur le spectromegravetre de masse FT-ICR APEX III du
84
laboratoire afin de pouvoir deacuteterminer les conditions expeacuterimentales propres agrave reacutealiser de
lECD sur des peptides puis des proteacuteines deuteacutereacutes Ce travail a eacuteteacute initieacute lors de la thegravese de
Magalie Duchateau (27) mais navait pas pu ecirctre termineacute pour des problegravemes instrumentaux
Afin dassurer la coheacuterence des reacutesultats toutes expeacuteriences reacutealiseacutees preacuteceacutedemment ont eacuteteacute
dupliqueacutees et compleacuteteacutees au deacutebut de ma thegravese Une mise agrave jour de linstrument en APEX-Q
puis en SolariX nous a ensuite conduits agrave devoir reacute-optimiser certains paramegravetres Les
reacutesultats obtenus lors de ce travail font lobjet du deuxiegraveme chapitre de cette thegravese Les
peptides choisis sont les suivants
P1 HHHHHHIIKIIK
P2 KKDDDDDDIIKIIK
P3 KKDDDIIKIIK
P4 KKDDIIK
II2 Reacutesultats
II21 Systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons
Le systegraveme deacuteveloppeacute par T Joslashrgensen est celui que nous avons utiliseacute Il est constitueacute
dune seringue preacutealablement placeacutee entre deux sacs de glace puis refroidie pendant la dureacutee
de lanalyse par un sachet de carboglace La longueur du capillaire en PEEK (125 microm de
diamegravetre interne) entre la sortie de la seringue et lentreacutee dans la source dionisation a eacuteteacute
minimiseacutee agrave environ 30 cm et le deacutebit utiliseacute est de 600 microLmin afin de minimiser leacutechange
inverse pendant le transfert de leacutechantillon entre la seringue refroidie et la source dionisation
(voir Chap IV) Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees pendant 10 minutes avec le mecircme eacutechantillon
et la stabiliteacute du marquage (qui doit resteacutee dans les 10 du marquage initial qui sert de
reacutefeacuterence) est suivie par lacquisition reacuteguliegravere de spectres MS
II22 Marquage des peptides de reacutefeacuterence
Parmi les quatre peptides que nous avons choisis deux ont deacutejagrave eacuteteacute eacutetudieacutes preacuteceacutedemment
par T Joslashrgensen (18-19 21) Notre premier objectif eacutetait donc de retrouver le mecircme nombre
de deuteacuteriums initial que ce quil avait trouveacute Les peptides ont eacuteteacute conccedilus de telle sorte que
85
seule lextreacutemiteacute C-terminale doit porter des deuteacuteriums au niveau du motif IIKIIK pour les
peptides P1 P2 et P3 En theacuteorie on sattend donc agrave cinq eacutechanges H D pour ces peptides
Les reacutesultats expeacuterimentaux montrent que lon natteint pas tout agrave fait cette valeur mais quune
moyenne de 42 D est obtenue comme lindique le Tab II 1 Cette perte de 08 D
sexplique par le fait que le marquage au niveau de lamide situeacute entre la derniegravere histidine et
la premiegravere isoleucine nest pas parfait et quil existe un meacutelange de populations de peptides
pour lesquels cest bien un D qui est agrave cette place et des peptides pour lesquels le D a eacuteteacute
remplaceacute par un H De la mecircme faccedilon on nobtient pas exactement 2 D pour le peptide P4
mais seulement 16 Les reacutesultats regroupeacutes dans le Tab II 1 montrent eacutegalement que la taille
et la nature de la partie du peptide qui eacutechange vite (seacuterie dhistidines ou enchainement
lysine-acide aspartique) nont pas dinfluence sur le marquage global du peptide
Tab II 1 Seacutequence des quatre peptides utiliseacutes dans cette eacutetude Nombre de deuteacuteriums
retenus au niveau des acides amineacutes de lrsquoextreacutemiteacute C-terminale dans les diffeacuterents eacutetats de
charge apregraves reacute-eacutechange de certains deuteacuteriums avec les hydrogegravenes du solvant protieacute dans
des conditions controcircleacutees (Chap V)
Peptide Seacutequence Masse
monoisotopique MH
1+ MH2
2+ MH3
3+ Reacutefeacuterence
P1 HHHHHHIIKIIK 15498975 -
43 39 (18 21)
P2 KKDDDDDDIIKIIK 16738956 44a
43 43 (19)
P3 KKDDDIIKIIK 13288148 40b
42 42
P4 KKDDDIIK 9745517 20 16 -
Potentiel de deacutesolvatation a entre 200 et 250 V et
b entre 150 et 250 V
II23 Influence des paramegravetres de source sur le laquo scrambling raquo
Afin deacutevaluer le taux de laquo scrambling raquo ducirc agrave la source eacutelectrospray les spectres ECD des
peptides ont eacuteteacute enregistreacutes en faisant varier les conditions expeacuterimentales dans la source
Comme les peptides sont construits pour ne porter des deuteacuteriums quagrave leur extreacutemiteacute C-
terminale les ions de type c (N-terminaux) fournissent des massifs isotopiques diagnostics
simples En labsence de laquo scrambling raquo les ions c de petite taille (comme lion c4 par
exemple) doivent conserver un massif isotopique identique agrave celui obtenu pour le peptide non
deuteacutereacute En revanche sil y a eu laquo scrambling raquo les enveloppes isotopiques seront deacuteplaceacutees
vers des rapports mz plus eacuteleveacutes
86
A titre dexemple la Fig II 1 montre le deacuteplacement du massif isotopique obtenu pour
lion c4 du peptide P2 lorsque lon augmente leacutenergie de deacutesolvatation
Fig II 1 Spectres ECD du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) (a) Spectre complet du peptide
non marqueacute (b) Massif isotopique de lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave partir du peptide
seacutelectivement marqueacute pour des valeurs de potentiel de deacutesolvatation eacuteleveacutee (180 V spectre du
haut) et basse (40 V spectre du milieu) Le spectre du bas montre lrsquoion fragment c4+
obtenu agrave
partir du peptide agrave lrsquoeacutequilibre (marquage homogegravene) agrave 100 V
Alors quagrave 40 V correspondant agrave une basse eacutenergie de deacutesolvatation le massif isotopique
obtenu est le mecircme que pour le peptide non deuteacutereacute on observe agrave 180 V un deacuteplacement tregraves
clair du massif vers les hauts mz signature de lincorporation de deuteacuteriums du cocircteacute N-
terminal du peptide et donc de laquo scrambling raquo
Par cette approche diffeacuterents paramegravetres de source ont eacuteteacute testeacutes le potentiel de
deacutesolvatation (laquo CapExit raquo sur notre instrument) la tempeacuterature du gaz de deacutesolvatation et le
temps daccumulation dans lhexapocircle Parmi ces trois paramegravetres seul le potentiel de
deacutesolvatation a un effet majeur sur le laquo scrambling raquo comme le montre leacutevolution du nombre
de deuteacuteriums dans les diffeacuterents ions c et z formeacutes agrave partir du peptide P2 (Fig II 2)
87
88
Fig II 2 Graphes du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment ECD obtenu agrave
partir de lrsquoion preacutecurseur trichargeacute du peptide KKDDDDDDIIKIIK (P2) seacutelectivement
marqueacute en fonction du potentiel de deacutesolvatation
Avec un potentiel de deacutesolvatation conduisant agrave tregraves peu de laquo scrambling raquo (40 V) on
nobserve pas deffet marquant de la tempeacuterature de la source (varieacutee de 50 agrave 140degC) ni du
temps daccumulation dans lhexapocircle (varieacute de 05 agrave 2 s) Les conditions optimales ayant eacuteteacute
obtenues pour limiter le laquo scrambling raquo nous navons pas chercheacute agrave faire varier dautres
paramegravetres qui par ailleurs ont eacutegalement une influence sur lefficaciteacute de transmission des
ions
Neacuteanmoins nous avons souhaiteacute comprendre un peu mieux le rocircle de leacutenergie de
deacutesolvatation et pour ce faire les spectres MS et MSMS en ECD ont eacuteteacute enregistreacutes Pour les
peptides P1-P3 les spectres ECD obtenus agrave partir dions preacutecurseurs trichargeacutes montrent des
courbes similaires agrave celles deacutecrites sur la Fig II 2 agrave bas potentiel de deacutesolvatation les
fragments contiennent un nombre de deuteacuteriums constant mais lorsque le potentiel est
augmenteacute on observe une incorporation de deuteacuteriums croissante pour les ions c et une perte
de deuteacuteriums pour les ions z Le seuil agrave partir duquel le laquo scrambling raquo commence est le
mecircme pour les diffeacuterents fragments dun mecircme peptide mais est diffeacuterent dun peptide agrave
lautre Pour le peptide P4 aucun fragment ECD na pu ecirctre observeacute agrave partir de lion
doublement chargeacute et lion triplement chargeacute nest apparemment pas formeacute
Ces reacutesultats sont tregraves proches de ce qui avait eacuteteacute observeacute par T Joslashrgensen sur le LTQ-FT
(18) et sur la trappe ionique (19) et ne semblent pas deacutependre de la taille et de la nature de la
partie du peptide qui preacutesente un eacutechange rapide
89
Un examen des spectres MS en fonction de leacutenergie de deacutesolvatation (Fig II 3) apporte
un eacuteclairage nouveau sur ce qui se passe dans la source qui est un pheacutenomegravene indeacutependant du
laquo scrambling raquo
Fig II 3 Intensiteacute des ions des diffeacuterents eacutetats de charge du peptide KKDDDIIKIIK (P3)
ainsi que celle de ses ions fragments geacuteneacutereacutes dans la source ionique en fonction du potentiel
de deacutesolvatation Lrsquointensiteacute des fragments correspond agrave la somme des intensiteacutes des ions
fragments b et y (a) Intensiteacutes absolues (b) Intensiteacutes relatives par rapport agrave lrsquointensiteacute
totale des ions
Tout dabord le type dion observeacute (simplement doublement ou triplement chargeacute) et
lapparition de fragments sont correacuteleacutes avec les potentiels de deacutesolvatation (Fig II 3) Comme
lindique la Fig II 3 les ions triplement chargeacutes sont largement favoriseacutes agrave bas potentiels de
deacutesolvatation et la fragmentation est quasi-inexistante Pour le peptide P3 on peut observer
une chute de lintensiteacute de lion triplement chargeacute au-delagrave de 160 V avec une augmentation
concomitante de lintensiteacute de lion moleacuteculaire doublement chargeacute et de celle des fragments
En intensiteacute absolue lion (1+) deacutecroicirct quant agrave lui lentement agrave partir de 200 V Ces reacutesultats
90
sexpliquent au moins en partie par le fait que lion (3+) est le premier agrave se fragmenter
lorsque lon augmente le potentiel de deacutesolvatation car chaque collision est trois fois plus
eacutenergeacutetique que pour son eacutequivalent monochargeacute
Si lon trace leacutevolution de la deuteacuteration de lion parent en fonction de leacutenergie de
deacutesolvatation un reacutesultat surprenant est obtenu (Fig II 4) le nombre de deuteacuteriums diminue
aux hauts potentiels de deacutesolvatation
Fig II 4 Nombre de deuteacuteriums dans les diffeacuterents eacutetats de charge de lrsquoion preacutecurseur en
fonction du potentiel de deacutesolvatation (a) Peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) (b) Peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK)
Ce reacutesultat explique le comportement observeacute pour les ions c111+
et c132+
aux hauts
potentiels de deacutesolvatation la diminution du nombre de deuteacuteriums pour ces ions fragments
est correacuteleacutee agrave celle de lion preacutecurseur Par ailleurs le nombre de deuteacuteriums perdu semble lieacute
(a)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
50
0 50 100 150 200 250 300
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M 2+
M 3+
M 4+
(b)
30
32
34
36
38
40
42
44
46
48
100 150 200 250 300 350
o
f d
eu
teri
um
Desolvation potential (V)
M3+
M2+
M1+
91
agrave la fois agrave la nature et agrave leacutetat de charge du peptide Par exemple le peptide P2 trois fois
chargeacute perd 08 D alors que le peptide P3 avec le mecircme eacutetat de charge perd au moins 2 D
Cette perte de deuteacuteriums ne peut sexpliquer que par lintervention dune autre moleacutecule
posseacutedant des hydrogegravenes eacutechangeables avec laquelle un eacutechange inverse D H peut avoir
lieu Cette moleacutecule peut par exemple provenir du solvant de spray utiliseacute pour les
expeacuteriences eau meacutethanol acide aceacutetique En effet il est possible deacutemettre lhypothegravese que
des reacuteactions ionmoleacutecule dans la source dans laquelle la pression est importante conduisent
agrave cet eacutechange dhydrogegravenes et de deuteacuteriums Le fait que P1 ne subisse aucune perte de
deuteacuterium permet mecircme de postuler que les acides amineacutes responsables de cet eacutechange sont
les acides aspartiques reacutesidus que lon retrouve dans tous les peptides eacutetudieacutes agrave lexception de
P1 Compte tenu du faible nombre de peptides eacutetudieacutes il est difficile de conclure sur un
meacutecanisme geacuteneacuteral permettant dexpliquer cet eacutechange en phase gazeuse mais le meacutecanisme
de flip-flop deacutecrit par Beauchamp et al (28-29) pourrait expliquer les reacutesultats observeacutes
Il est inteacuteressant de noter que les pheacutenomegravenes deacutecrits preacuteceacutedemment (apparition de
fragments dans la source laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums) apparaissent tous agrave une limite
preacutecise (mais diffeacuterente) de potentiel de deacutesolvatation (Tab II 2) Comme le potentiel de
deacutesolvatation est directement lieacute agrave leacutenergie interne des ions produits par la source
eacutelectrospray (26) il est possible dutiliser la valeur des seuils observeacutes comme indication de
leacutenergie requise pour chaque pheacutenomegravene Bien que les seuils deacutependent du peptide (et de son
eacutetat de charge) il est possible deacutetablir un ordre dapparition de chaque pheacutenomegravene car il est
conserveacute dune seacutequence et dun eacutetat de charge agrave lautre ainsi le laquo scrambling raquo apparaicirct en
premier avec un seuil assez bas deacutenergie de deacutesolvatation suivi dune perte du marquage et
enfin de lapparition de fragments aux plus hautes eacutenergies
Tab II 2 Valeurs de potentiel de deacutesolvatation (en V) pour lrsquoapparition de chaque
pheacutenomegravene observeacute laquo scrambling raquo perte de deuteacuteriums et fragmentation dans la source
Peptide
Desolvation potential (V) at onset
Scrambling Loss of D atom
Fragmentation
from 3+ from 2+
P1 100
- - 150
P2 110 160 - 170
P3 100 110 180 140
P4 - - - 120
92
Lordre des deux premiers pheacutenomegravenes indique que les hydrogegravenes damide ne sont pas
directement eacutechangeables avec ceux des moleacutecules de solvant vaporiseacutees Deux meacutecanismes
diffeacuterents peuvent alors ecirctre envisageacutes soit un eacutechange direct en phase gazeuse dun atome
dhydrogegravene du solvant avec un deuteacuterium porteacute par un azote dune des liaisons peptidiques
ce qui implique une eacutenergie dactivation importante soit un eacutechange agrave un autre site labile
apregraves transfert du deuteacuterium Comme la courbe du deacutemarquage est tregraves proche de celle du
laquo scrambling raquo deacutetermineacutee par les expeacuteriences ECD on peut supposer que la reacuteaction a lieu
en deux eacutetapes reacutearrangement intramoleacuteculaire dans le peptide conduisant agrave eacutechanger les
deuteacuteriums damide avec les hydrogegravenes carboxyliques des acides aspartiques puis reacuteaction
ionmoleacutecule avec le solvant en phase gazeuse En absence de ces acides carboxyliques relais
(cas de P1) seul le laquo scrambling raquo peut avoir lieu Ce meacutecanisme ne reacutepond toutefois pas agrave
une question qui est la suivante pourquoi dans le cas de P2 et pas de P3 le deacutemarquage
conduit-il agrave un eacutechange limiteacute agrave 08 D alors qu‟on devrait s‟attendre agrave suivre la courbe du
laquo scrambling raquo Si lon revient au scheacutema de la source dionisation de linstrument utiliseacute il
convient de se souvenir quapregraves leur deacutesolvatation dans le capillaire de transfert chauffeacute les
ions sont stockeacutes pendant une seconde environ dans un hexapocircle dans lequel regravegne une
pression assez importante (10-6
mbar environ) Ainsi un eacutechange HD partiel semble indiquer
que les deux pheacutenomegravenes observeacutes ont lieu dans deux reacutegions diffeacuterentes de linstrument le
reacutearrangement aurait lieu dans linterface entre le capillaire et le premier laquo skimmer raquo qui est
une reacutegion agrave haute pression et soumise agrave un potentiel eacutelectrique important tandis que les
reacuteactions ionmoleacutecule auraient plutocirct lieu dans lhexapocircle Ainsi si tous les sites labiles du
peptide ne participent pas aux reacuteactions ionmoleacutecule avec leur environnement gazeux (ce qui
est le cas dans lhypothegravese ougrave les acides aspartiques sont lieacutes speacutecifiquement agrave cet eacutechange) le
reacutearrangement conduirait agrave un nombre fini de sites eacutechangeables portant un atome de
deuteacuterium et ceux situeacutes sur dautres sites ne pourraient donc pas participer au deacutemarquage
II3 Conclusions
II31 Conclusion sur lrsquoAPEX III
Lobjectif initial de ce travail eacutetait de deacuteterminer quels paramegravetres expeacuterimentaux de la
source eacutelectrospray Apollo I de lAPEX III devaient ecirctre optimiseacutes pour minimiser le
reacutearrangement intramoleacuteculaire des hydrogegravenes et des deuteacuteriums qui a lieu en source Parmi
les diffeacuterents paramegravetres testeacutes les reacutesultats preacutesenteacutes preacuteceacutedemment montrent que cest le
93
potentiel de deacutesolvatation qui est le plus critique Gracircce agrave lutilisation de lECD sur des
peptides seacutelectivement marqueacutes nous avons ainsi pu montrer que le potentiel de deacutesolvatation
doit ecirctre maintenu agrave une valeur leacutegegraverement infeacuterieure agrave celle conduisant agrave un maximum
dintensiteacute pour les ions formeacutes soit entre 80 et 110 V pour eacuteviter le laquo scrambling raquo Cette
valeur est sensiblement la mecircme pour tous les peptides que nous avons eacutetudieacutes
Les reacutesultats obtenus sur les peptides seacutelectivement marqueacutes montrent clairement quil faut
faire extrecircmement attention agrave optimiser ce paramegravetre avant dutiliser lECD ou lETD pour
localiser des deuteacuteriums dans des peptides ou des proteacuteines qui ont eacuteteacute marqueacutes et pouvoir
tirer des conclusions sur la preacutesence de zones structureacutees ou non Utiliser des peptides
seacutelectivement marqueacutes pour deacuteterminer les conditions expeacuterimentales de source propres agrave
reacutealiser lanalyse de peptides ou de proteacuteines deuteacutereacutes (conditions qui deacutependent de
linstrument utiliseacute) devrait ainsi ecirctre leacutetape preacuteliminaire agrave toute expeacuterience HDX-MSMS
Au cours de ce travail nous avons eacutegalement mis en eacutevidence un pheacutenomegravene de reacuteactions
ionmoleacutecule dans la source qui sont potentiellement agrave lorigine deacutechanges entre les
deuteacuteriums preacutesents sur la seacutequence peptidique et des hydrogegravenes issus fort probablement de
moleacutecules de solvant en phase gazeuse Il est apparu au cours de notre travail que ce
pheacutenomegravene eacutetait particuliegraverement marqueacute pour les peptides portant des acides aspartiques par
rapport agrave ceux portant des histidines Ce pheacutenomegravene eacutetant a priori baseacute sur une premiegravere
eacutetape qui est leacutechange entre un deuteacuterium preacutesent sur une liaison amide et un hydrogegravene
carboxylique de la chaicircne lateacuterale des Asp il peut ecirctre reacuteduit par un reacuteglage approprieacute des
paramegravetres de source (diminution de leacutenergie de deacutesolvatation)
II32 Autres instruments FT-ICR
Nous avons proceacutedeacute agrave l‟laquo upgrade raquo de nos instruments agrave deux reprises (APEX III gt
APEX-Q en janvier 2011 et APEX-Q gt SolariX en avril 2012) De la mecircme maniegravere que pour
l‟APEX III nous avons pu deacuteterminer pour l‟APEX-Q et le SolariX le paramegravetre ou les
paramegravetres critiques qu‟il faut optimiser pour limiter le laquo scrambling raquo En effet agrave chaque
changement ou modification d‟instrument une reacute-optimisation de l‟ensemble des paramegravetres
entre la source et la cellule est requise pour eacuteviter un eacutechauffement des ions lors de leur
formation ou de leur transfert Les reacutesultats sont reacutesumeacutes dans le tableau ci-apregraves (Tab II 3)
94
Tab II 3 Paramegravetre(s) critique(s) agrave optimiser pour limiter le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
en fonction de lrsquoinstrument utiliseacute
APEX III Tension agrave la sortie du capillaire de source
(Potentiel de deacutesolvatation ou laquo CapExit)
lt 80 V
APEX-Q
APEX-Qe
Tension dans la cellule de collision
(laquo CollisionVoltage raquo)
gt 0 V
(3-5 V)
SolariX Tension du premier eacutecorceur (SK1)
Conditions de la cellule de collision
collision activeacutee
tension de collision en entreacutee
lt 50 V
Non
lt 2 V
Fig II 5 Nombre de deuteacuteriums dans lrsquoion preacutecurseur triplement chargeacute du peptide P2
(KKDDDDDDIIKIIK) et dans les fragments c2 c6 et z6 en fonction du potentiel du premier
eacutecorceur
A titre d‟illustration la Fig II 5 reprend les reacutesultats obtenus sur le SolariX avec le
peptide P1 en faisant varier la tension du premier eacutecorceur (laquo skimmer raquo) SK1 montrant une
valeur optimale vers 40 V On notera par contre la preacutesence d‟un taux de deuteacuteration non nul
sur les fragments c2 et c6 degraves les basses tensions Il faut noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un ion preacutecurseur triplement chargeacute preacutesentant un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
que ce qui est attendu
0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60 70
o
f d
eu
teri
um
SK1 (V)
C2 C6 Z6 Parent M3+
95
Les deux versions successives (APEX-Q et SolariX) preacutesentent une eacutevolution majeure qui
est l‟introduction d‟une cellule de collision sur le chemin optique des ions (Annexe Fig A 4
et Fig A 6) En conseacutequence on observe que cette seconde reacutegion agrave pression de gaz eacuteleveacutee
ajoute une seconde reacutegion susceptible de conduire agrave un deacutepocirct d‟eacutenergie dans les ions et par
conseacutequent agrave du laquo scrambling raquo Les paramegravetres optimiseacutes concernent par conseacutequent ces
deux reacutegions L‟ajout d‟entonnoirs agrave ions (laquo ion funnels raquo) au premier eacutetage de deacutesolvatation
semble rendre la tension en sortie de capillaire (laquo CapExit raquo) nettement moins critique sans
doute parce que les distances sont plus grandes (et donc le champ eacutelectrique plus faible) Par
contre sur le SolariX de l‟eacutenergie peut ecirctre deacuteposeacutee entre le premier eacutecorceur (SK1) et le
second entonnoir qui joue un rocircle critique dans le deacutepocirct d‟eacutenergie (Annexe Fig A 6)
En conclusion dans cette partie nous avons utiliseacute un jeu de peptides speacutecifiquement
marqueacutes par des deuteacuteriums pour valider notre instrumentation et trouver les paramegravetres
optimaux par rapport au pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo ou meacutelange des deuteacuteriums lors des
eacutetapes de transfert en phase gazeuse et d‟introduction dans le vide du spectromegravetre de masse
Nous avons eacutegalement valideacute au passage que l‟ECD permet effectivement de mesurer des
fragments donc le nombre de deuteacuteriums correspond agrave celui attendu apregraves deacutemarquage seacutelectif
de peptides modegraveles Dans la partie suivante nous allons transposer ces reacutesultats agrave un systegraveme
reacuteel
96
II4 Bibliographie
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98
99
Chapitre III Deacuteveloppement de
lrsquoapproche HDX top-down ECD
100
Chapitre III Deacuteveloppement de lrsquoapproche HDX top-down ECD 99
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD 101
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo 101 III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo 102
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo 106
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX 106 III211 Proteacuteines d‟eacutetude 106 III212 Protocole d‟analyse HDXMS 107 III213 Instruments utiliseacutes108
III22 Fragmentation par ECD 109 III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3 109
III2211 Spectre de masse 109 III2212 Reacutesultats obtenus en ECD 109 III2213 Reacutesultats en HDXECD 113 III2214 Analyse des donneacutees 115
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ121 III2221 Optimisation du protocole d‟analyse 121 III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD 123
III23 Fragmentation par ETD 127 III231 Spectre de masse 127 III232 Reacutesultats obtenus en ETD 128 III233 Reacutesultats en HDXETD 129 III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats d‟ECD131 III235 Conclusion 134
III24 Fragmentation par CID 135 III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 135
III2411 Spectres de masse 135 III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID 136
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines 139
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse 142
III4 Conclusion 147
III5 Bibliographie 149
101
III1 Pourquoi faire une analyse laquo top-down raquo des eacutechanges HD
III11 Problegravemes et limitations de lrsquoapproche laquo bottom-up raquo
Comme nous l‟avons vu dans le premier chapitre de ce manuscrit (voir Chap I) les
eacutechanges HD coupleacutes agrave la spectromeacutetrie de masse (HDXMS) permettent d‟obtenir des
informations sur l‟organisation structurale des proteacuteines L‟approche classique dite
laquo bottom-up raquo (Fig III 1) repose sur une digestion enzymatique de la proteacuteine d‟inteacuterecirct apregraves
marquage afin de deacuteterminer la localisation des deuteacuteriums incorporeacutes Pour cela les peptides
issus de la digestion sont analyseacutes par spectromeacutetrie de masse une eacutetape preacutealable de
seacuteparation par chromatographie liquide eacutetant le plus souvent requise Les eacutetapes de digestion
enzymatique et de seacuteparation chromatographique qui se deacuteroulent en solution doivent ecirctre
reacutealiseacutees dans les conditions de conservation du marquage Des cineacutetiques deacutechange HD
peuvent alors ecirctre calculeacutees pour chaque peptide en mesurant le deacuteplacement de leur masse
dans les spectres Ces cineacutetiques sont correacuteleacutees dune part agrave laccessibiliteacute au solvant et dautre
part agrave la structure locale de la proteacuteine
Fig III 1 Scheacutema repreacutesentant les eacutetapes des approches laquo bottom-up raquo et laquo top-down raquo dans
des eacutetudes en HDXMS Le segment en bleu correspond agrave la proteacuteine hydrogeacuteneacutee tandis que
les portions en rouge correspondent aux zones de la proteacuteine qui ont eacuteteacute deuteacutereacutees Les
flegraveches vertes repreacutesentent le moment de la fragmentation en phase gazeuse
Cependant cette approche souffre de deux limitations majeures La premiegravere est l‟eacutechange
inverse entre les deuteacuteriums et les hydrogegravenes qui a lieu en solution lors des eacutetapes de
digestion et de seacuteparation avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Bien que le laquo back-
exchange raquo puisse ecirctre minimiseacute il ne peut ecirctre eacuteviteacute (1) La seconde limitation est la
reacutesolution qui deacutepend directement de la taille des peptides issus de la fragmentation
enzymatique par la pepsine et qui est typiquement de lordre de cinq agrave dix acides amineacutes
102
Une possibiliteacute pour ameacuteliorer la reacutesolution est de combiner diffeacuterentes enzymes Une
autre est de fragmenter les peptides obtenus dans le spectromegravetre de masse pour localiser
preacuteciseacutement les deuteacuteriums (2) Il a neacuteanmoins eacuteteacute montreacute que les techniques classiques par
chauffage lent (Collision Induced Dissociation CID) ne peuvent ecirctre utiliseacutees car une
migration intramoleacuteculaire et par conseacutequent un meacutelange des hydrogegravenes et des deuteacuteriums a
lieu dans la seacutequence avant la rupture des liaisons peptidiques ce qui fait perdre linformation
de leur localisation (Fig III 2) (3) En revanche comme nous l‟avons montreacute dans le chapitre
preacuteceacutedent (voir Chap II) lutilisation de meacutethodes de fragmentation baseacutees sur la capture ou
le transfert dun eacutelectron (Electron Capture Dissociation ECD ou Electron Transfer
Dissociation ETD) permet de reacuteduire consideacuterablement ce pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo De
plus linteacuterecirct de ces modes de fragmentation alternatifs est quils peuvent ecirctre utiliseacutes aussi
bien dans une approche laquo bottom-up raquo sur les peptides proteacuteolytiques marqueacutes (4-5) que
directement sur la proteacuteine deuteacutereacutee dans une approche dite laquo top-down raquo Dans ce dernier
cas l‟incorporation des deuteacuteriums peut alors ecirctre mesureacutee pour chaque ion fragment comme
nous l‟avons fait pour les peptides modegraveles
Avec redistribution
NH2 COOHNH2
COOH
NH2COOH
CID ETDECD
NH2
COOH
by ionscz ions
D D DDD
H HH
H
NH2
COOH
Sans redistributionActivation
Fragmentation
Fig III 2 Illustration du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo qui est freacutequent lors de la
fragmentation par activation collisionnelle (CID) Les meacutethodes drsquoactivation par les eacutelectrons
(ECD ETD) ne conduisent pas agrave de la redistribution quand les conditions sont optimales
III12 Etat de lrsquoart de la strateacutegie laquo top-down raquo
Dans une approche laquo top-down raquo la proteacuteine entiegravere est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse (Fig III 1) On s‟affranchit alors de l‟eacutetape de digestion proteacuteolytique De cette
maniegravere une partie du laquo back-exchange raquo qui a lieu en solution notamment lors de la
103
digestion enzymatique de la proteacuteine deuteacutereacutee (1) est eacutelimineacutee De plus dans la mesure ougrave
lobjet agrave analyser nest pas coupeacute en de nombreux morceaux en solution lutilisation dune
seacuteparation chromatographique n‟est pas requise ce qui permet eacutegalement de s‟affranchir de
l‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape L‟approche laquo top-down raquo est geacuteneacuteralement combineacutee agrave
une fragmentation par ECD ou ETD Comme nous l‟avons montreacute dans les chapitres
preacuteceacutedents (voir Chap I et II) l‟utilisation de ces techniques de dissociation par capture ou
transfert d‟eacutelectron permet de limiter au maximum le laquo scrambling raquo qui peut avoir lieu en
phase gazeuse au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem Elles sont donc
particuliegraverement bien adapteacutees pour deacuteterminer la position preacutecise des deuteacuteriums incorporeacutes
le long de la seacutequence polypeptidique
Des reacutesultats obtenus tregraves reacutecemment par diffeacuterents groupes utilisant aussi bien l‟ETD que
l‟ECD sur des proteacuteines modegraveles ont ainsi montreacute que ces techniques de dissociation utiliseacutees
en combinaison avec les eacutechanges HD permettent danalyser la structure native des proteacuteines
(6) ou encore de caracteacuteriser des espegraveces transitoires ce qui est essentiel pour la
compreacutehension des meacutecanismes de repliement (7) Il a mecircme eacuteteacute montreacute au cours de ces
eacutetudes qu‟une reacutesolution agrave lrsquoacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue Les premiers reacutesultats
provenant d‟une association entre eacutechanges HD et analyse laquo top-down raquo ont eacuteteacute obtenus en
2008 par l‟eacutequipe de Lars Konermann au Canada sur une petite proteacuteine modegravele de 86 kDa
l‟ubiquitine (8) Il montre dans son article que les informations de structure quil obtient sont
tregraves proches de celles issues de la RMN (Fig III 3)
Fig III 3 Symboles pleins taux de deuteacuteration des ions fragments ECD de lrsquoubiquitine apregraves
30 min incubation dans 95 de D2O agrave 22degC Symboles vides taux de deuteacuteration obtenus
par RMN dans les mecircmes conditions HDX
104
Dans une eacutetude plus reacutecente encore Igor Kaltashov a preacutesenteacute des reacutesultats tregraves
prometteurs sur une proteacuteine de 18 kDa en utilisant un spectromegravetre de masse FT-ICR
(Bruker) sur lequel une source d‟ionisation chimique permettant de faire des expeacuteriences ETD
a eacuteteacute installeacutee (9) Il a eacutegalement montreacute tregraves reacutecemment en travaillant sur la mecircme proteacuteine
modegravele que la fragmentation par activation collisionnelle (CID) pouvait ecirctre combineacutee agrave une
approche laquo top-down raquo dans des eacutetudes HDX indiquant que le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo
pouvait ecirctre controcircleacute lorsque des eacutetats de charge tregraves eacuteleveacutes eacutetaient choisis pour la
fragmentation (10) Bien que les meacutethodes d‟activation par les eacutelectrons pour la fragmentation
de peptides (11-12) et de petites proteacuteines (6 8 13) se soient reacuteveacuteleacutees tregraves encourageantes
pour augmenter la reacutesolution des eacutetudes en HDX-MSMS elles ne fournissent pas une
couverture de seacutequence complegravete en particulier pour les gros polypeptides C‟est pour cette
raison qu‟il serait inteacuteressant de pouvoir utiliser en compleacutement les reacutesultats de la
fragmentation par CID qui conduit agrave des ions fragments souvent compleacutementaires agrave ceux
obtenus par dissociation ECD ou ETD Ainsi la possibiliteacute d‟utiliser les meacutethodes
d‟activation collisionnelle en plus des techniques d‟activation par les eacutelectrons dans les eacutetudes
laquo top-down raquo HDX conduirait agrave une reacutesolution spatiale significativement ameacutelioreacutee
permettant de sonder la conformation et la dynamique des proteacuteines Une autre faccedilon
d‟augmenter la reacutesolution est l‟utilisation d‟un reacuteactif tel que l‟alcool m-nitrobenzylique (m-
NBA) qui augmente leacutetat de charge des ions proteacuteiques en provoquant leur rapide
deacutenaturation lors du processus d‟ionisation par ESI Il en reacutesulterait le deacutepliement de la
proteacuteine dans la goutte eacutelectrospray mais sans l‟apparition de modifications significatives de
sa structure par rapport agrave celle de la solution initiale permettant d‟ameacuteliorer l‟efficaciteacute de
fragmentation et donc la couverture de seacutequence par ECD ou ETD Ainsi dans une eacutetude
reacutecente Evan Williams (14) a montreacute que lajout de m-NBA dans le spray utiliseacute pour ioniser
lubiquitine permet de former des ions de plus hauts eacutetats de charge dont la mobiliteacute ionique a
reacuteveacuteleacute quils eacutetaient comme attendu plus deacuteplieacutes que leurs homologues de plus bas eacutetat de
charge Ainsi comme lefficaciteacute de la fragmentation ECDETD augmente avec leacutetat de
charge du preacutecurseur Williams a pu montrer dans le cas de lubiquitine quune meilleure
couverture de seacutequence pouvait ecirctre obtenue simplement par lajout de m-NBA Une autre
possibiliteacute est de combiner les reacutesultats obtenus pour diffeacuterents eacutetats de charge d‟ions
preacutecurseurs ce qui peut ameacuteliorer un peu plus la reacutesolution spatiale des expeacuteriences ETD
Ceci peut devenir d‟autant plus important que le systegraveme proteacuteique est grand dans le cas ougrave
typiquement la fragmentation par ETD est limiteacutee
105
Les diffeacuterents exemples reacutecents deacutecrits preacuteceacutedemment montrent que les approches laquo top-
down raquo ont fait l‟objet de deacuteveloppements importants dans le contexte des eacutechanges HD ces
derniegraveres anneacutees Neacuteanmoins jusquagrave maintenant seules des proteacuteines modegraveles stables et
disponibles en quantiteacute importante ont eacuteteacute lobjet de ces deacuteveloppements Dans ce contexte
lobjet de ma thegravese a eacuteteacute de poursuivre les eacutetudes reacutealiseacutees au laboratoire dans lobjectif de
mettre au point une meacutethodologie robuste combinant eacutechanges HD et approche laquo top-
down raquo pour des complexes proteacuteiques reacuteels en collaboration avec le laboratoire de
Biochimie de lEacutecole Polytechnique Notre objectif est donc (i) de disposer dune meacutethode
permettant de localiser rapidement et preacuteciseacutement les deuteacuteriums dans la seacutequence
polypeptidique et deacuteterminer ainsi des cineacutetiques deacutechange pour chaque acide amineacute (ii) de
pouvoir appliquer cette meacutethodologie agrave leacutetude structurale des complexes d‟initiation de la
traduction La difficulteacute ici reacuteside dans le fait qu‟il s‟agit d‟eacutechantillons biologiques reacuteels et
de grande taille Cela implique des eacutetapes additionnelles dans le protocole de preacuteparation et
d‟analyse des eacutechantillons et donc des preacutecautions suppleacutementaires agrave prendre vis-agrave-vis de la
conservation du marquage Notre eacutetude HDXMS preacuteliminaire qui a eacuteteacute meneacutee sur des
peptides de reacutefeacuterence et qui a eacuteteacute preacutesenteacutee dans le chapitre preacuteceacutedent (voir Chap II) a
montreacute que l‟utilisation de meacutethodes de fragmentation telle que la dissociation par capture
d‟eacutelectron (ECD) eacutetait adapteacutee pour mesurer les taux d‟eacutechanges HD pour chaque acide
amineacute Pour cela une optimisation fine des conditions de source et des paramegravetres
instrumentaux a eacuteteacute requise preacutealablement agrave l‟analyse pour reacuteduire au maximum le
laquo scrambling raquo pendant les processus de deacutesolvatation et de transfert des ions en phase
gazeuse Nous avons dans ce troisiegraveme chapitre reacuteutiliseacute ces paramegravetres optimiseacutes pour
l‟analyse laquo top-down raquo de nos eacutechantillons proteacuteiques Dans un premier temps cette partie se
focalisera sur l‟eacutetude laquo top-down raquo HDX avec activation par ECD qui est la technique
d‟activation pour laquelle le plus de reacutesultats ont eacuteteacute obtenus Ensuite pour mieux
comprendre le rocircle des meacutethodes d‟activation sur les migrations d‟hydrogegravene le mecircme
systegraveme a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacute avec d‟autres modes d‟activation (ETD et CID)
106
III2 Comparaison des diffeacuterentes techniques de fragmentation
lors drsquoeacutetudes HDXMS par approche laquo top-down raquo
III21 Deacuteveloppement de lapproche laquo top-down raquo HDX
III211 Proteacuteines drsquoeacutetude
Nous avons travailleacute sur le complexe proteacuteique aIF2 (archaeal Initiation Factor 2) de
Sulfolobus solfataricus (Fig III 4) qui est un des complexes responsables de l‟initiation de
la traduction chez les archeacutees Son rocircle est de recruter l‟ARNt meacutethionyleacute lieacute agrave l‟ARNm au
niveau de la petite sous-uniteacute du ribosome Nous savons deacutejagrave par des donneacutees
cristallographiques qu‟il est constitueacute de trois sous-uniteacutes α β et γ La sous-uniteacute γ (45
kDa) qui constitue la proteacuteine centrale du complexe est connue pour interagir avec les deux
autres sous-uniteacutes α (30 kDa) et β (15 kDa) au sein d‟aIF2 Afin d‟obtenir des informations
structurales sur l‟organisation de ce complexe nous avons deacuteveloppeacute notre meacutethodologie agrave
partir de l‟analyse de la proteacuteine aIF2α3 de 10 kDa qui est une version tronqueacutee de la sous-
uniteacute α du complexe aIF2 mais qui contient le site d‟interaction avec γ Ce travail a eacuteteacute initieacute
lors de la thegravese de M Duchateau (15) pendant laquelle l‟eacutetude de la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute
reacutealiseacutee par HDXECD sur l‟APEX III Dans le cadre du travail actuel nous avons eacutetendu
notre eacutetude au sous-complexe aIF2α3γ et compareacute les diffeacuterents modes de fragmentation en
utilisant d‟autres spectromegravetres de masse
Fig III 4 Scheacutema du complexe heacuteteacuterotrimeacuterique aIF2αβγ
107
III212 Protocole drsquoanalyse HDXMS
L‟analyse d‟eacutechantillons biologiques reacuteels a neacutecessiteacute une optimisation du protocole mis au
point pour les peptides En effet ces eacutechantillons proteacuteiques preacutesentent des inconveacutenients
majeurs qui sont les suivants
- ils ne sont pas disponibles en grande quantiteacute
- le maintien de leur structure native neacutecessite des concentrations importantes de sels non
volatils
- ils se deacutegradent rapidement agrave tempeacuterature ambiante
L‟ensemble des eacutetapes du protocole allant des conditions de l‟eacutechange en solution (pH
tempeacuterature tampons dessalage) agrave la fragmentation par ECD a donc eacuteteacute minutieusement
optimiseacute (Fig III 5) pour tenir compte de ces limitations Au deacutebut de l‟expeacuterience la
proteacuteine aIF2α3 est dans son eacutetat natif En effet elle est conserveacutee dans son tampon de
purification qui est riche en sels (chlorure de sodium) et qui lui permet ainsi de garder sa
conformation native La premiegravere eacutetape de notre protocole qui a consisteacute agrave initier la reacuteaction
d‟eacutechange HD a eacuteteacute de diluer aIF2α3 dans un tampon deuteacutereacute riche eacutegalement en sels
(solution de NaCl agrave 330 mM dans D2O) afin de ne pas deacutenaturer la proteacuteine et donc de sonder
sa conformation active Une incubation du meacutelange agrave 37degC sous agitation est reacutealiseacutee pendant
diffeacuterents temps agrave l‟issu desquels la reacuteaction de marquage est bloqueacutee Cette eacutetape d‟arrecirct de
la reacuteaction d‟eacutechange est effectueacutee par l‟addition d‟une solution aqueuse (H2O) acide (pH
final de 25) et glaceacutee (agrave 0degC) Etant donneacute que les fortes concentrations en sels non volatils
ne sont absolument pas compatibles avec une ionisation par eacutelectrospray nous avons ducirc
ajouter et optimiser une eacutetape de dessalage dans les conditions de conservation du marquage
Apregraves cette eacutetape de dessalage dont la dureacutee totale a eacuteteacute optimiseacutee agrave seulement une minute
(15) la proteacuteine deuteacutereacutee est precircte pour l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Elle est injecteacutee
par le systegraveme de seringue refroidie ioniseacutee par eacutelectrospray et fragmenteacutee par ECD dans la
cellule ICR
108
Alpha3 dans des conditions natives Arrecirct de la reacuteaction
H2O pH 25 et 0degC
Dilution dans D2O
NaCl 330 mM
Incubation
Temps variables
1 Dessalage
2 Eacutelution dans H2OACNAF2Alpha3 deuteacutereacutee dans le solvant pour ESI
ECD
Fig III 5 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude drsquoaIF2α3 en HDXMS par
analyse laquo top-down raquo
Pour eacuteviter l‟eacutetape de dessalage et optimiser encore plus le protocole nous avons fait de
nombreux essais pour essayer de remplacer les sels non volatils par des sels volatils
compatibles avec une analyse par ESI mais dans tous les cas la proteacuteine a preacutecipiteacute ou sest
deacutegradeacutee
III213 Instruments utiliseacutes
Les fragmentations par ECD ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur des spectromegravetres de masse de type FT-
ICR Les premiegraveres expeacuteriences ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur un spectromegravetre APEX III qui nest pas
eacutequipeacute dun quadripocircle de seacutelection avant la cellule ICR puis sur un APEX-Qe disponible agrave
Orsay (P Maicirctre Laboratoire de Chimie Physique) Les diffeacuterences majeures entre les deux
instruments sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
Les expeacuteriences ETD ont quant agrave elles eacuteteacute effectueacutees sur un instrument LTQ Orbitrap
Velos (Thermo Scientific) en collaboration avec la plateforme proteacuteomique de Paris 7 dirigeacutee
par Jean-Michel Camadro
Les expeacuteriences CID ont eacuteteacute obtenues sur un spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
(Waters) installeacute au laboratoire DCMR
109
III22 Fragmentation par ECD
III221 Analyse de la sous-uniteacute aIF2α3
III2211 Spectre de masse
Le spectre de masse d‟aIF2α3 dont la masse monoisotopique est 10422985 Da a eacuteteacute
obtenu apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes (Fig III 6)
aiF2alpha3ss1 +MS
0
2
4
6
8
6x10
Intens
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+6H]6+
mz
Intensx106
Fig III 6 Spectre MS drsquoaIF2α3 enregistreacute sur notre instrument FT-ICR APEX III
III2212 Reacutesultats obtenus en ECD
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX III du DCMR
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres pour l‟ECD afin d‟obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour cette proteacuteine de 10 kDa sans eacutechange HD
Pour cela nous avons tout d‟abord utiliseacute une autre petite proteacuteine l‟ubiquitine (86 kDa)
pour optimiser lensemble des paramegravetres expeacuterimentaux
110
Lors de la thegravese de M Duchateau (15) notre eacutequipe a montreacute que la fragmentation par
ECD d‟aIF2α3 eacutetait beaucoup plus efficace sans seacutelection d‟un eacutetat de charge Nous avons
donc proceacutedeacute de la mecircme maniegravere
Pour l‟ubiquitine les spectres ECD les plus informatifs ont eacuteteacute obtenus avec une cathode
chauffeacutee agrave 16 A et une irradiation par des eacutelectrons de 09 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 80
ms Nous utilisons eacutegalement la technique de pieacutegeage dynamique des ions dans la cellule
afin de maximiser la quantiteacute d‟ions accumuleacutes avant la fragmentation ECD En effet la
qualiteacute des spectres ECD deacutepend en grande partie de lintensiteacute des ions preacutecurseurs et il
existe un veacuteritable seuil pour le nombre dions pour obtenir des spectres ECD de qualiteacute Le
pourcentage de couverture de seacutequence ainsi obtenu est de 68 Pour obtenir un reacutesultat
similaire avec aIF2α3 l‟eacutenergie cineacutetique des eacutelectrons a eacuteteacute augmenteacutee jusqu‟agrave 2 eV
Les proteacuteines marqueacutees sont introduites dans le spectromegravetre de masse par le systegraveme de
seringue refroidie qui est deacutecrit dans le Chap IV Afin de minimiser l‟eacutechange inverse en
solution l‟analyse ne doit pas exceacuteder dix minutes Dans ce laps de temps relativement court
deux cents scans sont accumuleacutes par spectre ECD
L‟analyse du spectre ECD d‟aIF2α3 reacutealiseacute sans seacutelection d‟eacutetat de charge permet
l‟identification d‟un total de 83 ions fragments correspondant agrave 39 ions c et 44 ions z dont 18
paires d‟ions compleacutementaires Cela se traduit par un tregraves bon pourcentage de couverture de
seacutequence de 706 (Fig III 7) L‟identification des ions fragments b et y permet d‟ameacuteliorer
leacutegegraverement la couverture de seacutequence en augmentant le pourcentage de 55 (1 ion b et 4 ions
y suppleacutementaires pour lesquels il n‟y a pas d‟ions c et z correspondants) atteignant donc la
valeur de 761
111
aIF2a3_noHD_ECD_000008d +MS
0
1
2
3
4
5
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
~ ~
~
~
~
~
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+ [M+8H]8+
[M+7H]7+
~[M+6H]6+
250 300 350 400 450 500 550 mz0
1
2
3
4
5
6
6x10
Intens
+MS
z2+
z3+
z4+ z5
+
c2+
c3+
c4+
Intens
mz
Fig III 7 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX III et sa couverture de seacutequence associeacutee Un agrandissement de la reacutegion mz
250-550 a eacuteteacute ajouteacute montrant la complexiteacute du spectre
Des problegravemes de stabiliteacute du signal et de sensibiliteacute sont apparus au cours de ces
expeacuteriences ECD il arrivait freacutequemment que le taux de fragmentation diminue brutalement
sans raison apparente au cours d‟une cineacutetique d‟eacutechange Pour pouvoir poursuivre nos
expeacuteriences nous avons deacutecideacute de continuer nos travaux sur l‟APEX-Qe accessible agrave
l‟Universiteacute Paris-Sud Une reacute-optimisation des paramegravetres pour l‟ECD a donc eacuteteacute neacutecessaire
car cet instrument nest pas le mecircme que celui du DCMR et notamment le fait que les sources
dionisation soient diffeacuterentes nous laissait agrave penser que des ajustements au moins au niveau
de la source seraient neacutecessaires (voir Chap II)
Expeacuteriences reacutealiseacutees sur l‟APEX-Qe du Laboratoire de Chimie Physique agrave Orsay
Pour aIF2α3 les nouveaux paramegravetres optimiseacutes pour maximiser la couverture de
seacutequence obtenue en ECD ont eacuteteacute les suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par des
eacutelectrons de 17 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 10 ms Contrairement aux expeacuteriences
reacutealiseacutees sur l‟APEX III nous n‟avons pas utiliseacute la technique de pieacutegeage dynamique des
ions En effet un gain de sensibiliteacute a eacuteteacute apporteacute par les laquo ion funnels raquo Dans ces conditions
expeacuterimentales l‟analyse du spectre ECD a permis l‟identification d‟un total de 59 ions
112
fragments correspondant agrave 19 ions c et 40 ions z dont 3 paires d‟ions compleacutementaires Le
pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 608 (Fig III 8)
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
00
05
10
15
20
7x10
Intens
400 600 800 1000 1200 1400 1600 mz
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+9H]9+[M+8H]8+
[M+7H]7+
[M+6H]6+
[M+13H]13+
~
~
~
~~
~
~
~
mz
Intensx107
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
250 300 350 400 450 500 550 mz
z2+
c2+
z3+
c3+
z4+
z5+
c4+
Fig III 8 Spectre ECD drsquoaIF2α3 obtenu sans seacutelection drsquoeacutetat de charge sur un instrument
FT-ICR APEX-Qe La couverture de seacutequence correspondante agrave la fragmentation et
lrsquoagrandissement de la reacutegion mz 250-550 sont eacutegalement montreacutes
Si l‟on compare les deux spectres ECD ci-dessus une meilleure efficaciteacute de fragmentation
a eacuteteacute obtenue sur l‟APEX III permettant d‟avoir une meilleure reacutesolution en ce qui concerne la
zone [20-55] correspondant agrave la partie de la proteacuteine aIF2α3 qui se retrouve en contact avec la
sous-uniteacute γ lorsque leur association est effective Neacuteanmoins la fragmentation ECD de la
proteacuteine sur l‟APEX-Qe permet aussi d‟avoir un bon pourcentage de couverture de seacutequence
pour deacuteterminer des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute notamment au niveau des
extreacutemiteacutes
113
III2213 Reacutesultats en HDXECD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ECD
Pour cela nous avons mis en application notre protocole de marquage pour un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure (Fig III 5)
L‟observation des spectres ECD apregraves eacutechange HD montre que les massifs isotopiques
avec l‟incorporation de deuteacuteriums se deacuteplacent vers des rapports masse sur charge plus
importants tout en s‟eacutelargissant car lincorporation progressive de deuteacuteriums ajoute des pics
isotopiques dans le massif (Fig III 9) La premiegravere conseacutequence agrave cet eacutelargissement est que
l‟intensiteacute totale du signal obtenu pour un ion fragment est reacutepartie sur un nombre plus grand
de pics composant le massif Il en reacutesulte une diminution de l‟intensiteacute globale du signal
pouvant entraicircner une perte de deacutetection Dans ce contexte le nombre de fragments pouvant
ecirctre interpreacuteteacutes de maniegravere correcte car lenveloppe isotopique preacutesente une intensiteacute
suffisante diminue par rapport agrave lexpeacuterience sans deuteacuterium Parfois mecircme certains
fragments disparaissent complegravetement dans le bruit de fond contribuant agrave son augmentation
En effet les ions fragments c et z de faible intensiteacute avant l‟eacutechange ne sont plus deacutetectables
dans les spectres apregraves eacutechange Une autre conseacutequence de l‟eacutelargissement des massifs
isotopiques ayant incorporeacute des deuteacuteriums est leur superposition compliquant aussi fortement
l‟analyse des reacutesultats Plus le nombre de fragments est grand et moins il est facile de suivre
l‟incorporation des deuteacuteriums Par ailleurs pour les hauts rapports mz on note eacutegalement
l‟apparition de pics intenses agrave toutes les uniteacutes de masse perturbant davantage l‟interpreacutetation
des reacutesultats Ce pheacutenomegravene indeacutesirable reacutesultant de la recapture successive d‟un eacutelectron
avait eacutegalement eacuteteacute observeacute lors de la thegravese de M Duchateau (15) Une solution pour le
limiter a eacuteteacute d‟optimiser au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les
recaptures successives tout en obtenant suffisamment de fragmentations (eacutenergie cineacutetique
des eacutelectrons de 17 eV pendant 10 ms)
114
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
000
025
050
075
100
125
7x10
Intens
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
6x10
870 872 874 876 878 880 882 884 mz
[M+12H]12+
[M+12H]12+
z324+
z324+
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
Fig III 9 Comparaison des spectres ECD drsquoaIF2α3 sans HDX (en bleu) et avec HDX t=1h
(en rouge) Agrandissements des reacutegions du spectre mz 869-884 (a) et mz 1080-1150 (b)
L‟analyse des spectres ECD montre donc une perte importante de sensibiliteacute apregraves eacutechange
HD essentiellement pour les hauts rapports mz La conseacutequence immeacutediate est une
diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD ce qui n‟est pas
favorable pour obtenir une bonne reacutesolution Nous avons identifieacute au total 43 ions fragments
correspondant agrave 23 ions c et 20 ions z dont une paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage
de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 456 (Fig III 10)
(a)
(b)
115
Fig III 10 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ECD
Lanalyse de la Fig III 10 montre clairement que si lanalyse des petits fragments
(extreacutemiteacutes N- et C-terminales) ne pose pas de problegraveme lanalyse dions fragments plus gros
correspondant agrave une rupture plutocirct au niveau du milieu de la seacutequence polypeptidique est
bien plus probleacutematique A la diffeacuterence de l‟APEX III en pieacutegeage dynamique il semble que
sur l‟APEX-Qe la capaciteacute de pieacutegeage du piegravege hexapolaire soit limitante et ne permette pas
d‟accumuler autant d‟ions dans la cellule Pour eacuteviter ce problegraveme il faudrait pouvoir
accumuler plus de temps pour faire sortir les pics peu intenses du bruit de fond (mais ce nest
pas possible avec notre systegraveme de seringue refroidie car leacutechange inverse devient trop grand
au bout de 10 minutes) Une autre solution agrave ce problegraveme aurait pu eacutegalement ecirctre une
augmentation du champ magneacutetique qui aurait permis d‟augmenter la gamme dynamique
ainsi que la vitesse de balayage
III2214 Analyse des donneacutees
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Data Analysis (Bruker Daltonics)
L‟analyse des spectres de fragmentation MSMS est effectueacutee entiegraverement manuellement ce
qui la rend longue et fastidieuse
La premiegravere eacutetape de l‟analyse consiste agrave identifier les ions fragments c et z preacutesents dans
le spectre enregistreacute avant l‟eacutechange HD Une liste de pics est alors geacuteneacutereacutee Elle contient
tous les pics des massifs isotopiques correspondant aux ions fragments identifieacutes Cette liste
reacutepertorie le rapport mz et l‟intensiteacute de chaque pic A partir de celle-ci les masses moyennes
pondeacutereacutees des fragments n‟ayant pas incorporeacute de deuteacuteriums sont calculeacutees Il s‟agit ensuite
de proceacuteder de la mecircme maniegravere pour les fragments ayant incorporeacute des deuteacuteriums apregraves
eacutechange Pour la seacuteparation des massifs isotopiques eacutelargis et la deacutetermination de leur masse
moyenne pondeacutereacutee la preacutecision sur la mesure de masse et la reacutesolution de l‟instrument sont
deux critegraveres essentiels Afin de cartographier les eacutechanges isotopiques des hydrogegravenes
d‟amide le choix de spectromegravetres de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR et Orbitrap) est
116
justifieacute Enfin le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour chaque ion fragment peut ecirctre
deacutetermineacute Il est obtenu en faisant la diffeacuterence entre la masse moyenne pondeacutereacutee d‟un ion
fragment donneacute apregraves eacutechange isotopique avec celle obtenue sans eacutechange et en multipliant
par la charge Le taux de deuteacuteration correspondant est deacuteduit en divisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le nombre d‟hydrogegravenes d‟amide eacutechangeables (multiplieacute par cent)
La repreacutesentation la plus directe des reacutesultats consiste agrave tracer le graphe du nombre total de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment en fonction de sa position (numeacutero de reacutesidu)
dans la seacutequence Pour un temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O donneacute deux graphes
peuvent alors ecirctre reacutealiseacutes correspondant agrave l‟analyse des deux seacuteries d‟ions c et z (Fig III 11)
La ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la seacutequence de tous les deuteacuteriums
incorporeacutes dans la proteacuteine Cette courbe theacuteorique correspond donc agrave l‟incorporation
moyenne en deuteacuteriums pour chaque ion fragment Elle tient compte du contenu maximal de
deuteacuteriums incorporeacutes par la proteacuteine Dans le cas que nous preacutesentons qui correspond agrave un
temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte eacutetait marqueacutee agrave 61 Chaque
point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de 061 deuteacuterium par reacutesidu Les
deacutecrochements de la courbe sont dus agrave la preacutesence de proline dans la seacutequence de la proteacuteine
qui est le seul acide amineacute qui ne possegravede pas de groupement amide N-H de liaison Si notre
expeacuterience avait abouti agrave un reacutearrangement total des deuteacuteriums sur les hydrogegravenes d‟amide le
long de la chaicircne peptidique tous les points expeacuterimentaux en rose et en bleu se situeraient
sur la courbe noire Or ce n‟est pas le cas Par conseacutequence nous pouvons conclure que nous
n‟avons pas de redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD
117
c-type fragments (N-terminus)
0
5
10
15
20
25
30
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
Numeacutero de reacutesidu
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 10 20 30 40 50 60
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Fig III 11 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment en fonction de son numeacutero de reacutesidu pour les seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure
drsquoincubation dans D2O
Une autre maniegravere de repreacutesenter ces reacutesultats est de tracer le nombre de deuteacuteriums par
reacutesidu (et non plus le nombre cumuleacute de deuteacuteriums le long de la seacutequence) (Fig III 12) Ce
nombre est calculeacute en faisant la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour deux
ions fragments conseacutecutifs Par exemple si on considegravere l‟extreacutemiteacute N-terminale le nombre
de deuteacuteriums incorporeacutes par le reacutesidu numeacutero dix a eacuteteacute deacutetermineacute en faisant le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par le fragment c10 moins celui du fragment c9 Le taux de deuteacuteration
obtenu pour ce reacutesidu a eacuteteacute de 68 Lorsqu‟il manquait des ions fragments une moyenne
d‟incorporation des deuteacuteriums entre les deux reacutesidus les plus proches a alors eacuteteacute calculeacutee
Dans ce cas la diffeacuterence du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes pour les deux fragments
correspondants a donc eacuteteacute diviseacutee par le nombre de reacutesidus les seacuteparant Ainsi entre les
reacutesidus 33 et 44 le taux moyen de 70 a eacuteteacute calculeacute en faisant le nombre de deuteacuteriums
incorporeacutes dans c44 moins celui dans c33 diviseacute par 11
118
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero de reacutesidu
Fig III 12 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O
L‟ensemble des points se situe en dessous de un qui est la valeur maximale de deuteacuteration
attendue correspondant exactement agrave l‟incorporation d‟un deuteacuterium par hydrogegravene d‟amide
Plus le taux de deuteacuteration s‟eacuteloigne de la valeur de un plus la zone correspondante de la
proteacuteine est structureacutee Inversement plus le taux est proche de un moins la proteacuteine est
structureacutee Ces reacutesultats peuvent donc ecirctre exploiteacutes pour obtenir des informations structurales
sur la sous-uniteacute α3 du complexe d‟initiation de la traduction aIF2 chez Sulfolobus
solfataricus Ils ont eacuteteacute reporteacutes sur la structure primaire d‟aIF2α3 dans laquelle des eacuteleacutements
de structure connus (heacutelices feuillets et boucles) ont eacuteteacute indiqueacutes (Fig III 13) Les zones en
bleu caracteacuteriseacutees par une incorporation faible de deuteacuteriums indiquent une zone tregraves
structureacutee de la proteacuteine Le passage de bleu agrave rouge (avec des zones intermeacutediaires en vert
jaune ou orange) montre des segments de la proteacuteine de moins en moins structureacutes
119
Fig III 13 Repreacutesentation scheacutematique sur la structure primaire et secondaire drsquoaIF2α3 du
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu Ce nombre a eacuteteacute calculeacute agrave partir des taux de
deuteacuteration drsquoions fragments conseacutecutifs ou proches pour les seacuteries c et z apregraves une heure
drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O
Malgreacute la diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence apregraves eacutechange HD des
informations de structure sont deacuteduites sur une grande partie de la proteacuteine Une reacutesolution agrave
l‟acide amineacute pregraves est principalement obtenue au niveau des extreacutemiteacutes et dans des zones non
structureacutees de la proteacuteine Notons que la zone pour laquelle agrave la fois des ions c et z sont
obtenus preacutesente une parfaite correacutelation entre nos reacutesultats ce qui constitue une validation
suppleacutementaire de notre approche Neacuteanmoins nous n‟observons pas toujours une tregraves bonne
correacutelation entre les taux d‟incorporation des deuteacuteriums que nous avons calculeacutes et les
eacuteleacutements structuraux proposeacutes par la cristallographie et notamment en ce qui concerne la
zone [20-55] Cette zone qui comprend l‟heacutelice α1 le feuillet β2 et le deacutebut du feuillet β3
correspond agrave la partie de la proteacuteine qui interagit avec la sous-uniteacute γ lorsqu‟il y a formation
du complexe
Il est eacutegalement possible de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums dans la proteacuteine entiegravere
ou au niveau des ions fragments au cours du temps en reacutealisant des cineacutetiques d‟eacutechange HD
En faisant varier le temps d‟incubation de la proteacuteine dans D2O il est alors possible
d‟obtenir diffeacuterents points de cineacutetique et donc de tracer une courbe de cineacutetique
d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) Elle nous renseigne sur la vitesse
d‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine et sur le taux de deuteacuteration maximal atteint
120
Dans le cas de la proteacuteine aIF2α3 la vitesse d‟eacutechange HD est tregraves rapide Un plateau est
atteint degraves trente minutes d‟incubation correspondant agrave un marquage maximal d‟environ 66
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
d
eu
teri
ation
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
Temps (minutes)
Po
urc
enta
ge
de
deu
teacutera
tio
n
Fig III 14 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la proteacuteine entiegravere
Les vitesses d‟eacutechange pour les diffeacuterents ions fragments peuvent eacutegalement ecirctre traceacutees
(Fig III 15) Une autre maniegravere simple (autre que celle discuteacutee dans III2214) de s‟assurer
qu‟il n‟y a pas eu un reacutearrangement aleacuteatoire total des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique est de veacuterifier que les pourcentages de deuteacuteration observeacutes pour les ions
fragments c et z de mecircme taille ne sont pas identiques En effet deux cineacutetiques d‟eacutechange
identiques pour des ions fragments c et z comportant le mecircme nombre d‟hydrogegravenes
eacutechangeables seraient la signature d‟une redistribution aleacuteatoire totale des deuteacuteriums ayant
eu lieu avant la formation de ces ions
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500
c13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
9193319575m1
0053075008066m2
9422930195m3
045244084732m4
NA12581Chisq
NA097786R
0
10
20
30
40
50
60
70
0 500 1000 1500
z13
2+
d
euteacute
ratio
n
Temps (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
1007264506m1
3463903455m2
11624-095451m3
095437m4
NA93538Chisq
NA099061R
Fig III 15 Cineacutetique drsquoincorporation des deuteacuteriums pour les ions fragments c13 et z13
dichargeacutes
121
Nous avons donc geacuteneacutereacute un important jeu de donneacutees par la reacutealisation d‟une cineacutetique
d‟eacutechange HD combineacutee agrave une fragmentation par ECD Nous avons montreacute que notre
approche permettait de limiter la redistribution aleacuteatoire des deuteacuteriums le long de la chaicircne
peptidique en phase gazeuse et d‟obtenir des informations de structure sur une grande partie
de la proteacuteine Neacuteanmoins la comparaison de nos reacutesultats de HDX avec les donneacutees obtenues
par cristallographie montre des diffeacuterences que l‟on peut peut-ecirctre expliquer par le fait que les
donneacutees de cristallographie sont issues du complexe (16) La proteacuteine adopterait une
conformation particuliegravere (en heacutelice et feuillets) lorsqu‟elle serait en interaction avec la sous-
uniteacute γ afin de stabiliser la formation du complexe tandis qu‟en absence de son partenaire
proteacuteique elle resterait deacutestructureacutee Une analyse du sous-complexe aIF2α3γ permettra de
confirmer cette hypothegravese
En conclusion nos reacutesultats sont encourageants mais ils doivent eacutegalement ecirctre ameacutelioreacutes
pour que nous puissions obtenir des cineacutetiques d‟eacutechange HD par acide amineacute pour une
grande partie de la proteacuteine qui nous permettraient de distinguer tregraves nettement des zones
structureacutees de segments deacutesordonneacutes
III222 Analyse du sous-complexe aIF2α3γ
III2221 Optimisation du protocole drsquoanalyse
La premiegravere eacutetape a consisteacute agrave optimiser les paramegravetres de source et la concentration de
l‟eacutechantillon proteacuteique afin d‟obtenir une bonne intensiteacute du signal sur l‟APEX-Qe Alors que
la proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute analyseacutee agrave la concentration de 57 microM une concentration de 74 microM
apregraves laquo quench raquo et deacutenaturation a eacuteteacute neacutecessaire agrave l‟obtention d‟un spectre de masse aussi
intense que celui qui avait eacuteteacute obtenu pour la proteacuteine seule De plus nous avons reacutegleacute
l‟instrument pour maximiser l‟observation de la sous-uniteacute α3 en particulier via les reacuteglages
du quadripocircle de l‟instrument car nous avions deacutejagrave un jeu de donneacutees sur cette proteacuteine Le
spectre de masse d‟aIF2α3 en complexe avec γ ainsi obtenu est donneacute dans la Fig III 16
122
aIF2a3g_ss_noHD_000003d +MS
0
1
2
3
4
7x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz
[M+13H]13+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+7H]7+[M+14H]14+
mz
Intensx107
Fig III 16 Spectre MS drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HDX obtenu sur lrsquoAPEX-
Qe avec maximisation de lrsquointensiteacute de la sous-uniteacute α3
Dans une deuxiegraveme eacutetape les paramegravetres ECD ont eacuteteacute optimiseacutes pour obtenir la plus
grande couverture de seacutequence possible pour la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ avant
l‟ajout de l‟eacutetape d‟eacutechange HD Le meilleur pourcentage de couverture de seacutequence obtenu
a eacuteteacute d‟environ 40 avec les paramegravetres suivants une cathode agrave 18 A et une irradiation par
des eacutelectrons de 1 eV d‟eacutenergie cineacutetique pendant 35 ms Le spectre ECD correspondant est
donneacute dans la Fig III 17
aIF2a3g_ss_noHD_000005d +MS
0
1
2
3
6x10
Intens
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 mzmz
Intensx106
Fig III 17 Spectre ECD drsquoaIF2α3 en complexe avec γ avant eacutechange HD enregistreacute sur
lrsquoAPEX-Qe
123
Finalement le complexe a eacuteteacute analyseacute par HDXECD Le protocole de marquage du
complexe aIF2α3γ est identique agrave celui utiliseacute pour la proteacuteine α3 seule Le principe est
rappeleacute dans la Fig III 18 La fragmentation ECD est reacutealiseacutee sur la sous-uniteacute α3 apregraves
diffeacuterents temps d‟incubation du complexe α3γ dans D2O
Fig III 18 Scheacutema de notre protocole optimiseacute pour lrsquoeacutetude de la sous-uniteacute alpha3 en
complexe avec gamma (aIF2α3γ) en HDXMS par analyse laquo top-down raquo ECD
III2222 Reacutesultats obtenus en HDXECD
L‟incorporation des deuteacuteriums dans la proteacuteine aIF2α3 en complexe avec γ a eacuteteacute suivie au
cours du temps et compareacutee agrave celle qui avait eacuteteacute obtenue pour la sous-uniteacute α3 seule (Fig III
19) Les deux courbes de cineacutetique d‟eacutechange HD preacutesentent la mecircme allure Neacuteanmoins
une diffeacuterence notable au niveau du taux maximal de deuteacuteration a eacuteteacute mise en eacutevidence
apregraves association de la proteacuteine En effet lorsque la proteacuteine a eacuteteacute complexeacutee la valeur
maximale atteinte a diminueacute d‟environ 20 passant de 66 (pour la proteacuteine seule) agrave 48
(pour la proteacuteine en complexe) Ce reacutesultat est encourageant dans la mesure ougrave l‟on attend une
baisse de la deuteacuteration pour α3 apregraves son association avec γ En effet une diminution des
vitesses d‟eacutechange HD est attendue dans la zone d‟interaction des deux sous-uniteacutes
124
0
20
40
60
80
100
0 500 1000 1500
Sous uniteacute alpha3 seulSous uniteacute alpha3 en complexe
d
eu
teriatio
n
Time (min)
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
3710242568m1
0018179008279m2
3538122127m3
2287919802m4
NA15165Chisq
NA098423R
y = m1(1-exp(-m2M0))+m3(1
ErrorValue
5657830388m1
00240560048802m2
5050216726m3
5630328684m4
NA43553Chisq
NA091987R
Temps (minutes)
Pourc
enta
ge
de
deu
teacutera
tion
Fig III 19 Cineacutetiques drsquoincorporation des deuteacuteriums pour la sous-uniteacute alpha3 seule
(aIF2α3 courbe en noir) et en complexe avec gamma (aIF2α3γ courbe en rouge)
Nous nous sommes ensuite inteacuteresseacutes aux diffeacuterences locales d‟incorporation des
deuteacuteriums pour la proteacuteine en complexe que nous avons compareacutees agrave celles qui avaient eacuteteacute
obtenues pour la proteacuteine seule (Fig III 12) afin de deacuteterminer la surface d‟interaction Pour
cela nous avons repreacutesenteacute comme nous l‟avions fait pour la proteacuteine seule (III2214) le
nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par fragments en fonction du numeacutero de reacutesidu
correspondant ainsi que le nombre de deuteacuteriums par acide amineacute calculeacute agrave partir des ions des
deux seacuteries c et z Les reacutesultats sont preacutesenteacutes dans les Fig III 20 et Fig III 21
Ainsi nous avons pu constater que nous n‟avions toujours pas de redistribution aleacuteatoire
totale des deuteacuteriums avant fragmentation par ECD car l‟incorporation des deuteacuteriums le long
de la seacutequence ne suit pas la moyenne statistique (Fig III 20)
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 15 20 25 30 35
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Numeacutero du reacutesidu
Ions fragments c
Fig III 20 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion c issu
de la fragmentation ECD drsquoaIF2α3 en fonction de son numeacutero de reacutesidu apregraves une heure
drsquoincubation du complexe aIF2α3γ dans D2O
125
De plus en comparant le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour α3 seule
et α3 en complexe avec γ on a pu mettre en eacutevidence des zones de la proteacuteine qui
eacutechangeaient moins rapidement (flegraveches descendantes Fig III 21) dans le cas de
l‟association des sous-uniteacutes Les graphes montrent eacutegalement des segments peptidiques qui
ont un taux d‟eacutechange plus important (flegraveches ascendantes) ou similaire (signes eacutegal) dans la
proteacuteine en complexe par rapport agrave la proteacuteine seule
Nous avons ensuite repreacutesenteacute les diffeacuterences de deuteacuteration obtenues par reacutesidu ou
segment peptidique entre la proteacuteine α3 seule et en complexe avec γ (deacutetermineacutees agrave partir de
Fig III 21) sur la structure tridimensionnelle de la proteacuteine (Fig III 22) afin d‟eacutemettre des
hypothegraveses quant agrave la maniegravere dont les sous-uniteacutes se lient entre elles Les reacutesultats montrent
que l‟ensemble de la proteacuteine semble voir la vitesse d‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide
modifieacutee dans le complexe et qu‟il n‟est pas possible de localiser preacuteciseacutement de surface
d‟interaction On notera en particulier que la reacuteduction de vitesse d‟eacutechange aurait pu donner
la zone de contact par une baisse d‟accessibiliteacute mais que la reacuteduction de la vitesse d‟eacutechange
peut aussi ecirctre lieacutee agrave des changements conformationnels ou agrave des variations de la dynamique
de la sous-uniteacute α3 en complexe avec γ
126
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Numeacutero de reacutesidu
No
mbre
de
deu
teacuteri
um
s
0
02
04
06
08
1
0 10 20 30 40 50
Numeacutero de reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
Fig III 21 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute pour les
seacuteries drsquoions c et z apregraves une heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus pour la
sous-uniteacute alpha3 seule (aIF2α3 points en noir) sont compareacutes agrave ceux de la sous-uniteacute
alpha3 en complexe avec gamma (aIF2α3γ points en rouge)
Sous-uniteacute 3
N-ter
Heacutelice 2
C-ter
Heacutelice 1
D
Sous-uniteacute
Sous-uniteacute
Fig III 22 Structure tridimensionnelle du complexe aIF2αβγ de S solfataricus obtenu par
cristallographie (16) Zoom sur la sous-uniteacute α3 sur laquelle ont eacuteteacute reporteacutees les diffeacuterences
de deuteacuteration entre la proteacuteine seule et en complexe
127
Nous avons ensuite voulu comparer l‟ETD agrave l‟ECD en termes de sensibiliteacute rapiditeacute et
efficaciteacute de fragmentation avec pour objectif de gagner en reacutesolution spatiale Pour cela nous
avons fragmenteacute en ETD la proteacuteine aIF2α3 et compareacute ces reacutesultats agrave ceux obtenus
auparavant en ECD
III23 Fragmentation par ETD
III231 Spectre de masse
Comme indiqueacute preacuteceacutedemment ces expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse ont eacuteteacute
reacutealiseacutees sur un instrument de type Orbitrap (Fig III 23) Le spectre de masse d‟aIF2α3 a eacuteteacute
obtenu apregraves infusion directe via le systegraveme de seringue refroidie de la proteacuteine agrave la
concentration de 57 microM et apregraves son ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
[M+9H]9+
[M+8H]8+
[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
Fig III 23 Spectre MS drsquoaIF2α3 obtenu sur un spectromegravetre de masse LTQ Orbitrap Velos
apregraves ionisation eacutelectrospray dans des conditions deacutenaturantes
128
III232 Reacutesultats obtenus en ETD
Nous avons observeacute le mecircme pheacutenomegravene en ETD qu‟en ECD la couverture de seacutequence
obtenue apregraves seacutelection d‟un eacutetat de charge particulier est moins bonne que celle obtenue sans
seacutelection Le problegraveme est que si on peut travailler sans seacutelection sur le FT-ICR ce nest pas
le cas pour lOrbitrap Nous avons eacutegalement constateacute que comme en ECD le nombre d‟ions
fragments deacutetecteacute eacutetait lieacute agrave l‟eacutetat de charge seacutelectionneacute de la proteacuteine mecircme si une meilleure
couverture de seacutequence est obtenue sans seacutelection Il est classiquement observeacute que plus l‟eacutetat
de charge seacutelectionneacute est important meilleure est la fragmentation En ETD comme en ECD
nous avons observeacute que la fragmentation eacutetait meilleure lorsqu‟un eacutetat de charge pair eacutetait
seacutelectionneacute et qu‟elle eacutetait toujours moins bonne pour les eacutetats de charge impairs Nous avons
donc deacutecideacute de fragmenter en ETD deux eacutetats de charge pairs de la proteacuteine correspondant agrave
l‟eacutetat de charge pair le plus eacuteleveacute et agrave celui le plus intense Dans notre cas les eacutetats de charge
14+ et 12+ ont eacuteteacute seacutelectionneacutes (Fig III 23) pour ecirctre ensuite fragmenteacutes (Fig III 24)
L‟eacutetude des reacutesultats de fragmentation de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 12+ a permis
l‟identification de 51 ions fragments correspondant agrave 29 ions c et 22 ions z dont deux paires
d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de
533 (Fig III 24 (a)) L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ a
quant agrave elle reacuteveacuteleacute la preacutesence de 61 ions fragments correspondant agrave 31 ions c et 30 ions z
dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Une meilleure couverture de seacutequence avec un
pourcentage de 663 a ainsi eacuteteacute obtenue (Fig III 24 (b)) Afin d‟optimiser le pourcentage
de couverture de seacutequence de la proteacuteine trois temps d‟activation (10 15 et 25 ms) d‟une
minute chacun ont eacuteteacute testeacutes conseacutecutivement Il est apparu que la combinaison de tous les
scans enregistreacutes pendant ces trois minutes de fragmentation ETD a permis d‟obtenir le
meilleur reacutesultat de recouvrement de seacutequence L‟option laquo supplemental activation raquo a eacuteteacute
utiliseacutee Sur la base de ces reacutesultats nous avons donc choisi de fragmenter l‟eacutetat de charge
14+ apregraves eacutechange avec ces trois temps d‟activation
129
1102001-01_3_110105164919 300-536 RT 349-648 AV 237 NL 254E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 86974etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
1102001-01_3_110105164919 64-296 RT 048-344 AV 233 NL 257E4T FTMS + p ESI sa Full ms2 74564etd1000 [23000-200000]
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700
mz
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Re
lative
Ab
un
da
nce
Fig III 24 Spectre ETD de la sous-uniteacute aIF2α3 seule sans eacutechange HD avec seacutelection de
lrsquoeacutetat de charge 12+ (a) et 14+ (b) et leur couverture de seacutequence associeacutee
III233 Reacutesultats en HDXETD
L‟eacutetape suivante a consisteacute agrave combiner les eacutechanges HD et la fragmentation par ETD De
la mecircme maniegravere qu‟en ECD nous avons proceacutedeacute au marquage d‟aIF2α3 pendant un temps
d‟incubation dans D2O d‟une heure
L‟analyse du spectre ETD de l‟ion preacutecurseur d‟eacutetat de charge 14+ reacutevegravele eacutegalement apregraves
eacutechange HD une diminution du pourcentage de la couverture de seacutequence agrave 533 (Fig III
25) au lieu de 663 Nous avons identifieacute au total 49 ions fragments correspondant agrave 25 ions
c et 24 ions z dont aucune paire d‟ions compleacutementaires
(a)
(b)
130
Fig III 25 Couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 apregraves eacutechange HD suivi drsquoune fragmentation
par ETD de lrsquoeacutetat de charge 14+
Le nombre de fragments identifieacutes dans les spectres ETD est leacutegegraverement plus important
que celui obtenu par ECD En revanche apregraves eacutechange HD en ETD comme en ECD une
importante perte de sensibiliteacute est observeacutee reacuteduisant consideacuterablement le pourcentage de
couverture de seacutequence (Fig III 26) Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment pour l‟ECD
une des ameacuteliorations agrave ce problegraveme serait d‟augmenter la dureacutee d‟analyse pour pouvoir
accumuler (ou combiner en ETD) un plus grand nombre de scans MSMS afin de faire sortir
les petits pics du bruit de fond Lagrave ougrave en ECD nous avions utiliseacute la totaliteacute des dix minutes
d‟analyse autoriseacutees avec le systegraveme de seringue refroidie avant que le laquo back-exchange raquo
devienne un problegraveme majeur en ETD en revanche seulement trois minutes de
fragmentation ont eacuteteacute reacutealiseacutees Ces expeacuteriences HDX eacutetant preacuteliminaires il conviendra par la
suite de profiter des dix minutes que nous disposons avec le systegraveme de seringue refroidie
pour reacutealiser la fragmentation ETD
Neacuteanmoins ces reacutesultats nous ont paru encourageants pour lutilisation de lETD plutocirct que
lECD pour ces approches laquo top-down raquo HDX car lETD est disponible sur un nombre de
spectromegravetres de masse bien plus important que lECD qui reste speacutecifique des FT-ICR
131
aIF2a3_ss_noHD_000002d +MS
0
1
2
3
4
5
6x10
Intens
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
aIF2_a3ss_HD_000003d +MS
0
1
2
3
4
5x10
1080 1090 1100 1110 1120 1130 1140 mz
z10+
z10+
1102001-02_110111172633 11012011 172634ion transfer tube closed
1102001-02_110111172633 233-453 RT 180-470 AV 221 NL 220E3T FTMS + p ESI sa Full ms2 74973etd1000 [25000-200000]
1080 1085 1090 1095 1100 1105 1110 1115 1120 1125 1130 1135 1140 1145
mz
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rela
tive
Abun
danc
e
11206548
11186450
11226640
11046457
1093632811446618
1132659511096422
1137659710876289
11406533
10849925
11256479
1128648611026351
11111505
10896333
11166401
10986460
10951423
Fig III 26 Comparaison des spectres ECD (en rouge) et ETD (en noir) drsquoaIF2α3 apregraves une
heure drsquoincubation de la proteacuteine dans D2O Agrandissements des reacutegions du spectre mz
1080-1150 En bleu le spectre ECD de la proteacuteine sans eacutechange HD
III234 Analyse de donneacutees et comparaison avec les reacutesultats drsquoECD
L‟extraction des donneacutees est reacutealiseacutee agrave partir du logiciel Xcalibur (Thermo Scientific) La
fenecirctre du logiciel peut ecirctre diviseacutee en trois parties correspondant au chromatogramme au
spectre de masse et agrave la liste de pics associeacutes (Fig III 27) Le spectre ETD de l‟ion preacutecurseur
d‟eacutetat de charge 14+ agrave eacuteteacute geacuteneacutereacute agrave partir du chromatogramme Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment (III232) il reacutesulte de la combinaison des reacutesultats obtenus pour trois temps
d‟activation (10 15 et 25 ms) et correspond agrave une dureacutee d‟analyse d‟environ trois minutes
Les reacutesultats ETD peuvent eacutegalement ecirctre preacutesenteacutes sous forme d‟une liste de pics associant
chaque rapport mz d‟un ion agrave son abondance relative dans le spectre
132
[M+14H]14+
Fragmentation ETD (10 15 et 25 ms)
1 min temps d‟activation
RT ~3 min
Chromatogramme
Spectre ETDListe
des pics
Fig III 27 Preacutesentation de la fenecirctre du logiciel Xcalibur pour le traitement des spectres
ETD
Les reacutesultats ETD sont analyseacutes de la mecircme maniegravere qu‟en ECD Les ions fragments sont
identifieacutes dans les spectres sans eacutechange et apregraves eacutechange Leur masse moyenne pondeacutereacutee est
ensuite deacutetermineacutee dans les deux conditions (sans eacutechange et apregraves eacutechange) Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion fragment est calculeacute en faisant la diffeacuterence de ses deux
masses moyennes pondeacutereacutees et en multipliant le reacutesultat par sa charge Le nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par reacutesidu est finalement deacuteduit par soustraction du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes par deux ions fragments conseacutecutifs Dans le cas ougrave les ions fragments
ne sont pas conseacutecutifs cette diffeacuterence de deuteacuteriums incorporeacutes est moyenneacutee sur
l‟ensemble des acides amineacutes les seacuteparant Les reacutesultats ETD ont eacuteteacute compareacutes agrave ceux qui
avaient eacuteteacute obtenus par ECD (Fig III 28)
133
0
02
04
06
08
1
12
14
0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments z (Analyse de l‟extreacutemiteacute C-ter)
0
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04
06
08
1
12
14
0 10 20 30 40 50Numeacutero de reacutesidu
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Ions fragments c (Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
Fig III 28 Repreacutesentation du nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par acide amineacute apregraves une
heure drsquoincubation dans D2O Les reacutesultats obtenus en ETD (points en vert) sont compareacutes agrave
ceux obtenus en ECD (points en rose et en bleu respectivement pour les seacuteries drsquoions c et z)
Le taux de deuteacuteration de la proteacuteine entiegravere est de 66 en ECD contre 60 en ETD
Le premier constat agrave l‟issue de l‟analyse des reacutesultats ETD a eacuteteacute l‟obtention de nombres de
deuteacuteriums incorporeacutes supeacuterieurs agrave la valeur maximale attendue (gt 1) pour quelques reacutesidus
Deux hypothegraveses peuvent expliquer ce reacutesultat La premiegravere consiste agrave penser que le lavage
des chaicircnes lateacuterales n‟a pas eacuteteacute total Autrement dit il resterait des deuteacuteriums au niveau des
chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes qui n‟auraient pas eacuteteacute reacute-eacutechangeacutes avant l‟analyse
Cependant nous avons utiliseacute le mecircme protocole de marquage et le mecircme systegraveme
d‟introduction des eacutechantillons pour l‟analyse des eacutechanges isotopiques par ETD par rapport agrave
celle qui avait eacuteteacute reacutealiseacutee en ECD Or de telles valeurs n‟ont pas eacuteteacute obtenues en ECD
Notons ici que dans le cas de l‟analyse des ions z les zones pour lesquelles on obtient des
valeurs anormales en ETD correspondent agrave des reacutegions de la proteacuteine pour lesquelles tregraves peu
134
d‟informations en ECD avaient eacuteteacute extraites (incorporation moyenne de deuteacuteriums sur une
dizaine d‟acides amineacutes) La seconde hypothegravese repose sur le fait qu‟en ETD certains ions
fragments suivis apregraves eacutechange HD n‟auraient pas eacuteteacute correctement attribueacutes Des
expeacuteriences de MSMS sur ces ions fragments (expeacuteriences de MS3) permettraient de
confirmer ou d‟infirmer cette hypothegravese Des essais ont eacuteteacute reacutealiseacutes mais n‟ont
malheureusement pas eacuteteacute concluants La faible intensiteacute des fragments obtenus par MS3 ne
nous a pas permis d‟identifier les ions fragments issus de la MSMS Un problegraveme de fuite au
niveau du montage de seringue refroidie en a eacuteteacute probablement la cause Nous n‟avons pas eu
le temps de reproduire les expeacuteriences
Neacuteanmoins on obtient une relativement bonne correacutelation pour les ions fragments c si on
compare les reacutesultats ETD agrave ceux obtenus en ETD tandis que des diffeacuterences notoires
d‟incorporation des deuteacuteriums par reacutesidu pour les ions fragments z sont observeacutees Les
graphes ne se superposent pas agrave l‟exception de petites zones qui s‟alignent entre elles
III235 Conclusion
Contrairement aux analyses reacutealiseacutees en ECD les expeacuteriences ETD requiegraverent la seacutelection
preacutealable d‟un eacutetat de charge Malgreacute cette contrainte une couverture de seacutequence
leacutegegraverement meilleure a eacuteteacute obtenue en ETD (sans eacutechange et apregraves eacutechange HD) Elle a eacuteteacute
deacuteduite de la combinaison de spectres enregistreacutes pour trois temps d‟activation diffeacuterents (10
15 et 25 ms) correspondant agrave trois minutes de fragmentation au total Les spectres ECD
reacutesultent quant agrave eux de l‟accumulation de scans correspondant agrave la dissociation de la
proteacuteine par un faisceau d‟eacutelectrons d‟eacutenergie cineacutetique et de temps d‟irradiation fixeacutes
pendant dix minutes d‟analyse
Nous avons ensuite deacutecideacute de comparer la fragmentation CID sur des ions preacutecurseurs de
haut eacutetat de charge afin de limiter le laquo scrambling raquo (10) vs les meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECD et ETD)
135
III24 Fragmentation par CID
III241 Analyse de la proteacuteine aIF2α3
III2411 Spectres de masse
La proteacuteine aIF2α3 a eacutegalement eacuteteacute eacutetudieacutee par une approche HDX laquo top-down raquo CID La
premiegravere eacutetape a consisteacute agrave reacutealiser les spectres de masse sans eacutechange et apregraves eacutechange HD
gracircce agrave un instrument de type Q-ToF La proteacuteine deuteacutereacutee a eacuteteacute injecteacutee dans le spectromegravetre
de masse par le systegraveme de seringue refroidie puis ioniseacutee par eacutelectrospray dans des
conditions deacutenaturantes La faible reacutesolution de l‟instrument (Fig III 29) nous a ensuite
obligeacutes agrave veacuterifier les fenecirctres d‟isolation avant la fragmentation par CID Finalement les
eacutenergies de collision ont eacuteteacute optimiseacutees pour chaque eacutetat de charge
Sans eacutechange HD
Apregraves eacutechange HD
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+12H]12+
[M+11H]11+
[M+10H]10+
[M+9H]9+
Fig III 29 Spectres MS drsquoaIF2α3 obtenus sans eacutechange (courbe rouge) et apregraves eacutechange
HD pendant une heure (courbe verte) agrave lrsquoaide drsquoun spectromegravetre de masse Q-ToF Premier
Un agrandissement de lrsquoion preacutecurseur drsquoeacutetat de charge 13+ a eacuteteacute ajouteacute
136
III2412 Reacutesultats obtenus en HDXCID
L‟analyse des spectres CID des ions preacutecurseurs d‟eacutetat de charge 10+ agrave 16+ de la proteacuteine
aIF2α3 dans H2O a permis l‟identification d‟un total de 54 ions fragments correspondant agrave 23
ions b et 31 ions y dont deux paires d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de couverture de
seacutequence obtenu a donc eacuteteacute de 565 (Fig III 30 (a)) Il regroupe l‟ensemble de tous les ions
fragments identifieacutes dans les spectres correspondant agrave la dissociation des diffeacuterents eacutetats de
charge Apregraves incubation de la proteacuteine dans D2O pendant une heure et fragmentation par
CID seulement 20 ions fragments au total ont pu ecirctre suivis correspondant agrave 14 ions b et 6
ions y dont aucune paire d‟ions compleacutementaires Le pourcentage de la couverture de
seacutequence a ainsi eacuteteacute reacuteduit agrave 217 apregraves eacutechange HD (Fig III 30 (b))
b ions y ions Fig III 30 Pourcentages de couverture de seacutequence drsquoaIF2α3 sans eacutechange (a) et apregraves
eacutechange HD (b) obtenus par fragmentation CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave
16+
La Fig III 31 illustre la complexiteacute du traitement des donneacutees en CID De la mecircme
maniegravere qu‟en ECD ou en ETD l‟analyse a consisteacute agrave deacuteterminer des masses moyennes
pondeacutereacutees d‟ions fragments La reacutesolution relativement faible de l‟instrument ainsi que la
faible abondance de certains ions fragments ont contribueacute agrave la diminution du nombre de
fragments pouvant ecirctre suivis apregraves eacutechange HD Ainsi le fragment b375+
a pu ecirctre interpreacuteteacute
dans les spectres de fragmentation par CID des ions preacutecurseurs 12+ agrave 16+ mais pas dans
ceux des eacutetats de charge 10+ et 11+ (Fig III 31) D‟autres (eg y2+ y3
+ y4
+ hellip) n‟ont pu ecirctre
suivis dans aucun des spectres (Fig III 30)
(a)
(b)
137
b375+[M+10H]10+
[M+11H]11+
[M+12H]12+
[M+13H]13+
[M+14H]14+
[M+15H]15+
[M+16H]16+
[M+11H]11+
[M+13H]13+
Fig III 31 Spectres CID des ions preacutecurseurs drsquoeacutetat de charge 10+ agrave 16+ Agrandissement
(a) de la reacutegion mz 832-852 permettant de suivre le massif isotopique de lrsquoion fragment b375+
dans les diffeacuterents eacutetats de charge et (b) du massif isotopique lui-mecircme dans les eacutetats de
charge 11+ et 13+ pour montrer la complexiteacute de lrsquoanalyse
Nous avons ensuite calculeacute le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes par les fragments qu‟il
nous eacutetait possible de suivre apregraves eacutechange HD dans les spectres CID des diffeacuterents eacutetats de
charge Nous avons reporteacute ces valeurs en fonction du numeacutero de reacutesidu dans la seacutequence
(Fig III 32) Rappelons que la ligne noire repreacutesente une redistribution statistique dans la
seacutequence de tous les deuteacuteriums incorporeacutes dans la proteacuteine Il s‟agit donc dune courbe
theacuteorique Elle donne le nombre moyen de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque fragment
calculeacute agrave partir du contenu maximal en deuteacuteriums de la proteacuteine Dans le cas que nous
preacutesentons qui correspond agrave un temps d‟incubation d‟une heure dans D2O la proteacuteine intacte
(a)
(b)
138
eacutetait marqueacutee agrave 57 Chaque point de la ligne noire correspond donc agrave une incorporation de
057 deuteacuterium par reacutesidu
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Courbe theacuteorique
11+
12+
13+
14+
15+
16+
Numeacutero du reacutesidu
No
mb
re d
e d
euteacute
riu
ms
Ions fragments b ( Analyse de l‟extreacutemiteacute N-ter)
11+
13+15+14+
11+
14+15+
13+
12+
Fig III 32 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums incorporeacutes par chaque ion
fragment b issus de la dissociation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 11+ agrave 16+ en
fonction de son numeacutero de reacutesidu La proteacuteine a eacuteteacute incubeacutee pendant une heure dans D2O
avant analyse
A la vue de ces reacutesultats on note que tous les points expeacuterimentaux ne sont pas aligneacutes sur
la courbe theacuteorique Par conseacutequent nous pouvons conclure de ce premier constat que nos
expeacuteriences HDXCID ne semblent pas aboutir agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des
deuteacuteriums le long de la chaicircne peptidique On remarque eacutegalement que les points
correspondant agrave la fragmentation du plus petit eacutetat de charge le 11+ (points en rouge sur la
Fig III 32) sont effectivement les plus proches de la redistribution totale des deuteacuteriums
Ainsi il semble reacuteellement y avoir un rapport entre le taux de redistribution HD et leacutetat de
charge du preacutecurseur Neacuteanmoins il est curieux dobserver que cest lion chargeacute 13+ qui
conduit aux ions fragments les plus eacuteloigneacutes de cette redistribution totale
Nous avons ici voulu reproduire les expeacuteriences HDXCID meneacutees tregraves reacutecemment par
l‟eacutequipe d‟I Kaltashov (10) sur notre systegraveme d‟eacutetude Ils ont montreacute qu‟il eacutetait possible
d‟analyser les eacutechanges isotopiques HD au sein des proteacuteines par une approche laquo top-down raquo
associeacutee agrave une activation collisionnelle (CID) En effet la seacutelection et la dissociation d‟ions
139
proteacuteiques de hauts eacutetats de charge limiteraient le pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo Or dans son
article I Kaltashov n‟a consideacutereacute qu‟un seul fragment le b19 pour en arriver agrave cette
conclusion Il ne s‟est donc inteacuteresseacute qu‟aux reacutesultats contenus sur une verticale du graphe
Dans notre cas si on se place au niveau des deux verticales que nous avons traceacutees sur la Fig
III 32 nos reacutesultats sont coheacuterents avec ceux de l‟article En revanche la discrimination nette
entre les grands et les petits eacutetats de charge n‟est pas toujours eacutevidente et parfois les reacutesultats
contredisent ceux obtenus par I Kaltashov
III242 Analyse de la proteacuteine aIF2α3 avec une eacutetiquette poly-histidines
Pour rendre l‟eacutetude du pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo plus facile agrave mettre en eacutevidence
l‟article de I Kaltashov (10) se basait sur l‟utilisation d‟une eacutetiquette poly-histidines placeacutee agrave
l‟extreacutemiteacute soit N- soit C-terminale de la proteacuteine qu‟ils ont eacutetudieacutee L‟inteacuterecirct eacutetait que ces
segments sont connus comme eacutetant non structureacutes et qu‟on peut par conseacutequent preacutedire que la
vitesse d‟eacutechange y sera maximale par rapport agrave la partie structureacutee de la proteacuteine Dans le
cadre de leurs expeacuteriences la proteacuteine est initialement totalement marqueacutee par des deuteacuteriums
par dissolution dans du D2O et l‟incubation se fait en conditions natives apregraves dilution dans un
tampon H2O 10 mM aceacutetate d‟ammonium De ce fait on attend une perte rapide de la
deuteacuteration sur l‟extreacutemiteacute poly-histidines des proteacuteines Ils observent ainsi (Fig III 33) que
l‟activation par CID conduit agrave un laquo scrambling raquo important pour les eacutetats de charge faibles (9+
agrave 11+) alors qu‟il est nettement reacuteduit pour les eacutetats de charge 14+ agrave 20+
Nous avons souhaiteacute construire un systegraveme eacutequivalent pour notre proteacuteine aIF2α3 afin de
voir si nous aussi en CID pouvions mettre en eacutevidence la preacutesence de laquo scrambling raquo ou non
Pour cela nous avons construit un mutant de la proteacuteine aIF2α3 et l‟avons exprimeacute en
collaboration avec le Laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique La seacutequence de ce
mutant est donneacutee sur la Fig III 34
140
22 D
11 D
Avec Redistribution des D
Sans redistribution des D
Segment non structureacute de 21 acides amineacutes
Fig III 33 Nombre moyen de deuteacuteriums pour le fragment b19 en fonction de lrsquoeacutetat de charge
de lrsquoion preacutecurseur Les lignes horizontales en gris indiquent le nombre moyen de deuteacuteriums
calculeacute dans le cas drsquoune redistribution aleacuteatoire totale des hydrogegravenes et deuteacuteriums labiles
au sein de lrsquoion preacutecurseur avant la dissociation (en haut) et dans le cas de lrsquoabsence de
pheacutenomegravene de laquo scrambling raquo (en bas)
Fig III 34 Seacutequence drsquoaIF2α3 comportant lrsquoeacutetiquette poly-histidines (acides amineacutes en vert)
En rose les fragments eacutetudieacutes par HDXCID
Notons degraves maintenant qu‟il nous eacutetait impossible de reproduire exactement l‟expeacuterience
d‟I Kaltashov avec notre proteacuteine en effet elle est instable dans des conditions non-salines
et ne peut ecirctre lyophiliseacutee Par conseacutequent il sera neacutecessaire de proceacuteder par un double
eacutechange tel que fait jusqu‟agrave preacutesent ie commencer par diluer la proteacuteine dans une solution
D2O NaCl 330 mM puis arrecircter l‟eacutechange par une dilution frac12 dans une solution H2O acide
formique 2 avant de proceacuteder au dessalage sur colonne De ce fait on ne profite plus de
l‟aspect deacutestructureacute de la chaicircne poly-histidines (qui sera rapidement deuteacutereacutee dans l‟eacutetape
d‟eacutechange) mais de la grande vitesse de reacute-eacutechange de la chaicircne poly-histidines une fois celle-
ci placeacutee en condition d‟arrecirct tel qu‟observeacute sur les peptides de T Joslashrgensen au Chap II On
peut consideacuterer que l‟eacutechange inverse (laquo back-exchange raquo) sera de la mecircme faccedilon que pour le
141
peptide P1 (HHHHHHIIKIIK) nettement plus rapide sur la partie poly-histidines que sur le
reste de la seacutequence proteacuteique
Nous avons ensuite eacutetudieacute par HDXCID les fragments b2-10 correspondant aux fragments
situeacutes dans l‟eacutetiquette poly-histidines (en vert sur Fig III 34) ainsi que les fragments
communs avec ceux de la proteacuteine sans poly-histidines soit les fragments b21-22 et b28
correspondant aux fragments b9-10 et b16 de la proteacuteine sans eacutetiquette poly-histidines Les
reacutesultats obtenus sont preacutesenteacutes dans la Fig III 35 Ils sont compareacutes agrave ceux de la Fig III 32
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 5 10 15 20 25 30
Courbe theacuteorique
17+
16+
15+
14+
13+17+
14+
16+15+
17+
14+
16+
15+
Nom
bre
de
deu
teacuteri
um
s
Numeacutero du reacutesidu
Fig III 35 Repreacutesentation du nombre total de deuteacuteriums contenus dans les ions b issus de la
fragmentation de lrsquoion preacutecurseur dans les eacutetats de charge 13+ agrave 17+ en fonction de leur
position dans la seacutequence (numeacutero de reacutesidu) La proteacuteine laquo taggeacutee raquo a eacuteteacute incubeacutee pendant
une heure dans D2O Son analyse en MS reacutevegravele un pourcentage de deuteacuteration de 57
On constate tout d‟abord que les fragments b2 agrave b10 preacutesentent un taux de deuteacuteration
largement infeacuterieur (jusqu‟agrave 2 D d‟eacutecart pour b10) agrave la courbe de laquo scrambling raquo complet Ceci
montre deux choses Le premier reacutesultat est que le laquo scrambling raquo est tregraves loin d‟ecirctre total sur
cette reacutegion Par conseacutequent mecircme en cas de laquo scrambling raquo partiel ce reacutesultat ne peut ecirctre
obtenu que si la deuteacuteration locale est tregraves infeacuterieure agrave la moyenne sur lensemble de la
proteacuteine On peut donc en deacuteduire ce second reacutesultat comme nous lavions espeacutereacute un laquo back-
exchange raquo rapide des hydrogegravenes damide des histidines a bien eu lieu On ne peut pas par
contre savoir si ce laquo back-exchange raquo a eacuteteacute total ou pas On note par ailleurs que dans cette
142
partie de la proteacuteine l‟eacutetat de charge ne semble pas jouer un rocircle important sur la deuteacuteration
nettement moins en tout cas que les effets observeacutes pour la proteacuteine sans eacutetiquette
Si on s‟inteacuteresse maintenant aux fragments b21-22 et b28 on constate une dispersion des
niveaux de deuteacuteration nettement reacuteduite par rapport agrave celle de la proteacuteine non-marqueacutee et en
tout cas sans aucune rupture brutale similaire agrave celle preacutesenteacutee dans l‟article d‟I Kaltashov Il
est par contre difficile de comparer un agrave un les niveaux de deuteacuteration car on ne connaicirct pas a
priori le niveau de deuteacuteration restant sur la partie poly-histidines Toutefois on notera
qu‟entre les fragments b22 et b28 de la proteacuteine portant un His-tag on a 35 D de diffeacuterence On
retrouve une diffeacuterence similaire entre les fragments b10 et b16 de la proteacuteine portant un His-
tag
Pour compleacuteter ce travail il nous manque un eacuteleacutement qui est la veacuterification du taux reacuteel de
deuteacuteration sur la partie poly-histidines Ce travail reste agrave faire avec un suivi par ECD en
faisant l‟hypothegravese d‟une absence de laquo scrambling raquo dans ce cas
Mais au final une tendance nette semble neacuteanmoins se deacutegager dans une approche laquo top-
down raquo l‟activation par CID ne conduit pas neacutecessairement agrave un laquo scrambling raquo total des
deuteacuteriums d‟amide au moins dans certaines conditions L‟article d‟I Kaltashov semble avoir
identifieacute l‟eacutetat de charge comme eacutetant un facteur Dans notre cas l‟eacutetat de charge ne semble
pas jouer un rocircle aussi marqueacute Mais il faut noter d‟une part que l‟article d‟I Kaltashov
comme notre approche avec le His-tag n‟ont regardeacute le laquo scrambling raquo qu‟au niveau des
extreacutemiteacutes de la proteacuteine et d‟autre part que dans les deux cas un laquo scrambling raquo partiel
semble observeacute puisqu‟il reste une fraction de deuteacuteriums au niveau de l‟extreacutemiteacute
III3 Deacutetermination du taux maximal de deuteacuteration mise en
eacutevidence du pheacutenomegravene drsquoeacutechange inverse
Les expeacuteriences sont difficilement reproductibles par une mecircme technique ce qui
complique la comparaison entre les diffeacuterentes meacutethodes Plusieurs raisons permettent
d‟expliquer ce fait Tout d‟abord il est tregraves difficile d‟obtenir le mecircme pourcentage initial de
deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere De plus l‟efficaciteacute de fragmentation varie en fonction du
de l‟instrument mais aussi en fonction du temps pour un mecircme instrument N‟oublions pas de
mentionner eacutegalement les problegravemes techniques que nous avons rencontreacutes qui sont lieacutes au
143
montage de seringue refroidie et qui concernent la fuite du systegraveme Un autre fait surprenant
est que nous ne sommes pas parvenus apregraves des temps longs d‟incubation dans D2O agrave un
maximum de deuteacuteration pour la proteacuteine entiegravere proche des 90-95 deacutecrits dans la
litteacuterature En effet le taux maximal de deuteacuteration obtenu pour aIF2α3 si on se reacutefegravere au
laquo fit raquo de double exponentielle de sa cineacutetique d‟incorporation des deuteacuteriums (Fig III 14) a
eacuteteacute de 66 seulement A partir de ce constat deux hypothegraveses peuvent ecirctre formuleacutees
- nous ne sommes pas arriveacutes au bout de la cineacutetique d‟eacutechange de la proteacuteine Dans ce cas
des temps d‟incubation dans D2O plus longs seraient neacutecessaires pour que les hydrogegravenes
d‟amide qui preacutesentent des vitesses d‟eacutechange tregraves lentes finissent par s‟eacutechanger Le laquo fit raquo
de la cineacutetique serait alors agrave revoir
- d‟importantes pertes de deuteacuteriums sont enregistreacutees ce qui n‟est pas souhaitable et pose
le problegraveme de l‟interpreacutetation des reacutesultats
Afin de deacutepartager ces deux hypothegraveses et ainsi de mieux comprendre le sens de nos
reacutesultats nous avons deacutecideacute de deacuteterminer la valeur maximale de reacutefeacuterence ie le taux
maximal de deuteacuteration pour la proteacuteine aIF2α3 Pour cela la proteacuteine a eacuteteacute analyseacutee avec le
mecircme protocole qui a eacuteteacute deacutecrit dans la Fig III 5 agrave l‟exception pregraves qu‟elle a eacuteteacute initialement
placeacutee dans des conditions deacutenaturantes et non plus natives
Afin de deacuteterminer le taux maximal de deuteacuteration de la proteacuteine aIF2α3 nous avons donc
deacutecideacute de la deacutenaturer avec du chlorure de guanidinium preacutealablement agrave l‟analyse HDXMS
Il a eacuteteacute montreacute que ce composeacute chaotropique utiliseacute agrave forte concentration eacutetait capable de
deacutenaturer totalement les proteacuteines (17) ce qui rendrait tous les hydrogegravenes d‟amide
accessibles agrave l‟eacutechange
La proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M
dans D2O agrave 50degC sous agitation pendant 24 heures Puis elle a eacuteteacute analyseacutee en MS afin de
calculer son taux de deuteacuteration Malheureusement aucun signal n‟a eacuteteacute deacutetecteacute indiquant
que la proteacuteine a eacuteteacute deacutegradeacutee ou a preacutecipiteacute suite au traitement chimique La seacutequence de la
proteacuteine aIF2α3 ne comportant que tregraves peu d‟acides amineacutes aromatiques (seulement trois
tyrosines) n‟a pas permis la mesure de la concentration de l‟eacutechantillon par
spectrophotomeacutetrie UV agrave 280 nm Par ailleurs la solution de chlorure de guanidinium quant
agrave elle absorbe agrave la longueur donde utiliseacutee pour les proteacuteines
144
Dans le but de tester si le traitement chimique pour la deacutenaturation deacutegrade la proteacuteine
nous avons deacutecideacute de reacutealiser un gel SDS-PAGE 16 permettant de tester la preacutesence
d‟aIF2α3 (10 kDa) Nous avons eacutegalement souhaiteacute tester si c‟est l‟eacutetape de dessalage qui
conduit agrave la perte de la proteacuteine Pour cela un autre eacutechantillon traiteacute mais non dessaleacute agrave eacuteteacute
preacutepareacute Malheureusement les eacutechantillons sont si visqueux qu‟il est impossible de les
deacuteposer L‟origine de cette viscositeacute n‟est pas tregraves claire neacuteanmoins un temps d‟incubation de
24 heures dans le chlorure de guanidinium semble trop long
Nous avons donc reacutealiseacute d‟autres tests dans des conditions diffeacuterentes afin de deacuteterminer le
temps maximal d‟incubation dans le chlorure de guanidinium pour lequel la proteacuteine n‟est pas
deacutegradeacutee Diffeacuterents temps d‟incubation ont eacuteteacute testeacutes t0=0s t=5h et t=24h Pour chaque
temps d‟incubation le premier eacutechantillon proteacuteique n‟a pas eacuteteacute dessaleacute tandis que le second
l‟a eacuteteacute (Fig III 36) Dans le cas ougrave une eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee (puits 4 6 et 8) la
solution d‟eacutelution correspondant agrave la proteacuteine dans H2OACNAF (49492) a eacuteteacute eacutevaporeacutee
par SpeedVac pour ecirctre ensuite resuspendue dans H2O afin de faciliter son deacutepocirct sur gel apregraves
ajout du tampon Laemmli Sans dessalage la proteacuteine traiteacutee au chlorure de guanidinium est
dilueacutee dans H2OAF2 afin de mimer l‟eacutetape d‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange (Fig III 5)
Les eacutechantillons non dessaleacutes sont ensuite preacutepareacutes avec du tampon Laemmli Neacuteanmoins agrave
l‟issue du meacutelange avec le tampon les eacutechantillons ont preacutecipiteacute empecircchant leur deacutepocirct preacutevu
dans les puits 3 5 et 7 Ce qui explique l‟absence de bandes dans ces puits et donc l‟absence
de proteacuteine Un marqueur de poids moleacuteculaire a eacuteteacute deacuteposeacute dans le premier puits Il s‟agit
d‟un meacutelange de proteacuteines de reacutefeacuterence dont la taille est connue servant agrave estimer la taille des
moleacutecules d‟inteacuterecirct Un teacutemoin positif a eacuteteacute deacuteposeacute dans le deuxiegraveme et dernier puits Il est
constitueacute de la proteacuteine aIF2α3 n‟ayant pas subi de traitement chimique ni de dessalage Une
bande intense autour de 10 kDa est observeacutee dans ces deux puits teacutemoignant de la preacutesence de
la proteacuteine Une mecircme quantiteacute de mateacuteriel (18 microg) a eacuteteacute deacuteposeacutee dans tous les puits lorsque
le deacutepocirct eacutetait possible
145
Marqueurα3H2O
α3G3M agrave t0
sans incubation
avec dessalage
α3G3M
avec incubation de 5h
et dessalage
α3G3M avec
incubation de 24h
et dessalage
α3H2O
Jour + 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
18 microg 18 microg 18 microg 18 microg 18 microg
10 kDa
Fig III 36 Image du gel SDS-PAGE 16 La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute deacutenatureacutee apregraves
diffeacuterents temps drsquoincubation dans une solution de chlorure de guanidinium agrave 3 M Pour
chaque temps drsquoincubation deux eacutechantillons sont testeacutes sans et avec lrsquoeacutetape de dessalage
La proteacuteine aIF2α3 est preacutesente dans les puits 4 et 6 alors qu‟elle a subi le traitement
chimique avec le chlorure de guanidinium et l‟eacutetape de dessalage mais elle n‟est pas retrouveacutee
dans le puits 8 Pourtant dans ce cas lagrave elle a aussi eacuteteacute traiteacutee par le chlorure de guanidinium
mais pendant un temps beaucoup plus long (24 heures) et dessaleacutee
Par conseacutequent on peut conclure que c‟est le temps du traitement chimique (incubation
dans une solution de chlorure de guanidinium 3 M agrave 50degC sous agitation) qui est critique
dans le maintien de l‟inteacutegriteacute de la proteacuteine En effet la proteacuteine aIF2α3 est deacutegradeacutee suite agrave
une incubation pendant une dureacutee de vingt-quatre heures tandis qu‟elle est toujours preacutesente
pour un temps d‟incubation infeacuterieur ou eacutegal agrave cinq heures
Le taux de deuteacuteration maximal de la proteacuteine aIF2α3 a donc eacuteteacute deacutetermineacute par
spectromeacutetrie de masse apregraves deacutenaturation de la proteacuteine dans une solution de chlorure de
guanidinium 3 M preacutepareacutee dans du D2O Les temps d‟incubation t=1h et t=5h ont eacuteteacute testeacutes
(Tab III 1)
Nous obtenons des pourcentages de deuteacuteration leacutegegraverement plus eacuteleveacutes dans le cas d‟une
deacutenaturation de la proteacuteine pendant des temps d‟une heure et cinq heures (73) par rapport agrave
une incubation classique dans D2O (66) Afin de s‟assurer que la proteacuteine a bien eacuteteacute
deacutenatureacutee par le traitement chimique d‟autres conditions ont eacuteteacute testeacutees tempeacuterature
146
d‟incubation de 95degC concentration en chlorure de guanidinium de 6 M Les reacutesultats sont
preacutesenteacutes dans le Tab III 2 Malgreacute diffeacuterentes conditions de deacutenaturation testeacutees nous
n‟obtenons pas de pourcentage de deuteacuteration proche de la limite supeacuterieure de 875 donneacutee
par la dilution agrave 18 de la solution H2O dans du D2O
Tab III 1 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions natives (0 M de deacutenaturant) et
deacutenaturantes (3 M de deacutenaturant) La proteacuteine aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee soit dans un tampon
NaCl 330 mMD2O (conditions natives) soit dans une solution de chlorure de guanidinium 3
MD2O (conditions deacutenaturantes) pendant des temps variables Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee
avant drsquoecirctre analyseacutee par MS La valeur de reacutefeacuterence (66) obtenue dans des conditions
natives est indiqueacutee Une valeur moyenne (triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes
conditions deacutenaturantes
Concentration
du deacutenaturant 0 M 3 M 3 M
Conditions
drsquoincubation 1 h
37degC 600 rpm 1 h
50degC 700 rpm 5 h
50degC 700 rpm
Taux de
deuteacuteration 66 73 73
Tab III 2 Taux de deuteacuteration maximal dans des conditions deacutenaturantes La proteacuteine
aIF2α3 a eacuteteacute incubeacutee dans une solution de chlorure de guanidiniumD2O dans diffeacuterentes
conditions Elle a ensuite eacuteteacute dessaleacutee avant drsquoecirctre analyseacutee par MS Une valeur moyenne
(triplicats) a eacuteteacute calculeacutee dans les diffeacuterentes conditions
Concentration
du deacutenaturant 3 M 6 M
Conditions
drsquoincubation 5 min
95degC 700 rpm 1 h
50degC 700 rpm Taux de
deuteacuteration 70 72
En reconsideacuterant donc les deux hypothegraveses formuleacutees preacuteceacutedemment il semblerait que le
pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse soit important dans nos conditions expeacuterimentales Il a lieu en
solution avant l‟analyse finale en MS lors de la preacuteparation des eacutechantillons (eacutetape de
dessalage) et au cours de leur introduction dans le spectromegravetre de masse avec le systegraveme de
seringue refroidie utiliseacute
Afin de mettre en eacutevidence l‟influence de l‟eacutetape de dessalage sur l‟eacutechange inverse nous
avons mesureacute les pourcentages de deuteacuteration de peptide et proteacuteine modegraveles complegravetement
deuteacutereacutes avec notre systegraveme de seringue refroidie La substance P (peptide de onze reacutesidus) a
donc eacuteteacute incubeacutee dans une solution ACND2O (7525) pendant une heure agrave 37degC sous
agitation La reacuteaction d‟eacutechange a eacuteteacute arrecircteacutee par diminution du pH et de la tempeacuterature puis
147
le peptide totalement marqueacute a eacuteteacute dilueacute dans H2OACNAF (49492) afin d‟ecirctre analyseacute par
MS L‟expeacuterience a eacuteteacute reconduite une seconde fois mais en incluant l‟eacutetape de dessalage
avant l‟analyse par MS Sur le FT-ICR les pourcentages moyens (triplicats) de deuteacuteration
obtenus sont les suivants 914 sans l‟eacutetape de dessalage et 77 avec l‟eacutetape de dessalage
Sur le Q-TOF le taux maximum sans dessalage n‟atteint que 856 indiquant que c‟est bien
l‟introduction dans la source qui conduisait agrave un accroissement du laquo back-exchange raquo sur
celui-ci Il semblerait que l‟eacutetape de dessalage conduise agrave une perte d‟environ 15 de la
totaliteacute du marquage pour les peptides Il convient de noter que ces expeacuteriences ont eacuteteacute
reacutealiseacutees directement agrave partir de la poudre donc sans dilution initiale Par conseacutequent si on
considegravere les 77 de deuteacuteration obtenus apregraves dessalage appliqueacutes sur une solution agrave 875
de deuteacuteriums on trouve un maximum de deuteacuteration de 67 soit assez proche des 72-73
obtenus apregraves deacutenaturation complegravete
III4 Conclusion
Nos reacutesultats montrent qu‟il est possible deacuteviter une redistribution des deuteacuteriums dans la
seacutequence polypeptidique au moment de la fragmentation en phase gazeuse de proteacuteines par
approches laquo top-down raquo L‟ECD et l‟ETD semblent preacutesenter une bonne capaciteacute agrave garder la
localisation initiale des deuteacuteriums Dans le cas de l‟activation par CID nos reacutesultats
rejoignent ceux de la litteacuterature en restant incertains il ne nous a pas eacuteteacute possible ni de
montrer l‟absence de laquo scrambling raquo ni de montrer un laquo scrambling raquo complet tombant ainsi
dans une zone intermeacutediaire ougrave les paramegravetres controcirclant l‟extensiviteacute du laquo scrambling raquo
restent incertains
Un autre enseignement de cette partie est qu‟un des problegravemes majeurs de notre approche
est leacutechange inverse qui a lieu en solution avant l‟analyse par spectromeacutetrie de masse Ce
pheacutenomegravene est accentueacute dans notre cas par lobligation que nous avons deffectuer une eacutetape
de dessalage des proteacuteines avant leur analyse et la difficulteacute agrave savoir ce qui relegraveve de cette
eacutetape ou de la source dionisation Un autre problegraveme lieacute agrave celui-lagrave est quil est difficile
daccumuler un grand nombre de spectres car au bout dune dizaine de minutes leacutechange
inverse est devenu trop important
Dans ce contexte et avec lideacutee de controcircler beaucoup mieux leacutechange inverse nous avons
deacutecideacute de deacutevelopper un systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
148
spectromegravetre de masse complegravetement nouveau baseacute sur l‟utilisation d‟une enceinte isoleacutee
refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui eacutevite le
deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des deacutebits
faibles Le deacuteveloppement de cette laquo cryosource raquo et les premiers reacutesultats obtenus en
lutilisant font lobjet du dernier chapitre de cette thegravese
149
III5 Bibliographie
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150
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17 Tanford C (1968) Protein denaturation Adv Protein Chem 23 121-282
151
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source
refroidie
152
Chapitre IV Deacuteveloppement drsquoune source refroidie 151
IV1 Echange inverse 153
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction 155
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo 156 IV22 Avec une approche laquo top-down raquo 158
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection 165
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo 166 IV32 Mateacuteriel et meacutethodes 166
IV321 Instrumentation 166
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes 168
IV33 Reacutesultats 169 IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine 169
IV3311 Reacutealisation de la maquette 169
IV3312 Reacutealisation des prototypes 169
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides 174
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK 175
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK 175
IV33221 Deacutetermination du temps d‟incubation pour le deacutemarquage seacutelectif 176
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo 179
IV3323 Cas du peptide GluF 186
IV34 Conclusion 187
IV4 Bibliographie 189
153
IV1 Echange inverse
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment dans la partie introductive l‟association des
eacutechanges isotopiques hydrogegravenedeuteacuterium en solution avec la spectromeacutetrie de masse
(HDXMS) est devenue une meacutethode de choix pour obtenir des informations sur la structure
tridimensionnelle d‟une proteacuteine ou sur son changement de conformation induit par la fixation
d‟un ligand ou d‟un partenaire proteacuteique Neacuteanmoins cette approche souffre de deux
limitations importantes (i) l‟eacutechange inverse ou laquo back-exchange raquo qui peut avoir lieu en
solution agrave diffeacuterentes eacutetapes de l‟expeacuterience et (ii) la migration intramoleacuteculaire des protons
et des deuteacuterons ou laquo scrambling raquo qui peut se deacuterouler en phase gazeuse particuliegraverement
au cours d‟expeacuteriences de spectromeacutetrie de masse en tandem (MSMS) Ces deux processus
doivent ecirctre minimiseacutes pour obtenir des reacutesultats interpreacutetables Nous avons vu dans le Chap
II que la minimisation du laquo scrambling raquo neacutecessitait une optimisation minutieuse et speacutecifique
des potentiels de la source d‟ionisation et des optiques de transfert ionique afin de rendre
minimale l‟excitation vibrationnelle des ions peptidiques deuteacutereacutes Les paramegravetres
instrumentaux ne peuvent neacuteanmoins pas ecirctre directement transfeacutereacutes d‟un instrument agrave un
autre Il convient donc d‟optimiser individuellement les diffeacuterents reacuteglages de l‟instrument
quand on en change pour eacuteviter la redistribution aleacuteatoire des hydrogegravenes et deuteacuteriums Cela
peut ecirctre commodeacutement reacutealiseacute par l‟utilisation de peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
servant de sonde du laquo scrambling raquo pendant la fragmentation ECD ou ETD (1-3)
Ce dernier chapitre de ma thegravese est consacreacute agrave la minimisation du laquo back-exchange raquo lors
d‟expeacuteriences HDXMS En effet l‟eacutechange inverse reste et demeure une neacutecessiteacute mais
eacutegalement un problegraveme seacuterieux inheacuterent agrave la technique HDX Il conduit agrave une variation du
nombre de deuteacuteriums entre l‟eacutetape de marquage et l‟analyse finale par spectromeacutetrie de
masse En geacuteneacuteral cette variation prend la forme d‟une perte de deuteacuteration apregraves eacutechange
en solution deuteacutereacutee la reacuteaction d‟eacutechange sur les hydrogegravenes d‟amide est fortement ralentie
mais pas totalement arrecircteacutee par passage en conditions acides (pH 25) et agrave tempeacuterature reacuteduite
(0degC) geacuteneacuteralement dans un solvant majoritairement hydrogeacuteneacute Par conseacutequent ce laquo back-
exchange raquo peut avoir lieu lors des eacutetapes de preacuteparation de l‟eacutechantillon (digestion
dessalage concentration seacuteparationhellip) jusqu‟agrave son injection dans le spectromegravetre de masse
et son ionisation en phase gazeuse Ce pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse est neacutecessaire pour
assurer un retour des hydrogegravenes porteacutes par les chaicircnes lateacuterales sous forme hydrogeacuteneacutee mais
doit ecirctre controcircleacute pour maintenir en place le plus grand nombre possible des deuteacuteriums en
position amide pendant le temps neacutecessaire agrave l‟analyse
154
La maniegravere la plus simple de minimiser l‟eacutechange inverse est de maintenir un pH ougrave
l‟eacutechange est minimal et de rester agrave froid (Fig I 11) Comme nous l‟avons vu
preacuteceacutedemment le pH et la tempeacuterature sont ajusteacutes respectivement agrave 25 et agrave 0degC Sous ces
conditions de laquo quench raquo l‟eacutechange des hydrogegravenes d‟amide est diminueacute de cinq ordres de
grandeur par rapport agrave un pH de 7 et une tempeacuterature de 25degC
La demi-vie pour l‟eacutechange inverse dans des conditions d‟arrecirct de la reacuteaction est entre
trente et cent vingt minutes en fonction de la seacutequence peptidique Par conseacutequent les eacutetapes
d‟analyse doivent ecirctre reacutealiseacutees le plus rapidement possible degraves lors que la reacuteaction est
bloqueacutee Ainsi il n‟est pas envisageable de reacutealiser une digestion enzymatique d‟une heure
suivie d‟un gradient d‟une heure suppleacutementaire pour l‟eacutetape de seacuteparation
chromatographique Des protocoles et dispositifs expeacuterimentaux ont eacuteteacute mis au point afin
d‟optimiser les eacutetapes de digestion et de seacuteparation (4-5) Si ces eacutetapes tiennent dans un
minimum de temps d‟environ trente minutes au total le recouvrement en deuteacuteriums peut ecirctre
supeacuterieur agrave 85 Il faut noter que quelques eacutechanges inverses ont lieu dans l‟interface de
l‟eacutelectrospray mais qu‟ils n‟excegravedent pas 5 geacuteneacuteralement
Comme nous l‟avons vu preacuteceacutedemment les hydrogegravenes des chaicircnes lateacuterales s‟eacutechangent
plus vite que les hydrogegravenes d‟amide Par conseacutequent lorsque la proteacuteine ou les peptides
marqueacutes sont placeacutes dans les solvants hydrogeacuteneacutes utiliseacutes pour la digestion ou l‟analyse
chromatographique tous les deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales redeviennent rapidement des
hydrogegravenes Ainsi un increacutement de masse pourra ecirctre associeacute agrave l‟incorporation d‟un
deuteacuterium sur une fonction amide du squelette polypeptidique Le problegraveme est un peu plus
compliqueacute pour les proteacuteines ou les peptides riches en arginine car comme nous l‟avons vu
l‟arginine possegravede sur sa chaicircne lateacuterale deux hydrogegravenes qui eacutechangent agrave la vitesse des
hydrogegravenes d‟amide et pour lesquels l‟eacutetape de lavage (substitution de D en H) sera donc
moins efficace
Notons eacutegalement que les conditions de l‟eacutechange inverse (pH acide solvant organique)
favorisent a priori une forme deacutenatureacutee pour la proteacuteine initiale conduisant agrave un eacutechange
inverse moins deacutependant des structures secondaire tertiaire et quaternaire Par conseacutequent les
vitesses d‟eacutechange ne deacutependent globalement que de la seacutequence primaire Pour des peptides
typiques cette seacutequence conduit agrave une vitesse d‟eacutechange globalement proche pour tous les
sites conduisant agrave un eacutechange inverse de type laquo aleacuteatoire raquo Ceci rend en partie compte de la
forme gaussienne des distributions isotopiques obtenues pour les peptides deuteacutereacutes
155
Finalement le choix d‟une approche laquo top-down raquo semblerait ecirctre la meilleure solution
pour minimiser l‟eacutechange inverse Dans ce cas la proteacuteine entiegravere apregraves arrecirct de la reacuteaction
d‟eacutechange par diminution du pH et de la tempeacuterature est fragmenteacutee directement en phase
gazeuse Cette approche offre donc la possibiliteacute unique de reacuteduire consideacuterablement l‟effet
du laquo back-exchange raquo voire mecircme de presque l‟eacuteliminer dans des conditions expeacuterimentales
strictes (6) Ceci est ducirc au fait qu‟il n‟y a pas d‟eacutetape preacutealable agrave l‟analyse par spectromeacutetrie
de masse telle qu‟une digestion enzymatique agrave la pepsine ou une seacuteparation
chromatographique en phase liquide Cependant il faut noter le fait qu‟il n‟est pas toujours
possible d‟opter pour une approche laquo top-down raquo En effet pour des systegravemes de taille trop
importante par exemple l‟efficaciteacute de fragmentation en ECD est trop faible pour obtenir une
reacutesolution agrave l‟acide amineacute pregraves pour la plus grande partie de la proteacuteine
Dans tous les cas apregraves le laquo quench raquo de la reacuteaction de marquage l‟eacutechantillon doit ecirctre
injecteacute si possible agrave froid et le plus rapidement dans la source du spectromegravetre de masse pour
limiter le laquo back-exchange raquo
IV2 Diffeacuterents systegravemes drsquointroduction
Plusieurs modes d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse ont
eacuteteacute deacuteveloppeacutes en fonction de l‟approche MS adopteacutee laquo bottom-up raquo ou laquo top-down raquo La
mise au point de ces diffeacuterents systegravemes d‟injection doit eacutegalement prendre en compte la
technique d‟ionisation utiliseacutee La technique d‟analyse par MS la plus communeacutement utiliseacutee
pour les expeacuteriences HDX est l‟eacutelectrospray (ESI) tandis que la meacutethode MALDI est plus
rarement employeacutee (7-11) Cela s‟explique par le fait que contrairement agrave la technique ESI
elle ne peut ecirctre coupleacutee en ligne avec des systegravemes de chromatographie liquide qui sont tregraves
utiles pour l‟analyse de meacutelanges complexes
Autrement dit seule l‟eacutelectrospray autorise le couplage avec une chromatographie liquide
en phase inverse (HPLC-ESI-MS) permettant l‟isolation de peptides et de proteacuteines en
meacutelange complexe Cette eacutetape de seacuteparation est indispensable dans beaucoup d‟eacutetudes
d‟identification et de caracteacuterisation de biomoleacutecules par spectromeacutetrie de masse Elle est
d‟autant plus neacutecessaire dans le cas d‟analyses de systegravemes proteacuteiques de grande taille en
HDXMS En effet la superposition des nombreux massifs isotopiques qui ont eacuteteacute deacuteplaceacutes et
eacutelargis par le marquage complique eacutenormeacutement l‟analyse En pratique apregraves avoir arrecircteacute la
156
reacuteaction d‟eacutechange l‟eacutechantillon est directement introduit dans la source eacutelectrospray via une
HPLC (laquo High-Performance Liquid Chromatography raquo)
La technique HPLC-ESI-MS preacutesente donc plusieurs avantages Elle est tout d‟abord
particuliegraverement bien adapteacutee pour la seacuteparation temporelle d‟un grand nombre de peptides
L‟eacutetape de seacuteparation en HPLC participe eacutegalement au lavage des chaicircnes lateacuterales des
acides amineacutes (12) Elle est compatible avec la plupart des tampons et avec la preacutesence
d‟agents deacutenaturants et offre la possibiliteacute de concentrer rapidement des eacutechantillons dilueacutes
En contre partie l‟avantage du MALDI-MS par rapport agrave l‟ESI-MS est qu‟un grand nombre
d‟eacutechantillons peuvent ecirctre analyseacutes dans une courte peacuteriode de temps De plus cette
technique est plus toleacuterante aux sels que l‟eacutelectrospray et ne requiert donc pas d‟eacutetape
preacutealable de dessalage de l‟eacutechantillon Bien que l‟ionisation MALDI soit plus facilement
reacutealisable et interpreacutetable elle conduit neacuteanmoins agrave une perte en deuteacuteriums significativement
plus eacuteleveacutee par rapport agrave la meacutethode ESI mecircme si des essais ont eacuteteacute meneacutes pour reacuteduire ces
pertes (13) De plus il n‟est pas envisageable d‟utiliser la technique MALDI pour l‟analyse de
systegravemes proteacuteiques complexes de hauts poids moleacuteculaires En effet les informations de tous
les peptides sont fournies dans un mecircme spectre de masse le rendant laquo illisible raquo et il n‟est pas
possible de reacutealiser preacutealablement agrave l‟analyse une seacuteparation par HPLC qui serait pourtant
indispensable pour ce type d‟eacutechantillon
Les deux sous-paragraphes suivants constitueront un bilan des diffeacuterents systegravemes
d‟introduction de l‟eacutechantillon marqueacute dans le spectromegravetre de masse qui ont eacuteteacute deacuteveloppeacutes
avant mon arriveacutee au laboratoire des Meacutecanismes Reacuteactionnels Ils ont eacuteteacute mis au point par
l‟eacutequipe ou par d‟autres groupes dans un contexte de minimisation de l‟eacutechange inverse
IV21 Avec une approche laquo bottom-up raquo
Une extension eacutevidente de la meacutethode HDXESI-MS est l‟utilisation du nano-deacutebit bien
qu‟elle ne soit pas encore systeacutematique En effet ce choix est particuliegraverement pertinent pour
des proteacuteines qui sont difficiles agrave obtenir (eacutechantillons biologiques preacutecieux) ainsi que pour
celles qui forment des agreacutegats proteacuteiques agrave forte concentration Ces derniegraveres suscitent un vif
inteacuterecirct car elles sont pour la plupart responsables de maladies neurodeacutegeacuteneacuteratives telles que
les maladies agrave prion dAlzheimer ou de Parkinson Dans la litteacuterature on trouve quelques
eacutetudes HDX utilisant la technique d‟analyse nano-ESI-MS laquo off-line raquo (14-15) ou coupleacutee en
157
ligne aux eacutetapes de digestion enzymatique et de seacuteparation chromatographique (16) Par la
reacuteduction du systegraveme il a eacuteteacute obtenu une sensibiliteacute supeacuterieure d‟un facteur cent tout en
conservant la deuteacuteration
Lors de la thegravese de Thorsten Daubenfeld (17) notre eacutequipe a valideacute un systegraveme par
injection directe nano-ESI-FTMS pour l‟eacutetude structurale de proteacuteines par HDX En effet les
tregraves hautes performances d‟un instrument de type FT-ICR tant au niveau de la reacutesolution que
de la preacutecision sur la mesure de masse ont permis de s‟affranchir d‟une seacuteparation
chromatographique pour les proteacuteines eacutetudieacutees (18) L‟eacutechange inverse relatif agrave cette eacutetape a
ainsi eacuteteacute eacutelimineacute Cependant comme le systegraveme n‟eacutetait pas refroidi une aiguille nanospray
autorisait un temps d‟analyse de trois minutes seulement avant le reacutechauffement de la solution
menant au pheacutenomegravene d‟eacutechange inverse Il faut noter ici que plus le temps d‟analyse est
faible moins il est aiseacute de deacutetecter des peptides deuteacutereacutes couvrant une gamme dynamique
importante seule l‟accumulation d‟un nombre important de spectres permet de gagner en
gamme dynamique Par ailleurs plus la taille du systegraveme proteacuteique est grande moins il est
facile de suivre l‟incorporation de deuteacuteriums des peptides car leur nombre croicirct fortement et
leurs massifs isotopiques deacuteplaceacutes et eacutelargis se superposent
Ce problegraveme de superposition des massifs isotopiques est classiquement reacutesolu par le
couplage du spectromegravetre de masse avec une technique de seacuteparation chromatographique (16
19) permettant d‟isoler les diffeacuterents peptides preacutesents dans l‟analyte dans une seconde
dimension Cette seacuteparation doit dans le cas d‟eacutetudes en HDXMS respecter les contraintes
lieacutees agrave la technique ie qu‟elle doit limiter les eacutechanges inverses Pour cela plusieurs
meacutethodes ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees Elles utilisent soit des solvants protiques auquel cas la
seacuteparation doit se faire agrave froid en conditions acides et rapidement soit des solvants non-
protiques Par exemple la chromatographie supercritique a eacuteteacute proposeacutee comme alternative
aux gradients sur phase inverse classiques permettant de s‟affranchir des problegravemes de
tempeacuterature et de dureacutee d‟eacutelution (20) De plus le temps de reacutetention associeacute agrave un peptide
reste inchangeacute quel que soit son degreacute de deuteacuteration En effet l‟incorporation en deuteacuteriums
des peptides n‟altegravere que tregraves peu leur temps de reacutetention (21-22) Par conseacutequent ils
serviront de reacutefeacuterence pour identifier les peptides apregraves eacutechanges HD
158
Lors de la thegravese de Magalie Duchateau (23) notre eacutequipe a mis au point et optimiseacute un
systegraveme nano-LC-ESI-FTMS refroidi pour l‟analyse structurale de proteacuteines de haut poids
moleacuteculaire et de complexes proteacuteiques tels que des complexes d‟initiation de la traduction
chez les archeacutees et les eucaryotes par HDX Le montage comprenant deux vannes nano une
preacute-colonne et une colonne est immergeacute dans de l‟eau glaceacutee pendant toute la dureacutee de
l‟analyse pour refroidir un maximum le systegraveme et ainsi minimiser les eacutechanges inverses Il
est coupleacute agrave une chaicircne de nano-chromatographie liquide
Notons eacutegalement que Waters commercialise deacutesormais un systegraveme complegravetement inteacutegreacute
pour les eacutetudes HDXMS appeleacute laquo nanoACQUITY UPLC System with HDX Technology raquo
qui peut ecirctre coupleacute agrave un spectromegravetre de masse du mecircme constructeur Le systegraveme integravegre
eacutegalement une proteacuteolyse laquo on-line raquo Les vannes et colonnes sont refroidies agrave 0degC par des
modules agrave effet Peltier
IV22 Avec une approche laquo top-down raquo
Une meacutethode populaire consiste agrave geacuteneacuterer et agrave envoyer un flux continu de solution
contenant la proteacuteine deuteacutereacutee vers la source d‟ionisation Ce dernier reacutesulte du meacutelange de la
solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange avec celle d‟arrecirct de la reacuteaction Sur ce
principe un dispositif avec deux seringues relieacutees ensemble et connecteacutees eacutegalement avec le
spectromegravetre de masse a eacuteteacute imagineacute (24) (Fig IV 1) Les deux seringues contiennent les
deux solutions agrave meacutelanger donneacutees ci-dessus Ce montage permet de proceacuteder agrave l‟arrecirct de la
reacuteaction d‟eacutechange au point de connexion des deux seringues Cette eacutetape s‟effectue laquo on-
line raquo puisque le flux reacutesultant du meacutelange des deux solutions est directement dirigeacute vers
l‟entreacutee du spectromegravetre de masse Dans ces conditions le temps pendant lequel peut avoir
lieu le laquo back-exchange raquo correspond uniquement agrave la courte dureacutee de reacutesidence dans le tube
capillaire (eg une minute) qui s‟eacutetend du nœud de connexion reliant les deux seringues agrave la
source d‟ionisation eacutelectrospray (scheacutematiseacute en violet sur la Fig IV 1) De cette faccedilon le
laquo back-exchange raquo peut ecirctre efficacement reacuteduit
159
Seringue 1 proteacuteine dans D2O
Seringue 2 solution H2O (pH 25 0degC)
Source drsquoionisation
eacutelectrospray
Arrecirct de la
reacuteaction drsquoeacutechange
Fig IV 1 Scheacutema drsquoun dispositif drsquointroduction des eacutechantillons dans une approche laquo top-
down raquo HDX mettant en œuvre le flux continu
Une autre meacutethode d‟introduction minimisant le laquo back-exchange raquo consiste agrave deacutesolvater et
ioniser directement la solution de proteacuteine dans son tampon d‟eacutechange sans passer par une
eacutetape preacutealable d‟arrecirct de la reacuteaction (25) (Fig IV 2) La reacuteaction d‟eacutechange HD est alors
arrecircteacutee au moment mecircme ougrave la proteacuteine est deacutesolvateacutee Des ions en phase gazeuse sont alors
geacuteneacutereacutes
Source ESI
Spectromegravetre
de masse
Aiguille nanospray avec solution de
proteacuteine dans tampon drsquoeacutechange
+ 1 NBA (reacuteactif superchargeacute)
Fig IV 2 Scheacutema du mode drsquointroduction des eacutechantillons par spray direct dans une
approche laquo top-down raquo HDX
Le profil de deuteacuteration en phase gazeuse devant impeacuterativement refleacuteter celui en solution
ces deux modes d‟injection sont privileacutegieacutes car ils permettent de reacuteduire le laquo back-exchange raquo
D‟autre part l‟ajout d‟une solution acide pour l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD ou
l‟utilisation d‟un reacuteactif superchargeacute tel que le NBA (laquo nitrobenzyl alcohol raquo) augmente de
faccedilon significative l‟eacutetat de charge de la proteacuteine Cela se traduit donc par une ameacutelioration
consideacuterable de l‟efficaciteacute de fragmentation par ECD (ou ETD) meacutethode choisie pour limiter
le laquo scrambling raquo Toutefois notons que ces deux montages excluent la possibiliteacute de reacutealiser
une eacutetape de dessalage preacutealable agrave l‟injection dans le spectromegravetre de masse Or dans le cas
d‟eacutechantillons reacuteels les proteacuteines sont initialement conserveacutees en conditions natives dans leur
160
tampon de purification qui est riche en sels L‟eacutelectrospray eacutetant tregraves sensible agrave la preacutesence de
sels ou d‟additifs qui contribuent agrave la suppression du signal une eacutetape de dessalage est alors
neacutecessaire avant leur analyse Par conseacutequent afin de pouvoir analyser des eacutechantillons
proteacuteiques reacuteels le deacuteveloppement de nouveaux dispositifs d‟introduction laquo off-line raquo s‟est
reacuteveacuteleacute indispensable Il est donc tregraves important de travailler agrave froid
Le systegraveme d‟injection que j‟ai utiliseacute au deacutebut de ma thegravese a eacuteteacute mis en place au sein du
laboratoire trois mois avant mon arriveacutee avec la collaboration du Professeur Joslashrgensen Il
s‟agit eacutegalement d‟un montage en flux continu mais laquo off-line raquo constitueacute d‟une seule
seringue (Fig IV 3)
Proteacuteine deuteacutereacutee dans
solution H2O (pH 25 0degC)
Source ESI
Carboglace
(-78degC)Spectromegravetre
de masse
Gaz de neacutebulisation
N2 (TdegC ambiante)
Fig IV 3 Scheacutema de notre ancien dispositif drsquointroduction des eacutechantillons en flux continu
laquo off-line raquo la seringue refroidie
Avec ce type de dispositif la preacuteparation de l‟eacutechantillon correspondant agrave son marquage et
agrave son dessalage peut ecirctre reacutealiseacutee en amont Elle se deacutecline en trois eacutetapes qui sont les
suivantes (1) initiation de la reacuteaction d‟eacutechange HD en diluant la proteacuteine dans son tampon
de purification deuteacutereacute puis (2) fixation du marquage apregraves un temps d‟incubation t donneacute en
ajoutant une solution acide (pH final de 25) agrave basse tempeacuterature (0degC) et enfin (3) dessalage
et concentration de l‟eacutechantillon agrave l‟aide d‟une colonne de phase inverse C8 Cette derniegravere
eacutetape doit ecirctre reacutealiseacutee dans la glace et pendant un temps tregraves court (une minute environ) afin
de limiter l‟eacutechange inverse L‟eacutechantillon est ensuite chargeacute immeacutediatement dans la seringue
preacutealablement refroidie agrave 0degC puis injecteacute dans la source eacutelectrospray du spectromegravetre de
masse FT-ICR
161
refroidie
Longueur minimale
Carboglace
deuteacutereacutee
Agrave 0 C
(pH 25 0 C)
Fig IV 4 Photographie de notre systegraveme drsquointroduction des eacutechantillons marqueacutes la
seringue refroidie
La photographie de notre systegraveme d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes est preacutesenteacutee ci-
dessus (Fig IV 4) Ce dernier a eacuteteacute minutieusement optimiseacute afin de reacuteduire au maximum le
laquo back-exchange raquo Pour cela la seringue d‟injection est preacutealablement refroidie agrave 0degC entre
deux sachets de glace Au terme de la dureacutee d‟eacutechange HD preacutedeacutefinie la reacuteaction est arrecircteacutee
en diluant l‟eacutechantillon dans une solution acidifieacutee (pH final de 25) agrave 0degC L‟eacutechantillon est
conserveacute dans la glace Pour des eacutechantillons reacuteels une eacutetape de dessalage est reacutealiseacutee sous
ces mecircmes conditions strictes L‟eacutechantillon est alors preacuteleveacute gracircce agrave la seringue refroidie et
injecteacute dans la source du spectromegravetre de masse FT-ICR Pendant toute la dureacutee de l‟analyse
il est lui-mecircme refroidi par un sachet de carboglace surplombant la seringue Il est transfeacutereacute
par un capillaire en PEEK qui lui est agrave tempeacuterature ambiante et dont la longueur a par
conseacutequent eacuteteacute rendue minimale Pour des raisons techniques le capillaire ne mesure pas
moins de trente et un centimegravetres Un deacutebit d‟injection important eacutegal agrave 10 microLmin a donc
eacuteteacute utiliseacute Dans ces conditions il avait eacuteteacute montreacute que ce dispositif permettait un maintien
des deuteacuteriums agrave leur place pendant au moins dix minutes d‟acquisition de donneacutees Ainsi
l‟analyse d‟un point de cineacutetique de l‟arrecirct de la reacuteaction d‟eacutechange HD agrave la fin de
l‟acquisition en MS durait environ douze minutes Le dispositif d‟analyse ideacuteal combinerait
la consommation d‟une faible quantiteacute d‟eacutechantillon tout en minimisant les eacutechanges inverses
avec un temps d‟acquisition le plus long possible
162
Apregraves quelques mois d‟expeacuterimentation de ce systegraveme j‟ai pu dresser un rapide bilan des
difficulteacutes lieacutees agrave son utilisation La premiegravere surprise a eacuteteacute le nombre de seringues que l‟on
peut fecircler ou casser avec ce dispositif En effet bien que le modegravele de seringue choisi
(seringues Hamilton seacuterie 800) propose un piston renforceacute l‟eacutechantillon refroidi par la
carboglace a tendance agrave congeler Il forme alors un glaccedilon Tandis que le pousse-seringue
continue agrave fonctionner et agrave envoyer l‟eacutechantillon vers le spectromegravetre de masse une
surpression finit par ecirctre exerceacutee au niveau du verre de la seringue jusqu‟agrave sa fecirclure si
l‟analyse n‟est pas interrompue ou l‟eacutechantillon reacutechauffeacute Par ailleurs les deacutebits d‟injection
utiliseacutes impliquent de disposer d‟importantes quantiteacutes d‟eacutechantillon Dans le cas de l‟analyse
d‟eacutechantillons biologiques preacutecieux cette technique ne pourrait pas ecirctre utiliseacutee De plus
comme nous l‟avons vu dans le chapitre preacuteceacutedent les expeacuteriences sont difficilement
reproductibles Ayant pour objectif d‟ameacuteliorer le systegraveme j‟ai testeacute l‟effet du refroidissement
de l‟eacutechantillon par la carboglace lors de l‟analyse par MS et l‟influence du deacutebit d‟injection
sur le laquo back-exchange raquo
Pour cela j‟ai utiliseacute un systegraveme modegravele l‟ubiquitine Il s‟agit d‟une petite proteacuteine de 76
reacutesidus (86 kDa) dont la structure a eacuteteacute complegravetement deacutecrite dans la litteacuterature et qui est
souvent utiliseacutee dans la mise au point d‟approches par eacutechange HD Apregraves avoir deuteacutereacute
complegravetement l‟ubiquitine par incubation dans D2O (Annexe Mateacuteriel et meacutethodes) elle est
dilueacutee au centiegraveme dans une solution acidifieacutee H2OMeOH (4060) agrave environ 0degC Des
meacutelanges H2OACN (5050) eacutetaient auparavant utiliseacutes Le fait de choisir le meacutethanol comme
solvant et de l‟utiliser en plus grande proportion permet d‟une part d‟ameacuteliorer le processus
d‟ionisation par eacutelectrospray et d‟autre part de diminuer consideacuterablement le point de
congeacutelation de la solution agrave analyser Cela empecircche la formation systeacutematique de glaccedilons dus
au refroidissement de la solution par la carboglace L‟ubiquitine est ensuite directement
preacuteleveacutee par la seringue refroidie et injecteacutee dans la source ESI du spectromegravetre de masse FT-
ICR L‟analyse MS est reacutealiseacutee avec ou sans le sachet de carboglace surplombant la seringue
puis en testant diffeacuterents deacutebits d‟injection Le pourcentage de deuteacuteration de l‟ubiquitine est
suivi au cours des dix minutes d‟analyse autoriseacutes par le systegraveme de seringue refroidie afin de
mesurer l‟eacutechange inverse Les expeacuteriences sont reacutealiseacutees en duplicats ou triplicats pour
estimer l‟erreur de mesure
En theacuteorie en absence d‟eacutechange inverse la valeur du pourcentage de deuteacuteration devrait
rester constante et maximale en fonction du temps Dans la situation ideacuteale l‟ensemble des
hydrogegravenes d‟amide devraient ecirctre marqueacutes et aucun autre site ne devrait ecirctre deuteacutereacute
163
deacutefinissant ainsi un 100 theacuteorique En pratique ce pourcentage doit ecirctre corrigeacute pour
prendre en compte la preacutesence de deuteacuteriums dilueacutes dans la solution d‟eau leacutegegravere acidifieacutee On
peut par conseacutequent corriger le ratio maximal par la formule suivante
ougrave Ntot est le nombre total de sites eacutechangeables (hydrogegravenes d‟amide et chaicircnes lateacuterales)
Namide est le nombre de liaisons peptidiques R est le pourcentage de deuteacuteriums dans la
solution dilueacutee rapporteacute au nombre total d‟hydrogegravenes et de deuteacuteriums Damide est le taux de
deuteacuteration reacuteel des hydrogegravenes d‟amide ducirc au marquage et Dexp est le ratio de deuteacuteration
expeacuterimental donneacute par la formule suivante
ougrave nD est le nombre de deuteacuteriums (mesureacute par spectromeacutetrie de masse par exemple) Du fait
de la preacutesence de deuteacuteriums dans la solution on s‟attend donc agrave une surestimation du taux de
deuteacuteration Ainsi par exemple si on considegravere une dilution au 1100e dans une solution 6040
meacutethanoleau on trouve un ratio de deuteacuteration R de 19
ougrave 18 et 32 sont les masses molaires de l‟eau et du meacutethanol 079 est la densiteacute du meacutethanol
(celle de l‟eau est prise agrave 1) 4060 sont les proportions d‟eau et de meacutethanol
On s‟attend par conseacutequent agrave un taux de deuteacuteration maximal (avec Ntot = 146 Namide = 72)
d‟environ 102
De plus un excegraves de deuteacuteration suppleacutementaire peut ecirctre ducirc au non reacute-eacutechange d‟un
hydrogegravene pour les chaicircnes lateacuterales d‟arginine or l‟ubiquitine comporte 4 arginines dans sa
seacutequence Dans la suite de ce manuscrit une reacutefeacuterence agrave 105 sera prise qui correspond au
maximum expeacuterimentalement observeacute pour les diffeacuterents montages qui seront tenteacutes
164
Dans le cas des injections utilisant le montage d‟origine l‟eacutevolution preacutesenteacutee ci-dessous
est observeacutee (Fig IV 5)
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Avec carboglace Sans carboglace
Fig IV 5 Evolution du taux de deuteacuteration de lrsquoubiquitine mesureacute en fonction du temps apregraves
le deacutebut de lrsquoinjection Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI
par le systegraveme de seringue refroidie Bleu pas de carboglace placeacute sur la seringue rouge
avec carboglace
Lors des cinq premiegraveres minutes les courbes avec et sans carboglace preacutesentent la mecircme
allure et se confondent presque La solution d‟ubiquitine agrave 0degC injecteacutee agrave 10 microLmin par la
seringue refroidie n‟a pas le temps de se reacutechauffer mecircme en l‟absence de carboglace Au
bout de cinq minutes la solution d‟ubiquitine se reacutechauffe en l‟absence de carboglace Ils
s‟opegraverent alors des eacutechanges inverses faisant chuter le pourcentage de deuteacuteration Par
conseacutequent en l‟absence de carboglace on divise le temps d‟analyse par deux au moins dans
des expeacuteriences HDXMS La partie initiale avec un taux de deuteacuteration plus eacuteleveacute
correspond agrave la combinaison d‟une perte de deuteacuteriums au cours du temps avec un effet de
deacutebit car initialement la seringue est maintenue agrave un deacutebit eacuteleveacute jusqu‟agrave apparition du signal agrave
t=0
L‟effet du deacutebit d‟injection de l‟eacutechantillon sur l‟eacutechange inverse (Fig IV 6) a ensuite eacuteteacute
testeacute pour le deacutebit de reacutefeacuterence de 10 microLmin et pour un deacutebit diviseacute par cinq de 2 microLmin
165
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie 10 microLmin 2 microLmin
Fig IV 6 Effet du deacutebit drsquoinjection sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse
MS Lrsquoubiquitine complegravetement deuteacutereacutee est introduite dans la source ESI par le systegraveme de
seringue refroidie surplombeacutee de carboglace Rouge deacutebit de 10 microLmin-1
violet deacutebit de
2 microLmin-1
Avec un faible deacutebit d‟injection (2 microLmin) de l‟eacutechantillon marqueacute le pourcentage de
deuteacuteration de l‟ubiquitine diminue consideacuterablement au cours de l‟analyse MS Les eacutechanges
inverses sont donc plus nombreux dans ces conditions expeacuterimentales On enregistre un
laquo back-exchange raquo moyen apregraves eacutequilibration de 35
Les graphes des Fig IV 5 et Fig IV 6 montrent que le systegraveme de seringue refroidie
permet de reacuteduire au maximum le laquo back-exchange raquo si l‟eacutechantillon est lui-mecircme refroidi par
la carboglace lors de l‟analyse MS et qu‟il est injecteacute agrave un deacutebit eacuteleveacute (10 microLmin)
Cependant le laquo back-exchange raquo moyen reste non neacutegligeable eacutegal agrave 20 Ayant eacutetudieacute
l‟ensemble des paramegravetres possibles en restant sur la base de ce systegraveme nous ne pouvons
guegravere plus l‟ameacuteliorer Nous avons donc deacutecideacute d‟inventer et de deacutevelopper un nouveau
systegraveme d‟introduction
IV3 Deacuteveloppement drsquoun nouveau dispositif drsquoinjection
L‟ideacutee a eacuteteacute d‟imaginer un dispositif capable de stocker l‟eacutechantillon marqueacute aux
deuteacuteriums agrave tregraves basse tempeacuterature en dessous de zeacutero degreacute avant son analyse finale par
spectromeacutetrie de masse
166
IV31 Qursquoest-ce que la laquo cryosource raquo
La laquo cryosource raquo est le nom que nous avons donneacute agrave notre dispositif d‟injection (Fig IV
7) Il s‟agit d‟une enceinte close thermostateacutee agrave tempeacuterature controcircleacutee avec comme objectif
initial une plage de tempeacuterature allant de la tempeacuterature ambiante agrave -100degC C‟est une boicircte
thermiquement isoleacutee issue de la transformation d‟une glaciegravere Elle se branche directement
sur la source ESI Elle est traverseacutee par un flux reacuteguleacute de gaz refroidi agrave l‟azote liquide (78 K)
La tempeacuterature interne de la boicircte est mesureacutee en continu par une sonde thermique et ajusteacutee
par un reacutegulateur de tempeacuterature controcirclant une reacutesistance chauffante L‟eacutechantillon est
introduit dans la laquo cryosource raquo puis injecteacute dans la source ESI du FT-ICR par un systegraveme de
vanne et boucle d‟injection Il est entraicircneacute vers le spectromegravetre de masse gracircce agrave l‟entreacutee d‟un
flux continu de solvant geacuteneacutereacute par un pousse-seringue situeacute agrave l‟exteacuterieur de la laquo cryosource raquo
deuteacutereacute agrave pH 25 et agrave 0 C
-30 C
Reacutegulateur de tempeacuterature
N2 (-30 C)
Azote liquide
Fig IV 7 Photographie de la laquo cryosource raquo
IV32 Mateacuteriel et meacutethodes
IV321 Instrumentation
Dans un premier temps voici la description de la version optimiseacutee de la laquo cryosource raquo et
des conditions expeacuterimentales neacutecessaires agrave la reacutealisation d‟expeacuteriences pour l‟eacutetude de la
167
structure de petites proteacuteines en HDXMS Elle est illustreacutee dans le scheacutema ci-apregraves (Fig IV
8)
L‟enceinte inteacuterieure de la laquo cryosource raquo est refroidie agrave une tempeacuterature de -30degC par
l‟arriveacutee d‟un gaz froid via un tuyau en cuivre Celui-ci forme un serpentin plongeacute dans un
reacutecipient rempli d‟azote liquide (78 K) qui permet le refroidissement du flux continu de gaz
entrant dans le systegraveme Une partie du gaz froid est envoyeacutee dans la laquo cryosource raquo agrave l‟aide
d‟un raccord en T tandis que l‟autre partie traverse le systegraveme et vient refroidir la ligne de
transfert de l‟eacutechantillon qui est introduit dans la source ESI
L‟inteacuterieur de la boicircte est maintenu agrave une tempeacuterature constante par un reacutegulateur de
tempeacuterature eacutequipeacute d‟une sonde thermique et d‟un ruban chauffant La sonde thermique de
type K est positionneacutee au niveau de la boucle contenant l‟eacutechantillon tandis que le ruban
chauffant entoure les tuyaux en cuivre deacuteposeacutes au fond de la boicircte Un ventilateur placeacute dans
l‟enceinte assure l‟homogeacuteneacuteiteacute de la tempeacuterature dans celle-ci
L‟eacutechantillon introduit dans une boucle de 75 microL par une vanne d‟injection est pousseacute vers
la source ESI du spectromegravetre de masse FT-ICR par le solvant agrave l‟aide d‟un pousse-seringue
Il est programmeacute agrave 2 microLmin correspondant agrave la valeur minimale du deacutebit pour laquelle le
spray est stable pour notre montage Les deacutebits infeacuterieurs deviennent instables lors du
refroidissement du montage probablement agrave cause de l‟augmentation de la viscositeacute des
solvants agrave -30degC Le volume injecteacute pour le remplissage de la boucle est de 100 microL
Finalement le gaz de neacutebulisation est eacutegalement refroidi par l‟azote liquide Il est envoyeacute agrave
l‟inteacuterieur du dispositif par un second tuyau en cuivre et est relieacute agrave l‟aiguille de neacutebulisation
de la source ESI permettant son refroidissement
168
Fig IV 8 Scheacutema du principe de la laquo cryosource raquo
IV322 Preacuteparation et analyse des eacutechantillons marqueacutes
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de l‟ubiquitine proteacuteine modegravele et de peptides de reacutefeacuterence que l‟on peut deuteacuterer de
maniegravere seacutelective (peptides modegraveles conccedilus par le Prof T Joslashrgensen Universiteacute dOdense
Danemark)
L‟ubiquitine (100 microM) et les peptides modegraveles (1 mM) sont complegravetement deuteacutereacutes par
incubation dans D2O Ils sont ensuite dilueacutes (au 1100e) dans une solution H2OMeOH
(4060) agrave basse tempeacuterature contenant de l‟acide formique (2) pour l‟ubiquitine et de
l‟acide aceacutetique pour les peptides (05 M pH=23) L‟ubiquitine est alors immeacutediatement
analyseacutee par FT-ICR MS Les peptides quant agrave eux sont analyseacutes apregraves une incubation dans
H2O glaceacutee pendant un temps agrave deacuteterminer (environ 10 min avec le systegraveme de seringue
refroidie) afin de deacutemarquer seacutelectivement l‟extreacutemiteacute N-terminale et conserver un nombre
moyen de 45 deuteacuteriums du cocircteacute C-terminal (26-27)
L‟eacutetape de dessalage a eacuteteacute reacutealiseacutee manuellement sur colonne Une cartouche Sep-Paktrade
C8 a eacuteteacute utiliseacutee
169
IV33 Reacutesultats
IV331 Conception du produit et optimisation sur une petite proteacuteine
IV3311 Reacutealisation de la maquette
Cette phase de reacutealisation de la maquette initiale a permis une grande creacuteativiteacute de notre
part et a deacutetermineacute la faisabiliteacute technologique des choix de conception Elle a eacuteteacute conccedilue agrave
l‟aide d‟un bac agrave glace isotherme et de son couvercle Cette boicircte en polystyregravene a montreacute de
bonnes capaciteacutes de stockage agrave basse tempeacuterature malgreacute des fuites thermiques non
neacutegligeables causant une perte de froid En particulier elle a permis de valider la plage de
tempeacuterature atteignable (0degC agrave -100degC) et de veacuterifier la faisabiliteacute de l‟utilisation de meacutelanges
eausolvant organique agrave ces tempeacuteratures On notera en particulier que bien que les
tempeacuteratures de cristallisation des meacutelanges eaumeacutethanol et eauaceacutetonitrile soient connues
la viscositeacute de ceux-ci ne l‟est pas Pour les meacutelanges eaumeacutethanol qui preacutesentent des
tempeacuteratures de cristallisation infeacuterieures agrave -100degC agrave forts rapports meacutethanoleau il s‟est
aveacutereacute impossible d‟obtenir un deacutebit stable agrave des tempeacuteratures infeacuterieures agrave -80degC Pour les
meacutelanges eauaceacutetonitrile la limite se situe vers -25degC pour un minimum theacuteorique agrave -43degC
IV3312 Reacutealisation des prototypes
Le produit a ensuite eacuteteacute deacuteveloppeacute et des prototypes ont eacuteteacute reacutealiseacutes pour permettre sa
validation apregraves une seacuterie de tests
Pour cela une glaciegravere de la marque Campingaz qui preacutesentait l‟avantage d‟avoir des
joints d‟eacutetancheacuteiteacute ainsi qu‟une reacutesistance garantie agrave des tempeacuteratures de -78degC a eacuteteacute
transformeacutee en laquo cryosource raquo Dans la premiegravere version de notre dispositif d‟introduction agrave
froid des eacutechantillons marqueacutes dans le spectromegravetre de masse le gaz de neacutebulisation a eacuteteacute
laisseacute agrave tempeacuterature ambiante (Fig IV 9)
170
Fig IV 9 Scheacutema du prototype de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave
tempeacuterature ambiante
Afin de valider le prototype nous lavons compareacute agrave l‟ancien systegraveme d‟injection la
seringue refroidie Les reacutesultats obtenus avec la premiegravere version de la laquo cryosource raquo (courbe
en violet) sont assez similaires agrave ceux enregistreacutes avec la seringue refroidie (courbe en rouge)
(Fig IV 10) L‟ubiquitine preacutesente un taux de deuteacuteration un peu plus eacuteleveacute lorsqu‟elle est
introduite par la laquo cryosource raquo par rapport agrave la seringue refroidie Par contre le pourcentage
de deuteacuteration est instable au cours de l‟analyse MS La laquo cryosource raquo dans cette
configuration n‟apporte pas de valeur ajouteacutee agrave la seringue refroidie Elle doit donc ecirctre
ameacutelioreacutee pour ecirctre valideacutee
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (Ta) Seringue refroidie
Fig IV 10 Effet du systegraveme drsquoinjection utiliseacute sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de
lrsquoanalyse MS Les dispositifs ici compareacutes sont le systegraveme de seringue refroidie et la premiegravere
version de la laquo cryosource raquo avec le gaz de neacutebulisation agrave tempeacuterature ambiante
Ubiquitine
171
L‟ameacutelioration de notre dispositif a porteacute sur le refroidissement du gaz de neacutebulisation par
l‟azote liquide (78 K) (Fig IV 8) Il est envoyeacute dans l‟enceinte isoleacutee agrave -30degC par un tuyau en
cuivre qui traverse la boicircte L‟extreacutemiteacute du tuyau de cuivre agrave la sortie de la laquo cryosource raquo
est brancheacutee au niveau de la source ESI L‟aiguille de spray est par ce systegraveme elle-mecircme
refroidie
On obtient alors un spray refroidi stable qui nous donne les reacutesultats suivants (courbe en
bleu fonceacute) (Fig IV 11) Dans cette configuration l‟ubiquitine preacutesente un pourcentage
moyen de deuteacuteration nettement supeacuterieur agrave celui obtenu avec les autres systegravemes (ou
versions de systegravemes) et le taux de deuteacuteration est stable tout au long de l‟analyse MS (Fig
IV 11 Tab IV 1)
Tab IV 1 Pourcentages moyens de deuteacuteration de lrsquoubiquitine obtenus agrave lrsquoaide de la
seringue refroidie et de la laquo cryosource raquo dans les versions 1 et 2 et calculeacutes agrave diffeacuterents
temps de lrsquoanalyse par MS
1 min d‟analyse 5 min d‟analyse 10 min d‟analyse
Seringue refroidie 8870 8518 8484
Cryosource version 1 9773 9167
Cryosource version 2 10388 10433 10388
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource N2 (-30degC)
Seringue refroidie Cryosource N2 (Ta)
Fig IV 11 Effet du refroidissement du gaz de neacutebulisation agrave -30degC avec la laquo cryosource raquo
sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Ubiquitine
172
La Fig IV 11 montre que la ldquocryosourcerdquo dans sa version ameacutelioreacutee (avec le gaz de
neacutebulisation refroidi) agrave -30degC et pour un deacutebit d‟injection de 2 microLmin conduit agrave un
pourcentage de deuteacuteration tregraves proche de la valeur maximale attendue (105) et qui reste
stable pendant toute la dureacutee de l‟analyse par rapport au systegraveme de seringue refroidie La
laquo cryosource raquo avec ses diffeacuterents paramegravetres optimiseacutes est alors valideacutee
Nous avons ensuite testeacute diffeacuterentes tempeacuteratures dans la cryosource pour voir l‟influence
du paramegravetre tempeacuterature sur la deuteacuteration J‟ai donc eacutegalement testeacute les tempeacuteratures de -
20degC (courbe en violet) et -10degC (courbe en rouge) (Fig IV 12) Quelle que soit la
tempeacuterature de la laquo cryosource raquo elle nous permet de maintenir constant le taux de
deuteacuteration au cours de l‟analyse Cependant plus la tempeacuterature augmente plus le laquo back-
exchange raquo est important En effet agrave -30degC il est infeacuterieur agrave 3 tandis qu‟agrave -20degC le laquo back-
exchange raquo moyen est de 25 et agrave -10degC il est de 35 Ceci peut s‟expliquer par le fait que la
partie correspondant agrave la sortie de laquo cryosource raquo juste avant l‟entreacutee dans la source ESI
n‟est pas recouverte par un manchon isolant Elle est certes refroidie par l‟arriveacutee d‟un gaz
froid agrave -30degC mais qui se reacutechauffe au contact de l‟air conduisant agrave une perte de froid
Lorsque l‟inteacuterieur de la boicircte est agrave -30degC alors la sortie de la laquo cryosource raquo enregistre une
tempeacuterature d‟environ -10degC suffisante pour eacuteviter le reacute-eacutechange des deuteacuteriums avec les
hydrogegravenes Mais lorsque la tempeacuterature de la laquo cryosource raquo est supeacuterieure agrave -30degC ie agrave -
20degC ou agrave -10degC la sortie preacutesente des tempeacuteratures positives conduisant agrave du laquo back-
exchange raquo
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie -30degC -20degC -10degC
Fig IV 12 Effet de la tempeacuterature interne de la laquo cryosource raquo sur le maintien en place des
deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
173
Les Fig IV 11 et Fig IV 12 montrent que l‟utilisation de la laquo cryosource raquo agrave -30degC et
avec le refroidissement du gaz de neacutebulisation permet de reacuteduire le deacutebit d‟injection agrave 2
microLmin avec un laquo back-exchange raquo minimal (lt 3)
Nous avons ensuite voulu quantifier le laquo back-exchange raquo imputable agrave l‟eacutetape de dessalage
En effet le but ultime de cette eacutetude est de pouvoir utiliser notre dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes pour l‟analyse structurale de proteacuteines et de complexes proteacuteiques reacuteels
D‟apregraves le graphe de la Fig IV 13 nous concluons que l‟eacutetape de dessalage conduit agrave une
perte de 20 de la deuteacuteration lui aussi tregraves stable au cours du temps
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500 600
Po
urc
en
tage
de
de
uteacute
rati
on
Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Sans dessalage Avec dessalage
Fig IV 13 Effet du dessalage sur le maintien en place des deuteacuteriums lors de lrsquoanalyse MS
Nous avons deacuteveloppeacute un dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes dans le
spectromegravetre de masse qui reacuteduit consideacuterablement le laquo back-exchange raquo Nous avons
deacutetermineacute un ensemble de paramegravetres optimiseacutes conduisant agrave moins de 3 d‟eacutechange inverse
en solution Pour cela il est indispensable d‟utiliser la laquo cryosource raquo pour refroidir
l‟eacutechantillon la tempeacuterature optimale du systegraveme eacutetant de -30degC pour un deacutebit d‟injection de
l‟analyte de 2 microLmin Le gaz de neacutebulisation doit ecirctre eacutegalement refroidi agrave -30degC La
laquo cryosource raquo preacutesente plusieurs avantages Elle permet de refroidir l‟eacutechantillon agrave tregraves basse
tempeacuterature agrave une valeur bien au-dessous de zeacutero degreacute Celsius ce qui allonge
consideacuterablement le temps d‟analyse La tempeacuterature est en effet stable pendant des temps
longs allant jusqu‟agrave une heure Et elle autorise de plus faibles deacutebits d‟injection Les diffeacuterents
paramegravetres optimiseacutes au niveau de l‟ancien et du nouveau dispositif d‟introduction des
eacutechantillons marqueacutes sont reacutecapituleacutes et compareacutes dans le tableau (Tab IV 2) Le dessalage
174
est maintenant l‟eacutetape critique pour la minimisation du laquo back-exchange raquo Il faudrait ecirctre
capable de le reacutealiser eacutegalement agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo
Tab IV 2 Comparaison des paramegravetres optimiseacutes pour les systegravemes de seringue refroidie et
de laquo cryosource raquo
Finalement il convient de noter qu‟une derniegravere ameacutelioration a eacuteteacute apporteacutee agrave la
laquo cryosource raquo suite agrave l‟observation de problegravemes de reproductibiliteacute preacutesenteacutes ci-dessous Il
apparaissait reacuteguliegraverement des problegravemes de bouchage du montage ougrave apregraves injection le
montage se retrouvait agrave monter en pression au-delagrave de la limite permise par le pousse-
seringue Apregraves recherche de l‟origine de ce problegraveme reacutecurrent nous avons pu identifier ce
problegraveme comme eacutetant arriveacute lors de l‟ajout du gaz de neacutebulisation refroidi et eacutetant lieacute agrave une
tempeacuterature du tuyau d‟ameneacutee de ce gaz largement infeacuterieure agrave celle de l‟enceinte (-65degC
mesureacutes agrave la jonction avec la source ESI) L‟augmentation de viscositeacute voire la cristallisation
au niveau de ces points froids pourrait ecirctre agrave l‟origine de ces pheacutenomegravenes de bouchage Ce
problegraveme a eacuteteacute reacutegleacute en ameacuteliorant les eacutechanges thermiques dans l‟enceinte agrave la fois par
l‟augmentation du contact tuyau du gaz de neacutebulisationruban chauffant mais eacutegalement par
l‟ajout d‟un ventilateur dans l‟enceinte Une contrepartie de ces ajouts est une perte de la
capaciteacute de refroidissement en dessous de -30degC
IV332 Validation de la laquo cryosource raquo et optimisation sur des peptides
Nous avons ensuite souhaiteacute valider notre dispositif d‟introduction des eacutechantillons
marqueacutes permettant la minimisation du laquo back-exchange raquo sur des peptides modegraveles
seacutelectivement deuteacutereacutes En effet ces peptides sont speacutecifiquement construits pour la mise au
point d‟expeacuteriences HDXMS Leur analyse permet d‟eacutetudier les pheacutenomegravenes de laquo back-
exchange raquo et plus particuliegraverement de laquo scrambling raquo
175
IV3321 Validation de la laquo cryosource raquo pour HHHHHHIIKIIK
Le peptide HHHHHHIIKIIK complegravetement deuteacutereacute est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-
terminal apregraves dilution dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes
d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide introduit par la cryosource dans le spectromegravetre de
masse FT-ICR contient bien 45 deuteacuteriums Le reacutesultat est conforme agrave la publication de T
Joslashrgensen (26) De plus au cours de l‟analyse MS le nombre de deuteacuteriums reste constant par
rapport agrave l‟utilisation du systegraveme de seringue refroidie (Fig IV 14) La laquo cryosource raquo permet
donc de reacuteduire au maximum l‟eacutechange inverse dans le cas eacutegalement de l‟analyse du peptide
HHHHHHIIKIIK par HDX Le systegraveme peptide modegravele laquo cryosource raquo permettra d‟eacutetudier
par la suite le laquo scrambling raquo avec preacutecision
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Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource Seringue refroidie
Fig IV 14 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse Comparaison de la
laquo cryosource raquo vs la seringue refroidie
IV3322 Cas du peptide KKDDDDDDIIKIIK
La mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee avec le peptide KKDDDDDDIIKIIK qui appartient agrave la
mecircme famille que HHHHHHIIKIIK Dans un premier temps il est complegravetement deuteacutereacute par
incubation dans D2O Puis il est seacutelectivement deacutemarqueacute du cocircteacute N-terminal par dilution dans
une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature Apregraves dix minutes d‟incubation dans H2O
glaceacutee le peptide est finalement injecteacute dans la laquo cryosource raquo puis analyseacute en spectromeacutetrie
de masse Son nombre de deuteacuteriums est alors supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) (Fig IV
15) Avant de tester la stabiliteacute de la laquo cryosource raquo il nous faut deacuteterminer le temps
HHHHHHIIKIIK
176
d‟incubation dans H2O glaceacutee pour lequel le peptide aura incorporeacute 45 deuteacuteriums
Apparemment ce temps serait supeacuterieur agrave quatorze minutes
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5589655
5592998
55963595599711
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000001d +MS2(5586)
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Intens
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
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5606417 5609768
5613124
5616476
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111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000010d +MS2(5609)
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7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5589678 5593021 5596386
5599737
5603078
56064175609769
5613122
5616475
56198235623167
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000017d +MS2(5609)
00
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10
15
20
25
7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
5593029
5596384
5599727
5603066
5606408
5609760
5613115
5616464
5619811
111005_KKDDDDDDIIKIIK_cryosource_000030d +MS2(5609)
00
05
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7x10
5590 5595 5600 5605 5610 5615 5620 5625 5630 mz
58 D
Reacutefeacuterence sans HDX
Avec HDX sans incubation dans
H2O analyse agrave t0 = 0 min
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 10 min56 D
Avec HDX incubation dans H2O
pendant 14 min
50 D
(a)
(b)
(c)
(d)
Fig IV 15 Zoom du massif isotopique de lrsquoion parent [M+3H] 3+
dans les spectres MS du
peptide KKDDDDDDIIKIIK Les eacutechantillons marqueacutes sont introduits par la laquo cryosource raquo
et le nombre de deuteacuteriums incorporeacutes est calculeacute apregraves diffeacuterents temps drsquoincubation dans
H2O t0=0 min (b) 10 min (c) et 14 min (d) par rapport agrave la reacutefeacuterence sans marquage (a)
IV33221 Deacutetermination du temps drsquoincubation pour le deacutemarquage seacutelectif
J‟ai donc deacutecideacute de retravailler avec le systegraveme de seringue refroidie pour pouvoir
deacuteterminer ce temps Le montage reacutealiseacute a eacuteteacute le suivant apregraves que l‟eacutechantillon ait eacuteteacute
complegravetement deuteacutereacute il a eacuteteacute dilueacute dans une solution H2O acide et agrave basse tempeacuterature pour
bloquer la reacuteaction d‟eacutechange HD Il a ensuite eacuteteacute immeacutediatement preacuteleveacute et injecteacute agrave 10
microLmin par la seringue refroidie qui a eacuteteacute entoureacutee par deux sachets de glace L‟acquisition
des donneacutees a eacuteteacute reacutealiseacutee pendant vingt-cinq minutes Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig
IV 16 Avec le systegraveme de seringue refroidie le temps requis semble ecirctre de quatorze
minutes alors qu‟il paraissait ecirctre supeacuterieur avec la laquo cryosource raquo
La difficulteacute geacuteneacuterale agrave laquelle nous n‟avions pas penseacute initialement est la suivante les
hydrogegravenes d‟amide ne se deacutemarquent pas agrave la mecircme vitesse et dans les expeacuteriences de T
Joslashrgensen la fin du deacutemarquage a lieu dans le capillaire de transfert qui est agrave tempeacuterature
177
ambiante Elle est donc incontrocirclable La laquo cryosource raquo quant agrave elle ne comporte pas de
capillaire de transfert agrave tempeacuterature ambiante pour finir le deacutemarquage Par conseacutequent il
nous faut deacuteterminer avec ce nouveau mode d‟introduction le temps d‟incubation des
peptides dans H2O pour les deacutemarquer seacutelectivement et avoir exactement le bon nombre
initial de deuteacuteriums Il semblerait que ce temps d‟incubation soit plus long dans le cas de
l‟utilisation de la laquo cryosource raquo
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Temps danalyse (en minutes)
Fig IV 16 Nombre de deuteacuteriums de lrsquoion parent [M+3H] 3+
du peptide KKDDDDDDIIKIIK
calculeacute en fonction du temps de reacutesidence dans la seringue refroidie agrave 0degC tout au long de
lrsquoanalyse
Par conseacutequent j‟ai travailleacute de nouveau avec la laquo cryosource raquo par tacirctonnements J‟ai
reacutealiseacute plusieurs essais (Fig IV 17) Un essai correspond agrave une incubation du peptide
complegravetement marqueacute dans H2O glaceacutee et agrave une ou plusieurs injections dans la laquo cryosource raquo
agrave diffeacuterents temps D‟apregraves les reacutesultats du premier essai (points en bleu) le nombre de
deuteacuteriums retenu par le peptide seacutelectivement deacutemarqueacute apregraves vingt minutes d‟incubation est
supeacuterieur (53) agrave ce qui est attendu (45) mais apregraves trente minutes il est infeacuterieur (40) Un
deuxiegraveme essai a donc eacuteteacute reacutealiseacute apregraves vingt-cinq minutes d‟incubation (point rouge)
supposeacute ecirctre le temps que l‟on cherche agrave deacuteterminer Mais le nombre de deuteacuteriums s‟est
aveacutereacute bien supeacuterieur (68) agrave ce que nous attendions Un troisiegraveme essai (point orange) agrave trente
minutes d‟incubation a donneacute exactement le mecircme nombre de deuteacuteriums (53) qu‟une
mesure effectueacutee preacuteceacutedemment agrave vingt minutes (1er
essai) Un dernier essai a eacuteteacute reacutealiseacute pour
diffeacuterents temps d‟incubation allant de vingt agrave soixante minutes (points en violet) laissant
supposer que vingt-cinq minutes serait le temps rechercheacute Notons ici que je n‟ai pas eu de
178
signal en spectromeacutetrie de masse pour des temps d‟incubation infeacuterieurs agrave vingt minutes
Pourtant j‟ai testeacute les temps t= 0 15 min Par conseacutequent les reacutesultats ne sont pas
reproductibles et il semblerait que j‟ai rencontreacute des problegravemes de bouchage en raison de
l‟apparition de points froids dans le montage
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Theacuteorie 1er essai 2e essai 3e essai 4e essai
Fig IV 17 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee
J‟ai alors reacutealiseacute le mecircme type d‟expeacuterience un autre jour en augmentant le deacutebit agrave 25
microLmin (courbe noire Fig IV 18) Cela m‟a permis finalement d‟obtenir du signal pour des
temps t= 0 15 min Cependant le temps d‟incubation dans H2O glaceacutee pour avoir le bon
nombre de deuteacuteriums initial semble avoir consideacuterablement eacuteteacute reacuteduit (de 25 agrave 10 min
environ) Pour s‟assurer de la reproductibiliteacute des reacutesultats la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee un
autre jour (courbe orange) Puis j‟ai effectueacute deux autres essais (courbes bleue et rouge) le
mecircme jour apregraves avoir recouvert la sortie de la laquo cryosource raquo qui se branche sur la source
ESI du FT-ICR par un manchon isolant L‟ideacutee ici est de limiter au maximum les pertes de
froid agrave cet endroit La tempeacuterature diminue passant de -8degC agrave -15degC Ainsi le nombre de
deuteacuteriums est augmenteacute Les reacutesultats semblent reproductibles et deacutesormais un temps
d‟incubation de quinze minutes semble convenir
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Temps dincubation dans H2O glaceacutee (en minutes)
Fig IV 18 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoincubation dans H2O glaceacutee Le
deacutebit drsquoinjection a eacuteteacute augmenteacute agrave 25 microLmin et la sortie de la laquo cryosource raquo isoleacutee
thermiquement (courbes en bleu et en rouge)
IV33222 Veacuterification de la stabiliteacute de la deuteacuteration dans la laquo cryosource raquo
Apregraves quinze minutes d‟incubation dans H2O glaceacutee le peptide est de nouveau injecteacute dans
la laquo cryosource raquo puis analyseacute par spectromeacutetrie de masse Son nombre de deuteacuteriums est une
nouvelle fois supeacuterieur (56) agrave celui attendu (45) De plus un pheacutenomegravene tout agrave fait
incompreacutehensible est observeacute le nombre de deuteacuteriums augmente lors des premiegraveres minutes
de l‟analyse alors que le peptide est stockeacute agrave -30degC dans la laquo cryosource raquo Le peptide gagne
deux deuteacuteriums suppleacutementaires au bout de cinq minutes passant de 56 agrave 76 deuteacuteriums
(Fig IV 19) Dans ces conditions la minimisation du laquo scrambling raquo en utilisant le peptide
KKDDDDDDIIKIIK et la laquo cryosource raquo ne peut pas ecirctre envisageacutee
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Temps danalyse (en secondes)
Theacuteorie Cryosource
Fig IV 19 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse
Pour s‟assurer que ce pheacutenomegravene n‟est pas un arteacutefact expeacuterimental mais qu‟il est
reproductible la mecircme expeacuterience est reacutealiseacutee agrave diffeacuterents temps t= 0 15 20 25 30 min
d‟incubation dans H2O glaceacutee (Fig IV 20) Les diffeacuterentes courbes preacutesentent la mecircme allure
deacutefinie par deux parties La premiegravere partie qui correspond aux cinq premiegraveres minutes
d‟analyse montre une augmentation du nombre de deuteacuteriums tandis que la seconde partie est
caracteacuteriseacutee par une diminution du nombre de deuteacuteriums Le temps d‟incubation dans H2O
glaceacutee a eacuteteacute changeacute et vingt minutes semblent maintenant convenir
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Temps danalyse (en minutes)
Theacuteorie
0 min
15 min
20 min
25 min
30 min
Fig IV 20 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents temps
drsquoincubation dans H2O glaceacutee
KKDDDDDDIIKIIK
181
Pour essayer de comprendre scientifiquement le pheacutenomegravene en utilisant le mecircme jeu de
donneacutees j‟ai traceacute le graphe suivant intensiteacute des ions formeacutes en fonction du temps
d‟analyse (Fig IV 21) Les courbes preacutesentent la mecircme allure que celles du graphe de la
figure preacuteceacutedente (Fig IV 20) L‟intensiteacute des ions semble varier comme le nombre de
deuteacuteriums
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
0 5 10 15 20 25 30
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Temps danalyse (en minutes)
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 21 Intensiteacute des ions en fonction du temps drsquoanalyse pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Nous deacutecidons alors de tracer le graphe de l‟intensiteacute des ions en fonction du nombre de
deuteacuteriums (Fig IV 22) Il apparaicirct alors clairement qu‟il existe une correacutelation entre le
nombre d‟ions formeacutes et le nombre de deuteacuteriums retenus Or les facteurs qui peuvent
influencer le nombre d‟ions formeacutes sont le pH et la concentration en analyte En effet un pH
acide et une concentration eacuteleveacutee d‟eacutechantillon favorisent la formation d‟ions Sachant que les
eacutechanges HD sont controcircleacutes non seulement par la tempeacuterature mais aussi par le paramegravetre
pH alors le pheacutenomegravene que nous observons ressemblerait agrave un effet de pH Cet effet de pH
s‟expliquerait par un effet de meacutelange entre la solution contenant l‟eacutechantillon (peptide
complegravetement deuteacutereacute dilueacute au 1100e dans une solution H2OMeOH 4060 acidifieacutee) et le
solvant (H2OMeOH 4060) qui sert agrave pousser l‟analyte vers la source du spectromegravetre de
masse (Fig IV 23)
182
00E+00
20E+07
40E+07
60E+07
80E+07
10E+08
12E+08
2 3 4 5 6 7 8 9 10
Inte
nsi
teacute d
es
ion
s
Nombre de deuteacuteriums
0 min
15 min
25 min
30 min
Fig IV 22 Intensiteacute des ions en fonction du nombre de deuteacuteriums pour les diffeacuterents temps
drsquoincubation testeacutes
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Injection avec pousse-seringue
EchantillonSolvant Solvant
Δ pH
Δ concentration
Analyse en MS
Cryosource
Δ pH
Δ concentration
Chargement de lrsquoeacutechantillon
Injection de lrsquoeacutechantillon
Cas ideacuteal
Cas reacuteel
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
KKDDDDDDIIKIIK
Fig IV 23 Scheacutema explicatif de lrsquohypothegravese de lrsquoeffet de meacutelange observeacute
Afin de s‟affranchir de l‟effet de meacutelange nous avons deacutecideacute de modifier la composition
du solvant de faccedilon agrave avoir exactement la mecircme que pour l‟eacutechantillon Autrement dit nous
l‟avons acidifieacute et leacutegegraverement deuteacutereacute Le nouveau solvant est un meacutelange H2OMeOH 4060
auquel a eacuteteacute ajouteacute 05 M d‟acide aceacutetique et 1 de D2O Il est conserveacute agrave -20degC avant
chaque utilisation Un sachet de glace est eacutegalement deacuteposeacute sur la seringue contenant le
solvant lors de l‟analyse par MS Le lavage des capillaires en PEEK (boucle et celui
183
d‟introduction de l‟eacutechantillon dans le spectromegravetre de masse) est deacutesormais reacutealiseacute gracircce au
nouveau solvant Puis j‟ai testeacute l‟effet du deacutebit d‟injection sur la reacutetention du marquage dans
la laquo cryosource raquo (Fig IV 24 et Fig IV 25) Les reacutesultats montrent que pheacutenomegravene
s‟amplifie avec l‟augmentation du deacutebit ce qui est inattendu
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150 microLh (25 microLmin)
350microLh
600 microLh (10 microLmin)
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Fig IV 24 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Les analyses sont reacutealiseacutees dans lrsquoordre
croissant du deacutebit drsquoinjection
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
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Fig IV 25 Zoom de la Fig IV 24 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les mecircmes expeacuteriences ont ensuite eacuteteacute reacutealiseacutees en changeant l‟ordre des diffeacuterents deacutebits
d‟injection testeacutes (Fig IV 26 et Fig IV 27)
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150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
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Fig IV 26 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 600 microLh est testeacute en
premier puis celui de 150 microLh et enfin celui de 350 microLh
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150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)1
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Fig IV 27 Zoom de la Fig IV 26 pour les dix premiegraveres minutes drsquoanalyse
Les reacutesultats ne sont pas reproductibles Nous deacutecidons alors de raccourcir au maximum le
capillaire en PEEK qui transfegravere le solvant dans la laquo cryosource raquo (67 cm 22 cm) et de
recommencer une nouvelle seacuterie de mesures en changeant une nouvelle fois l‟ordre des
diffeacuterents deacutebits d‟injection testeacutes (Fig IV 28) Les reacutesultats obtenus ne sont toujours pas
satisfaisants
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
350 microLh
600 microLh (10 microLmin)
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3
Fig IV 28 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour diffeacuterents deacutebits
drsquoinjection sans incubation dans H2O glaceacutee Le deacutebit drsquoinjection de 150 microLh est testeacute en
premier puis celui de 360 microLh et enfin celui de 350 microLh
Nous avons ensuite voulu deacutecoupler l‟effet du deacutebit agrave celui du temps en reacutealisant trois fois
conseacutecutivement la mecircme expeacuterience dans les mecircmes conditions avec le mecircme deacutebit et en
testant les deux deacutebits extrecircmes 2 microLmin et 10 microLmin (reacutealisation de triplicats) De
nouvelles conditions expeacuterimentales ont eacuteteacute deacutefinies La laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee pendant
trente minutes apregraves qu‟elle ait atteint sa tempeacuterature de -30degC Auparavant les analyses
eacutetaient lanceacutees sans l‟eacutetape de stabilisation de la laquo cryosource raquo De plus l‟ajout d‟azote
liquide dans le reacutecipient servant agrave refroidir le systegraveme n‟est deacutesormais plus effectueacute pendant
l‟analyse mais uniquement entre deux analyses Les reacutesultats sont donneacutes dans la Fig IV 29
Le nombre de deuteacuteriums n‟est toujours pas stable lors de l‟analyse par MS
Il semblerait que la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la laquo cryosource raquo ne soit pas homogegravene en
tout point L‟ajout d‟une seconde sonde thermique proche de la source du spectromegravetre de
masse pourrait mettre en eacutevidence le diffeacuterentiel de tempeacuterature
Une ideacutee serait de rincer la boucle d‟injection avec un solvant identique mais
complegravetement deuteacutereacute (D2OCH3ODCH3COOD) afin de comparer les reacutesultats
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
600 microLh (10 microLmin)
Fig IV 29 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse pour les deacutebits drsquoinjection
de 2 microLmin et 10 microLmin sans incubation dans H2O glaceacutee
Le peptide KKDDDDDDIIKIIK semble ecirctre tregraves sensible vis-agrave-vis de la deuteacuteration agrave un
(ou plusieurs) paramegravetre(s) relatif(s) agrave l‟utilisation de la laquo cryosource raquo que nous n‟identifions
ni ne controcirclons Pour veacuterifier si ces problegravemes eacutetaient geacuteneacuteraux ou speacutecifiques de ce peptide
nous avons deacutecideacute deffectuer nos tests sur un peptide plus classique le Glufibrinopeptide
(GluF)
IV3323 Cas du peptide GluF
Le peptide GluF n‟est pas un peptide classiquement utiliseacute pour la mise au point
d‟expeacuteriences HDXMS mais il nous sert au laboratoire comme standard de calibration en
MSMS car il se fragmente pour donner de nombreux ions b et y en CID
Fort heureusement lanalyse du GluF agrave laide de la cryosource apregraves incubation dans D2O
et dilution dans les solvants hydrogeacuteneacutes indique que le marquage reste stable au cours de
l‟analyse par spectromeacutetrie de masse (Fig IV 30) Ces reacutesultats montrent que les problegravemes
que nous avons rencontreacutes preacuteceacutedemment semblent lieacutes agrave la nature du peptide K2D6IIKIIK et
permettent enfin de valider lutilisation de la laquo cryosource raquo minutieusement optimiseacutee pour
des eacutetudes HDXMS
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Temps danalyse (en minutes)
150 microLh (25 microLmin)
Fig IV 30 Nombre de deuteacuteriums en fonction du temps drsquoanalyse apregraves injection du peptide
GluF deuteacutereacute dans la laquo cryosource raquo
IV34 Conclusion
Nous avons deacuteveloppeacute un nouveau systegraveme dintroduction des proteacuteines deuteacutereacutees dans le
spectromegravetre de masse que nous avons appeleacute laquo cryosource raquo Lutilisation de cette
laquo cryosource raquo permet le stockage des eacutechantillons dans une enceinte isoleacutee agrave -30degC ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs (une heure) et permet eacutegalement de travailler
avec des deacutebits faibles de lordre de 2 microLmin
Loptimisation de tous les paramegravetres expeacuterimentaux pour la laquo cryosource raquo a eacuteteacute reacutealiseacutee agrave
laide de peptides seacutelectivement marqueacutes et eacutegalement sur lubiquitine proteacuteine modegravele de 86
kDa
L‟analyse du peptide de reacutefeacuterence KKDDDDDDIIKIIK a permis une optimisation plus
fine des paramegravetres Des ameacuteliorations techniques ont eacuteteacute apporteacutees Le solvant utiliseacute pour
pousser l‟eacutechantillon jusqu‟agrave la source du spectromegravetre de masse a eacuteteacute modifieacute Il a eacuteteacute
acidifieacute (acide aceacutetique 05M) et deuteacutereacute (1 D2O) afin d‟avoir la mecircme composition que
celle de l‟eacutechantillon Il a eacutegalement eacuteteacute conserveacute agrave -20degC avant son utilisation L‟analyse est
reacutealiseacutee avec un sachet de glace sur la seringue contenant le solvant et le capillaire en PEEK
d‟entreacutee dans la laquo cryosource raquo a eacuteteacute raccourci (67 cm 22 cm) La sortie de la
laquo cryosource raquo assurant le couplage avec la source ESI a eacuteteacute quant agrave elle isoleacutee La
188
tempeacuterature optimale de la laquo cryosource raquo est de -30degC pour un deacutebit optimum de 25 microLmin
Avant le deacutebut des analyses la laquo cryosource raquo est eacutequilibreacutee agrave -30degC pendant trente minutes
pendant lesquelles le solvant est continuellement injecteacute permettant le rinccedilage des capillaires
Le remplissage d‟azote liquide pour le refroidissement du systegraveme est reacutealiseacute entre deux
analyses concomitamment agrave une eacutetape de lavage des capillaires de vingt minutes gracircce au
solvant
La toute derniegravere innovation apporteacutee agrave la laquo cryosource raquo est l‟ajout d‟un ventilateur afin
d‟homogeacuteneacuteiser la tempeacuterature agrave l‟inteacuterieur de la boicircte
Notre objectif final est dutiliser le dispositif d‟introduction des eacutechantillons marqueacutes que
nous avons deacuteveloppeacute dans une approche HDX top-down ECD pour obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques responsables de l‟initiation de la traduction dans le
cadre dune collaboration avec laboratoire de Biochimie de l‟Eacutecole Polytechnique Et plus
geacuteneacuteralement de fournir agrave la communauteacute des biologistes structuraux une meacutethodologie
robuste pour l‟analyse de proteacuteines et complexes proteacuteiques par eacutechanges isotopiques HD et
spectromeacutetrie de masse agrave tregraves haute reacutesolution (FT-ICR)
J‟aimerais souligner le fait que des travaux similaires ont eacuteteacute meneacutes par l‟eacutequipe du Prof
T Joslashrgensen au Danemark pour le mecircme objectif de reacuteduire le laquo back-exchange raquo lors
d‟eacutetudes HDX par top-down ECD ou ETD Dans leur cas ils ont deacuteveloppeacute un systegraveme de
refroidissement des eacutechantillons agrave -15degC tout aussi efficace agrave partir du systegraveme TriVersa
NanoMate de la socieacuteteacute Advion (28)
189
IV4 Bibliographie
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191
Conclusion geacuteneacuterale
192
193
Lobjectif initial de ce travail de thegravese eacutetait de mettre au point une meacutethode robuste top-
down HDX-MSMS (cest-agrave-dire combinant eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium en solution et
fragmentation de proteacuteines entiegraveres en phase gazeuse) pour pouvoir obtenir des informations
structurales sur des complexes proteacuteiques reacuteels Combiner eacutechanges HD et spectromeacutetrie de
masse nest pas nouveau mais les meacutethodes classiquement utiliseacutees dites bottom-up et
baseacutees sur une digestion enzymatique preacutesentent linconveacutenient majeur decirctre peu reacutesolutives
(5-10 acides amineacutes en moyenne) Mettre au point des approches sur proteacuteines entiegraveres
preacutesente sur le principe un grand nombre davantages le premier gain attendu est pour la
reacutesolution (qui peut atteindre un seul acide amineacute) le second est pour leacutechange inverse
(laquo back-exchange raquo) qui devrait en theacuteorie ecirctre plus limiteacute car le nombre deacutetapes lors
desquels ce pheacutenomegravene peut se produire (digestion enzymatique seacuteparation
chromatographique) est reacuteduit
Ce travail de thegravese montre cependant quil nest pas aiseacute de mettre une meacutethode top-down
HDX au point et que nous avons ducirc faire face agrave un certain nombre de problegravemes
Tout dabord les reacutesultats obtenus pour les peptides que lon peut seacutelectivement marquer
montrent quil est important doptimiser de maniegravere fine un certain nombre de paramegravetres
expeacuterimentaux que ce soit dans la source dionisation ou agrave diffeacuterents endroits de linstrument
pour eacuteviter au maximum leacutechange inverse entre deuteacuteriums et hydrogegravenes Nos reacutesultats
montrent eacutegalement que ces paramegravetres sont deacutependants du spectromegravetre de masse sur lequel
les expeacuteriences sont reacutealiseacutees et que lanalyse de peptides seacutelectivement marqueacutes devrait ecirctre
un preacute-requis pour toutes les eacutetudes par eacutechange HD Nos reacutesultats confirment eacutegalement que
lECD peut ecirctre utiliseacute pour localiser de maniegravere preacutecise les deuteacuteriums dans la seacutequence et
quune reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves peut ecirctre obtenue ce qui est une ameacutelioration majeure
par rapport aux expeacuteriences classiques de bottom-up sans fragmentation
Sur la base du protocole optimiseacute pour des peptides nous avons souhaiteacute poursuivre
lanalyse du complexe aIF2 impliqueacute dans linitiation de la traduction chez les archeacutees Nous
avons alors fait face agrave un certain nombre de problegravemes Le premier a eacuteteacute le manque de
reproductibiliteacute de nos expeacuteriences avec des variations importantes au niveau du nombre de
deuteacuteriums incorporeacutes et de leur localisation Un point crucial que nous avons mis en
eacutevidence au cours de nos travaux est que pour une proteacuteine contrairement agrave un peptide le
nombre de fragments est important leur intensiteacute couvre un large domaine dynamique et la
deuteacuteration reacuteduit fortement l‟intensiteacute totale Par conseacutequent il est neacutecessaire d‟accumuler un
194
grand nombre de scans MSMS pour faire augmenter le rapport signal sur bruit des fragments
peu intenses et que dans ce cas le problegraveme de leacutechange inverse devient majeur En effet
alors que pour des peptides leacutelargissement des pics ducirc agrave la deuteacuteration ne pose pas reacuteellement
de problegraveme danalyse car les masses des fragments ne sont pas tregraves eacuteleveacutees et le nombre de
fragments nest pas tregraves important le problegraveme est tout autre quand on passe sur des systegravemes
plus grands ne serait-ce que pour une petite proteacuteine de 10 kDa Ainsi il devient tout agrave fait
crucial de pouvoir accumuler pendant un temps suffisant pour pouvoir analyser correctement
les massifs isotopiques larges qui sont obtenus (et qui seacutelargissent au fur et agrave mesure que la
cineacutetique de deuteacuteration avance) Par ailleurs le nombre de fragments obtenus pour une
proteacuteine de 10 kDa est bien supeacuterieur agrave ce que lon attend pour un peptide et le
chevauchement des massifs isotopiques dans les spectres MSMS devient eacutegalement un
problegraveme qui conduit agrave une diminution importante des couvertures de seacutequence entre
leacutechantillon non deuteacutereacute et leacutechantillon deuteacutereacute
Nos reacutesultats obtenus sur aIF2 sont neacuteanmoins prometteurs et montrent quil est reacuteellement
possible dobtenir une reacutesolution agrave lacide amineacute pregraves sur certains segments de la proteacuteine et
que de nouvelles ameacuteliorations de lapproche devraient permettre darriver agrave lobjectif initial
que nous nous eacutetions fixeacutes LECD et lETD sont des meacutethodes de choix pour ces approches
mais certains reacutesultats que nous avons obtenus en CID montrent quil est sans doute possible
dutiliser ce mode de fragmentation installeacute sur tous les spectromegravetres de masse sous
certaines conditions qui restent encore agrave deacuteterminer
Lensemble de nos reacutesultats nous a ainsi conduits agrave consideacuterer que notre systegraveme
dintroduction des eacutechantillons baseacute initialement sur une seringue refroidie ne convenait pas
aux approches top-down et quil eacutetait absolument essentiel de trouver une solution
alternative permettant de maintenir le taux de deuteacuteration initial pendant un temps
suffisamment long pour quun grand nombre de scans MSMS puissent ecirctre accumuleacutes Nous
avons donc deacutecideacute de mettre au point un systegraveme complegravetement diffeacuterent de ce qui existe
aujourdhui dans les diffeacuterentes eacutequipes travaillant dans le domaine baseacute sur lutilisation dune
enceinte isoleacutee refroidie permettant de stocker les eacutechantillons agrave tregraves basse tempeacuterature ce qui
eacutevite le deacutemarquage pendant des temps longs et permet eacutegalement de travailler avec des
deacutebits faibles Le deacuteveloppement de cette cryosource nous a pris plusieurs mois car
maintenir une tempeacuterature de -30degC pour le stockage des eacutechantillons jusquagrave leur
introduction dans le spectromegravetre de masse induit un certain nombre de contraintes (viscositeacute
du solvant formation de bouchons difficulteacute agrave reacutealiser des meacutelanges homogegravenes sur des
195
temps courts) Neacuteanmoins les reacutesultats que nous avons obtenus avec la derniegravere version
optimiseacutee sont tregraves encourageants car ils montrent quil est deacutesormais possible de travailler
pendant des temps longs avec les eacutechantillons deuteacutereacutes sans que le taux de deuteacuteration ne
varie au cours de lanalyse Malheureusement nous navons pas eu le temps au cours de ma
thegravese de revenir sur les proteacuteines du complexe aIF2 et de les analyser avec ce nouveau
systegraveme dintroduction mais nous pensons que lutilisation de cette source devrait enfin
rendre notre approche robuste et applicable agrave des eacutechantillons reacuteels
Ainsi je considegravere que mon travail de thegravese a permis de faire un grand pas en avant pour
rendre les approches top-down HDX applicables agrave des systegravemes preacutesentant un inteacuterecirct
biologique important (ce qui nest pas exactement le cas de tout ce qui a eacuteteacute deacutecrit dans la
litteacuterature jusquici) et que dans quelques anneacutees ces approches complegraveteront de maniegravere
robuste larsenal des meacutethodes danalyse utiliseacutees en biologie structurale apportant des
informations compleacutementaires agrave ce que la RMN ou les rayons X sont capables de fournir
196
197
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes
198
Annexe Mateacuteriels et meacutethodes 197
A1 Instrumentation 199
A11 Ionisation par eacutelectrospray 199 A111 Formation des gouttelettes chargeacutees 200 A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes 201 A113 Formation d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites gouttelettes fortement
chargeacutees 201 A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS) 203
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 203 A1211 Principe physique 206 A1212 Pieacutegeage des ions 206 A1213 Obtention des spectres de masse 208
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR 212 A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse 212 A1222 Sensibiliteacute 212 A1223 Gamme dynamique 213 A1224 Gamme de masse 213
A123 Technologie Orbitrap214 A13 Fragmentation en phase gazeuse 216
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR 216 A132 Fragmentation par ETD sur l‟Orbitrap 218 A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF 220
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium 220
A21 Marquage 220 A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes 220 A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine 221 A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ 221
A22 Dessalage 222 A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse 222
A3 Bibliographie 224
199
A1 Instrumentation
A11 Ionisation par eacutelectrospray
La premiegravere eacutetape d‟une expeacuterience par spectromeacutetrie de masse consiste agrave vaporiser et
ioniser l‟analyte (des moleacutecules) ie agrave former agrave partir d‟un milieu gazeux liquide ou solide
des moleacutecules ioniseacutees isoleacutees manipulables dans le vide pousseacute preacutesent dans le spectromegravetre
de masse Pour cela diffeacuterentes sources d‟ionisation ont eacuteteacute deacuteveloppeacutees adapteacutees agrave diffeacuterents
types d‟eacutechantillons et agrave diffeacuterents analyseurs
L‟eacutelectroneacutebulisation (ou eacutelectrospray ESI) est une meacutethode d‟ionisation agrave pression
atmospheacuterique qui permet de transfeacuterer et ioniser simultaneacutement des macromoleacutecules intactes
(eg des proteacuteines) preacutesentes en solution en phase gazeuse La formation des ions en phase
gazeuse par cette technique est reacutealiseacutee par des meacutecanismes de deacutesolvatation peu eacutenergeacutetiques
n‟induisant quasiment pas de fragmentation L‟eacutelectrospray est donc consideacutereacutee comme une
technique dionisation douce par opposition agrave d‟autres techniques comme l‟impact
eacutelectronique technique tregraves eacutenergeacutetique qui conduit agrave un grand nombre de fragmentations lors
de leacutetape dionisation De plus les ions isoleacutes sont formeacutes directement agrave partir des moleacutecules
en solution ce qui permet d‟eacuteviter une eacutetape de vaporisation par chauffage qui peut conduire
agrave la deacutegradation de l‟analyte L‟eacutelectroneacutebulisation a eacuteteacute deacuteveloppeacutee par John Fenn (1) sur la
base de travaux plus anciens de Malcolm Dole (2) et John Zeleny (3) et aujourd‟hui elle est
(avec le MALDI) la meacutethode de choix pour l‟eacutetude des biomoleacutecules par spectromeacutetrie de
masse
La formation des ions en phase gazeuse par eacutelectrospray se deacuteroule en trois eacutetapes
principales (i) formation des gouttelettes chargeacutees agrave l‟extreacutemiteacute dun capillaire meacutetalliseacute (ii)
eacutevaporation du solvant et fission des gouttelettes par explosions coulombiennes successives
et finalement (iii) obtention d‟ions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir des gouttelettes
fortement chargeacutees issues des deux premiegraveres eacutetapes Les meacutecanismes preacutecis de la formation
des espegraveces ioniseacutees et deacutesolvateacutees dans les deux derniegraveres eacutetapes sont aujourd‟hui encore
assez mal deacutefinis et sujets agrave controverse
200
A111 Formation des gouttelettes chargeacutees
L‟eacutetape initiale du processus d‟eacutelectrospray est la formation de gouttelettes chargeacutees agrave
partir d‟une solution Pour cela l‟eacutechantillon est introduit dans un capillaire meacutetallique (ou
une aiguille meacutetalliseacutee) porteacute agrave un fort potentiel eacutelectrique de plusieurs kilovolts (kV)
L‟application d‟une telle diffeacuterence de potentiel entre ce capillaire et une contre-eacutelectrode
placeacutee quelques millimegravetres plus loin induit une seacuteparation des charges agrave linteacuterieur du liquide
par un pheacutenomegravene eacutelectrophoreacutetique de migration des eacutelectrolytes (cations et anions) Lorsque
le capillaire est utiliseacute comme eacutelectrode positive les espegraveces cationiques s‟accumulent alors agrave
son extreacutemiteacute tandis que les anions migrent en sens inverse en s‟accumulant agrave l‟inteacuterieur
jusqu‟agrave s‟oxyder agrave la surface du capillaire (Fig A 1)
Fig A 1 Scheacutema simplifieacute du fonctionnement drsquoune source eacutelectrospray (4)
Ainsi en mode dit positif les cations sont attireacutes par l‟eacutelectrode neacutegative (contre-
eacutelectrode) et les anions par l‟eacutelectrode positive (capillaire) La seacuteparation des charges induit
une deacuteformation du liquide agrave l‟extreacutemiteacute du capillaire deacuteformation qui met en jeu un
eacutequilibre entre les forces eacutelectrostatiques (reacutepulsives) et la tension de surface (attractive) du
liquide Lorsque les forces eacutelectrostatiques atteignent la valeur de la tension de surface du
liquide la deacuteformation est conique et porte le nom de cocircne de Taylor (5) Une faible
augmentation du champ eacutelectrique suffit alors agrave deacutestabiliser le cocircne qui se rompt agrave son
extreacutemiteacute dispersant la solution en nombreuses gouttelettes qui emportent une partie des
charges preacutesentes agrave la pointe Apregraves cette eacutetape les gouttelettes se deacuteplacent sous l‟influence
du champ eacutelectrique mais eacutegalement sous celle d‟un gradient de pression creacuteeacute par la
deacutepression agrave lentreacutee du spectromegravetre de masse
201
A112 Evaporation du solvant et explosions coulombiennes
Les gouttelettes chargeacutees issues du cocircne de Taylor migrent donc vers l‟interface du
spectromegravetre de masse Sur leur trajet elles entrent en collision avec le gaz atmospheacuterique et
suivant les interfaces avec un gaz de seacutechage et subissent une eacutevaporation du solvant alors
que le nombre de charges reste constant L‟eacutevaporation du solvant est favoriseacutee par la
tempeacuterature souvent eacuteleveacutee de la source dionisation (80-140degC) La diminution du rayon R
des gouttelettes posseacutedant une charge constante q conduit agrave l‟augmentation de la reacutepulsion
eacutelectrostatique des charges agrave sa surface jusqu‟agrave ce que les gouttelettes atteignent la limite de
stabiliteacute de Rayleigh donneacutee par
213
0 )(8 RqRy
ougrave 0 permittiviteacute du vide R rayon de densiteacute de charges et tension de surface stabilisant
la goutte
Cette eacutequation donne les conditions pour lesquelles les forces de reacutepulsions
eacutelectrostatiques deviennent eacutegales agrave celles de tension de surface A partir de la limite de
Rayleigh la gouttelette chargeacutee devient instable ce qui conduit agrave une explosion
coulombienne correspondant agrave la fission de la gouttelette en gouttelettes de plus petites tailles
Les travaux de Rayleigh en 1882 (6) puis de Gomez et Tang en 1994 (7) ont montreacute que la
fission des gouttelettes s‟effectuait par eacutemission d‟un jet tregraves fin de gouttelettes sans reacuteelle
relation de symeacutetrie Ce pheacutenomegravene d‟eacutevaporation se reproduit jusqu‟agrave ce que les nouvelles
gouttelettes aient agrave nouveau atteint la limite de Rayleigh
A113 Formation drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de petites
gouttelettes fortement chargeacutees
Dans la litteacuterature deux meacutecanismes ont eacuteteacute proposeacutes pour expliquer ce pheacutenomegravene Le
premier modegravele dit modegravele des reacutesidus chargeacutes ou laquo Charged Residue Model raquo (CRM) a eacuteteacute
deacutecrit par Dole en 1968 (2) L‟hypothegravese est la suivante la succession d‟explosions
coulombiennes conduirait agrave des gouttelettes de plus en plus petites jusqu‟agrave ce que la derniegravere
gouttelette ne possegravede plus qu‟une seule et unique moleacutecule d‟analyte (Fig A 2 (a)) Dans
ce modegravele l‟eacutevaporation totale du solvant reacutesiduel accumule les charges sur l‟analyte et
permet l‟obtention d‟ions multichargeacutes en phase gazeuse
202
En 1979 une seconde theacuteorie baseacutee sur de nouveaux meacutecanismes a eacuteteacute proposeacutee par Iribarne
et Thomson (8) Il s‟agit du modegravele de l‟eacutevaporation ionique ou laquo Ion Evaporation Model raquo
(IEM) Leur theacuteorie repose comme celle de Dole sur une succession initiale de fissions de
type coulombiennes qui reacuteduit la taille des gouttelettes et augmente leur densiteacute de charge
Cependant selon la theacuteorie dIribarne et Thomson pour des gouttelettes avec un rayon tregraves
petit (de l‟ordre de 10 nm) et une densiteacute de charge tregraves eacuteleveacutee le champ eacutelectrostatique agrave leur
surface serait assez intense pour expulser directement des ions preacuteformeacutes en phase gazeuse
(Fig A 2 (b)) Ce pheacutenomegravene appeleacute eacutevaporation ionique suggegravere que l‟explosion
coulombienne ne constitue pas le meacutecanisme majoritaire pour les petites gouttelettes de rayon
R le 10 nm
Fig A 2 Les deux theacuteories de lrsquoobtention drsquoions deacutesolvateacutes en phase gazeuse agrave partir de
gouttelettes chargeacutees (a) Modegravele des reacutesidus chargeacutes par Dole (b) Modegravele de lrsquoeacutevaporation
ionique par Iribarne et Thomson
Cependant aujourd‟hui encore aucun de ces deux modegraveles n‟est consideacutereacute comme
applicable agrave l‟ensemble des pheacutenomegravenes observeacutes en eacutelectrospray (9) Le consensus semble
ecirctre l‟existence d‟un effet de taille de l‟analyte les grosses moleacutecules eacutetant plutocirct orienteacutees
vers une formation d‟ions en phase gazeuse par le meacutecanisme de reacutesidus chargeacutes de Dole (10-
12) John B Fenn eacutemet l‟hypothegravese que cette theacuteorie s‟applique aux moleacutecules de haut poids
moleacuteculaire agrave partir du moment ougrave les dimensions lineacuteaires de ces moleacutecules sont
sensiblement plus grandes que la gouttelette qui les contient
Quel que soit le meacutecanisme responsable de la formation des ions en phase gazeuse
leacutelectrospray est aujourdhui une meacutethode dionisation extrecircmement utiliseacutee dans des
domaines varieacutes (biologie chimie pharmaciehellip)
203
A12 Spectromeacutetrie de masse agrave transformeacutee de Fourier (FT-MS)
Parmi les diffeacuterents spectromegravetres de masse commercialiseacutes les instruments FT-ICR et
Orbitrap occupent une place de choix pour l‟eacutetude de proteacuteines entiegraveres par approche laquo top-
down raquo en raison de leurs tregraves grandes performances en termes de reacutesolution et de preacutecision
sur la mesure de masse
A121 Principe de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
Notre eacutetude sur les peptides modegraveles deacuteveloppeacutes par T Joslashrgensen qui est preacutesenteacutee dans le
Chap II de ce manuscrit a eacuteteacute reacutealiseacutee sur un spectromegravetre APEX III de Bruker (Brecircme
Allemagne) eacutequipeacute d‟un aimant supraconducteur de 7 Tesla d‟une cellule ICR de type
Infinity Cell et d‟une source eacutelectrospray Apollo I
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Needle on
ground
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
EV1
PV1 PV2
Excitation
Detection
EV2b
PV2quench
EV2a
PL1 PL2
(DPL2)
pulsed
PL4
(DPL4)
pulsed
HVO
(XDFL)
pulsed
(YDFL)
gate valve
FOCL1 FOCL2
PL9
(3kV)
Endplate
(~plusmn3600)
Capillary
(~plusmn4200)
CapExit
Skimmer2
Offset
ESI Source
ExtractTrap amp ExtractTrap amp
pulsing between
(EV2DEV2)
Infinity cell
Skimmer1
Fig A 3 Scheacutema du FT-ICR APEX III Bruker de la source eacutelectrospray agrave la cellule ICR
Infinity Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Les ions sont formeacutes au niveau de la source ESI puis transfeacutereacutes via un ensemble de
lentilles eacutelectrostatiques au centre de la cellule de pieacutegeage situeacutee au cœur de l‟eacutelectroaimant
supraconducteur (Fig A 3)
Un hexapocircle de stockage est inseacutereacute apregraves le capillaire de transfert de la source eacutelectrospray
et avant le systegraveme de transfert eacutelectrostatique afin dy accumuler les ions avant de les
envoyer dans la cellule ICR Cette derniegravere placeacutee dans un vide pousseacute (10-10
mbar environ)
repreacutesente l‟eacuteleacutement cleacute du spectromegravetre puisqu‟elle va servir d‟analyseur et de deacutetecteur par
la mesure de la freacutequence cyclotron des ions pieacutegeacutes
204
Au cours de cette thegravese notre spectromegravetre a beacuteneacuteficieacute d‟importantes eacutevolutions
instrumentales Ainsi en janvier 2011 nous avons fait l‟acquisition du chariot de la socieacuteteacute
Sanofi-Aventis de Toulouse notre APEX III devenant alors APEX-Q Les principales
diffeacuterences entre les deux instruments sont l‟ajout d‟un quadripocircle et d‟une cellule de
collision et la source d‟ionisation (Apollo I sur lAPEX III et CombiSource premier modegravele
sur l‟APEX-Q) (Fig A 4)
Ion transfer
optics
UV Laser
Lens
Windows
Mirror
Medium pressure
chamber
Movable
hexapole
PPP
MALDI
sample
plate
Second
skimmer
Ion transfer
capillary
ESI
skimmer
Funnel
Electrospray
nebulizer
End
cap
ICR trap
Attenuator Magnet
Mirrors
PP
P
Storage hexapole
Trapextractplate
Collision
gas tube
Pulsed
valve
Collision hexapole
Quadrupole
ESI
Sprayed
sample
Hollow
cathode
IRMPDECD
Fig A 4 Scheacutema du FT-ICR APEX-Q Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity
Cell (drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Puis en avril 2012 nous avons reccedilu le nouveau chariot de Bruker le SolariX (Fig A 5) Il
apporte les ameacuteliorations suivantes une combisource nouvelle geacuteneacuteration l‟ajout d‟un
module ETS (possibiliteacutes de CID ou d‟ECDETD) et d‟un hexapocircle pour acheminer les ions
de la cellule de collision agrave la cellule ICR (Fig A 6)
205
Fig A 5 Photographie du FT-ICR SolariX (Bruker)
Fig A 6 Scheacutema du FT-ICR SolariX Bruker de la combi-source agrave la cellule ICR Infinity Cell
(drsquoapregraves la documentation de Bruker)
Comme il a deacutejagrave eacuteteacute speacutecifieacute dans le Chap III de ce manuscrit nous avons eacutegalement eacuteteacute
ameneacutes agrave travailler sur l‟APEX-Qe d‟Orsay Les diffeacuterences majeures entre l‟APEX III et
l‟APEX-Qe sont la preacutesence dun quadripocircle sur lAPEX-Qe permettant de reacutealiser la
seacutelection d‟ions preacutecurseurs avant leur entreacutee dans la cellule ICR la preacutesence dlaquo ion
funnels raquo (qui ameacuteliorent la sensibiliteacute de linstrument) et la source dionisation (Apollo I sur
lAPEX III Apollo II sur lAPEX-Qe)
206
A1211 Principe physique
Le principe de la spectromeacutetrie de masse agrave reacutesonance cyclotronique ionique (laquo Ion
Cyclotron Resonance raquo ICR) repose sur le fait qu‟une particule chargeacutee animeacutee dune vitesse
v se deacuteplaccedilant dans un champ magneacutetique uniforme B subit la force de Lorentz (Eq A 1)
BvqF
(Eq A 1)
Cette force conduit la particule chargeacutee agrave adopter une trajectoire heacutelicoiumldale autour d‟un
axe parallegravele agrave celui du champ magneacutetique B (conventionnellement axe z) dont la projection
dans le plan orthogonal (xy) est un mouvement circulaire uniforme (Fig A 7)
Fig A 7 Mouvement cyclotron drsquoun ion dans un champ magneacutetique
Ce mouvement de rotation est appeleacute mouvement cyclotron et en l‟absence de champ
eacutelectrique sa freacutequence νc ne deacutepend que du champ magneacutetique et du rapport masse sur
charge (Eq A 2) On conccediloit degraves lors quune mesure de cette freacutequence de rotation permet
une deacutetermination du rapport mz de lespegravece consideacutereacutee
zm
B
m
Bqc
105356111
2
7
(Eq A 2)
A1212 Pieacutegeage des ions
Jusquici seul le mouvement dans le plan xy a eacuteteacute consideacutereacute En labsence dautres champs
la vitesse suivant laxe z reste constante et la trajectoire reacutesultante est un mouvement
heacutelicoiumldal autour dun axe parallegravele agrave z qui se poursuivra indeacutefiniment Pour construire un
piegravege une possibiliteacute est de fermer le mouvement suivant z par deux plaques de pieacutegeage
207
perpendiculaires agrave laxe z porteacutees agrave un potentiel reacutepulsif Ainsi est neacutee la cellule ICR aussi
appeleacutee piegravege de Penning et le premier modegravele en est la cellule cubique (Fig A 8)
Fig A 8 Cellule cubique simple (13)
Sil eacutetait possible dappliquer un champ eacutelectrique homogegravene parallegravele au champ
magneacutetique avec des plaques de longueurs infinies le mouvement dun ion serait heacutelicoiumldal
avec des oscillations peacuteriodiques suivant laxe z Cette freacutequence d‟oscillations ou freacutequence
de pieacutegeage νt est principalement due aux reacutepulsions successives des deux plaques de
pieacutegeage et peut ecirctre exprimeacutee par (Eq A 3)
2
2
2
1
am
Vq trap
t
(Eq A 3)
ougrave Vtrap potentiel de pieacutegeage a distance entre les deux plaques et α facteur geacuteomeacutetrique
eacutegal agrave 2 dans le cas ideacuteal
Cependant il n‟est pas possible de se situer dans le cas ideacuteal d‟un champ eacutelectrique
homogegravene qui suppose des plaques infinies Le champ eacutelectrique ne peut pas ecirctre exactement
parallegravele au champ magneacutetique et une composante radiale est alors agrave prendre en compte Par
conseacutequent un troisiegraveme mouvement propre au mouvement de deacuteplacement des charges
pieacutegeacutees s‟ajoute aux deux preacuteceacutedents mouvements (cyclotron et pieacutegeage) Ce mouvement dit
mouvement magneacutetron s‟oppose agrave la force de Lorentz et se traduit par un abaissement de la
freacutequence cyclotronique
208
Ce pieacutegeage suppose toutefois que la trajectoire des ions les ait ameneacutes agrave ecirctre confineacutes
dans la cellule Cela peut ecirctre obtenu en produisant des ions in situ (ionisation eacutelectronique
MALDI) mais des difficulteacutes suppleacutementaires sont agrave prendre en compte lorsque les ions sont
formeacutes initialement agrave l‟exteacuterieur de la cellule (cas de l‟ionisation par eacutelectrospray) En effet la
conservation de l‟eacutenergie cineacutetique impose que pour des ions transporteacutes suivant l‟axe z s‟ils
ont suffisamment d‟eacutenergie pour entrer dans la cellule et que le potentiel des plaques ne
change pas ils en ont assez pour ressortir
Le pieacutegeage dynamique est une solution agrave ce problegraveme au lieu dappliquer des tensions
continues sur les plaques de pieacutegeage on va jouer sur des variations de tension pour sassurer
du pieacutegeage des ions On synchronise les tensions sur la plaque de la cellule situeacutee cocircteacute source
avec le deacuteplacement des ions (Fig A 9) Neacuteanmoins cette technique introduit une
discrimination en masse par la diffeacuterence de temps de vol des espegraveces
Fig A 9 Principe du pieacutegeage dynamique des ions
A1213 Obtention des spectres de masse
Une fois les ions pieacutegeacutes la mesure de leur freacutequence cyclotronique n‟est pas possible
directement Bien qu‟ayant une freacutequence de rotation identique tous les ions de mecircme rapport
masse sur charge ne preacutesentent pas un mouvement coheacuterent En effet les ions ont eacuteteacute produits
agrave des temps variables et avec des eacutenergies cineacutetiques diffeacuterentes ce qui se traduit par une
209
phase (position sur l‟orbite) et un rayon variables Afin de pouvoir mesurer les freacutequences
cyclotroniques il est neacutecessaire que ce mouvement global devienne coheacuterent ie que tous les
ions de mecircme rapport masse sur charge se preacutesentent avec la mecircme phase et avec le mecircme
rayon Ce reacutesultat est obtenu par une proceacutedure d‟excitation-deacutetection deacutetailleacutee ci-apregraves
Excitation des ions
Comme cela vient d‟ecirctre dit une fois pieacutegeacutes les ions de mecircme rapport masse sur charge
ont la mecircme freacutequence cyclotronique mais ne forment pas un paquet coheacuterent En effet la
position de leur axe de rotation et la phase de leur mouvement ne sont pas eacutegales De plus le
rayon de leur orbite cyclotronique est trop faible pour induire un quelconque signal sur les
plaques de deacutetection L‟application d‟un pulse de radiofreacutequence sur les plaques d‟excitation agrave
leur freacutequence cyclotron permet de rendre le mouvement des ions coheacuterent et de les conduire
sur une trajectoire de mecircme rayon agrave proximiteacute des plaques de deacutetection En effectuant un
balayage de freacutequence il est possible d‟exciter des populations d‟ions de rapports masse sur
charge diffeacuterents qui adoptent alors une trajectoire circulaire de mecircme rayon avec des
freacutequences de rotation diffeacuterentes Cette eacutetape permet non seulement d‟obtenir des paquets
d‟ions deacutecrivant un mouvement coheacuterent mais aussi de les rapprocher des deux plaques de
deacutetection afin de pouvoir analyser ce mouvement Dans le cas ideacuteal il conviendrait d‟exciter
les ions sur une orbite la plus grande possible afin d‟augmenter le signal et la sensibiliteacute
Cependant ceci n‟est pas applicable puisque la non homogeacuteneacuteiteacute du champ eacutelectrique pregraves
des plaques conduirait agrave l‟eacutejection progressive des ions C‟est la raison pour laquelle il est
usuel de ne pas exciter les ions sur des rayons supeacuterieurs agrave 08 fois le rayon de la cellule
Plusieurs types de champs eacutelectriques sinusoiumldaux peuvent ecirctre appliqueacutes pour exciter les
ions La Fig A 10 preacutesente trois types d‟excitations diffeacuterentes
210
a)
b)
c)
a)
b)
c)
Fig A 10 Types drsquoexcitations usuellement utiliseacutees agrave gauche dans le domaine temporel et agrave
droite dans le domaine des freacutequences (a) sinusoiumlde monofreacutequence tronqueacutee (b) balayage
de freacutequence (chirp) (c) balayage par SWIFT
Le premier type permet l‟excitation des ions agrave une seule freacutequence (Fig A 10 (a))
L‟excitation monofreacutequence n‟est donc pas vraiment utile pour la deacutetection de tous les ions
preacutesents dans la cellule qui est le cas le plus couramment rencontreacute En effet dans ce cas il
faudrait reacutealiser une excitation monofreacutequence pour chacun des ions preacutesents Il est donc
preacutefeacuterable d‟utiliser un mode d‟excitation par balayage de freacutequence (Fig A 10 (b)) qui va
balayer toute la gamme de freacutequences des ions en une seule impulsion Le balayage par
SWIFT (laquo Stored-Waveform Inverse Fourier Transform raquo) (Fig A 10 (c)) permet de calculer
l‟onde d‟excitation agrave partir du domaine des rapports masse sur charge eacutetudieacute Cependant le
SWIFT n‟est employable que sur les instruments eacutequipeacutes d‟un geacuteneacuterateur arbitraire de
freacutequences
Deacutetection du courant induit
La rotation coheacuterente des ions sur une orbite large creacutee un courant induit sur les deux
plaques de deacutetection qui est deacutetectable apregraves amplification par une eacutelectronique adapteacutee Ce
courant est proportionnel agrave la charge totale du paquet d‟ions ayant un mouvement coheacuterent
et ne deacutepend pas de la freacutequence cyclotronique des ions
Forme du signal mesureacute
La collision des ions avec des moleacutecules de gaz reacutesiduelles pendant le temps de mesure
conduit agrave une perte de coheacuterence du paquet d‟ions et donc agrave une perte d‟intensiteacute du signal
211
De ce fait le signal obtenu correspond agrave une sinusoiumlde amortie exponentiellement (Fig A
11) Or la preacutecision en masse est directement lieacutee agrave la preacutecision sur la mesure de la freacutequence
de rotation cyclotron des ions pieacutegeacutes Par conseacutequent une mesure de masse preacutecise neacutecessite
une pression la plus faible possible dans la cellule
Fig A 11 Signal sinusoiumldal amorti exponentiellement (agrave gauche eacutechelle en temps) et le
reacutesultat apregraves transformation de Fourier (agrave droite eacutechelle en freacutequence)
Digitalisation et transformation de Fourier
Comme l‟indique le nom de l‟appareil c‟est la transformeacutee de Fourier (laquo Fourier
Transform raquo FT) qui permet de mesurer en une seule expeacuterience l‟ensemble des freacutequences
de rotation des ions (Fig A 12)
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
7+
6+
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 mz00
10
20
30
5+ 4+8+
FT
Fig A 12 Spectre de masse obtenu apregraves transformeacutee de Fourier du signal
Le courant induit mesureacute sur les plaques de deacutetection correspond agrave un interfeacuterogramme (ou
laquo Free Induction Decay raquo FID) ougrave les sinusoiumldes amorties de l‟ensemble des ions preacutesents
dans la cellule sont additionneacutees les unes aux autres La digitalisation de ce signal suivie
d‟une transformation de Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre
contenant les informations sur les freacutequences (convertibles en rapport masse sur charge via la
relation A 2) et les abondances des ions pieacutegeacutes dans la cellule En additionnant plusieurs
deacutetections successives il est possible d‟ameacuteliorer le rapport signal sur bruit du spectre
transformeacute
212
A122 Performances de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR
A1221 Reacutesolution et preacutecision en masse
La particulariteacute de la spectromeacutetrie de masse FT-ICR qui consiste agrave ramener la mesure des
rapports masse sur charge agrave la mesure d‟une freacutequence lui confegravere ses caracteacuteristiques en
termes de reacutesolution Dans des conditions approprieacutees ie avec un vide tregraves pousseacute dans la
cellule permettant un enregistrement pendant un temps suffisamment long sans perte de
signal il est possible d‟atteindre des reacutesolutions supeacuterieures agrave 106 pour un ion de mz 1000
dans un champ magneacutetique de 7 Tesla En plus du temps d‟enregistrement pour obtenir de la
haute reacutesolution la principale contrainte est le transfert et le stockage d‟interfeacuterogrammes de
grande taille (jusqu‟agrave 8 Mega points) De ce fait la reacutesolution expeacuterimentale utiliseacutee est
freacutequemment de l‟ordre de 60 000 pour minimiser les temps d‟acquisition ainsi que la taille
de stockage
La preacutecision en masse deacutepend principalement de la reacutesolution mais eacutegalement de la charge
d‟espace En effet la preacutesence d‟un tregraves grand nombre d‟ions pieacutegeacutes dans la cellule modifie le
champ eacutelectrique et geacutenegravere une force de reacutepulsion entre les ions Cette force a pour
conseacutequence la deacuteviation de la trajectoire des ions ce qui biaise les mesures de masses Ce
pheacutenomegravene pose le problegraveme eacutevident de la calibration externe En effet pour que l‟eacutetalonnage
externe soit le plus preacutecis possible il faut qu‟il soit effectueacute avec une charge d‟espace
comparable agrave celle de l‟eacutechantillon ce qui est difficilement controcirclable Il est ainsi
recommandeacute de travailler avec de faibles quantiteacutes d‟ions pour limiter au maximum la
deacuteviation due agrave ce pheacutenomegravene Une preacutecision de lordre de quelques ppm est alors obtenue
Cependant l‟eacutetalonnage interne permet de saffranchir de ce problegraveme de charge d‟espace
puisque les ions calibrants sont preacutesents dans la cellule en mecircme temps que les ions de
l‟eacutechantillon et subissent la mecircme charge d‟espace On atteint alors en routine des preacutecisions
en masse de l‟ordre d‟une ppm voire moins
A1222 Sensibiliteacute
Des calculs theacuteoriques ont montreacute que le nombre de charges minimum ayant un
mouvement coheacuterent neacutecessaire pour deacutetecter un signal eacutetait de l‟ordre de 200 Ceci constitue
une limite ultime de la sensibiliteacute de ce type d‟instrument En pratique il faut tenir compte de
213
l‟efficaciteacute de chacune des eacutetapes permettant de passer de l‟analyte neutre aux ions pieacutegeacutes et
exciteacutes dans la cellule Il faut eacutegalement tenir compte des eacutetats de charge et de l‟existence de
massifs isotopiques qui augmentent le nombre de freacutequences sur lesquelles se reacutepartissent les
ions Les sensibiliteacutes records atteintes actuellement sur des peptides de masse 1000 Da sont
de l‟ordre de 10 attomoles consommeacutees en nano-eacutelectrospray Dans un instrument
commercial avec les protocoles standards on peut obtenir un signal exploitable avec environ
10 femtomoles de produit consommeacute
A1223 Gamme dynamique
Un point sur lequel la spectromeacutetrie de masse FT-ICR nest pas particuliegraverement bien
placeacutee est la gamme dynamique qui repreacutesente la capaciteacute agrave discriminer des ions
d‟abondances diffeacuterentes dans un mecircme spectre Le problegraveme est lieacute agrave celui de la charge
d‟espace dans la mesure ougrave les mouvements des ions de faible abondance sont perturbeacutes par
ceux des ions majoritairement preacutesents dans la cellule Il est admis qu‟il est difficile de
mesurer avec une bonne preacutecision la masse d‟un ion dont l‟abondance est infeacuterieure agrave 1 de
celle de l‟ion le plus abondant
A1224 Gamme de masse
La gamme de masse est quant agrave elle en theacuteorie quasiment illimiteacutee La limite de masse
infeacuterieure deacutepend uniquement de l‟eacutelectronique et plus preacuteciseacutement des capaciteacutes du
digitaliseur et du geacuteneacuterateur de freacutequences Pour un aimant de 7 Tesla eacutequipeacute d‟un
digitaliseur agrave 8 MHz cela eacutequivaut agrave une limite infeacuterieure de mz 29 En ce qui concerne la
limite supeacuterieure elle deacutepend de la capaciteacute de la cellule agrave pieacuteger les ions Dans le cas d‟un
aimant de 7 Tesla cette limite est atteinte pour un ion de mz 274 000 Malheureusement des
problegravemes apparaissent avant cette limite notamment agrave cause des limites sur les dureacutees
d‟acquisition de signal Les signaux des masses eacuteleveacutees correspondant agrave de basses freacutequences
se trouvent consideacuterablement eacutelargis (mz 274 000 eacutequivaut agrave mesurer une freacutequence de 393
Hz) De ce fait la limite expeacuterimentale couramment admise se situe agrave mz 27 000 pour un
aimant de 7 Tesla
214
A123 Technologie Orbitrap
L‟Orbitrap est une technologie relativement reacutecente (baseacutee sur le principe d‟un piegravege
orbitalaire eacutelectrostatique) inventeacutee par A Makarov (14) L‟Orbitrap repose sur le pieacutegeage
des ions par un champ eacutelectrostatique quadripolaire qui creacutee l‟oscillation des ions pieacutegeacutes Ces
oscillations proportionnelles au rapport (mz)-12
sont deacutetecteacutees par la mesure du courant
induit et traduites en spectre de masse par la transformeacutee de Fourier (Fig A 13) Il existe
donc de grandes similitudes au niveau de la deacutetection des ions par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR et Orbitrap
Fig A 13 Deacutetection des ions par la technologie Orbitrap Les courants induits correspondent
agrave un interfeacuterogramme qui est la superposition de freacutequences de plusieurs espegraveces Le
traitement du signal qui est reacutealiseacute de la mecircme maniegravere que par spectromeacutetrie de masse FT-
ICR avec les mecircmes contraintes et limitations suivi eacutegalement drsquoune transformation de
Fourier permet de convertir cet interfeacuterogramme en un spectre de freacutequence facilement
convertible en spectre de masse
De ce fait les performances de la technologie Orbitrap en termes de reacutesolution (jusque
100 000) et preacutecision sur la mesure de masse (de l‟ordre de 1-2 ppm) rivalisent avec celles de
la spectromeacutetrie de masse FT-ICR De plus la reacutesolution de l‟Orbitrap eacutetant proportionnelle
au rapport (mz)-12
elle diminue moins vite avec l‟augmentation du rapport mz que dans le
cas du FT-ICR Par ailleurs la gamme dynamique de l‟Orbitrap contrairement agrave la
spectromeacutetrie de masse FT-ICR est satisfaisante (gt 3 deacutecades) (15) L‟Orbitrap est
principalement utiliseacutee en spectromeacutetrie de masse en tandem associeacutee agrave un piegravege lineacuteaire
Le scheacutema et la photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher) que
nous avons utiliseacute pour nos expeacuteriences HDX correspondent aux Fig A 14 et Fig A 15
215
L‟instrument est composeacute d‟une source ESI de type laquo Z-spray raquo suivie d‟une optique ionique
de type laquo S-lens raquo permettant de mieux focaliser les ions et d‟ameacuteliorer la sensibiliteacute Une
optique de transfert ionique (quadripocircle octopocircle) performante en termes de stabiliteacute et
efficaciteacute de transmission des ions permet leur acheminement dans une trappe lineacuteaire Dans
cette trappe ionique il est possible de fragmenter les ions par CID ou ETD et de proceacuteder agrave
leur deacutetection Il est eacutegalement possible de les deacutetecter par transformation de Fourier dans
l‟Orbitrap avec une meilleure reacutesolution Dans ce cas les ions sont transfeacutereacutes de la trappe
lineacuteaire agrave la C-trappe via un quadripocircle puis eacutejecteacutes dans l‟analyseur Orbitrap Une cellule de
collision placeacutee agrave proximiteacute de la C-trappe permet eacutegalement de fragmenter les ions par HCD
(laquo High-energy Collisional Dissociation raquo) Les ions sont ensuite analyseacutes dans l‟Orbitrap
Fig A 14 Scheacutema du LTQ-Orbitrap Velos (drsquoapregraves la documentation de Thermo Ficher
Scientific)
Fig A 15 Photographie du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific) de
la plateforme proteacuteomique de lInstitut Jacques-Monod (Paris 7)
216
A13 Fragmentation en phase gazeuse
La spectromeacutetrie de masse en tandem consiste (i) dans une premiegravere eacutetape agrave seacutelectionner
l‟ion d‟inteacuterecirct (appeleacute ion parent ou ion preacutecurseur) et (ii) dans une seconde eacutetape agrave
analyser les ions fragments (ou ions fils) obtenus par la dissociation de l‟ion parent Selon
les instruments utiliseacutes les eacutetapes de seacutelection et d‟analyse des fragments se font soit dans
l‟espace (tQ Q-TOF TOF-TOF) soit dans le temps (IT FT-ICR) soit en combinant des
eacutetapes dans le temps et l‟espace (q-FT-ICR IT-Orbitrap)
Comme les sources d‟ionisation dites douces (ESI MALDI) celles utiliseacutees pour
l‟analyse des biomoleacutecules conduisent agrave des ions avec peu d‟eacutenergie interne il faut induire la
fragmentation par un apport d‟eacutenergie au systegraveme Cet apport d‟eacutenergie peut se faire de
diffeacuterentes faccedilons (16) collision avec un gaz inerte (fragmentation de haute ou basse
eacutenergie) collision avec une surface irradiation par des photons irradiation par des eacutelectrons
(speacutecifique des FT-ICR) reacuteactions ion-moleacutecule ou ion-ion (dont l‟ETD) Le controcircle de
l‟eacutenergie deacuteposeacutee est un paramegravetre important comme nous avons pu le voir dans le Chap I
dans le cadre des eacutetudes HDX il est important de pouvoir controcircler l‟eacutenergie apporteacutee aux
ions pour ne pas conduire agrave un reacutearrangement aleacuteatoire total des hydrogegravenes et deuteacuteriums le
long du squelette polypeptidique
La spectromeacutetrie de masse en tandem permet d‟obtenir des informations de structure de
l‟ion fragmenteacute (qu‟il soit organique ou biologique) et permet dans le cas de meacutelanges
complexes de seacutelectionner speacutecifiquement une espegravece parmi les autres pour obtenir son
spectre de fragmentation
Les deux principaux types de fragmentation utilisables dans le cadre des eacutetudes HDX sont
deacutetailleacutes dans les sous-paragraphes suivants Il s‟agit des meacutethodes d‟activation par les
eacutelectrons (ECDETD) preacutesenteacutees preacuteceacutedemment dans le Chap I
A131 Fragmentation par ECD sur le FT-ICR
Ce mode de dissociation consiste agrave irradier les ions multichargeacutes par un faisceau
d‟eacutelectrons La recombinaison entre un eacutelectron et l‟ion conduit agrave la formation d‟un cation
radical (Fig A 16) et permet un gain d‟eacutenergie de l‟ordre de quelques eV (2-3 eV) (17) Ce
type de fragmentation est speacutecifique des FT-ICR et a eacuteteacute preacutesenteacute dans le Chap I dans la
217
partie consacreacutee agrave la fragmentation des peptides proteacuteolytiques marqueacutes La grande diffeacuterence
avec la fragmentation CID repose sur la formation initiale d‟un radical cation dont les voies
de fragmentation seront pour des polypeptides tregraves diffeacuterentes de celles du cation Cela se
traduira en particulier par la formation de fragments de type c et z De plus comme vu dans le
Chap II l‟ECD conduit agrave une faible redistribution des deuteacuteriums avant fragmentation ce
que les proposants de meacutecanismes pour l‟ECD ont attribueacute soit agrave une vitesse de fragmentation
rapide ne permettant pas une redistribution initiale de l‟eacutenergie (hypothegravese non-ergodique)
soit plus vraisemblablement agrave une barriegravere de fragmentation suffisamment abaisseacutee pour
rendre la vitesse de rupture des liaisons amide dans le radical cation supeacuterieure agrave celles des
autres voies de fragmentation etou de transferts de protons
e-
[M nH]n+ [M nH](n-1)+bull F1m+ + F2
k+bull
Fig A 16 Capture exothermique drsquoun eacutelectron par une moleacutecule multichargeacutee (positive)
Mode drsquoactivation ECD passe par une voie de fragmentation de type radicalaire
D‟un point de vue technique les eacutelectrons sont formeacutes par une cathode chauffeacutee
indirectement qui a remplaceacute le filament afin d‟obtenir un flux suffisant pour que la capture
d‟eacutelectron soit efficace La fragmentation a lieu dans la cellule ICR ougrave les ions sont pieacutegeacutes agrave
proximiteacute du centre de la cellule Trois paramegravetres influencent l‟efficaciteacute de fragmentation
par ECD (i) le potentiel de la cathode qui controcircle l‟eacutenergie des eacutelectrons mais a eacutegalement
un effet sur le courant d‟eacutelectrons (ii) la tempeacuterature de la cathode et (iii) la dureacutee
d‟irradiation par des eacutelectrons qui controcircle le taux de fragmentation Notons que l‟efficaciteacute
de capture deacutecroicirct rapidement avec l‟eacutenergie des eacutelectrons et qu‟il est important d‟optimiser
au maximum le temps d‟irradiation par des eacutelectrons pour eacuteviter les recaptures successives
tout en obtenant suffisamment de fragmentations (voir Chap III)
Lors de nos expeacuteriences ECD nous avons utiliseacute une cathode chauffeacutee agrave 16 A pour
l‟APEX III et 18 A pour l‟APEX-Qe avec une irradiation par des eacutelectrons de l‟ordre de
quelques eV d‟eacutenergie cineacutetique (de 09 eV pour l‟ubiquitine agrave 2 eV pour aIF2α3) pendant
quelques dizaines de millisecondes (optimum agrave 10 ms) Nous avons travailleacute sur tous les eacutetats
de charge sans seacutelection
218
A132 Fragmentation par ETD sur lrsquoOrbitrap
L‟ETD est un analogue de l‟ECD Il procegravede par une reacuteaction ion-moleacutecule entre un
radical anion formeacute geacuteneacuteralement dans une source CI neacutegatif et un cation multichargeacute La
difficulteacute est de maximiser le transfert d‟eacutelectron en limitant le transfert de proton Les
reacuteactifs ont eacuteteacute optimiseacutes pour cela et le fluoranthegravene utiliseacute dans ce travail est le reacuteactif
geacuteneacuteralement utiliseacute De plus il est possible via le choix du reacuteactif de controcircler la
thermochimie du transfert d‟eacutelectrons On obtient en ETD une fragmentation similaire agrave celle
en ECD mais pas identique
L‟ETD preacutesente tous les avantages de l‟ECD il ne deacutepend pas de la seacutequence
polypeptidique (nature en acides amineacutes et longueur) il permet de localiser des modifications
post-traductionnelles labiles et il permet d‟obtenir une couverture de seacutequence importante
pour les peptides non tryptiques (issus de la digestion de la proteacuteine agrave la trypsine) pour les
proteacuteines et les peptides hautement basiques La meacutethode ETD comme la technique ECD est
donc particuliegraverement bien adapteacutee aux analyses laquo top-down raquo Par ailleurs contrairement agrave
l‟ECD qui requiert un FT-ICR la fragmentation ETD peut ecirctre reacutealiseacutee dans une trappe
ionique quadripolaire radiofreacutequence voire dans un piegravege hexapolaire qui demandent une
faible maintenance et que l‟on retrouve sur une grande varieacuteteacute d‟instruments moins coucircteux
D‟un point de vue technique le fluoranthegravene est utiliseacute comme reacuteactif pour la
fragmentation ETD reacutealiseacutee agrave l‟aide du spectromegravetre LTQ-Orbitrap Velos L‟anion radicalaire
du fluoranthegravene qui constitue donc le reacuteactif ETD est produit par la reacuteaction preacutesenteacutee dans
Fig A 17
Fig A 17 Production du reacuteactif ETD (anion radicalaire) agrave partir du fluoranthegravene
Cette reacuteaction est reacutealiseacutee dans le module ETD (Fig A 18) de l‟instrument qui est donc
constitueacute d‟une source agrave ionisation chimique utilisant
- deux reacuteservoirs indeacutependants de reacuteactifs dont un pour les reacuteactions de type transfert
d‟eacutelectron (ETD) et l‟autre pour les reacuteactions par transfert de proton (PTR)
- une ligne de transfert chauffeacutee
219
- un volume d‟ion chargeacute en eacutelectron par un filament
- une optique de transfert utilisant un quadripocircle pour filtrer le reacuteactif chargeacute en eacutelectron
Il est placeacute agrave proximiteacute de la C-trappe (Fig A 14)
Fig A 18 Module ETD de lrsquoinstrument LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific)
Le reacuteactif ETD est ensuite envoyeacute dans la trappe lineacuteaire ougrave la reacuteaction ionion entre le
peptide multiprotoneacute et un anion radicalaire aura lieu conduisant agrave la fragmentation de l‟ion
peptidique consideacutereacute La dissociation est reacutealiseacutee sur un eacutetat de charge particulier qui a eacuteteacute au
preacutealable seacutelectionneacute dans la cellule de haute pression de la trappe ionique
Trois temps d‟activation (5 15 et 25 ms) correspondant agrave trois dureacutees pendant lesquelles se
deacuteroule la reacuteaction ETD ont eacuteteacute utiliseacutes conseacutecutivement sur un mecircme eacutetat de charge afin de
maximiser la couverture de seacutequence En effet des profils de fragmentation diffeacuterents sont
obtenus en fonction du temps d‟activation Pour chaque temps d‟activation une minute
environ de fragmentation a eacuteteacute enregistreacutee
L‟option laquo Supplemental Activation raquo a eacutegalement eacuteteacute utiliseacutee Elle permet d‟apporter au
systegraveme une petite quantiteacute d‟activation collisionnelle suppleacutementaire afin de faciliter la
dissociation de l‟ion preacutecurseur En effet il a eacuteteacute montreacute que dans beaucoup de cas le transfert
d‟eacutelectron avait lieu sans que la dissociation soit pour autant effective
220
A133 Fragmentation par CID sur le Q-ToF
Des expeacuteriences de collision avec un gaz inerte (CID) ont eacuteteacute reacutealiseacutees sur le Q-ToF
Premier (Waters) (Fig A 19) Les diffeacuterents eacutetats de charge des ions multichargeacutes (positifs)
ont eacuteteacute seacutelectionneacutes dans le quadripocircle du spectromegravetre de masse avant d‟ecirctre fragmenteacutes dans
la cellule de collision L‟eacutenergie de collision est le paramegravetre agrave optimiser pour la dissociation
de chaque eacutetat de charge
Fig A 19 Scheacutema du Q-ToF Premier (Waters)
A2 Expeacuteriences drsquoeacutechange hydrogegravenedeuteacuterium
A21 Marquage
A211 Peptides modegraveles seacutelectivement deuteacutereacutes
Les peptides de synthegravese (P1 HHHHHHIIKIIK P2 KKDDDDDDIIKIIK P3
KKDDDIIKIIK P4 KKDDDIIK) ont eacuteteacute acheteacutes chez Genscript Corporation (Piscataway
NJ) Une solution stock agrave 1 mM de chaque peptide a eacuteteacute preacutepareacutee en diluant le peptide
lyophiliseacute dans D2O Afin d‟eacutechanger complegravetement tous les sites eacutechangeables (hydrogegravenes
d‟amide de la liaison peptidique et hydrogegravenes labiles des chaicircnes lateacuterales des acides
amineacutes) la solution est incubeacutee agrave tempeacuterature ambiante pendant au moins 1 heure Le
221
deacutemarquage (seacutelectif du cocircteacute N-terminal) est initieacute en diluant au 1100e la solution stock dans
H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05 M pH 23) MeOH 11 (vv)
A212 Proteacuteine modegravele ubiquitine
L‟ubiquitine petite proteacuteine modegravele a eacuteteacute utiliseacutee (avec les peptides modegraveles de T
Joslashrgensen) pour eacutetudier le laquo back-exchange raquo Elle a donc eacuteteacute totalement marqueacutee par dilution
de sa poudre lyophiliseacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM et incubation pendant
1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
De la mecircme maniegravere la substance P et le Glu F sont deux peptides qui ont eacuteteacute
ponctuellement utiliseacutes comme sonde de l‟eacutechange inverse Leur poudre lyophiliseacutee a donc
eacuteteacute eacutegalement dilueacutee dans D2O agrave la concentration finale de 100 microM puis le meacutelange a eacuteteacute
incubeacute pendant 1 heure agrave 37degC sous agitation (600 rpm)
A213 Proteacuteine aIF2α3 et complexe proteacuteique aIF2α3γ
L‟eacutechange isotopique de la proteacuteine ou du complexe proteacuteique d‟inteacuterecirct sous sa forme
native se fait par incubation dans une solution correspondant agrave son tampon de purification
contenant des deuteacuteriums eacutechangeables Une fois le temps d‟eacutechange souhaiteacute atteint le
marquage doit ecirctre arrecircteacute dans des conditions figeant les deuteacuteriums d‟amide du squelette
polypeptidique sur leur position et en deacutemarquant les autres sites eacutechangeables (hydrogegravenes
labiles des chaicircnes lateacuterales) Pour cela il faut diminuer tregraves rapidement la tempeacuterature du
milieu et repasser en conditions acides et en milieu protoneacute Dans ces conditions seuls les
deuteacuteriums des chaicircnes lateacuterales des acides amineacutes seront eacutechangeacutes par des hydrogegravenes et les
deuteacuteriums sur la fonction amide de la liaison peptidique conserveront leur localisation
aIF2α3 Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique aIF2α3 agrave 178
microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave une
tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute bloqueacute
lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF 2
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aIF2α3γ Sulfolobus solfataricus
112 microL de D2O NaCl 330 mM ont eacuteteacute ajouteacutes agrave 16 microL de solution proteacuteique agrave aIF2α3γ agrave
1156 microM dans H2O NaCl 330 mM Le meacutelange a eacuteteacute incubeacute pendant des temps variables agrave
une tempeacuterature de 37degC sous agitation (600 rpm) et l‟eacutechange hydrogegravenedeuteacuterium a eacuteteacute
bloqueacute lors de l‟eacutetape de dessalage par ajout de 128 microL de H2OAF2
A22 Dessalage
Le dessalage se deacuteroulant apregraves les eacutechanges hydrogegravenedeuteacuterium il doit obligatoirement
ecirctre effectueacute agrave faible tempeacuterature (dans la glace) et pH afin de minimiser les eacutechanges
inverses Pour cette mecircme raison il est obligatoire d‟utiliser une technique de dessalage
rapide excluant de ce fait bon nombre de systegravemes
Un dessalage laquo off-line raquo a eacuteteacute reacutealiseacute imposeacute par le type d‟approche choisi (approche
laquo top-down raquo) Une Sep-Paktrade C8 (Waters) a eacuteteacute utiliseacutee
Les colonnes sont activeacutees deux fois avec 1 mL ACNMeOHAF 499 499 02 puis
rinceacutees deux fois avec 1 mL H2OAF 1 La colonne conditionneacutee est conserveacutee au
reacutefrigeacuterateur jusqubdquoagrave utilisation L‟eacutechantillon meacutelangeacute agrave eacutegal volume avec H2OAF 2 (eacutetape
d‟arrecirct de la reacuteaction) est chargeacute immeacutediatement sur la colonne Les sels sont eacutelimineacutes par
trois lavages successifs avec 1 mL H2OAF 1 glaceacute
A23 Analyse par spectromeacutetrie de masse
Le mode d‟ionisation utiliseacute a eacuteteacute l‟eacutelectrospray Les eacutechantillons proteacuteiques ont eacuteteacute
injecteacutes dans le spectromegravetre de masse par le dispositif de seringue refroidie (ou par le
nouveau systegraveme d‟introduction la laquo cryosource raquo que nous avons mis au point et preacutesenteacute
dans Chap V)
Pour cela les proteacuteines dessaleacutees sont finalement eacutelueacutees avec un meacutelange H2OACNAF
49 49 2 (500 microL pour aIF2α3 concentration finale agrave 57 microM et 250 microL pour aIF2α3γ
concentration finale agrave 74 microM) et immeacutediatement analyseacutees par FT-ICR
223
Les peptides seacutelectivement marqueacutes sont analyseacutes dans H2O glaceacutee (0degC) et acide (AA 05
M pH 23) MeOH 11 (vv) agrave la concentration finale de 10 microM
Les eacutechantillons totalement marqueacutes (ubiquitine peptides) sont dilueacutes au 1100e dans
H2OACNAF 49 49 2 pour ecirctre analyseacutes en spectromeacutetrie de masse agrave la concentration
finale de 1 microM
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