effects of mutational loss of specific intracellular proteases on the sporulation of bacillus...

7/28/2019 Effects of Mutational Loss of Specific Intracellular Proteases on the Sporulation of Bacillus Subtilis

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J O U R N A LO F B A C T E R I O L O G Y,M a y 1 9 7 3 ,p . 6 1 2 - 6 1 7C o p y r i g h t0 1 9 7 3 A m e r i c a nS o c i e t y f o rM i c r o b i o l o g y

Vo l .1 1 4 ,N o . 2P r i n t e d i n U . S . A .

E f f e c t so f M u t a t i o n a l L o s s o f S p e c i f i c

I n t r a c e l l u l a rP r o t e a s e s on t h e S p o r u l a t i o no fB a c i l l u ss u b t i l i s

JAMES H . HAGEMAN' AND BRUCE C . CARLTON2

D e p a r t m e n to fB i o l o g y ,Ya l e U n i v e r s i t y ,New H a v e n , C o n n e c t i c u t0 6 5 2 0 ,an d D e p a r t m e n to fC h e m i s t r y ,Ne wM e x i c oS t a t e U n i v e r s i t y ,L a s C r u c e s ,New M e x i c o8 8 0 0 1

R e c e i v e d f o rp u b l i c a t i o n 8 D e c e m b e r1 9 7 2

Two p r o t e a s e - d e f i c i e n tm u t a n t s o f B a c i l l u s s u b t i l i s1 6 8 ( T r p - )were i s o l a t e da n d c o m p a r e dw i t h t h e p a r e n t a l s t r a i n w i t h r e s p e c t t o p r o d u c t i o no f i n t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s a n d s p o r u l a t i o n .A m u t a n t l a c k i n g t h e m e t a l - r e q u i r i n g " n e u t r a l "p r o t e a s e i n t r a c e l l u l a r l ys p o r u l a t e d a s w e l l as t h e p a r e n t a l s t r a i n .A s e c o n dm u t a n t , d e f i c i e n ti n an a s y e t u n c h a r a c t e r i z e d i n t r a c e l l u l a r p r o t e a s e ,f a i l e dt os p o r u l a t e n o r m a l l y . I t i s p r o p o s e d t h a t t h i s new p r o t e a s e i s a l s o i n v o l v e d i ni n t r a c e l l u l a rp r o t e i n t u r n o v e r .

We h a v e p r e v i o u s l yd es cr i b ed t h e i s o l a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o e x t r a c e l l u l a re n -d o p e p t i d a s e s o f t h e s e r i n et y p e p r o d u c e db y at r a n s f o r m a b l e s t r a i n o fB a c i l l u s s u b t i l i s( 2 , 4 ) .M i l l e t h a s p a r t i a l l yc h ar ac t e r i z ed t h e m e t a l -r e q u i r i n g e n d o p e p t i d a s ee x c r e t e d b y a c l o s e l yr e l a t e ds t r a i no f B . s u b t i l i s( 1 1 ) ,w h e r e a s P r e -s t i d g ee t a l . ( 1 3 )h a v e r e c e n t l yd e s c r i b e d t h et i m e o f a p p e a r a n c e o f e a c h o f t h e s e t h r e ep r o t e a s e s i n t h e c u l t u r em e d i u m d u r i n g t h ec o u r s e o fs p o r u l a t i o n .

I t h a s b e e n s u g g e s t e d ,o n t h e b a s i so f s t u d i e sw i t h s e v e r a lp l e i o t r o p i cm u t a n t s , t h a t t he p r o -d u c t i o n o f a n e x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e m ay b e a no b l i g a t es t e pi n t h e s p o r u l a t i o np r o c e s s o fB a c i l -l u s s u b t i l i s( 1 , 8 , 1 4 ) .T h e f a c tt h a tm o r e t h a n

o n e e x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e i s p r o d u c e da n d t h el a c ko fk n o w l e d g ec o n c e r n i n gt h e r e l a t i o n s h i po fi n t r a c e l l u l a ra n d e x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s c o m -p l i c a t ea n y i n t e r p r e t a t i o no ft h e r o l eo fe x t r a c e l -l u l a rp r o t e a s e s .F o r e x a m p l e , i t h a s b e e n n o t e dt h a t m u t a n t s o f B . s u b t i l i s( 9 ,a n d J . - P.A u b e r t ,p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n )a n d B . m e g a t e r i u m( 1 1 )w h i c h f a i lt o e x c r e t et h e m e t a l - c o n t a i n i n g" n e u t r a l " p r o t e a s e n e v e r t h e l e s ss p o r u l a t e n o r -m a l l y .

We h a v e a t t e m p t e d t o i s o l a t em u t a n t s w h i c hl a c k a s i n g l eb i o c h e m i c a l l yd e f i n e d i n t r a c e l l u l a r

p r o t e a s e ;w e r e p o r th er e t h e s p o r u l a t i n g p r o p e r -t i e so f t w o s u c h m u t a n t s o fB . s u b t i l i s 1 6 8 .T h i s

1 P r e s e n t a d d r e s s :D e p a r t m e n to f C h e m i s t r y , New M e x i c oS t a t e U n i v e r s i t y ,L a s C r u c e s ,N . M. 8 8 0 0 1 .

2 P r e s e n ta d d r e s s :D e p a r t m e n t so f B i o ch em i s t r y a n dM i -c r o b i o l o g y ,U n i v e r s i t yo f G e o r g i a ,A t h e n s , G a . 3 0 6 0 1 .

s t ud y w a sp r e s e n t e d i n p a r t a t t h e F i f t hI n t e r -n a t i o n a l S p o r e s C o n f e r e n c e , L a k e G e n e v a ,W i s . ,8 - 1 0 O c t o b e r , 1 9 7 1 .

MATERIALS AND METHODSS e l e c t i o n o f m u t a n t s . T h e p a r e n t a ls t r a i nu s e d i n

t h e s e s t u d i e sw a s t h e t r a n s f o r m a b l e t r y p t o p h a n -r e q u i r i n ga u x o t r o p hB . s u b t i l i s1 6 8( T r p - )o fS p i z i z e n( 1 5 ) .Th e t w o p r o t e a s e - d e f i c i e n ts t r a i n su s e d w e r ed e r i v e d f r o m t h e p a r e n t a lt y p e ,a n d b o t h r e t a i n e d t h ea u x o t r o p h i cr e q u i r e m e n t f o r t r y p t o p h a n .O n e l o w -p r o t e a s e - p r o d u c i n gs t r a i n ,B . s u b t i l i s1 6 8L - 4 ,w a ss e l e c t e df o ri t s i n a b i l i t yt o h y d r o l y z et h e e s t e r i n d o x y la c e t a t e .C e l l si r r a d i a t e dw i t h u l t r a v i o l e t( U V )l i g h tt o0 . 0 1 % s u r v i v a lw e r e p l a t e do n g e l a t i n - a g a rp l a t e s( 1 . 2 % D i f c o g e l a t i n ;0 . 4 % D i f c o n e o p e p t o n e ; 0 . 1 %y e a s t e x t r a c t ;a n d 1 . 5 %a g a r )a n d o v e r l a i dw i t h 1 0 m lo f s o f t a g a r ( 0 . 7 % I o n a g a r a t 4 5 C ) i n 0 . 0 5Mp o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f f e ra t a p H o f 7 . 6 ,t o w h i c hw a s a d m i x e d0 . 3m l o f0 . 0 8 3M i n d o x y la c e t a t e ( M a n nl o t T- 3 8 4 8 ) i n d i o x a n e i m m e d i a t e l yb e f o r ep o u r i n g .T h eo v e r l a i dp l a t e sw e r e i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r1 t o 2 h ,

a n d c l o n e s w h i c h f a i l e d t ot u r nb l u e ( t h ea u t o - o x i d a -t i o n p r o d u c t o f 3 - h y d r o x y i n d o l ei s i n t e n s e l yb l u e )w e r e p i c k e d a n d r e g r o w n i n D i f c o P e n a s s a y B r o t h .T h e p i c k e d c l o n e sw e r e r e s t r e a k e d o n g e l a t i n - a g a rp l a t e s ,a n d s i n g l e - c l o s ei s o l a t e sw e r e t e s t e df o rt h e i ra b i l i t yt o p r o d u c ee x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e a c t i v i t yd u r -i n g g r o w t hi n 2 % y e a s t e x t r a c tm e d i u m .

A s e c o n d l o w - p r o t e a s e - p r o d u c i n gs t r a i n ,B . s u b t i l i s

1 6 8 S - 8 7 ,w a s s e l e c t e df o r i t s r e d u c e d a b i l i t yt oh y d r o l y z e N - b e n z o y l - D L - t y r o s i n et h i o b e n z y l e s t e r( B T T B E ) .T h e s y n t h e s i so ft h i se s t e rw i l lb e r e p o r t e de l s e w h e r e .F o r t h i si s o l a t i o n ,U V- i r r a d i a t e d s p o r e so fs t r a i n1 6 8 T r p - ( 0 . 1 % s u r v i v a l )w e r e p l a t e d o n g e l a -t i n - a g a r .A f t e r i n c u b a t i o n a t 3 7 C o v e r n i g h t ,t h er e s u l t i n g c l o n e sw e r e o v e r l a i dw i t h s o f ta g a r c o n t a i n -

6 1 2

b y onA

u g u s t 2 1

,2

0 0 8

j b . a

s m

. or g

D ownl o

a d e d f r om
http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/http://jb.asm.org/


2/6

B . S U B T I L I SSPORULATION

i n g6 m l o f 0 . 7 % I o n a g a r i n 0 . 1M p o t a s s i u mp h o s -p h a t e b u f f e r a tp H 7 . 6 a n d 0 . 0 1 M d i s o d i u me t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d( E D T A )t o i n h i b i tt h e n e u t r a lp r o t e a s e ,1 m l o f s o l u t i o nc o n t a i n i n g0 . 1Mt r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e( T r i s ) - h y d r o c h l o -

r i d e ,p H 7 . 6 ,a n d 4 m g o f5 ,5 ' - d i t h i o - b i s( 2 - n i t r o b e n -z o i ca c i d )p e rm l ,a n d 0 . 1 m l o f a s a t u r a t e dm e t h -a n o l i cs o l u t i o no f BTTBE. A f t e r3 0 t o 6 0 m i n o fi n c u b a t i o na t r o o mt e m p e r a t u r e , c l o n e sw h i c hd i d n o tt u r n y e l l o w ,s i g n i f y i n ga f a i l u r et o h y d r o l y z et h et h i o e s t e r ,w e r e p i c k e d a n d t e s t e da s d e s c r i b e da b o v e .U n l i k e t h e p a r e n t a ls t r a i na n d t h eL - 4 m u t a n t , t h eS - 8 7 v a r i a n td i dn o t s p o r u l a t ew e l lo n g e l a t i n - a g a rp l a t e s ,b u t d i d s p o r u l a t eo n p l a t e so f D i f c oTAMs p o r u l a t i o na g a r .

G r o w t hs t u d i e s .P r e c u l t u r e sw e r e g r o w nb y i n o c u -l a t i n gP e n a s s a y B r o t h w i t h a s i n g l ec l o n ef r o m ag e l a t i n - a g a rp l a t ea n d i n c u b a t i o n a t 3 1C o v e r n i g h ti na New B r u n s w i c ks h a k i ng w at e rb a t h .T h e s u b s e -q u e n t g r o w t ha n d s p o r u l a t i o ns t u d i e sw e r e c a r r i e do u ti n t h e s u p p l e m e n t e dn u t r i e n tb r o t h d e s c r i b e db yH a n s o n e t a l . ( 5 ) . G r o w t h w a s i n i t i a t e db y t h ea d d i t i o no f5 m l o ft h e p r e c u l t u r et o 5 0 0m l o fn u t r i e n tb r o t hi n 2 - l i t e rb a f f l e d ,s h a k e f l a s k s .I n s o m e c a s e sp r e c u l t u r e sw e r e p r e p a r e d b y t h e m e t h o d o fD e u t s c h e ra n d K o r n b e r g( 3 ) .T h e f l a s k sw e r e p l a c e di n a New B r u n s w i c kr o t a r yi n c u b a t o rs h a k e r a t 3 7 C .G r o w t h o f t h e c u l t u r e sw a s f o l l o w e db y u s i n g aK l e t t - S u m m e r s o nc o l o r i m e t e rw i t h a n o .6 6 f i l t e r .

T h e e x t e n to fs p o r u l a t i o nw a s f o l l o w e db y e s t i m a t -i n g t h e p r o p o r t i o no f r e f r a c t i l eb o d i e so b s e r v e d i n

s e v e r a lf i e l d so fa p h a s e c o n t r a s tm i c r o s c o p eb y u s i n ga n o i l - i m m e r s i o no b j e c t i v eo r b y h e a t i n ga 1 : 1 0d i l u t i o no f t h ec e l l c u l t u r ea t 7 0 C f o r3 0 m i n a n dd e t e r m i n i n gt h e n u m b e ro fs u r v i v o r sa f t e rp l a t i n go ng e l a t i n - a g a rp l a t e s .

P r e p a r a t i o n o f c e l l - f r e ee x t r a c t s .A t a p p r o p r i a t et i m e s c e l l s w e r e c o l l e c t e db y c e n t r i f u g a t i o ni n ap r e c o o l e dG SA r o t o ri n a S o r v a l lRC2B c e n t r i f u g e .T h e s u p e r n a t a n t l i q u i dw a s d e c a n t e d a n d s a v e d f o ra n a l y s i so fe x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s .T h e p e l l e t e dc e l l sw e r e w a s h e dt w i c eb y s u s p e n s i o n i n 0 . 0 5M s o d i u ma c e t a t eb u f f e ra t p H 6 . 0 ,r e c e n t r i f u g e d ,a n d f r o z e nf o r2 h . T h e c e l l sf r o m 1 l i t e ro f m e d i u mw e r e t h a w e d ,s u s p e n d e d i m m e d i a t e l y i n 3 0 m l o f c o l da c e t a t eb u f f e r ,a n d s o n i c a l l yt r e a t e df o ra t o t a lo f5 m i n w i t h aB r o n s o n( B i o s o n i cI I )s o n i f i e r a ta p o w e rs e t t i n go f5 .M i c r o s c o p ye x a m i n a t i o no ft h e s o n i ce x t r a c tr e v e a l e dt h a tc e l lb r e a k a g ew a s n e a r l yc o m p l e t e .I nsome c a s e st h ec e l l sw e r e r u p t u r e d i n a F r e n c h p r e s s u r ec e l l .T h ec e l ll y s a t e sw e r e t h e n c e n t r i f u g e da t 4 0 , 0 0 0x g f o r1 ha t 4 C . T h e p e l l e t sw e r e d i s c a r d e d ,a n d t h es u p e r n a -t a n t s o l u t i o n sw e r e d i a l y z e da g a i n s t0 . 0 5M s o d i u ma c e t a t eb u f f e ra t pH 6 . 0 o v e r n i g h ta t 4 C a n dc o n c e n t r a t e d t o a f e w m i l l i l i t e r sb y p a c k i n g t h ed i a l y s i sb a g s i n A q u a c i d eI ( C a l b i o c h e m ) .T h e c o n -c e n t r a t e dd i a l y s a t e sw e r e u s e d f o rs u b s e q u e n te l e c t r o -

p h o r e t i ca n d e n z y m a t i ca s s a y s .E n z y m a t i ca s s a y s . T h e u n i t so fp r o t e o l y t i ca c t i v -i t y i n c u l t u r es u p e r n a t a n t f l u i d sw e r e d e t e r m i n e db yt h e s p e c t r o p h o t o m e t r i cc a s e i n a s s a y p r e v i o u s l yd e -s c r i b e d( 2 ) .P r o t e o l y t i ca c t i v i t yi n c e l l - f r e ee x t r a c t sw a s d e t e r m i n e db y u s i n ga m o d i f i c a t i o no ft h e m e t h o do f K u n i t z ( 6 ) .To 1 . 0m l o f 1 % H a m m e r s t e nc a s e i n

( N u t r i t i o n a lB i o c h e m i c a l s )i n 0 . 1M T r i s - h y d r o c h l o -r i d eb u f f e r( p H 7 . 8 )w a s a d d e d0 . 1m l o fe x t r a c t ,a n di n c u b a t i o nw a s a t 2 6 C f o rp e r i o d so fu p t o 1 0 h . T h er e a c t i o nw a s s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f2 m l o f 1 0 %t r i c h l o r o a c e t i ca c i d ,a n d t h e p r e c i p i t a t ew a s r e m o v e d

b y c e n t r i f u g a t i o n .A s a m p l e o f t h e t r i c h l o r o a c e t i ca c i d - s o l u b l es o l u t i o nw a s a s s a y e d f o rp r o t e i nb y t h em e t h o d o f L o w r ye t a l . ( 7 ) . T h e a m o u n t o f c a s e i ns o l u b i l i z e dw a s p r o p o r t i o n a lt o t h ea m o u n to fc e l l - f r e ee x t r a c ta d d e d .

E l e c t r o p h o r e s i s a n d zymogram p r o c e d u r e s .F i v et o t e n u l i t e r so fd i a l y z e d ,c e l l - f r e ee x t r a c tw a s a d d e dt o s t r i p so f c e l l u l o s ep o l y a c e t a t e ( S e p h a r o p o r em I ,G e l m a nI n s t r u m e n t C o . )p r e s o a k e d i n t h e a c e t a t eb u f f e r ,a n d e l e c t r o p h o r e s i sw a s c a r r i e do u t i n aS h a n d o ne l e c t r o p h o r e s i sc h a m b e rb y u s i n g t h e s a m ea c e t a t eb u f f e rp r e v i o u s l yd e s c r i b e d .E l e c t r o p h o r e s i sw a s p e r f o r m e da t 2 0 0 V p o t e n t i a l( a n d 1 . 5mA p e r

s t r i p )f o ra p e r i o do f 1 . 5t o 2h a t r o o mt e m p e r a t u r e .A f t e re l e c t r o p h o r e s i st h e s t r i p sw e r e p l a c e d o n a g e lb e d c o n t a i n i n g2 %c a s e i na n d 1 %a g a r ( D i f c o )i n a 0 . 1M p o t a s s i u mp h o s p h a t eb u f f e ra t p H 7 . 6f o r1 h a t 3 7C . T h e s t r i p st h e n w e r e w r a p p e dt i g h t l yi n S a r a nW r a pa n d i n c u b a t e d .

A f t e ro v e r n i g h ti n c u b a t i o n a t 3 7 C , t h e s t r i p sw e r er e m o v e d f r o m t h e S a r a n Wrap a n d s t a i n e di n a na q u e o u ss o l u t i o no f5 % t r i c h l o r o a c e t i ca c i ds a t u r a t e dw i t h A m i d oB l a c k 1 0 B .T h e s t r i p sw e r e d e s t a i n e d b yr e p e a t e d w a s h i n g i n 5 % a c e t i ca c i d .T h e e n z y m ep o s i t i o n sw e r e d e t e c t e da s w h i t e z o n e s a g a i n s tad a r k - b l u eb a c k g r o u n d ,a m o d i f i c a t i o no f t h e m e t h o do fM i l n e r a n d M a s s i e( 1 2 ) .I m m u n o l o g i c a lt e s t s . T h e p r e p a r a t i o n o f a n t i -b o d i e s a g a i n s tb a c i l l o p e p t i d a s eE a n d b a c i l l o p e p t i -d a s e F a n d t h e p r o c e d u r e sf o ri m m u n o d i f f u s i o nh a v eb e e n d e s c r i b e dp r e v i o u s l y( 4 ) .B a c i l l o p e p t i d a s eE i st h e " s u b t i l i s i n - l i k e "e n z y m e , w h e r e a s b a c i l l o p e p t i -d a s e F w a s c h a r a c t e r i z e da s h a v i n g h i g h e s t e r o l y t i ca c t i v i t yo n s u b s t r a t e ss u c h a s N - b e n z o y l - L - t y r o s i n ee t h y le s t e r .( 2 , 4 ) .

RESULTS

Growth r a t e s , s p o r u l a t i o n , an d e x t r a c e l -l u l a r p r o t e a s e p r o d u c t i o n . E x a m i n a t i o no f t h eg r o w t h r a t e s i n s u p p l e m e n t e d , n u t r i e n t b r o t hmed ium o f t h e B . s u b t i l i sp a r e n t a l s t r a i n 1 6 8a n d t h e t w o m u t a n t s t r a i n s 1 6 8 L - 4 and 1 6 8S - 8 7 s h o w e d no d i f f e r e n c e s i n i n i t i a lg r o w t hr a t e s , a l t h o u g h t h e L - 4 s t r a i n c o n s i s t e n t l ya c h i e v e d a h i g h e r ,f i n a lo p t i c a ld e n s i t y t h a n d i dt h e 1 6 8 p a r e n t s t r a i n .S t r a i n S - 8 7 r o u t i n e l yr e a c h e d a l o w e r f i n a ld e n s i t y t h a n d i d t h e o t h e rt w o s t r a i n s .P a r e n t a l s t r a i n 1 6 8 b e g a n t o p r o -d u c e e x t r a c e l l u l a r p r o t e a s e a f t e r a b o u t 8 h o fg r o w t h i n s u p p l e m e n t e dn u t r i e n t b r o t h a n dr e a c h e d a m a x i m u m p r o t e a s e l e v e lo f a b o u t 8 5s p e c t r o p h o t o m e t r i cc a s e i n a s e u n i t s p e r m l o fc u l t u r e a f t e r 1 4 h o f g r o w t h( F i g .1 ) .N e i t h e r L - 4n o r S - 8 7 mutan t s t r a i n s p r o d u c e d d e t e c t a b l el e v e l so f p r o t e a s e i n t h e c u l t u r e u n t i l 9 t o 1 2 h o fg r o w t h . A f t e r 1 4 h s t r a i n s L - 4 and S - 8 7 h a d

6 1 3O L . 1 1 4 ,1 9 7 3

b y onA

u g u s t 2 1

,2

0 0 8

j b . a

s m

. or g

D ownl o

a d e d f r om


3/6

HAGEMAN AND C A R LT O N

0 B . s u b t i l i s 1 6 8 oL

3 L - 4 LU60- 6

2 2 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ 0

s e i n - h y d r o l y z i n ga c t i v i t y( s o l i dl i n e s )a n d t h e f o r m a -t i o no f r e f r a c t i l es p o r e s ( d o t t e dl i n e s )b yB . s u b t i l i s1 6 8 ( T r p - )a n d t w o p r o t e a s e - d e f i c i e n td e r i v a t i v e sg r o w i n g i n s u p p l e m e n t e dn u t r i e n tb r o t h .P r o t e a s ea c t i v i t ywa s m e a s u r e da s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y( 2 ) .

p r o d u c e d1 3 a n d 7 % , r e s p e c t i v e l y ,o f t h e t o t a lc a s e i n a s e a c t i v i t yo f t h e p a r e n t a ls t r a i n .T h i sa s s a y m e a s u r e dt h e s u m o f t h e s e r i n e - t y p ea n dn e u t r a l p r o t e a s e sp r e s e n ti n t h e c u l t u r eb r o t h .A p p r o x i m a t e l y5 0 p e r c e n t o f t h e t o t a lp r o t e o -l y t i ca c t i v i t yp r o d u c e db y s t r a i n1 6 8 was i n h i b -

i t e db y EDTA.R e f r a c t i l eb o d i e s b e c a m ev i s i b l ei n t h es t r a i n1 6 8 c u l t u r ea t a b o u t 1 0 t o 1 1h , w h e r e a s i n t h eL - 4 c u l t u r er e f r a c t i l eb o d i e s i n v a r i a b l ya p p e a r e d1 t o 3 h e a r l i e r .T h e s a m e p a t t e r nwas o b s e r v e dw h e nt h e a p p e a r a n c eo fh e a t - r e s i s t a n tc e l l swasm e a s u r e db y p l a t i n gc e l l son g e l a t i n - a g a ra f t e rh e a t i n gs a m p l e sa t 7 0 C f o r3 0 m i n . O n t h e o t h e rh a n d , a f t e r 1 4 h o f g r o w t h u n d e r t h e s a m ec o n d i t i o n s ,S - 8 7 c u l t u r e sc o n t a i n e dn o r e f r a c t i l eb o d i e s .T h i s s t r a i nd i d ,h o w e v e r ,p r o d u c ea b o u tt h e s a m e n u m b e r o f r e f r a c t i l es p o r e s a s t h e

p a r e n t a ls t r a i n a f t e rc o n t i n u o u ss h a k i n gf o r2 4 ho r m o r e .I n t r a c e l l u l a r p r o t e a s e s . A f t e r 5 h ( e a r l y

s t a t i o n a r yp h a s e )a n d 8 . 2 5 h o f g r o w t h ,c e l l swere h a r v e s t e d a n d w a s h e d ; e x t r a c t s werem a d e , a n d c a s e i n a s e a s s a y s were p e r f o r m e da sd e s c r i b e d e a r l i e r .A t t h e e a r l i e rt i m e ,a l a r g ep r o p o r t i o no ft h e t o t a lc a s e i n - h y d r o l y z i n ga c t i v -i t y o f t h e p a r e n t s t r a i nwas i n h i b i t a b l eb yEDTA. T h i s p r o p o r t i o nc h a n g e d d r a m a t i c a l l ya s s p o r u l a t i o np r o c e e d e d ( T a b l e1 ) . T h e S - 8 7s t r a i n ,i n a d d i t i o n t o h a v i n gr e d u c e d l e v e l so ft o t a la c t i v i t y ,f o r m e dv e r y l i t t l eenzyme w h i c hi sn o t i n h i b i t e d b y E D T A ;p r o t e o l y t i ca c t i v i t yi nt h e L - 4 e x t r a c t s ,on t he o th er h a n d ,wa s n o ts i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d b y E D TA a t e i t h e rt i m e .Th e L - 4 s t r a i ni n v a r i a b l ywa s f o u n d t o h a v eh i g h e rs p e c i f i ca c t i v i t i e sw i t h r e s p e c tt o t h e

e n z y m ew h i c h w a s n o t s e n s i t i v et o E D TA t h a nd i d e i t h e rs t r a i n1 6 8 o r S - 8 7 .

T h e s e r e s u l t sa r ec o n s i s t e n t w i t h t h e o b s er v a-t i o n so ft h e c as e i na s e z y m o g r a m sp r e p a r e da f t e re l e c t r o p h o r e s i so f t h e c e l l - f r e ee x t r a c t s o n c e l -

l u l o s ea c e t a t es t r i p s .F i g u r e 2 s h o w st h e b a n d so f c a s e i n - h y d r o l y z i n ga c t i v i t yo b s e r v e d a f t e re l e c t r o p h o r e s i so f e x t r a c t s p r e p a r e d f r o m 5 - hc u l t u r e s .T h e u p p e r t h r e e z y m o g r a m ss h o wt h ee l e c t r o p h o r e t i cp o s i t i o n so f t h e t h r e e p u r i f i e de x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s .Th e e l e c t r o p h o r e t i cp o -s i t i o no f b a c i l l o p e p t i d a s eE i n d u p l i c a t er u n sv a r i e d s o m e w h a t ;i t o c c a s i o n a l l ym i g r a t e d t o ap o s i t i o nj u s tt o t h e c a t h o d i c s i d eo f t h e o r i g i n .I m m u n o e l e c t r o p h o r e t i cs t u d i e sw i t h b a c i l l o p e p -t i d a s eF h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e t w o a c t i v i t yb a n d s o b t a i n e d w i t h t h e p u r i f i e de n z y m ea r ei n d i s t i n g u i s h a b l ei m m u n o l o g i c a l l y .Th e n e u t r a lp r o t e a s e u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w a s n o to b t a i n e d f r o m B . s u b t i l i s1 6 8 b u t f r o m a n o t h e rs t r a i no f B . s u b t i l i s ,NRRL B 3 4 4 1 ;we a s s u m et h a t i t i s v e r y s i m i l a rt o t h e n e u t r a l p r o t e a s e o fs t r a i n1 6 8 .

T h e l o w e r t h r e e z y m o g r a m ss h o wt h e e l e c t r o -p h o r e t i c p a t t e r n s o f p r o t e o l y t i ca c t i v i t i e si nc e l l - f r e ee x t r a c t s o f t h e p a r e n t a la n d m u t a n ts t r a i n s .T h e p a r e n t a ls t r a i nh a d t w o m a i nb a n d s o fa c t i v i t y ,o n e c o r r e s p o n d i n gi n p o s i t i o nt o t h e n e u t r a l p r o t e a s e a n d t h e o t h e r n o tc o r r e s p o n d i n gi n p o s i t i o nt o a n y o f t h e p r e v i -o u s l yc h a r a c t e r i z e de x t r a c e l l u l a re n z y m e s . ( A ne n z y m es i m i l a ro r t h e s a m e a s t h a t o b s e r v e da tt h e u n i q u e p o s i t i o nh a s b e e n p r e v i o u s l yo b -s e r v e d b y A u b e r t [ p e r s o n a lc o m m u n i c a t i o n ] . )E x t r a c t s o f t h e m u t a n t s t r a i nL - 4 w e r e m i s s i n gt h e n e u t r a l p r o t e a s e b a n d , b u t d i s p l a y e da ni n t e n s e b a n d f o r t h e u n c h a r a c t e r i z e d p r o t e a s e .E x t r a c t s o fS - 8 7 p r e p a r e da f t e r5 h o fg r o w t hd i dn o t c o n t a i n s u f f i c i e n tp r o t e a s e a c t i v i t yt o g i v ea n y d i s t i n c tb a n d s . I n some e x p e r i m e n t sS - 8 7

e x t r a c t sh a v e d i s p l a y e dw e a k b a n d s o f p r o t e o -l y t i ca c t i v i t y ;t h e m o r e i n t e n s e b a n d i s a l w a y s

T A B L E1 . P r o t e a s e a c t i v i t i e si n c e l l - f r e ee x t r a c t s a

C a s e i n a s e

S t r a i n A g eo f T o t a l I n h i b i -c u l t u r e i n i b i t e d "t i o n( h ) inM%

B a c i l l u ss u b t i l i s1 6 8 ( T r p - ) 5 7 . 7 1 . 7 7 81 6 8 L - 4 5 2 . 7 2 . 6 41 6 8 S - 8 7 5 1 . 0 0 . 1 9 0

B . s u b t i l i s1 6 8 ( T r p ) 8 . 2 5 5 . 4 4 . 6 1 51 6 8L - 4 8 . 2 5 4 . 9 5 . 6 - 1 41 6 8 S - 8 7 8 . 2 5 2 . 2 0 . 4 8 2

a S p e c i f i ca c t i v i t i e s i nu n i t s p e r m i l l i gr am .One u n i t i s t h eamoun t o f p r o t e a s e w h i c h p r o d u c e s a 0 . 0 0 1 O D , , ,u n i ti n c r e a s e p e r h o u r a t 2 6 C i n t h e s t a n d a r d a s s a y .

' I n t h e p r e s e n c e o f 8 mM EDTA.

6 1 4 J . B A C T E R I O L .

b y onA

u g u s t 2 1

,2

0 0 8

j b . a

s m

. or g

D ownl o

a d e d f r om


4/6

B . S U B T I L I SSPORULATION

j b

N

1 6 8

L - 4

S-87

F I G .2 . Z y m o g r a m sc o m p a r i n gt h ep o s i t i o n so f s e v -e r a l c a s e i n - h y d r o l y z i n ga c t i v i t i e sa f t e rp o l y a c e t a t es t r i pe l e c t r o p h o r e s i s .T h e u p p e r t h r e es t r i p ss h o wt h ep o s i t i o n s o ft h et h r e ep u r i f i e de x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s .7 T h el o w e r t h r e es t r i p ss h o w t h e p o s i t i o n so f t h ep r o t e a s e sp r e s e n t i n 5 t o 1 0 M l i t e r so fc e l l - f r e ee x t r a c t s

p r e p a r e d a f t e r5 h o fg r o w t h . E , B a c i l l o p e p t i d a s eE ;N , n e u t r a lp r o t e a s e ;F , b a c i l l o p e p t i d a s eF . T h ea n o d ei s t o t h er i g h t .

t h a t a t t h e e l e c t r o p h o r e t i cp o s i t i o no f t h e n e u -t r a l p r o t e a s e .

I m m u n o l o g i c a lo b s e r v a t i o n s . F i g u r e s3 a n d4 s h o wt h e r e s u l t so fi m m u n o d i f f u s i o na s s a y s o fc e l l - f r e ee x t r a c t s o f s t r a i n s1 6 8 ,L - 4 ,a n d S - 8 7a g a i n s ta n t i s e r a p r e p a r e d a g a i n s tb a c i l l o p e p t i -d a s e E a n d b a c i l l o p e p t i d a s eF , r e s p e c t i v e l y .A tn e i t h e r5 n o r 8 . 2 5 h d i d a n y o ft h e e x t r a c t s s h o w

d e t e c t a b l ea m o u n t so f b a c i l l o p e p t i d a s eE - t y p ea n t i g e n ( F i g .3 ) . H o w e v e r ,a f t e r5 h o f g r o w t h ,e x t r a c t s o fL - 4 c o n t a i n e d a n t i g e n so f t h e b a c i l -l o p e p t i d a s eF t y p e ,a n d a f t e r8 . 2 5 h e x t r a c t s o fb o t h L - 4 a n d 1 6 8 c o n t a i n e d a n t i g e n so f t h eb a c i l l o p e p t i d a s eF t y p e ( F i g .4 ) . A s s h o w n ,

a

F I G .3 . I m m u n o d i f f u s i o np a t t e r n s o f b a c i l l o p e p t i -d a s e E a n d c e l l - f r e ee x t r a c t sw i t h r a b b i ta n t i s e r u mp r e p a r e d a g a i n s tp u r e b a c i l l o p e p t i d a s eF . P a t t e r n a ,E x t r a c t s p r e p a r e d f r o m 5 - h c u l t u r e s ;p a t t e r nb , e x -t r a c t sp r e p a r e df r o m8 . 2 5 - hc u l t u r e s .

a C c i b ()

( i )( 3

( i -

F I G .4 . I m m u n o d i f f u s i o np a t t e r n s o f b a c i l l o p e p t i -d a s e F a n d c e l l - f r e ee x t r a c t s w i t h r a b b i t a n t i s e r u mp r e p a r e d a g a i n s tp u r e b a c i l l o p e p t i d a s eF . P a t t e r n a ,E x t r a c t s p r e p a r e d f r o m 5 - h c u l t u r e s ;p a t t e r nb , e x -t r a c t sp r e p a r e d f r o m8 . 2 5 - hc u l t u r e s .

V

.0t t i .

6 1 5O L . 1 1 4 ,1 9 7 3

. . . . . . . . .

b y onA

u g u s t 2 1

,2

0 0 8

j b . a

s m

. or g

D ownl o

a d e d f r om


5/6

H A G E M A NAN D C A R LTO N

S - 8 7 e x t r a c t sc a u s e d n o p r e c i p i t i nb a n d a te i t h e rt i m e .

I n o t h er s t u d i e s ,i t h a s b e e n f o u n d t h a t o n l yc u l t u r eb r o t h so f s t r a i n1 6 8 c o nt a i n d e t ec ta b l ec r o s s - r e a c t i n gm a t e r i a l ;t h e a n t i g e n d e t e c t e d

w a s i m m u n o l o g i c a l l yi d e n t i c a lt o b a c i l l o p e p t i -d a s e E .

DISCUSSIONT h e s e s t u d i e sh a v e s h o w n t h a t t h e m u t a -

t i o n a ll o s so f a n i n t r a c e l l u l a rn e u t r a lp r o t e a s eh a s n o a p p a r e n t e f f e c to n s p o r u l a t i o n( s t r a i nL - 4 ) ,w h e r e a s t h e m u t a t i o n a l l o s s o f a newu n c h a r a c t e r i z e d i n t r a c e l l u l a rp r o t e a s e r e s u l t si nl o s so fn o r m a ls p o r u l a t i n ga b i l i t y( s t r a i nS - 8 7 ) .

I t s h o u l db e n o t e dt h a tt h e m u t a n t sd e s c r i b e d

h e r e h a v e n o t b e e n s h o w nt o b e p o i n tm u t a n t si n t h e s t r u c t u r a lg e n e s f o ra p a r t i c u l a ri n t e r n a lp r o t e a s e a n d , i n d e e d ,a r ep l e i o t r o p i ci n n a t u r e( b e c a u s e t h e y b o t h p r o d u c e g r e a t l yr e d u c e dl e v e l so fe x t r a c e l l u l a rp r o t e a s e s ) .N e v e r t h e l e s s ,i t s e e m sv e r y p r o b a b l et h a t t h e n e u t r a l p r o t e a s ei s n o t r e q u i r e df o rs p o r u l a t i o n .T h i s i s c o n s i s t -e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n so fM i c h e l a n d M i l l e t( 9 ) o n a s t r a i no f B . s u b t i l i sw h i c h c o m p l e t e l yl a c k e d e x t r a c e l l u l a rn e u t r a lp r o t e a s e a c t i v i t y ,b u t w h i c hs p o r u l a t e dn o r m a l l y .T h ep h y s i o l o g i -c a l r o l eo f t h e n e u t r a lp r o t e a s e i s u n c e r t a i n .I nt h e s e e x p e r i m e n t s t h e s t a t i o n a r y - p h a s ec e l l sw e r e h i g h l yr e s i s t a n tt o l y s o z y m ea c t i o n ;t h u sw e d i d n o t p r e p a r e p r o t o p l a s t sb e f o r ed i s r u p t i n gt h e c e l l sa n d c a n n o t b e e n t i r e l yc e r t a i nt h a t t h ea c t i v i t yo b s e r v e dw a s t r u l yt h a to fa n i n t r a c e l l u -l a r e n z y m e .

We c h o s e t o e x a m i n e c e l l e x t r a c t s p r e p a r e da f t e r 5a n d 8 . 2 5 h o f g r o w t h i n s u p p l e m e n t e dn u t r i e n t b r o t h ,b e c a u s e d u r i n g t h i st i m e p e r i o dg e n e r a lp r o t e i nt u r n o v e r i s w e l lb e g u n ( 1 6 ) .I na d d i t i o nD e u t s c h e r a n d K o r n b e r g ( 3 ) h a v es h o w nt h a t w h e nt h e s t a t i o n a r yp h a s e o f g r o w t hi s r e a c h e d ,t h e l e v e l so f s e v e r a le n z y m e s ( i n -c l u d i n gi n o s i n em o n o p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e( E C 1 . 2 . 1 . 1 4 ) ,m a l i c d e h y d r o g e n a s e ( E C1 . 1 . 1 . 3 9 ) ,a n d a s p a r t y lt r a n s c a r b a m y l a s e ( E C2 . 1 . 3 . 2 . ) )h a v e u n d e r g o n eo r b e g i n t o u n d e r g oar a p i d d e c r e a s e ,p r e s u m a b l yi n d i c a t i n gt h e o n s e to f s p o r u l a t i o n .We h a v e o b s e r v e d a s i m i l a rp a t t e r no f e n z y m el o s s i nB . s u b t i l i s1 6 8 g r o w ni n s u p p l e m e n t e dn u t r i e n tb r o t h ( J . Hagemana n d B . B r o w n , u n p u b l i s h e d d a t a ) .D e u t s c h e ra n d K o r n b e r g( 3 )a l s oo b s e r v e d i n a n a s p o r o g e -n o u s p r o t e a s e l e s ss t r a i ng r o w nu n d e r t h e s a m ec o n d i t i o n s a s t h e w i l d - t y p e c e l l t h a t ,w i t h t h ee x c e p t i o n o f a s p a r t y lt r a n s c a r b a m y l a s e , t h e r ew e r e n o d e c r e a s e s i n e n z y m el e v e l s .T h e p r o -t e a s e ( s )m i s s i n g i n t h e a s p o r o g e n o u ss t r a i nw a sn o t ,h o w e v e r , i d e n t i f i e d .

From t h e r e s u l t sw h i c hwe h a v e r e p o r t e d f o rt h e m u t a n t s t r a i nS - 8 7 ,w e w o u l ds u g g e s t t h a tt h e u n c h a r a c t e r i z e d p r o t e a s e w h i c h i s l a r g e l ym i s s i n g i n t h i s s t r a i nm ay b e n e c e s s a r y f o rs p o r u l a t i o n .We a l s o s u g g e s t t h a t i t i s t h i s

e n z y m ew h i c hi s

r e s p o n s i b l ef o r p r o t e i n t u r n -o v e r d u r i n g s p o r u l a t i o n ,a c o n c l u s i o n b a s e d o np r e l i m i n a r y r e s u l t s( J . H a g e m a n , B . B r o w n ,a n d B . C a r l t o n ;u n p u b l i s h e dd a t a )w h i c h i n d i -c a t e t h a t B . s u b t i l i ss t r a i n1 6 8 a n d s t r a i nL - 4h a v e n e a r l yi d e n t i c a lr a t e so f o v e r a l lt u r n o v e rd u r i n g t h e s p o r u l a t i o np e r i o d ,b u t t h a t s t r a i nS - 8 7 h a s a m a r k e d l y r e d u c e d r a t eo f p r o t e i nt u r n o v e r . I n a d d i t i o n ,R . L . S w i t z e r a n d E . B .M o o r e ( p e r s o n a lc o m m u n i c a t i o n ) h a v e o b -s e r v e d t h a t s t r a i n s1 6 8 a n d L - 4 b e h a v e i d e n t i -c a l l yw i t h r e s p e c t t o r a p i d l o s so fi n o s i n em o n o -p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s ea n d p h o s p h o r i b o s y lp y r o p h o s p h a t es y n t h e t a s e ( E C 2 . 7 . 6 . 1 . )a c t i v i -t i e s d u r i n g t h e s p o r u l a t i o np e r i o d ,b u t t h a ts t r a i nS - 8 7 s h o w sa s l o w e r l o s si n t h e a c t i v i t i e so f t h e s ee n z y m e sd u r i n g t h e same p e r i o d .

We a r e u n a b l e t o e x p l a i nt h e p r e s e n c e o fi m m u n o l o g i c a l l yc r o s s - r e a c t i n gb a n d s w h i c hc e l l - f r e ee x t r a c t s o f s t r a i n s1 6 8 a n d L - 4 f r o ma g a i n s t a n t i b o d i e st o t h e e x t r a c e l l u l a rb a c i l -l o p e p t i d a s eF ( 4 ) ; t h i s i s u n e x p e c t e d , b e c a u s en o e l e c t r o p h o r e t i cb a n d s c o r r e s p o n d i n gt o b a c i l -l o p e p t i d a s eF a c t i v i t ya r e o b s e r v e d i n t h e e x -t r a c t s .Two e x p l a n a t i o n s f o r t h i s o b s e r v a t i o ns e e m p o s s i b l e :e i t h e rb a c i l l o p e p t i d a s eF i s p r e s -e n t i n c e l l - f r e ee x t r a c t s a t l e v e l st o o l o w t o b ed e t e c t e d b y t h e e n z y m a t i c a s s a y m e t h o du s e do r , a n d p e r h a p s m o r e l i k e l y,t h e e x t r a c e l l u l a rb a c i l l o p e p t i d a s eF m ay b e a p a r t i a l l yd e g r a d e do ro t h e r w i s ea l t e r e df o r mo ft h e u n c h a r a c t e r i z e di n t r a c e l l u l a rp r o t e a s e .

ACKNOWLEDGMENTS

We t h a n k B a r b a r aB r o w nf o rt e c h n i c a la s s i s t a n c e ,L e o n a r dK e a y ( M o n s a n t oC o . ,S t . L o u i s ,M i s s o u r i )f o rh i s g e n e r o u s

g i f to f B . s u b t i l i sNRRL B 3 4 4 1n e u t r a lp r o t e a s e ,a n d L . N .O r n s t o nf o rs u g g e s t i n gt h e u s e o f t h i o l e s t e rs u b s t r a t e s .T h i s i n v e s t i g a t i o nw a s s u p p o r t e db y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e

r e s e a r c hg r a n t GM 1 0 7 3 9 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t eo fG e n e r a l M e d i c a lS c i e n c e s t o Ya l e U n i v e r s i t ya n d b y A m e r i -c a n C a n c e rS o c i e t yp o s t d o c t o r a lf e l l o w s h i pP F - 5 6 7t o J . H . H .A c k n o w l e d g m e n ti s made t o t h e d o n o r s o f t h e P e t r o l e u mR e s e a r c h F u n d , a d m i n i s t e r e d b y t h e A m e r i c a n C h e m i c a lS o c i e t y ,f o rp a r t i a ls u p p o r t o ft h i sr e s e a r c h .

LITERATURE CITED

1 . B a l l a s s a ,G . 1 9 6 9 .B i o c h e m i c a l g e n e t i c so f b a c t e r i a ls p o r u l a t i o n .M o l . G e n . G e n e t . 1 0 4 : 7 3 - 1 0 3 .

2 . B o y e r ,H . , a n d B . C . C a r l t o n .1 9 6 8 .P r o d u c t i o no f t w op r o t e o l y t i ce n z y m e sb y a t r a ns f o r m ab l es t r a i n o fB a c i l -l u ss u b t i l i s .A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s . 1 2 8 : 4 4 2 - 4 5 5 .

3 . D e u t s c h e r ,M. P . , a n d A . K o r n b e r g . 1 9 6 8 .B i o c h e m i c a ls t u d i e so f b a c t e r i a ls p o r u l a t i o na n d g e r m i n a t i o n . J .B i o l .C h e m .2 4 3 : 4 6 5 3 - 4 6 6 0 .

4 . H a g e m a n ,J . H . ,a n d B . C . C a r l t o n .1 9 7 0 .An e n z y m a t i c

6 1 6 J . B A C - r E i O L .

b y onA

u g u s t 2 1

,2

0 0 8

j b . a

s m

. or g

D ownl o

a d e d f r om


6/6

V O L .1 1 4 ,1 9 7 3 B . SUBTILIS S I

a n d i m m u n o l o g i c a lc o m p a r i s o no ft wo p r o t e a s e s f r o mat r a n s f o r m a b l es t r a i no fB a c i l l u ss u b t i l i sw i t h t h e " S u b -t i l i s i n s . "A r c h . B i o c h e m .B i o p h y s .1 3 9 : 6 7 - 7 9 .

5 . H a n s o n , R . S . , J . B l i c h a r s k a ,a n d J . S z u l m a j s t e r . 1 9 6 4 .R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e t r i c a r b o x y l i ca c i dc y c l een -zymes a n d s p o r u l a t i o n o f B a c i l l u ss u b t i l i s .B i o c h e m .B i o p h y s .R e s .C o m m u n . 1 7 : 1 - 7 .

6 . K u n i t z , M. 1 9 4 7 .C r y s t a l l i n es o y b e a ni n h i b i t o r .fl. G e n -e r a l p r o p e r t i e s .J . G e n . P h y s i o l .3 0 : 2 9 1 - 3 2 0 .

7 . L o w r y , 0. H . , N . J . R o s e b r o u g h ,A . L . F a r r ,a n d R . J .R a n d a l l . 1 9 5 1 .P r o t e i n measurement w i t h t h e F o l i np h e n o l r e a g e n t . J . B i o l .C h e m .1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .

8 . M a n d e l s t a m ,J . , a n d W. M. Wa i t e s . 1 9 6 8 .S p o r u l a t i o n i nB a c i l l u ss u b t i l i s :t h e r o l eo f e x o p r o t e a s e . B i o c h e m .J .1 0 9 : 7 9 3 - 8 0 1 .

9 . M i c h e l , J . F . ,a n d J . M i l l e t .1 9 7 0 .P h y s i o l o g i c a l s t u d i e sone a r l y - b l o c k e ds p o r u l a t i o nm u t a n t s o fB a c i l l u ss u b t i l i s .J . A p p l . B a c t e r i o l .3 3 : 2 2 0 - 2 2 7 .

1 0 . M i l l e t ,J . 1 9 6 9 .C a r a c t e r i s a t i o nd e d e u x e n d o p e p t i d a s e s

PORULATION 6 1 7

e x c r e t e e sp a r B . s u b t i l i sM a r b u r g a u c o u r sd e l as p o r u l a t i o n .B u l l .S o c .C h i m .B i o l .5 1 : 4 5 7 - 4 6 9 .

1 1 . M i l l e t ,J . , a n d R . A r c h e r . 1 9 6 8 .S p e c i f i c i t 6" h y d r o -p h o b i q u e " d ' u n e e n d o p e p t i d a s e i s o l e ed e B a c i l l u sm e g a t e r i u m .B i o c h e m .B i o p h y s .A c t a 1 5 1 : 3 0 2 - 3 0 5 .

1 2 . M i l n e r , S . N . , - a n d B . M a s s i e . 1 9 6 9 .D e t e c t i o no f p r o t e o -l y t i ce n z y m e s a f t e rc e l l u l o s ea c e t a t ee l e c t r o p h o r e s i s .A n a l . B i o c h e m .3 2 : 1 5 4 - 1 5 7 .

1 3 . P r e s t i d g e ,L . , V . G a g e , a n d J . S p i z i z e n .1 9 7 1 .P r o t e a s ea c t i v i t i e sd u r i n g t h e c o u r s e o f s p o r u l a t i o ni n B a c i l l u ss u b t i l i s .J . B a c t e r i o l .1 0 7 : 8 1 5 - 8 2 3 .

1 4 . S c h a e f f e r ,P . 1 9 6 7 .A s p o r o g e n o u sm u t a n t s o f B a c i l l u ss u b t i l i sM a r b u r g .F o l i aM i c r o b i o l .1 2 : 2 9 1 - 2 9 6 .

1 5 . S p i z i z e n ,J . 1 9 5 8 .T r a n s f o r m a t i o no f b i o c h e m i c a l l yd e f i -c i e n ts t r a i n so fB a c i l l u ss u b t i l i sb y d e o x y r i b o n u c l e a t e .P r o c .N a t . A c a d . S c i .U . S . A . 4 4 : 1 0 7 2 - 1 0 7 8 .

1 6 . S p u d i c h , J . A . , a n d A . K o m b e r g .1 9 6 8 .B i o c h e m i c a ls t u d i e so f b a c t e r i a ls p o r u l a t i o na n d g e r m i n a t i o n . J .B i o l .C h e m .2 4 3 : 4 6 0 0 - 4 6 0 5 .

b y onA

u g u s t 2 1

,2

0 0 8

j b . a

s m

. or g

D ownl o

a d e d f r om

effects of mutational loss of specific intracellular proteases on the sporulation of bacillus...

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