Elucigene® CF-EU2v1

Guide du logiciel d’analyse

Fabriqué par : Gen-Probe Life Sciences Ltd. Heron House Oaks Business Park Crewe Road Wythenshawe Manchester M23 9HZ Pour joindre le service des ventes, le service à la clientèle et le service technique: T: +49 (0) 6122 7076451 F: +49 (0) 6122 7076155 E: eucustomerservice@hologic.com E: eutechnicalsupport@hologic.com

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Analyse GeneMapper Introduction Le chapitre suivant décrit les procédures d’analyse des résultats d’échantillons Elucigene CF-EU2v1 à l’aide des progiciels Applied Biosystems GeneMapper (version 3.7 ou ultérieure). Processus d’analyse Le processus de l’analyse des échantillons est résumé dans l’organigramme présenté ci-dessous.

Traitement des échantillons amplifiés sur l’analyseur génétique

Ouverture du logiciel GeneMapper

Ajout des fichiers d’échantillon fsa au projet

Définition de la Analysis Method (méthode d’analyse) et du Size Standard (marqueur de taille) pour CF-EU2v1

Sélection des panels de mélange appropriés

Traitement de l’analyse de l’échantillon

Enregistrement du projet

Sélection de l’échantillon et ouverture de Plot Window (fenêtre de graphe)

Examen des données de tracé et de génotype

Impression des tracés de l’échantillon Elucigene CF-EU2v1

Notation des génotypes de l’échantillon

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GeneMapper Ouvrir le fichier de l’application GeneMapper et importer les fichiers fsa nécessaires en cliquant sur le bouton ( ) « add samples to project » (Ajouter des échantillons au projet).

Naviguer jusqu’au dossier de traitement souhaité en utilisant l’arborescence des dossiers du côté gauche de la fenêtre. Sélectionner le dossier et cliquer sur le bouton « Add to List >> » (Ajouter à la liste >>). Le dossier de traitement apparaît à présent dans la zone des échantillons à ajouter. Double-cliquer sur l’icône du dossier de traitement dans cette zone pour afficher chaque fichier FSA à importer (figure 1).

Figure 1 : Les échantillons ont été ajoutés à la liste et sont prêts à être ajoutés

au projet.

Ajouter ensuite les échantillons en cliquant sur le bouton ( ) « Add » (Ajouter). Importer les paramètres de l’analyse GeneMapper CF-EU2v1 dans le Gestionnaire GeneMapper Les paramètres CF-EU2v1 pour GeneMapper doivent être importés. Ce processus est contrôlé par l’interface « GeneMapper Manager » (Gestionnaire GeneMapper).

Les paramètres de GeneMapper CF-EU2v1 sont disponibles sur le site Internet de Gen-Probe : www.gen-probe.com. Ils doivent être téléchargés dans un dossier approprié sur le système de l’utilisateur. 1. Ouvrir le programme GeneMapper Manager (Gestionnaire GeneMapper) en cliquant

sur l’icône (figures 2 et 3).

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Figure 2 : Ouverture du Gestionnaire GeneMapper.

Figure 3 : Interface du Gestionnaire GeneMapper.

2. Sélectionner l’onglet « Analysis Methods » (Méthodes d’analyse) puis cliquer sur le bouton Import.

3. Parcourir les dossiers et importer le ou les fichiers de paramètres requis pour l’analyse CFEU2: 3130 ou 3500 (figure 4).

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Figure 4 : Import des méthodes d’analyse.

4. Recommencer le processus, en sélectionnant l’onglet approprié et en important les fichiers correspondants pour : ● Table Settings (paramètres de tableau) ● Plot Settings (paramètres de graphe) ● Size Standards (marqueurs de taille)

Remarque : Les paramètres Cluster Plot Settings (paramètres de regroupement de graphe), Matrices (matrices), SNP Sets (ensembles SNP) et Report Settings (paramètres de compte-rendu) ne nécessitent pas d’import de fichier.

Importer les paramètres du panel CF-EU2v1 dans le Panel Manager (Gestionnaire de panel) Les paramètres du panel CF-EU2v1 pour GeneMapper doivent être importés. Ce processus est contrôlé par l’interface « Panel Manager » (Gestionnaire de panel).

1. Ouvrir l’application GeneMapper Panel Manager (Gestionnaire de panel GeneMapper) en cliquant sur l’icône .

2. Cliquer sur « Panel Manager » (Gestionnaire de panel) dans la fenêtre de navigation de gauche. Le Gestionnaire de panel apparaît à présent surligné en bleu.

3. Sélectionner « File/Import Panels » (Fichier/Importer panels). Parcourir les dossiers et importer le fichier de panel CFEU2 « GeneMapper Panels ».txt (figure 5).

4. Cliquer sur « CFEU2 panel » (Panel CFEU2) dans la fenêtre de navigation de gauche. Le panel CF-EU2v1 apparait à présent surligné en bleu.

5. Sélectionner « File/Import Bin Set » (Fichier/Importer ensemble de segments géniques). Parcourir les dossiers et importer le fichier des segments géniques CFEU2 « GeneMapper Bins ».txt (figure 6).

6. Cliquer sur « Apply » (Appliquer) puis sur « OK ».

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Figure 5 : Import du fichier de panel CFEU2.

Figure 6 : Import du fichier d’ensemble de segments géniques CFEU2.

Modifier le fichier de paramètres d’analyse Il peut être nécessaire de modifier les « Analysis Ranges » (Plages d’analyse) par défaut dans les paramètres d’analyse de CF-EU2v1, de manière à représenter vos conditions d’analyse. La plage minimum d’analyse dépendra du capillaire et du polymère utilisés pendant la collecte des données. Procédure pour visualiser les paramètres actuels d’analyse.

1. Ouvrir le « GeneMapper Manager » (Gestionnaire GeneMapper).

2. Sélectionner l’onglet « Analysis Methods » (Méthodes d’analyse). Le fichier CF-EU2v1 importé est intitulé « CFEU2 Analysis Method » (Méthode d’analyse CFEU2).

3. Cliquer sur « CFEU2 Analysis Method » (Méthode d’analyse CFEU2). La ligne apparaît à présent surlignée.

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4. Cliquer sur le bouton « Open » (Ouvrir) et sélectionner l’onglet « Peak Detector » (Détecteur de pic) (figure 7).

Les plages d’analyse sont paramétrées par défaut pour commencer à 1 600 et se terminer à 8 000.

Figure 7 : Plages d’analyse (surlignées).

Procédure pour déterminer la plage d’analyse adaptée à votre laboratoire :

1. Dans la fenêtre principale GeneMapper, double-cliquer sur le dossier de traitement importé, pour visualiser la liste des fichiers fsa qu’il contient.

2. Sélectionner un fichier fsa.

3. Cliquer sur l’onglet « Raw data » (Données brutes) pour afficher l’électrophérogramme des données brutes.

4. En utilisant le pic GS600v2 LIZ de 100 pb (orange) comme référence, décider d’un point de données inférieur d’environ 100 points de données (figure 8).

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Figure 8 : Détermination de la plage minimum à l’aide des données brutes d’échantillon.

5. S’assurer que la plage maximum d’analyse laisse environ 100 points de données au-delà du pic GS600v2 LIZ de 600 pb.

6. Saisir les nouvelles valeurs dans le fichier d’analyse CF-EU2v1 (en y accédant comme décrit ci-dessus).

Il peut également être nécessaire de modifier le paramètre « Peak Amplitude Thresholds » (Seuils d’amplitude de pic) selon la concentration de l’échantillon. Des échantillons très concentrés présentent un niveau élevé de bruit de fond qui peut interférer avec l’analyse. Pour éviter ceci, le seuil d’amplitude de pic peut être relevé. Par exemple, le fluorochrome vert peut être défini à 100 plutôt qu’à 50. Là encore, ce paramètre est défini dans l’onglet « Peak Detector » (Détecteur de pic) de « CFEU2 Analysis method » (Méthode d’analyse CFEU2) (figure 7). Analyser et génotyper les fichiers CF-EU2v1 importés 1. Dans la fenêtre principale GeneMapper, sélectionner « CFEU2 Table Settings »

(Paramètres de tableau CFEU2) (figure 9).

Figure 9 : Utilisation du menu déroulant pour sélectionner les paramètres de tableau CFEU2.

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2. Dans la fenêtre principale GeneMapper, sélectionner la première cellule sous « Analysis Method » (Méthode d’analyse) et choisir la méthode d’analyse appropriée dans le menu déroulant : CFEU2_3130 ou CFEU2_3500. Répéter la procédure pour le paramètre « Size Standard » (Marqueur de taille) en sélectionnant « CFEU2 size standard » (Marqueur de taille CFEU2) dans le menu déroulant.

3. Sélectionner le panel « CFEU2 » pour chaque échantillon (figure 10). Pour le mélange A, sélectionner le sous-panel contenant le mélange A et pour le mélange B, sélectionner le sous-panel contenant le mélange B.

4. Cliquer sur pour démarrer l’analyse de l’échantillon.

Figure 10 : Sélection des paramètres du panel CFEU2.

Examiner les données de tracé et de génotype de CF-EU2v1 1. Sélectionner « Edit/Sort » (Édition/Trier). Trier les échantillons par « Sample

Name » (Nom d’échantillon) et cliquer sur « OK ».

2. Cliquer sur « Display Plots » pour afficher les graphes.

3. Utiliser le menu déroulant pour sélectionner les paramètres de graphe CF-EU2v1 appropriés.

Pour visualiser le mélange A avec les données poly-T, sélectionner : « CFEU2 Plot PT-on » (Graphe CFEU2, PT activé)

Pour visualiser le mélange A sans les données poly-T, sélectionner : « CFEU2 Plot PT-off » (Graphe CFEU2, PT désactivé)

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Figure 11 : Utilisation du menu déroulant pour sélectionner les paramètres de graphe CFEU2.

4. La fenêtre de graphe affiche les données de tracé de l’échantillon (figure 12).

5. Il est recommandé d’activer le paramètre « Single click editing » (Modification par clic unique) sur la fenêtre de graphe. Pour cela, sélectionner « Alleles/set click editing » (Allèles/Paramétrage de l’édition par clic) et s’assurer que cette option est cochée.

Figure 12 : Fenêtre de graphe d’échantillon affichant les données de tracé étiquetées.

Elucigene CF-EU2v1 mélange A

Elucigene CF-EU2v1 mélange B

Noter les pics de diagnostic Une personne a deux copies du gène CFTR. Quand ces copies ont la même séquence pour un allèle donné, la personne est décrite comme étant homozygote pour ce site. Quand les copies ont une séquence différente pour un allèle donné, la personne est décrite comme étant hétérozygote (figure 13).

Le mélange A (mutant) détermine si une personne porte une mutation, indiquée par la présence d’un pic bleu. Le mélange mutant contient également des amorces de l’allèle normal F508del, ce mélange peut donc déterminer si une personne est normale pour F508del (pic vert uniquement), homozygote pour F508del (pic bleu uniquement) ou hétérozygote pour F508del (pics bleu et vert).

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Si une autre mutation est observée, l’échantillon peut être amplifié avec le mélange B (type sauvage) pour déterminer le statut homozygote ou hétérozygote. La présence d’un pic vert pour l’allèle donné du mélange de type sauvage indique que la personne est hétérozygote, et l’absence du pic vert indique que la personne est homozygote pour cette mutation particulière.

Figure 13 : Exemples de personnes a) normale, b) hétérozygote et c) homozygote pour l’allèle 711+1G>T.

A B C

Une personne qui porte deux mutations différentes est dénommée hétérozygote composite (figure 14).

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Figure 14 : Exemples d’échantillons hétérozygotes composites. A) G85E/D1152H

B) F508del/E60X.

A

B

Les deux mélanges comportent deux marqueurs STR hypervariables (rouge). Ceci permet de comparer l’échantillon amplifié avec le mélange mutant et l’échantillon amplifié avec le mélange de type sauvage pour réduire le risque de confusion d’échantillon (figure 15). L’absence de ces marqueurs STR indique un échantillon invalide. La présence des marqueurs STR à très faible rfu indique un échantillon faible à analyser avec précaution.

Figure 15 : Graphes du mélange A et du mélange B affichant les deux marqueurs STR d’une personne.

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Les marqueurs STR hypervariables peuvent être masqués en éliminant de la fenêtre de graphe les données du fluorochrome rouge. L’élimination des données des fluorochromes bleu et vert facilite la visualisation des marqueurs STR.

Désignation de marqueur GeneMapper Quand les données de tracé analysées sont visualisées dans GeneMapper, les pics de diagnostic du mélange A sont indiqués par le nom et le numéro du marqueur. Les pics de diagnostic du mélange B seront indiqués uniquement par le numéro du marqueur.

Les données de pic d’un marqueur détecté étiqueté peuvent être examinées de manière plus détaillée en faisant passer le curseur de la souris au-dessus de l’étiquette du marqueur concerné. Dans ce cas, le nom du marqueur, la taille et la hauteur du pic s’affichent au bas de la fenêtre de graphe des échantillons.

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La corrélation entre les numéros de marqueur et les marqueurs est présentée ci-dessous.

Marqueurs détectés

Marqueur n° Marqueur Plage de taille

du produit en bp (données 3130/POP7)

01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195

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* Tailles de l’allèle 5T Remarque : Les plages de taille de chaque marqueur peuvent varier selon l’instrument et le polymère utilisé.

Marqueur CF-EU2v1 dI507del En raison de l’emplacement de la délétion I507 sur le gène CFTR, il est possible de détecter la présence de ce marqueur par un déplacement de 3 pb de la taille du pic F508del ainsi que par un pic spécifique du mutant I507del. Si un seul allèle mutant I507del est présent, le pic I507del mutant sera observé sous forme d’un pic bleu à environ 159 pb. Un pic F508del de type sauvage sera présent, mais à environ la moitié de la hauteur du pic normalement associé à un génotype homozygote de type sauvage. Celui-ci est observé sous forme d’un pic vert à environ 167 pb. Un pic vert supplémentaire sera également observé à environ 164 pb (figure 16).

Figure 16 : Échantillon hétérozygote I507del.

Un échantillon I507del/F508del comportera un pic F508del vert de type sauvage déplacé à environ 164 pb (3 pb de moins que la normale), un pic mutant bleu F508del à 166 pb et un pic mutant bleu I507del à environ 159 pb. Un échantillon I507del/I507del comportera un pic bleu à environ 159 pb et un seul pic vert à environ 164 pb (inférieur de 3 pb par rapport au pic F508del normal observé en l’absence de I507del). Il faut noter que la présence d’une mutation F508del empêche le fonctionnement de l’amorce I507 de type sauvage. Donc, une personne homozygote pour F508del n’aura pas de pic I507 de type sauvage dans le mélange de type sauvage et une personne hétérozygote pour F508del aura un pic I507 de type sauvage de hauteur réduite dans le mélange de type sauvage.

Marqueur Plage de taille du

produit en pb POP7/3130

5T (9) 117,25 – 118,75 5T (10) 119,25 – 120,75 5T (11) 121,25 – 122,75 5T (12) 123,25 – 124,75 5T (13) 125,25 – 126,75

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Marqueurs poly-T Elucigene CF-EU2v1 contient des amorces ARMS fluorescentes marquées au NED (jaune) pour la détection des variants IVS8-5T, IVS8-7T et IVS8-9T. L’information poly-T d’un échantillon peut être déterminée en activant la visualisation des données du fluorochrome jaune dans les paramètres de GeneMapper CF-EU2v1. L’opérateur peut donc choisir de visualiser ces données selon le besoin dans la procédure d’analyse du laboratoire. Remarque : Le mélange B ne comporte pas d’amorces poly-T, les produits seront donc visualisés uniquement dans les échantillons du mélange A. Analyse poly-T Les exemples GeneMapper suivants présentent des morphologies de pic caractéristiques des régions testées de variant IVS8. Example 1: Échantillon IVS8-5T / IVS8-9T L’exemple ci-dessous présente le résultat du mélange A observé avec les paramètres de graphe « CFEU2 Plot PT-on » (Graphe CFEU2, PT activé).

La suppression des informations de couleur verte et bleue dans les paramètres de graphe pour le même échantillon montre clairement le marqueur poly-T, voir ci-dessous.

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Example 2: Échantillon IVS8-7T / IVS8-7T.

Example 3 : Échantillon IVS8-7T / IVS8-7T (variabilité de la répétition de TG).

Les deux pics sont dus à l’hétérozygotie de la région répétée TG, qui se situe au sein de notre amplicon. Cet effet peut également être observé avec des échantillons homozygotes 5T et 9T. Il est donc possible de déterminer le nombre de répétitions de TG au sein de chaque variant de polythimidine IVS8. Example 4 : Échantillon IVS8-9T / IVS8-9T.

Avertissement important Dans certaines conditions d’analyse, des artéfacts de fluorochrome peuvent être observés et interférer avec l’analyse de routine. Il est important que l’utilisateur soit averti de la possibilité d’interférence pour garantir la bonne analyse des données. Les artéfacts de fluorochrome marqué peuvent être observés sous forme de petits pics bleus ou verts. Ces artéfacts de fluorochrome sont généralement d’une taille inférieure à 100 pb et n’interfèrent normalement pas avec l’analyse des données. Dans des conditions normales, ces pics artéfacts sont insignifiants par rapport aux pics d’amplicon réel et n’entraînent pas de problèmes avec l’analyse. Cependant, quand l’amplicon est chargé en faible quantité, peut-être en raison d’ADN génomique restreint, les pics d’artéfact de fluorochrome apparaissent relativement plus grands, et peuvent être analysés comme des pics d’amplicon réels.

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Analyse GeneMarker Introduction Le paragraphe suivant décrit les procédures pour l’analyse des résultats Elucigene CF-EU2v1 à l’aide du progiciel SoftGenetics GeneMarker V1.95. Processus d’analyse Le processus d’analyse des échantillons est résumé dans l’organigramme présenté ci-dessous.

Traitement des échantillons amplifiés sur l’analyseur génétique

Ouverture du logiciel GeneMarker

Ajout des fichiers d’échantillon fsa au projet

Sélectionner le panel CF-EU2v1 et les paramètres d'analyse appropriés

Traitement de l’analyse de l’échantillon

Sélectionner « Mutant + Wild-type » (Mutant + type sauvage) ou « Mutant Only »

(Mutant uniquement)

Sélectionner l’application : ARMS/Comparative Analysis (Analyse ARMS/comparative)

Sélectionner Print (Imprimer)

Sélectionner Preview (Aperçu)

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Ajouter des fichiers d’échantillons à GeneMarker Ouvrir le fichier de l’application GeneMarker et sélectionner « Open Data » (Ouvrir données) à l’invite. La boîte de dialogue « Open Data Files » (Ouvrir fichiers de données) apparaît.

Cliquer sur le bouton « Add » (Ajouter). La boîte de dialogue Open (Ouvrir) s’affiche.

Parcourir les dossiers jusqu’au répertoire contenant les fichiers de données brutes. ● Sélectionner tous les fichiers par CTRL+A ou utiliser les touches CTRL et/ou

SHIFT pour sélectionner des échantillons individuels. ● Cliquer sur le bouton Open (Ouvrir) dans la boîte de dialogue Open (Ouvrir).

Les fichiers sélectionnés apparaissent dans la zone Data File List (Liste de fichiers de données) (figure 1).

Cliquer sur le bouton OK de la boîte de dialogue Open Data Files (Ouvrir les fichiers de données) pour charger les échantillons dans GeneMarker.

Le logiciel ouvrira alors automatiquement la fenêtre Raw Data Analysis (Analyse des données brutes) (figure 2).

Figure 1 : Échantillons ajoutés à la liste de fichiers de données.

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Figure 2 : Fenêtre d’analyse des données brutes

Traiter les données Une fois les fichiers de données brutes chargés dans GeneMarker, ils sont prêts à être traités. L’étape de traitement comprend l’application d’un marqueur de taille, le filtrage des pics de bruit et la comparaison avec un panel d’allèles connu si cela est souhaité.

GeneMarker associe toutes les étapes en un outil simple appelé Run Wizard (Assistant de traitement) (figure 3). Pour accéder au Run Wizard (Assistant de traitement), il suffit de cliquer sur l’icône Run Project (Traiter projet) dans la barre d’outils principale.

Figure 3 : Assistant de traitement – Fenêtre Sélection de la matrice

Arborescence des échantillons Image synthétique du gel

Courbe des données brutes

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Assistant de traitement – Fenêtre Sélection de la matrice

Créer une matrice CF-EU2v1 et sélectionner les paramètres appropriés de Size Standard (Marqueur de taille), Standard Colour (Couleur du marqueur de taille) et Analysis type (Type d’analyse) (tels que présentés dans la figure 3).

Sélectionner le panel approprié en fonction de la plateforme utilisé, par ex. CF-EU2v1_POP7. Ceux-ci sont disponibles sur le site Internet de Gen-Probe : www.gen-probe.com. Ils doivent être téléchargés dans un dossier approprié sur le système de l’utilisateur.

Cliquer sur « Next » (Suivant) pour continuer.

Run Wizard (Assistant de traitement) – Data Process (Traitement des données)

La fenêtre Data Process (Traitement des données) du Run Wizard (Assistant de traitement) permet à l’utilisateur de sélectionner les paramètres de filtrage des pics.

Vérifier que les paramètres sont sélectionnés comme sur la figure 4 ci-dessous.

Cliquer sur « Next » (Suivant) pour continuer.

Figure 4 : Assistant de traitement – Fenêtre Traitement des données

REMARQUE : Pour les données du 3500, augmenter le paramètre Min Intensity (Intensité minimale) à 300.

Run Wizard (Assistant de traitement) – Additional settings (Paramètres supplémentaires)

Aucun paramètre supplémentaire n’est requis pour réaliser l’analyse CF-EU2v1.

Cliquer sur « OK » pour continuer.

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Figure 5 : Assistant de traitement – Paramètres supplémentaires.

Boîte de dialogue Data Processing (Traitement des données) Après avoir cliqué sur OK dans la boîte de dialogue Additional Settings (Paramètres supplémentaires) du Run Wizard (Assistant de traitement), la boîte de dialogue Data Processing (Traitement des données) apparaît (figure 6). Les données brutes sont traitées et mesurées, puis les paramètres de filtrage sont appliqués et le panel CF-EU2v1 sélectionné est appliqué.

Cliquer sur « OK » dans la boîte de dialogue Data Processing (Traitement des données) quand l’analyse est terminée.

Figure 6 : Boîte de dialogue Traitement des données.

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Fenêtre principale d’analyse La disposition de la fenêtre principale d’analyse (figure 7) de GeneMarker est simple à utiliser. Cette disposition comprend les éléments suivants :

● Liste des fichiers d’échantillon – affichée dans la partie gauche de la fenêtre.

● Image synthétique du gel – affichée en haut de la fenêtre.

● Électrophérogrammes des données – en dessous de l’image du gel.

● Tableau de compte-rendu – affiché dans la partie droite de la fenêtre.

Il est important de vérifier sur cette fenêtre que tous les pics appropriés de chaque profil ont été correctement dénommés.

Double-cliquer successivement sur chaque échantillon dans l’arborescence des fichiers d’échantillon du côté gauche de l’écran. Cliquer avec le bouton droit sur les pics en question et choisir dans les options de la boîte de dialogue, par ex. modifier ou supprimer l’allèle, confirmer ou annuler la confirmation selon le cas.

Quand un pic n’est pas dénommé car il se situe en dessous du seuil, il est possible d’affecter manuellement un allèle. Sélectionner le « Marker » (Marqueur) approprié dans la liste déroulante, tout en maintenant la touche SHIFT enfoncée, cliquer avec le bouton droit sur le pic en question, cliquer sur « Insert Allele » (Insérer allèle) puis sur « OK ». Quand les mélanges A et B sont analysés ensemble, il est important de s’assurer que tous les pics STR ont été dénommés.

Une fois ce processus terminé pour tous les échantillons, l’étape suivante d’analyse peut être réalisée.

Figure 7 : Fenêtre principale d’analyse

Arborescence des fichiers

d’échantillon Image synthétique

du gel Électrophérogramme Tableau de

compte-rendu

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Analyse des mutants uniquement (mélange A) Dans la fenêtre principale d’analyse, sélectionner l’option de menu déroulant « Applications » en haut de l’écran.

Sélectionner « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative) puis « Mutant Only » (Mutants uniquement). Dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) sélectionner « Poly-T Analysis » (Analyse poly-T) si cette analyse est souhaitée (figure 8).

Cliquer sur « Preview » (Aperçu) dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) pour visualiser le compte-rendu Elucigene CF-EU2v1 des mutants uniquement (mélange A) (figure 11). L’opérateur peut examiner et imprimer chaque compte-rendu d’échantillon à partir de cette fenêtre.

Cliquer sur « OK » dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) pour imprimer le compte-rendu Elucigene CF-EU2v1 des mutants uniquement (mélange A) (figure 11) sans l’examiner.

Figure 8 : Boîte de dialogue des paramètres d’impression ARMS/comparative des mutants uniquement.

Afficher l’aperçu du compte-rendu Elucigene CF-EU2v1

Compte-rendu des mutants uniquement (Mélange A)

Cliquer sur « Preview » (Aperçu) dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) pour visualiser le compte-rendu du mélange A Elucigene CF-EU2v1 (figure 11). L’opérateur peut examiner et imprimer chaque compte-rendu d’échantillon à partir de cette fenêtre.

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Figure 11 : Fenêtre du compte-rendu CF-EU2v1 des mutants uniquement (Mélange A).

Le compte-rendu Elucigene CF-EU2v1 comprend les informations suivantes. ● En-tête de rapport : comporte les informations sur l’analyse, le projet,

l’échantillon et les paramètres. ● Case de signature : emplacement pour la date et les initiales des examinateurs

du compte-rendu. ● Électrophérogramme : comparable à la fenêtre d’analyse ARMS/comparative,

affiche toutes les couleurs de fluorochrome du tracé de l’échantillon. ● Tableau de compte-rendu : le tableau principal affiche toutes les mutations

testées dans ce kit. La présence ou l’absence d’une mutation est signalée par un 1 ou un 0. À noter que le statut complet de zygotie peut être indiqué uniquement pour le locus F508 quand seul le mélange A est analysé. Le deuxième tableau affiche le statut poly-T de l’échantillon dans le cas où la fonction a été sélectionnée.

Analyse des mélanges mutant + type sauvage (A et B) Dans la fenêtre principale d’analyse, sélectionner l’option de menu déroulant « Tools » (Outils) en haut de l’écran puis « File Name Group Tool » (Outil de groupe de nom de fichier). Ceci ouvre l’écran « File Name Group Editor » (Éditeur de groupe de nom de fichier). Dans la boîte de dialogue « Compare by Section » (Section Comparer selon), saisir le numéro de la colonne dans laquelle le nom de l’échantillon apparaît. Dans la boîte de dialogue « Match to Identifier by Section » (Section Apparier avec l’identifiant selon), saisir le numéro de la colonne dans laquelle le type de mélange (A ou B) apparaît.

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Dans la boîte de dialogue « Control Identifier » (Identifiant de contrôle), saisir « A ». Cliquer sur le bouton « Match » (Apparier) et les échantillons appariés apparaitront dans la partie droite de la boîte de dialogue (figure 9).

Figure 9 : Écran de l’éditeur de groupe de nom de fichier.

Enregistrer le groupe apparié dans un dossier approprié en cliquant sur l’icône située en haut de la partie « Matched Groups » (Groupes appariés).

Dans la fenêtre principale d’analyse, sélectionner l’option de menu déroulant « Applications » en haut de l’écran.

Sélectionner « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative) puis « Mutant + Wildtype» (Mutant + type sauvage). Dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative), commencer par sélectionner le « Group File » (Fichier de groupe) approprié, puis sélectionner « Poly-T Analysis » (Analyse poly-T) si cette analyse est souhaitée et/ou « STR Check » (Vérification STR) (figure 10a). Puis cliquer sur « OK » pour visualiser la fenêtre « ’ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative) (figure 10b).

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Figure 10a : Boîte de dialogue des paramètres de l’analyse ARMS/comparative.

Figure 10b : Fenêtre de l’analyse ARMS/comparative.

Afficher l’aperçu du compte-rendu Elucigene CF-EU2v1

Compte-rendu mutant + type sauvage (Mélange A + B)

Cliquer sur l’icône d’impression dans la fenêtre « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative). Sélectionner « Poly-T Analysis » (Analyse poly-T) si cette analyse est souhaitée et/ou « STR Check » (Vérification STR) (figure 12a). Cliquer sur « Preview » (Aperçu) pour visualiser le compte-rendu Elucigene CF-EU2v1 A + B (figure 12b). L’opérateur peut examiner et imprimer chaque compte-rendu d’échantillon à partir de cette fenêtre.

Fichiers regroupés Électrophérogrammes

Histogramme de différence

Tableau de compte-rendu

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Figure 12a : Boîte de dialogue des paramètres d’impression ARMS/Comparative.

Figure 12b : Fenêtre de compte-rendu CF-EU2v1 Mutant + type sauvage (Mélanges A + B).

Le compte-rendu Elucigene CF-EU2v1 comprend les informations suivantes. ● En-tête de rapport : comporte les informations sur l’analyse, le projet,

l’échantillon et les paramètres.

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● Case de signature : emplacement pour la date et les initiales des examinateurs du compte-rendu. Une colonne supplémentaire de vérification est prévue pour les initiales de l’examinateur.

● Électrophérogramme : comparable à la fenêtre d’analyse ARMS/comparative, affiche toutes les couleurs de fluorochrome du tracé de l’échantillon.

● Tableaux de compte-rendu : le tableau principal affiche toutes les mutations testées dans ce kit. Le statut homozygote ou hétérozygote est indiqué par le nombre d’allèles de type sauvage ou mutant rapporté pour chaque locus. Le deuxième tableau affiche le statut poly-T de l’échantillon dans le cas où la fonction a été sélectionnée.

● Histogramme de comparaison de tracé : GeneMarker calcule les différences d’allèle entre les tracés des mélanges A et B et les affiche sur un histogramme situé en dessous des électrophérogrammes d’échantillon.

Étiquettes de pic

Les étiquettes de pic sont codées couleur selon la qualité de la correspondance entre le pic détecté et les segments géniques observés. Dans l’électrophérogramme, les marqueurs sont indiqués par des barres grises horizontales et le centre des pics est indiqué par une barre grise verticale.

Les pics situés en dehors des marqueurs ou des segments géniques du panel sont marqués en rouge en Off Ladder (Hors échelle) (OL).

Remarque : Les différences de type de polymère de machine et de marqueur de taille peuvent nécessiter l’optimisation des segments géniques des marqueurs, de manière à adapter le logiciel aux conditions de traitement utilisées. Davantage d’informations sur la modification des segments géniques de panel peuvent être consultées dans le manuel GeneMarker fourni avec le logiciel.

Noter les pics de diagnostic Une personne a deux copies du gène CFTR. Quand ces copies ont la même séquence pour un allèle donné, la personne est décrite comme étant homozygote pour ce site. Quand les copies ont une séquence différente pour un allèle donné, la personne est décrite comme étant hétérozygote (figure 13).

Le mélange A (mutant) détermine si une personne porte une mutation, indiquée par la présence d’un pic bleu. Le mélange mutant contient également des amorces de l’allèle normal F508del, ce mélange peut donc déterminer si une personne est normale pour F508del (pic vert uniquement), homozygote pour F508del (pic bleu uniquement) ou hétérozygote pour F508del (pics bleu et vert).

Si une autre mutation est observée, l’échantillon peut être amplifié avec le mélange B (type sauvage) pour déterminer le statut homozygote ou hétérozygote. La présence d’un pic vert pour l’allèle donné du mélange de type sauvage indique que la personne est hétérozygote, et l’absence du pic vert indique que la personne est homozygote pour cette mutation particulière.

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Figure 13 : Exemples de personnes a) normale, b) hétérozygote et c) homozygote pour l’allèle 711+1G>T.

A B C

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Une personne qui porte deux mutations différentes est dénommée hétérozygote composite (figure 14).

Figure 14 : Exemples d’échantillons hétérozygotes composites. A) W1282X/S1251N

B) F508del/R560T.

A

B

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Les deux mélanges comportent deux marqueurs STR hypervariables (rouge). Ceci permet de comparer l’échantillon amplifié avec le mélange mutant et l’échantillon amplifié avec le mélange de type sauvage pour réduire le risque de confusion d’échantillon (figure 15). L’absence de ces marqueurs STR indique un échantillon invalide. La présence des marqueurs STR à très faible rfu indique un échantillon faible à analyser avec précaution.

Figure 15 : Graphes du mélange A et du mélange B affichant les deux marqueurs STR d’une personne.

Les marqueurs STR hypervariables peuvent être masqués en décochant la case « STR Check » (Vérification STR) dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) si le mélange A est le seul analysé ou dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative) si les mélanges A et B sont analysés. L’affichage des données du fluorochrome rouge seul dans la fenêtre « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative) facilite la visualisation des marqueurs STR.

Désignation du marqueur GeneMarker Quand les données des tracés analysés sont visualisées dans GeneMarker, les pics de diagnostic du mélange A sont étiquetés avec le nom du marqueur. Les pics de diagnostic du mélange B seront étiquetés uniquement avec le numéro de marqueur et le suffixe « WT » quand ils sont visualisés en sélectionnant uniquement le fluorochrome vert.

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La corrélation entre les numéros de marqueur et les marqueurs est présentée ci-dessous.

Marqueurs détectés

Marqueur n° Marqueur Plage de taille

de produit en bp (données 3130/POP7)

01 R347H 110.5-116.5 02 R347P 117-123 03 2789+5 G>A 124-130 04 3120+1 G>A 132.5-138.5 05 711+1 G>T 141.5-147.5 06 R334W 147.5-154 07 I507del 156-162.5 08 F508del 163-169 09 3849+10kb C>T 172-178 10 1677delTA 180-188.5 11 1078delT 193-199 12 V520F 206-211.5 13 L206W 215-220 14 W1282X 224.5-230.5 15 R560T 234.5-240.5 16 2347delG 242-246 17 Q890X 250-252 18 R553X 255.5-261.5 19 G551D 265-267 20 S549R(T>G) 267.5-269.5 21 S549N 275-280 22 M1101K 282-288 23 G542X 289-295.5 24 3905insT 297-303.5 25 Y1092X(C>A) 308-314 26 S1251N 315-321 27 444delA 323-326 28 1811+1.6kb A>G 332-338 29 1717-1 G>A 341.5-347.5 30 R117H 349-355 31 R117C 357-360 32 N1303K 360-366.5 33 Y122X 367-373 34 394delTT 377-383 35 G85E 384-390 36 R1066C 391-397 37 1898+1 G>A 398.5-404.5 38 W846X 406-411 39 2184delA 413-418 40 D1152H 423-429 41 CFTRdel2_3 433-439 42 P67L 439.5-445.5 43 2143delT 446-450.5 44 E60X 453.5-460.5 45 3659delC 461-465.5 46 3272 470-476 47 621+1G 485.5-491.5 48 A455E 496-503 49 R1162X 506-512 50 R1158X 516.5-524.5 5T* IVS8-5T 110-130 7T IVS8-7T 140-160 9T IVS8-9T 175-195

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* Tailles de l’allèle 5T

Remarque : Les plages de taille de chaque marqueur peuvent varier selon l’instrument

et le polymère utilisé.

Marqueur CF-EU2v1 dI507del En raison de l’emplacement de la délétion I507 sur le gène CFTR, il est possible de détecter la présence de ce marqueur par un déplacement de 3 pb de la taille du pic F508del ainsi que par un pic spécifique du mutant I507del. Si un seul allèle mutant I507del est présent, le pic I507del mutant sera observé sous forme d’un pic bleu à environ 159 pb. Un pic F508del de type sauvage sera présent, mais à environ la moitié de la hauteur du pic normalement associé à un génotype homozygote de type sauvage. Celui-ci est observé sous forme d’un pic vert à environ 167 pb. Un pic vert supplémentaire sera également observé à environ 164 pb (figure 16).

Figure 16 : Échantillon hétérozygote I507del.

Un échantillon I507del/F508del comportera un pic F508del vert de type sauvage déplacé à environ 164 pb (3 pb de moins que la normale), un pic mutant bleu F508del à 166 pb et un pic mutant bleu I507del à environ 159 pb. Un échantillon I507del/I507del comportera un pic bleu à environ 159 pb et un seul pic vert à environ 164 pb (inférieur de 3 pb par rapport au pic F508del normal observé en l’absence de I507del).

Marqueur Plage de taille du

produit en pb POP7/3130

5T (9) 117,25 – 118,75 5T (10) 119,25 – 120,75 5T (11) 121,25 – 122,75 5T (12) 123,25 – 124,75 5T (13) 125,25 – 126,75

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Il faut noter que la présence d’une mutation F508del empêche le fonctionnement de l’amorce I507 de type sauvage. Donc, une personne homozygote pour F508del n’aura pas de pic I507 de type sauvage dans le mélange de type sauvage et une personne hétérozygote pour F508del aura un pic I507 de type sauvage de hauteur réduite dans le mélange de type sauvage. Marqueurs poly-T Elucigene CF-EU2v1 contient des amorces ARMS™ fluorescentes marquées au NED (jaune) pour la détection des variants IVS8-5T, IVS8-7T et IVS8-9T. L’information poly-T d’un échantillon peut être déterminée en activant la visualisation des données du fluorochrome jaune dans la fenêtre principale d’analyse de GeneMarker (figure 7). Les marqueurs poly-T peuvent être masqués en décochant « Poly-T Analysis » (Analyse poly-T) dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) si le mélange A est le seul analysé ou dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Analysis » (Analyse ARMS/comparative) si les mélanges A et B sont analysés. L’opérateur peut donc choisir de visualiser ces données selon le besoin dans la procédure d’analyse du laboratoire. Remarque : Il n’existe pas d’amorces poly-T dans le mélange B, les produits seront

donc visualisés uniquement dans les échantillons du mélange A. Analyse poly-T Les exemples suivants de GeneMarker présentent des morphologies de pic caractéristiques des régions testées de variant IVS8.

Les exemples ci-dessous présentent le résultat du mélange A observé avec le paramètre « Poly-T Analysis » (Analyse poly-T) sélectionné dans la boîte de dialogue « ARMS/Comparative Print Settings » (Paramètres d’impression ARMS/comparative) quand le mélange A est le seul analysé.

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Example 1 : Échantillon IVS8-5T / IVS8-7T.

Example 2 : Échantillon IVS8-7T / IVS8-7T.

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Example 3 : Échantillon IVS8-7T / IVS8-7T (variabilité de la répétition de TG).

Les deux pics sont dus à l’hétérozygotie de la région répétée TG, qui se situe au sein de notre amplicon. Cet effet peut également être observé avec des échantillons homozygotes 5T et 9T. Il est donc possible de déterminer le nombre de répétitions de TG au sein de chaque variant de polythimidine IVS8.

Example 4 : Échantillon IVS8-9T / IVS8-9T.

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Avertissement important Dans certaines conditions d’analyse, des artéfacts de fluorochrome peuvent être observés et interférer avec l’analyse de routine. Il est important que l’utilisateur soit averti de la possibilité d’interférence pour garantir la bonne analyse des données. Les artéfacts de fluorochrome marqué peuvent être observés sous forme de petits pics bleus ou verts. Ces artéfacts de fluorochrome sont généralement d’une taille inférieure à 100 pb et n’interfèrent normalement pas avec l’analyse des données. Dans des conditions normales, ces pics artéfacts sont insignifiants par rapport aux pics d’amplicon réel et n’entraînent pas de problèmes avec l’analyse. Cependant, quand l’amplicon est chargé en faible quantité, peut-être en raison d’ADN génomique restreint, les pics d’artéfact de fluorochrome apparaissent relativement plus grands, et peuvent être analysés comme des pics d’amplicon réels. ELUCIGENE est une marque commerciale de Gen-Probe Life Sciences Ltd. ARMS est une marque commerciale de AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP est une marque commerciale de Qiagen GmbH. GENEMARKER est une marque commerciale de SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, VIC, NED, POP-7, HI-DI et PET sont des marques commerciales de Life Technologies Corporation. REMARQUE À L’ATTENTION DE L’ACHETEUR : LICENCE RESTREINTE Les polynucléotides marqués par les fluorochromes VIC, NED et PET et/ou leur utilisation peuvent être protégés par un ou plusieurs brevets appartenant à Applied Biosystems, LLC. Le prix d’achat de ce produit comprend des droits limités non transférables conformément à certaines demandes de brevets appartenant à Applied Biosystems, LLC pour l’utilisation de cette quantité de produit destinée uniquement aux activités de détection des cibles de l’acheteur dans le cadre d’un diagnostic humain. Aucun autre droit n’est octroyé. De plus amples informations sur les licences d’achat concernant les fluorochromes mentionnés plus haut peuvent être obtenues en contactant le directeur des licences, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, États-Unis. Copyright 2013 Gen-Probe Life Sciences Ltd.

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