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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

FACULDADE DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA

EFEITO ANSIOLÍTICO E ANTIDEPRESSIVO DO

DESIDRODIEUGENOL ( BIS-EUGENOL) EM CAMUNDONGOS:

ESTUDO NEUROCOMPORTAMENTAL E NEUROQUÍMICO

JEFERSON FALCÃO DO AMARAL

Fortaleza - CE

2010





Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-

Graduação em Farmacologia, da Universidade Federal

do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau

de Doutor em Farmacologia. Área de concentração:

Farmacologia do Sistema Nervoso Central.

Orientador (a): Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa.

Fortaleza - CE

2010

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde

A514e Amaral, Jeferson Falcão do.

Efeito ansiolítico e antidepressivo do desidrodieugenol (Bis-eugenol) em camundongos: estudo neurocomportamental e neuroquímico. / Jeferson Falcão do Amaral. – 2010.

124 f.: il., color.,enc. ; 30 cm. Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina,

Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Fortaleza, 2010.

Área de Concentração: Farmacologia do Sistema Nervoso Central. Orientação: Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa. 1. Ansiolíticos. 2. Eugenol. 3. Monoaminas Biogênicas. I. Título. CDD 615.323





Aprovada em _____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

________________________________________________________

Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará – UFC

________________________________________________________

Profa. Dra. Marta Maria França Fonteles Universidade Federal do Ceará – UFC

________________________________________________________________

Prof. Dr. Otoni Cardoso do Vale Universidade Federal do Ceará – UFC

_________________________________________________________

Profa. Dra. Adriana Campos Rolim Barros Universidade de Fortaleza - UNIFOR

_______________________________________________________

Profa. Dra. Regilane Matos da Silva Universidade Federal do Mato Grosso - UFMT

“O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato não os despreza. O

Altíssimo deu-lhes a ciência da medicina para ser honrado em suas maravilhas, e dela

se serve para acalmar as dores e curá-las. O farmacêutico faz misturas agradáveis,

compõe ungüentos úteis à saúde, e seu trabalho não terminará, até que a paz divina

se estenda sobre a face da terra”.

(Eclesiástico 38, 4. 6-8)

DedicatóriaDedicatóriaDedicatóriaDedicatória

A Deus, Senhor de todas as coisas, por permitir meu crescimento pessoal e profissional e por me capacitar, a

cada dia, para escrever esta tese de Doutorado

Aos meus pais que me deram o primeiro impulso para a vida e me ensinaram o verdadeiro significado do

amor e da integridade

À minha esposa Rejane, maior incentivadora do meu crescimento profissional e pessoal, que esteve sempre

ao meu lado nos momentos mais alegres e nos momentos mais difíceis durante minha trajetória acadêmica

Aos meus filhos, Nicolas e Stephany, por serem a razão e estímulo para prosseguir adiante e representarem

sempre o amor, a alegria, a motivação e o entusiasmo pela vida e em minha vida

AGRADECIMENTOS

À Profa. Dra. Francisca Cléa Florenço de Sousa, pessoa por quem tenho profunda admiração e

respeito, pela preciosa orientação, confiança, paciência e apoio na execução deste trabalho.

Agradeço, principalmente, porque a Profa. Cléa Florenço não orienta apenas para o

desenvolvimento científico, mas orienta também para a vida.

À Profa. Dra. Glauce Socorro Barros Viana, pessoa a quem tenho profunda admiração e

respeito, por sua cordial acolhida em seu laboratório, para que eu pudesse executar os

experimentos e concluir o meu doutorado.

Aos professores do curso de pós-graduação, pelos conhecimentos transmitidos e dedicação

permanente aos alunos e ao programa de pós-graduação.

Aos Professores: Izabel Gomes, Danielle Macêdo, Silvânia Vasconcelos, Flávia Almeida, Vietla

Rao, Rachel Pinho, Josenilda Malveira, Michell Kamimura, Eucléa Vale e Regilane Matos pelo

apoio e incentivo constantes, a fim de verem o meu desenvolvimento acadêmico e profissional

durante os últimos 05 anos.

Aos amigos de pós-graduação: Patrícia Gomes, Patrícia Freire, Carla Thiciane, Fernando

Araújo, Aline Albuquerque, Maria do Carmo, Flávio Damasceno e Tiago Olinda pela amizade e

apoio recebidos sempre.

Aos estudantes de iniciação científica: Manuel Rufino, Brinell Arcanjo, Mariana Feitosa pela

dedicação e seriedade no auxílio à execução dos experimentos.

Às Técnicas de Laboratório, Vilani Bastos e Jaqueline, pela sua cooperação e apoio.

A todos que fazem parte do Laboratório de Neurofarmacologia, pelos préstimos e convívio

amigável, que tornaram mais agradável minha passagem por este laboratório.

Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Faculdade de Medicina da

Universidade Federal do Ceará e em especial aos funcionários da secretaria do curso de pós-

graduação em Farmacologia, pelo apoio e cooperação.

RESUMO

Desidrodieugenol, conhecido como bis-eugenol, é um orto-dímero do eugenol que, similarmente ao eugenol, exibe atividades antiinflamatória e antioxidante. Eugenol, também, apresentou efeito antidepressivo, no entanto, as ações biológicas do bis-eugenol em modelos experimentais para screening da atividade antidepressiva não tem sido estudada. O presente estudo investigou a possível atividade antidepressiva do bis-eugenol nos testes do nado forçado e suspensão da cauda, em camundongos, e o envolvimento do sistema monoaminérgico neste efeito. A análise neuroquímica das monoaminas no cérebro de camundongos submetidos ao tratamento agudo com bis-eugenol foi também realizado. Além disso, os efeitos centrais do bis-eugenol foram avaliados em modelos animais de ansiedade tais como tempo de sono induzido por pentobarbital, teste da placa perfurada, labirinto em cruz elevado (plus maze), convulsões induzidas por pentilenotetrazol e teste do claro escuro. Bis-eugenol reduziu o tempo de imobilidade no teste do nado forçado, o qual não acompanhou as alterações da ambulação no teste do campo aberto na dose de 10 mg/kg, no entanto, a ambulação foi induzida pelas doses de 25 e 50 mg/kg. O melhor efeito anti-imobilidade do bis-eugenol (50 mg/kg, i.p.) foi revertido pelo pré-tratamento dos camundongos com PCPA 100 mg/kg, i.p. (um inibidor da síntese de serotonina) por quatro dias consecutivos. Prazozin (1 mg/kg, i.p., antagonista α1-adrenoceptor), ioimbina (1 mg/kg, i.p., antagonista α2-adrenoceptor), SCH23390 (15 µg/kg, s.c., antagonista do receptor D1) ou sulpirida (50 mg/kg, i.p., antagonista do receptor receptor D2). Bis-eugenol apresentou atividade ansiolítica no teste da placa perfurada, plus maze e claro/escuro que parece não estar relacionado com o sistema gabaérgico, uma vez que o flumazenil, um antagonista dos benzodiazepínicos no sítio receptor gabaérgico, não reverteu o efeito ansiolítico provocado pelo bis-eugenol no teste do plus maze. A análise dos níveis de monoaminas e seus metabólitos, utilizando High Performace Liquid Chromatograph (HPLC), revelou um significativo aumento nos níveis de monoamínas (NA, DA e 5-HT) e seus metabólitos (DOPAC, HVA e 5-HIAA) no corpo estriado dos camundongos. O presente estudo sugere que o efeito anti-imobilidade observado com o tratamento agudo de bis-eugenol no teste do nado forçado está relacionado ao sistema monoaminérgico, considerando o aumento dos níveis de monoaminas e seus metabólitos no cérebro. Foi observado um efeito ansiolítico do bis-eugenol que não está relacionado com o sistema gabaérgico, uma vez que o flumazenil não reverteu os efeitos do bis-eugenol no teste do plus maze. Palavras-chave: Ansiolíticos. Eugenol. Monoaminas Biogênicas.

ABSTRACT

Desidrodieugenol, known as bis-eugenol, is an ortho dimer that of similarly to eugenol was able to exhibits anti-inflammatory and antioxidant. Bis-eugenol has also showed antidepressant effect, however, the biological actions of bis-eugenol on experimental models for screening of antidepressant activity are still unknown. The present study investigated the possible antidepressant-like activity of bis-eugenol in the forced swimming test (FST) and the tail suspension test (TST) in mice and the involvement of monoaminergic system in this effect. In addiction, the neurochemical analysis on brain monoamines of mice acutely treated with bis-eugenol was also conducted. Besides, the central effects of bis-eugenol were evaluated, also, animal models of anxiety such as barbiturate-induced sleeping time, hole board, elevated plus maze, pentilenotetrazole induced-convulsions and white/black test. Bis-eugenol drecreased the immobility time in the FST which accompanying changes in ambulation in the open-field test at 10 mg/kg, i.p., nevertheless, it induced ambulation at 25 and 50 mg/kg doses. The higher anti-immobility effect of bis-eugenol (50 mg/kg, i.p.,) was prevented by pre-treatment of mice with PCPA 100 mg/kg, i.p., ( inhibitor of serotonin synthesis, 4 consecutive days), prazozin (1 mg/kg, i.p., α1-adrenoceptor antagonist), yohimbine (1 mg/kg, i.p., α2-adrenoceptor antagonist), SCH23390 (15 µg/kg, s.c., D1 receptor antagonist) or sulpiride (50 mg/kg, i.p., D2 receptor antagonist). Bis-eugenol showed anxiolytic activity in the hole board, elevated plus maze and white/black test and it seems there no performance of bis-eugenol on the gabaergic system, once flumazenil no reverted the anxiolytic effect of bis-eugenol in the plus maze test. Monoamines analysis using High Performace Liquid Chromatograph (HPLC) reveled a significant increase in 5-HT, NE, DA levels in brain striatum, as well as the metabolites DOPAC, HVA and 5-HIAA were also increased. The present study suggests that the anti-immobility or antidepressant-like effect of bis-eugenol in the FST is related to the monoaminergic system, likely due to increase of brain monoamines. An anxiolytic effects was observed which no related of the gabaergic system, once flumazenil no reversed the anxiety effects of the bis-eugenol in the plus maze test. Keywords: Anti-Anxiety Agents . Eugenol . Biogenic Monoamines

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 17

1.1 Generalidades 17

1.2 Eugenol e seus derivados 19

1.3 Desidrodieugenol ou bis-eugenol (DDE) 24

1.4 Ansiedade e depressão 25

1.5 Sistema dopaminérgico 28

1.5.1 Receptores dopaminérgicos 29

1.5.2 Expressão dos receptores dopaminérgicos 30

1.5.3 Vias de transdução de sinal 31

1.5.4 Funções da dopamina 33

1.5.5 Síntese, metabolização e localização dos receptores dopaminérgicos (DA) 34

1.6 Sistema serotonérgico 37

1.6.1 Localização dos receptores serotonérgicos 39

1.7 Sistema noradrenérgico 40

1.8 Áreas cerebrais (corpo estriado) 43

1.9 Relevância e justificativa 44

2 OBJETIVOS 46

2.1 Objetivos gerais 46

2.2 Objetivos específicos 46

3 MATERIAIS 47

3.1 Equipamentos e materiais 47

3.2 Reagentes e drogas 47

3.3 Animais experimentais 48

4 MÉTODOS 48

4.1 Preparo da droga 48

4.2 Tratamento dos grupos experimentais 49

4.3 Modelos experimentais (neurocomportamentais) 50

4.3.1 Teste do nado forçado 50

4.3.2 Teste da suspensão da cauda 51

4.3.3 Teste do campo aberto 51

4.3.4 Teste do tempo de sono induzido por pentobarbital 52

4.3.5 Teste do Rota Rod 52

4.3.6 Teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol 53

4.3.7 Teste do labirinto em cruz elevado (Plus maze) 53

4.3.8 Teste do Claro/Escuro 54

4.3.9 Teste da placa perfurada (Hole Board) 54

4.4 Dissecação da área cerebral (corpo estriado) 54

4.5 Estudo neuroquímico 55

4.5.1 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC 55

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 56

6 RESULTADOS 57

6.1 Avaliação da atividade antidepressiva 57

6.1.1 Efeito do DDE no teste do nado forçado (Investigação do possível envolvimento

no sistema dopaminérgico)

57


no sistema serotonérgico)

60


no sistema noradrenérgico)

60

6.1.4 Efeito do DDE no teste da suspensão da cauda 65

6.2 Avaliação do envolvimento do sistema dopaminérgico nos efeitos centrais do DDE 67

6.2.1 Efeito do DDE no teste do campo aberto 67

6.3 Avaliação da atividade ansiolítica e sedativa/hipnótica 74

6.3.1 Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital 74

6.3.2 Efeito do DDE no teste do Rota Rod 77

6.3.3 Efeito do DDE no teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol 79

6.3.4 Efeito do DDE no teste do labirinto em cruz elevado (Plus maze) 81

6.3.5 Efeito do DDE no teste do Claro/Escuro 87

6.3.6 Efeito do DDE no teste da placa perfurada (Hole Board) 89

6.4 Estudo neuroquímico 91

7 DISCUSSÃO 97

8 CONCLUSÕES 106

REFERÊNCIAS 107

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 Efeito do DDE no teste do nado forçado (Investigação do

possível envolvimento do sistema dopaminérgico)

58


possível envolvimento do sistema serotonérgico)

61


possível envolvimento do sistema noradrenérgico)

63

TABELA 4 Efeito do DDE no teste da suspensão da cauda.

65

TABELA 5 Efeito do DDE no teste do campo aberto.

70

TABELA 6 Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por

pentobarbital.

74

TABELA 7 Efeito do DDE no teste do Rota rod.

77

TABELA 8 Efeito do DDE no teste das convulsões induzidas por

pentilenotetrazol

79

TABELA 9 Efeito do DDE no teste do labirinto em cruz elevado (Plus

maze)

82

TABELA 10 Efeito do DDE no teste do Claro/Escuro

87

TABELA 11 Efeito do DDE no teste da placa perfurada (Hole board)

89

TABELA 12 Efeito do DDE sobre os Níveis de Neurotransmissores

91

TABELA 13 Efeito do DDE sobre os Níveis de Metabólitos 94

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 Estrutura química do Eugenol e seus derivados químicos

20

FIGURA 2 Estrutura química do Desidrodieugenol ou bis-eugenol

24

FIGURA 3 Vias dopaminérgicas no cérebro.

29

FIGURA 4 Vias da 5-hidroxitriptamina (serotonérgicas) no cérebro.

38

FIGURA 5 Síntese do desidrodieugenol ou bis-eugenol (DDE) a partir do

Eugenol

49

FIGURA 6 Efeito do DDE no teste do nado forçado (Investigação do possível

envolvimento do sistema dopaminérgico)

59


envolvimento do sistema serotonérgico)

62


envolvimento do sistema noradrenérgico)

64

FIGURA 9 Efeito do DDE no teste da suspensão da cauda

66

FIGURA 10A Efeito do DDE no teste do campo aberto (Nº de travessias)

71

FIGURA 10B Efeito do DDE no teste do campo aberto (Nº de rearing)

72

FIGURA 10C Efeito do DDE no teste do campo aberto (Nº de grooming)

73

FIGURA 11A Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital

(latência de sono)

75

FIGURA 11B Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital

(tempo de sono total)

76

FIGURA 12 Efeito do DDE no teste do Rota Rod

78

FIGURA 13 Efeito do DDE no teste das convulsões induzidas por

pentilenotetrazol

80

FIGURA 14A Efeito do DDE no teste do Plus maze (Investigação do possível

envolvimento do sistema gabaérgico) – NEBA

83

FIGURA 14B Efeito do DDE no teste do Plus maze (Investigação do possível

envolvimento do sistema gabaérgico) – TPBA

84

FIGURA 14C Efeito do DDE no teste do Plus maze (Investigação do possível

envolvimento do sistema gabaérgico) – PEBA

85

FIGURA 14D Efeito do DDE no teste do Plus maze (Investigação do possível

envolvimento do sistema gabaérgico) – PTBA

86

FIGURA 15 Efeito do DDE no teste do Claro/Escuro

88

FIGURA 16 Efeito do DDE no teste da placa perfurada (Hole board)

90

FIGURA 17A Efeito do DDE 10mg/kg sobre os Níveis de Neurotransmissores

92

FIGURA 17B Efeito do DDE 50mg/kg sobre os Níveis de Neurotransmissores

93

FIGURA 18A Efeito do DDE 10mg/kg sobre os Níveis de Metabólitos

95

FIGURA 18B Efeito do DDE 50mg/kg sobre os Níveis de Metabólitos 96

LISTA DE QUADROS

QUADRO 01 Receptores da dopamina

30

QUADRO 02

Localização, no SNC, dos receptores dopaminérgicos e

segundos mensageiros

36

QUADRO 03 Localização dos receptores noradrenérgicos e segundos

mensageiros

42

LISTA DE ABREVIATURAS

AC - Adenilil ciclase

ACETIL CoA - Acetilcoenzima A

ACh – Acetilcolina

AChE - Acetilcolinesterase

AMPc – 3’;5’-adenosina monofosfato cíclico

ANOVA - Análise de variância

ASP - Aspartato

Bmax - Número máximo de receptores

BSA – Albumina sérica bovina

CAT - Catalase

COMT- Catecol orto metiltransferase

D1 e D2 - Receptores dopaminérgicos do tipo 1 e 2

DA - Dopamina

DOPAC -Ácido 3, 4 dihidroxifenilacético

EEG - Eletroencefalograma

EP – estado epiléptico

EROs – espécies reativas derivadas do oxigênio

EUA - Estados Unidos da América

GABA - Ácido gama aminobutírico

GLI – Glicina

GLU- Glutamano

GSH - Glutationa reduzida

GPx – Glutationa peroxidase

HVA -Ácido homovanílico

h – Hora 3H-NMS - 3H-N-Metilescopolamina

5- HT- 5-Hidroxitriptamina (serotonina)

5- HT1 e 5- HT2 – Receptor serotonérgico dos tipos 1 e 2

5-HIAA – Ácido 5-hidroxiindolacético

i.p. - Intraperitoneal

Kd - Constante de dissociação

Kg – Kilograma

LC – Latência da primeira convulsão

LEP – Latência do estado epiléptico

MAOA – Monoamina oxidase A

MAOB – Monoamina oxidase B

MDA – Malonil dialdeído ou malondialdeído

M1 e M2 - Receptores muscarínicos do tipo 1 e 2

ME - Movimentos estereotipados

mg – Miligrama

min – Minutos

mL – Mililitros

mM - Milimolar

MK-801 - Antagonista para receptores de NMDA

NA – Noradrenalina

Need – N-1-naftiletilenodiamina

NEBA – número de entradas nos braços abertos

nM – Nanômetro

nmol - Nanomoles

NMDA – N-metil-D-aspartato

NO – Óxido nítrico

PEBA – porcentagem de entrada nos braços abertos

PG - Proteína transdutora do sinal ligada ao GTP

PI - Fosfoinositídios

PIP2 - Fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato

PIP - Fosfatidilinositol 4-fosfato

PKC - Proteína quinase C

PLC - Fosfolipase C

PTZ - Pentilenotetrazol.

RCM - Receptores colinérgicos muscarínicos

RD1 - Receptores dopaminérgicos D1

RD2 - Receptores dopaminérgicos D2

RL – Radicais livres

RNAm - Ácido ribonucleico mensageiro

rpm – Rotações por minuto

s - Segundos

SCH 23390 - 7-Cloro-2,3,4,5-tetrahidro-metil-5-fenil-1H-3-benzazepina

SCP - Sinais colinérgicos periféricos

s.c. - Subcutâneo

SNC - Sistema Nervoso Central

SNP - Sistema Nervoso Periférico

SOD – Superóxido dismutase

TIR - Tirosina

TSH - Hormônio tireotrófico

TBA – Ácido tiobarbitúrico

TBARS – Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TPBA – tempo de permanência nos braços abertos

v.o. - Via oral

XO - Xantina oxidase

µL - Microlitros

µM – Micromolar

17

1 INTRODUÇÃO

1.1 Generalidades

O uso de produtos naturais iniciou-se há milhares de anos por populações de vários

países com o intuito de tratar diversas patologias onde eram utilizados como forma alternativa

ou complementar aos medicamentos sintéticos (SOUSA et al., 2008). Estudos atuais

confirmam a importância das plantas medicinais na saúde mundial, com grandes avanços

observados na medicina moderna. A medicina tradicional é usada em todas as partes do

mundo e tem uma grande importância econômica, principalmente pelo uso de plantas

medicinais que têm uma posição respeitável hoje; especialmente em países em

desenvolvimento onde o serviço de saúde moderno é limitado e representa um tratamento

pouco acessível (AGRA, 2008).

A utilização da fitoterapia, que significa o tratamento com “remédios” elaborados a

partir de plantas, vem desde épocas remotas. A referência mais antiga que se tem

conhecimento do uso de plantas data de mais de sessenta mil anos. As primeiras descobertas

foram feitas por estudos arqueológicos em ruínas do Irã. Também na China em 3.000 a.C. já

existiam farmacopéias que copilavam as ervas e suas indicações terapêuticas (REZENDE;

COCCO, 2002).

Segundo Maciel e colaboradores (2002), o conhecimento sobre plantas medicinais

simboliza muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos.

O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo quanto à espécie

humana. Ainda hoje nas regiões mais pobres do país e até mesmo nas grandes cidades

brasileiras, plantas medicinais são comercializadas em feiras livres, mercados populares e

encontradas em quintais de residências.

As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais contribuem de

forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais prescritos, com

frequência, pelos efeitos medicinais que produzem, apesar de não terem seus constituintes

químicos conhecidos (VEIGA JUNIOR; PINTO MACIEL, 2005). Dessa maneira, usuários de

plantas medicinais do mundo inteiro mantêm viva a prática do consumo de fitoterápicos,

tornando válidas informações terapêuticas que foram sendo acumuladas durante séculos.

A Organização Mundial da Saúde (OMS) reconhece a importância da fitoterapia,

sugerindo ser uma alternativa viável e importante também às populações dos países em

desenvolvimento, já que seu custo é diminuído. As plantas medicinais têm um importante

18

papel na saúde mundial. Apesar dos grandes avanços observados na medicina moderna, nas

últimas décadas, elas continuam sendo utilizadas e estima-se que 25 a 30% de todos os

fármacos avaliados como agentes terapêuticos são provenientes de produtos naturais

(CALIXTO, 2005).

Segundo Brandão e colaboradores (2006) os países latino-americanos são ricos em

espécies medicinais devido à diversidade vegetal vasta e rica tradição da utilização de

vegetais praticada por seus povos durante séculos. No Brasil, no entanto, a mistura intensa de

culturas conduziu a uma introdução de espécies nativas de outros continentes. O uso de

plantas medicinais, então, foi disseminado principalmente pela cultura indígena. É um país

rico na sua biodiversidade cujo território possui cinco principais biomas: floresta amazônica,

cerrado, mata atlântica, pantanal e caatinga; figurando como uma rica fonte de produtos

terapêuticos (SOUSA et al., 2008). O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e

sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de

sua vocação para os produtos naturais (PINTO et al., 2002).

Especificamente no Nordeste do Brasil, a diversidade de espécies, aliada à precária

assistência à saúde de grande parte da população, torna o uso de plantas medicinais uma

prática cada vez mais comum para o tratamento de várias enfermidades. As substâncias

biologicamente ativas, presentes nos extratos ou óleos essenciais de diferentes partes dessas

plantas, são retiradas através de chás ou infusões e utilizadas na medicina popular contra os

mais diversos males (MAIA, 2007).

Agra e colaboradores (2008), realizaram um levantamento das plantas medicinais

usadas na região Nordeste do Brasil, onde obteve um total de 650 espécies e 407 gêneros

pertencentes a 111 famílias. Destes, cerca de 126 espécies, referidas por seus usos medicinais,

são exóticas e cultivadas na região. No entanto o mesmo estudo concluiu que a maioria das

espécies relatadas não tem sido estudada em relação aos seus constituintes químicos e/ou

atividades biológicas. Ressalta, ainda, a importância de se investigar essas espécies que não

tem sido objeto de estudos farmacológicos e químicos, embora sua utilização popular tenha

sido relatada.

As potencialidades do uso de plantas medicinais encontram-se longe de estarem

esgotadas. Novos conhecimentos e novas necessidades certamente encontraram no reino

vegetal soluções através da descoberta e desenvolvimento de novas moléculas com atividade

terapêutica (SIMÕES et al., 2004).

De maneira direta, a cultura popular do uso de plantas medicinais, desperta o interesse

de pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como a botânica, a

19

farmacognosia, a química orgânica, a farmacologia e a toxicologia; que juntas enriquecem os

conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural que é a flora mundial. O potencial

das plantas como fonte de novas drogas ainda oferece grande campo para investigação

científica, pois das cerca de 250 000 a 500 000 espécies conhecidas, uma pequena

porcentagem foi investigada fitoquimicamente e apenas uma fração desta já foi avaliada

quanto ao seu potencial farmacológico (RATES, 2001). De acordo com Cordell e Colvard

(2005) mesmo entre as plantas com uso medicinal tradicional ainda há um grande percentual

que não foi objeto de estudo visando à comprovação da eficácia e da segurança de seu uso.

Individualmente, a descoberta de novos fármacos, ou fármacos acessíveis, pode

determinar a melhoria da qualidade de vida em doenças crônicas ou a própria sobrevivência

do paciente afetado. Socialmente, a descoberta de fontes naturais e locais de compostos

químicos usualmente importados e/ou o desenvolvimento de fitoterápicos de fabrificação

nacional, podem ter conseqüências econômicas significativas, além de possibilitar autonomia

de cada país no gerenciamento de suas políticas de saúde (RATES, 2001).

No entanto, mesmo a descoberta de novos fármacos, através de síntese química a

partir de compostos oriundos de fontes naturais, devem observar rigorosamente a legislação

vigente. No Brasil, os quatro conceitos bioéticos básicos (autonomia, não maleficência,

beneficiência e justiça) foram incorporados à Resolução 1/1988 do Conselho Nacional de

Saúde (CNS), Ministério da Saúde (MS), posteriormente substituída pela Resolução

196/1996, que normatiza as pesquisas nessa área visando o aprimoramento do conhecimento

científico e à produção de novos fármacos para serem incorporados ao arsenal terapêutico no

contexto do atendimento médico-hospitalar. Esta legislação brasileira (Resolução 196/1996

do Conselho Nacional de Saúde – MS) regulamenta as etapas das pesquisas pré-clínicas e

clínicas para avaliação de novos fármacos e registro de novos medicamentos (LAPA et al.,

2003).

1.2 Eugenol e seus derivados

Eugenol (4-alil-1-hidroxi-2-metoxibenzeno), um constituinte natural fenólico

semelhante a um óleo aromático, está presente em muitas plantas medicinais como

Cinnamomum zeylanicum Blume, Caryophilus aromaticus (IRIE et al., 2004), Eugenia

caryophyllata (ZHENG; KENNEY; LAM, 1992), Rosa ssp (UMEZU et al., 2002),

Cinnamomum verum (CHENG et al., 2004), Caryophillus aromaticus (COSTA et al., 1994).

20

Eugenol apresenta várias atividades: anticonvulsivante (SAYYAH; VALIZADEH;

KAMALINEJAD, 2002), hipotérmica (WON et al., 1998), antioxidante (FUJISAWA et al.,

2002), antidepressiva (IRIE et al., 2004), é extensamente utilizado também como analgésico

em odontologia (OHKUBO et al., 1997) e induz apoptose em células HL-60 de leucemia

promielocítica humana (YOO et al., 2005). Muitos derivados de combinações de eugenol têm

atividade depressora no Sistema Nervoso Central (SNC) como metileugenol, isoeugenol e

metilisoeugenol (MELLO et al., 1973). Benzileugenol, fenileugenol, feniletil-eugenol são

anticonvulsivantes (BARBOSA et al., 1988). Desidrodiisoeugenol tem atividade

antiinflamatória (MURAKAMI et al., 2003) e o dimetildesidrodieugenol deprime o SNC

(COSTA et al., 1994).

Eugenol é um agente aromático utilizado em cosméticos e produtos alimentícios.

Este composto também é amplamente usado em odontologia como um material do cimento

com óxido de zinco ou como um agente sedativo. Por outro lado, isoeugenol, um isômero do

Eugenol, é encontrado em óleos essenciais e sabões, vinho, café e atua como um agente

aromatizante e conservante (FUJISAWA et al., 1999; FUJISAWA et al., 2007).

Para diminuir a potente atividade oxidativa de Eugenol, foram sintetizados vários

compostos relacionados ao Eugenol como o bis-eugenol ou dehidrodiisoeugenol (DDE - 3,30-

dimetoxi-5, 50-di-2-propenil-1, 10-bifenil-2, 20-diol), um dímero do Eugenol menos

citotóxico e com atividade antioxidante mais significativa quando comparado ao Eugenol,

sugerindo que o bis-eugenol poderia agir como um potente inibidor da resposta inflamatória e

alérgica (MURAKAMI et al., 2003).

Figura 1. Estrutura química do Eugenol e do Desidrodieugenol

Fonte: http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/mol_summary/?molName=Eugenol

Eugenol

(4-alil-1-hidroxi-2-metoxibenzeno)

Bis-eugenol (3,30-dimetoxi-5 ,50-di-2-propenil-1 ,1

0-bifenil-2 ,20-diol)

21

Foi relatada a participação do Eugenol em reações fotoquímicas, além de possui

atividade antioxidante, inseticida e fotocitotoxicidade. Entretanto, em baixas concentrações, o

Eugenol pode atuar como agente antioxidante e antiinflamatório, enquanto que em altas

concentrações pode agir como pró-oxidante (YOO et al., 2005).

Yoo e colaboradores (2005) investigaram os efeitos do eugenol, isolado da Eugenia

caryophyllata (Myrtaceae), sobre a citotoxicidade, indução de apoptose e as supostas vias de

suas ações em células HL-60 e observaram que a geração de ROS desempenha um papel

crítico na apoptose induzida por eugenol em células HL-60, observando um efeito

anticancerígeno.

Outros estudos demonstraram que o Eugenol é o princípio ativo majoritário

encontrado no rizoma de Acori graminei, uma planta medicinal usada para epilepsia e perda

de memória na Ásia Oriental durante séculos, na redução da citotoxicidade induzida por Aβ1–

40 em células PC-12 in vitro. Estes achados propõem, no futuro, um potencial terapêutico e

profilático do eugenol na administração para desordens neurológicas ou psiquiátricas. Além

disso, foi demonstrado que eugenol e imipramina induzem o fator neurotrófico derivado do

cérebro (BDNF) no hipocampo com e sem indução de metalonéina-III (MT-III) e que

possivelmente ocorra o envolvimento da expressão MT-III na exibição da atividade

antidepressiva do eugenol, mas não da imipramina (IRIE et al., 2004).

Eugenol e Isoeugenol são bem conhecidos por possuírem atividade antioxidante.

Estresse oxidativo é produzido quando o equilíbrio entre estímulo oxidativo e vários sistemas

antioxidantes é alterado. Embora eugenol e isoeugenol sejam utilizados em baixos níveis,

estes compostos foram previamente apresentados com a habilidade de sensibilizar a pele

causando reações alérgicas, possivelmente devido ao estresse oxidativo. A partir do momento

em que estes compostos fazem contato direto com a mucosa oral ou com a pele, o estresse

oxidativo e o oxigênio molecular passam e ter um papel crucial na sua citotoxicidade.

Estudos demonstraram que Eugenol produz radicais livres intracelulares derivados

do oxigênio a partir da foto-oxigenação por irradiação de luz visível e/ou alcalinização,

resultando em aumento da citotoxicidade. No entanto, os mecanismos determinantes das

atividades antioxidantes/pró-oxidantes do eugenol e isoeugenol são pouco conhecidos. Em

conclusão, está claro que a citotoxicidade do isoeugenol ocorre na produção intracelular de

radicais livres de oxigênio de maneira dependente, associada com redução nos níveis

intracelulares de glutationa (GSH), é provavelmente mediado pela formação do radical benzil.

Em contraste, à citotoxicidade do eugenol na presença de estresse oxidativo ocorre de maneira

independente da produção intracelular de radicais livres de oxigênio, o qual pode atuar como

22

um antioxidante em baixas concentrações e como uma característica de pró-oxidante, e é

provavelmente mediado através do mecanismo dos radicais fenoxil (FUJISAWA et al., 1999;

FUJISAWA et al., 2007).

A modulação do fator nuclear intracelular kappaB (NF-kappaB) via de sinalização

envolvidos na expressão desregular de proliferação celular e moléculas reguladoras do ciclo

celular é uma abordagem pragmática para a quimioprofilaxia. Trabalhos recentes

demonstraram o efeito modulador do Eugenol sobre NF-kappaB reduzindo significativamente

a incidência de tumores gástricos por suprimir sua ativação como também pela modulação da

expressão de genes alvo NF-kappaB que regulam a proliferação e a sobrevivência das células,

podendo essa via de sinalização do eugenol ter um impacto significativo sobre abordagens

terapêuticas quimiopreventivas para o câncer (MANIKANDAN et al., 2009).

Kar Mahapatra e colaboradores (2009) observaram o efeito protetor in vitro do

eugenol na toxicidade induzida por nicotina sobre macrófagos peritoneais murinos, com

diminuição do nível de geração de radicais, NADPH oxidase e atividade de mieloperoxidase,

lipídios, proteínas, danos ao DNA e glutationa oxidada, sugerindo um potencial de

uso/benefício do eugenol como um modulador da nicotina induzida pela lesão celular,

podendo ser usado como uma droga imunomoduladora contra a toxicidade da nicotina.

Compostos orto-metoxifenóis como Eugenol e Isoeugenol apresentam atividades

antioxidantes e anti-inflamatórias, mas com maior concentração de atuar como agentes

oxidantes e alérgenos potentes. Em geral, acredita-se que baixas concentrações de Eugenol

atuam como antioxidantes, com benéfico efeito antiinflamatório; enquanto altas

concentrações atuam como pró-oxidantes, levando a lesão tecidual como resultado da

formação dos nocivos radicais fenoxil. Recentemente foi demonstrado que o bis-eugenol, é

um eficaz inibidor da expressão de citocinas inflamatórias em macrófagos induzidos por LPS,

como também a expressão da COX-2 e do NF-kappaB, sugerindo que o desidrodieugenol age

como um potente antiinflamatório (MURAKAMI et al., 2005; FUJISAWA et al., 2007).

Eugenol, princípio ativo do rizoma de Acori graminei, uma erva medicinal usada na

Ásia para o tratamento da Doença de Alzheimer, demonstrou proteger células neuronais do

efeito citotóxico de peptídeos amilóide (Abs) em culturas de células e apresentou atividade

antidepressiva em camundongos. O Eugenol inibe as monoamino oxidases (MAO A e MAO

B), por inibição competitiva com o substrato monoamina provavelmente devido à relação

estrutura-atividade que possui características estruturais importantes para essa inibição.

Estudos para avaliar a atividade antidepressiva utilizando o teste de nado forçado em

23

camundongos, sugerem uma ligação entre a atividade antidepressiva de eugenol e sua

atividade inibitória da MAO em relação aos seus substratos 5-HT e DA (TAO et al., 2005).

Eugenol, por ter relevância clínica na epilepsia e cefaléia, foi investigado quanto a

suas propriedades neurofisiológicas. Eugenol reduziu significativamente a potenciação de

longa duração por aproximadamente 30% em comparação com os controles, suprimindo

potenciais epileptiformes e depressão alastrante, provavelmente através da inibição da

plasticidade sináptica, indicando seu potencial uso no tratamento da epilepsia e da dor cefálica

(MÜLLER et al., 2006).

Estudos realizados por Ardjmand e colaboradoes (2006) utilizando hipocampo de

ratos, observaram os efeitos do Eugenol sobre a transmissão sináptica e potenciação de longa

duração (LTP). Eugenol diminuiu a amplitude do PS de forma dependente com efeito rápido e

completamente reversível, indicando que enquanto eugenol deprime transmissão sináptica,

não afeta a capacidade sináptica CA1 para induzido pelo tétano.

Metil-eugenol, composto majoritário e isolado do Croton zehntneri, mostrou possuir

atividade depressiva no sistema nervoso central (SNC). Em estudo utilizando modelos

comportamentais de depressão e ansiedade como campo aberto, natação forçada, plus-maze e

hole board, metil-eugenol induziu alterações antidepressivas no SNC, expressas pela menor

imobilidade no modelo de natação, e não de um nível capaz de alterar a atividade motora e

exploratória, podendo essa ausência de efeitos observados no campo aberto ser um resultado

da contingência experimental, tendo altos níveis de ansiedade (NORTE; COSENTINO;

LAZARINI, 2005).

Eugenol, extraído de Caryophyllus aromaticus (Myrtaceae), foi estudado quanto ao

edema de língua produzido pela aplicação tópica do sumo de Dieffenbachia picta Schott

(Araceae), uma planta ornamental conhecida como "comigo-ninguém-pode", com

propriedades tóxicas que quando mastigada, provoca um edema doloroso da membrana da

mucosa oral e inflamação aguda que pode torna-se grave produzindo obstrução da glote,

comprometimento respiratório e até morte. Quando comparado com a combinação de

medicamento. Eugenol, mesmo na menor dose de 5 mg/kg, apresentou melhores resultados na

redução e inibição do edema de língua induzido pelo suco de D. picta em até 70% do edema

em geral provavelmente pela inibição da ácido araquidônico, podendo ser utilizado no

tratamento da intoxicação com D. picta em substituição aos tratamentos clássicos, reduzindo

o risco de efeitos colaterais dessas substâncias (DIP et al., 2004).

24

1.3 Desidrodieugenol ou bis-eugenol (dde)

O desidrodieugenol (DDE), também conhecido como bis-eugenol, é um dímero de

eugenol e apresenta-se em baixas concentrações em algumas plantas como Syzygium

aromaticum (MIYAZAWA; HISAMA, 2003). O DDE pode ser preparado sinteticamente por

uma reação de oxidação que produz um dímero orto (YOKOE et al., 1997). Possui baixa

atividade citotóxica e uma atividade antioxidante maior do que o eugenol (ATSUMI et al.,

2000; SATOH et al., 1998). O DDE possui, ainda, atividade antimutagênica (MIYAZAWA et

al., 2003) e anti-inflamatória (MURAKAMI et al., 2003). Foi demonstrado que o bis-eugenol

sintetizado pela oxidação do Eugenol é menos citotóxico e mais antioxidante do que o

Eugenol, porém seu mecanismo anti-inflamatório permanecia incerto. Murakami e

colaboradores (2003) propuseram um possível mecanismo de ação antiinflamatório do bis-

eugenol. Observou-se que bis-eugenol, mas não Eugenol, inibiu a degradação inibitória de

kB-α em macrófagos murino estimulados com LPS e, conseqüentemente, a atividade

transcricional do NF-kB nas células, além de o bis-eugenol inibir a expressão de citocinas

inflamatórias estimuladas por LPS agindo assim como um potente inibidor do NF-kB

podendo ser útil para a quimioprofilaxia de doenças bucais.

A depressão é uma síndrome psiquiátrica altamente prevalente na população em geral,

(TENG; HUMES; DEMETRIO, 2005). Após o desenvolvimento da Imipramina como uma

droga antidepressiva, foram pesquisados muitos tipos de substâncias para serem utilizadas

clinicamente no tratamento de doenças afetivas (IRIE et al., 2004).

Considerando que o Eugenol possui atividade antidepressiva, anticonvulsivante e

antioxidante, decidiu-se avaliar as alterações neurocomportamentais e neuroquímicas do

desidrodieugenol (DDE), um derivado sintético do Eugenol, em modelos animais de

depressão, convulsão e ansiedade, avaliando, ainda, as alterações nos níveis de

neurotransmissores em áreas cerebrais específicas, como o corpo estriado, em camundongos.

25

Fonte: http://www.bmrb.wisc.edu/metabolomics/mol_summary/?molName=Eugenol

1.4 Ansiedade e depressão

Depressão representa um distúrbio afetivo muito doloroso resultante de queda

importante da auto-estima, manifestando-se por episódios ou estados de humor deprimido que

podem durar semanas, meses ou anos consecutivos. Trata-se de doença bastante freqüente,

acometendo 3 a 6% da população geral e seu diagnóstico e tratamento adequado tem grande

impacto sobre a saúde e qualidade de vida do paciente. A maioria dos casos é de depressão

reativa, ou seja, secundária a um problema real. São freqüentes outros casos na família. O

prognóstico é variável e depende da ocorrência de recorrência, recaída ou cronificação da

depressão e com o risco de suicídio (BROWN et al., 1996; LIBERMAN; WANG CHENG.,

2005).

A depressão maior é um dos distúrbios psiquiátricos mais comuns. Em qualquer

momento particular, cerca de 5-6% da população sofrem de depressão (prevalência pontual), e

estima-se que 10% das pessoas possam apresentar depressão durante a sua vida (prevalência

em toda a vida). Os sintomas de depressão são freqüentemente sutis e passam despercebidos

tanto para o paciente quanto para o médico. Deve-se suspeitar da presença de depressão em

pacientes com queixas vagas que não têm qualquer explicação, como manifestações de

distúrbios somáticos e naqueles que, de maneira simplista, poderiam ser considerados

“neuróticos” (KATZUNG, 2005).

A depressão é um distúrbio heterogêneo que foi caracterizado e classificado de

diversas maneiras. A depressão maior e a distimia (menor) são síndromes depressivas puras,

enquanto o distúrbio bipolar e o distúrbio ciclotímico indicam depressão em associação com

mania. Uma classificação simplificada, baseada na suposta origem do distúrbio é a seguinte:

Figura 2. Estrutura química do Desidrodieugenol ou bis-eugenol (DDE)

26

(1) depressão “reativa” ou “secundária” (a mais comum), que ocorre em resposta a estímulos

reais, como pesar, doença, etc; (2) depressão “endógena”, um distúrbio bioquímico

geneticamente determinado, que se manifesta por uma incapacidade de sentir prazer ou lidar

com acontecimentos habituais da vida; e (3) depressão associada ao distúrbio afetivo bipolar

(maníaco- depressivo) (KATZUNG, 2005).

Atualmente as síndromes depressivas são classificadas como transtornos do humor do

mesmo modo que as síndromes maníacas. Entende-se por humor a emoção constante e

predominante que é a base para as percepções de um indivíduo em relação ao meio externo.

Geralmente o humor é descrito como irritável, deprimido, desesperançado, ansioso, eufórico,

etc. (ATKINSON et al., 2002).

Ansiedade é uma reação medrosa, sem causa lógica identificável, levando o indivíduo

a sofrer por antecipação. Ansiedade e depressão constituem as mais freqüentes causas de

busca de atenção primária à saúde. Apesar de dolorosa, a ansiedade normal não é

necessariamente nociva, pois funciona como uma reação de alerta. O paciente ansioso

apresenta um estado psíquico doloroso e desagradável de enorme temor, exagerada

expectativa, grande tensão e super-vigilância, acompanhada de pronunciadas manifestações

somáticas neurovegetativas, neuroendócrinas e neuroimunitárias, induzidas pelo medo

irracional sem causa aparente. A ansiedade pode gerar mal-estar e sofrimento intenso,

podendo interferir de modo debilitante, diminuindo o rendimento intelectual, prejudicando as

relações interpessoais e com o meio ambiente, afetando o conforto emocional desejável e

limitando as funções biopsicossocioculturais (BRUNELLO, 2000; LIBERMAN et al., 2005).

A ansiedade dita patológica é um dos distúrbios psiquiátricos que mais afetam as

pessoas em todas as partes do mundo e, dessa forma, é fácil deduzir que aqueles

medicamentos capazes de atenuar os seus sintomas, chamados de “ansiolíticos”, têm sido

procurados e consumidos pelo homem desde a antiguidade. Entre os atuais ansiolíticos,

destacam-se drogas que estão inseridas no grupo dos benzodiazepínicos, antidepressivos e

anti-histamínicos, principalmente. Contudo, há necessidade de se buscarem novos agentes

farmacológicos para esse fim, considerando a falta de especificidade e efeitos indesejáveis

apresentados pelas drogas usadas clinicamente (SILVA, 1997; GRAEFF; GUIMARÃES,

1999).

Não se pode negar que estamos vivendo hoje a era da incerteza, da insegurança e,

conseqüentemente, da ansiedade. Mesmo que seja incorporado ao discurso comum de

qualquer indivíduo, o termo ansiedade se refere a uma experiência humana muito difícil de se

definir ou de se caracterizar. No entanto, pode-se dizer que a ansiedade caracteriza-se por um

27

estado de tensão, apreensão e desconforto, que se originam de perigo interno ou externo

iminente, podendo ser resposta a estresse ou a estímulo ambiental. É considerada uma emoção

semelhante ao medo. Porém, enquanto este é o fruto de ameaça definida, na ansiedade a fonte

do perigo é incerta ou desconhecida. Os sintomas ligados à ansiedade podem ser

predominantemente psíquicos, como preocupação, nervosismo, irritabilidade, insônia,

dificuldade de concentração, ou somáticos, a exemplo de sudorese, taquicardia, tremores,

opressão no tórax ou epigastro, tensão muscular, cefaléia entre outros (SILVA, 1997;

GRAEFF; GUIMARÃES, 1999).

É um fenômeno humano subjetivo e, exceto para algumas das alterações somáticas e

autônomas associadas, não possui um equivalente óbvio nos animais experimentais. Em

termos biológicos, pode ser considerada uma forma particular de inibição comportamental,

ocorrendo em resposta a eventos ambientais que são novos, que não contêm qualquer

recompensa ou que são punitivos. Na verdade, essa inibição comportamental que ocorre nos

animais pode assumir a forma de imobilidade ou supressão de uma resposta comportamental

(RANG; DALE, 2004). Alterações na transmissão neuronal dos sistemas gabaérgico,

serotonérgico, noradrenérgico e dopaminérgico são considerados importantes na

fisiopatologia da ansiedade e depressão.

Os BDZs (Benzodiazepínicos) possuem efeito farmacológico de redução da ansiedade,

sedação, indução do sono, diminuição do tônus muscular e da coordenação, além de serem

anticonvulsivantes. Podem dificultar o processo de aprendizagem e memória, além de

prejudicar as funções psicomotoras. Produzem efeitos tóxicos, se misturados ao álcool,

levando, eventualmente, o paciente ao estado de coma. Se forem utilizados por alguns meses,

podem causar dependência química (CARVALHO; DIMENSTEIN, 2004). Agem nos

receptores GABA que equilibra a transmissão sináptica inibitória no sistema nervoso central

como um todo. Esse medicamento potencializa a resposta ao GABA fazendo com que ocorra

a abertura dos canais de cloreto ativados pelo GABA, intensificando a afinidade do GABA

pelo receptor (RANG, 2004). Classificam-se de acordo com a sua meia-vida plasmática, como

sendo uma ação muito curta, curta, intermediária e longa. Apesar dessa divisão, sabe-se hoje

que o grau de afinidade da substância pelo receptor benzodiazepínico também interfere na

duração da ação (LARANJEIRAS, 2002).

Os Fármacos Antidepressivos podem ser classificados nas seguintes categorias:

• Inibidores da captura de monoaminas: antidepressivos tricíclicos, como a

amitriptilina e a imipramina, que não são seletivos, ou seja, inibem a

recaptação de serotonina e noradrenalina. Inibidores seletivos da captura de

28

serotonina como a fluoxetina, paroxetina, fluvoxamina, sertralina; outros

inibidores que não tem as mesmas características químicas aos antidepressivos

tricíclicos, mas que são semelhantes farmacologicamente como: maprotilina,

reboxetina. Antidepressivos atípicos, como a bupropiona, inibe seletivamente a

recaptação de dopamina.

• Inibidores da monoaminooxidase p. ex., fenelzina, tranicilpromina, esses

fármacos não são seletivos aos subtipos A e B da MAO; A moclobemida é

seletiva para a MAO-A (RANG, 2004).

1.5 Sistema dopaminérgico

A dopamina (DA) pertence ao grupo de neurotransmissores chamado de

catecolaminas. As características estruturais dessas monoaminas são a presença de um único

grupamento amina, um núcleo de catecol (um anel benzeno com dois gupos de hidroxilas

adjacentes) e uma cadeia lateral de etilamina ou um de seus derivados. O precursor para a

síntese da dopamina é o aminoácido tirosina. Duas reações transformam a tirosina em

dopamina: a primeira é catalisada pela enzima tirosina-hidroxilase (TH) a qual converte

tirosina em L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA). A tirosina-hidroxilase é considerada a

enzima limitante desta via. O segundo passo é a descarboxilação da DOPA, catalisada pela

enzima L-aminoácido descarboxilase (AADC), a qual produz dopamina (FELDMAN;

MEYER; QUENZER., 1997).

A dopamina constitui em torno de 80% do conteúdo de catecolaminas no cérebro.

Projeções originadas de áreas cerebrais que sintetizam este neurotransmissor se estendem para

regiões do mesencéfalo formando quatro vias dopaminérgicas: (1) nigroestriatal; (2)

mesolímbica; (3) mesocortical e (4) tuberoinfundibular (Figura 3).

O sistema nigroestriatal compreende os neurônios dopaminérgicos que se

originam da substância negra da “pars compacta” do mesencéfalo e terminam na região

chamada de corpo estriado dorsal. Esta região inclui o núcleo caudado e putamen. A via

nigroestriatal está envolvida no controle dos movimentos e a sua degeneração causa a doença

de Parkinson, caracterizada por tremor de repouso, rigidez e bradicinesia (GERFEN, 1992;

LANG; LOZANO, 1998b). A via mesocortical tem origem na área tegumentar ventral (ATV)

e inerva diferentes regiões do córtex frontal. Esta via parece estar envolvida em alguns

aspectos do aprendizado e memória (LE MOAL; SIMON, 1991; FELDMAN; MEYER;

29

QUENZER., 1997). A via mesolímbica é originada do mesencéfalo na área tegumentar

ventral e inerva o estriado ventral (nucleus accumbens), o tubérculo olfatório (TO) e parte do

sistema límbico (FELDMAN; MEYER; QUENZER., 1997). Esta via está implicada com o

comportamento motivacional (KOOB; BLOOM, 1988; KOOB, 1992). A via

tuberoinfundibular origina-se das células do núcleo periventricular e arqueado do hipotálamo

(FELDMAN; MEYER; QUENZER., 1997). Projeção desta via atinge a eminência mediana

do hipotálamo onde libera dopamina no espaço perivascular do plexo capilar do sistema porta

hipotalâmico-hipofisário. Daí a dopamina é transportada para a pituitária anterior onde atua

sobre o lactótrofo para inibir a liberação da prolactina. Este hormônio estimula a produção do

leite na glândula mamária (FELDMAN; MEYER; QUENZER., 1997; DOPPLER, 1994) e

estimula a proliferação de lactótrofo por um mecanismo autócrino na glândula pituitária

(SAIARDI et al., 1997).

Figura 3 – Vias dopaminérgicas no cérebro.

Fonte: Rang et al., 2004

1.5.1 Receptores dopaminérgicos

A dopamina exerce sua ação pela ligação a receptores de membrana específicos

(GINGRICH; CARON, 1993), os quais pertencem a família de receptores ligados à proteína

30

G (guanina nucleotídeo) com 7 domínios transmembrana. Cinco distintos receptores

dopaminérgicos foram isolados, caracterizados e subdivididos em duas sub-famílias, D1- e D2-

símile, com base em suas propriedades bioquímicas e farmacológicas (Quadro 1).

A sub-família D1-símile compreende os receptores D1- e D5-, enquanto o D2-

símile inclui os receptores D2-, D3- e D4-. O C-terminal de ambas sub-famílias contém locais

de fosforilação e esterificação, os quais parecem estar envolvidos na dessenssibilização do

receptor (BATES et al., 1991; NG et al., 1994). Ligantes dopaminérgicos facilmente

distinguem os receptores das sub-famílias D1- e D2-símile. Entretanto, a maioria deles não

diferencia claramente entre os membros da mesma sub-família. Por exemplo, o antagonista do

receptor D1, SCH-23390, ou o agonista SKF-38393 tem afinidade semelhante para ambos

receptores D1- e D5. A seletividade farmacológica destes compostos tem ainda de ser

determinada em animais vivos. Para esta finalidade o uso de animais knock-out de um

receptor em particular será de grande ajuda na definição da seletividade de um composto

particular para um receptor específico.

Quadro 1 – Receptores da dopamina

Distribuição

Papel Funcional

Tipo D1 Tipo D2

D1 D5 D2 D3 D4

Córtex

Reatividade,

Humor

+++

−

++

−

+

Sistema límbico Emoção,

Comportamento

Estereotipado

+++ + ++ +

Estriado Controle motor

+++ + ++ + +

Hipotálamo

ventral e adeno-

hipófise

Secreção de prolactina − − ++ + −

Transdução de

sinais

↑AMPc ↑AMPc ↓AMPc

e/ou ↑IP3

↓AMPc

e/ou ↑IP3

↓AMPc

e/ou ↑IP3

AMPC – adenina monofosfato cíclico IP3 – trifosfato de inositol


31

1.5.2 Expressão dos receptores dopaminérgicos

Os genes dos receptores dopaminérgicos D1- e D2 possuem uma maior

distribuição e apresentam maiores níveis de expressão. O receptor D1 é principalmente

expresso no caudado-putamen, núcleo accumbens, tubérculo olfatório, córtex cerebral. Os

receptores D1 também foram detectados no núcleo sub-talâmico. Na substância negra pars

reticulata não foi detectado nenhum RNAm para o receptor D1, embora tenha sido mostrado a

ligação de ligantes específicos para este receptor nesta região. Isto sugere que o receptor D1 é

expresso no neurônio estriatal que envia suas projeções para a substância negra através da via

nigroestriatal. O gene do receptor D5 tem um padrão de expressão mais restrito quando

comparado com o receptor D1. A expressão deste receptor foi detectada no hipocampo, núcleo

mamilar lateral e no núcleo parafascicular do tálamo (JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994).

O receptor D2 é expresso predominantemente nos tecidos cerebrais, tais como o

caudado putamen, tubérculo olfatório e nucleus accumbens. Este receptor é também expresso

na substância negra pars compacta e na área tegumentar ventral. Estas são as regiões

anatômicas que originam as fibras dopaminérgicas, indicando que os receptores D2 têm uma

localização pré-sináptica. Em contraste, os receptores D1-símile são receptores

exclusivamente pós-sinápticos (CIVELLI et al., 1991). Além do cérebro os receptores D2

estão também localizados na retina, fígado, sistema vascular e glândula pituitária (NG et al.,

1994, JACKSON;WESTLIND-DANIELSSON, 1994; PICETTI et al., 1997).

A distribuição neuroanatômica do RNAm do receptor D3 no cérebro de ratos é

restrita a poucas regiões cerebrais tais como a ilha de Calleja, um pouco do núcleo septal,

hipotálamo e regiões distintas do tálamo e cerebelo (JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994). Além disso, o receptor D3 está também localizado na substância negra

pars compacta indicando localização pré-sináptica. O receptor D4 parece estar altamente

expresso no córtex frontal, amígdala, bulbo olfatório, hipocampo, hipotálamo e mesencefálo

(JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).

32

1.5.3 Vias de transdução de sinal

As vias de transdução de sinal ativadas pelos receptores dopaminérgicos são

numerosas. Entretanto, os efeitos mais descritos mediados pela dopamina são a ativação ou

inibição da via do AMPc e a modulação da atividade de canais.

A estimulação de efetores celulares originados de receptores dopaminérgicos é

mediada via interação com membros de proteínas regulatórias heterotriméricas ligadas ao

GTP (proteína G) (HEPLER; GILMAN, 1992). A região da terceira alça intracelular dos

diferentes receptores dopaminérgicos tem um papel central na interação com a proteína G

(STRADER; SIGAL; DIXON, 1989).

Receptores do sub-tipo D1-símile são reguladores dos níveis de AMPc

(MONSMA-JR et al., 1990; SUNAHARA et al., 1991; JACKSON; WESTLIND-

DANIELSSON, 1994). A estimulação destes receptores resulta na ativação da proteína kinase

A (PKA). A PKA fosforila proteínas citoplasmáticas e nucleares e regula o metabolismo

celular, incluindo a função de canais iônicos e também dessenssibiliza a proteína G ligada aos

receptores, levando a uma resposta celular para liberar o neurotransmissor (CHOI et al., 1993;

HOFMANN et al., 1994). A inibição da atividade da adenilato ciclase, entretanto, parece ser

uma propriedade geral dos receptores D2-símile. O receptor D2 foi primeiro caracterizado

como um inibidor dos níveis de AMPc intracelular na glândula pituitária, e nas células

estriatais. O receptor D2 desencadeia a inibição da adenilato ciclase por acoplamento de vias

sinalizadas bloqueadas pela toxina pertussis (GINGRICH; CARON, 1993; JACKSON;

WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Similarmente ao receptor D2, o receptor D3 é descrito

como um inibidor dos níveis de AMPc endógeno em vários tipos celulares (JACKSON;

WESTLIND-DANIELSSON, 1994; MISSALE et al., 1998). Entretanto, o receptor D3 parece

inibir a adenilato ciclase com menos eficiência que o receptor D2 (MISSALE et al., 1998). A

literatura também relata que o receptor D4 pode inibir o acúmulo de AMPc na retina e em uma

variedade de tipos celulares (MISSALE et al., 1998).

A estimulação do receptor D1 aumenta a corrente dos canais de Ca2+ do tipo L e

leva a redução da corrente nos canais de Ca2+ do tipo N e P em neurônios neoestriatais de

ratos, via uma ação direta ou indireta da PKA (MISSALE et al., 1998). De modo oposto, em

células glomerulares da adrenal em ratos, o receptor D1 inibe a corrente dos canais de Ca2+ do

tipo T (DROLET et al., 1997). Os receptores D1 podem também mobilizar os estoques de

33

Ca2+ intracelulares pela ativação da via do AMPc sem ativar a hidrólise do fosfoinositídeo

(MISSALE et al., 1998).

Os receptores D2 podem diretamente modular vários efetores diferentes pela

ligação da subunidade α da proteína Gi (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).

Além disso, via proteína Gi, o receptor D2 reduz a corrente de canais de Ca2+ do tipo N em

interneurônios colinérgicos neoestriatais em ratos (YAN; SONG; SURMEIER, 1997) e

medeia a inibição da atividade de Ca2+ nos melanótrofos (TARASKEVICH; DOUGLAS,

1990).

A modulação do receptor D2 na concentração do Ca2+ intracelular pode ter um

papel importante na biossíntese da dopamina, visto que os receptores D2 têm localização tanto

pré como pós-sináptica. De fato a tirosina-hidroxilase, a enzima que limita a taxa de produção

da dopamina, é ativada pela Ca2+/calmodulina dependente de proteína-quinase (BRAUN;

SCHULMAN, 1995) e a Ca2+/calmodulina dependente de proteína-quinase é

subsenquentemente ativada por Ca2+ ligado a calmodulina (CHOI et al., 1993).

Existem trabalhos conflitantes reportando que os receptores D1-símile são capazes

de aumentar ou diminuir o efluxo de potássio. De fato foi demonstrado que os agonistas D1-

símile aumentam a corrente de potássio em células de retina de galinha via um mecanismo

independente de AMPc, mas inibem este efluxo em neurônios estriatais de ratos (MISSALE

et al., 1998). Correntes de potássio em vários tecidos neurais, tais como o estriado, neurônios

dopaminérgicos mesencefálicos, lactótrofos e melanótrofos são regulados pela ativação dos

receptores D2 (SUNAHARA et al., 1991; JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994).

1.5.4 Funções da dopamina

A importância da dopamina no controle dos movimentos é demonstrada em

condições patológicas tais como a doença de Parkinson. De fato esta doença é caracterizada

pela redução da dopamina circulante devido à degeneração de neurônios dopaminérgicos

(LANG; LOZANO, 1998a, 1998b). A disponibilidade de agonistas e antagonistas permitiu

estudos, os quais indicam o papel dos receptores dopaminérgicos nas funções motoras tais

como locomoção, rearing, catalepsia, sniffing e grooming em camundongos e ratos.

Geralmente, agonistas aumentam a função dopaminérgica, aumentando a atividade motora,

enquanto os antagonistas possuem efeito oposto. A administração sistêmica do agonista do

receptor D1, SKF-38393, em ratos aumenta o grooming e o sniffing, mas não aumenta

34

significantemente a locomoção ou outros comportamentos estereotiopados (JACKSON;

WESTLIND-DANIELSSON, 1994). Entretanto, a infusão direta deste agonista dentro do

núcleo accumbens também afeta a locomoção, rearing e a estereotipia de maneira dose-

dependente (MEYER et al., 1993a). De forma oposta, a injeção de antagonistas dos receptores

D1, tais como SCH-23390 ou SKF-83566 reduzem os mesmos comportamentos, de maneira

dose e tempo-dependente (MEYER et al., 1993b).

As administrações de baixas doses de agonistas dos receptores D2 causam uma

redução das funções motoras, provavelmente pela estimulação dos receptores pré-sinápticos.

Isto leva a uma redução do disparo das células dopaminérgicas e liberação de dopamina

(JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994). A injeção de antagonistas dos receptores

D2, tanto quanto antagonistas dos receptores D1, diminuem a atividade motora. Quando altas

doses destes compostos são administradas, o animal torna-se cataléptico, mantendo uma

posição anormal por um período de tempo (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994;

FELDMAN et al., 1997). Um achado interessante consiste no efeito sinérgico entre os

receptores D1 e D2, desde que estereotipia induzida pela administração de agonistas dos

receptores D1 e D2 juntos são mais intensas que aquelas produzidas por um dos agonistas

sozinho (JACKSON; WESTLIND-DANIELSSON, 1994; FELDMAN et al., 1997).

A geração de camundongos modificados geneticamente para os diferentes

componentes das vias dopaminérgicas constitui uma poderosa ferramenta para estudar o papel

dessas proteínas in vivo. Análise comportamental de animais mutantes para quatro receptores

dopaminérgicos (D1-D4) mostrou que cada um apresenta um fenótipo locomotor.

Inesperadamente, em contraposição aos prognósticos feitos a partir de análises

farmacológicas, a locomoção em animais knock-out de receptores D1 não é afetada (DRAGO

et al., 1994), nem tão pouco a sua linha de base aumenta, quando comparado aos animais

normais (XU et al., 1994). Estes resultados confirmam dados anteriores sugerindo uma

interação mais complexa entre os diferentes tipos de receptores dopaminérgicos na regulação

dos movimentos voluntários, especialmente com respeito à interação dos receptores D1 e D2.

O estudo do comportamento locomotor de camundongo Knock-out para o receptor

D2 claramente revelou um impedimento motor no camundongo mutante (BAIK et al., 1995).

O impedimento é caracterizado pelos movimentos reduzidos e não-coordenados e também na

supressão de rearings.

Mutantes de receptores D3 e D4 também mostraram fenótipo locomotor anormal.

Mutantes do receptor D3 apresentaram um fenótipo hiperlocomotor o qual está de acordo com

os resultados obtidos pelos estudos farmacológicos usando agonistas (FELDMAN et al.,

35

1997) e antagonistas (ACCILI et al., 1996) de receptores D3. Surpreendentemente, a

locomoção em mutantes dos receptores D4 foi também afetada, e em particular é reduzida,

apesar do que tem sido predito da expressão anatômica deste receptor (SVENSSON et al.,

1994; RUBINSTEIN et al., 1997).

1.5.5 Síntese, metabolização e localização dos receptores dopaminérgicos (DA)

A DA exerce seus efeitos biológicos por interagir com os receptores específicos. Esses

receptores foram classificados originalmente segundo Kebabian & Calne (l979), como

receptores dopaminérgicos D1 (D1-símile) e D2 (D2-símile).

Esses receptores realizam suas ações por se acoplarem e ativarem diferentes

complexos de proteína G. O receptor D1 interage com o complexo de proteína Gs, resultando

em ativação da adenililato ciclase e um aumento nos níveis de AMPc intracelular. Os

receptores D2 interagem com um complexo de proteina GI para inibir a produção de AMPc

(COOPER; BLOOM; ROTH, l99l; CIVELLI; BUNZOW; GRANDY, l993).

Estudos indicam que os receptores dopaminérgicos podem influenciar a função

celular através de outros mecanismos, além de estimular ou inibir a adenililato ciclase (AC).

O receptor D1 parece fazer também um efeito estimulatório no “turnover” do fosfoinositídio.

Enquanto o receptor D2, além de inibir a AC, aumenta a condutância para o K+ e modula o

metabolismo do fosfoinositídio (COOPER; BLOOM; ROTH, l99l; CIVELLI; BUNZOW;

GRANDY, l993). O avanço da biologia molecular e o aperfeiçoamento de técnicas de

radioligantes possibilitou a identificação de quatro subtipos de receptores D2 (D2c, D2L, D3 e

D4) e um subtipo de receptor D1 (D5). O receptor D2 foi dividido em dois subtipos: D2c

(curto) e o D2L (longo), onde o D2L se diferencia do D2c por possuir 29 aminoácidos a mais

na sua estrutura. Esses dois subtipos parecem ter uma farmacologia idêntica. Um terceiro

subtipo de receptor D2 determinado foi D3, encontrado em altos níveis em certas regiões do

sistema límbico cerebral, enquanto, baixos níveis são observados no corpo estriado. O perfil

farmacológico do subtipo D3 é similar, mas não idêntico ao D2. O mecanismo efetor do

subtipo D3 ainda não é conhecido (COOPER; BLOOM; ROTH, l99l). O quarto subtipo de

receptor D2 recentemente clonado foi D4. O gene desse receptor possui alta homologia para

os genes dos receptores D2 e D3. As características farmacológicas desse subtipo lembram as

do D2 e D3 e o mecanismo efetor do D4 também é desconhecido (CIVELLI; BUNZOW;

GRANDY, l993).

36

O subtipo de receptor D1 encontrado, chamado de D5, é farmacologicamente similar ao

receptor D1, porém sua afinidade por agonistas endógenos (DA) é cerca de dez vezes maior.

Similar ao D1, o subtipo D5 estimula a ativação da AC, sendo esse o seu mecanismo efetor.

Sua localização está principalmente nas áreas límbicas (SOKOLOFF; SCHWARTZ; GIROS,

1995; SOKOLOFF et al., 1995).

A ação da DA foi descoberta desde décadas passadas e interpretada através das suas

interações com somente dois receptores. A descoberta de D2c, D2L, D3, D4 e D5

imediatamente revelou a possibilidade de que a atividade desses novos receptores tenha sido

disfarçada pelos receptores clássicos D1 e D2 (CIVELLI; BUNZOW; GRANDY, l993). Tendo

em vista essa dúvida, quanto à nova classificação de receptores dopaminérgicos em D1, D2,

D3, D4 e D5, alguns pesquisadores preferem agrupar esses subtipos em D1-símile e D2-símile,

já que as propriedades farmacológicas e estruturais desses subtipos clonados (D2c, D2L, D3,

D4 e D5) não são suficientemente divergentes daquelas já existentes (D1 e D2).

A DA está presente na maioria das regiões do SNC, sendo originada de longos axônios

que partem da substância nigra e área tegmentar ventral e inervam os núcleos da base, partes

do sistema límbico e o córtex frontal (KEBABIAN; CALNE, 1979).

O sistema dopaminérgico compreende três vias neuronais principais: nigroestriatal,

mesocorticolímbica e tuberoinfundibular. A via nigroestriatal está envolvida com disfunções

extrapiramidais. Esta via é responsável por 75% da DA cerebral, sendo constituída por

neurônios que se projetam da substância nigra para o corpo estriado. A via nigroestriatal têm

importante papel na locomoção (CIVELLI; BUNZOW; GRANDY, l993).

Um resumo do sistema dopaminérgico, no que se refere à localização dos receptores e

o sistema de segundo mensageiros envolvidos é apresentado no Quadro 2.

37

Quadro 2: Localização, no SNC, dos receptores dopaminérgicos e segundos mensageiros

SUBTIPOS DE RECEPTORES

LOCALIZAÇÃO NO SNC

SEGUNDOS MENSAGEIROS

D1

corpo estriado núcleo accumbens

↑↑↑↑ AMPc

D2

corpo estriado núcleo accumbens substância nigra área tegmentar ventral hipocampo

↓↓↓↓ AMPc

D3

substância nigra área tegumentar ventral núcleo accumbens hipocampo

?

D4

córtex frontal hipocampo e cerebelo

?

D5

Hipocampo núcleo parafascicular do tálamo

↑↑↑↑ AMPc

Fonte: CIVELLI et al.,1991; CHEN; WEISS, 1991; SOKOLOFF et al., 1995.

Abreviaturas: (↑) aumenta ou (↓) diminui o nível do segundo mensageiro.

1.6 Sistema serotonérgico

Desde a sua descoberta há mais de 50 anos, a serotonina tem provado ser um dos

maiores neuromediadores centrais, tanto do ponto de vista filogenético como ontogenético.

Seu papel como neurotransmissor foi demonstrado em uma grande variedade de invertebrados

e vertebrados, enquanto as funções morfogenéticas da serotonina surgem muito cedo durante

o desenvolvimento cerebral. Além disso, a serotonina não é restrita ao sistema nervoso

central (LAUDER; KREBS, 1978).

38

Os neurônios serotonérgicos têm um papel importante na inervação entérica, e a

serotonina pode ser estocada e liberada dos assim chamados paraneurônios e plaquetas

sangüíneas. A profusa distribuição dos terminais contendo serotonina contrasta com a

limitada e discreta localização de suas células corporais correspondentes, localizadas

principalmente nos núcleos da rafe. Esta ampla distribuição da inervação serotonérgica

explica a variedade de funções nas quais a serotonina está envolvida, incluindo o ciclo sono-

vigília, controle do humor, controle sexual e alimentar, termoregulação, controle da dor etc.

Além do mais, disfunções serotonérgicas foram reportadas em numerosos processos

neuropatológicos tais como desordens do sono, ansiedade e depressão, agressividade, bulimia

e anorexia, tanto quanto nas condições neurodegenerativas incluindo as doenças de

Alzheimer, Parkinson e Huntington (VERGÉ; CALAS, 2000).

Os neurônios contendo serotonina originam-se no mesencefálo no núcleo da rafe e

inervam a substância negra e a área tegmentar ventral. Estudos neuroanatômicos mostram

uma alta densidade de fibras serotonérgicas imunoreativas na substância negra “pars

compacta”, “pars reticulata” e área tegmentar ventral (HERVÉ et al., 1987; MOUKHLES et

al., 1997). Interessantemente, o tegmento ventral mesencefálico incluindo a substância negra

contém altas concentrações de serotonina, e ambas, substância negra “pars compacta” e

“reticulata”, recebem uma densa contribuição serotonérgica, a qual é maior na substância

negra reticulata (9x106 varicosidade/mm3) que na pars compacta (6x106 varicosidade/mm3)

(MOUKHLES et al., 1997).

Áreas terminais de substância negra pars compacta e área tegmentar ventral, tais

como o estriado ou o núcleo accumbens, recebem uma contribuição de neurônios

serotonérgicos originados no núcleo da rafe (AZMITIA; SEGAL, 1978) (Figura 4). Vários

subtipos de receptores serotonérgicos estão presentes nos gânglios basais. Uma alta densidade

de receptores 5-HT1B foram encontrados na substância negra, área tegmentar ventral, “globus

pallidus” e núcleo entopenducular (PAZOS; PALACIOS, 1985a; BARNES; SHARP, 1999).

Em contraste, locais de ligação dos receptore 5-HT1A e RNAm codificando o receptor 5-HT1A

são detectados nos gânglios basais (BARNES; SHARP, 1999). Por outro lado, de alto a

moderado níveis de receptores 5-HT2A e 5-HT2C e o RNAm correspondente estão presentes

em várias áreas do prosencéfalo incluindo o gânglio basal e o sistema límbico.

O entendimento da função da neurotransmissão dentro de áreas do sistema

nervoso onde ela tem sido localizada também requer a identificação do seu alvo e os

mecanismos de transduções associados aos receptores. A história dos receptores

serotonérgicos começou com o trabalho de Gaddum e Picarelli (1957) que definiu dois

39

subtipos de receptores 5-HT, chamados D e M baseado no bloqueio destes receptores pela

dibenzilina ou morfina, respectivamente. O desenvolvimento de ensaios de binding usando

radioligante e a progressiva disponibilidade de ligantes seletivos, tornou possível a

caracterização de vários subtipos de receptores, enquanto a sua distribuição cerebral é

estudada usando autoradiografia quantitativa. Mais recentemente, um grande número de gens

codificando subtipos de receptores 5-HT foram identificados (HOYER; MARTIN, 1997). A

disponibilidade do número crescente de anticorpos específicos (VERGÉ; HARMON, 1997)

possibilitou o estudo da localização dos receptores 5-HT em níveis celular e subcelular.

Figura 4: Vias da 5-hidroxitriptamina (serotonérgicas) no cérebro.


1.6.1 Localização dos receptores serotonérgicos

Estudos de autoradiografia usando radioligantes seletivos demonstraram que os locais

de ligação de cada subtipo de receptor mostram uma particular distribuição regional no

cérebro e os estudos imunocitoquímicos geralmente confirmam estes dados. Desta forma os

receptores 5-HT1A estão principalmente localizados nas estruturas límbicas: o hipocampo,

córtex, septum, amígdala e núcleus da rafe e a projeção dorsal da coluna espinhal

40

(MARCINKIEWICZ et al., 1984; PAZOS; PALACIOS, 1985b; KIA et al., 1996). Os

receptores 5-HT1B estão localizados predominantemente nas áreas extrapiramidais tais como a

substância negra, globus pallidus e com menor densidade no estriado (PAZOS; PALACIOS,

1985a; PAZOS et al., 1985b; VERGÉ et al., 1986; SARI et al., 1997). Os receptores 5-HT1D,

os quais estão intimamente relacionados com os receptores 5-HT1B, são menos abundantes e

localizam-se nas mesmas áreas. De qualquer modo, o RNAm do receptor 5-HT1D foi

encontrado em alta densidade com respeito aos receptores 5-HT1B no nucleos trigêmeo de

cobaio e humano (REBECK et al., 1994; BOUCHELET et al.,1996), sugerindo o

envolvimento preferencial deste subtipo de receptor no efeito inibitório do sumatriptano na

inflamação neurogênica. Os receptores 5-HT1E e 5-HT1F são menos abundantes e os mais

pobremente caracterizados. O primeiro subtipo foi encontrado nas áreas corticais, estriado e

amígdala de cérebros de roedores e primatas (BRUINVELS et al., 1994). No cérebro de

cobaio, o RNAm e locais de ligação para os receptores 5-HT1F foram detectados no córtex,

núcleo mamilar, núcleo talâmico e núcleo oculomotor (MENGOD et al., 1996).

Locais de ligação para os receptores 5-HT2A, formalmente denominados de 5-HT2, são

particularmente abundantes no claustrum, tubérculo olfatório e córtex frontal (PAZOS et al.,

1985a). Estudos imunocitoquímicos recentes (HAMADA et al., 1998; WU et al., 1998;

CORNEA-HÉBERT et al., 1999) confirmaram esta localização. Os receptores 5-HT2C

(formalmente chamados de 5-HT1C) são altamente expressos no plexo coróide (PAZOS;

PALACIOS, 1985b), e estão também presentes em muitas estruturas cerebrais, tais com o

núcleo olfatório anterior, córtex piriforme, nucleus accumbens, estriado ventral, núcleo

talâmico e amigdalóide, substância negra (MENGOD et al., 1996).

Os locais de ligação do receptor 5-HT3 estão principalmente localizados em um

número limitado de estruturas medulares: o núcleo do trato solitário, o núcleo dorsal do nervo

vago e o núcleo do trato espinhal do nervo trigêmeo, e a projeção dorsal da coluna espinhal

(KILPATRICK et al., 1988; LAPORTE et al., 1992). Locais de baixa densidade foram

encontrados no hipocampo, amígdala e cortex entorinal (LAPORTE et al., 1992).

Investigações iniciais imunocitoquímicas indicaram uma enorme distribuição do receptor 5-

HT3, notavelmente no córtex e núcleo olfatório anterior (MORALES et al., 1996, 1998). Os

locais de ligação e o RNAm do receptor 5-HT4 foram encontrados em várias áreas cerebrais: o

sistema olfatório, estriado, córtex, septum, hipocampo, amígdala, hipotálamo dorsal,

substância negra e núcleo interpeduncular (WAEBER et al., 1994; VILARÓ et al., 1996). Os

receptores 5-HT5 são pobremente caracterizados. Tem sido sugerido que este subtipo de

receptor está localizado principalmente nos astrócitos (CARSON et al., 1996). Estudos com

41

camundongos knock-out para os receptores 5-HT5A, usando autoradiografia e 125I-LSD na

presença de clozapina e espiperona indicaram uma restrita localização de locais de ligação dos

receptores 5-HT5A no bulbo olfatório e neocortex, embora os locais de ligação do receptor 5-

HT5B fossem encontrados no dorsomedial do tálamo (WAEBER et al., 1998). Os receptores

5-HT6, os quais não puderam ser estudados usando ligantes seletivos, foram localizados no

tubérculo olfatório, córtex, estriado, núcleo accumbens e hipocampo, usando hibridização

localizada (RUAT et al., 1993) e imunocitoquímica (GÉRARD et al., 1997). Na ausência de

um radioligante seletivo, os locais de ligação dos receptores 5-HT7 foram estudados usando

diferentes radioligantes com coquetéis de drogas apropriadas. Estruturas fortemente marcadas

incluíram o cortex, hipocampo e o núcleo talâmico, hipotalâmico e amigdalóide (WAEBER;

MOSKOWITZ, 1995; GUSTAFSON et al., 1996).

1.7 Sistema noradrenérgico

Os corpos celulares de neurônios noradrenérgicos são encontrados exclusivamente na

ponte e bulbo, formando uma variedade de grupos distintos (COOPER et al., 1991). Esses

grupos de neurônios são bastante pequenos e enviam axônios extensamente ramificados para

muitas outras partes do cérebro, incluindo córtex cerebral, sistema límbico, hipotálamo,

cerebelo e medula espinhal. O grupo mais proeminente de neurônios noradrenérgicos

localiza-se no locus coeruleus (EL-ETRI et al., 1993).

Quando a NA é aplicada diretamente em células individuais no cérebro, o efeito mais

freqüentemente observado é inibitório, sendo, na maioria das vezes, produzido pela ativação

dos β-adrenoreceptores. A ativação da adenilato-ciclase, com o acúmulo resultante de AMPc

parece explicar o mecanismo de ação de vários tipos de neurônios do sistema nervoso central.

Por outro lado, a NA tem um efeito excitatório, mediado tanto por α quanto por β-

adrenoreceptores. Existe, no entanto, um grande abismo entre os mecanismos neuronais e as

respostas comportamentais e fisiológicas mediadas pelos neurônios noradrenérgicos e estudos

estão sendo realizados com o propósito de esclarecê-lo (COOPER et al., 1991).

Várias pesquisas realizadas com diferentes modelos de convulsão indicam a

participação do sistema noradrenérgico na epilepsia do lobo temporal em humanos

(CAVALHEIRO et al., 1994; EL-ETRI et al., 1983; SHIPLEY et al., 1999). O sistema

noradrenérgico tem como neurotransmissor a NA, um importante neurotransmissor

excitatório e inibitório (COOPER et al., 1991). As mais importantes funções comportamentais

42

mediadas pelo sistema noradrenérgico são: sistema de recompensa e humor, estado de vigília,

pressão sanguínea e regulação neuroendócrina (ATTWELL et al., 1993).

Forray et al. (1995), levantaram a hipótese de que muitos dos distúrbios afetivos são

ocasionados por um funcionamento inadequado do sistema noradrenérgico, por exemplo, a

depressão seria resultante de uma deficiência funcional de noradrenalina em determinadas

partes do cérebro, enquanto a mania seria produzida pelo excesso deste neurotransmissor.

Os receptores noradrenérgicos são amplamente distribuídos em todo corpo e exercem

inúmeras funções vitais no cérebro e no sistema nervoso autônomo (FORRAY et al., 1995).

Através de técnicas de biologia molecular, foram identificados 5 subtipos de receptores

noradrenérgicos (α1, α2, β1, β2, e β3) (COOPER et al., 1991). Esses receptores encontram-se

distribuídos de forma diferenciada e divergem quanto ao mecanismo de ativação. O subtipo α1

transmite sinais através da mobilização de cálcio (Ca++) no SNC. Um determinado estímulo

faz com que o receptor ative uma enzima efetora, a fosfolipase C (PLC), através de uma

proteína G (ELGOYHEN et al., 2000). A PLC promove uma cascata de eventos, finalizando

com a produção de dois segundos mensageiros, o inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e 1,2-

diacilglicerol (DAG) que vão transmitir a informação do receptor para o interior da célula. Já

o subtipo α2 agem inibindo a enzima adenilil ciclase (AC) reduzindo os níveis de AMPc.

Por outro lado, os subtipos β1, β2, e β3 agem por estimulação da adenilil ciclase (AC),

aumentando os níveis de AMPc. O Quadro 3 sumariza as informações sobre localização dos

receptores e o sistema de segundos mensageiros envolvidos sobre os receptores

noradrenérgicos.

43

Quadro 3: Localização dos receptores noradrenérgicos e segundos mensageiros

SUBTIPOS DE RECEPTORES

LOCALIZAÇÃO

SEGUNDOS

MENSAGEIROS

α1

Vasos sanguíneos, Brônquios

Útero/TGI/Fígado

Glândula salivar

IP3 + DAG

α2

Vasos sanguíneos e Plaquetas

Terminações adrenérgicas e

colinérgicas

↓ AMPc

β3

Coração e Glândula salivar

Terminações adrenérgicas

↑ AMPc

β2

Vasos sanguíneos

Brônquios/Bexiga/Útero

Musculatura esquelética

Fígado e Mastócitos

↑ AMPc

β3

Tecido adiposo ↑ AMPc

Fonte: COOPER; BLOOM; ROTH, 1991.

Abreviaturas: TGI: Tratogastrointestinal, (↑): alta densidade; (↓): baixa densidade; IP3: trifosfato de

inositol; DAG: diacilglicerol; AMPc: adenosina monofosfato cíclico;

1.8 Áreas cerebrais (corpo estriado)

Os núcleos da base estão envolvidos com o controle motor, planejamento e a execução

de estratégias motoras complexas e também participam dos comportamentos não relacionados

aos movimentos, tais como: função afetiva, humor e pensamento (CÔTÉ; CRUTCHER,

1991). Estes núcleos consistem em vários núcleos subcorticais interconectados com projeções

para o córtex, tálamo e certos núcleos do tronco encefálico. Eles recebem impulsos de entrada

principalmente do córtex cerebral e tálamo e mandam impulsos de saída de volta para o córtex

44

e para o tronco encefálico. Desta forma, os núcleos da base são os principais componentes de

um amplo circuito cortical-subcortical ligando o córtex e o tálamo (DELONG, 2000).

O núcleo da base possui grande papel nos movimentos voluntários normais. Esta

região também está envolvida na produção das desordens do movimento. Estudos postmortem

de pacientes com doença de Parkinson e de Huntington revelaram alterações nesta área

cerebral. Essas doenças têm três tipos de distúrbios motores: tremor e outros movimentos

involuntários, alterações na postura e tônus muscular e finalmente, pobreza e lentidão dos

movimentos sem paralisia. Desta forma distúrbios nos gânglios da base podem resultar tanto

na redução do movimento, como a que ocorre na doença de Parkinson, movimento excessivo,

aquele observado na doença de Huntington. Além destas desordens do movimento, lesões nos

núcleos da base estão associadas com distúrbios neuropsiquiátricos cognitivos

comportamentais, refletindo o importante papel destes núcleos em diversas funções do lobo

frontal (DELONG, 2000).

Os quatro núcleos da base principais são: o corpo estriado, o globo pálido, a substância

nigra (pars reticulata e pars compacta) e núcleos subtalâmicos. O corpo estriado consiste de

três importantes subdivisões: o núcleo caudado, o putamen e o estriado ventral (o qual inclui o

núcleo accumbens) (DELONG, 2000).

Dentro dos núcleos da base o corpo estriado é o principal recebedor de impulsos de

entrada provenientes do córtex cerebral, tálamo e tronco encefálico. Seus neurônios se

projetam para o globo pálido e substância nigra. Todas as áreas do córtex mandam projeções

glutamatérgicas excitatórias para porções específicas do corpo estriado. Esta área também

recebe projeções dopaminérgicas do mesencéfalo e impulsos de entrada serotonérgicos dos

núcleos da rafe (DELONG, 2000).

Embora o corpo estriado contenha vários tipos celulares distintos, 90 a 95 % destas

são projeções de neurônios GABAérgicos espinhais de tamanho médio. Estes neurônios dão

origem a quase todos os impulsos de saída estriatais, como para o globo pálido e a substância

nigra, e são o principal alvo de impulsos de entrada excitatórios provenientes do córtex e

tálamo, de fibras dopaminérgicas originárias da substância nigra e área tegmentar ventral, de

axônios locais colaterais de outros neurônios espinhais, e de interneurônios estriatais

(GERFEN, 1992).

O corpo estriado também contém dois tipos de interneurônios inibitórios:

interneurônios colinérgicos grandes e células menores que contém somatostatina,

neuropeptídio Y ou óxido nítrico sintetase (NOs), que embora pequenos em número, são

responsáveis pela maioria da atividade tônica do corpo estriado. A neurotransmissão mediada

45

por receptores glutamatérgicos excitatórios do tipo AMPA e pelo neurotransmissor inibitório

GABA é considerado como sendo de uma natureza neurotransmissora rápida, enquanto os

interneurônios colinérgicos, as projeções dopaminérgicas e os aferentes excitatórios dos

receptores NMDA estão envolvidos em ações modulatórias nesta área cerebral (DI CHIARA;

MORELI; CONSOLO, 1994).

Os neurônios colinérgicos têm um papel central no controle da atividade estriatal via

receptores muscarínicos (BERNARD et al., 1993). Portanto, a interação entre impulsos de

entrada dopaminérgicos, GABAérgicos e glutamatérgicos representam um importante aspecto

da regulação funcional do núcleo accumbens.

1.9 Relevância e justificativa

Nos últimos 10 anos, os avanços da neurociência básica, graças à biologia celular, à

biologia molecular e às técnicas de imagem, têm trazido contribuições crescentes para a

melhor compreensão da fisiopatologia das doenças do sistema nervoso. Com isso,

especialmente no que diz respeito à psicofarmacologia, a possibilidade de desenvolver novos

medicamentos, especificamente para atuar em alvos selecionados, vem se tornando um

objetivo constante. Na era pós-genômica, repleta de perspectivas e novos desafios, vemo-nos

diante de uma diversidade de possibilidades e de uma mudança no modo de pensar e enxergar

o funcionamento do cérebro. A utilização dos novos conhecimentos vem, gradativamente,

contribuindo para o desenvolvimento de novas intervenções terapêuticas. Ainda, a

farmacogenômica e a farmacogenética acenam com a possibilidade concreta de

individualização do tratamento farmacológico (KAPCZINSKI; QUEVEDO; IZQUIERDO,

2004; TENG; HUMES; DEMETRIO, 2005).

Vários sistemas neurotransmissores e suas vias metabólicas têm sido elucidados,

incluindo o glutamato, o GABA, a serotonina, a noradrenalina e a dopamina, assim como as

cascatas de sinalização intracelular, que modulam a função de canais iônicos, receptores,

transcrição gênica e síntese de proteínas. Esses conhecimentos têm contribuído para que as

classes de drogas se tornem menos inespecíficas, de maneira que os mesmos medicamentos

possam ser utilizados no tratamento de condições clínicas distintas e bem-definidas

(KAPCZINSKI; QUEVEDO; IZQUIERDO, 2004).

A comunidade científica tem insistentemente buscado obter de fontes naturais,

substâncias que atuem em diversas patologias do SNC tais como: ansiedade, depressão,

epilepsia, esquizofrenia e outros. Inúmeros são os estudos que confirmam a ação

46

farmacológica de uma variedade de plantas e de seus princípios ativos. Os usos das plantas

medicinais e suas virtudes terapêuticas foram acumulados durante séculos, e muito desse

conhecimento empírico se encontra disponível atualmente. O conhecimento sobre plantas

medicinais representou e ainda representa o único recurso terapêutico de muitas comunidades

e grupos étnicos (DI STASI, 1996).

Durante a última parte do século XX a prática da Fitoterapia tornou-se difundida por

todo mundo. Isto é suficiente, em parte, para o reconhecimento do valor do sistema de

medicina tradicional e a identificação de plantas medicinais; que têm mostrado um

significativo poder de cura no seu estado natural ou como fonte de novos agentes

farmacológicos (ELVIN LEWIS, 2001).

O Laboratório de Neurofarmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia

da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará (UFC) há muitos anos vem

investindo em pesquisas com o objetivo de descobrir novas substâncias, oriundas de plantas

medicinais, com potencial farmacológico; especialmente aquelas que atuam no sistema

nervoso central. Considerando que o Eugenol possui atividade antidepressiva,

anticonvulsivante e antioxidante, decidiu-se avaliar as alterações neurocomportamentais e

neuroquímicas do desidrodieugenol (DDE), um derivado sintético do eugenol, em modelos

animais de depressão, convulsão, ansiedade e avaliando, ainda, as possíveis alterações nos

níveis de neurotransmissores e seus metabólitos em áreas cerebrais específicas, como o corpo

estriado, em camundongos.

47

2 OBJETIVOS

2.1 Geral

Avaliar os efeitos farmacológicos do desidrodieugenol (DDE) no sistema nervoso

central, através do estudo das alterações neurocomportamentais e neuroquímicas produzidas

em corpo estriado de camundongos.

2.2 Específicos

- Estudar as alterações neurocomportamentais nos seguintes modelos experimentais:

ℵ Estudar a atividade antidepressiva nos testes do nado forçado e suspensão da cauda;

ℵ Verificar a atividade exploratória no teste do campo aberto;

ℵ Estudar o potencial sedativo no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital;

ℵ Avaliar o efeito relaxante muscular (periférico) no teste do rota rod;

ℵ Verificar o efeito no teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol;

ℵ Estudar o efeito ansiolítico nos testes do labirinto em cruz elevado (plus maze),

claro/escuro e placa perfurada (hole board).

- Investigar a possível interação do DDE com o sistema dopaminérgico, noradrenérgico e

serotonérgico, através da utilização de ensaios com agonistas e antagonistas específicos no

modelo do nado forçado.

- Estudar as alterações neuroquímicas produzidas em corpo estriado de camundongos

através de:

Determinação dos níveis das monoaminas noradrenalina (NA), dopamina (DA) e

serotonina (5-HT) e seus metabólitos DOPAC, HVA e 5-HIAA.

48

3 MATERIAIS

3.1 Equipamentos e materiais

ℵ Agitador de tubos (Modelo 251, FANEN®, SP, Brazil)

ℵ Balança analítica (Modelo H5, Mettler®, Suíça)

ℵ Balança para animais (mod. MF-6, Filizola®, Brazil)

ℵ Bomba para HPLC (LC-10AD Shimadzu Corp, Japan)

ℵ Caixa claro/escuro (acrílico)

ℵ Campo aberto (caixa de acrílico)

ℵ Centrífuga refrigerada (Eppendorf)

ℵ Cuba (acrílico)

ℵ Degaseificador (DGU-2A Shimadzu® Corp., Japan)

ℵ Detector de fluorescência (RF-535 Shimadzu® Corp., Japan)

ℵ Equipamento de Millipore para filtração a vácuo (Millipore Apparatus, Bedford®, MA,

USA)

ℵ Estufa para secagem (Modelo 315 SE FANEM®, SP, Brasil)

ℵ Frascos de vidro (vials) para contagem de cintilação (Beckman, Fullerton, Ca, USA)

ℵ Freezer -70 ºC (Modelo ULT 2586-3D14, Revco Scientific, Inc. Asheville, N.C.,USA)

ℵ Guilhotina (Harvard, USA)

ℵ Homogeneizadores manuais (Bellico, USA)

ℵ Labirinto em cruz elevado (acrílico)

ℵ Medidor de pH (Modelo B374, Micronal®, SP, Brasil)

ℵ Micropipetas (H.E., Pedersen, Dinamarca)

ℵ Programa de computação para integração de picos (Shimadzu® Corp., Japan)

ℵ Rota Rod (Ugo Basile®, Italy)

ℵ Seringas plásticas (BD Plastipak)

ℵ Sonicador (Modelo PT 10-35. Brinkmann Instruments Inc. NY, USA)

ℵ Vidrarias (Pirex®, U.S.A.)

49

3.2 Reagentes e drogas

ℵ Água destilada (deionizador)

ℵ Álcool etílico P.A. (Quimex®, Brasil)

ℵ Bupropiona (Sigma®, USA)

ℵ Diazepam (Sigma®, USA)

ℵ Imipramina (Imipra®, Cristália)

ℵ Ioimbina (Sigma®, USA)

ℵ p-clorofenilalanina (PCPA) (Sigma®, USA)

ℵ Pentilenotetrazol (Sigma®, USA)

ℵ Pentobarbital sódico (Sigma®, USA)

ℵ Prazosin (Sigma®, USA)

ℵ SCH23390 (Sigma®, USA)

ℵ Sulpirida (Sigma®, USA)

ℵ Tween 80 – Polyoxyethilene Sorbitan Mono-oleate (Sigma®, USA)

ℵ Fluoxetina (Sigma®, USA)

ℵ Flumazenil (Sigma®, USA)

3.3 Animais experimentais

Camundongos albinos (Mus musculus) variedade Swiss Webster, adultos, do sexo

masculino, pesando entre 25-30g, provenientes do Biotério do Departamento de Fisiologia e

Farmacologia e do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, foram mantidos em

caixas de propileno em temperatura constante de 26 ± 2 ºC, com ciclos claro/escuro de 12 em

12 horas, recebendo ração padrão (Purina Chow®) e água “ad libitum” .

Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Animal (CEPA) desta Universidade, sob o protocolo nº 79/07 de 25 de junho de 2008, e está

de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal adotados pelo Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

50

4 MÉTODOS

4.1 Preparo da droga

O desidrodieugenol, bis-eugenol ou dimethoxymagnolol (DDE), classe química das

Neolignanas, foi fornecido pelo Prof. Dr. José Maria Barbosa Filho da Universidade Federal

da Paraíba (UFPB). Foi obtido por síntese química a partir do Eugenol extraído da Nectandra

polita (Lauraceae). Apresenta-se como um pó de cor marfim, em forma de cristais que são

solúveis em água após uso de Cremofor, DMSO ou Tween 80. (Fórmula: C20H22O4) e peso

molecular de 326 g/mol.

Para a realização dos tratamentos dos animais, o DDE foi emulsificado com Tween 80

a 5% e dissolvido em água deionizada, obtendo-se as concentrações finais de 1; 2,5 e 5

mg/mL para serem administradas nas doses de 10, 25 e 50 mg/kg por via intraperitoneal

(i.p.).

4.2 Tratamento dos grupos experimentais

Os animais foram tratados, de forma aguda, com DDE por via intraperitoneal (i.p.) 30

minutos antes da realização dos testes neurocomportamentais. Os animais do grupo controle

foram tratados com solução de Tween 80 a 5 % em água deionizada, a qual foi utilizada como

veículo. As drogas utilizadas ao longo dos experimentos tais como, diazepam (1 e 2 mg/kg),

imipramina (10 e 30 mg/kg), bupropiona (10 e 30 mg/kg), fluoxetina (35 mg/kg),

pentobarbital sódico (40 mg/kg), pentilenotetrazol (100 mg/kg), flumazenil (2,5 mg/kg),

Bis-eugenol

K3Fe (CN)6

NH4OH (25%)

Figura 5. Síntese do desidrodieugenol ou bis-eugenol (DDE) a partir do Eugenol

51

SCH23390 (15 µg/kg), sulpirida (50 mg/kg), prazosin (1 mg/kg), ioimbina (1 mg/kg) e p-

clorofenilalanina (PCPA 100 mg/kg) foram dissolvidas e diluídas diretamente em água

deionizada. O volume total de solução administrada em cada animal foi de 10 mL/kg.

Todos os testes comportamentais foram realizados em uma sala fechada, com

temperatura controlada (23 ± 1ºC), iluminação de pouca intensidade (lâmpada vermelha de 15

W) e ruídos atenuados; dessa forma, procurou-se promover a adaptação dos animais ao

ambiente experimental. Em todos os testes, com exceção apenas do nado forçado e suspensão

da cauda, após a observação de cada animal, foi utilizado álcool 10% para a remoção de

resíduos e odores dos animais.

Após a realização dos testes comportamentais, os animais foram sacrificados por

deslocamento cervical, seus cérebros removidos e os corpos estriados dissecados sobre gelo,

para a dosagem de monoaminas e seus metabólitos utilizando-se o HPLC.

4.3 Modelos experimentais (neurocomportamentais)

4.3.1 Teste do Nado Forçado

O teste do nado forçado (PORSOLT et al., 1977), incluiu uma exposição dos animais,

em uma cuba de acrílico com água transparente de 40 cm de altura por 18 cm de diâmetro

contendo 15 cm de água fresca a 24 ± 1 °C. Após 30 minutos do tratamento com DDE (10, 25

e 50 mg/kg; i.p.), os animais foram colocados na cuba e observados por 5 minutos. Durante

este período, foi verificado o tempo em que o animal permaneceu imóvel. O camundongo foi

considerado imóvel quando permaneceu flutuando, fazendo apenas pequenos movimentos

necessários para manter a cabeça fora d’água. Neste modelo um grupo de animais recebeu

imipramina (IMI-10 mg/kg, i.p.) como controle positivo.

Posteriormente, com o objetivo de investigar o mecanismo de ação antidepressivo do

DDE, verificou-se a possível atuação do DDE sobre os sistemas dopaminérgico, serotonérgico

e noradrenérgico.

- Ação de DDE sobre o sistema dopaminérgico:

Diferentes grupos foram pré-tratados com sulpirida (SULP-50 mg/kg, i.p.) ou SCH

23390 (SCH-15 µg/kg, s.c.) 15 minutos antes da administração de DDE (10 e 50 mg/kg, i.p.),

veículo (água deionizada + 5% Tween 80, i.p.) ou bupropiona (BUP-10 e 30 mg/kg, i.p.).

Após 30 minutos da administração de DDE, bupropiona ou veículo, os animais foram

52

colocados no cilindro com água onde o tempo de imobilidade, durante um período de 5

minutos, foi avaliado.

- Ação do DDE sobre o sistema serotonérgico:

Diferentes grupos foram tratados com PCPA (100 mg/kg, i.p.) durante 4 dias

consecutivos e, no 4º dia, os animais foram pré-tratados com PCPA, 15 minutos antes do

tratamento com DDE (10 e 50 mg/kg, i.p.), veículo (água deionizada + 5% Tween 80, i.p.) ou

fluoxetina (FLX-35 mg/kg, i.p.). Após 30 minutos da administração de DDE, fluoxetina ou

veículo, os animais foram colocados no cilindro com água onde o tempo de imobilidade,

durante um período de 5 minutos, foi avaliado.

- Ação do DDE sobre o sistema noradrenérgico:

Diferentes grupos de animais foram pré-tratados com prazosin (PZA-1 mg/kg, i.p.) ou

ioimbina (IOB-1 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes dos tratamentos com DDE (10 e 50 mg/kg,

i.p.) ou veículo (água deionizada + 5% Tween 80, i.p.). Após 30 minutos da administração de

DDE ou veículo, os animais foram colocados no cilindro com água onde o tempo de

imobilidade, durante um período de 5 minutos, foi avaliado.

4.3.2 Teste da Suspensão da Cauda

Após 30 minutos do tratamento dos animais com DDE (10, 25 e 50 mg/kg; i.p.), os

mesmos foram suspensos, presos cerca de 1 cm a partir da ponta da cauda, por uma fita

adesiva numa plataforma a 58 cm da bancada do experimento,. A duração da imobilidade foi

avaliada durante 6 minutos (STERU et al., 1985). A imipramina (IMI-30 mg/kg, i.p.) ou

bupropiona (BUP-30 mg/kg, i.p.) foram utilizadas como controle positivo a fim de observar a

confiabilidade do teste.

4.3.3 Teste de Campo Aberto

Um campo aberto feito em acrílico (paredes transparentes e piso preto, 30 x 30 x 15

cm) dividido em nove quadrados de áreas iguais, foi utilizado para avaliar a atividade

exploratória dos animais (ARCHER, 1973). Após 30 minutos da administração do DDE (10,

25 e 50 mg/kg; i.p.), cada animal foi colocado, um de cada vez, no centro do campo e foram

registrados o número de travessias; que é o ato do animal locomover-se com o tronco afastado

do chão por meio de movimentos coordenados das quatro patas, deslocando-se

horizontalmente sobre a base do campo aberto. A unidade de medida correspondeu ao número

53

de divisões da base do campo aberto nas quais o animal penetrou com as quatro patas. Os

números de comportamentos esteriotipados (rearing e grooming) foram registrados durante 5

minutos. Antes do início da observação, os animais permaneceram 1 minuto em adaptação ao

ambiente experimental no aparato.

Posteriormente, com a finalidade de avaliar se o mecanismo de ação do DDE, neste

modelo experimental, estava relacionado com a atuação do mesmo sobre o sistema

dopaminérgico, diferentes grupos foram pré-tratados com sulpirida (SULP-50 mg/kg, i.p.) ou

SCH 23390 (SCH-15 µg/kg, s.c.) 15 minutos antes da administração de DDE (50 mg/kg, i.p.),

veículo (água deionizada + 5% Tween 80, i.p.) ou bupropiona (BUP-10 e 30 mg/kg, i.p.).

Após 30 minutos da administração de DDE, bupropiona ou veículo, os animais foram

colocados no campo aberto onde o número de travessias, rearing e grooming, durante um

período de 5 minutos, foi avaliado.

4.3.4 Teste do Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital

Após 30 minutos dos tratamentos com DDE (25 e 50 mg/kg; i.p.), os animais

receberam pentobarbital sódico (40 mg/kg, i.p.) como agente indutor do sono de acordo com o

método de Dandiya & Collumbine (1959). O tempo desde a injeção do pentobarbital até o

animal perder o reflexo postural foi registrado como latência de sono e o tempo de latência

entre a perda e a recuperação voluntária do reflexo postural foi registrado como tempo total de

sono.

Iniciado o período de sono, em seus respectivos grupos, os animais foram

posicionados em decúbito dorsal em local de adequada observação e foi registrado o início do

sono de cada animal. Os animais foram observados durante todo o tempo de sono, sendo o

final deste marcado no momento em que o animal retornou à situação de alerta, caracterizada

pela alteração da posição de decúbito dorsal. O período total de observação foi de no máximo

120 minutos. Diazepam (DZP-2 mg/kg, i.p.) foi utilizado como controle positivo.

4.3.5 Teste do Rota Rod

Em relação ao teste do rota rod, após 30 minutos da administração do DDE (25 e 50

mg/kg; i.p.), os animais foram colocados com as quatro patas sobre uma barra de 2,5 cm de

diâmetro, elevado a 25 cm do piso, em uma rotação de 12 rpm. Para cada animal foi

registrado o tempo de permanência na barra (em segundos), nos tempos de 0 (antes), 1 e 2h

54

(depois) do tratamento dos animais com DDE. O período total de observação dos animais no

aparato foi de até 1 minuto (DUNHAM; MIYA, 1957). Diazepam (DZP-2 mg/kg, i.p.) foi

utilizado como controle positivo.

4.3.6 Teste das Convulsões induzidas por Pentilenotetrazol

Este experimento foi realizado seguindo a metodologia descrita por Swinyard e

colaboradores (1952), permite avaliar a possível ação anticonvulsivante da droga em teste.

Após 30 minutos do tratamento com DDE (25 e 50 mg/kg; i.p.), veículo ou diazepam (DZP-1

mg/kg, i.p.), todos os animais foram tratados com pentilenotetrazol (100 mg/kg, i.p.). Em

seguida, os camundongos foram colocados em gaiolas individuais e observados por até 20

minutos. O tempo de manifestação da primeira convulsão (em segundos) do tipo clônica ou

tônico-clônica (latência para 1ª convulsão) foi registrado.

4.3.7 Teste do Labirinto em Cruz Elevado (Plus Maze)

Cada animal, após 30 minutos do tratamento com DDE (25 e 50 mg/kg; i.p.) foi

colocado na plataforma central direcionado para um dos braços fechados como descrito por

Pellow et al. (1985). Durante 5 minutos, foram observados os seguintes parâmetros: número

de entradas nos braços abertos e fechados e o tempo de permanência do animal em cada um

desses braços. A percentagem do tempo de permanência em cada braço foi calculada

utilizando-se a razão do tempo em cada um dos braços e o tempo total de permanência em

ambos os braços. A percentagem do número de entradas foi calculada usando a razão entre o

número de entradas em cada um dos braços e o número total de entradas nos braços abertos e

fechados. Além dos grupos tratados com o DDE, um grupo foi tratado com diazepam (DZP-1

mg/kg, i.p.) como controle postivo. Os animais do grupo controle foram tratados com solução

de Tween 80 a 5%, o qual foi utilizado como veículo.

Com objetivo de avaliar se o mecanismo de ação do DDE, neste modelo experimental,

estava relacionado com a atuação do mesmo sobre o sistema gabaérgico, diferentes grupos

foram pré-tratados com flumazenil (FLU-2 mg/kg, i.p.) 15 minutos antes da administração de

DDE (50 mg/kg, i.p.), veículo (água deionizada + 5% Tween 80, i.p.) ou diazepam (DZP-1

mg/kg, i.p.). Após 30 minutos da administração de DDE, diazepam ou veículo, cada animal

foi colocado na plataforma central direcionado para um dos braços fechados; durante 5

minutos, foram observados os seguintes parâmetros: número de entradas nos braços abertos e

55

o tempo de permanência do animal nesses braços. Em seguida calculou-se suas respectivas

percentagens.

4.3.8 Teste do Claro/Escuro

O teste consiste na utilização de uma caixa de acrílico com uma divisão de cor branca

sob iluminação artificial (claro) e uma divisão de cor preta (escuro). Cada animal, após 30

minutos do tratamento com DDE (25 e 50 mg/kg; i.p.), foi colocado na divisão (claro) e

durante 5 minutos (cut-off) foi observada a latência para a entrada do animal na divisão

(escuro). Um grupo foi tratado com diazepam (DZP-1 mg/kg, i.p.) como controle postivo.

Drogas ansiolíticas aumentam a latência para entrada na divisão (escuro), ou seja, aumentam

o tempo de permanência dos animais na divisão (claro) (BHATTACHARYA; SATYAN,

1997).

4.3.9 Teste da Placa Perfurada (Hole board)

O método seguido foi o proposto por Clark e colaboradoes (1971). O aparato que foi

utilizado foi um Ugo Basile® de 60 x 30 cm com 16 buracos espaçados uniformemente com

sensores de infra-vermelho. O parâmetro analisado foi o número de head dips (número de

vezes em que o animal coloca a cabeça nos buracos) durante 5 minutos. Após 30 minutos do

tratamento com DDE (25 e 50 mg/kg; i.p.), os animais, um por vez, foram colocados na

plataforma. Um grupo foi tratado com diazepam (DZP-1 mg/kg, i.p.) como controle postivo.

A contagem do número de head dips foi realizada automaticamente através do sensor

localizado nos buracos e registrada no aparelho.

4.4 Dissecação das áreas cerebrais

Após 30 minutos do tratamento com DDE (10 e 50 mg/kg; i.p.), os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical, os encéfalos foram retirados e rapidamente colocados

sobre papel alumínio em uma placa de Petris sobre o gelo. Acompanhando a fissura sagital

mediana, a camada cortical cerebral foi rebatida das leptomeninges com o auxílio de uma

pinça reta de microdissecação, a qual, progredindo delicada e tangencialmente aos ventrículos

laterais, divulsionou o córtex em toda a sua extensão fronto-occipital. O córtex já

divulsionado foi rebatido para os lados, expondo parte do corpo estriado. Os corpos estriados

56

(caudado, putamen e núcleo acumbens) foram isolados das estruturas circunjacentes, por

divulsionamento, com uma tesoura de microdissecação, sendo a sua retirada orientada pelo

diâmetro da porção tuberosa visível desses núcleos, após o rebatimento lateral do córtex.

Após a retirada do corpo estriado (CE), o rebatimento do córtex, realizado inicialmente, foi

reconstituído juntamente com o contorno dos hemisférios cerebrais; o córtex foi direcionado

em sua posição inicial (ZILLES; REE, 1985).

Terminada a dissecação da área cerebral (corpo estriado), esta foi acondicionada em

papel alumínio devidamente identificada, pesada e conservada a -70 °C para uso posterior.

Quando se fez necessária a estocagem por um determinado período de tempo (no máximo 6

meses a -70 °C) os tecidos foram considerados como tendo a mesma viabilidade para

experimentação que os ensaiados imediatamente ou 24 h após a dissecação (BURKE

GREENBAUN, 1987; FIELDER; MARKS; COLLINS, 1987).

4.5 Estudo neuroquímico

4.5.1 Determinação de Monoaminas e Metabólitos com HPLC

A análise de monoaminas e seus metabólitos, em corpo estriado, foram realizadas

através da utilização de HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performace) com detecção

eletroquímica. O equipamento consistiu de um detector eletroquímico com eletrodo de

carbono vitreado, bomba e injetor. Para a análise de monoaminas, uma coluna Shimadzu®

CLC-ODS (M) foi utilizada. A fase móvel foi preparada com ácido cítrico (0,163 M), em um

pH 3,0 contendo 0,02 mM EDTA, com 0,69 mM de ácido octanesulfônico sódio (SOS), como

parte de reagentes iônicos, 4 % v/v acetonitrila e 1,7% v/v tetrahidrofurane. NA, DA,

DOPAC, 5-HT, 5-HIAA e HVA foram eletronicamente detectados usando um detector

amperométrico (Modelo L-ECD-6A; Shimadzu® Corp, Japan) por oxidação do eletrodo de

vidro de carbono de 0,85 V relativo para um eletrodo de referências Ag-AgCl. Os

cromatogramas foram registrados e quantificados por um integrador. A quantidade dos

neurotransmissores e seus metabólitos foram calculados por comparação da altura dos picos

com a média dos padrões (BURKE GREENBAUN, 1987; FIELDER; MARKS; COLLINS,

1987).

57

5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os testes de análise de variância (ANOVA) se apóiam na hipótese de que os grupos

são semelhantes e a variância em cada um (dentro) dos grupos é similar àquela entre os

grupos. Portanto, compara-se a variabilidade das médias de todas as amostras com a

variabilidade dentro das amostras, informando somente se há ou não diferença

estatisticamente significativa entre dois ou mais grupos (DORIA FILHO, 1999). Para

identificar os grupos, realizou-se uma comparação entre pares, ou seja, um teste de

comparações múltiplas.

Os dados experimentais foram expressos como média ± EPM e submetidos à análise

de variância (ANOVA), seguido do teste de Student Newman Keuls como teste post hoc. A

análise estatística dos dados foi realizada através de um computador Pentium IV utilizando o

programa GraphPad Instat tm., GraphPad software V2.05., Copyright (c) 1990-1994. Em

todas as análises estatísticas, foi considerado o nível crítico para rejeição da hipótese de

nulidade menor que 0,05 (p< 0,05).

58

6 RESULTADOS

6.1 Avaliação da atividade antidepressiva

6.1.1 Teste do Nado Forçado (Investigação do possível envolvimento do sistema

dopaminérgico nos efeitos centrais do DDE)

No teste do nado forçado, os animais tratados com DDE (via i.p.), apresentaram uma

redução no tempo de imobilidade nas doses de 10 mg/kg (97,67 ± 5,60s), 25 mg/kg (53,75 ±

4,46s) e 50 mg/kg (36,56 ± 3,05s) quando comparados ao grupo controle veículo (120,80 ±

8,77s) (Tabela 1 / Figura 6).

As drogas utilizadas como controles positivos (via i.p.), imipramina (10 mg/kg,),

bupropiona (10 mg/kg e 30 mg/kg.), também diminuíram o tempo de imobilidade (IMI-10:

31,00 ± 4,47s; BUP-10: 51,50 ± 5,07s; BUP-30: 53,38 ± 4,44s) em relação ao controle

veículo (Tabela 1 / Figura 6).

Os grupos pré-tratados com SCH 23390 ou sulpirida e tratados com veículo não

diminuíram o tempo de imobilidade (SCH-15 + veículo: 104,4 ± 3,87s; SULP-50 + veículo:

102,2 ± 3,63s) em relação ao controle veículo. Os grupos pré-tratados com SCH 23390 e

tratados com DDE 10 e 50 mg/kg (via i.p.) apresentaram um aumento no tempo de

imobilidade (SCH-15 + DDE-10: 119,60 ± 7,19s; SCH-15 + DDE-50: 93,29 ± 7,14s) em

relação aos grupos DDE 10 e 50 mg/kg (97,67 ± 5,60s; 36,56 ± 3,05s; respectivamente)

sozinhos; portanto, SCH 23390 reverteu o efeito antidepressivo do DDE neste modelo.

Os grupos pré-tratados com sulpirida e tratados com DDE 10 e 50 mg/kg (via i.p.)

apresentaram um aumento no tempo de imobilidade (SULP-50 + DDE-10: 122,20 ± 10,04s;

SULP-50 + DDE-50: 121,30 ± 7,76s), pois demonstraram uma diferença significativa em

relação aos grupos DDE 10 e 50 mg/kg sozinhos; portanto, sulpirida também reverteu o efeito

antidepressivo do DDE (Tabela 1 / Figura 6). O SCH 23390 reverteu o efeito da bupropiona

(SCH-15 + BUP-30: 101,60 ± 5,06s), assim como a sulpirida (SULP-50 + BUP-30: 105,10 ±

4,12s), pois ambos os grupos mostraram diferenças significativas quando comparados com o

grupo BUP-30 (53,38 ± 4,44s) sozinho.

59

Tabela 1. Efeito do DDE no teste do nado forçado (Investigação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico)

Tratamento Dose

(mg/kg, via)

Tempo de imobilidade (s)

Controle (veículo)

-----

120,80 ± 8,77

10

25

97,67 ± 5,60 a

53,75 ± 4,46 b

DDE

50 36,56 ± 3,05 b

IMI 10; i.p. 31,00 ± 4,47 b

BUP 10; i.p.

30; i.p.

51,50 ± 5,07 b

53,38 ± 4,44 b

SCH 23390 + veículo 15 µg/kg; s.c. 104,4 ± 3,87

SULP + veículo 50 102,2 ± 3,63

SCH + BUP 15 µg/kg, s.c. +

30 mg/kg, i.p.

101,60 ± 5,06 c

SCH + DDE 15 µg/kg, s.c. +

10 mg/kg, i.p.

119,60 ± 7,19 d

15 µg/kg, s.c. +

50 mg/kg, i.p.

93,29 ± 7,14 e

SULP + BUP 50 + 30 105,10 ± 4,12 c

SULP + DDE 50 + 10 122,20 ± 10,04 d

50 + 50 121,30 ± 7,76 e

a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,001 vs BUP 30 mg/kg; d p<0,05 vs DDE 10 mg/kg; e p<0,001 vs DDE 50 mg/kg (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

60

Figura 6. Efeito do DDE no teste do nado forçado

(Investigação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico): O DDE (10, 25 e 50 mg/kg), imipramina (IMI-

10 mg/kg) ou bupropiona (BUP-10 e 30 mg/kg), foram administrados 30 minutos antes da exposição dos animais ao

cilindro d`água. SCH ou SULP foram administrados 15 minutos antes da administração de veículo, BUP-30 ou

DDE-10 e 50. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao cilindro d`água e o tempo de imobilidade foi

registrado em segundos. Os valores foram expressos como média ± EPM. a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs

controle; c p<0,001 vs BUP 30 mg/kg; d p<0,05 vs DDE 10 mg/kg; e p<0,001 vs DDE 50 mg/kg. ANOVA e t-

Student Newman Keuls post hoc

0

20

40

60

80

100

120

140

Tem

po d

e im

obili

dade

(s)

e

a

Controle

10 25 50

DDE

30 50

BUP

10 10 30

BUP IMI DD

mg/kg

SCH

----

VEI

30 50

DDE

SULP

----

VEI BUP

10 10

e

b

b b

b b

c

d

c

d

61


serotonérgico nos efeitos centrais do DDE)

Neste modelo experimental, os animais tratados com DDE (i.p.), apresentaram uma

redução no tempo de imobilidade nas doses de 10 e 50 mg/kg (DDE-10: 62,60 ± 5,22s; DDE-

50: 52,57 ± 6,08s) quando comparados ao grupo controle veículo (DDE-50: 75,50 ± 5,60s)

(Tabela 2 / Figura 7).

A droga utilizada como controle positivo, fluoxetina (35 mg/kg), também diminuiu o

tempo de imobilidade (FLX-35: 45,57 ± 4,27s) em relação ao controle veículo (Tabela 2 /

Figura 7).

O grupo pré-tratado com PCPA e tratado com veículo não diminuiu o tempo de

imobilidade (PCPA-100 + veículo: 115,80 ± 5,83s) em relação ao controle veículo. Os grupos

pré-tratados com PCPA e tratados com DDE 10 e 50 mg/kg (via i.p.) apresentaram um

aumento no tempo de imobilidade (PCPA-100 + DDE-10: 97,20 ± 5,52s; PCPA-100 + DDE-

50: 105,10 ± 11,03s) em relação aos grupos DDE 10 e 50 mg/kg (DDE-10: 62,60 ± 5,22s;

DDE-50: 52,57 ± 6,08s) sozinhos; portanto, PCPA reverteu o efeito antidepressivo do DDE

neste modelo experimental (Tabela 2 / Figura 7).

O PCPA reverteu o efeito antidepressivo da fluoxetina (PCPA-100 + FLX-35: 117,30

± 4,74s), pois demonstrou diferença significativa quando comparado com o grupo (FLX-35:

45,57 ± 4,27s) sozinho (Tabela 2 / Figura 7).


noradrenérgico nos efeitos centrais do DDE)

Neste modelo experimental, os animais tratados com DDE (via i.p.), apresentaram

uma redução no tempo de imobilidade nas doses de 10 e 50 mg/kg (DDE-10: 62,60 ± 5,22s;

DDE-50: 58,63 ± 3,16s) quando comparados ao grupo controle veículo (DDE-50: 86,88 ±

3,78s) (Tabela 3 / Figura 8).

Os grupos pré-tratados com prazosina ou ioimbina e tratados com veículo não

alteraram o tempo de imobilidade (PZA-1 + veículo: 98,56 ± 3,41s; IOB-1 + veículo: 99,78 ±

3,04s) em relação ao controle veículo. Os grupos pré-tratados com PZA e tratados com DDE

10 e 50 mg/kg (via i.p.) não apresentaram alterações significativas no tempo de imobilidade

62

(PZA-1 + DDE-10: 55,40 ± 4,66s; PZA-1 + DDE-50: 51,14 ± 8,37s) em relação aos grupos

DDE 10 e 50 mg/kg (DDE-10: 62,60 ± 5,22s; DDE-50: 58,63 ± 3,16s) sozinhos. Os grupos

pré-tratados com ioimbina e tratados com DDE 10 e 50 mg/kg (via i.p.) apresentaram um

aumento do tempo de imobilidade apenas na dose de 50 mg/kg (IOB-1 + DDE-50: 119,20 ±

7,27s), pois demonstrou uma diferença significativa em relação ao grupo DDE 50 mg/kg

sozinho neste modelo experimental (Tabela 3 / Figura 8).

Tabela 2. Efeito do DDE no teste do nado forçado (Investigação do possível envolvimento do sistema serotonérgico)

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)


Controle (veículo)

-----

75,50 ± 5,60

DDE 10 62,60 ± 5,22 a

50 52,57 ± 6,08 a

FLX 35 45,57 ± 4,27 a

PCPA + veículo 100 115,80 ± 5,83

PCPA + DDE 100 + 10 97,20 ± 5,52 b

100 + 50 105,10 ± 11,03 c

PCPA + FLX 100 + 35 117,30 ± 4,74 d

a p<0,05 vs controle; b p<0,01 vs DDE 10 mg/kg; c p<0,001 vs DDE 50 mg/kg;

d p<0,001 vs FLX 35 mg/kg

(ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

63


(Investigação do possível envolvimento do sistema serotonérgico). O DDE ou fluoxetina (FLX),

nas doses estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição dos animais ao cilindro

d`água. PCPA foi administrado durante 4 dias consecutivos. No quarto dia, PCPA foi

administrado 15 minutos antes da administração de veículo, DDE-10 e 50 mg/kg ou FLX-35.

Após 30 minutos, os animais foram expostos ao cilindro d`água e o tempo de imobilidade foi

registrado em segundos. Os valores foram expressos como média ± EPM. a p<0,05 vs controle; b

p<0,01 vs DDE 10 mg/kg; c p<0,001 vs DDE 50 mg/kg; d p<0,001 vs FLX-35 mg/kg (ANOVA e

t-Student Newman Keuls post hoc).

Controle

---- 50 35

PCPA

10

DDE

35

FLX DDE FLX

mg/kg

d

VEI

0

20

40

60

80

100

120

140

Tem

po d

e im

obili

dade

(s)

50 10

a a

a

b

c

64

Tabela 3. Efeito do DDE no teste do nado forçado (Investigação do possível envolvimento do sistema noradrenérgico)

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)


Controle (veículo)

-----

86,88 ± 3,78

DDE 10 62,60 ± 5,22*

50 58,63 ± 3,16 **

PZA + veículo 1 98,56 ± 3,41

PZA + DDE 1 + 10 55,40 ± 4,66

1 + 50 51,14 ± 8,37

IOB + veículo 1 99,78 ± 3,04

IOB + DDE 1 + 10 81,00 ± 7,77

1 + 50 119,20 ± 7,27***

* p<0,05 vs controle; ** p<0,001 vs controle; *** p<0,05 vs DDE 50 mg/kg

(ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

65


(Investigação do possível envolvimento do sistema noradrenérgico). O DDE ou veículo foram

administrados 30 minutos antes da exposição dos animais ao cilindro d`água. Prazosin (PZA) ou

Ioimbina (IOB) foram administrados 15 minutos antes da administração de veículo ou DDE-10 e

50 mg/kg. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao cilindro d`água e o tempo de

imobilidade foi registrado em segundos. Os valores foram expressos como média ± EPM. * p<0,05

vs controle; ** p<0,001 vs controle; *** p<0,05 vs DDE 50 mg/kg (ANOVA e t-Student Newman

Keuls post hoc)

***

Controle

---- 50

PZA

50

DDE DDE

mg/kg

VEI

0

20

40

60

80

100

120

140

Tem

po d

e im

obili

dade

(s)

10 10 ---- 50

IOB

DDE VEI

10

* * *

66

6.1.4 Teste da Suspensão da Cauda

Neste modelo experimental, a administração (via i.p.) de DDE reduziu,

significativamente, o tempo de imobilidade dos animais nas doses de 10 mg/kg (99,31 ±

6,74s), 25 mg/kg (86,00 ± 5,80s) e 50 mg/kg (69,63 ± 7,80s) quando comparados ao grupo

controle veículo (121,30 ± 5,90s) (Tabela 4 / Figura 9).

A imipramina 30 mg/kg e bupropiona 30 mg/kg (via i.p.), utilizadas como controles

positivos, também diminuíram o tempo de imobilidade (IMI-30: 26,00 ± 5,21s; BUP-30:

64,33 ± 6,89s) em relação ao controle veículo (Tabela 4 / Figura 9).

Tabela 4. Efeito do DDE no teste da suspensão da cauda.

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)


Controle (veículo)

-----

121,30 ± 5,90

10

25

99,31 ± 6,74 **

86,00 ± 5,80 ***

DDE

50 69,63 ± 7,80 ***

IMI 30 26,00 ± 5,21 ***

BUP 30 64,33 ± 6,89 ***

** p<0,01 vs controle; *** p<0,001 vs controle. ANOVA e t-Student Newman Keuls

post hoc)

67

0

20

40

60

80

100

120

140

Tem

po d

e Im

obilid

ade

(Seg

)

Controle

10 25 50

DDE

10 30

BUP IMI

mg/kg

**

* **

* **

* **

* **

Figura 9. Efeito do DDE no teste da Suspensão da cauda.

DDE, imipramina (IMI) ou bupropiona (BUP), nas doses estudadas, foram administrados 30

minutos antes da suspensão dos animais a partir da cauda. O tempo de imobilidade foi registrado

em segundos. Os valores foram expressos como média ± EPM. ** p<0,01 vs controle; *** p<0,001

vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

68

6.2 Avaliação do envolvimento do sistema dopaminérgico nos efeitos centrais do dde

6.2.1 Teste do Campo Aberto

O número de travessias, rearing e grooming foram os parâmetros analisados e a forma

como os resultados foram expressos.

O DDE (via i.p.) aumentou o número de travessias dos animais no campo aberto

(Tabela 5 / Figura 10A) nas doses de 25 e 50 mg/kg (DDE-25: 30,63 ± 1,10; DDE-50: 31,13

± 2,03) comparando com o controle veículo (21,25 ± 0,86). O DDE 10 mg/kg (via i.p.) não

alterou, de forma significativa, o número de travessias dos animais no campo aberto (DDE-

10: 21,00 ± 3,20) quando comparado ao controle veículo. A bupropiona 10 e 30 mg/kg (via

i.p.), utilizada como controle positivo, aumentou significativamente o número de travessias

(BUP-10: 30,33 ± 3,00; BUP-30: 31,50 ± 3,53) em relação ao controle veículo (Tabela 5 /

Figura 10A). Os grupos pré-tratados com SCH 23390 ou sulpirida e tratados com veículo não

alteraram o número de travessias no campo aberto (SCH-15 + veículo: 25,88 ± 2,17; SULP-

50 + veículo: 22,38 ± 1,84) em relação ao controle veículo.

O grupo pré-tratado com SCH 23390 e tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.) reduziu o

número de travessias (SCH-15 + DDE-50: 21,50 ± 1,55) em relação ao grupo DDE 50 mg/kg

(31,13 ± 2,03) sozinho; portanto, SCH 23390 reverteu o aumento da atividade exploratória

dos animais, induzido pelo DDE, neste modelo experimental. O grupo pré-tratado com

sulpirida e tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.) não alterou o número de travessias (SULP-50

+ DDE-50: 29,63 ± 1,60), pois não demonstrou uma diferença significativa em relação ao

grupo DDE 50 mg/kg sozinho; portanto, sulpirida não foi capaz de reverter a atividade

exploratória dos animais, induzida pelo DDE, neste modelo experimental. O SCH 23390

reverteu o aumento no número de travessias induzido pela bupropiona (SCH-15 + BUP-30:

22,50 ± 2,13) quando comparado a bupropiona sozinha (31,50 ± 3,53). No entanto, sulpirida

não alterou significativamente o número de travessias (SULP-50 + BUP-30: 30,50 ± 1,93),

quando comparado a bupropiona sozinha (Tabela 5 / Figura 10A).

O DDE aumentou o número de rearing (DDE-25: 9,12 ± 0,51; DDE-50: 9,50 ± 0,53)

quando comparado com o grupo controle veículo (5,37 ± 0,46). No entanto, o DDE 10 mg/kg

(via i.p.) não alterou, de forma significativa, o número de rearing dos animais no campo

69

aberto (5,87 ± 0,69) quando comparado ao controle veículo. A bupropiona 30 mg/kg (via i.p.)

aumentou o número de rearing (BUP-30: 9,87 ± 1,04) quando comparado ao grupo controle

(Tabela 5 / Figura 10B). No entanto, a bupropiona 10 mg/kg (via i.p.) não alterou, de forma

significativa, o número de rearing dos animais no campo aberto (6,67 ± 0,61) quando

comparado ao controle veículo. Os grupos pré-tratados com SCH 23390 ou sulpirida e

tratados com veículo não alteraram o número de rearing no campo aberto (SCH-15 + veículo:

6,37 ± 0,99; SULP-50 + veículo: 5,87 ± 0,61) em relação ao controle veículo. O grupo pré-

tratado com SCH 23390 e tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.) não alterou o número de

rearing (SCH-15 + DDE-50: 8,12 ± 0,51) em relação ao grupo DDE 50 mg/kg (9,50 ± 0,53)

sozinho; portanto, SCH 23390 não reverteu o aumento do número de rearing induzido pelo

DDE neste modelo experimental (Tabela 5 / Figura 10B).

O grupo pré-tratado com sulpirida e tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.) alterou o

número de rearing (SULP-50 + DDE-50: 5,50 ± 1,11), pois demonstrou uma diferença

significativa em relação ao grupo DDE 50 mg/kg sozinho; portanto, sulpirida foi capaz de

reverter o aumento do número de rearing induzido por DDE neste modelo experimental. O

SCH 23390 não reverteu o aumento no número de rearing induzido pela bupropiona (SCH-15

+ BUP-30: 8,50 ± 0,62) quando comparado a bupropiona sozinha (9,87 ± 1,04). No entanto,

sulpirida alterou significativamente o número de rearing (SULP-50 + BUP-30: 6,00 ± 0,62)

quando comparado a bupropiona sozinha (Tabela 5 / Figura 10B).

O número de grooming (Tabela 5 / Figura 10C) também aumentou após o tratamento

(via i.p.) com DDE nas doses de 25 e 50 mg/kg (DDE-25: 7,62 ± 0,90; DDE-50: 7,75 ± 0,75)

quando comparado ao grupo controle veículo (3,75 ± 0,36). No entanto, o DDE 10 mg/kg (via

i.p.) não alterou, de forma significativa, o número de grooming dos animais no campo aberto

(DDE-10: 4,37 ± 0,42) quando comparado ao controle veículo. A bupropiona 30 mg/kg (via

i.p.) aumentou este parâmetro (BUP-30: 8,25 ± 1,03) comparando com o grupo controle

veículo. No entanto, a bupropiona 10 mg/kg (via i.p.) não alterou, de forma significativa, o

número de grooming dos animais no campo aberto (BUP-10: 3,00 ± 0,25) quando comparado

ao controle veículo. Os grupos pré-tratados com SCH 23390 ou sulpirida e tratados com

veículo não alteraram o número de grooming no campo aberto (SCH-15 + veículo: 4,25 ±

0,88; SULP-50 + veículo: 4,37 ± 0,49) em relação ao controle veículo. O grupo pré-tratado

com SCH 23390 e tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.) não alterou o número de grooming

(SCH-15 + DDE-50: 7,62 ± 0,49) em relação ao grupo DDE 50 mg/kg (7,75 ± 0,75) sozinho;

portanto, SCH23390 não reverteu o aumento do número de grooming induzido pelo DDE

70

neste modelo experimental (tabela 05 / figura 10C). O grupo pré-tratado com sulpirida e

tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.) alterou o número de grooming (SULP-50 + DDE-50:

4,75 ± 0,79), pois demonstrou uma diferença significativa em relação ao grupo DDE 50

mg/kg sozinho; portanto, sulpirida foi capaz de reverter o aumento do número de grooming

induzido por DDE neste modelo experimental. O SCH 23390 não reverteu o aumento no

número de grooming induzido pela bupropiona (SCH-15 + BUP-30: 7,12 ± 0,54) quando

comparado a bupropiona sozinha (8,25 ± 1,03). No entanto, sulpirida alterou

significativamente o número de grooming (SULP-50 + BUP-30: 4,50 ± 0,65), quando

comparado a bupropiona sozinha (Tabela 5 / Figura 10C).

71

Tabela 5. Efeito do DDE no teste do campo aberto.

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)

Rearing Grooming Nº travessias

Controle (veículo)

-----

5,37 ± 0,46

3,75 ± 0,36

21,25 ± 0,86

10

25

5,87 ± 0,69

9,12 ± 0,51 a

4,37 ± 0,42

7,62 ± 0,90 a

21,00 ± 3,20

30,63 ± 1,10 a

DDE

50 9,50 ± 0,53 a 7,75 ± 0,75 a 31,13 ± 2,03 a

BUP 10

30

6,67 ± 0,61

9,87 ± 1,04 a

3,00 ± 0,25

8,25 ± 1,03 a

30,33 ± 3,00 a

31,50 ± 3,53 a

SCH 23390 +

veículo

15 µg/kg, s.c. 6,37 ± 0,99 4,25 ± 0,88 25,88 ± 2,17

SULP + veículo 50

5,87 ± 0,61 4,37 ± 0,49 22,38 ± 1,84

SCH + BUP 15 µg/kg, s.c. +

30 mg/kg, i.p.

8,50 ± 0,62 7,12 ± 0,54 22,50 ± 2,13 b

SCH + DDE 15 µg/kg, s.c. +

50 mg/kg, i.p.

8,12 ± 0,51 7,62 ± 0,49 21,50 ± 1,55 c

SULP + BUP 50 + 30 6,00 ± 0,62 b 4,50 ± 0,65 b 30,50 ± 1,93

SULP + DDE 50 + 50 5,50 ± 1,11 c 4,75 ± 0,79 c 29,63 ± 1,60

- Nº de travessias: a p<0,05 vs controle; b p<0,05 vs BUP; c p<0,05 vs DDE 50 mg/kg - Rearing (s): a p<0,01 vs controle; b p<0,01 vs BUP; c p<0,01 vs DDE 50 mg/kg - Grooming (s): a p<0,01 vs controle; b p<0,01 vs BUP; c p<0,05 vs DDE 50 mg/kg (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

72

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Nº

trave

ssia

s

Controle

10 25 50

DDE

30 50

BUP

10 30

BUP DDE

mg/kg

SCH

30 50

BUP DDE

SULP

a a

b c

a

---

VEI

---

VEI

a

73

Figura 10B. Efeito do DDE no teste do campo aberto

(Investigação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico). DDE ou bupropiona (BUP),

nas doses estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição dos animais ao campo

aberto. SCH ou SULP foram administrados 15 minutos antes da administração de veículo, BUP-30

ou DDE-50. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao campo aberto e o nº de rearing,

durante 5 minutos, foi registrado. Os valores foram expressos como média ± EPM.a p<0,01 vs

controle; b p<0,01 vs BUP; c p<0,01 vs DDE 50 mg/kg (ANOVA e t-Student Newman Keuls post

hoc)

Controle

10 25 50

DDE

30 50

BUP

10 30

BUP DDE

mg/kg

SCH

30 50

BUP DDE

SULP

a a

b c

a

---

VEI

---

VEI

0

2

4

6

8

10

12

Rea

ring

(Seg

)

74

Figura 10C. Efeito do DDE no teste do campo aberto

(Investigação do possível envolvimento do sistema dopaminérgico). DDE ou bupropiona (BUP),

nas doses estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição dos animais ao campo

aberto. SCH ou SULP foram administrados 15 minutos antes da administração de veículo, BUP-30

ou DDE-50. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao campo aberto e o nº de grooming,

durante 5 minutos, foi registrado. Os valores foram expressos como média ± EPM .a p<0,01 vs

controle; b p<0,01 vs BUP; c p<0,05 vs DDE 50 mg/kg (ANOVA e t-Student Newman Keuls post

hoc)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Gro

omin

g (S

eg)

Controle

10 25 50

DDE

30 50

BUP

10 30

BUP DDE

mg/kg

SCH

30 50

BUP DDE

SULP

a a

b

a

---

VEL

---

VEL

c

75

6.3 Avaliação da atividade ansiolítica e sedativa/hipnótica

6.3.1 Teste do Tempo de Sono Induzido por Pentobarbital

O DDE nas doses de 25 e 50 mg/kg (via i.p.) não prolongou, significativamente, a

latência para o início do sono e nem o tempo de sono total induzido por pentobarbital (40

mg/Kg, i.p.) quando comparado ao controle. Diazepam (DZP-2 mg/kg, i.p.), utilizado como

controle positivo, diminuiu significativamente a latência para início do sono (2,80 ± 0,48 min)

e o tempo de sono total (117,60 ± 2,73 min) quando comparado ao controle veículo (4,80 ±

0,32 min; 60,60 ± 3,64 min) respectivamente (Tabela 6 / Figuras 11A e 11B).

Tabela 6. Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital.

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)

Latência de sono

(min)

Tempo de sono total

(min)

Controle (veículo)

-----

4,80 ± 0,32

60,60 ± 3,64

25 5,20 ± 0,59 63,60 ± 3,36 DDE

50 5,30 ± 0,26 62,00 ± 2,54

Diazepam 2 2,80 ± 0,48** 117,60 ± 2,73***

** p<0,01 e *** p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keu post hoc).

76

0

1

2

3

4

5

6

7

Latê

ncia

de

sono

(min

)

Controle

25 50

DDE

2

Diazepam

mg/kg

**

Figura 11A. Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital.

DDE ou diazepam, nas doses estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição dos

animais ao pentobarbital. Os animais foram colocados em recipientes secos até o início do sono,

onde foi registrada a latência para o sono. Os valores foram expressos como média ± EPM.**

p<0,01 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keul post hoc)

77

0

20

40

60

80

100

120

140

Tem

po d

e so

no to

tal (

min

)

Controle

25 50

DDE

2

Diazepam

mg/kg

***

Figura 11B: Efeito do DDE no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital.


animais ao pentobarbital. Os animais foram colocados em telas onduladas, logo após o início do

sono (latência de sono), para observação e registro do tempo total de sono. Os valores foram

expressos como média ± EPM.*** p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls

post hoc).

78

6.3.2 Teste do Rota Rod

Os animais tratados por via intraperitoneal com DDE nas doses de 25 e 50 mg/kg, não

apresentaram alterações significativas no tempo de permanência na barra (segundos) em

relação ao grupo controle nos três períodos de tempo observados (1h e 2h).

Utilizado como controle positivo, diazepam 2 mg/kg (via i.p.), reduziu o tempo de

permanência na barra (1h: 33,92 ± 1,24s; 2h: 34,28 ± 1,04s) quando comparado ao grupo

controle (1h: 59,54 ± 1,09s; 2h: 58,23 ± 0,72s) respectivamente (Tabela 7 / Figura 12)

Tabela 7. Efeito do DDE no teste do Rota rod.

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)

Tempo de permanência (s) / 1min

Período

(observação)

0h

1h

2h

Controle (veículo) ----- 58,63 ± 0,90 59,54 ± 1,09 58,23 ± 0,72

25 58,25 ± 1,04 58,69 ± 0,90 57,29 ± 0,58 DDE

50 59,50 ± 0,50 58,19 ± 0,88 57,93 ± 0,37

Diazepam 2 59,63 ± 0,26 33,92 ± 1,24*** 34,28 ± 1,04***

*** p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

79

0

10

20

30

40

50

60

70

Tem

po d

e pe

rman

ênci

a (s

eg)

/ 1m

in

Diazepam 2mg/kg

DDE 25mg/kg DDE 50mg/kg

Controle

0 1 2

Tempo (h)

*** ***

Figura 12. Efeito do DDE no teste do Rota Rod.

DDE ou diazepam, nas doses estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição

dos animais a barra do rota rod. O tempo (segundos) que cada animal permaneceu na barra

em rotação (12 rpm) foi registrado. Os valores foram expressos como média ± EPM.***

p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

80

6.3.3 Teste das Convulsões Induzidas por Pentilenotetrazol

No teste da convulsão induzida por pentilenotetrazol foi avaliada a latência da

convulsão (LC) em segundos. Os animais tratados com DDE, nas doses 25 e 50 mg/kg (via

i.p.), não apresentaram alterações na latência para a 1ª convulsão quando comparado com o

controle veículo (tabela 08 / figura 13).

O diazepam 1 mg/kg (via i.p.), utilizado como controle positivo, aumentou

significativamente a latência para a 1ª convulsão (DZP-1: 372,7 ± 52,99s) quando comparado

ao grupo controle veículo (76,56 ± 3,88s).

A percentagem de sobrevivência dos animais tratados com DDE (via i.p.) foi de 100%

nas doses estudadas. Além disso, os animais tratados com diazepam 1 mg/kg (via i.p.)

também apresentaram um percentagem de sobrevivência de 100% em relação as convulsões

induzidas por pentilenotetrazol (tabela 08 / figura 13).

Tabela 8. Efeito do DDE no teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol

Tratamento Dose (mg/kg, i.p.)

Latência para 1ª convulsão (s)

Controle (veículo)

-----

76,56 ± 3,88

25 79,60 ± 5,68 DDE

50 71,10 ± 3,53

Diazepam 1 372,7 ± 52,99 ***

*** p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

81

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Latê

ncia

par

a 1ª

con

vuls

ão (s

)

Controle

25 50

DDE

1

Diazepam

mg/kg

***

Figura 13. Efeito do DDE no teste das convulsões induzidas por pentilenotetrazol.


animais ao pentilenotetrazol. Os animais foram colocados em recipientes secos e foram observados

até o início das convulsões do tipo clônica ou tônico-clônica, onde foi registrada a latência para a 1ª

convulsão (segundos). Após isto, os animais continuaram em observação durante todo o período do

teste (20 minutos) para que pudesse ser verificada a taxa (%) de sobrevivência. Os valores foram

expressos como média ± EPM.***p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post

hoc).

82

6.3.4 Teste do Labirinto em Cruz-Elevado (Plus maze)

O tratamento agudo com as doses de 25 e 50 mg/kg (via i.p.) de DDE aumentou, no

teste do labirinto em cruz elevado, o NEBA (DDE-25: 9,45 ± 0,38; DDE-50: 9,57 ± 0,62)

comparando com o controle veículo (7,16 ± 0,74), assim como aumentou TPBA (DDE-25:

136,9 ± 6,58s; DDE-50: 137,2 ± 3,12s) comparando com o controle (90,28 ± 4,36s). O DDE

aumentou a PEBA nas doses estudadas (DDE-25: 54,69 ± 1,79%; DDE-50: 55,78 ± 2,15%)

assim como a PTBA (DDE-25: 60,74 ± 1,69%; DDE-50: 62,68 ± 1,09%) quando comparado

ao grupo controle veículo (PEBA: 45,18 ± 1,98%; PTBA: 48,12 ± 3,62%) (Tabela 9 /

Figuras 14A, B, C, D).

O diazepam 1 mg/kg (via i.p.) aumentou, de forma significativa, todos os parâmetros

analisados neste modelo experimental (NEBA: 11,68 ± 0,46; TPBA: 147,49 ± 7,25s; PEBA:

58,91 ± 1,94%; PTBA: 75,71 ± 4,22%) em relação ao grupo controle veículo (NEBA: 7,16 ±

0,74; TPBA: 90,28 ± 4,36s; PEBA: 45,18 ± 1,98%; PTBA: 48,12 ± 3,62%).

A análise do envolvimento dos receptores benzodiazepínicos no efeito ansiolítico do

DDE mostrou que o grupo pré-tratado com flumazenil 2 mg/kg (via i.p.) e tratado com

veículo não alterou os parâmetros analisados (NEBA: 7,98 ± 0,31; TPBA: 95,77 ± 5,15s;

PEBA: 44,42 ± 1,57%; PTBA: 49,19 ± 1,99%) quando comparados com os respectivos

parâmetros do grupo controle veículo. No entanto, o grupo pré-tratado com o flumazenil 2

mg/kg (via i.p.) e tratado com diazepam 1 mg/kg (via i.p.) reverteu o efeito ansiolítico do

diazepam em todos os parâmetros avaliados (NEBA: 6,31 ± 0,78; TPBA: 106,69 ± 3,02s;

PEBA: 48,14 ± 1,35%; PTBA: 60,47 ± 2,58%) quando este grupo foi comparado com os

respectivos parâmetros do grupo tratado com diazepam 1 mg/kg (via i.p.) sozinho (NEBA:

11,68 ± 0,46; TPBA: 147,49 ± 7,25s; PEBA: 58,91 ± 1,94%; PTBA: 75,71 ± 4,22%) (Tabela

9 / Figuras 14A, B, C, D). O grupo pré-tratado com flumazenil 2 mg/kg (via i.p.) e tratado

com DDE, nas doses de 25 e 50 mg/kg (via i.p.), não foi capaz de reverter o efeito ansiolítico,

induzido pelo DDE, quando comparado ao grupo tratado com DDE 50 mg/kg (via i.p.)

sozinho, considerando todos os parâmetros analisados neste modelo experimental.

83

Tabela 9. Efeito do DDE no teste do labirinto em cruz elevado (Plus maze)

Tratamento Dose

(mg/kg,

i.p.)

NEBA TPBA (s) PEBA (%) PTBA (%)

Controle

(veículo)

-----

7,16 ± 0,74

90,28 ± 4,36

45,18 ± 1,98

48,12 ± 3,62

25 9,45 ± 0,38 a 136,9 ± 6,58 a 54,69 ± 1,79 a 60,74 ± 1,69 aDDE

50 9,57 ± 0,62 a 137,2 ± 3,12 a 55,78 ± 2,15 a 62,68 ± 1,09 a

DIAZP 1 11,68 ± 0,46 b 147,49 ± 7,25 b 58,91 ± 1,94 b 75,71 ± 4,22 b

FLU + veículo 2 7,98 ± 0,31 95,77 ± 5,15 44,42 ± 1,57 49,19 ± 1,99

FLU + DIAZP 2 + 1 6,31 ± 0,78 c 106,69 ± 3,02 c 48,14 ± 1,35 c 60,47 ± 2,58 c

FLU + DDE 2 + 50 9,88 ± 0,91 139,8 ± 5,62 54,12 ± 1,88 61,94 ± 1,83

NEBA: a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,001 vs DIAZP TPBA (s): a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,001 vs DIAZP PEBA (%): a p<0,05 vs controle; b p<0,01 vs controle; c p<0,05 vs DIAZP PTBA (%): a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,05 vs DIAZP (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

84

0

2

4

6

8

10

12

14

NE

BA

Controle

25 50

DDE

1 50

DZP

1

DZP DDE

mg/kg

FLU

a a

b

c

VEI

---

Figura 14A. Efeito do DDE no teste do Plus maze

(Investigação do possível envolvimento do sistema gabaérgico). DDE ou diazepam, nas doses

estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição dos animais ao labirinto em cruz

elevado (Plus maze). Flumazenil (FLU) foi administrado 15 minutos antes do tratamento dos

animais com veículo, DZP-1 ou DDE-50. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao labirinto

e o número de entradas nos braços abertos (NEBA) foi registrado. Os valores foram expressos

como média ± EPM. a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,001 vs DIAZP (ANOVA e t-

Student Newman Keuls post hoc).

85

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

TP

BA

(Seg

)

Controle

25 50

DDE

1 50

DZP

1

DZP DDE

mg/kg

FLU

a a b

c

VEI

---

Figura 14B. Efeito do DDE no teste do Plus maze

(investigação do possível envolvimento do sistema gabaérgico). dde ou diazepam, nas doses


elevado (plus maze). flumazenil (flu) foi administrado 15 minutos antes do tratamento dos

animais com veículo, dzp-1 ou dde-50. após 30 minutos, os animais foram expostos ao labirinto e

o tempo de permanência nos braços abertos (tpba), em segundos, foi registrado. os valores foram

expressos como média ± epm. a p<0,01 vs controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,001 vs dzp (anova

e t-student newman keuls post hoc).

86

0

10

20

30

40

50

60

70

PE

BA

(%)

Figura 14C. Efeito do DDE no teste do Plus maze




animais com veículo, DZP-1 ou DDE-50. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao

labirinto. A percentagem (%) de entradas nos braços abertos (PEBA) foi calculada em relação ao

NEBA. Os valores foram expressos como média ± EPM a p<0,05 vs controle; b p<0,01 vs

controle; c p<0,05 vs DIAZP (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

Controle

25 50

DDE

1 50

DZP

1

DZP DDE

mg/kg

FLU

a a b

c

VEI

---

87

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

PT

BA

(%)

Figura 14D. Efeito do DDE no teste do Plus maze




animais com veículo, DZP-1 ou DDE-50. Após 30 minutos, os animais foram expostos ao

labirinto. A percentagem (%) do tempo de permanência nos braços abertos (PTBA) foi

calculada em relação ao TPBA. Os valores foram expressos como média ± EPM a p<0,01 vs

controle; b p<0,001 vs controle; c p<0,05 vs DIAZP (ANOVA e t-Student Newman Keuls post

hoc).

Controle

25 50

DDE

1 50

DZP

1

DZP DDE

mg/kg

FLU

a a

b

c

VEI

---

88

6.3.5 Teste do Claro/Escuro

O DDE nas doses de 25 e 50 mg/kg (via i.p.) aumentou, significativamente, a latência

para a entrada dos animais na divisão escuro (DDE-25: 124,6 ± 3,78s; DDE-50: 127,3 ±

4,19s) comparando com o controle veículo (105,0 ± 4,11s) (Tabela 10 e Figura 15).

Da mesma forma, o diazepam 1 mg/kg (via i.p.), utilizado como controle positivo,

reduziu significativamente a latência para a entrada dos animais na divisão escuro (DIAZP-1:

180,5 ± 3,73s) quando comparado ao mesmo parâmetro analisado com o grupo controle

veículo (105,0 ± 4,11) (Tabela 10 e Figura 15).

Tabela 10. Efeito do DDE no teste do Claro/Escuro


Latência para entrada divisão escuro (s)

Controle (veículo)

-----

105,0 ± 4,11

25 124,6 ± 3,78 ** DDE

50 127,3 ± 4,19 **

Diazepam 1 180,5 ± 3,73 ***

** p<0,01 vs controle; *** p<0,01 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

89

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Latê

ncia

par

a en

trad

a di

visã

o es

curo

(s)

Figura 15. Efeito do DDE no teste do Claro/Escuro.


animais ao aparato (claro/escuro). Os animais foram colocados na divisão iluminada (claro) e

observados durante um período de 5 minutos. O tempo (latência) para entrada na divisão (escuro)

foi registrado em segundos. Os valores foram expressos como média ± EPM.** p<0,01 vs

controle; *** p<0,01 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

Controle

25 50

DDE

1

DZP

mg/kg

***

** **

90

6.3.6 Teste da Placa Perfurada (Hole board).

Neste modelo experimental, após a administração aguda de DDE nas doses de 25 e 50

mg/kg, foi observado um significante aumento do número de vezes que o animal colocou a

cabeça no buraco da placa perfurada (head dips) (DDE-25: 53,38 ± 2,14; DDE-50: 55,50 ±

1,42) quando comparado ao grupo controle (45,75 ± 1,98).

O diazepam 1 mg/kg (via i.p.), utilizado como controle positivo, também demonstrou

um aumento no número de (head dips) neste modelo experimental (DZP-1: 69,75 ± 1,59)

quando comparado ao grupo controle veículo (Tabela 11 / Figura 16).

Tabela 11. Efeito do DDE no teste da placa perfurada (Hole board)


Nº de head-dips

Controle (veículo)

-----

45,75 ± 1,98

25 53,38 ± 2,14 ** DDE

50 55,50 ± 1,42 **

Diazepam 1 69,75 ± 1,59 ***

** p<0,01 e *** p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

91

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Nº

de h

ead-

dips

Controle

25 50

DDE

1

DZP

mg/kg

***

** **

Figura 16. Efeito do DDE no teste da placa perfurada (Hole board).

DDE ou diazepam, nas doses estudadas, foram administrados 30 minutos antes da exposição

dos animais ao aparato Hole board. Os animais foram colocados na placa perfurada e

observados durante um período de 5 minutos. O número de vezes que o animal colocou a

cabeça nos “buracos” da placa (head-dips) foi registrado eletronicamente pelo aparelho. Os

valores foram expressos como média ± EPM.** p<0,01 vs controle; *** p<0,001 vs controle

(ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

92

6.4 Estudo neuroquímico

A tabela 12 e as figuras 17A e 17B apresentam os níveis de monoaminas em corpo

estriado de camundongos, após 1 h da administração aguda de DDE 10 e 50 mg/kg, i.p.

Foi observado um aumento significativo nos níveis de monoaminas (DDE-10: NA-

267,60 ± 39,39; DA-1050,00 ± 192,00; 5-HT-957,00 ± 143,10 ng/mg de tecido) e (DDE-50:

NA-333,20 ± 40,59; DA-1420,00 ± 157,70; 5-HT-814,60 ± 140,10 ng/mg de tecido) em

relação aos seus respectivos grupos controle (veículo) (Controle: NA-156,20 ± 29,58; DA-

589,80 ± 72,54; 5-HT-304,60 ± 110,90 ng/mg de tecido) e (Controle: NA-152,50 ± 27,98;

DA-531,60 ± 62,24; 5-HT-391,00 ± 108,20 ng/mg de tecido) (Tabela 12 / Figuras 17A e

17B).

Tabela 12. Efeito do DDE sobre os Níveis de Neurotransmissores

Tratamento Dose

(mg/kg,

i.p.)

Níveis de Neurotransmissores (ng/mg de tecido)

NA

DA

5-HT


DDE 10 267,60 ± 39,39 * 1050,00 ± 192,00 * 957,00 ± 143,10 **


DDE 50 333,20 ± 40,59 ** 1420,00 ± 157,70 *** 814,60 ± 140,10 *

* p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

93

Figura 17A. Efeito do DDE sobre os Níveis de Neurotransmissores.

O DDE 10 mg/kg ou veículo foram administrados 1 hora antes da dissecação e isolamento do

corpo estriado dos animais. Os níveis de monoaminas foram detectados eletronicamente por

HPLC. Os valores foram expressos como média ± EPM.* p<0,05 e ** p<0,01 vs controle

(ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Nív

eis

de N

euro

trans

mis

sore

s (n

g/m

g de

teci

do)

Controle 10

DDE

NA

*

Controle 10

DDE

DA

Controle 10

DDE

5-HT

mg/kg

*

**

94

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Nív

eis

de N

euro

tran

smis

sore

s (n

g/m

g de

teci

do)

***

*

Controle 50

DDE

NA

**

Controle 50

DDE

DA

Controle 50

DDE

5-HT

mg/kg

Figura 17B. Efeito do DDE sobre os Níveis de Neurotransmissores.


corpo estriado dos animais. Os níveis de monoaminas foram detectados eletronicamente por

HPLC. Os valores foram expressos como média ± EPM. * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001

vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc).

95

A Tabela 13 e as Figuras 18A e 18B apresentam os níveis de metabólitos das

monoaminas em corpo estriado de camundongos, após 1 h da administração aguda de DDE 10

e 50 mg/kg, i.p.

Em relação aos metabólitos dos neurotransmissores, foi observado um aumento nos

seus níveis (DDE-10: DOPAC-10330,00 ± 690,20; HVA-2915,00 ± 380,80; 5-HIAA-1318,00

± 174,00 ng/mg de tecido; DDE-50: DOPAC-14197,00 ± 1858,00; HVA-2616,00 ± 260,50;

5-HIAA-733,20 ± 55,63 ng/mg de tecido) em relação aos seus respectivos grupos controle

(veículo) (Controle: DOPAC-8120,00 ± 512,00; HVA-1784,00 ± 102,50; 5-HIAA-557,90 ±

94,32 ng/mg de tecido) e (Controle: DOPAC-8942,00 ± 876,00; HVA-1848,00 ± 199,10; 5-

HIAA-480,50 ± 50,12 ng/mg de tecido) (Tabela 13 e Figuras 18A e 18B).

Tabela 13. Efeito do DDE sobre os Níveis de Metabólitos

Tratamento Dose

(mg/kg, i.p.)

Níveis de Metabólitos (ng/mg de tecido)

DOPAC

HVA

5-HIAA


DDE 10 10330,00 ± 690,20 * 2915,00 ± 380,80 * 1318,00 ± 174,00 **


DDE 50 14197,00 ± 1858,00 * 2616,00 ± 260,50 * 733,20 ± 55,63 **

* p<0,05 e ** p<0,01 vs controle (ANOVA e t-Student Newman Keuls post hoc)

96

Figura 18A. Efeito do DDE sobre os Níveis de Metabólitos.


corpo estriado dos animais. Os níveis de metabólitos das monoaminas foram detectados

eletronicamente por HPLC. Os valores foram expressos como média ± EPM.* p<0,05 e **


0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

Nív

eis

de M

etab

ólito

s (n

g/m

g de

teci

do)

Controle 10

DDE

DOPAC

Controle 10

DDE

HVA

Controle 10

DDE

5-HIAA

mg/kg

*

**

*

97

Figura 18B. Efeito do DDE sobre os Níveis de Metabólitos.

O DDE 50mg/kg ou veículo foram administrados 1 hora antes da dissecação e isolamento do

corpo estriado dos animais. Os níveis de metabólitos das monoaminas foram detectados

eletronicamente por HPLC. Os valores foram expressos como média ± EPM.* p<0,05 e **


0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

Nív

eis

de M

etab

ólito

s (n

g/m

g de

teci

do)

Controle 50

DDE

DOPAC

*

Controle 50

DDE

HVA

Controle 50

DDE

5-HIAA

mg/kg

*

**

98

7 DISCUSSÃO

Eventos estressantes são considerados fatores importantes no desenvolvimento de

desordens do sistema nervoso central tais como a depressão e a ansiedade (BROWN, 1996;

KOOLHAAS et al., 1997; SILVA et al., 2007). Com base na associação clínica de episódios

depressivos e eventos estressantes da vida, muitos dos modelos animais, utilizados para

avaliar atividade central de drogas, são baseados em comportamentos induzidos por estresse.

No presente trabalho, os efeitos do desidrodieugenol (DDE) foram investigados em

vários modelos animais (testes) de comportamento, para avaliar sua atividade sobre sistema

nervoso central (SNC), tais como: teste do nado forçado, teste da suspensão da cauda (TSC),

campo aberto, tempo de sono induzido por pentobarbital, rota rod, convulsões induzidas por

pentilenotetrazol, labirinto em cruz elevado, claro/escuro e placa perfurada. Estes são modelos

de experimentação, com animais, considerados clássicos para o screening de atividades de

drogas no SNC, que evidenciam informações sobre desempenho exploratório, ansiedade e

depressão.

O TNF e o TSC foram utilizados, neste estudo, porque são modelos animais clássicos

para avaliação do potencial antidepressivo de drogas. Nossos resultados demonstraram que o

DDE, nas doses estudadas, reduziu significativamente o tempo de imobilidade no TNF e no

TSC, quando comparados ao grupo controle. A imipramina (inibidor da recaptação de

noradrenalina e serotonina) e a bupropiona (inibidor da recaptação de dopamina), utilizados

como padrões positivos nos referidos testes, também reduziram o tempo de imobilidade dos

animais, demonstrando a sensibilidade destes testes às diferentes classes de drogas

antidepressivas. Assim, os resultados obtidos sugerem uma possível atividade antidepressiva

para o DDE nestes modelos experimentais.

O TNF e o TSC são modelos bem caracterizados e têm sido utilizados para a avaliação

de várias classes distintas de drogas, incluindo antidepressivos tricíclicos e atípicos e são bons

indicadores para as ações de antidepressivos em humanos (PORSOLT et al., 1977; STERU et

al., 1985; MULLER, 2003; SILVA et al., 2007). Quando os camundongos são forçados a

nadar ou são pendurados de cabeça para baixo pela cauda, eles tendem a ficar imóveis depois

de atividade vigorosa inicial. Estes testes submetem os animais a situações de estresse

inescapável e são comumente utilizados para o screening de substâncias com potencial efeito

antidepressivo (PORSOLT et al., 1977; STERU et al., 1985; SOUSA et al., 2004). Embora a

relação entre imobilidade (postura que se acredita refletir em um estado de “desespero

comportamental” em que os animais tentam escapar da situação de estresse) e depressão

99

permaneça controverso (GARDIER; BOURIN, 2001; SOUSA et al., 2004); têm sido bem

demonstrado que drogas com atividade antidepressiva reduzem o tempo de duração em que os

animais permanecem imóveis (PORSOLT et al., 1977; BORSIN; MELI, 1988). Além disso,

substâncias que possuem atividade antidepressiva, em humanos, frequentemente diminuem a

imobilidade (PORSOLT et al., 1977; PORSOLT, 1979; PORSOLT et al., 1978).

De acordo com a literatura, a depressão está relacionada com a redução de

noradrenalina e serotonina, e inibidores seletivos da recaptação de monoaminas melhoram a

depressão (BLIER et al., 1994). Além disso, tem sido proposto que a dopamina apresenta,

também, um importante papel nos sintomas depressivos e no efeito antidepressivo de drogas;

além de estar implicada na regulação do humor (WILLNER, 1995; BROWN et al., 1996).

Com base nisso, decidiu-se investigar a atuação do DDE sobre os sistemas dopaminérgico,

serotonérgico e noradrenérgico com o objetivo de evidenciar o possível mecanismo de ação

dos efeitos centrais do DDE em modelos animais de depressão.

Está bem documentado na literatura que o sistema serotonérgico está intimamente

relacionado com a patogênese da depressão e no mecanismo de ação de drogas

antidepressivas (WONG; LICINIO, 2001; POLESZAK, 2007). Muitas drogas antidepressivas

usadas na clínica promovem um aumento de serotonina (5-HT) inibindo a metabolização pela

enzima monoaminaoxidase (MAO), inibindo a recaptação de serotonina ou também

interagindo diretamente com os receptores 5-HT1A e 5-HT2 (CRYAN et al., 2005;

ELHWUEGI, 2004). Neste contexto, dados da literatura têm mostrado que a depleção dos

estoques de serotonina com PCPA (um inibidor da síntese de serotonina) por 04 dias

consecutivos, depleta os estoques endógenos de 5-HT e previne o efeito antidepressivo de

inibidores da recaptação de 5-HT (KASTER et al., 2005; POLESZAK, 2007; MACHADO et

al., 2007). Os resultados, no presente estudo, demonstraram que o efeito antidepressivo do

DDE 10 e 50 mg/kg (via i.p.) foi prevenido pelo pré-tratamento dos animais com PCPA,

sugerindo que o sistema serotonérgico pode está relacionado com o efeito induzido pelo DDE

no TNF. Além disso, este resultado também indica que o possível mecanismo de ação do

DDE é dependente do aumento nos níveis de 5-HT na fenda sináptica; este aumento pode

estar relacionado com a inibição da recaptação neuronal de serotonina ou inibição da enzima

de metabolização MAO.

Estudos experimentais e clínicos indicam que o sistema noradrenérgico está, também,

fortemente relacionado na fisiopatologia da depressão, desde que muitas drogas

antidepressivas usadas na clínica também promovem um aumento nos níveis de noradrenalina

(NA) presente na fenda sináptica (NUTT, 2006). Dessa forma, há evidências do papel do α1-

100

adrenoceptor nas ações de agentes antidepressivos, desde que o bloqueio de α1-adrenoceptor

mimetiza estados depressivos, que são associados com desensibilização deste receptor

(STONE et al., 2003). Considerando estas evidências da literatura, o efeito anti-imobilidade

do DDE 10 e 50 mg/kg (via i.p.) parece não estar sendo modulado pelo α1-adrenoceptor, uma

vez que prazosin, um antagonista seletivo para este receptor, não foi capaz de reverter a

redução do tempo de imobilidade induzida pelo DDE. Por outro lado, α2-adrenoceptor

também modula a liberação de NA, 5-HT e vários outros neurotransmissores e estudos pré-

clínicos a respeito destes receptores têm demonstrado algumas evidências de respostas

antidepressivas de drogas em modelos comportamentais de depressão. De fato, O´Neill e

Conway (2001) mostraram que o efeito antidepressivo da clonidina (um agonista do α2-

adrenoceptor) no TNF foi revertido pelo antagonista do mesmo receptor, a ioimbina.

Considerando isto, os dados obtidos neste estudo mostraram que apenas o efeito da dose DDE

50 mg/kg (via i.p.) envolve, pelo menos em parte, uma interação com o α2-adrenoceptor, uma

vez que a iomibina, um antagonista deste receptor, numa dose que não promove um efeito per

si, reverteu a redução do tempo de imobilidade induzida por DDE no TNF.

Em paralelo aos sistemas serotonérgico e noradrenérgico, o sistema dopaminérgico

também é sugerido por estar implicado na regulação do humor (D'AQUILA et al., 2000;

WILLNER et al., 2005). De fato, há várias evidências atuais que referem a eficácia de

antidepressivos, com efeitos dopaminérgicos, no tratamento da depressão (PAPAKOSTAS,

2006).

Para se investigar a atuação do DDE sobre o sistema dopaminérgico, utilizou-se o

SCH 23390 e a sulpirida, que são antagonistas dos receptores dopaminérgicos D1 e D2,

respectivamente. Os resultados obtidos, neste estudo, demostraram que o pré-tratamento dos

animais com SCH 23390 e sulpirida aumentou, de forma siginificativa, o tempo de

imobilidade dos animais tratados com DDE 10 e 50 mg/kg e bupropiona 30 mg/kg no TNF.

Estes dados demonstram que os efeitos antidepressivos do DDE e da bupropiona foram

revertidos pelo SCH 23390 e a sulpirida, podendo-se sugerir a hipótese de que existe a

possível participação dos receptores D1 e D2 no mecanismo de ação do efeito antidepressivo

do DDE neste modelo experimental.

Esta hipótese pode ser fundamentada na observação de que o antagonista do receptor

dopaminérgico do tipo D2, sulpirida, bloqueia o efeito antidepressivo da bupropiona no TNF

(BARROS, 1987; SLUZEWSKA, 1991). Apesar da maioria dos estudos demonstrarem o

envolvimento apenas do receptor dopaminérgico D2 nos distúrbios afetivos, alguns autores

acreditam que o receptor D1 também possua alguma participação. De fato, alguns estudos

101

mostraram que o antagonista dos receptores D1, SCH 23390, bloqueou o efeito antidepressivo

da bupropiona no TNF em camundongos (YAMADA et al., 2004; VIANA et al., 2005;

HIRANO et al., 2007), sugerindo assim, a participação do receptor D1 no efeito

antidepressivo de drogas.

A eficácia da estimulação do receptor dopaminérgico do tipo D2 no efeito anti-

imobilidade no TNF é geralmente aceito, enquanto o papel dos receptores D1 é mais

controverso, pois alguns autores reportam a eficácia desses receptores em modelos animais de

depressão (D’AQUILA et al., 1994; GAMBARANA et al., 1995); enquanto outros afirmam

que não estão envolvidos (DUTERTE-BOUCHER et al., 1988; GEOFROY et al., 1993).

Estudos demonstraram que a bupropiona, utilizada como controle positivo no presente estudo,

teve seu efeito antidepressivo revertido pelo SCH 23390 (antagonista dos receptores D1) no

TNF em camundongos (MENON et al., 1988; YAMADA et al., 2004; HIRANO et al., 2007);

sugerindo, assim, a participação deste receptor na depressão.

Dessa forma, os resultados obtidos no presente estudo, sugerem a possível

participação dos receptores D1 e D2 no efeito antidepressivo do DDE no TNF, que pode estar

relacionada à atuação do DDE, no sistema dopaminérgico, como agonista direto ou como

agonista indireto destes receptores.

Com o objetivo de aprofundar os estudos da atuação do DDE sobre o sistema

dopaminérgico, decidiu-se avaliar a atividade exploratória dos animais, tratados com DDE, no

teste do campo aberto. Foi observado, a partir dos dados obtidos, que o DDE 50 mg/kg e a

bupropiona 30mg/kg produziram um aumento no número de travessias, rearing e grooming

obtidos a partir do campo aberto. SCH 23390 reverteu o número de travessias induzidas por

DDE e bupropiona, mas não foi capaz de reverter o número de rearing e grooming. No

entanto, sulpirida não reverteu o número de travessias, mas foi capaz de reverter o número de

rearing e grooming induzidos pelo DDE e bupropiona. Estes resultados sugerem a possível

atuação do DDE sobre o sistema dopaminérgico, neste modelo experimental, demonstrando a

possibilidade de interação do DDE com os receptores dopaminérgicos D1 e D2, uma vez que

seus respectivos antagonistas, SCH 23390 e sulpirida, foram capazes de reverter os

parâmetros alterados pelo DDE e bupropiona no teste do campo aberto.

O número de travessias, rearing e grooming observado em roedores, no teste do

campo aberto, são parâmetros comportamentais utilizados para análises multifatoriais e para

demonstrar a atividade exploratória dos animais submetidos aos efeitos das drogas em estudo.

Estes parâmetros comportamentais são mais utilizados para demonstrar a influência dos

eventos da vida, tais como ansiedade, e avaliar como tais parâmetros são alterados após a

102

administração de drogas (REX et al., 1996). É importante enfatizar que alguns estudos têm

demonstrado que a locomoção, neste modelo experimental, depende da ativação do receptor

D1, enquanto os comportamentos esteriotipados dependem da ativação do receptor D2

(STARR et al., 1989; USHIJIMA et al., 1995). De fato, Sousa e colaboradores (1999)

demonstraram, em estudos anteriores, que o manzidol, um agonista dopaminérgico, aumentou

o número de travessias dos animais, sugerindo que tais efeitos podem ser mediados por

ativação dopaminérgica. Além disso, dados da literatura demonstraram que o tratamento com

haloperidol, um antagonista dopaminérgico, reduz a locomoção em camundongos

(VASCONCELOS et al., 2003). Outros estudos mostraram que a indução da hiperatividade

dopaminérgica aumentou o comportamento de rearing e grooming observado no teste do

campo aberto (DRAGO et al., 1994; SWANSON et al., 1997).

Desse modo, o aumento dos parâmetros comportamentais induzidos por DDE,

observados no teste do campo aberto, pode estar relacionado com ativação dopaminérgica

direta ou indireta dos receptores, uma vez que estes dados podem estar corroborando com os

apresentados no TNF, onde os efeitos antidepressivos do DDE parecem envolver a ativação

dos receptores dopaminérgicos D1 e D2. Quando drogas em estudo apresentam um aumento

na atividade exploratória dos animais (atividade motora geral) no teste do campo aberto, isto

pode, de certa forma, representar a ação estimulante da droga em estudo, uma vez que drogas

estimulantes aumentam atividade locomotora (NOVAS et al.,, 1988). O DDE (25 e 50 mg/kg)

apresentou aumento da atividade exploratória, no teste do campo aberto, mas não apresentou

qualquer alteração, nos parâmetros observados, quando os animais foram submetidos a dose

de 10 mg/kg de DDE. Além disso, o DDE apresentou, diferentemente do observado no teste

do campo aberto, uma redução no tempo de imobilidade, quando as animais foram tratados

com DDE 10 mg/kg no TNF e no TSC; demonstrando, assim, que DDE possivelmente possui

atividade do tipo antidepressiva e não estimulante de acordo com os dados obtidos nos

modelos experimentais utilizados.

A atuação do DDE no SNC foi, também, avaliado no teste do tempo de sono induzido

por pentobarbital. A redução da latência para o sono e aumento do tempo total de sono são

parâmetros clássicos para relacionar a ação de drogas depressoras do SNC (DANDIYA et al.,

1959). Drogas estimulantes do SNC normalmente promovem efeitos contrários a esse. O

tratamento com DDE (25 e 50 mg/kg, i.p.) não influenciou a latência para o sono e nem o

tempo de sono total induzido pelo pentobarbital sódico. O grupo tratado com diazepam 2

mg/kg, uma conhecida droga sedativa, demonstrou de forma estatísticamente significativa,

uma redução na latência para o sono e um aumento no tempo de sono total induzido pelo

103

pentobarbital sódico. Estes resultados sugerem que o DDE não apresentou nem atividade

sedativa e nem atividade estimulante, o que pode reforçar, indiretamente, a hipótese do efeito

antidepressivo do DDE, com atuação proeminente no sistema dopaminérgico, considerando a

redução do tempo de imobilidade observado no TNF e no TSC e o aumento da atividade

exploratória no teste do campo aberto.

Alterações na coordenação motora podem muito comumente afetar o desempenho dos

animais nos testes TNF e TSC. Por isso, foram investigados os efeitos do DDE no teste do

Rota Rod, um clássico modelo animal para avaliar atividade neuromuscular periférica

(AMARAL et al., 2007; ADZU et al., 2002). Os resultados, do presente estudo,

demonstraram que DDE 25 e 50 mg/kg, diferentemente de diazepam 2 mg/kg, não afetou, a

coordenação motora dos animais neste modelo experimental. Estes dados corroboram com os

dados apresentados no teste do tempo de sono induzido por pentobarbital, mostrando que

DDE não apresenta atividade sedativa e/ou estimulante sobre SNC e/ou periférico.

Além disso, os dados, do presente estudo, demonstraram que os diferentes grupos de

animais tratados com DDE, diferentemente do grupo tratado com diazepam, não alterou a

latência para convulsões e nem preveniu as mortes no teste das convulsões induzidas por

pentilenotetrazol. Prevenção de convulsões, induzidas por pentilenotetrazol em camundongos,

é mais comumente utilizada para realização de screening inicial do potencial ansiolítico de

drogas (SANTOS et al., 1996). No entanto, pode-se inferir que os dados obtidos,

demonstraram que DDE não apresenta atividade sedativa e/ou estimulante sobre SNC e/ou

periférico, uma vez que DDE não induziu qualquer alteração nos parâmetros analisados neste

modelo experimental.

Os parâmetros observados, nos animais, no teste do campo aberto (nº de travessias,

rearing, grooming), “freeze”, defecar e urinar são associados a comportamentos de um animal

ansioso, uma vez que animais ansiosos demonstram uma redução na ambulação associada

com um estado periódico de “freeze”, além da redução normal de comportamentos como

rearing e grooming; concomitantemente com um aumento na atividade autonômica

resultando em aumento do ato de defecar e urinar. Todos estes efeitos são acentuados por

agentes ansiogênicos e atenuados por agentes ansiolíticos (BHATTACHARYA; SATYAN,

1997). Considerando isto, o fato de o DDE 25 e 50 mg/kg ter aumentado os parâmetros

clássicos do teste do campo aberto, no presente estudo, indica a possibilidade de o DDE estar

evidenciando uma atividade ansiolítica concomitantemente com sua ação antidepressiva.

Dessa forma, se fez necessário avaliar atividade do DDE em modelos animais de ansiedade a

fim de observar uma possível atividade ansiolítica do DDE.

104

O presente estudo mostrou que a administração de diferentes doses de DDE, em

camundongos, foi capaz de induzir efeitos ansiolíticos nos testes do labirinto em cruz elevado

(Plus maze; LCE) e placa perfurada (Hole board; HB). O teste LCE é considerado o teste

mais comumente aceito e validado para ensaiar novas drogas ansiolíticas do tipo

benzodiazepínicas (PELLOW et al., 1985; RODGERS et al., 1997).

Os benzodiazepínicos são mais comumente prescritos como depressores do SNC, com

seletiva atividade inibitória sobre o receptor GABAA. Com o aumento da freqüência de

abertura do canal de Cl- e influxo deste através do receptor GABAA, benzodiazepínicos

potencializam o efeito inibitório do GABA (LILLY; TIETZ, 2000). Em ambas as doses e de

forma similar ao diazepam, no teste do LCE, DDE significativamente reduziu a aversão dos

animais aos braços abertos e promoveu um comportamento exploratório, evidenciado pelo

aumento no número de entradas nos braços abertos, aumento no tempo de permanência dos

animais nestes braços e aumento das suas respectivas percentagens; indicando, assim, que

DDE possui efeito ansiolítico. Flumazenil é reconhecido como antagonista competitivo do

receptor de benzdiazepínicos no SNC e foi utilizado para anlisar o possível mecanismo de

ação o qual o DDE está atuando neste modelo experimental.

Os resultados mostraram que o pré-tratamento com flumazenil foi capaz de reverter o

efeito ansiolítico do diazepam, mas não reverteu o efeito ansiolítico do DDE neste modelo

experimental; indicando que o mecanismo de ação ansiolítico do DDE não está relacionado

com a atuação deste sobre o sistema de neurotransmissão gabaérgica.

Com o objetivo de confirmar a atividade ansiolítica do DDE observada no teste do

LCE, decidiu-se utilizar o teste do HB que também evidencia que o comportamento

exploratório é gradualmente inibido pela ansiedade (CRAWLEY, 1985). Este modelo é, assim

como observado no LCE, também utilizado para induzir ansiedade nos animais experimentais

e tem sido demonstrado que drogas ansiolíticas aumentam o número de head-dips (TAKEDA

et al., 1998). Nossos resultados mostraram que DDE, de forma semelhante ao diazepam,

aumentou siginificativamente o número de head-dips; indicando, assim, um possível efeito

ansiolítico para o DDE neste modelo experimental e corroborando, dessa forma, com os

efeitos observados no teste do LCE.

Além disso, DDE demonstrou, de forma siginificativa, um aumento no tempo de

permanência dos animais na divisão (claro), de modo similar ao diazepam, no teste do

Claro/Escuro. Drogas ansiolíticas aumentam a latência para entrada na divisão (escuro), ou

seja, aumentam o tempo de permanência dos animais na divisão (claro) (BHATTACHARYA;

SATYAN, 1997). Dessa forma, pode-se observar um possível efeito ansiolítico do DDE neste

105

modelo experimental; estando em concordância com os dados observados nos outros modelos

de avaliação de atividade ansiolítica como o teste do LCE e o teste do HB.

Com a finalidade de corroborar com as alterações comportamentais evocadas pelo

DDE, especialmente nos testes do nado forçado e campo aberto, decidiu-se quantificar os

níveis de monoaminas (NE, DA e 5-HT) e os níveis de seus metabólitos (DOPAC, HVA e 5-

HIAA) em corpo estriado de cérebros de animais agudamente tratados com DDE nas doses de

10 e 50 mg/kg (via i.p.). Consistentes com os resultados induzidos por DDE no TNF e campo

aberto, a análise neuroquímica realizada através de HPLC revelou um aumento nos níveis de

monoaminas (NE, DA e 5-HT) em corpo estriado de cérebros de camundongos. Além disso,

os metabólitos da dopamina (DOPAC e HVA) e da serotonina (5-HIAA) também

aumentaram significativamente nas doses estudadas.

De acordo com a teoria monoaminérgica, o aumento dos níveis de monoaminas, em

áreas cerebrais, têm sido considerando como possuindo um papel importante na etiologia da

depressão e das desordens de humor (CARDOSO et al., 2009; BOOIJ et al., 2003). Assim,

não é surpreendente saber que a modulação destes neurotransmissores seja o foco da

farmacoterapia das desordens mentais, tais como depressão e ansiedade. Em adição, durantes

anos, a terapia com antidepressivos têm sido utilizada para restabelecer os níveis destas

monoaminas, especialmente noradrenalina e serotonina, que encontram-se reduzidas na fenda

sináptica durante estados depressivos (CERVO; SAMANIN, 1991; KREISS; LUCKI, 1995;

UZBEKOV, 2009). Neste contexto, os resultados deste estudo sugerem que o efeito anti-

imobilidade, evocado pelo DDE no TNF, está diretamente relacionado com um aumento dos

níveis de monoaminas no corpo estriado dos cérebros dos animais, o que então poderia

confirmar um perfil de droga antidepressiva para o DDE. Em adição, considerando que a

depressão está associada com baixos níveis de monoaminas, estudos sugerem que uma

redução dos metabólitos de monoaminas também estão implicadas nesta desordem, uma vez

que as concentrações dos metabólitos de monoaminas são um reflexo da quantidade global de

neurotransmissores dentro do SNC (HYLAND, 2008). De fato, os resultados deste estudo

demonstraram um aumento nos níveis de metabólitos de monoaminas (5-HT e DA), nas doses

estudadas com DDE; corroborando com a hipótese de um perfil de droga antidepressiva para

o DDE.

Considerando os resultados do presente estudo, o mecanismo através do qual o DDE

aumenta os níveis das monoaminas e seus metabólitos ainda não está totalmente claro e

investigações adicionais serão necessárias a fim de que isto possa ser elucidado. No entanto,

estudos anteriores demonstraram que a inibição da monoaminoxidase (MAO) tem um

106

importante papel no mecanismo de ação do efeito antidepressivo do eugenol, um análogo

estrutural do DDE (TAO et al., 2005; KONG et al., 2004). Dessa forma, estas informações

podem contribuir para investigações futuras acerca do mecanismo de ação do DDE no seu

efeito antidepressivo como inibidor da MAO. Vale ressaltar que as drogas inibidoras da MAO

são conhecidas e utilizadas clinicamente no tratamento farmacoterapêutico da depressão

maior típica, incluindo-se doenças marcadas por fobias e ansiedade ou pânico, assim como

disforia e possivelmente transtornos distímicos crônicos (GOODMAN; GILMAN, 2007).

Estas informações associadas com os dados obtidos no presente estudo, poderiam justificar,

em parte, os efeitos antidepressivos e ansiolíticos observados com o tratamento dos animais

com DDE em modelos experimentais de depressão e ansiedade.

No entanto, estudos mais aprofundados, como os ensaios de binding poderão ser

realizados a fim de confirmar o mecanismo de ação do DDE (alvo farmacológico);

considerando que os comportamentos psicológicos dependem de uma complexa interação

entre os diversos sistemas de neurotransmissores no contexto do SNC.

107

8 CONCLUSÕES • Foi demonstrado que o tratamento com DDE reduziu o tempo de imobilidade dos animais,

no TNF e TSC, sugerindo um possível efeito antidepressivo para o DDE apresentado

nestes modelos experimentais;

• Além disso, outros dados evidenciam que este efeito parece estar relacionado com a

possível interação do DDE com os sistemas serotonérgico, noradrenérgico e

principalmente dopaminérgico; resultados observados no TNF, TSC e no teste do campo

aberto;

• DDE apresentou atividade ansiolítica nos testes do LCE, HB e Claro/Escuro sendo que

parece não haver atuação do DDE sobre o sistema gabaérgico, uma vez que flumazenil não

reverteu os efeitos ansiolíticos do DDE no teste do LCE;

• O DDE não apresentou qualquer efeito sedativo e/ou estimulante sobre o SNC e/ou

periférico, uma vez que não alterou qualquer parâmetro observado nos testes do tempo de

sono induzido por pentobarbital, convulsões induzidas por pentilenotetrazol e Rota Rod;

• O DDE aumentou os níveis de monoaminas (NA, DA e 5-HT) e seus metabólitos

(DOPAC, HVA e 5-HIAA) nas doses estudadas, o que pode justificar o perfil de droga

antidepressiva para o DDE, principalmente com os dados comportamentais observados

com a dose de 10mg/kg nos testes do nado forçado e campo aberto;

• Considerando dados anteriores da literatura e os obtidos no presente estudo, é possível que

o mecanismo de ação do DDE ocorra através da inibição da MAO; ressaltando que drogas

inibidoras da MAO possuem atividade antidepressiva e ansiolítica; apesar disso, estudos

futuros são indispensáveis para a elucidação do mecanismo de ação do DDE e o seu alvo

farmacológico nos efeitos antidepressivos e ansiolíticos.

108

REFERÊNCIAS

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efeito ansiolÍtico e antidepressivo do … · se serve para acalmar as dores e curá-las. ... para...

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