UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC

PROGRAMA DE POS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

ANGELA MARTINHA BONGIOLO

EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Eugenia uniflora L.

(MYRTACEAE) SOBRE A HIPERGLICEMIA E DISLIPIDEMIA DE

RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ALOXANA.

CRICIÚMA, MARÇO DE 2008

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ANGELA MARTINHA BONGIOLO

EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Eugenia uniflora L.

(MYRTACEAE) SOBRE A HIPERGLICEMIA E DISLIPIDEMIA DE

RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ALOXANA.

Dissertação apresentada à Diretoria de Pós-graduação da Universidade do Extremo Sul Catarinense- UNESC, para a obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde

Orientador(a): Prof. Dra. Luciane Costa Campos

CRICIÚMA, MARÇO DE 2008

ANGELA MARTINHA BONGIOLO

EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Eugenia uniflora L.

(MYRTACEAE) SOBRE A HIPERGLICEMIA E DISLIPIDEMIA DE

RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR ALOXANA.

Dissertação apresentada à Diretoria de Pós-graduação da Universidade do Extremo Sul Catarinense- UNESC, para a obtenção do título de mestre em Ciências da Saúde

Orientador(a): Prof. Dra. Luciane Costa Campos

CRICIÚMA, MARÇO DE 2008

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, que sempre me ampara no caminho para

alcançar minhas metas.

A minha orientadora Luciane, que além de brilhantemente conduzir o trabalho,

sempre esteve à disposição em todos os momentos. Obrigada! Grande amiga!

A batalhadora professora Tatiana Schoenfelder, que esteve em todos os

momentos orientando este trabalho. Este trabalho não seria realizado sem seu

grande apoio.

As meninas, Larissa e Juana, minhas alunas, porém neste estudo, foram

minhas professoras.

Agradeço também aos técnicos de laboratório, Geovana, Sinara, Mara e

Tiago que estiveram presentes no desenvolvimento do experimento.

A todos os mestres que neste período de alguma forma contribuíram para o

meu crescimento profissional e para a conclusão deste trabalho.

Ao meu filho Lucas que sempre entendeu minha ausência.

Muito obrigada!

RESUMO

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), é conhecida na América do Sul como “pitangueira” ou “nangapiri” e utilizada popularmente para o tratamento de várias patologias, particularmente no diabetes. No Paraguai as folhas dessa espécie têm sido utilizadas para obesidade e diabetes. A planta apresenta compostos fenólicos com ação antioxidante, hipoglicemiante e anti-reumática, sendo utilizados em distúrbios estomacais e como anti-hipertensivos. No entanto os efeitos e mecanismos farmacológicos como hipoglicemiante da E. uniflora não estão totalmente elucidados. A infusão das folhas dessa planta é aplicada popularmente em especial como tratamento do diabetes mellitus, coadjuvante ao tratamento médico convencional. A partir disso objetivou-se verificar a propriedade hipoglicemiante do extrato bruto hidroalcoólico de folhas de E. uniflora (EHE) avaliando também as modificações lipidêmicas decorrentes das alterações metabólicas dessa patologia. Foram utilizados ratos machos Wistar (200-300g). Os animais normoglicêmicos permaneceram em jejum de 12-14 horas durante a noite e foram divididos em: grupos tratados com EHE (125, 250, 500 e 1000 mg/kg v.o., n=6) e controle (veículo solução salina v.o.). O sangue foi coletado por punção ocular 1, 2, 3 e 4 horas após o tratamento e os níveis de glicose sangüínea foram determinados. Para o teste de tolerância à glicose os ratos em jejum foram divididos em 3 grupos: ratos hiperglicêmicos (glicose 4 g/kg, v.o.), tratados com EHE (glicose v.o. + EHE 125, 250, 500 e 1000 mg/kg v.o., n=6) e controle (veiculo solução salina v.o.). O sangue foi coletado 30, 60, 90 e 180 minutos após os tratamentos e determinados os níveis de glicose sangüínea. No experimento em animais diabéticos, o diabetes foi induzido por uma única administração intraperitoneal de 200 mg/kg de monohidrato de aloxana. Após 72 horas o estado diabético foi confirmado pela perda do peso corporal e desenvolvimento de hiperglicemia (níveis séricos >300 mg/dl). Foram então separados e receberam: EHE (125, 250, 500 e 1000 mg/kg v.o.) ou controle (veículo v.o). O sangue foi coletado 1, 2, 3 e 4 horas após os tratamentos e foram determinados os níveis de glicose sangüínea, colesterol total e triglicerídeos. Os resultados obtidos mostraram que o EHE não demonstrou atividade hipoglicemiante em animais normais, tão pouco nos animais que foram submetidos ao teste de tolerância à glicose. Nos animais diabéticos, o EHE mostrou diminuir o triglicerídeo sérico nas concentrações de 500 mg/kg nos tempos 1h (21%, P<0,01), 2h (41%, P<0,001), 3h (55%, P<0,001) e 4h (50%, P<0,001) e para a concentração de 1.000 mg/kg nos tempos 1h (56%, P<0,001), 2h (46%,P<0,001), 3h (57%, P<0,001) e 4 h (70%, P<0,001). Esses resultados sugerem que o EHE de E. uniflora pode ter efeito sobre a hipertrigliceridemia que ocorre em decorrência do diabetes. Entretanto estudos farmacológicos e bioquímicos adicionais devem ser feitos para tentar elucidar o mecanismo pelo qual a planta exerce essa propriedade. Palavras-chave: plantas medicinais; Eugenia uniflora; diabetes mellitus; aloxana; hipertrigliceridemia; etnofarmacologia.

ABSTRACT

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) is a tree species known in South America by the popular names “pitangueira” or “nangapiri”. Leaf infusion is used in Brazilian folk medicine to treat several diseases. In Paraguay, the leaves are used to treat obesity and diabetes. This plant presents phenolic compounds with antioxidant, hypoglycemic and anti-rheumatic effects and is used as anti-hypertensive and to stomach diseases. However the mechanisms responsible for the hypoglycemiant effects of E. uniflora are not clearly understood. Leaf infusion is used popularly to treat diabetes mellitus, associated with the conventional treatment. The aim of this work was to verify the hypoglycemic property of the crude hydroalcoholic extract (EBH) of leaves from E. uniflora and to evaluate the lipidemic alterations resulting of this pathology. Male Wistar rats (body weight 200 – 300g) were used in the experiments. Overnight fasted normal animals were randomly divided into: EBH treated groups (125, 250, 500, 1000 mg/kg v.o., n=6) and control (vehicle saline v. o.). Blood samples were collected from the retro-orbital plexus 1, 2, 3 and 4 h after treatment and blood glucose levels were measured. Fasted rats were divided into three groups for the oral glucose tolerance test (OGTT): hyperglycemic rats (glucose 4 g/kg, v.o.), EBH treated (glucose v.o. + EBH 125, 250, 500, 1000 mg/kg v.o, n=6) and control (vehicle saline v.o.). Blood samples were collected from the retro-orbital plexus before and at 30, 60, 90 and 180 min after the glucose loading, and blood glucose levels were measured. Diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of 200 mg/kg of alloxan monohydrate. Diabetes was confirmed 72 h after the alloxan injection by the development of hyperglycemia, with serum glucose levels > 300 mg/dL and decrease of weight. The animals were then randomly allocated into groups: EBH treated (125, 250, 500 e 1000 mg/kg v.o.) or control (vehicle v.o.). Blood samples were collected from the retro-orbital plexus 1, 2, 3 and 4 h after the treatment and blood glucose, triglyceride and cholesterol levels were measured. EBH tested doses did not present significant lowering of blood glucose on normal rats (Table 1) and oral glucose tolerance test (Table 2). In the groups of diabetic rats, the EBH decreased the triglyceride levels at doses of 125 mg/kg at 2h (43%, P<0.05); 500 mg/kg at 1h (21%, P<0.01), 2h (41%, P<0.001), 3h (55%, P<0.001) and 4h (50%, P<0.001); 1000 mg/kg at 1h (56%, P<0.001), 2h (46%, P<0.001), 3h (57%, P<0.001) and 4 h (70%, P<0.001). Results suggest that the crude hydroalcoholic extract of E. uniflora (EBH) may present a hypotriglyceridemic effect, with implication on diabetes. Further pharmacological and biochemical investigations are necessary to elucidate the mechanism of the hypolipidemic effect of the leaves of this species. Key-words: medicinal plants; Eugenia uniflora; diabetes mellitus; alloxan; hypertriglyceridemia; ethnopharmacology.

5

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................06

1.1 Diabetes X Dislipidemias………………………………………………….08

1.2 Plantas Medicinais… ………...............……………………………………09

1.3 Plantas hipoglicêmicas......................... ...............................................13

1.4 Eugenia uniflora L.................................................................................14

1.5 E. uniflora X Uso tradicional................................. ................................15

1.6 E. uniflora X Ação farmacológica.............................. ...........................17

2 OBJETIVOS....................................... ....................................................................20

2.1 Objetivo geral................................ ..........................................................20

2.2 Objetivos específicos......................... ....................................................20

3 ARTIGO CIENTIFICO............................................................................................21

4 DISCUSSÃO..........................................................................................................37

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................... ................................................48

1 INTRODUÇÃO

O Diabetes mellitus (DM) é um distúrbio metabólico crônico, caracterizado

por níveis elevados de glicemia. A Organização Mundial de Saúde (OMS) e a

Associação Americana de Diabetes (ADA) propuseram incluir quatro classes clínicas

na classificação do Diabetes: DM tipo I, DM tipo II, outros tipos específicos

(secundário a doença pancreática, resistência congênita ou adquirida a insulina,

relacionados a anormalidades da insulina, associado a desnutrição ou fibrocalculoso

e tipo LADA – Latent Autoimmune Diabetes in Adults) e diabetes mellitus gestacional

(DIRETRIZES BRASILEIRA DE DIABETES, 2006).

O DM tipo I é o resultado de uma destruição das células β-pancreáticas com

conseqüente deficiência de insulina. Na maioria dos casos, esta destruição é

ocasionada por auto-imunidade, porém existem casos em que não apresenta estas

evidências, sendo caracterizada como forma idiopática do DM tipo I. O DM tipo I está

presente em cerca de 5 a 10% dos casos. O DM tipo II caracteriza-se por defeitos na

ação e na secreção da insulina. Em geral ambos os defeitos estão presentes quando

a hiperglicemia se manifesta, porém pode haver predomínio de um deles. O DM tipo

II está presente em cerca de 90 a 95% dos casos (DIRETRIZES BRASILEIRA DE

DIABETES, 2006).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), cinco milhões de

brasileiros têm diabetes. O país encontra-se em 6º lugar no mundo em casos dessa

doença. Esta situação é agravada devido às estatísticas mostrarem que 50% das

pessoas não sabem que têm diabetes e 23% conhece seu diagnóstico, mas não

fazem nenhum tipo de tratamento (OLIVEIRA & FILHO, 2004).

7

Pacientes diabéticos estão propensos a complicações a longo prazo, como a

retinopatia, catarata, aterosclerose, neuropatia, nefropatia e dificuldades na

cicatrização de feridas. Como conseqüência, a expectativa de vida dos diabéticos é

somente 2/3 da expectativa da população em geral (AHMED, 2004).

O DM é a maior causa de incapacidade e hospitalização resultando em alto

custo financeiro ($92 bilhões/ano nos EUA) (FOSTER, 1994). As opções para

diabéticos não insulino-dependentes, como modificação na dieta, hipoglicemiantes

orais e insulina tem suas limitações próprias. A princípio o tratamento pode ser

dietético, porém, os agentes hipoglicemiantes tornam-se comumente necessários, e

cerca de um terço dos pacientes acaba necessitando de insulina. No entanto, a

evolução não é retardada, nem evitada pelo tratamento (RANG, 2004).

As complicações do DM parecem afetar órgãos onde as células não

requerem insulina para a utilização da glicose, tais como, sistema nervoso, coração

e pequenos vasos sanguíneos. Como conseqüência, estas células têm alterações

nas concentrações de glicose intracelular durante hiperglicemia (AHMED, 2005).

O papel da hiperglicemia nas complicações tardias não está muito claro,

entretanto existem hipóteses sobre a participação da proteína glicada nestas

complicações. A formação da proteína glicada em condições de hiperglicemia se dá

pela reação de um grupo amino livre da proteína com o grupo carbonil de um

carboidrato, no caso a glicose. Reações oxidativas estão também envolvidas na

formação de produtos finais da glicação que é acelerado na presença de oxigênio e

reduzido em condições anaeróbicas. Substâncias antioxidantes protegem contra

radicais livres derivados da glicação e podem ter efeito terapêutico (AHMED, 2005).

No diabetes, caracterizado pela ausência ou resistência a insulina , a enzima

lípase sensível a hormônio é ativada promovendo a hidrólise dos triglicerídeos

8

armazenados, liberando grande quantidade de ácidos graxos e glicerol, elevando a

concentração plasmática de ácidos graxos livres. O excesso de ácidos graxos no

plasma promove a conversão hepática de diversos ácidos graxos em fosfolipídios e

colesterol, que juntamente com o excesso de triglicerídeos sintetizados no fígado,

são enviados ao sangue nas lipoproteínas (GUYTON, 2006).

1.1 Diabetes X Dislipidemias

Dislipidemias são alterações no metabolismo lipídico que promovem

alterações nos níveis das lipoproteínas, e assim podendo contribuir para o

desenvolvimento de doenças crônicas, sendo classificadas em primárias ou

secundárias. As primárias são associadas a fatores genéticos e as secundárias

podem ser devido a ações medicamentosas (diuréticos, os beta bloqueadores, os

anticoncepcionais, corticosteróides e anabolizantes) ou por conseqüência de alguma

doença, tais como hipotireoidismo, doenças renais parenquimatosas e diabetes

melittus (VIANA e cols. apud DAMASO, 2001).

Tanto o diabetes tipo I como o diabetes tipo II são associados com o risco de

doença cardiovascular, onde as principais causas de mortalidade estão relacionadas

com lesões ateroscleróticas de artérias de grande calibre como o infarto agudo do

miocárdio e o acidente vascular cerebral (BORTOLOTTO, 2007).

Lipoproteínas são complexos macromoleculares que transportam lipídios

plasmáticos hidrofóbicos no plasma, denominadas partículas esféricas, constituídas

por numerosas moléculas de proteínas e lipídios (HARRISON; BRAUNWALD, 2006;

9

RODRIGUES, 2007). As lipoproteínas são classificadas com base nas suas

densidades em cinco classes: quilomícrons, lipoproteínas de muito baixa densidade

(VLDL), lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), lipoproteínas de baixa

densidade (LDL) e lipoproteína de alta densidade (HDL) (HARRISON;

BRAUNWALD, 2006).

No diabetes ocorre o aumento da glicação da lipoproteína de baixa

densidade (LDL). A glicação do LDL não é reconhecida pelo receptor de LDL, mas é

reconhecida pelos macrófagos que apresentam-se aumentados e podem ser

considerados ao menos em parte responsáveis pela hiperlipidemia e aceleração da

formação das células espumosas observadas em pacientes diabéticos. A glicação e

a formação dos produtos finais dessa glicação são acompanhados pelo aumento da

oxidação de LDL e de um aumento nesta oxidação LDL aterogênica ocorrendo no

diabetes. Ao contrário, a glicação da lipoproteína de alta densidade aumenta o

turnover e reduz a eficiência durante transporte reverso de colesterol. A glicação da

HDL reduz a atividade da paraoxonase, uma enzima importante associada a HDL,

importante para a prevenção da oxidação de LDL e adesão de monócitos nas

células endoteliais aórticas, ambos são chaves iniciais durante a formação de placas

ateroscleróticas (AHMED, 2004).

A aterosclerose pode ocorrer, portanto, com freqüência em pacientes

diabéticos de longa data, sendo caracterizada pela deposição de placas

ateroscleróticas nas paredes das artérias, obstruindo a passagem sangüínea e

podendo levar ao infarto miocárdio.

1.2 Plantas Medicinais

10

A utilização de plantas medicinais como fonte de alívio para doenças pode

ser percebida em documentos de civilizações primitivas na China, Índia e Europa.

Acredita-se, portanto, que as farmacopéias tradicionais foram elaboradas ao longo

de muitos séculos de experimentação onde o conhecimento empírico acumulado foi

preservado e é transmitido a gerações futuras (ELISABETSKY; SETZER, 1985).

Os primeiros europeus que chegaram ao Brasil encontraram inúmeras

plantas medicinais utilizadas pelos índios, repassadas e aprimoradas de geração a

geração pelos pajés das tribos indígenas. Os novos conhecimentos sobre a flora

local acabaram-se fundidos àqueles trazidos da Europa. Os escravos africanos

contribuíram para a formação da tradição no uso de plantas medicinais com o uso

de plantas trazidas da África (DI STASI, 1996; SIMÕES e cols., 2002).

Durante o período da industrialização e urbanização, o conhecimento

tradicional em nosso país foi deixado de lado, despertando novamente o interesse

pela fitoterapia com as recentes tendências globais preocupadas com a

biodiversidade e com o desenvolvimento sustentável (SIMÕES e cols., 2002).

A realização de vários estudos nos permite supor que grande parte das

formações culturais do planeta faz uso de plantas para fins terapêuticos. Em muitos

casos esse uso representa o único ou principal recurso medicinal de algumas

comunidades ou grupos étnicos. A prática da terapia com plantas medicinais é tão

antiga quanto é a existência da espécie humana (DI STASI, 1996; SIMÕES e cols.,

2002).

A investigação destes conhecimentos seculares do uso de plantas com

finalidades medicinais por determinados grupos étnicos com o propósito de oferecer

elementos práticos para outros investigadores favorecendo a descoberta de novos

11

medicamentos é, entre outros, um dos objetivos da etnobotânica (ALBUQUERQUE,

2002).

Os resultados de pesquisas com plantas medicinais podem ter

desdobramentos em vários níveis. No nível individual, a descoberta de drogas

protótipo pode determinar a melhoria da qualidade de vida em doenças crônicas ou

a própria sobrevivência do paciente afetado. No nível social, a descoberta de fontes

naturais e locais de compostos químicos importados e/ou o desenvolvimento de

fitoterápicos de fabricação nacional pode ter efeitos econômicos significativos, além

de possibilitar a autonomia de cada país no gerenciamento de suas políticas de

saúde. Por parte do setor empresarial, a indústria farmacêutica movimenta

importantes volumes de capital e a procura de drogas protótipo envolve milhões de

dólares. No nível ecológico, esse crescimento do interesse medicinal aumenta a

importância da conservação da biodiversidade e diversidade cultural do

ecossistema, salvaguardando e perpetuando nossa interdependência de plantas

como fonte de medicamentos de origem vegetal (ELISABETSKY; COSTA-CAMPOS,

1996).

A Organização Mundial da Saúde estima que 65-80% da população mundial

utiliza de algum modo plantas para suprir as necessidades de assistência médica

primária. Já que não há hospitais adequados e médicos treinados, a destruição da

floresta acarreta a extinção da fonte primária de saúde destas populações (BALICK,

1990; CALIXTO, 2000).

Segundo indicam os estudos do NIH (National Institute of Health), nos

Estados Unidos, pelo menos um terço dos pacientes tratados com a medicina

convencional também utiliza fitoterápicos (FETRON & ÁVILA, 1999).

12

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), o uso de plantas

medicinais é uma importante alternativa para tratamento de doenças, principalmente

nos países em desenvolvimento, atendendo os cuidados primários com a saúde.

Além do incentivo quanto ao uso da fitoterapia no sistema nacional de saúde,

também orientam sobre a necessidade de investigações sobre sua segurança,

eficácia, qualidade e acesso e uso racional da medicina tradicional complementada

com a medicina alternativa (OMS, 2002).

No Brasil, o Ministério da Saúde (MS) em 2001 divulgou uma proposta de

política nacional de plantas medicinais e fitoterápicos, tendo como objetivos

estabelecer a relação nacional de medicamentos fitoterápicos para Atenção Básica;

incentivar a pesquisa e o desenvolvimento de plantas medicinais e medicamentos

fitoterápicos; resgatar, valorizar, embasar cientificamente e validar o conhecimento,

a produção e o uso popular de plantas medicinais.

O objetivo desta política é garantir a população brasileira o acesso seguro e

uso racional de plantas medicinais e fitoterápicos, promovendo o uso sustentável da

biodiversidade, o desenvolvimento da cadeia produtiva e da indústria nacional

(Ministério da Saúde, 2001).

A etnofarmacologia vem de encontro com esses objetivos, uma vez que tem

como finalidade básica, em estudos fitoquímicos e farmacológicos, conciliar as

informações adquiridas junto às comunidades locais que fazem uso da flora

medicinal, com o intuito de fornecer dados para produção de medicamentos

economicamente acessíveis à população mundial, especialmente à de países em

desenvolvimento (SIMÕES e cols., 2002).

13

O método etnofarmacológico permite a formulação de hipóteses quanto às

atividades farmacológicas e as substâncias ativas responsáveis pelas ações

terapêuticas relatadas pelas populações usuárias (ELIZABETSKY; SETZER, 1985).

É fundamental que se desenvolva estudos etnofarmacológicos no Brasil,

pois somente cerca de 8% da flora considerada a mais rica do mundo foram

analisadas. Também é necessário que se busque nestas plantas uma opção de

desenvolvimentos de novos medicamentos, objetivando obter fármacos mais

eficazes e específicos (LORENZI; MATOS, 2002).

No Brasil, a população utiliza freqüentemente as plantas medicinais para o

tratamento de diversas moléstias, através do conhecimento popular passado de

geração a geração.

É difícil selecionar espécies vegetais a investigar quanto ao potencial

farmacológico, levando-se em conta a imensa quantidade de espécies a explorar.

Os relatos da medicina popular costumam serem vistos como eficazes na

identificação de espécies vegetais potencialmente terapêuticas e, orientadores das

pesquisas com plantas medicinais (AURICCHIO, 2003).

1.3 Plantas hipoglicêmicas

Várias plantas e compostos derivados de plantas têm sido utilizados há

muito tempo no tratamento do diabetes, basicamente para controlar a glicemia dos

pacientes. As plantas têm sido as origens para o desenvolvimento de medicamentos

e muitos fármacos disponíveis são derivados direta ou indiretamente destas fontes.

14

As informações etnobotânicas relatam que aproximadamente 800 plantas possuem

potencial anti-diabético (ALARCON-AGUILARA, 1998).

Um grande número de princípios ativos derivados destas plantas tem

demonstrado importante atividade e possibilidade de uso no tratamento do DM tipo II

(IVORRA e cols., 1998). Muitos destes compostos são alcalóides, glicosídeos,

polissacarídeos, esteróides, carboidratos, glicopeptídeos, terpenóides, aminoácidos

e íons inorgânicos (GROVER, 2002).

O uso de ervas no controle do diabetes na Índia apresenta grande

prevalência e muitas destas plantas têm sido investigadas quanto aos seus

benefícios nos diferentes tipos de diabetes. Os resultados desses estudos têm sido

descritos em numerosas revistas científicas, destacando algumas espécies como:

Acacia arabica (Lam) (Mimosaceae), Aegle marmelos L. (Rutaceae), Aloe vera L.

(Aloaceae), Eugenia jambolana L. (Myrtaceae), Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) e

muitas outras (MUKHERJEE, 2006).

1.4 Eugenia uniflora L.

A Eugenia uniflora L. pertencente à família Myrtaceae possui algumas

sinonímias, entre elas: Eugenia micheli, Stenocalyx brunneus, Stenocalyx glaber,

Myrtus brasiliana, Plinia rubrea e Plinia pedunculata. Conhecida popularmente como

pitangueira ou pitangueira-vermelha é uma árvore originária do Brasil e distribuída

em toda América do Sul (LORENZI; MATOS, 2002).

15

É um vegetal encontrado em Goiás, Bahia, Mato Grosso do Sul, Mato

Grosso, Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul, sendo

seletiva higrófita, ocorrendo com freqüência em solos úmidos próximos a rios. É

principalmente de fácil adaptação ao clima do sul do Brasil, sendo também

abundante nas matas litorâneas (AURICCHIO, 2003).

A composição fitoquímica das folhas da E. uniflora incluem a presença de

compostos fenólicos, flavonóides, leucoanticianidinas, esteróides e/ou triterpenóides

(BANDONI, 1972; CONSOLINI, 1999; CONSOLINI, 2002; AURICCHIO, 2003).

Schmada-Hirschmann e cols. (1995 apud AURICCHIO; BACCHI, 2003) verificaram a

presença dos flavonóides quercetina e miricetina em folhas de E. uniflora coletadas

no leste do Paraguai. No trabalho publicado por Lee et al. (1997 apud AURICCHIO;

BACCHI, 2003) sobre a investigação dos constituintes fenólicos de folhas de folhas

de E. uniflora, relataram também a presença de eugenioflorina D1 e eugenioflorina

D2, dois taninos macrocíclicos hidrolisáveis, obtidos do extrato metanólico das

folhas.

Os flavonóides são compostos que contêm grupos hidroxila fenólicos que

lhes conferem uma ação antioxidante com potencial terapêutico. O efeito

farmacológico dos flavonóides se deve à sua ação na inibição de certas enzimas e

sua capacidade antioxidante. A quercetina é um destacado integrante do grupo de

flavonóides e por sua ação antioxidante, o seu desempenho terapêutico tem sido

mencionado por vários autores no combate de estresse oxidativo. A quercetina

depura ânions superóxidos e radicais hidroxilas (SOARES, 2002; MILTERSTEINER

e cols., 2003;).

16

1.5 E. uniflora X Uso Tradicional

A E. uniflora foi introduzida na medicina popular pelos Guaranis no século

XV. Na América do Sul, as folhas desta planta têm sido utilizadas para o tratamento

da hipercolesterolemia, gota, hipertensão, antidiarréico, reumatismo, tosse, febre,

doenças hepáticas, amigdalite, dores de garganta e hemorróidas (SCHMEDA-

HIRSCHMANN, 1987; SCHMEDA-HIRSCHMANN, 1998). No Paraguai, as folhas

dessa espécie têm sido utilizadas para obesidade e diabetes (ARAI e cols., 1999).

Em regiões adjacentes do Paraguai as folhas parecem apresentar propriedades

diurética e anti-inflamatória (SCHMEDA- HIRSCHMANN, 1987).

Em um estudo realizado no estado do Rio Grande do Sul, no município de

São José do Polêsine, foi aplicado um modelo de questionário em 85 famílias, com o

objetivo de catalogar as espécies vegetais utilizadas para as doenças de maior

incidência na região e para obtenção de informações etnofarmacológicas. Foram

identificadas 136 espécies sendo a E. uniflora uma das sete espécies citadas da

família das Myrtaceae. Os métodos mais empregados pela população estudada que

utilizam as folhas de pitangueira foi na forma de decocto e infusão e empregadas

para cólica menstrual, diarréia, hipertensão e hipotensão (DORIGONI e cols., 2001).

Garlet e Irgang (2001) realizaram um levantamento de plantas medicinais

utilizadas por mulheres agricultoras de Cruz Alta, Rio Grande do Sul, com o intuito

de resgatar e preservar o conhecimento popular. Foram citadas 189 espécies,

dentre elas as folhas de E. uniflora que eram utilizadas para aliviar as cólicas

menstruais, estomacais, para a diarréia, a hipercolesterolemia, o diabetes e como

17

fortificante. A forma de preparo relatada por essa população foi através de chá das

folhas da planta.

Na cidade de Porto Alegre, no bairro de Ponta Grossa, foram entrevistadas

51 pessoas para verificar a importância das espécies e uso tradicional para esta

população. As folhas de E. uniflora foram as mais citadas com 76% de concordância

e a sua utilização principal relatada foi para tratar “diarréia, disenteria e desarranjo”

(VENDRUSCOLO; MENTZ, 2006).

O uso da infusão das folhas de E. uniflora no tratamento de diversas

patologias é aplicado na medicina popular, em especial como tratamento do

diabetes mellitus coadjuvante ao tratamento médico convencional, ainda que em sua

grande maioria, os pacientes deixam de revelar isso aos médicos.

E. uniflora X Ação Biológica

Schmeda–Hirschmann e cols. (1987) utilizaram diversas frações do extrato

hidroalcoólico das folhas de E. uniflora para verificar a atividade da enzima xantina-

oxidase, responsável em catalisar a oxidação da hipoxantina e xantina em ácido

úrico. Concluíram que ocorre a atividade inibitória desta enzima e em grande parte

deve-se aos flavonóides quercetina e miricetina.

Em outro estudo, o extrato aquoso bruto de folhas de E.uniflora foi

administrado em ratos com o intuito de verificar a ação hipotensora, vasodilatadora e

diurética e para estabelecer a dose terapêutica. Os resultados mostraram uma

18

notável atividade hipotensora após administrar, via intraperitoneal, doses de 1,0

mg/kg de extrato de 30 em 30 minutos por até 4-7 horas em ratos anestesiados com

1,5g de uretano/kg. Para determinar a origem da atividade hipotensora, um grupo de

animais foi tratado com fenilefrina e outro com fenilefrina mais extrato na dose de 8

mg/kg. A pressão arterial de ratos tratados com o extrato de E. uniflora diminuiu em

relação àqueles tratados apenas com fenilefrina. No primeiro grupo o valor de

pressão máxima foi de 120mmHg + 9, já no segundo grupo o valor de pressão

mínima foi de 52 mmHg + 9, considerando que o extrato de folhas de E.uniflora

apresenta atividade hipotensora, porém não competitiva com a fenilefrina, sendo

este um agonista alfa-1. A ação diurética do extrato foi verificada após administração

das doses de 15, 60 ou 120 mg/kg de extrato, solução salina ou amilorida. O extrato

apresentou atividade diurética na dose de 120 mg/kg, considerado quase tão

potente quanto amilorida, que diminui reabsorção de sódio e retém potássio. No

entanto, extrato induziu uma diminuição na excreção de sódio (CONSOLINI, 1999).

Almeida e cols. (1995) utilizaram o extrato aquoso bruto de diversas plantas

entre elas E.uniflora e verificaram a redução de propulsão gastrintestinal quando

relacionado com o grupo controle, indicando que o extrato apresenta ação

antidiarréico, que necessitam de confirmação através de estudos com animais

infectados com agentes enteropatogênicos.

Holetz e cols. (2002) avaliaram a ação antimicrobiana de 13 plantas do

Brasil usualmente empregadas pela população com esta finalidade. Foi testado o

extrato bruto hidroalcoólico em bactérias gram-negativas e gram-positivas. O extrato

bruto de E. uniflora apresentou atividade antimicrobiana moderada para os

microrganismos Staphylococcus aureus com concentração inibitória mínima de 250

µg/mL e Escherichia coli com concentração inibitória mínima 500 µg/mL. Quanto a

19

ação antifúngica, o extrato apresentou boa atividade para Cândida krusei e Cândida

tropicalis, ambos com concentração inibitória mínima de 31,2 µg/mL e atividade

moderada para Cândida parapsilosis (125 µg/mL). Auricchio e cols. (2007),

demonstraram que o extrato de E. uniflora apresenta atividade antimicrobiana mais

expressiva frente à Staphylococcus aureus, Salmonela cholerasuis e Pseudomonas

aeruginosa.

O extrato etanólico de seis plantas foi avaliado por Velásquez e cols. (2003)

para verificar propriedades antioxidantes. O extrato de E. uniflora protegeu contra

peroxidação lipídica enzimática e não enzimática de membranas microssomal de

ratos e atuou como “scavenger” de radicais livres superóxidos e radical 1,1-difenil-2-

picril hidrazina (DPPH).

Os estudos sobre os efeitos do extrato hidroalcoólico dias folhas de E.

uniflora relatam melhora sobre a hiperglicemia e hipertrigliceridemia pós-prandial,

sugerindo mecanismos de inibição da decomposição de açúcares e gorduras, e

absorção de glicose (ARAI e cols., 1999). Os pesquisadores atribuíram ao extrato

obtido por infusão de folhas de E. uniflora, uma atividade inibitória sobre as enzimas

α-glicosidase, maltase e sucrase em camundongos, sugerindo, portanto, ser útil no

tratamento de diabetes.

Entretanto, são necessários mais estudos sobre a propriedade

hipoglicemiante em animais diabéticos avaliando também as alterações lipidêmicas

decorrentes das alterações metabólicas dessa patologia. A realização deste estudo

justifica-se para um melhor esclarecimento quanto à eficácia do extrato

hidroalcoólico de folhas de E. uniflora no tratamento hipoglicêmico.

20

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL:

Investigar o efeito do extrato hidroalcoólico das folhas de Eugenia uniflora L.

sobre as alterações glicêmicas e lipidêmicas em ratos.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

- Avaliar a atividade hipoglicemiante do extrato hidroalcoólico de E. uniflora

em ratos normais, hiperglicêmicos e diabéticos induzidos por aloxana.

- Verificar ação hipolipidêmica do extrato hidroalcoólico de E. uniflora em

ratos diabéticos induzidos por aloxana.

21

3 ARTIGO CIENTIFICO

Angela M. Bongiolo, Larissa L. Pavei, Juana V. Reus, Tatiana Schoenfelder, Luciane

Costa-Campos. Evaluation of the hydroalcoholic extract of Eugenia uniflora L.

(Myrtaceae) in animal model of diabetes.

Submetido a Journal of Ethnopharmacology

22

Evaluation of the hydroalcoholic extract of Eugenia uniflora L. (Myrtaceae) in animal model of diabetes.

Ângela Martinha Bongioloa,b, Larissa Lodetti Paveib, Juana Villatore Réusb, Tatiana

Schoenfelderb,c, Luciane Costa-Camposa,c,d*

a Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul

Catarinense, Criciúma – SC, Brazil

b Curso de Nutrição, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Universidade do

Extremo Sul Catarinense, Criciúma – SC, Brazil

c Laboratório de Etnofarmacologia, Universidade do Extremo Sul Catarinense,

Criciúma – SC, Brazil

d Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Universidade do Extremo

Sul Catarinense, Av. Universitária nο1105, CEP: 88806-000, Criciúma – SC, Brazil

_____________________________________________________________________

* Correspondence address:

Luciane Costa Campos, Programa de Pós Graduação em Ciências Ambientais,

Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC

Av. Universitária nο1105, CEP: 88806-000, Criciúma – SC, Brazil

e-mail: luciane.costacampos@gmail.com

Phone: (+55) 48 3431-2643 FAX: (+55) 48 3431-2644.

23

Abstract:

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), “pitangueira”, is widely dispersed in southern Brazil

because of its medicinal properties. The infusion of the E. uniflora leaves is used for

various pathologies, especially on the diabetes mellitus treatment as a supporter for

the conventional medical treatment. This study aimed to check the hyperglycemic

and hyperlipidemia action of the E. uniflora hydroalcoholic extract (EHE) in diabetic

rats induced with alloxan. The animals were divided in three groups for the

hypoglycemic effect evaluation: normal rats, alloxan diabetic rats, and hyperglycemic

rats. Glucose serum was analyzed after the treatment of the animals. Triglyceride

and cholesterol levels were determined on the diabetic animals induced with alloxan.

The EHE did not show hypoglycemic activity on the normal nor the hyperglycemic

animals. However, the EHE was effective lowering the blood triglyceride in

concentrations of 500 mg/kg on times 1, 2, 3 and 4 hours after the extract

administration and in concentration of 1,000 mg/kg on times 1, 2, 3 and 4 hours. Our

results suggest that E. uniflora could be a potential candidate as a hypolipidemic

agent.

Keywords: Eugenia uniflora, hypolipidemic, alloxan, diabetes mellitus, medicinal

plants, dyslipidemia.

24

1. Introduction

The Diabetes Mellitus (DM) is the greatest cause of disability and hospitalization

resulting in a high financial cost, about $92 billions/year in the USA (Foster, 1994,

Vats et al., 2002). The DM is an endocrine disorder characterized by the

hyperglycemia due to the total or partial lack of insulin or insulin-resistant. Diabetic

patients are inclined to long term complications such as retinopathy, cataract,

atherosclerosis, neuropathy and difficulties with healing their wounds. The DM

complications seem to affect the organs where the cells do not require insulin for the

use of glucose, such as the nervous system, the heart, and small blood vessels. As a

consequence, these cells have high concentrations of intracellular glucose during the

hyperglycemia (Ahmed, 2005).

Together with the hyperglycemia and the abnormalities on the blood lipid levels,

the diabetes results in microvascular and macrovascular complications, being the

greatest cause of morbidity and mortality in diabetic patients (Huse et al., 1989). The

diabetes is associated with alterations on the profile of plasmatic lipids and

lipoproteins and with the increase of atherosclerosis risk, coronary insufficiency and

stroke of the myocardium (Ravi et al., 2005).

The potential role of medicinal plants as hypoglycemic agents has been reviewed

by several authors, and is supported by ethnobotanical surveys and the use of

traditional medicines in numerous cultures (Ivorra et al., 1988; Jouad et al., 2001;

Grover et al., 2002; Yeh et al., 2003; Biesalski, 2004; Li et al., 2004, Afifi et al., 2005).

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), “pitangueira”, is widely spread in South America,

South Asia and Africa. In South America, this plant leaves have been used on the

25

treatment of hypercholesterolemia, gout, hypertension, anti-diarrhea, arthritis, cough,

fever, hepatic diseases, tonsillitis, sore throats and hemorrhoids (Schmeda-

Hirschmann et al., 1987, Schmeda-Hirschmann, 1988).

In Paraguay the leaves of this species have been used for obesity and diabetes

(Ferro et al., 1988). However their pharmacological mechanisms and effects in

hypoglycemia are not totally clear (Grover et al., 2002; Arai et al., 1999). In southern

Brazil the E. uniflora leaf infusion is used to treat various pathologies in popular

medicine, especially as a treatment for diabetes mellitus, as a co-adjuvant to the

conventional medical treatment.

There are few studies about the effects of E. uniflora on diabetes and its

complications. Studies concerning the effects of the hydroalcoholic extract of E.

uniflora leaves report a decrease of the hyperglycemia and postprandial

hypertriglyceridemia, suggesting inhibition mechanisms on the breaking up of sugars

and fats, and absorption of glucose (Arai et al., 1999). The authors also attributed to

the infusion of E. uniflora leaves an inhibitory activity on α-glycosidase enzymes,

maltose and sucrose in mice, suggesting, therefore, to be useful on the treatment of

diabetes. However, more studies are needed on the hypoglycemic properties of E.

uniflora on diabetic animals, also evaluating the lipidemic alterations deriving from

the metabolic modifications typical of this pathology. The present work evaluates the

effects of the hydroalcoholic extract of the leaves of E. uniflora on the hyperglycemia

and hyperlipidemia in alloxan-induced diabetic rats.

2. Materials and Methods

2.1 Plant material and preparation of the hydroalcoholic extract (EHE)

26

The leaves of E. uniflora were collected in Nova Veneza (Santa Catarina, Brazil).

They were taxonomically authenticated by Dr. Vanilde Citadini-Zanete and a voucher

specimen of the plant (CRI7374) was deposited in the herbarium Pe. Dr. Raulino

Reitz at Universidade do Extremo Sul Catarinense (Criciúma, Brazil).

For the preparation of the EHE, leaves of E. uniflora (300 g) were macerated in

ethanol 70% (3 L) at room temperature for 10 days. The final solution was filtrated

and dried at 42° C by rotary evaporator (Fisaton 80 2D; 117 RPM). The concentrated

extract (EHE) was stored at 4°C in refrigerator.

2.2 Animals

Male albino Wistar rats (body weight 200 – 250g) were used in the experiment.

These rats were housed in an air-conditioned room (21°C) with controlled lighting

(lights on from 07:00am to 07:00pm). The animals were maintained with pelleted

food (Supra Lab, Alisul – Braço do Norte - SC), while tap water was available ad

libitum. Before experimentation the animals were fasted for 12-14 hours but had free

access to water. Rats were monitored and maintained in accordance with the ethical

recommendations of the Brazilian Veterinary-Medicine Council (CMV) and the

Brazilian College of Animal Experimentation (COBEA). All procedures were carried

out according to institutional policies on the handling of experimental animals

(CEP515/2007).

2.3 Study of EHE in normal rats

Overnight fasted animals were randomly divided into three groups of six rats:

group I received the vehicle only (v.o. control); group II received EHE (125,250, 500,

1000 mg/kg, v.o.); group III received glibenclamide (200 mg/kg, v.o.)

27

Blood samples were collected from the retro-orbital plexus before the

administration of the extract and 1, 2 and 3 hours subsequently. Blood glucose levels

were then measured.

2.4 Oral glucose tolerance test

The oral glucose tolerance test (OGTT) was performed on normal rats. Fasted

rats were divided into three groups of six animals: group I received glucose (4 g/kg,

v.o.); group II received glucose (4 g/kg, v.o.) plus EHE (125, 250, 500, 1000 mg/kg,

v.o.); group III received glucose (4 g/kg, v.o.) plus glibenclamide (200 mg/kg, v.o.).

Blood samples were collected from the retro-orbital plexus before and at 0.5, 1,

1.5 and 3 hours after the glucose loading, and blood glucose levels were then

measured.

2.5 Study of EHE in diabetic rats

Diabetes was induced by a single intraperitoneal (IP) injection of 200 mg/kg of

alloxan monohydrate (dissolved in water just before use) (Schoenfelder et al., 2006).

Animals whose development of hyperglycemia was confirmed (around 90%) 72 h

after the alloxan injection, with serum glucose levels > 300 mg/dL were considered

diabetic. These were used for the study and randomly allocated into groups of six

rats: group IV was considered control and received the vehicle only (v.o.); group V

received EHE (125, 250, 500 and 1000 mg/kg, v.o.); group VI received glibenclamide

(200 mg/kg, v.o.).

Blood samples were collected from the retro-orbital plexus before the

administration of EHE and 1, 2, 3 and 4 hours after the treatment and blood glucose,

cholesterol and triglycerides levels were then measured.

28

2.6 Biochemical estimates

Fasting blood glucose, cholesterol and triglyceride (TG) levels were measured

using standard methods (Trinder, 1969; Allain et al., 1974; Bucolo and David, 1973).

2.7 Statistical analysis

The data are expressed as mean ± SEM. One-way analysis of variance (ANOVA)

followed by Bonferroni’s post-test was used to identify significant differences between

the groups. Differences were considered to be significant when P ≤ 0.05.

3. Results

3.1 Effect of EHE on normal rats

The effects of the treatment with E. uniflora extract and glibenclamide on the

blood glucose concentration in normal fasted rats are shown in Table 1. None of the

tested doses presented any significant lowering of blood glucose when compared to

the “zero time” of each respective dose. Glibenclamide exhibited a reduction in the

glucose concentration of 30% (P<0.01) after 1 h.

3.2 Effect of EHE on the oral glucose tolerance test

Within 0.5 h of starting the glucose tolerance test, blood glucose concentration

almost doubled from its initial control level. This hyperglycemia was maintained until

1 h, before beginning to decrease (Table 2).

None of the tested doses of E. uniflora prevented the increase in blood glucose

levels after glucose administration when compared to the “zero time” of each

29

respective dose. Glibenclamide did not exhibit a significant reduction in blood

glucose levels (Table 2).

3.3 Effect of EHE on blood glucose, triglyceride and cholesterol levels in alloxan-

induced diabetic rats

The administration of alloxan (200 mg/kg) significantly decreased (19%, P<0.05)

the body weight of the rats while it significantly increased (63%, P<0.001) the blood

glucose concentrations when compared to those of the normal animals (Table 3).

The administration of alloxan (200 mg/kg) significantly decreased (13%, P<0.05)

the body weight of the rats while increasing the blood glucose (115%, P<0.001),

cholesterol (34%, P<0.001) and triglyceride (52%, P<0.001) concentrations when

compared to those of the normal animals (data not shown).

The acute treatment with different concentrations of E. uniflora extract in alloxan-

induced diabetic rats did not show significant decrease on the blood glucose and

cholesterol levels (Table 4). The glibenclamide-treated animals showed a significant

reduction in blood glucose levels at 1 h (34%; P<0.01), 2 h (40%; P<0.001) and 4h

(45%; P<0.001) (Table 4).

The treatment with EHE (500 mg/kg) significantly decreased triglyceride levels at

all times tested: 1 h (21.5%, P<0.01), 2 h (41.6%, P<0.001), 3 h (55.6%, P<0.001)

and 4 h (49.8%, P<0.001). The treatment with EHE (1000 mg/kg) also significantly

decreased triglyceride levels at all times tested: 1h (56.4%, P<0.001), 2h (46.1%,

P<0.001), 3h (56.9%, P<0.001) and 4h (70.75%, P<0.001) (Table 4).

4. Discussion and Conclusion

30

The treatment with the crude extract of E. uniflora did not alter, in any doses, the

blood glucose levels on the different groups analyzed. However, the EHE was

effective on significantly decreasing the blood triglycerides levels on the diabetic

animals. The elevated lipid levels derive from the metabolic changes induced by the

diabetes on the animals. However the EHE did not decrease the blood cholesterol

levels.

The greatest decrease of the triglycerides levels with the doses of 500 mg/kg and

1000 mg/kg of EHE were observed respectively three hours (55.6%) and four hours

(70.75%) after the treatment.

The results obtained in our experimental model of diabetes confirm the results

described by Arai et al. (1999). In their studies the authors administrated different

doses of fractions of the E. uniflora hydroalcoholic extract in mice followed by oral

administration of corn oil (5 mL/kg). The aqueous fraction and the precipitate showed

significant effect, inhibiting the increase of plasmatic triglyceride concentration.

Arai et al. (1999) suggest that the effect of EHE over the pancreatic lipase in an

in vitro experimental model can be related to the inhibition of this enzyme, being it

responsible for the lipid breaking up in the intestines. In their study, the enzyme

activity was inhibited by the action of different fractions and doses of the E. uniflora

extract, suggesting its action occurs by inhibiting the breaking up of sugars and fat in

the intestines.

In another study by Ferro et al. (1988) the results achieved suggest the E.

uniflora extract can promote a protective effect on the triglyceride levels and Very

Low Density Lipoprotein (VLDL) in Cebus apella male monkeys.

31

In summary, the E. uniflora extract showed hypolipidemic activity in diabetic

animals. This has clinical implications, since if used as a hypoglycemic agent, it may

reverse the dyslipidemia associated with diabetes and may prevent the

cardiovascular complications which are very prevalent in diabetic patients. The

present work is the third investigating the effects of E. uniflora on diabetes and our

results suggest that this plant may be a potential hypolipidemic agent on the

treatment of dyslipidemia in humans, being necessary more investigations.

Table 1. Acute effect of EHE in normoglycemic rats and in alloxan-diabetic rats

Blood glucose level (mg/ dl) Time (h) Group I (control) Group II E. uniflora - treated

Group III Glibenclamide

125 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg 1.000 mg/kg 200 mg/kg 0 160.12 ± 3.69 108.24 ± 2.14 110.13 ± 3.27 99.92 ± 5 .11 111.30 ± 3.61 122.75 ± 3.54 1 115.28 ± 3.15 *** 122.63 ± 3.88 134.64 ± 7.45 114.99 ± 6.58 156.14 ± 6.37 ** 86.40 ± 4.60 ** 2 159.87 ± 3.84 108.98 ± 3.92 119.28 ± 3.80 116.16 ± 3.88 133.38 ± 7.37 98.57 ± 9.88 3 189.12 ± 5.56 *** 112.26 ± 6.56 100.66 ± 9.69 140.47 ± 8.78 * 163.63 ± 9.25 *** 126.73 ± 7.64 4 195.15 ± 2.35 *** 109.70 ± 5.35 101.03 ± 8.30 134.70 ± 12.24 * 165.01 ± 6.16 *** 100.37 ± 5.27

Values are expressed as mean ± SEM; n=6 in duplicates for each group.

(*), (**); (***) Statistically significant difference to the corresponding zero time value, P≤0.05, P≤0.01

and P≤ 0.001, respectively.

32

Table 2. Effect of EHE on oral glucose tolerance

Time (min)

Blood glucose level (mg/ dl)

Group I (control) Group II glucose plus E. uniflora

Group VI glucose plus Glibenclamide

Glucose 125 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg 1.000 mg/kg 200 mg/kg

0 72.02±6.76 119.65± 6.01 119.57±6.26 135.12±6.31 125.00±8.70 117.84±4.16 30 152.62±3.97 *** 1145.14± 8.31 136.32±10.75 213.42±6.59 *** 215.55±6. 01 *** 173.00±8.55 ** 60 165.57±5.94 *** 1179.47± 7.67 *** 182.92±10.28 *** 217.37±10.53 *** 215.07±13.06 *** 132.05±6.94 90 176.50±13.00 *** 1176.16± 5.48 *** 195.45±4.79 *** 211.61±8.74 *** 242.08±15.66 *** 140.23±11.50 180 113.87±7.41 * 157.30± 4.01 ** 164.78±6.96 ** 178.74±5.79 * 176.79±5.38 * 125.47±8.76

Values are expressed as mean ± SEM; n=6 in duplicates for each group.

(*); (**); (***) Statistically significant difference to the corresponding zero time value, P≤0.05, P≤ 0,01

and P≤ 0.001 respectively.

Table 3. Effect of alloxan over the body weight and blood glucose level, at the third day, after induce diabetes

Group Tratament Body weight (g) Blood glucose(mg/dL)

I Normal 239.77± 3.60 162.45 ± 3.01

II Alloxan 194.45± 6.51 434.75 ± 48.02

Values are expressed as mean ± SEM; n=10 in duplicates for each group.

(*); (****) Statistically significant difference to the corresponding zero time value, P≤0.05, P≤ 0,0001

respectively.

33

Table 4. Acute effect of EHE in alloxan-diabetic rats

Time (h) Blood glucose level (mg/ dl)

Group IV (control)

Group V E. uniflora - t reated Glibenclamide

125 mg/kg 250 mg/kg 500 mg/kg 1.000 mg/kg 200 mg/k g

0 345.23 ± 3.93 323.54 ± 5.26 329.71 ± 4.92 417.37 ± 4.58 411.23 ± 20.53 345.82 ± 16.13 1 349.82 ± 1.76 331.77 ± 5.64 343.26 ± 10.91 428.48 ± 6.56 443.22 ± 10.14 228.90 ± 11.34 ** 2 362.07 ± 6.54 335.20 ± 4.75 340.13 ± 13.23 429.28 ± 7.55 433.19 ± 10.61 205.53 ± 16.76 *** 3 344.85 ± 15.75 341.17 ± 6.12 341.84 ± 10.46 426.10 ± 4.29 441.95 ± 3.77 270.64 ± 8.88 4 355.38 ± 4.46 342.68 ± 8.85 351.42 ± 9.84 440.85 ± 6.50 431.71 ± 10.95 189.27 ± 32.62 ***

Time (h) Blood cholesterol level (mg/ dl)

0 86.84 ± 5.07 51.10 ± 5.41 80.85 ± 7.21 99.78 ± 8. 48 77.64 ± 8.62 76.36 ± 5.89 1 56.77 ± 2.46 ** 53.04 ± 6.04 78.36 ± 5.24 117.80 ± 5.53 63.70 ± 4.52 73.21 ± 2.32 2 83.94 ± 7.96 49.01 ± 4.70 82.16 ± 8.77 97.65 ± 8. 87 56.24 ± 7.14 73.48 ± 3.96 3 53.29 ± 2.75 ** 49.87 ± 4.37 90.96 ± 8.67 85.40 ± 7.57 54.68 ± 3.85 95.90 ± 5.44 * 4 44.12 ± 7.34 *** 47.13 ± 6.45 89.57 ± 7.32 77.00 ± 8.00 51.52 ± 7.86 80.58 ± 3.61

Time (h) Blood trigliceride level (mg/dl)

0 549.56±19.16 261.63 ± 35.95 872.38 ± 50.63 1.494.15 ± 34.96 496.48 ± 10.20 305.83 ± 30.03 1 429.41±20.31 ** 196.40 ± 39.81 853.25 ± 41.58 1.172.19±70.08 ** 216.31 ± 4.60 *** 363.75 ± 17.26 2 536.67±31.76 147.46 ± 35.81 732.70 ±103.60 872.19 ±57.88 *** 267.34 ±23.88 *** 399.66 ± 17.42 * 3 537.87±4.68 294.14 ± 29.63 839.68 ± 31.37 663.25 ±60.20 *** 213.96 ±10.11 *** 358.81 ± 7.91 4 664.34±14.18 ** 254.52 ± 22.00 843.97 ± 29.94 748.62 ±29.78 *** 145.22 ± 4.97 *** 325.59 ± 9.43

Values are expressed as mean ± SEM; n=6 in duplicates for each group.

(*); (**); (***) Statistically significant difference to the corresponding zero time value,

P≤0.05, P≤ 0,01 and P≤ 0.001 respectively.

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37

4 Discussão

No presente estudo, a atividade hipoglicêmica do extrato bruto hidroalcoólico

de folhas de E. uniflora (EHE) foi avaliada em três grupos de ratos experimentais:

ratos normais; hiperglicêmicos e diabéticos induzidos por aloxana.

Os resultados obtidos nesse experimento mostraram que o tratamento com

diferentes doses do extrato da planta em estudo não foi capaz de reduzir os níveis

glicêmicos, sendo verificado esse mesmo resultado em todos os grupos

experimentais. Entretanto, no grupo de animais diabéticos induzidos por aloxana (2,

4, 5, 6-tetraoxypyrimidine; 5,6-dioxyuracil), o extrato induziu uma redução

significativa nos níveis de triglicerídeos. As reduções nos níveis de triglicerídeos

plasmáticos foram significativas nas doses de 500 mg/kg e 1.000 mg/kg de EHE nos

tempos 1, 2, 3 e 4 horas após a administração do extrato. Contudo, nos animais

tratados com o extrato não foi observado decréscimo em relação aos níveis de

colesterol.

Os tratamentos convencionais utilizados em pacientes diabéticos incluem a

administração de insulina e/ou vários agentes antidiabéticos de uso oral. Os

antidiabéticos orais disponíveis são as sulfunoréias, biguanidas, inibidores

glucosidase e glinidas que podem ser utilizados como terapia única ou em

combinação com a insulina para melhor regulação da glicemia.

Neste estudo, foi utilizada a glibenclamida como grupo controle positivo, no

qual verificou-se significativa redução nos níveis séricos de glicose dos animais

diabéticos (1 h (34%; P<0.01), 2 h (40%; P<0.001) e 4h (45%; P<0.001). Nos

animais normais uma redução de 30% ocorreu 1 hora após a administração de

38

glibenclamida e no teste de tolerância à glicose não houve redução na glicose

sérica.

O hipoglicemiante oral, glibenclamida, também conhecido como glibura na

América do Norte, atua estimulando a liberação de insulina endógena. Por essa

razão não possui ação em pacientes que não apresentam função residual de células

β-pancreáticas (MARTINS e cols., 2007).

A partir dos resultados obtidos nesse estudo, sugere-se que na indução do

diabetes por aloxana não ocorreu destruição total das células β–pancreáticas, uma

vez que a glibenclamida provocou reduções significativas na glicemia nos grupos de

animais diabéticos alloxanizados.

A ação diabetogênica do aloxana foi reportada por Dunn, Sheehan e

McLethie (1943 apud SZKUDELSKI, 2001) em seu estudo sobre os efeitos dessa

substância em coelhos. Os autores concluíram nesse trabalho que o aloxana induz

necrose específica das ilhotas pancreáticas. A partir daí, essa substância tem sido

comumente utilizada como modelo animal de indução de diabetes mellitus insulino-

dependentes. O aloxana exerce sua ação quando administrado parenteralmente:

intravenosa, subcutânea ou intraperitonealmente. A ação do aloxana no pâncreas é

precedida por uma rápida captação das células β-pancreáticas. Esse mecanismo

tem sido proposto como um dos mais importantes fatores que determinam a

diabetogenicidade da substância.

Além disso, tem sido proposto também que alteração na homeostase

intracelular de cálcio é um importante fator diabetogênico provocado pelo aloxana. A

afluência do cálcio pode resultar da capacidade do aloxana de despolarizar as

células β–pancreáticas. Portanto, a ação tóxica do aloxana sobre essas células é

39

devido a diversos processos, como inibição da glucoquinase, geração de radicais

livres e distúrbios na homeostase intracelular do cálcio (SZKUDELSKI, 2001).

Sy e cols. (2005) relataram em seu estudo sobre a avaliação da ação do

extrato aquoso de Vernonia colorata Willd. Drake (Composeae) em ratos, que

ocorreu a indução de diabetes não insulino-dependentes com a administração de

aloxana via intraperitoneal. Estes autores sugerem que, na dose de 120 mg/kg de

aloxana, as células β-pancreáticas foram parcialmente destruídas. Possivelmente a

insulina é secretada, porém em quantidades insuficientes para manter os níveis de

glicemia adequados. A partir desse estudo sugere-se, portanto, que o aloxana pode

ser utilizado como modelo de diabetes tanto do tipo I como do tipo II.

Poucos estudos têm relatado o efeito da E. uniflora sobre o diabetes, como

indica a utilização popular. Em estudo realizado por Arai e cols. (1999) foram

utilizados camundongos para avaliar os efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de

E. uniflora sobre hiperglicemia. O estudo consistiu em administrar diferentes frações

de extrato hidroalcoólico 70% após a administração oral ou intraperitoneal de glicose

e sacarose. No grupo controle positivo foi administrado tolbutamida ou metformina e

voglibose. Os autores observaram, a partir dos seus resultados, que o extrato

hidroalcoólico na dose de 300 mg/kg provocou uma redução nos níveis séricos de

glicose nos animais tratados com glicose por via oral, mais precisamente pelas

frações do n-hexano do extrato e precipitado. Nos grupos controle positivo, os

fármacos tolbutamida e metformina inibiram significativamente o aumento nos níveis

de glicemia pela glicose via oral. No entanto, nos camundongos tratados com glicose

pela via intraperitoneal não foi verificada redução da glicemia pelo extrato. Porém, os

efeitos inibitórios da tolbutamida e metformina também foram observados após a

administração intraperitoneal de glicose. Nos camundongos que receberam

40

sacarose via oral, todas as frações do extrato inibiram o aumento da glicose

plasmática significativamente. No grupo controle positivo, verificou-se que a

voglibose teve ação importante na inibição da elevação da glicemia por sacarose

oral. Foram realizados também experimentos para verificar os efeitos do extrato de

E. uniflora e suas frações sobre a enzima α-glicosidase. Como resultado foi

verificado que as frações aquosa, precipitado e a fração por ultrafiltração da solução

aquosa do extrato inibiram a atividade da maltase e sucrase de forma dose

dependente. Os autores sugeriram como mecanismo de atividade hipoglicêmica do

extrato de E. uniflora a inibição da decomposição de açúcares e inibição da

absorção de glicose, corroborando com a utilização de folhas de E. uniflora para

diabetes e obesidade.

No presente estudo, os animais utilizados foram ratos nos quais foi

administrada uma dose única de aloxana 200 mg/kg intraperitonealmente e assim

induzidos ao diabetes. Após 72 horas da confirmação do estado diabético pelo

aloxana, foi realizado o experimento que consistiu da administração do extrato nas

doses de 125, 250, 500 e 1.000 mg/kg e coleta de sangue antes e 1, 2, 3 e 4 horas

após o extrato, para realizar as análises laboratoriais. No entanto, os resultados

obtidos nesse experimento não mostraram alterações nos níveis plasmáticos de

glicose, diferentemente do que foi constatado por Arai e cols. (1999). A diferença

entre os resultados obtidos no presente estudo e no trabalho realizado por esses

autores pode ser analisada e justificada pelas diferenças metodológicas entre os

experimentos ou pelo fato do extrato ser utilizado na forma de frações de diferentes

concentrações de solventes, os quais foram utilizados por aqueles autores em seu

estudo.

41

Outro resultado obtido na presente avaliação foi uma ação hipolipidêmica do

EHE nos animais diabéticos. O tratamento com as doses de 500 e 1.000 mg/kg de

EHE reduziu significativamente os níveis plasmáticos de triglicerídeos em todos os

tempos testados: 1, 2, 3 e 4 horas após a administração do extrato. Entretanto não

foi observada redução nos níveis de colesterol sérico nos animais tratados.

Em estudo realizado por Ferro e cols. (1988) foi avaliado o efeito do extrato

etanólico das folhas de E. uniflora sobre o metabolismo de lipídios em macacos

Cebus apella. Foi induzida experimentalmente a hipercolesterolemia e

hipertrigliceridemia nos animais utilizados para esse estudo. Os animais foram

divididos em grupo controle e grupo teste, recebendo ração comercial padrão,

suplementada com frutas frescas duas vezes por semana e com multivitamínicos,

cálcio e ferro uma vez na semana. Diariamente os animais recebiam uma emulsão

lipídica rica em gorduras e colesterol. A administração do extrato hidroalcoólico de E.

uniflora 70% com a emulsão lipídica foi iniciada quando os níveis séricos de

colesterol eram superiores a 30% comparados aos valores de referência. O extrato

foi administrado via oral diariamente durante 14 dias. Depois deste período, as duas

preparações foram suspensas e as alterações sorológicas foram avaliadas nas duas

semanas seguintes. Os resultados obtidos nesse estudo mostraram que o extrato

das folhas de E. uniflora apresenta ligeira atividade sobre o metabolismo de lipídios.

Em ambos os grupos, teste e controle, não houve alterações importantes na uremia

e glicemia durante o tratamento. Entretanto, diferenças significativas foram

observadas nos níveis de triglicérides e VLDL duas semanas depois da suspensão

da administração da emulsão lipídica e do extrato. A partir dos resultados, os

autores sugerem que o extrato de E. uniflora pode ser capaz de exercer um efeito

42

protetor em relação aos níveis de triglicerídeos e VLDL em animais

hipertrigliceridêmicos e hipercolesterêmicos.

No presente estudo pôde-se constatar que os resultados obtidos vêm ao

encontro com os apresentados por Ferro e cols. (1998) no que se refere ao efeito

sobre os níveis séricos de triglicerídeos. No entanto, não foram avaliados os níveis

de lipoproteínas séricas, não podendo, dessa forma, comparar-se todos os

resultados aos do estudo de Ferro e cols. (1998). Porém de acordo com Lameu

(2005), as partículas de VLDL podem ser liberadas na circulação com a

responsabilidade de transportar os triglicerídeos endogenamente sintetizados para

os tecidos extra-hepáticos, como o tecido adiposo e muscular. Entende-se, portanto,

que níveis aumentados da partícula VLDL estão diretamente ligados ao aumento de

triglicerídeos plasmáticos. Pode-se dessa forma supor que no presente estudo existe

a possibilidade de os níveis de VLDL estarem elevados, mesmo não tendo sido

analisados, sendo relevante serem avaliados em estudos posteriores.

No trabalho realizado por Arai e cols. (1999) foi investigada a ação de

frações do extrato hidroalcoólico 70% sobre os níveis séricos de triglicerídeos em

camundongos. Os camundongos do grupo teste receberam por via oral as frações

do extrato seguido pela ingestão de 5 ml/kg de óleo de milho. No grupo controle, os

animais receberam somente o solvente. Após 1,5, 3 e 4,5 horas da ingestão do óleo

de milho o sangue dos animais foi coletado para as análises bioquímicas. Os

resultados desse estudo demonstraram que as frações aquosa e precipitado inibiram

significativamente o aumento da concentração plasmática de triglicerídeos. Os

autores avaliaram o efeito das frações do extrato de E. uniflora sobre a atividade da

enzima lípase pancreática in vitro. Essa enzima é responsável pela decomposição

de lipídios no intestino, ingeridos na alimentação, em ácidos graxos e glicerol que

43

posteriormente serão absorvidos. Os resultados obtidos pelos autores neste

experimento mostraram que, com exceção da fração n-hexano, as demais frações

inibiram a atividade da lípase pancreática de maneira dose-dependente.

Fármacos capazes de inibir a enzima lípase pancreática são indicados para

redução dos níveis de triglicerídeos no plasma em casos específicos. A inibição

dessa enzima leva a uma redução na decomposição dos lipídios permitindo assim a

excreção de grande parte da gordura ingerida (RANG, 2003).

Levando-se em consideração que no presente estudo os níveis de

triglicerídeos foram significativamente reduzidos pelo EHE e, que no estudo

realizado por Arai e cols. (1999), foi constatada a ação das frações do extrato de E.

uniflora sobre a enzima lípase pancreática, podemos sugerir que possivelmente o

EHE possa ter agido da mesma forma. Entretanto devem-se realizar estudos

específicos com essa enzima para confirmação.

Tem sido proposto em alguns estudos que ocorre um estresse oxidativo

derivado de um aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) e

concomitante redução dos mecanismos antioxidantes em pacientes diabéticos. O

estresse oxidativo facilitaria o dano progressivo às funções das células β–

pancreáticas na patogênese do DM. A formação da proteína glicada e os produtos

finais dessa glicação são acompanhados pelo aumento da atividade dos radicais

livres, contribuindo para a gênese dos malefícios ao nível molecular no diabetes

(SONG e cols. 2005).

Em decorrência destes distúrbios metabólicos observados no diabetes,

surgiriam diversas complicações, entre elas, doença macrovascular e

microangiopatia. Esses distúrbios são caracterizados pela disfunção do endotélio

vascular, que constitui um evento precoce e crítico no desenvolvimento destas

44

complicações vasculares. Os radicais livres derivados de oxigênio e os produtos

finais da glicacão avançada têm sido apontados como responsáveis nesta disfunção

(RANG, 2003).

Tem sido sugerido que doenças causadas pelas reações oxidativas em

sistemas biológicos podem ser retardadas pela ingestão de agentes antioxidantes

encontrados na dieta, em especial os compostos fenólicos (SIMOES, 2002). Se o

sistema endógeno estiver inadequado para a realização dos mecanismos de

proteção contra as espécies reativas de oxigênio, o dano oxidativo pode ocorrer em

importantes macromoléculas (VELÁZQUEZ e cols., 2002).

Diversos autores relatam a presença de diferentes compostos fenólicos nas

folhas de E. uniflora, em especial quercetina e miricetina que encontram-se em

maior quantidade (BANDONI, 1972; CONSOLINI, 1999; CONSOLINI, 2002;

AURICCHIO, 2003. SCHMEDA-HIRSCHMANN e cols.,1987). Velázquez e cols.

(2002) realizaram um estudo para verificar as propriedades antioxidantes de seis

plantas utilizadas na medicina popular no Paraguai, estando entre elas a E. uniflora.

Para a realização do experimento, os autores utilizaram ratos que receberam o

extrato metanólico de partes aéreas das plantas com o intuito de verificar a

capacidade “scavenger” de radicais livres e sua atividade antioxidante. Os

resultados do estudo levaram os autores a considerar que as folhas de E. uniflora

apresentam alta atividade inibitória da peroxidação lipídica, íons superóxido e

potente eficácia na redução do radical livre DPPH.

Os flavonóides têm grande atividade antioxidante agindo como “scavenger”

de radicais livres e potencial ação como quelante de metais. Um estudo prospectivo

realizado na Finlândia mostrou que a ingestão de alguns tipos específicos de

flavonóides, incluindo quercetina e miricetina está inversamente associada ao risco

45

de incidência do diabetes tipo II (KNEKT e cols., 2002). A partir disso, Song e cols.

(2002) sugere que os flavonóides podem atuar preservando as funções das células

β–pancreáticas por redução do dano no tecido induzido pelo estresse oxidativo.

Além disso, teria também a capacidade protetora contra a progressão da resistência

à insulina no diabetes tipo II.

Os níveis de lipídios séricos estão usualmente elevados em pacientes

diabéticos e essa elevação representa um risco aumentado de doença arterial

coronariana. A redução na concentração de lipídios séricos através do controle

alimentar ou com o uso de medicamentos está associado com menor risco de

doença cardiovascular (PARI e cols.). A aterosclerose é a mais séria conseqüência

provocada pelo diabetes e considerada a maior causa de morte destes pacientes

(AHMED, 2005).

Ong e Khoo (2000), em experimento realizado em ratos diabéticos utilizando

miricetina na dose de 3 mg/kg a cada 12 horas, demonstraram que, após dois dias

de tratamento, a hiperglicemia foi reduzida em 50% em relação ao controle.

Também foi evidenciada que a hipertrigliceridemia sofreu redução até os parâmetros

normais. Os autores sugerem nesse estudo que a miricetina apresenta potencial

terapêutico no tratamento do diabetes.

Em outro estudo, Liu e cols. (2007) verificaram os efeitos da miricetina sobre

a resistência à insulina em ratos alimentados por seis semanas com dieta contendo

60% de frutose. Esses animais receberam durante quatorze dias injeções

intravenosas de miricetina (1 mg/kg, 3 vezes ao dia). Os resultados obtidos pelos

autores mostraram uma redução significativa nos altos níveis de glicemia e nos

níveis de triglicerídeos plasmáticos.

46

Em estudo realizado para verificar a ação in vitro dos flavonóides, entre eles,

quercetina e miricetina, concluíram que com as propriedades antioxidantes destes

compostos provavelmente inibem a glicação de LDL e dessa forma ter um papel

importante em atenuar o risco aterosclerótico em indivíduos diabéticos (GHAFFARI;

MOJAB, 2007)..

A partir dos dados apresentados nesses estudos, podemos sugerir que a

presença dos flavonóides quercetina e miricetina nas folhas da planta E. uniflora

seja responsável pela a ação hipolipidêmica do EHE verificada no presente trabalho.

Esses compostos presentes no extrato podem agir potencializando a redução da

oxidação de LDL, reduzindo assim os níveis de triglicerídeos plasmáticos.

Portanto, novos estudos são importantes para complementação desses

resultados. Também é relevante a avaliação do potencial da E. uniflora como agente

protetor de disfunções metabólicas em estado diabético ou outras desordens que

levem a um quadro aterosclerótico.

Apesar do EHE não ter apresentando capacidade de controle nos níveis

sangüíneos de glicose, os dados corroboram com a indicação popular de uso da E.

uniflora para o diabetes. Pode-se sugerir isso uma vez que o EHE foi capaz de

reduzir os níveis de triglicerídeos plasmáticos nos animais diabéticos e, dessa forma,

seria importante na redução das alterações metabólicas decorrentes dessa

patologia.

No entanto, novos experimentos devem ser realizados, especialmente em

animais diabéticos com uso crônico do extrato de E. uniflora para confirmação dos

resultados verificados no presente estudo.

O uso tradicional de plantas baseadas na crença popular e nas várias

formações culturais para o alívio de sintomas e prevenção de algumas doenças ou

47

distúrbios fisiológicos tem sido o marco inicial para o desenvolvimento de pesquisas

etnofarmacológicas. Através de estudos semelhantes ao apresentado, contribui-se

com a população usuária quanto ao emprego correto de plantas medicinais para fins

terapêuticos, através da comprovação da eficácia e segurança terapêuticas das

plantas.

Esses resultados mais uma vez demonstram a importância de estudos

etnofarmacológicos que contribuem para a descoberta e desenvolvimento de novos

fármacos protótipos.

O incentivo da OMS, juntamente com a política nacional de plantas

medicinais e fitoterápicos do Ministério da Saúde, quanto a utilização de plantas

medicinais no tratamento de diversas patologias coadjuvante ao tratamento

alternativo, e da importância de pesquisas etnofarmacológicas, vem estimular os

estudiosos no conhecimento do potencial da flora brasileira para a produção de

fitofármacos, contribuindo desta forma para a obtenção de novos fármacos mais

eficazes e específicos.

48

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