ACTIVIDAD ANTAGONICA DE HONGOSENDOFITOS DE PLANTAS MEDICINALES DEL

ECUADOR SOBRE BACTERIAS PATOGENAS(Antagonic activity of endophytic fungi from

medicinal plants of Ecuador on pathogenic bacteria)

Ramrez R. Jorge Yandry1, Ernesto Delgado Fernandez2, Marinella Rodolfi3, Tosi Solveig3

1Centro de Biologa Celular y Molecular, Universidad Tcnica particular de Loja,san Cayetano alto s/n. 11 01 608, Loja-Ecuador.

2 Universidad Politcnica Salesiana Calle Vieja 12-30 y Elia Liut, Cuenca, Ecuador 3Sezione di Micologia, Dipartimento di Ecologia del Territorio e degli Ambienti Terrestri,

Universit di Pavia, via S. Epifanio 14, 27100, Pavia, Italy, solveig.tosi@unipv.it

Palabras Clave: Plantas medicinales, hongos endfitos, antagonismo, bacterias.Keys words: Medicinal plants, Endophytic fungi, antagonism, bacteria.

RESUMEN

Mediante una investigacin a lo largo del sectorsuburbano de la ciudad de Loja-Ecuador, dedicada alcultivo de plantas medicinales, se aslaron los hongosendfitos asociados a Baccharis latifolia (Ruiz & Pav.)Pers., Baccharis obtusifolia Kunth, Piper barbatumKunth, Borreria laevis (Lam.) Grises, Chuquiraguajussieui J.F. Gmel y Bidens andicola Kunth. Los taxafngicos ms frecuentes fueron: Alternaria, Aspergillus,Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma, adems dealgunos representantes de los grupos: coelomycetes,sinnematosos y Zygomycota. La mayor dominanciafngica correspondi a integrantes de los denominadosMycelia sterilia, siendo de particular inters comoposibles endfitos. Se evalu adems la interaccinantagnica de siete aislados fngicos frente a bacterias:Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumomiae,Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. La mayorade las cepas fngicas estudiadas presentaron actividad,pero los resultados ms prometedores se evidenciaronen un aislado de Mycelia sterilia.

ABSTRACT

As a result of an investigation carried out alongthe suburban zone of the city of Loja-Ecuador, engagedin the growing of medicinal plants, endophytic fungi asso-ciated to Baccharis latifolia (Ruiz & Pav.) Pers., Baccha-ris obtusifolia Kunth, Piper barbatum Kunth, Borrerialaevis (Lam) Grises, Chuquiragua jussieui J.F. Gmel andBidens andicola Kunth were isolated. Fungal taxamost frequently appearing were: Alternaria, Aspergillus,Epicoccum, Fusarium, Nigrospora, Phoma besides somerepresentatives of the groups: coelomycetes, synnematousand Zygomycota. Major fungal dominance was found inelements of the so-called Mycelia sterilia, which hada special interest as possible endophyte. Besides theantagonic interaction of seven fungal isolations in frontof bacteria was assessed: Staphylococcus aureus,Klebsiella pneumomiae, Pseudomonas aeruginosa andEscherichia coli. Most of fungal strains investigatedrevealed activity , however most promising results couldbe seen in an isolation of Mycelia sterilia.

INTRODUCCION

En la literatura analizada, no hemos encontradodatos sobre asociaciones de hongos endfitos en hojasde plantas ecuatorianas y en las utilizadas en este trabajo,existen slo algunos antecedentes de hongos epfitos

asociados a diversas especies de Baccharis entre loscuales estn: 22 especies de Ascomycota (19 gneros), 24especies de Basidiomycota (18 gneros), 5 especies dehongos anamorfos (4 gneros) y 5 gneros de coelomy-cetes (Farr et al., 1995). Registros de la micota epfita sehan reportado tambin para algunas especies de losgneros Piper y Borreria (Farr et al., 1995), pero faltan

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antecedentes sobre Piper barbatum, Borreria laevis,Baccharis latifolia y Baccharis obtusifolia.

Las especies vegetales utilizadas en este estudiohan sido seleccionadas en base a dos principios: sonnativas de la zona Andina del Ecuador y poseenpropiedades medicinales y por tal motivo utilizadas por lapoblacin local que las cultiva (Bidlack et al., 2000;Aguirre, 2002; WHO, 2002;Villavicencio, 2006).

Zaragoza (2003) y Ordez & Vega (2005), en elestudio etnobotnico de la Planta de ProductosNaturales, comentan los beneficios de las siguentesespecies de inters medicinal analizadas en este estudio :Baccharis obtusifolia Kunth, vrtigo, reumatismo ymicosis de la piel, Borreria laevis (Lam.) Grises, para elespanto, en aplicacin directa de sus hojas madurasmachacadas, Piper barbatum Kunth, en dermatitis, comodesinfectante y cicatrizante, Baccharis latifolia (Ruiz &Pav.) Pers., como antiinflamatorio, clico estomacal y clicoheptico, Chuquiragua jussieui J.F. Gmel, para resfriados,gripe, tos, dolor de huesos y Bidens andicola Kunth,contra la cefalea e insolacin.

Los hongos en asociacin endoftica con estasespecies vegetales podran jugar un rol importante en laspropiedades medicinales de las mismas.

El propsito principal de esta investigacin, fueaislar los hongos endfitos de estas 6 plantas ecuatorianasy determinar la interaccin de los hongos aislados y lasbacterias patgenas: Staphylococcus aureus, Klebsiellapneumomiae, Pseudomonas aeruginosa y Escherichiacoli.

MATERIALES Y METODOS

Area estudiada. La investigacin se llev a cabo al surdel Ecuador, en la provincia de Loja, que limita al nortecon las provincias de Azuay y El Oro, al este con ZamoraChinchipe, al sur y oeste con Per, con una superficie de11.027 km2 (Figura 1). La zona de estudio, esta localizadaa lo largo del sector suburbano de la ciudad de Loja. Latemperatura promedio anual es de 15.7 C, y la preci-pitacin media mensual es de 75,6 mm, con su mximoen los meses de febrero y marzo (INAMI 2006). El sectorse encuentra dentro de las siguientes coordenadas:Longitud: 07911,366 W hasta 07911,893 W, Latitud:0357,966 S hasta 0359,343 S. Altitud: 2.125 hasta 2.144msnm.

Recoleccin y tratamiento de la muestra.Seis plantas ecuatorianas de inters medicinal: Bac-

charis latifolia, Baccharis obtusifolia, Piper barbatum,Borreria laevis, Chuquiragua jussieui y Bidens andcola,fueron colectadas desde sus reas naturales. De cadaplanta seleccionada, se muestrearon diez individuos

diferentes y de cada uno se colectaron diez hojas al azar.Estas fueron puestas en bolsas de plstico estriles yllevadas al laboratorio para procesarlas en un perodo nosuperior a 24 h a partir del muestreo.

Las hojas se lavaron con agua potable y fueronesterilizadas superficialmente por inmersiones consecu-tivas, durante 1 minuto en etanol 70% (v/v), 10 minutosen hipoclorito de sodio 3% y 30 segundos en etanol 70%(v/v), siguiendo el mtodo reportado por Bills (1996). Parael secado de las hojas se dej pasar unos minutos bajo lacabina de bioseguridad, cada hoja fue dividida en cuatropartes y mediante tcnicas aspticas se cortaron ensecciones pequeas (3-5 mm2) entre la nervadura centraly el borde de la hoja, con el uso de una tijera esterilizadacon alcohol y flameada en el mechero.

Despus de la esterilizacin, las seccionescorrespondientes a cada hoja se inocularon en cajas Petri(100 x 15 mm) con Agar extracto de malta, (MEA;DIFCO). Las cajas se rotularon de acuerdo al cdigoestablecido (planta-individuo-hoja-muestra), e incubaronen el laboratorio a temperatura ambiente (25 2C)expuestas a perodos naturales de luz y oscuridad. Seinocularon un total de 40 fragmentos de hojas por especievegetal. El crecimiento de las colonias se observ durantelas primeras 2 semanas, luego se aislaron cada una de lasnuevas colonias a cajas Petri (60 x 15 mm) con agar extractode malta y agar papa dextrosa (PDA) (Salgado & Cerero,2005). Los cultivos puros se rotularon y mantuvieron a

Figura 1: Localizacin geogrfica de la Prov. de Loja.

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tempera-tura ambiente (25 2C), expuestos a perodosnaturales de luz y oscuridad.

Evaluacin de la interaccin antagnica entre los aisladosfngicos y bacterias patgenas.

Las bacterias patgenas fueron proporcionadaspor la Planta de Productos Naturales de la UniversidadTcnica Particular de Loja, las cepas con las que se evalula interaccin fueron: Staphylococcus aureus subsp.aureus (ATCC Number, 25923), Klebsiella pneumoniaesubsp. pneumoniae, (ATCC Number, 9997), Pseudomonasaeruginosa, (ATCC Number, 27853), Escherichia coli(ATCC Number, 25922). Las bacterias fueron inoculadasen cajas Petri (100 x 15 mm) con Tryptic Soy Agar (TSA;DIFCO), como medio de cultivo e incubadas a 37 C, hastaobservar crecimiento.

De la colonia fngica crecida sobre PDA, se corty retir con puntales estriles discos de micelio de 4 mmde dimetro. Estos fueron inoculados en cajas Petri de(100 mm), que contenan 20 ml del mismo medio de cultivo,y a una distancia de 2, 6 cm del margen de la caja. A unadistancia de 3.7 cm del disco fngico recientementeinoculado, se coloc 0.5 ml de suspensin (1 McFarland)de las bacterias patgenas S. aureus, K. pneumomiae, P.aeruginosa, o E. coli, en lnea recta, tal como se indica enel esquema (Figura 2).

Cada prueba de antagonismo se repiti portriplicado, y al mismo tiempo se realiz un control delcrecimiento bacteriano de las diferentes especiesensayadas. Las cajas fueron incubadas a 28C. La actividadinhibitoria por parte del hongo se consider positivacuando se verific el crecimiento limitado o inexistente dela bacteria ensayada en direccin al hongo.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los taxa de hongos encontrados en las especiesde plantas medicinales investigadas se observan en Tabla1. El porcentaje referido a la incidencia del hongo en laplanta, se calcul sobre el total de fragmentos de hojasanalizados por especie vegetal (French & Hebert; 1998).

Los principales taxa aislados, fueron: Myceliasterilia (micelios sin fructificaciones), Alternaria, algunosrepresentantes de los coelomycetes y algunos hongosambientales comunes (Acremonium, Epicoccum,Fusarium, Phoma) (Tabla 1), estos ltimos se encuentrancomnmente en el aire como epifitos o en asociacin condiversos sustratos (Barnett & Hunter,1972; Domsch et al.,1980; Kiffer & Morelet, 1997). Su presencia en las plantasanalizadas podra ser indicativa de una colonizacintemporal eventual de los tejidos del hospedero, sin excluirun posible significado ecolgico de endfitos (Carroll,1986, 1988).

El hospedador con la mayor presencia y abundanciade endfitos fue Borreria laevis con 7 taxa, le siguen enimportancia Chuquiragua jussieui y Piper barbatum(Tabla 1).

Algunos hongos aislados se consideran pat-genos. Esto vale en particular para los gneros Alternariay Fusarium, pues, se conoce su distribucin cosmopolita,su habilidad fitopatognica en diversos hospedadores noespecie-especficos (tanto en plantas silvestres comocultivadas), la produccin de micotoxinas, su oportunismoen el hombre y su rol endoftico (Sridhar & Raviraja, 1995;Janardhanan & Ahmad, 1997; Kuldau & Yates, 2000;Rudgers et al., 2004; Rubini et al., 2005).

El grupo fngico seguramente ms interesante esel que corresponde a los micelios estriles. Estos se aislaronen todas las plantas medicinales investigadas (Tabla 1),seguidos por Alternaria spp. (presentes en 4 de losvegetales) y los colelomycetes (en 3). Por lo tanto,especialmente para los integrantes del primer grupo, podraexistir un posible rol de asociacin endoftica por sucrecimiento solamente vegetativo en cultivos.

No fue posible asignarles una clara posicintaxonmica a este grupo morfolgicamente muy similar,debido a la falta de elementos sistemticos y a suincompleto desarrollo en cultivos.

Los hongos endfitos derivan de un largo procesode coevolucin con sus hospederos vegetales, es por estoque puede ser muy difcil su aislamiento desde elhospedero vegetal (Espola, 2005). Una vez aislados,difcilmente se muestran frtiles in vitro. Petrini (1981),seala el factor ms importante de induccin a laesporulacin es el tiempo: aislados de endfitos puedenfructificar solo dos o tres meses luego de la inoculacin yalgunos requieren sobre los 12/14 meses. El aislamientode micelios estriles, es quizs uno de los resultados msinteresantes de la presente investigacin micolgica, quenecesita ser posteriormente analizado y que arroja unaperspectiva muy amplia para el aislamiento de metabolitossecundarios, de inters potencial (Schulz, et al. 2002; Radu& Kqueen, 2002; Agary et al., 2005). Revisiones recientesde la diversidad de metabolitos secundarios aislados de

Figura 2. Esquema de la inoculacin del hongo y lasbacterias para el ensayo del antagonismo.

Actividad antagnica de hongos endfitos de plantas medicinales del Ecuador sobre bacterias patgenas - Ramrez R. Jorge et al.

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hongos endfitos enfatizan su favorable rol ecolgico(Tan & Zou, 2001).

Pruebas de Interaccin entre Hongos y Bacterias.Los resultados de la interaccin antagnica de

algunas de las cepas de hongos aislados que mostraronmayor actividad frente a bacterias patgenas, se presentanen la Tabla 2. Como una prueba de la accin de Myceliasterilia, se consider la cepa aislada de Baccharis obtusi-folia, por su nica presencia en este vegetal.

La mayora de las cepas fngicas analizadas,muestran actividad antibacteriana, en contra de Escheri-chia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aerugi-nosa y Staphylococcus aureus, sin embargo, la mayoractividad se detect con Mycelia sterilia frente aKlebsiella pneumoniae (Tabla 2).

Se ha descrito en la literatura que los metabolitossecundarios fngicos tienen una accin protectiva contralos insectos herbvoros en gramneas y conferas (entreotras) y un buen nmero de ellos son potenciales antimi-

crobianos, motivo de nuestra bsqueda (Fisher et al, 1984;Stone & Petrini, 1997; Picco & Rodolfi, 2004). Resulta deinters considerar que dentro de los beneficios medicinalesde algunas de los 6 vegetales analizados, se mezcla suaccin analgsica, antiinflamatoria y antimicrobiana, dondelos endfitos fngicos podran contribuir en sus efectosbenficos en la farmacopea popular.

CONCLUSION

Este reporte preliminar sobre la presencia de end-fitos fngicos en plantas del Ecuador consideradasmedicinales en la farmacopea homeoptica nacional,demostr que varias especies de hongos y especialmentelos micelios estriles aislados, podran constituir un ptimoy quizs inocuo material biolgico para investigacionesfuturas, en particular por la marcada actividad antagnicacon los bacterias patgenas utilizadas.

Tabla 2: Interaccin antognica de algunascepas fngicas en bacterias patgenas

Taxa y categoras Fngicas

Escherichia coli

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeruginosa

Staphyloco-ccus aureus

Alternaria sp.1 + + + + Alternaria sp.2 + + + + Phoma sp. + + + + Nigrospora sp. + + + + Epicoccum sp. + + + + Mycelia sterilia + ++ + + Sinnematoso + + + + Mycelia sterilia aislado de B. obtusifolia

Actividad antagnica de hongos endfitos de plantas medicinales del Ecuador sobre bacterias patgenas - Ramrez R. Jorge et al.

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AGRADECIMIENTOSUn agradacemiento especial a la Prof.

Anna Maria Picco de la Seccin de Micologa dela Universit degli Studi di Pavia, al departamentode Biologa Celular y Molecular de la UniversidadTcnica Particular de Loja, por las facilidades enla presente investigacin . Se agradece al MIURpor el financiamiento dado al Master BienalUniversitario Internacional de segundo nivel enScienza e Tecnologie per un utilizzo sostenibiledelle risorse biologiche non tradizionali en elproyecto de tipologa a CollaborazioniInteruniversitarie Internazionali (2001-2003 - prot.int01ad024).

Tabla 1: Hongos encontrados en las seis especies de Plantas. El porcentaje esta referido a la incidencia del hongoen la planta calculada sobre el total de fragmentos de hojas analizados por especie de planta

Ver Tabla 1 al final d

el artculo

REFERENCIAS

Petrini, O. (1981). Fungal endophytes of tree leaves. In: AndrewsJ.H., Hirano S.S. (Eds.) Microbial ecology of leaves. Springer-Verlag, New York, pp.179-197

Picco, A. M. & Rodolfi, M. (2004). Endophytism in grasses withreference to an experience in Northern Italy. In: Ragazzi A.,Moricca S., Dellavalle I. (eds.). Endophytism in Forest Trees.Accademia Italiana di Scienze Forestali. Tipografia Coppini,Firenze.

Radu, S. & Kqueen, C. H. (2002). Preliminary screening ofendophytic fungi from medicinal plants in Malaysia forantimicrobial and antitumor activity. Malaysian J. Med. Sc., 9:23-33

Rubini, M.; Silva, R.; Pomilla, A.; Maki, C.; Arajo, W.;Santos, D. & Azebedo, J. (2005). Diversity of endophytic fungalcommunity of cacao (Theobroma cacao L.) and biological controlof Crinipellis perniciosa, causal agent of Witches Broom Disease.Int. J. Biol. Sci. 1:24-33

Rudgers, J.; Koslow, M. & Clay, K. (2004). Endophytic fungialter relationships between diversity and ecosystem properties.Ecology Letters 7:42-51

Salgado, C. & Cerero, M. (2005). Aislamiento de hongosendfitos en rosa (Rosa hybrida) en Bogota, Colombia. RevistaIberoamericana de Micologia 22:99-101

Schulz, B.; Boyle, C.; Draeger, S.; Rommert, A. & Krohn,K. (2002). Endophytic fungi: a source of novel biologically activesecondary metabolites. Mycol. Res.106:996-1004

Sridhar, K. & Raviraja, N. (1995). Endophytes- a crucial issue.Current Sci. 69:570-571

Stone, J. & Petrini, O. (1997). Endophytes of forest trees: amodel for fungus-plant interactions. In: The mycota V prt BPlant relationships (Carrol/Tudzynski eds.). Springer Verlag , BerlinHeidelberg. pp. 129-140

Tan, R. & Zou, W. (2001). Endophytes: a rich source of functionalmetabolites. The Royal Society of Chemistry 18:448-459

Villavicencio, S. (2006). Diagnstico de Enfermedades Fngicas queafectan al follaje de ocho especies de Plantas Medicinales en laParroquia de Chuquiribamba (Loja). Tesis, Universidad TcnicaParticular de Loja. Laboratorio de Servicios Agropecuarios.

WHO (Word Health Organization) (2002). Medicina TradicionalNecesidades Crecientes y Potencial. Geneva.

Zaragoza, T. (2003). Estudio Entnomdico de las Plantas de lasProvincias de Loja y Zamora Chinchipe (Unpublished).FUNDACYT Universidad Tcnica Particular de Loja in: ProjectPFN 0133: Bioactividad de aceites esenciales y extractos de plantasmedicinales y aromticas de la regin sur del Ecuador.

Actividad antagnica de hongos endfitos de plantas medicinales del Ecuador sobre bacterias patgenas - Ramrez R. Jorge et al.

Agary, O.; Akinyosoye, F. & Adetuyi, F. (2005). Antagonisticproperties of microogranisms associated with cassaca (Manihotesculenta Crantz) products. African J. Biotechnol.. 4:627-632

Aguirre, Z. (2002). Botnica Austroecuatoriana. Ediciones AbyaYala, Quito, Ecuador.

Barnett, HL. & Hunter, B. B. (1972). Illustrated Genera of ImperfectFungi. Third Edition. American Phytopathological Society, USA

Bidlack, W.; Omaye, S.; Meskin, M. & Thopham, D. (2000).Phytochemicals as Bioactive Agents. CRC press, New York.

Bills, GF. (1996). Isolation and analysis of endophytic fungalcommunities from woody plants. In Endophytic Fungi in Grasses andWoody Plants Redlin, S. C. & Carris, L. M., APS Press, USA.

Carroll, G. (1986). The biology of endophytism in plants withparticular reference to woody perennials. En: Fokema, N. J. & Vanden Heuvel, J. (eds.), Microbiology of the phyllosphere. CambridgeUniversity Press, Cambridge.

Carroll, G. (1988). Fungal endophytes in stems and leaves: fromlatent pathogen to mutualistic symbiont. Ecology 69:2-9

Domsch, KH; Gams, W. & Anderson, T. H. (1980). Compendium ofsoil fungi. Academic Press, London.

Espola, M. (2005). Catastro de hongos endfitos miceliales en ThrinaxMorrisii h. wendl. en el bosque estatal de susa, sabana grande, PuertoRico. Universidad de Puerto Rico. Recinto Universitario de Mayagez.

Farr, D. F.; Bills, G. F.; Chamuris, G. P. & Rossman, A. Y.(1995). Fungi on plants and plant products in the Unites States.APS Press, USA.

Fisher, P.J.; Anson, A.E. & Petrini, O. (1984). Antibiotic activity ofsome endophytic fungi from ericaceous plants. Bot. Helv. 94:249-253

French, E. & Hebert, T. (1982). Mtodos de InvestigacinFitopatologa. Costa Rica.

Kuldau, G. A. & Yates, I. E. (2000). Evidence for Fusariumendophytes in cultivated and wild plants. In: Bacon .W., White J.F.(Eds.) Microbial Endophytes. Marcel dekker, Inc. New York-Basel.

INAMI (Instituto Nacional de Metereologa e Hidrologa).(2006). Resumen climatolgico. Estacin Base La Argelia.

Janardhanan, K. & Ahmad, A. (1997). Fungal Endophytes ofGrasses: Incidence and Distribution in India. Tropical Mycol. 157-168.

Kiffer, E. & Morelet, M. (1997). Les deutromyctes classificationet cls didentification gnrique. Louis-Jean France.

Ordez, P, & Vega, M. (2005). Estudio Fitoqumico de especiesvegetales nativas utilizadas en la medicina tradicional de laProvincia de Loja. Tesis, Universidad Tcnica Particular de Loja.Planta de Productos Naturales.

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Aislados fngicos Borreria laevis Baccharis latifolia

Baccharis obtusifolia

Bidens andcola

Chuquiragua jussieui

Piper barbatum

Acremonium sp. X (6 %) X (4 %) Alternaria sp.1 X (20 %) X (10 %) X (22 %) X (17 %) Alternaria sp.2 X (70 %) X (30 %) X (10 %) Aspergillus sp. X (20%) Coelomycetes X (15 %) X (12 %) X (20%) Epicoccum sp. X (10%) X (10 %)

Fusarium equiseti X (24 %) Fusarium sp. X (17 %)

Micelia sterilia X (100%) X (40%) X (10%) X (33 %) X (25 %) X (70%) Nigrospora sp. X (10%)

Phoma sp. X (10 %) X (5 %) Stilbacea X (10%)

Zygomycetes X (10 %)

Tabla 1: Hongos encontrados en las seis especies de Plantas. El porcentaje esta referido a la incidencia del hongoen la planta calculada sobre el total de fragmentos de hojas analizados por especie de planta