8/3/2019 Effect of Refrigerated Storage on Mueller Hinton Agar

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J O U R N A L O F C L I N I CA L M I C R O B I O L O G Y , J a n . 1 9 8 5 , p . 1 3 3 - 1 3 40 0 9 5 - 1 1 3 7 / 8 5 / 0 1 0 1 3 3 - 0 2 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 8 5 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

E f f e c t o f R e f r i g e r a t e d S t o r a g e on C e f a c l o r i n M u e l l e r - H i n t o n A g a rA . MICHELE SURPRENANT* AND DAVID A . PRESTON

L i l l y R e s e a r c h I ; a b o r a t o r i e s , I n d i a n a p o l i s , I n d i a n a 4 6 2 8 5R e c e i v e d 2 A u g u s t 1 9 8 4 / A c c e p t e d 2 5 S e p t e m b e r 1 9 8 4

C e f a c l o r i s l e s s s t a b l e t h a n most c e p h a l o s p o r i n s i n m e d i a a t 3 5 C . We d e m o n s t r a t e d t ha t t h e a c t i v i t y o fc e f a c l o r i n M u e l l e r - H i n t o n agar d i m i n i s h e s c o n t i n u o u s l y a t 4 C , r e s u l t i n g i n a l o s s o f t w o - t h i r d s o f t h e a c t i v i t yw i t h i n 2 1 d a y s . We r e c o m m e n d t h a t agar d i l u t i o n p l a t e s f o r t h i s c e ph a l o sp o r i n b e p r e p a r e d on t h e d a y o f t h e i ru s e .

C h e m i c a l i n s t a b i l i t y o f , B - l a c t a m a n t i b i o t i c s i n s o l u t i o n i sw e l l kno wn ( 1 , 8 ) . T h e s p e c i f i c r e a c t i o n s t h a t l e a d t o t h eb r e a k d o w p o f t h e s e a n t i b i o t i c s are v a r i a b l e a c c o r d i n g t o t h ec h e m i c a l s t r u c t u r e o f t h e a n t i b i o t i c i n q u e s t i o n a n d i t sp h y s i c a l e n v i r o n m e n t . C e f a c l o r i s a e p h a l o s p o r i n . d e r i v a t i v eh a v i n g ' a p h e n y l g l y c y l m o i e t y i n t h e C - 7 p o s i t i o n ' a n d ac h l o r i n e atom i n t h e C - 3 p o s i t i o n o f t h e c e p h a l o s p o r i nn u c l e u s . U n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s , t h i s m o l e c u l e r e a d i l yu n d e r g o e s h y d r o l y s i s b y i n t r a m o l e c u l a r n u c l e o p h i l i c a t t a c ko n t h e , 3 - l a c t a m b o n d b y t h e C - 7 s i d e c h a i n a m i n o group ( 5 ) .T h i s s e l f - d e s t r u c t i v e e v e n t appears t o b e r e s p o n s i b l e f o r t h er e l a t i v e l y r a p i d l o s s o f b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f c e f a c l o r s o l u -t i o n s i n b a c t e r i o l o g i c a l m e d i a a t 3 5 C ( 4 , 7 ) .B e c a u s e t h e r a t e o f d e g r a d a t i o n o f c e f a c l o r i n m e d i a a t3 5 C i s s o m e w h a t f a s t e r t h a n t h a t o f most o t h e r c e p h a l o s p o -r i n s , we c o m p a r e d t h e r a t e s o f l o s s o f b i o l o g i c a l a c t i v i t y o fc e f a c l o r a n d a c o m p a r i s o n c e p h a l o s p o r i n , c e f a m a n d o l e , d i s -s o l v e d i n M u e l l e r - H i n t o n agar a t 4 C . We p r e p a r e d agard i l u t i o n p l a t e s as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 6 ) w i t h c e f a c l o r a n dc e f a m a n d o l i n c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 2 8 t o 0 . 0 3, u g / m l . T h e p l a t e s were s e a l e d i n p l a s t i c b a g s a n d s t o r e d a t4 C . On d a y s 1 , 7 , 1 4 , a n d 2 1 , d u p l i c a t e s e t s o f p l a t e sc o n t a i n i n g e a c h a n t i b i o t i c were r e m o v e d f r o m r e f r i g e r a t i o n ,b r o u g h t t o a m b i e n t t e m p e r a t u r e , a n d i n o c u l a t e d a c c o r d i n g t op r e v i o u s l y d e s c r i b e d s t a n d a r d s ( 6 ) w i t h a group o f b a c t e r i a li s o l a t e s r e p r e s e n t i n g a d i v e r s i t y o f genera a n d s p e c i e s f o rw h i c h t e s t i n g on u n s u p p l e m e n t e d M u e l l e r - H i n t o n agar i sa p p r o p r i a t e . T h e i s o l a t e s i n c l u d e d E s c h e r i c hi a c o l i ( 3 ) , E n -t e r o b a c t e r spp. ( 3 ) , K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e ( 4 ) , P r o v i d e n c i as t u a r t i i ( 3 ) , S e r r a t i a marcescens ( 3 ) , a n d S t a p h y l o c o c c u saureus ( 9 ) . A f t e r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n a t 3 5 0 C , t h e l o w e s tc o n c e n t r a t i o n o f e a c h a n t i b i o t i c p r e v e n t i n g m a c r o s c o p i cg r o w t h o f e a c h c u l t u r e was r e c o r d e d as t h e MIC. A b a r e l yv i s i b l e h a z e or a s i n g l e c o l o n y a t t h e i n o c u l u m s i t e wasi g n o r e d .F o r e a c h a n t i b i o t i c , g e o m e t r i c mean MICs were c a l c u -l a t e d f o r e a c h t e s t d a y f o r o n l y t h e group o f i s o l a t e s t h a t h a dd e f i n i t i v e e n d p o i n t s a t a l l f o u r assay t i m e s . By d a y 2 1 o fs t o r a g e a t 4 C , t h e g e o m e t r i c mean MIC o f c e f a c l o r h a di n c r e a s e d a p p r o x i m a t e l y s e v e n f o l d ( T a b l e 1 ) . By c o n t r a s t ,t h e g e o m e t r i c mean MIC f o r c e f a m a n d o l e r e m a i n e d c l o s e t ot h e i n i t i a l v a l u e . The r e l a t i v e l y r a p i d l o s s o f c e f a c l o r a c t i v i t ys u g g e s t e d b y t h e s h i f t i n t h e mean MIC i s c o n s i s t e n t w i t h t h ef i n d i n g s o f F o g l e s o n g e t a l . ( 3 ) , w h o r e p o r t e d t h a t c e f a c l o rd i s s o l v e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 ) l o s e s over 50 % o fi t s b i o l o g i c a l a c t i v i t y w i t h i n 7 2 h a t 4 C .

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

We a l s o d e t e r m i n e d t h e r a t e o f l o s s o f c e f a c l o r i n M u e l -l e r - H i n t o n a g a r b y a d i r e c t m i c r o b i o l o g i c a l q u a n t i t a t i v ea s s a y s i m i l a r ' t o t h a t u s e d b y R y a n e t a l . ( B a c t e r i o l . P r o c . p .7 4 , a b s t r . n o . M 4 1 , 1 9 6 9 ) a n d b y B a r o n a n d H i n d l e r ( 2 ) i n t h es t u d y o f o t h e r a n t i b i o t i c s . L i q u e f i e d a n d c o o l e d ( 5 2 C )a n t i b i o t i c m e d i u m 1 ( D i f o L a b o r a t o r i e s ) s e e d e d w i t h B a c i l -l u s s u b t i l i s ATCC 6 6 3 3 s p o r e s ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 2 . 5 x 1 0 6s p o r e s p e r m l ) w a s p i p e t t e d i n 6 - m l v o l u m e s t o 90-mmf l a t - b o t t o m e d p l a s t i c d i s p o s a b l e p e t r i d i s h e s a n d a l l o w e d t os o l i d i f y . A s s a y ' p l a t e s w e r e p r e p a r e d a n d u s e d i m m e d i a t e l yo n e a c h t e s t d a y .F r s h l y p r e p a r e d M u e l l e r - H i n t o n a g a r d i l u t i o n p l a t e s c o n -t a i n i n g c e f a c l o r a t c o n c e n t r a t i o n s o f 1 6 , 8 , 4 , 2 , a n d 1 , u g / m lw e r e p r e p a r e d a n d s t o r e d a t 4 C . On d a y s 1 , 7 , 1 4 , a n d 2 1 ,t r i p l i c a t e p l u g s a m p l e s w e r e r e m o v e d f r o m e a c h c e f a c l o rp l a t e b y u s i n g s l i g h t s u c t i o n t h r o u g h a t h i n - w a l l e d b r a s s t u b e( 4 . 5 - m m i n s i d e d i a m e t e r ) . E a c h p l u g w a s t r a n s f e r r e d t o t h es u r f a c e o f a n a s s a y p l a t e . P l a t e s i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t 3 5 Cd e v e l o p e d z o n e s o f ' i n h i b i t i o n a r o u n d t h e a g a r p l u g s . Meanz o n e d i a m e t e r s f o r t h e v a r i o u s c e f a c l o r c o n c e n t r a t i o n s s a m -p l e d o n d a y 1 w e r e p l o t t e d o n s e m i l o g a r i t h m i c g r a p h p a p e ra g a i n s t c e f a c l o r c o n c e n t r a t i o n s ( l o g a r i t h m i c ) . T h e r e s u l t i n gd o s e - r e s p o n s e c u r v e w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d a g a i n s t w h i c hs u b s e q u e n t w e e k l y s a m p l e s w e r e c o m p a r e d . P o t e n c i e s o fs a m p l e s t a k e n a t 7 , 1 4 , a n d 2 1 d a y s w e r e e x p r e s s e d a sp e r c e n t a g e s o f t h e i n i t i a l s a m p l e v a l u e s ( d a y 1 ) ( T a b l e 2 ) .A l l c o n c e n t r a t i o n s o f c e f a c l o r l o s t p o t e n c y a t a p p r o x i -m a t e l y t h e s a m e r a t e . By t h e e n d o f w e e k 3 , t h e b i o l o g i c a la c t i v i t y i n e a c h p l a t e w a s s l i g h t l y l e s s t h a n o n e - t h i r d o f i t si n i t i a l c o n c e n t r a t i o n . T h i s l o s s i s s u f f i c i e n t t o e x p l a i n a s h i f to f t w o d i l u t i o n s i n MIC e n d p o i n t s .

TABLE 1 . P e r f o r m a n c e o f a g a r d i l u t i o n p l a t e s a f t e r s t o r a g e a t4 CG e o m e t r i c mean MIC ( p i g / m l )S t o r a g e( w k ) C e f a c l o r C e f a m a n d o l e( 1 8 ) a ( 2 4 ) a

0 3 . 3 1 . 21 4 . 1 1 . 52 1 1 . 8 1 . 53 2 2 , 6 1 . 63 / 0 r a t i o 6 . 8 1 . 3

a Number o f i s o l a t e s c o n s i d e r e d i n t h e g e o m e t r i c means i s shown w i t h i np a r e n t h e s e s . B e c a u s e MIC t e s t s were p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e , t h e n u m b e r o fv a l u e s f o r t h e g e o m e t r i c means was t w i c e t h e n u m b e r o f i s o l a t e s .1 3 3

V o l . 2 1 , N o . 1

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J . C L I N . M I C R O B I O L .TABLE 2 . S t a b i l i t y o f c e f a c l o r i n M u e l l e r - H i n t o n a g a r s t o r e d a t4 0 C

N o . o f d a y s % o f i n i t i a l c o n c n ( , u g / m l ) :a t 4 ' C 1 6 8 4 2 17 6 0 6 5 6 5 7 4 6 41 4 4 4 4 8 4 5 4 8 5 02 1 3 1 3 3 2 5 3 1 < 5 0 a

a M i n i m u m d e t e c t i o n l i m i t , 0 . 5 p . g / m l .

A c c o r d i n g t o t h e t e n t a t i v e s t a n d a r d o n d i l u t i o n t e s t i n g ( 6 ) ,agar d i l u t i o n p l a t e s may b e u s e d i m m e d i a t e l y or s t o r e d i np l a s t i c b a g s a t 4 C f o r up t o 4 w e e k s . T h e s t a n d a r d a l s os t a t e s w i t h e m p h a s i s t h a t a p p r o p r i a t e r e f e r e n c e c o n t r o ls t r a i n s s h o u l d b e t e s t e d e a c h t i m e t e s t s are p e r f o r m e d t oensure t h a t n o d e t e r i o r a t i o n o f a n t i m i c r o b i a l a g e n t s h a so c c u r r e d . O u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t , i n a d d i t i o n t o r e g u l a rq u a l i t y c o n t r o l t e s t i n g t o m o n i t o r f o r l o s s o f p o t e n c y , pre-c a u t i o n s s h o u l d b e t a k e n t o a v o i d d e g r a d a t i o n o f c e f a c l o r i nagar d i l u t i o n p l a t e s . F o r r o u t i n e w o r k , c e f a c l o r agar d i l u t i o np l a t e s s h o u l d b e p r e p a r e d w i t h i n 4 8 h o f t h e t e s t . F o rr e f e r e n c e w o r k , p l a t e s s h o u l d b e p r e p a r e d o n t h e d a y o f t h et e s t .

LITERATURE CITED1 . A n h a l t , J . P . , a n d J . A . W a s h i n g t o n I I . 1 9 8 0 . P r e p a r a t i o n a n ds t o r a g e o f a n t i m i c r o b i c s o l u t i o n s , p . 4 9 5 - 4 9 6 . I n E . H . L e n n e t t e ,A . B a l o w s , W. J . H a u s l e r , J r . , a n d J . P . T r u a n t ( e d . ) , M a n u a l o fc l i n i c a l m i c r o b i o l o g y , 3 r d e d . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l -o g y , W a s h i n g t o n , D . C .2 . B a r o n , E . J . , a n d J . A . H i n d l e r . 1 9 8 4 . B i o a c t i v i t y o f i m i p e n e m a sa f u n c t i o n o f m e d i u m , t i m e , a n d t e m p e r a t u r e . A n t i m i c r o b . A g e n t sC h e m o t h e r . 2 5 : 7 8 1 - 7 8 2 .3 . F o g l e s o n g , M . A . , J . W. L a m b , a n d J . V . D i e t z . 1 9 7 8 . S t a b i l i t ya n d b l o o d l e v e l d e t e r m i n a t i o n s o f c e f a c l o r , a new o r a l c e p h a l o s p o -r i n a n t i b i o t i c . A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 1 3 : 4 9 - 5 2 .4 . G i l l e t t , A . P . , J . M. A n d r e w s , a n d R . W i s e . 1 9 7 9 . C o m p a r a t i v e i nv i t r o m i c r o b i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d s t a b i l i t y o f c e f a c l o r . P o s t g r a d .M e d . J . 5 5 ( S u p p l . 4 ) : 9 - 1 1 .5 . I n d e l i c a t o , J . M . , A . D i n n e r , L . R . P e t e r s , a n d W. L . W i l h a m .1 9 7 7 . H y d r o l y s i s o f 3 - c h l o r o - 3 - c e p h e m s . I n t r a m o l e c u l a r n u c l e o -p h i l i c a t t a c k i n c e f a c l o r . J . M e d . C h e m . 2 0 : 9 6 1 - 9 6 3 .6 . N a t i o n a l C o m m i t t e e f o r C l i n i c a l L a b o r a t o r y S t a n d a r d s . 1 9 8 3 .S t a n d a r d m e t h o d s f o r d i l u t i o n a n t i m i c r o b i a l s u s c e p t i b i l i t y t e s t s o fb a c t e r i a w h i c h g r o w a e r o b i c a l l y . T e n t a t i v e s t a n d a r d M 7 - T . N a -t i o n a l C o m m i t t e e f o r C l i n i c a l L a b o r a t o r y S t a n d a r d s , V i l l a n o v a ,P a .7 . P r e s t o n , D . A . 1 9 7 7 . S u m m a r y o f l a b o r a t o r y s t u d i e s o n t h ea n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f c e f a c l o r . P o s t g r a d . M e d . J . 5 5 ( S u p p l .

4 ) : 2 2 - 2 9 .8 . W i c k , W. E . 1 9 6 4 . I n f l u e n c e o f a n t i b i o t i c s t a b i l i t y o n t h e r e s u l t so f i n v i t r o t e s t i n g p r o c e d u r e s . J . B a c t e r i o l . 8 7 : 1 1 6 2 - 1 1 7 0 .

1 3 4 NOTES