entomopatÓgenos beauveria bassiana (bassi) y metarhizium

i

EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE LOS HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana (Bassi) Y Metarhizium

anisopliae (Metchnikoff) EN EL CONTROL DE LA GARRAPATA DEL

GANADO Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) (Acari:

Ixodidae) EN SU FASE PARASÍTICA EN LOS ESTADOS LARVAL Y

NINFAL

DIANA CAROLINA VALBUENA MORENO

CRISTIÁN JAVIER ALZATE MARÍN

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

BOGOTÁ D.C. COLOMBIA

2007

ii

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 “La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velara por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por que la tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

iii






NINFAL



Trabajo de grado presentado como requisito parcial

para optar por el titulo de Microbiología Agrícola y Veterinaria

DIRECTOR

EDISON VALENCIA

Ph. D Entomología

CO-DIRECTOR

FERNANDO CRUZ

Biólogo

Laboratorio LST

ASESOR

VICTOR ORTEGA

Medico Veterinario

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

BOGOTÁ D.C. COLOMBIA

2007

iv






NINFAL

AUTORES:



APROBADO

____________________ ____________________

Edison Valencia Fernando Cruz

Ph. D Entomología Biólogo- Laboratorio LST

DIRECTOR DE TESIS CO- DIRECTOR

____________________ ____________________

Amanda Varela Jesús Cortés

Bióloga- Microbióloga Ph. D. Medico Veterinario, M.Sc

JURADO JURADO

v






NINFAL

AUTORES:



APROBADO

____________________ ____________________

Ángela Umaña Muñoz Janeth Arias Palacios

M. Phil. Bióloga Bacterióloga M.Sc

Decana Académica Directora de Carrera

vi

“Los seres humanos somos perezosos, nos olvidamos d e todo, no

queremos razonar, no queremos pensar. Muchas veces nos olvidamos del

esfuerzo mental, esfuerzo que utilizamos para crea r ideas y su valor es

mucho mayor; hay seres humanos que se olvidan del o rgullo, necesito

estar solo porque al platicar conmigo mismo, me enc uentro, me ubico,

razono y veo todo con mayor claridad. Ofrezco mi al ma a los que la

necesitan, me siento feliz por lo que pienso y por lo que hago, y vivo por

cumplir mis sueños.

Martín Maestro Marcín. A la memoria de Bárbara Jutinico.

vii

AGRADECIMIENTOS Al doctor Edison Valencia Pizo, Por ser un gran maestro y director de tesis, por su apoyo y orientación en la realización de este trabajo de investigación, al igual que por su amistad, dedicación y respaldo en todo momento. Al médico veterinario Jesús Cortés. Director del Laboratorio de Parasitología de la Universidad Nacional de Colombia, por su incondicional apoyo, orientación y respaldo durante el tiempo de realización de este trabajo. A los doctores Esperanza Morales y Fernando Cruz de la empresa LST (Live Systems Technology) S.A . Por su colaboración y acertada orientación técnica en el manejo de los insumos microbiales. Al señor Eliécer Vivas, por su oportuna e invaluable colaboración y apoyo para la realización de este trabajo de investigación. Al médico veterinario Víctor Ortega, propietario de la finca la Pradera, por su incondicional apoyo, amistad y orientación, principalmente en el manejo de los animales utilizados para esta investigación. Al señor Juan Hernández y Familia, gracias por su colaboración durante los montajes de los ensayos en campo, por su hospitalidad y amabilidad. Al doctor Bernardo Chávez de la Universidad Nacional, por su orientación y colaboración en el manejo de la parte estadística de la tesis. Al biólogo Alfredo Fajardo , por su oportuna colaboración en el desarrollo de la estadística de nuestro proyecto de investigación. A la doctora María Mercedes Martínez, gracias por su incondicional apoyo y por creer en éste proyecto. A nuestros compañeros del CIAA, Luz Stella Fuentes, Luís Alejandro Arias, Ligia Espinosa y Nancy Niño por su oportuno apoyo en la realización de este trabajo a demás de su amistad. A nuestros padres especialmente, gracias por su apoyo emocional y económico, que nos permitieron llevar a cabo nuestro proyecto, buscando siempre no defraudar su confianza

viii

TABLA DE CONTENIDO

Página

1. RESUMEN 1

ABSTRACT

2

2.

INTRODUCCIÓN

3

3.

OBJETIVOS

5

4.

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

6

5.

JUSTIFICACIÓN

7

6.

HIPÓTESIS DE TRABAJO

9

7.

REVISIÓN DE LITERATURA

10

7.1.

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

10

7.2.

CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS

12

7.3.

PROCESO DE INFECCIÓN

13

7.3.1.

ADHESIÓN

14

7.3.2.

GERMINACIÓN

16

7.3.3.

PENETRACIÓN

17

7.3.4.

CRECIMIENTO

19

7.3.5.

DISPERSIÓN

19

7.4.

SISTEMA INMUNE DE INSECTOS CONTRA LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS.

22

7.5.

FACTORES QUE INFLUYEN EN EL ESTABLECIMIENTO Y ACCIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

24

7.5.1.

HÚMEDAD RELATIVA (HR)

24

7.5.2.

TEMPERATURA AMBIENTAL

25

7.5.3.

MICROAMBIENTE

25

7.5.4.

RADIACIÓN SOLAR

26

7.6.

LOS AGROQUÍMICOS Y SU INTERACCIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

27

ix

7.7.

GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana Y Metarhizium anisopliae.

27

7.7.1. Beauveria bassiana (Bassi, 1837) 28

7.7.2. Metarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1879) 29

7.8.

TAXONOMÍA DE Beauveria bassiana (Bassi, 1837) Y Metarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1879)

30

7.9.

ANTECEDENTES DE LA UTILIZACIÓN DE Beauveria bassiana Y Metarhizium anisopliae EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA GARRAPATA DEL GANADO Rhipicephalus (Boophilus) microplus

31

7.10.

FORMULACIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS

32

7.11.

INSECTICIDAS BIORRACIONALES

33

8.

GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

35

8.1.

GENERALIDADES

35

8.2.

TAXONOMÍA DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

37

8.3.

DISTRIBUCIÓN

38

8.4.

MORFOLOGÍA

41

8.5. MECANISMOS DE SUPRESIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE POR PARTE DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus

44

8.6. CICLO DE VIDA DE LOS IXÓDIDOS 46

8.7. HABITOS Y ECOLOGÍA 49

8.8. HUÉSPEDES 50

8.9. IMPORTANCIA SANITARIA 51

8.10. CONTROL INTEGRADO DE GARRAPATAS 53

8.10.1. CONTROL QUÍMICO 54

8.10.1.1 Placas en orejas 55

8.10.1.2 Acaricidas sistémicos 56

8.10.1.3. Feromonas 56

8.10.1.4. Baños de inmersión 56

8.10.1.5. Baños de aspersión 57

8.10.2. CONTROL CULTURAL 57

8.10.2.1 Rotación de praderas 57

x

8.10.2.2 Quema dirigida de potreros 58

8.10.2.3 Inundación de Potreros 58

8.10.2.4. Labores de preparación y/o conservación de potreros. 59

8.10.2.5. Pastos antigarrapata 59

8.10.3. CONTROL BIOLÓGICO 60

8.10.3.1. Hongos entomopatógenos para el control de garrapatas 61

8.10.3.2. Control biológico mediante el uso de depredadores

61

8.11. RESISTENCIA DE LAS GARRAPATAS A LOS ACARICIDAS 61

8.11.1. MECANISMOS DE RESISTENCIA 62

8.11.2. MANEJO DE LA RESISTENCIA DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

63

8.11.2.1.

MANEJO POR MODERACIÒN

63

8.11.2.2.

MANEJO POR SATURACIÒN

64

8.11.2.3.

MANEJO POR ATAQUE MÚLTIPLE

64

8.12.

VACUNAS

65

8.13.

OTRAS ALTERNATIVAS DE CONTROL

66

8.13.1.

Extractos vegetales

66

8.13.2.

Aceites

67

8.13.3.

Resistencia del hospedero

68

9.

MATERIALES Y MÉTODOS

69

9.1.

LOCALIZACIÓN

69

9.2.

FASE DE CAMPO (ESTABLO)

69

9.2.1.

ANIMALES

69

9.2.2.

RECOLECCIÓN DE TELEOGINAS DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

70

9.2.3.

EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA EN CAMPO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassianaY Metarhizium anisopliae SOBRE NINFAS Rhipicephalus (Boophilus) microplus

70

9.2.4.

OBSERVACIÓN DEL EFECTO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana (Bassi) Y Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) EN SU PERÍODO DE PROTECCIÓN

74

9.3. FASE DE LABORATORIO 75

xi

9.3.1 CONFIRMACIÓN DE ESPECIE DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

75

9.3.2 CRÍA DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) (Acari: Ixodidae)

75

9.3.3. EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y DESNUDAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATOGENOS B.bassiana y M.anisopliae SOBRE LARVAS DE R. microplus EN CÁMARA HÚMEDA.

76

9.3.4. EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y DESNUDAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATOGENOS B. bassiana y M. anisopliae SOBRE LARVAS DE R.microplus EN CÁMARA SECA

78

9.3.5. EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae SOBRE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus

78

9.3.6. EVALUACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LAS CEPAS REACTIVADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS B. bassiana Y M. anisopliae.

81

9.4.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

82

10.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

83

10.1.

EVALUACIÓN DE LA PATÓGENICIDAD Y VIRULENCIA EN CAMPO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana Y Metarhizium anisopliae SOBRE NINFAS DE R. microplus

83

10.2.

EFECTO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÒGENOS Beauveria bassiana (Bassi) Y Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) EN TÉRMINOS DE SU PERÍODO DE PROTECCIÓN EN CAMPO SOBRE EL GANADO

90

10.3.

CONFIRMACIÓN DE ESPECIE DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

92

10.4.

EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae SOBRE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus EN CÁMARA HUMEDA

93

10.5.

EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULADAS DE LOS HONGOS B. bassiana y M. anisopliae SOBRE LARVAS DE R. microplus EN CAMARA SECA

100

10.6.

EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae SOBRE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus

106

xii

10.6.1. CONCENTRACIÓN LETAL CINCUENTA Y NOVENTA (CL50 y CL90 ) 113

10.6.2.

TIEMPO LETAL CINCUENTA Y NOVENTA (TL50 y TL90 )

115

10.7.

EVALUACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LAS CEPAS REACTIVADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS B. bassiana Y M. anisopliae.

119

11.

CONCLUSIONES

124

12.

RECOMENDACIONES

126

13.

GLOSARIO

129

14.

REVISIÓN DE LITERATURA

132

15.

ANEXOS

144

xiii

LISTA DE FIGURAS Página

Figura 1. Microscopía electrónica de B. bassiana creciendo con alcanos como fuente de carbono. (a) Proyecciones en forma de dedos en la membrana, (b) Estructuras membranosas, lameladas, (c) Inclusiones del hidrocarburo.

13

Figura 2. Ciclo infectivo de los hongos entomopatógenos tipo M. anisopliae para control de insectos

14

Figura 3. Crecimiento de B. bassiana en medio PDA, observación macroscópica y microscópica.

29

Figura 4. Microscopia electrónica de las conidios de B. bassiana en el proceso de infección de Amblyomma americanum

29

Figura 5. Características macroscópicas y microscópicas de una cepa madura de M. anisopliae.

30

Figura 6. Distribución mundial de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el cinturón tropical del mundo.

38

Figura 7. Partes bucales de las garrapatas. 43

Figura 8. Vista dorsal de macho y hembra de Boophilus microplus respectivamente.

43

Figura 9. Ciclo de vida de las garrapatas duras. 47

Figura 10. Infestaciones de bovinos con Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

51

Figura 11. Cuadrante de medición para el conteo de la garrapata sobre el ganado

71

Figura 12. Corral donde se almacenaron los animales del ensayo. 72

Figura 13. Puesta de huevos durante la cría de teleoginas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

76

Figura 14. Porcentaje de mortalidad promedio de ninfas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en cada tratamiento, después de la aplicación de los dos hongos entomopatógenos a una concentración de 1x108 conidios/ml.

84

Figura 15. Porcentaje de mortalidad corregida de ninfas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus hallada mediante la formula de Henderson y Tilton a una concentración de 1x108 conidios/ml, bajo condiciones de campo.

86

Figura 16. Mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación de los tratamientos 1: Control ,2: Control, 3: Cepa formulada de M .anisopliae ,4: Cepa no formulada de M .anisopliae ,5: Cepa formulada de B. bassiana y 6: Cepa no formulada de B. bassiana. Los tratamientos con la misma letra

88

xiv

no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de contraste de Fisher con un nivel de significancía 0.05.

Figura 17. Box plot de respuesta de mortalidad de larvas de R. microplus en la comparación entre las cepas formuladas y desnudas de los hongos B, bassiana y M. anisopliae (a) Tratamiento 1: control, 2: cepa formula de M. anisopliae y 3: cepa formula de B. bassiana (b) 1: control, 2: cepa no formulada de M. anisopliae y 3: cepa no formulada de B. bassiana.

88

Figura 18. Efecto de las cepas formuladas y desnudas de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae después de 30 días de aplicación sobre la población de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

91

Figura 19. Macho de la garrapata bovina, Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

93

Figura 20. Hembra de la garrapata bovina, Rhipicephalus (Boophilus) microplus

93

Figura 21. Porcentaje de mortalidad promedio de larvas por la aplicación de los hongos entomopatógenos B.bassiana y M.anisopliae con respecto al tiempo a una concentración de 1 x 10 8 conidias/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara húmeda.

94

Figura 22. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Beauveria bassiana en cámara húmeda, presencia de micelio aéreo a los 12 días.

95

Figura 23. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Metarhizium anisopliae en cámara húmeda, presencia de micelio aéreo a los 12 días.

95

Figura 24. Respuesta de la mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación de los tratamientos 1: Control 2: Cepa formulada de M .anisopliae ,3: Cepa no formulada de M .anisopliae ,4: Cepa formulada de B. bassiana y 5: Cepa no formulada de B. bassiana. Los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de contraste de Fisher con un nivel de significancía 0.05.

97

Figura 25. Porcentaje de mortalidad corregida (Abbott) de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación de los hongos entomopatógenos B.bassiana y M.anisopliae en una concentración de 1x108 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara húmeda.

98

Figura 26. Porcentaje de mortalidad de larvas por la aplicación de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae con respecto al tiempo a una concentración de 1 x 10 8 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara seca.

101

xv

Figura 27. Respuesta de la mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación en cámara seca de los tratamientos 1: Control 2: Cepa formulada de M .anisopliae ,3: Cepa no formulada de M .anisopliae ,4: Cepa formulada de B. bassiana y 5: Cepa no formulada de B. bassiana. Los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de contraste de Fisher con un nivel de significancía 0.05.

101

Figura 28. Porcentaje de mortalidad corregida (Abbott) de larvas por la aplicación de los hongos entomopatogenos B. bassiana y M. anisopliae con respecto al tiempo a una concentración de 1 x 10 8 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara seca.

103

Figura 29. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Beauveria bassiana en cámara seca, presencia de micelio aéreo a los 12 días.

105

Figura 30. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Metarhizium anisopliae en cámara húmeda, presencia de micelio aéreo a los 12 días.

105

Figura 31. Desviación estándar y prueba de contraste de Fisher para los tratamientos: (1) control absoluto (2)control comparativo (3)M. anisopliae 1x106conidios/ml, (4) M. anisopliae 1x107conidios/ml, (5) M. anisopliae 1x108conidios/ml, (6) M. anisopliae 5x108conidios/ml, (7) M. anisopliae 1x109conidios/ml, (8) B. bassiana 1x106conidios/ml, (9) B. bassiana 1x107 conidios/ml (10) B. bassiana 1x108conidios/ml (11) B. bassiana 5x108conidios/ml (12) B. bassiana 1x109conidios/ml. Barras con la misma letra no difieren significativamente.

107

Figura 32. Porcentaje de mortalidad promedio de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el tiempo, por la aplicación de Beauveria bassiana a concentraciones de 1x106,1x107 ,1x108, 5x108 y 1x109 conidios/ml.

108

Figura 33. Porcentaje de mortalidad absoluta de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el tiempo, por la aplicación de Metarhizium anisopliae concentraciones de 1x106,1x107 ,1x108, 5x108 y 1x109 conidios/ml.

110

Figura 34. Tiempo letal 50 para las concentraciones probadas del hongo M. anisopliae sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

116


116

Figura 36. Tiempo letal 50 para las concentraciones probadas del hongo B. bassiana sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

117


118

xvi

Figura 38. Aislamientos realizados y purificados de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae a partir de larvas infectadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

119

Figura 39. Porcentaje de mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a partir de inóculos realizados de B. bassiana y M. anisopliae, reaislados de larvas tratadas en el laboratorio, a una concentración de 1x108 conidios/ml.

120

Figura 40. Porcentaje de mortalidad corregida (Abbott) de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a partir de inóculos realizados de B. bassiana y M. anisopliae, reaislados de larvas tratadas en el laboratorio, a una concentración de 1x108 conidios/ml.

122

Figura 41. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo B. bassiana.

126

Figura 42. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo M. anisopliae.

126

Figura 43. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el tratamiento control.

126

xvii

LISTA DE TABLAS Página

Tabla 1. Principales hongos entomopatógenos utilizados comercialmente para el control de insectos plaga.

11

Tabla 2.

Especies de la familia Ixodidae encontradas en Colombia.

39

Tabla 3.

Número de especies de garrapatas encontradas en Colombia, en Latinoamérica y en todo el mundo

40

Tabla 4.

Interacción respuesta hospedero-garrapata

45

Tabla 5.

Duración de la fase en el ciclo de vida parasitaria de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

46

Tabla 6.

Tratamientos evaluados por la aplicación de cepas formuladas del laboratorio LST y desnudas de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre los animales para el control de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

73

Tabla 7. Tratamientos realizados para la comparación de cepas formuladas y cepas desnudas sobre larvas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en cámara húmeda.

77

Tabla 8.

Tratamientos probados para evaluar diferentes concentraciones de B. bassiana y M. anisopliae bajo condiciones de campo.

79

Tabla 9.

Tratamientos para la aplicación de las cepas reactivas de los hongos B. bassiana y M. anisopliae sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

82

Tabla 10.

Análisis del Probit para el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae en el día final de evaluación.

114

Tabla 11.

Análisis del Probit para el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana en el día final de evaluación

114

xviii

LISTA DE ANEXOS

Página

Anexo 1. FICHAS TECNICAS DE LOS PRODUCTOS FORMULADOS 144

Anexo 2. MODELO ESTADISTICO 146

Anexo 3.

ESTADÍSTICA CAMPO: COMPARACIÒN ENTRE CONTROLES Y CEPAS FORMULADAS Y DESNUDAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae

147

Anexo 4.

EFECTO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS ATRAVEZ DEL TIEMPO (PERIODO DE PROTECCIÓN).

154

Anexo 5.

COMPARACIÓN DE LAS CEPAS DE LOS HONGOS B. bassiana Y M. anisopliae EN CÁMARA HÚMEDA

156

Anexo 6.

PORCENTAJE DE MORTALIDAD DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus)microplus EN CÁMARA HÚMEDA

157

Anexo 7.

COMPARACIÓN DE LAS CEPAS DE LOS HONGOS B. bassiana Y M. anisopliae EN CÁMARA SECA

158

Anexo 8.

ESTADÍSTICA DE LABORATORIO: COMPARACIÓN DE LAS CINCO CONCENTRACIONES EVALUADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS B. bassiana Y. M anisopliae

160

Anexo 9. ANALISIS PROBIT- PORCENTAJES DE MORTALIDAD CORREGIDA EN LA EVALUACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES PARA LOS HONGOS B. bassiana Y M. anisopliae

165

Anexo 10.

TIEMPO LETAL CINCUENTA Y NOVENTA (CL50 y CL90 )

170

Anexo 11.

TIEMPO LETAL 50 Y 90, MORTALIDAD ACUMULADO METODO DE REED AND MUENCH

171

Anexo 12.

FÓRMULA DE ABBOTT (1925) PARA MORTALIDAD CORREGIDA EN MUESTRAS CON IGUAL NÚMERO DE POBLACIÓN.

176

Anexo 13.

FÓRMULA DE HENDERSON Y TILTON PARA MUESTRAS CON DIFERENTE NÚMERO DE POBLACIÓN

177

1

1. RESUMEN

Las garrapatas son una de las principales limitantes en la explotación bovina,

debido a que causan enfermedades, pérdida de peso, baja producción de leche y carne,

daño de las pieles además de los costos requeridos para su control y la resistencia

adquirida por la aplicación de productos químicos acaricidas. Por esta razón es necesario

implementar nuevas estrategias para el control de garrapatas.

El objetivo de este estudio fue evaluar la patogenicidad y virulencia de los hongos

entomopatógenos Beauveria bassiana (Bassi) y Metarhizium anisopliae (Metchnikoff)

para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en su fase

parasitica, por medio de ensayos en laboratorio y campo con larvas y ninfas de la

garrapata del ganado. Los ensayos en campo se realizaron sobre infestaciones naturales

en ganado Cebú, en la finca La Pradera en Sabanalarga, Casanare. Estos hongos

entomopatógenos demostraron una alta eficacia sobre larvas y ninfas de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus. El análisis Probit de las concentraciones letales (CL50 y CL90)

indicó que presentan una mayor eficacia a una mayor concentración, siendo para ambos

hongos la concentración mínima con mayor eficacia 5x108 conidios/ml a los 9 días de

evaluación. En la evaluación de la patogenicidad en campo de las cepas no formuladas y

las cepas formuladas de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae

mostraron que la cepa formulada de M. anisopliae presentaba una mayor eficacia con

una mortalidad promedio del 69%.

Estos resultados indican que estos hongos podrían ser incluidos como bioacaricidas en

programas de Manejo Integrado de Garrapatas (MIG) en fincas ganaderas de Colombia,

siendo una buena alternativa para el manejo de la resistencia que han adquirido estos

ácaros a la aplicación masiva de algunos compuestos químicos sintéticos. Se recomienda

hacer mayor énfasis en la evaluación de formulaciones de productos comerciales

biológicos para el control de garrapatas, cuya base sean las esporas de B. bassiana y M.

anisopliae, debido a que uno de los mayores inconvenientes encontrados durante la fase

de campo con estos microorganismos fue el efecto inhibitorio causado por las

condiciones ambientales y corporales del animal, especialmente su temperatura externa.

Es importante realizar algunos estudios que evalúen el impacto ecotoxicológico que

puedan tener estos microorganismos biocontroladores sobre otros organismos benéficos

y sobre la población humana que puedan estar en contacto directo con los conidios de

estos hongos.

2

ABSTRACT

The ticks are one of the principal limitations on the farm, because they cause disease,

weight loss, low production of milk and meat, hides damage to the other costs required for

their control and the acquired resistanceby the application of chemicals acaricides. For

this reason is necessary to implement new strategies for the control of ticks.

The objective of this study was to evaluate the pathogenicity and virulence of the

entomopathogenic fungus Beauveria bassiana (Bassi) and Metarhizium anisopliae

(Metchnikoff) for the control of tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus in its parasitic

phase, by means of tests in laboratory and under field conditions with larvae and nymphs

of the cattle tick. The essays in field were realized on natural infestations in Zebu cattle, in

the farm The Pradera in Sabanalarga Casanare. These entomopathogenic fungi showed

a high efficiency on larvae and nymphs of Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Probit

analysis of lethal concentrations (LC50 y LC90) indicated that presents greater efficiency to

a greater concentration, for both fungi being the minimum concentration fungi more

effectively 5x108 conidia / ml to the 9 day evaluation. In evaluating the pathogenicity in

field of no formulation strains and formulation commercial strains of entomopathogenic

fungi B. bassiana and M. anisopliae showed that the formulation strain by M. anisopliae

had greater efficiency with a mortality average of 69%.

These results indicate that these fungi might be included like bioacaricidas in programs of

Integrated pest Management of Ticks (IMT) in cattle farms of Colombia, being a very good

alternative for managing the resistance that these ticks have acquired to the massive

application of synthetic chemical compounds. One recommendation is to make more

emphasis in the evaluation of commercial formulations of biological products for the ticks

control, which base must be the spores of B. bassiana and M. anisopliae, because one of

the major disadvantages found during the field phase with these microorganisms was the

inhibitory effect caused by the environmental and corporal conditions of the animals,

specially its external temperature. It is important to perform some studies that evaluate the

ecotoxicological impact that could have these biocontrol microorganisms on other

beneficial organisms and on the human population that could be in direct contact with

conidia of these fungi during or after the applications

3

2. INTRODUCCIÓN

La ganadería en Colombia y en el mundo se ha visto afectada por la infestación de

garrapatas, debido a que es una de las principales limitantes en la explotación bovina

trayendo un impacto económico negativo, causando la disminución en la producción de

leche y carne, dificultad en la adaptación de razas, mayor tiempo de engorde, daño de

pieles, muerte de animales, debilitamiento y como consecuencia retardo de crecimiento

debido a la transmisión de enfermedades causadas por Babesia bovis, Babesia bigemina,

Anaplasma marginale. En Colombia se han estimado pérdidas que superan los

$10.000.000 al año a causa de las enfermedades que transmiten, además de los gastos

anuales generados en la adquisición de productos químicos para su control (Moreno,

2001).

La garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus es un ectoparásito perteneciente a la

familia Ixodidae. Actualmente ésta especie es la mas común en el ganado bovino debido

a su amplia distribución mundial, encontrándose desde el nivel del mar hasta 2.700 m de

altitud a temperaturas que oscilan entre 15ºC a 34°C (Moreno, 2001). El ciclo biológico

de R. (Boophilus) microplus se divide en dos fases, la fase no parasítica que inicia

cuando la garrapata adulta hembra ingurgitada (teleogina) se desprende del bovino y la

fase parasítica, ésta inicia cuando la larva ataca un hospedero alimentándose de su

sangre.

La estrategia para el control de garrapatas se ha basado casi exclusivamente en la

aplicación de productos químicos acaricidas sobre el cuerpo de los animales infestados a

intervalos específicos, los cuales están determinados por la región ecológica, la raza, la

especie a la que se va a combatir y por la eficacia residual del producto químico. Estos

productos han sido utilizados con gran éxito para el control de garrapatas, sin embargo, el

uso irracional de estos compuestos ha ocasionado la generación de cepas de garrapatas

resistentes además de ser una estrategia de control costosa. Por esto, es de gran

importancia la creación de estrategias de control biológico, acompañado de un esquema

de manejo integrado de plagas (MIP) , que sean ambientalmente amigables como la

implementación de hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana y Metarhizium

anisopliae, con el fin de realizar un manejo sostenible de la garrapata, conservando un

equilibrio ecológico y evitando problemas de contaminación ambiental; además de la

reducción de costos por la aplicación de productos químicos, que muchas veces son

poco específicos contra el organismo blanco, y que en algunas ocasiones afectan

poblaciones benéficas presentes en el ecosistema ganadero (Parra et al.,1999).

4

Debido al gran impacto económico que ocasionan las garrapatas a nivel nacional, este

proyecto tiene como objetivo evaluar la patogenicidad de cepas de Beauveria bassiana y

Metarhizium anisopliae para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus bajo condiciones de laboratorio y campo, enfocándose específicamente en la

fase parasítica en estado larval y ninfal, debido a que ya existe una cultura de control de

garrapatas en esta fase, con la utilización plaguicidas químicos principalmente.

5

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

Evaluar la patogenicidad y virulencia de los hongos entomopatógenos Beauveria

bassiana y Metarhizium anisopliae sobre la garrapata del ganado Rhipicephalus

(Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae), en su fase parasítica (larva y ninfa) bajo

condiciones de laboratorio y campo (establo), como una base para un esquema de

control biológico.

3. 2. Objetivos Específicos

3.2.1. Calcular los porcentajes de mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus)

microplus sobre el ganado, bajo condiciones semi-controladas en campo, después de la

aplicación de las cepas de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y

Metarhizium anisopliae para la evaluación de la virulencia de las formulaciones

comerciales.

3.2.2. Determinar la concentración letal (CL50 y CL90) de los hongos entomopatógenos

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre larvas de la garrapata Rhipicephalus

(Boophilus) microplus bajo condiciones de laboratorio.

3.2.3. Determinación del tiempo letal 50 (TL50) y 90 (TL90) de los hongos

entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre larvas de la

garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

6

4. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

En Colombia y en muchos países se han considerado las pérdidas económicas

ocasionadas por las garrapatas al ganado bovino. Springell (1974) señaló que al

incrementar la infestaciòn por garrapatas, disminuye la ganancia de peso del bovino y

concluyó que se produce una pérdida de 0.28 Kg por cada garrapata. Springell (1974),

también dedujo que la infestación de una garrapata Boophilus microplus, causa la pérdida

de 450 g de peso de un bovino al año, además de las pérdidas ocasionadas por la

transmisión de enfermedades por su parasitismo. Ante las anteriores consideraciones,

cada día es más urgente disponer de medidas efectivas de control para las garrapatas.

Una estrategia es la utilización del manejo integrado de plagas, que implica el uso de

diversos métodos de control, integrados de tal forma que los costos de cada uno sean

reducidos y que en combinación produzcan un mayor efecto. Esto debido a que la

disponibilidad de productos químicos para el control de garrapatas es cada vez menor,

por los altos costos para su desarrollo, la aparición de resistencia y la contaminación

ambiental que producen.

Por lo anterior es importante desarrollar estudios que evaluen la patogenicidad de

hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae para el

control microbiano de la garrapata del ganado Rhipicephalus (Boophilus) microplus. La

utilización de hongos entomopatógenos para el control de insectos plaga es una

alternativa viable desde el punto de vista económico, ya que se pueden reproducir a gran

escala y en pequeñas cantidades. Es necesario llevar a cabo programas de control que

puedan ser implementados en el sector pecuario, lo cual implica la generación de

estrategias de manejo integrado de garrapatas, adecuadas a las condiciones del país,

mediante un control microbiano de la plaga, disminuyendo de esta forma el impacto

negativo ocasionado en la explotación bovina por causa de las garrapatas.

7

5. JUSTIFICACIÓN

Las garrapatas, son los ectoparásitos de mayor importancia económica para el país. En

Colombia las pérdidas están representadas por la disminución de la producción de leche,

carne, daño en las pieles, muerte de animales, dificultad en la adaptación de razas

susceptibles importantes en el comercio internacional y la adaptación de las mismas a

cambios climáticos (Parra et al., 1999).

En Australia se ha comprobado que en animales con una infestación mediana e intensa

se pueden perder cerca de 166 ml diarios de sangre, conllevando a una pérdida de 60

litros por año y que un promedio de 50 garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus

causan una pérdida anual de 0.76 Kg por garrapatas, o sea aproximadamente 4

toneladas de carne por cada 100 bovinos. El departamento de Agricultura de los Estados

Unidos ha calculado que vacas con infestación media y alta bajan su producción de leche

en un 18.6% y un 42.4%, respectivamente (FAO, 2004). La FAO estima que en países

con buen sistema de control, las pérdidas ocasionadas por garrapatas alcanzan del 10 al

20% del valor total de la producción del año y que en países con sistemas de control

deficientes, el porcentaje oscila entre un 30 y un 40% del valor anual de la producción

(FAO, 2004).

Los datos anteriores fundamentan la necesidad de controlar las poblaciones de

garrapatas para evitar daños mayores en la economía de los países, por los altos costos

que ocasionan, implementando nuevas alternativas como el uso de reguladores

biológicos, manejo integrado de plagas (MIP) y el uso de productos ambientalmente

amigables (Parra, et al., 1999).

Un aspecto importante por el cual se requiere la búsqueda de nuevas alternativas para el

control de ectoparásitos en animales, es la resistencia que han adquirido estos

artrópodos debido al uso constante y excesivo de compuestos químicos (acaricidas

sintéticos). La estrategia más utilizada durante muchos años para el control de la

garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, ha sido la aplicación de sustancias

químicas acaricidas sobre el cuerpo de los bovinos parasitados, a intervalos

específicos. El historial del uso de acaricidas en el mundo ha incluido a los arsenicales,

organoclorados, organofosforados, carbamatos, piretroides, amidinas, endectocidas

(lactonas macrocíclicas) y fenilpirazoles, entre otros. Sin embargo, la aparición de

resistencia ha constituido una limitante para la utilización de estos químicos. La dificultad

8

para poder pronosticar que los mecanismos establecidos en las cepas resistentes puedan

afectar la eficacia de nuevos acaricidas, incluyendo aquellos con nuevas estructuras

químicas, sumado a los altos costos del desarrollo de nuevas moléculas, hace más

sombrío el panorama para el futuro control de las garrapatas (Suthers et al., 1989).

Teniendo en cuenta que los ganaderos reaccionan frente al ataque de garrapatas con el

uso indiscriminado de acaricidas químicos y si bien éstos han permitido un control eficaz,

se ha establecido que este tipo de compuestos pueden ser perjudiciales para la salud

humana y los ecosistemas, además de la resistencia adquirida de la plaga a algunos

productos. Por la gran preocupación que esto ha generado, se pretende limitar la

aplicación de estos productos y promover un manejo integrado.

Dentro del manejo integrado de garrapatas se presenta un control microbiano como una

nueva alternativa para el control, utilizando cepas patogénicas de algunos hongos

entomopatógenos como Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces sp y

Lecanicillium lecanii. De esta forma se busca disminuir el impacto ecotoxicológico que

ocasionan algunos productos químicos que son utilizados convencionalmente para el

control de este ectoparásito, y mejorar la inocuidad del producto final (carne y leche),

además de la posibilidad de disminuir los costos de producción. Este último aspecto es

muy importante, pensando en la expansión de la industria ganadera nacional hacia los

mercados internacionales.

9

6. HIPÓTESIS DE TRABAJO

6.1. FASE DE CAMPO

Ho 1: No existen diferencias estadísticamente significativas entre los controles no

tratados, las cepas formuladas y las cepas no formuladas de los hongos

entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae evaluados bajo

condiciones de campo para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus en su estado de ninfa.

Hi 1: Al menos una de las cepas evaluadas de los hongos entomopatógenos Metarhizium

anisopliae y Beauveria bassiana presenta diferencias estadísticamente significativas en

comparación con los controles no tratados, bajo condiciones de campo para el control de

la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en su estado de ninfa.

6.2. FASE DE LABORATORIO

Ho 2: No existen diferencias estadísticamente significativas entre los controles no

tratados, las cepas formuladas y las cepas no formuladas de los hongos

entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae evaluados bajo

condiciones de laboratorio para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus en su estado larval.

Hi 2: Al menos una de las cepas evaluadas de los hongos entomopatógenos Metarhizium

anisopliae y Beauveria bassiana presenta diferencias estadísticamente significativas en

comparación con los controles no tratados bajo condiciones de laboratorio para el control

de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en su estado larval.

Ho 3: No existen diferencias estadísticamente significativas entre las concentraciones

probadas de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae

para el control microbiológico de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en su

estado larval bajo condiciones de laboratorio, en comparación con los controles no

tratados.

Hi 3: Al menos una de las concentraciones evaluadas bajo condiciones de laboratorio

para el control de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en su estado larval

presenta diferencias estadísticamente significativas en comparación con los controles no

tratados.

10

7. REVISIÓN DE LITERATURA

7.1. HONGOS ENTOMOPATÓGENOS:

Un gran número de hongos son parásitos letales de artrópodos, y pueden infectar su

hospedero en cualquier estado de su ciclo de vida. El estudio de los organismos causales

de enfermedades en insectos fue preconizado desde siglos atrás por los egipcios por su

importancia para regular las poblaciones de plagas. El primer hongo descubierto fue

Beauveria bassiana (muscardina blanca) en 1835 por Agostino Bassi, a partir de las

observaciones sobre la muscarina blanca del gusano de seda Bombyx mori ocasionada

por el hongo Beauveria bassiana. En 1879 el ruso Elías Metchnikoff, utiliza Metarhizium

anisopliae (muscardina verde) para controlar las abundantes poblaciones de Anisoplia

austriaca, desde ese momento se han realizado muchas investigaciones, que han

permitido la implementación de estos microorganismos en un Manejo Integrado de

Plagas (MPI) (Bittencourt, et al, 1994).

Los hongos entomopatógenos constituyen un único grupo de microorganismos patógenos

de insectos en que la ingestión por el hospedero no es un prerrequisito para llevar a cabo

el proceso de infección, debido a que hay una penetración directa de la cutícula. Sus

conidios germinan sobre la cutícula del insecto, debido a que la superficie de estas

conidios consiste de una capa hidrofobica que interactúa con la epicutícula para llevar a

cabo el proceso de adhesión, luego desarrollan un tubo germinativo para penetrar y un

micelio dentro del hospedero para colonizar, y por último esporular en su superficie

(Carrillo, 2003).

Los hongos se describen como uno de los primeros agentes patógenos de los artrópodos

registrados en la historia. La mortalidad causada por las infecciones producidas por

hongos se debe a la destrucción mecánica de los tejidos, la eliminación de agua y la

actividad de las micotoxinas. Estos atacan al insecto a través de la cutícula, lugar donde

germinan las esporas, las cuales producen hifas invasoras que penetran los tejidos del

hospedero. Las hifas se ramifican por crecimiento del hongo, colonizan y llegan hasta la

cavidad hemocélica, donde se produce micelio, y se liberan las toxinas que están

implicadas en el bloqueo del desarrollo fisiológico del insecto (Bircher et al., 1990).

El potencial que tienen los hongos entomopatógenos como agentes de control, al

constituir un grupo con más de 750 especies de casi 100 géneros que pueden infectar

insectos, ha sido reconocido (Vilcinskas et al., 1996). La mayoría de estos hongos

pertenecen a las divisiones Zigomicota (entomophorales), Deuteromicota (hifomicetos) y

11

Ascomycota, encontrándose comúnmente en la naturaleza. Sin embargo, sólo algunos

hongos entomopatógenos han sido estudiados a fondo y son utilizados comercialmente

(Tabla 1), y están ahora siendo reproducidos a gran escala industrial mediante medios

artificiales con el fin de desarrollar inóculos con los cuales puedan atender la demanda

producida por las grandes pérdidas que generan estos insectos y artrópodos plaga en el

sector agropecuario (Kendrick, 1992), dentro de los mas importantes se mencionan,

Metarhizium spp, Beauveria spp, Aschersonia spp, Entomopthora spp, Zoophthora spp,

Erynia spp, Eryniopsis spp, Akanthomyces spp, Fusarium spp, Hirsutella spp,

Hymenostilbe spp, Paecelomyces spp y Lecanicilliun spp, pertenecientes a la clase

Zygomycetes e Hyphomycetes (Pucheta et al., 2006).

Los hongos entomopatógenos son de gran importancia dentro de los agroecosistemas

por su capacidad natural para degradar y descomponer materia orgánica y por su

potencial para regular las poblaciones de insectos, la cual depende de la susceptibilidad

del hospedero o de la asociación patógeno-hospedero. En este último caso, el insecto

hospedero puede ejercer una presión de selección que favorezca a pocos genotipos del

patógeno; es decir, hay una selección natural de estos microorganismos en términos de

especialización con respecto al hospedero (Pucheta et al., 2006). Los hongos

entomopatógenos son buenos reguladores de plagas en la naturaleza por su alta

virulencia, patogenicidad, amplia dispersión y capacidad de penetrar al hospedero por su

cutícula (Gindin et al., 2001).

Tabla 1. Principales hongos entomopatógenos utilizados comercialmente para el control de

insectos plaga (Wraight et al., 1998)

Especie

Insecto plaga

Beauveria bassiana Langostas, chapulines, áfidos, escarabajos,

mosca blanca.

Beauveria brogniartii Moscas, escarabajos.

Metarhizium anisopliae Termitas, chapulines, gallina ciega, langostas,

picudos del chile y algodón, escarabajos.

Paecilomyces fumosoroseus Mosca blanca.

Lecanicillium (Verticillium) lecanii Áfidos, trips, mosca blanca.

12

7.2. CARACTERÍSTICAS FISIOLÓGICAS

Para que la manifestación epizoótica de los hongos entomopatógenos tenga lugar, los

factores bióticos y abióticos tienen una enorme influencia. Entre los factores abióticos que

afectan la viabilidad y la persistencia de los hongos entomopatógenos en campo se

encuentran los rayos ultravioleta, la temperatura, la humedad relativa, pH y los fungicidas

(López et al., 1995). La susceptibilidad y la relación con los hospederos se relacionan

con los nutrientes presentes en los insectos, que son el medio para la propagación,

dispersión y persistencia de los hongos. Los conidios de los entomopatógenos tienen

requerimientos específicos de agua y temperatura, así como de otros factores

ambientales que en conjunto funcionan como inductores para la activación de receptores

presentes en el patógeno y que les permiten llevar a cabo el proceso infectivo sobre el

hospedero (Pucheta et al., 2006).

La germinación de los conidios de los hongos entomopatógenos esta influenciada

críticamente por los factores ambientales, especialmente temperatura y humedad.

Específicamente estos hongos requieren de una atmósfera saturada de humedad

equivalente a una humedad relativa entre 85 a 92% y una temperatura optima de

crecimiento en el rango de 25C° a 30°C, son mesófi los, mínima de 10C° y máxima de

32°C. Estudios realizados por Hallsworth (1999), de muestran un crecimiento óptimo de

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae a una temperatura de 25°C y 30°C, y una

actividad de agua (aw) de 0,90 y 0,998 respectivamente. Condiciones que son críticas

para el desarrollo de un hongo biocontrolador, debido a que en el caso de la humedad

relativa, esta es un factor abiótico indispensable para los procesos de germinación de

esporas, crecimiento e infección. Estos hongos son poco exigentes para su crecimiento

en el laboratorio sobre medios de cultivos artificiales como Agar Sabouraud y PDA (Agar

Papa Dextrosa).

Los hongos entomopatógenos realizan interacciones bioquímicas con la epicutícula (capa

mas externa de la cutícula, la cual es muy delgada y presenta un alto contenido lipidico)

de sus insectos hospederos, cuya capa mas externa esta compuesta por lípidos,

principalmente compuestos altamente estables y de cadena larga (20-40 carbonos),

características que le permiten ser mas resistente a la degradación enzimática (Pedrini et

al., 2006). Definitivamente una fuente de carbono es necesaria para la germinación de los

conidios de los hongos, estudios han demostrado que la quitina y ciertos ácidos grasos

presentes en la cutícula de los insectos son eficientemente utilizados como fuente de

13

carbono, indicando que los hongos entomopatógenos deben usar nutrientes presentes en

el integumento de los insectos. Otros estudios realizados por Napolitano y Juárez (1997)

encontraron que las fracciones lipidicas de la epicuticula de Ostrinia nubilalis

(Lepidóptero), Melolantha melolontha (Coleóptero) sirven como fuente de energía

favorable para la germinación de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae. Por otro

lado, cuando la fuente de carbono fue solo un extracto de hidrocarburos epicutícular de

Triatoma infestans (Hemiptera), la producción de conidios fue dos veces mas alta que la

obtenida con un extracto epicutícular no hidrocarbonado. Datos preliminares

demostraron que los Hyphomicetos entomopatógenos son viables consumiendo

hidrocarburos alifáticos de cadena media como esteroles y glicerol. Estos también

incluyen n-alcanos y n-alquenos, los primeros han sido encontrados en por lo menos 100

especie de insectos plaga (Figura 1) (Nelson y Blomquist, 1995). Demostrándose con

esto, la habilidad de los hongos entomopatógenos para degradar hidrocarburos alifáticos

presentes en la epicuticula de insectos y utilizarlos para la producción de energía,

mediante reacciones de oxidación, e incorporación en sus componentes celulares.

Figura 1. Microscopia electrónica de B. bassiana creciendo con alcanos como fuente de carbono. (a) Proyecciones en forma de dedos en la membrana, (b) Estructuras membranosas, lameladas, (c) Inclusiones del hidrocarburo alifático (Nelson y Blomquist, 1995).

7.3. PROCESO DE INFECCIÓN:

Una serie de eventos definidos son necesarios para el contacto entre el patógeno y el

organismo blanco. La secuencia de estos eventos corresponde a la adhesión de conidios

sobre la cutícula del artrópodo, germinación, interacción con la cutícula estimulando o

inhibiendo componentes, formación del apresorío en algunas especies, penetración,

crecimiento dentro del hemocele y la interacción con el sistema inmune, producción de

toxinas y muerte del hospedero (Valencia , 2002).

14

Bajo condiciones favorables los hongos siguen creciendo dentro del cadáver del

hospedero y eventualmente producirán muchos conidioforos, los cuales pueden infectar

nuevos hospederos de insectos o artrópodos (Valencia, 2002).

Los hongos entomopatógenos inician su proceso infectivo cuando las esporas viables son

retenidas en la superficie del integumento donde se realiza la asociación de patógeno y

hospedero, donde se inicia la formación del tubo germinativo, comenzando el hongo a

excretar enzimas como las proteasas, quitinasas, quitobiasas, lipasas y lipooxigenasas

(Figura 2). Estas enzimas degradan la cutícula del insecto y coayudan con el proceso de

penetración por presión mecánica iniciado por el apresorio, que es una estructura

especializada formada en el tubo germinativo, una vez dentro del artrópodo, el hongo se

desarrolla cuerpos hifales que se van diseminando (Pucheta et al., 2006).

Figura 2. Ciclo infectivo de los hongos entomopatógenos tipo M. anisopliae para control de insectos (Kershaw et al., 1999).

7.3.1. ADHESIÓN:

Los conidios se adhieren para infectar al hospedero, aunque esto depende del número

que sea capaz de germinar y penetrar en el artrópodo y el numeró de propagulos capaz

de permanecer adheridos en el integumento del artrópodo hospedero después del

contacto inicial. Además, en la naturaleza la probabilidad para que inicie el contacto

artrópodo y hongo entomopatógeno será dependiente de las capacidades fisiológicas del

hongo de producir conidios oportunamente y dispersarse por mecanismos adecuados,

15

según Fargues (1984), reporto que los cambios electrostáticos contribuían a la primera

interacción física entre el conidio y la cutícula y en segundo lugar la hidrofobicidad de los

conidios (Khachantourians et al., 2000).

El evento inicial es el ataque del conidio, desde aquí se determinan todos los eventos

subsecuentes de la infección. El conidio ataca los artrópodos sobre la cutícula, la cual

involucra dos pasos: El primero son las interacciones no específicas mediadas por

fuerzas electrostáticas e interacciones hidrofobicas, y la segunda, son las interacciones

específicas debido a la presencia sobre la superficie del conidio proteínas (glicoproteínas)

como las adhesinas y lectinas. Estas reconocen específicamente glicolipidos o

glicoproteinas de la cutícula del hospedero (Valencia, 2002). Observaciones preliminares

sugieren que la hidrofobicidad de las conidioesporas de Beauveria bassiana pueden ser

modificada por tratamientos a diferentes concentraciones de Tween 20 y 80, esto indica

que la aplicación de cepas inducidas a una alta hidrofobicidad pueden llegar a ser mas

virulentas que las cepas nativas (Valencia, 2002).

Para penetrar el integumento externo del hospedero, la conidiospora debe adherirse a la

superficie cutícular. La interacción entre los conidios y la cutícula depende de las

sustancias mucilaginosas que rodena el conidio, de las enzimas y de la conformación

morfológica del integumento, la cual favorece la germinación del conidio. Las conidios

pueden adherirse al azar de acuerdo a los pliegues íntersegméntales o a la rugosidad de

la superficie de la cutícula (Vargas et al., 2000).

Se ha sugerido que iones divalentes como el Ca+2 y el Mg+2 reducen las fuerzas de

repulsión electrostática de la superficie del artrópodo, por lo que pueden afectar su

hidrofobicidad y promover la adhesión de la pared celular fúngica a la cutícula, creando

condiciones favorables para el establecimiento de la espora y la subsecuente invasión del

hospedero (Pucheta et al., 2006). La principal importancia de la utilización de la

hidrofobicidad en las cepas de los hongos entomopatógenos, se refiere a la posibilidad

de incrementar el número de esporas que podrían permanecer atacando la cutícula del

insecto, después de la aplicación.

El manejo de la hidrofobicidad de las conidiosporas de hongos entomopatógenos

aislados puede ser una nueva alternativa para el desarrollo, selección y formulación de

bioplaguicidas.

16

7.3.2. GERMINACIÓN:

La germinación de la espora o conidio se inicia con el hinchamiento de la misma, que es

favorecido por una humedad alta (70% durante 14 horas); la germinación es disparada

por mensajeros que generalmente son carbohidratos individuales o complejos de

carbohidratos y proteínas presentes en la cutícula del insecto o artrópodo (Pucheta et al,

2006). La hidratación del conidio es favorecida por la acción antidesecante de su cubierta

mucilaginosa, que además funciona como protector ante la presencia de polifenoles

tóxicos y enzimas degradativas, secretadas por sistema inmune del artrópodo. Después

del hinchamiento de la espora tiene lugar la formación del tubo germinativo mediante el

proceso de polarización típico del crecimiento apical de los hongos, que estimula la

síntesis de la pared celular (Pucheta et al., 2006).

Los iones H+ y Ca2+ entran en la punta de la hifa a través de un mecanismo de transporte

pasivo y son expulsados por mecanismos dependientes de energía. Este flujo

transcelular permanece constante y mantiene el desarrollo del tubo germinativo y la

formación del apresorío, una estructura especializada formada en el tubo germinativo, el

cual recorre y reconoce la superficie del artrópodo para la localización de sitios

receptores, habilitando de ésta forma a la hifa para la penetración de la cutícula (Vargas

et al .,2000). El apresorío sirve para el anclaje de la espora o conidio y ejerce una presión

hacia el interior del artrópodo. Paralelamente, el hongo excreta una gran cantidad de

enzimas entre las que se incluyen proteasas, quitinasas, quitobiasas, lipasas,

lipooxigenasas y otras enzimas hidrolíticas, que van degradando la cutícula y

proporcionan a su vez nutrientes al hongo (Pucheta et al.,2006). El hongo

entomopatógeno Metarhizium anisopliae presenta un alto contenido de aminopeptidasas

e hidrofobina, las cuales favorecen la acción de enzimas extracelulares sobre la cutícula

del artrópodo para el proceso de infección. Sin embargo, se han encontrado esterasas y

proteasas en conidios no germinados, lo que sugiere una modificación de la superficie

cutcular previa a la germinación, ya que durante la hidratación del conidio no solo

absorbe agua, sino también nutrientes (Pucheta et al., 2006).

La germinación de los conidios del hongo puede ser inducida por componentes químicos

presentes en la cutícula del hospedero. Por ejemplo, la germinación de conidioforos de

Paecilomyces esta estimulada por esteroles y diacilgliceroles extraidos de su hospedero

Anticarsia gemmatalis (Boucias et al., 1988). Componentes como lípidos y ceras

presentes en la cutícula de algunos insectos, como por ejemplo Bemisia tabaci (mosca

blanca), se reporta que estos son potencialmente exitosos, debido a que estimulan la

gemación del conidio del hongo entomopatógeno. Los eventos tempranos de la infección

17

son críticos debido a que tiene lugar fuera del artrópodo, así exponiendo al hongo a

factores ambientales no favorables. Por esta razón, la selección de cepas de hongos con

una alta velocidad de desarrollo es un criterio promisorio para una buena selección de

aislamientos de hongos para el control de plagas (Khachatourians et al., 2000).

Otro aspecto de significante importancia en la patogenicidad y especificidad de los

hongos entomopatógenos es la utilización de substratos de la cutícula del hospedero

(Hegedus y Khachatourians, 1995; Fargues, 1984) como ácidos grasos que se

encuentran sobre las cutículas de algunos insectos como son ácido linoléico, acido

palmitito, etc. Como resultado la presencia o ausencia de estos componentes en la

cutícula, pueden bien determinar la rapidez y la extensión del crecimiento micelial y de la

virulencia que puede producir el hongo sobre el patógeno. La importancia de la utilización

de lípidos para la germinación y crecimiento de hongos entomopatógenos, confirma la

presencia de lipooxigenasas las cuales son enzimas envueltas en el metabolismo de

componentes lipidicos necesarios para el crecimiento del hongo, como demostró Kerwin y

Washino (1984), donde la conidiogenesis del hongo Erynia variabilis es regulado

directamente por los lípidos extraídos de adultos y pupas de las moscas Fania

canicularis. En adición a los nutrientes, la cutícula de los insectos usualmente presenta

una diversidad de inductores e inhibidores de componentes (Lecuona et al, 1992;

Khachatourians, 1996), Los cuales están regulando la germinación y el crecimiento de

hongos entomopatógenos.

7.3.3. PENETRACIÓN:

La penetración a la cutícula del hospedero es un paso crítico durante el proceso de

infección. La penetración es un fenómeno que resulta de la combinación de dos factores

principales: actividad enzimática y fuerzas físicas hidrostaticas por la hifa (Hegedus y

Khachatourians, 1995; Howard et al, 1991) Para algunas cepas de Metarhizium

anisopliae, la penetración puede ser ayudada por la formación de apresorio, una

estructura hinchada mucilaginosa que libera enzimas sobre una area reducida de la

cutícula para facilitar la adhesión, así la adhesión y penetración son eficientes. Sin

embargo no todos los hongos entomopatógenos forman apresorio, epecies como

Beauveria bassiana rara vez es capaz de formar esta estructura (Bidochka y

Khachatourians, 1991). El principal factor requerido para la penetración de la cutícula por

todos los hongos entomopatógenos estudiados, son las enzimas hidroliticas. Estas

enzimas son de gran importancia para el patógeno, no solo por que tienen la posibilidad

18

de romper la cutícula sino también por que proveen de nutrientes y oxígeno al hongo para

su crecimiento (Khachatourians, 1991).

Las enzimas hidroliticas pueden estar dentro de tres categorías: Proteasas, quitinasas y

lipasas, las cuales son sintetizadas en una combinación de interacciones relacionadas

con la estructura y componentes de la cutícula del insecto. Notablemente la actividad de

estas enzimas puede ser inducida in Vitro cuando el hongo patógeno esta en crecimiento

y sintetiza componentes mediante las enzimas (Bidochka y Khachatourians, 1991).

La actividad de muchos tipos de lipasas es el primer requerimiento para la degradación

de la cutícula de los insectos. La importancia de las lipasas del hongo depende de las

interacciones específicas con el insecto o artrópodo. Las enzimas pueden ser muy

importantes para la infección de artrópodos plaga y para la selectividad de los hongos

entomopatógenos, a organismos no objetivo y benéficos (Valencia, 2002).

Las enzimas proteasas secretadas por los hongos pueden ser inhibidas, debido a la

presencia de inhibidores de proteasas dentro del insecto hospedero. Por ejemplo

estudios realizados por Boucias y Pendland, 1987, demostraron que la germinación y el

crecimiento de N.rileyi es interrumpida por los inhibidores identificados dentro de la

hemolinfa de los estados inmaduros de A. gemmatalis.

La quitina se deriva de monomeros, incluyendo la quitobiasa, glucosamina y n-

acetilglucosamina, que son inductores generales del desarrollo de muchos hongos

entomopatógenos (Bidochka y Khachatourians, 1991). La deficiencia de quitina al igual

que la deficiencia de proteasas disminuye la virulencia del hongo entomopatogeno (Paris

et al., 1985). Otras enzimas como las amilasas y glucoamilasas son también importantes

para la infección, encontrando que cepas hipervirulentas de Metarhizium anisopliae son

capaces de elevar los niveles de amilasa durante el proceso de infección. Estas enzimas

son requeridas para la utilización de glucogenos y otros carbohidratos presentes en los

tejidos grasos y otros compartimentos del insecto (Hopkins, 1999).

El modo de acción de los hongos entomopatógenos es una relación de la actividad de

enzima hidroliticas como proteasas, quitinasas y lipasas. Estas enzimas tienen la

habilidad de degradar la cutícula y proveer de nutrientes al hongo para su creciemiento

inicial (Khachatourians, 1991).A través de la combinación de la actividad de diferentes

enzimas hidroliticas, se produce por completo la degradación de la cutícula; se ha

encontrado que la deficiencia de proteasa en una cepa mutada de Beauveria bassiana

19

representaba una significativa reducción de la virulencia contra chapulines o saltamontes

al ser comparado con una cepa nativa, esto se debe a que la virulencia es un proceso

multifuncional (Valencia, 2002). La actividad hidrolitica de las enzimas prueba ser un

factor limitante de la infección, el aumento de esta actividad puede contribuir a mejorar el

efecto de contacto y la virulencia de los hongos entomopatógenos.

7.3.4. CRECIMIENTO:

Una vez dentro del insecto o artrópodo, el hongo prolifera formando cuerpos hifales

secundarios, que se ramifican en la procutícula conformada principalmente de fibrillas,

lameladas, de quitina embebidas en una matriz proteínica que actúa como cubierta física

protectora ante las secreciones extracelulares del patógeno. Posteriormente, los cuerpos

hifales se encuentran con la capa epidérmica y con su respectiva membrana basal y se

diseminan a través del hemocele (Pucheta et al. ,2006). Así, invaden diversas estructuras

como tejidos musculares, cuerpos grasos, tubos de malpighi, mitocondrias, hemocitos,

retículos endoplásmicos liso y rugoso y membrana nuclear, ocasionando la muerte del

insecto después de 3 a 14 días de iniciada la infección, dependiendo de la virulencia del

hongo y del estado de desarrollo y susceptibilidad del insecto o artrópodo.

7.3.5. DISPERSIÓN:

Una vez muerto el artrópodo, y ya agotados muchos de los nutrientes, el hongo inicia un

crecimiento micelial secundario e invade todos los tejidos muertos del hospedero.

Finalmente, las hifas penetran la cutícula desde el interior del artrópodo y emergen a la

superficie, donde en condiciones ambientales apropiadas inician la formación de nuevos

conidios (Vilcinskas et al., 1996; Vargas et al.,2000).

Cabe destacar que durante la penetración del hongo desde la cutícula del insecto o

artrópodo hasta el hemocele, la hifa queda inmersa en proteínas, quitina, lípidos,

melanina, difenoles y carbohidratos; algunos de ellos se comportan como nutrientes pero

otros pueden inhibir su crecimiento, ya que el hospedero activa su sistema inmune a

través de procesos como la melanización, fagocitosis, nodulación y encapsulación. Sin

embargo, los hongos desarrollan una serie de respuestas fisiológicas y bioquímicas que

les permiten evadir este tipo de defensas, tales como cambios en la pared celular y

producción de sustancias inmunomodulatorias o toxinas fúngicas (Pucheta et al., 2006).

20

El ataque de hongos entomopatógenos ocasiona la ocurrencia de algunos síntomas; en

la fase infectiva de una la larva enferma, aparece la pérdida de apetito, decoloración del

integumento, hinchazón, flacidez, falta de movilidad hasta la parálisis, la muerte y la

momificación. Las larvas de lepidópteros y coleópteros que son afectadas en los últimos

estados de desarrollo larval, enpupan en actitud de defensa antes de cumplir el ciclo. Sin

embargo el hongo sigue su desarrollo hasta causarle la muerte. Luego crece el micelio y

esporulan a través de la pupa (Matthews, 2003).

Los síntomas que desarrollan los insectos o artrópodos se comienzan a visualizar a los 4

a 5 días después del contacto con el hongo, donde las larvas pierden actividad y dejan de

alimentarse; generalmente se observan manchas oscuras localizadas indistintamente en

la cutícula del insecto enfermo (Pucheta et al., 2006). Aunque los coleópteros adultos

infectados por el hongo se retiran del lugar donde se están alimentando un

comportamiento que a la larga, ofrece algún nivel de protección adicional a su especie.

Este comportamiento lo acompaña con una segregación de feromonas de alerta

informantes que evitan que otros adultos de su especie, lleguen al sitio y sean infectados.

Los hongos entomopatógenos usualmente presentan mayor virulencia frente algunos

estados de desarrolló del hospedero, siendo los estados jóvenes los más susceptibles.

Muchos hongos son de amplio espectro pero B. bassiana y M. anisopliae han demostrado

tener un buen nivel de especificidad dependiendo de la cepa seleccionada, los cuales

tienen un bajo impacto en insectos benéficos y enemigos naturales (EN) de la plaga

(Pucheta et al., 2006).

El hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae es un saprófito facultativo pudiéndose

desarrollar en el suelo o como parásito facultativo de algunos insectos. Cuando éste

hongo atraviesa la cutícula y entra a la hemolinfa del insecto debe adaptarse a diferentes

condiciones internas de su hospedero, para ello hay expresión de diferentes genes

involucrados en mecanismos de percepción, metabolismo de carbohidratos, proceso de

proteólisis de compuestos de la cutícula del insecto o artrópodo y síntesis de metabolitos

tóxicos. Estos genes de patogenicidad pueden codificar compuestos inductores que

interactúan directamente con su hospedero o con moléculas reguladoras que controlan

su expresión. El análisis de las ESTs (Expressed sequence tag) de M. anisopliae

creciendo sobre la cutícula del insecto mediante la técnica de PCR, demostró la

presencia de un gran número de genes involucrados en la interacción con su hospedero y

su respuesta inmune. Estudios realizados mediante comparación de secuencias sugieren

que el 50% de las ESTs de M. anisopliae codifican para enzimas y toxinas

21

principalmente, estas últimas son las encargadas de la disminución de la fecundidad y la

viabilidad de los huevos de insectos (Chengshu et al., 2005).

La expresión de estos genes que interactúan con el hospedero permite que este hongo

pueda adaptarse al ambiente de la cutícula y la hemolinfa en insectos y a los exudados

producidos por las raíces de las plantas, cuando se encuentran como saprófitos en el

suelo. Actualmente, mediante técnicas de hibridación demostró la presencia de

subtilisinas (enzimas que hidrolizan proteínas) en algunos análisis de M. anisopliae

creciendo sobre la cutícula de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Dutra et

al., 2004). Así mas adelante se demostró que en un estado temprano del proceso de

infección producido por algunos hongos entomopatógenos, las subtilisinas y tripsinas son

requeridas para solubilizar la cutícula de los insectos. Sin embargo, la liberación de estas

sustancias por los hongos, produce una estimulación del sistema de defensa de los

insectos mediado por el sistema de las profenoloxidasas (PPOs), las cuales provocan

una disminución en el crecimiento y reproducción del hongo entomopatogeno (Bagga et

al., 2004).

Para la mayor parte de los hongos entomopatógenos y para el caso de B. bassiana, la

adherencia es un paso previo necesario para su acción patogénica. La adhesión entre el

hongo (agente patógeno) y el hospedero tiene lugar por medio de moléculas de superficie

del patógeno, llamadas adhesinas, que se unen a receptores complementarios que

existen en las células del hospedero.

La mayor parte de estas moléculas estudiadas son glucoproteinas, mientras que los

receptores de las células del hospedero son generalmente azucares como la manosa.

Las adhesinas de diferentes cepas de la misma especie pueden variar en su estructura.

Diferentes tipos de células del hospedero pueden tener diferentes tipos de receptores

(Castellanos et al., 1999). Lecuona y colaboradores (1990) estudiaron las alteraciones de

la epicutícula del insecto (broca del café) al ser infectado por 147 cepas diferentes de

Beauveria bassiana y 6 cepas de B. brongniartii. Con ayuda de microscopía electrónica,

encontraron que los conidios se adhieren específicamente a los receptores de naturaleza

polisacárida del hospedero por intermedio de una particular segregación azucarada del

hongo. Después de cruzar la cutícula del artrópodo el conidio se transporta por el

hemocele hasta el momento de la muerte del hospedero, desarrollándose en presencia

de sustancias producidas por el hospedero para su defensa. Como parte de la reacción

de defensa cerca de las esporas son producidos granulomas (Narayanan, 2004).

22

Los hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana producen toxinas que son

capaces de destruir los granulomas, las cuales permiten a las blastosporas invadir la

hemolinfa. El hongo Beauveria bassiana al producir una toxina depsipéptida cíclica

(beauvericina) tiene un mecanismo de acción similar a las toxinas del hongo

Metarhizium, como las destruxinas aisladas por Kondo y Naganawa (1975). Estudios

realizados por Zizka y Weiser (1993), demostraron el efecto del beauvericin sobre la

ultraestructura de la larva de Culex pipiens, los cuales establecieron que con

concentraciones de hasta 0,1mg/ml de toxina se obtiene una mortalidad del 44% en 48

horas. El principal síntoma de la intoxicación fue la vacuolización generalizada. El efecto

toxico se concentro en las mitocondrias, las cuales se inflaron y tomaron aspecto de

vacuolas esféricas. La cromatina de los núcleos se concentró en forma de gránulos

alargados a lo largo de la membrana nuclear.

7.4. SISTEMA INMUNE DE INSECTOS CONTRA LOS HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS:

La primera respuesta de la hemolinfa de los insectos y artrópodos frente a una infección

está medida por los hemocitos circulantes, los cuales son muy eficaces a la hora de

eliminar sustancias o partículas extrañas a través de dos procesos principalmente, la

fagocitosis y la formación de nódulos o granulomas (Leucona, 1990). Luego como

respuesta secundaria a la infección aparece la inmunidad humoral, representada por la

secreción de una gran cantidad de enzimas antibacterianas y antifungicas, como las

cecropinas, atacinas, defensinas y diptericinas.

La fagocitosis es una forma de endocitosis en la cual bacterias y hongos, son

internalizadas por los hemocitos en grandes vesículas (fagosomas) que se funden con los

lisosomas, en donde las bacterias y hongos son destruidos y digeridos por la acción de

las enzimas lisosomales, generalmente de tipo proteasa. Mientras que la formación de

nódulos consiste en la agregación de los hemocitos con bacterias, esporas o partículas

abióticas cuando estas sobrepasan una determinada cantidad, esta acción ha sido

suprimida por sustancias liberadas por algunos hongos entomopatógenos como la

beauvericina, sintetizada por Beauveria bassiana y las destruxinas producidas por

Metarhizium anisopliae, las cuales destruyen estas agregaciones de los hemocitos

(Leucona, 1990). Cambios en el número de hemocitos circulantes han sido reportados

por algunos autores, cuando los insectos son atacados por algunos microorganismos,

demostrando que las infecciones por Beauveria bassiana han resultado en una supresión

gradual de la fagocitosis y alteraciones tanto en el conteo total como diferencial de los

hemocitos circulantes en ácaros, demostrándose nuevamente la capacidad que

23

presentan los hongos entomopatógenos para evadir los mecanismos de defensa

desarrollados por sus hospederos (Narayanan, 2004).

El proceso de infección esta dado por el rompimiento de la cutícula por enzimas

hidroliticas y el crecimiento inicial de micelio, posteriormente la hifa penetra la cavidad

del cuerpo y eventualmente busca la hemolinfa. Aquí se encuentra la primera interacción

con el sistema inmune del insecto, que consiste en una defensa que puede ser celular y

humoral, las cuales interactúan neutralizando la actividad de invasión del patógeno

(Hegedus y Khachatourians, 1995). La cutícula intacta de los insectos y artrópodos es

una barrera contra la invasión de agentes patógenos, esta al romperse o tener heridas

representa una oportunidad de invasión para algún patógeno. En general el sistema

inmune del insecto realiza una rápida coagulación de la hemolinfa donde ha sido

infectado por el patógeno en este caso por el hongo, un fenómeno llamado homeostasis

(Hegedus y Khachatourians, 1995).

Componentes liberados por los cistocitos y granulocitos, producen la coagulación de la

hemolinfa y una suspensión del sangrado, mediante la respuesta. Muchos hemocitos

pueden migrar al sitio de lesión para fagocitar al organismo invasor (Ratclife y Rowley,

1987). La patogenicidad de los hongos entomopatógenos esta dada por la evasión del

sistema inmune del insecto.

Los plasmocitos son células fagocíticas, que junto con granulocitos y cistocitos

contribuyen en el proceso de defensa del insecto. La eficiencia esta limitada dependiendo

del número de microorganismos invasores, para lo cual requiere otros mecanismos de

defensa adicionales (Hegedus y Khachatourians, 1995). Uno de estos mecanismos es la

formación de nódulos, estas estructuras se forman cuando partículas grandes están

unidas a una capa mucilaginosa haciendo que los granulocitos y cistocitos se unan por

los plasmocitos. La formación de nódulo ha sido característica de Melanoplus

sanguinipes contra los conidios de Beauveria bassiana, esta caracterizado por estar

rodeado de mucopolisacaridos, los cuales absorben el conidio y otros granulocitos

(Bidochka y Khachatourians, 1991). La infección de la larva del mosquito confirma la

hipótesis, que la superficie de cutícula de algunos insectos, puede reconocer los

propagulos del hongo a través de sus receptores (carbohidratos) y estimular la liberación

de células fagocíticas (Boucias y Pendland, 1988). Por otro lado la actividad de

hemoaglutinación esta inducida por la hemolinfa de lepidópteros, como resultado de la

infección del hongo.

24

La respuesta celular del insecto o artrópodo es mediada por diferentes procesos, como la

encapsulación, que es su última defensa contra el agente patógeno (Hegedus y

Khachatourians, 1995). La encapsulación esta mediada por el sistema de profenoloxidas

(PPOs), a través de la melanización de las partículas formadas sobre el insecto

hospedero. El sistema de las profenoloxidas se encuentra en el interior de los gránulos de

los hemocitos que pueden ser liberados por la presencia de los péptidoglicanos, B-

glucanos o lipopolisacáridos presentes en la pared celular de muchos microorganismos.

Una vez liberado el contenido granular por degranulación, el sistema de profenoloxidasa

es activado en fenoloxidasa. La fenoloxidasa es la enzima responsable de la

melanización observada en insectos (Söderhäll et al., 1996). Esta última es responsable

de la oxidación de fenoles en quinonas los cuales se polimerizan en melanina. La

melanina es un pigmento pardo-negro al cual, se le adjudican diversas propiedades

biológicas tal como la inhibición de la actividad de enzimas bacterianas y fúngicas

(Söderhäll et al., 1996).

7.5. FACTORES QUE INFLUYEN EN EL ESTABLECIMIENTO Y ACCIÓN DE LOS

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS:

Los factores ambientales cumplen una función esencial en la iniciación y desarrollo o en

la prevención y supresión de las epizootias naturales producidas por los hongos,

afectando las condiciones fisiológicas del hospedante, su densidad, distribución espacial

y temporal. Forman un complejo de factores que interactúan entre sí y entre otros

componentes del ambiente, siendo los más estudiados la temperatura, humedad relativa

y radiación solar. El microclima del insecto o artrópodo plaga y de los animales afectados

influye directamente sobre la capacidad infectiva de los hongos entomopatógenos

(Hernández, 2003).

7.5.1 HUMEDAD RELATIVA (HR):

La humedad relativa es un factor de gran importancia, tanto para el hospedante como

para el patógeno. Es indispensable en las diferentes fases del ciclo de las relaciones

entre ambos organismos. Tiene efecto sobre la germinación, penetración y para la

reproducción de los hongos entomopatógenos. La falta de humedad relativa adecuada

puede perjudicar una epizootia (Hernández, 2003).Por ejemplo se requiere de humedad

relativa alta para la germinación del hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae.

25

7.5.2 TEMPERATURA AMBIENTAL:

La temperatura puede afectar la estabilidad de los patógenos en el almacenamiento,

durante las aplicaciones en el campo y en su ocurrencia natural en el agroecosistema

(Costal et al., 2001). Los entomopatógenos no poseen condiciones biológicas para

defenderse de las grandes variaciones de temperatura y puede ser limitante para varios

microorganismos. El rango favorable de temperatura para los diferentes grupos de

entomopatógenos varía entre 20ºC y 30°C siendo en s u mayoría los hongos

entomopatógenos mesófilos. Sin embargo, existe una temperatura ideal para cada

patógeno y para cada fase del ciclo de la relación con su hospedante.

La temperatura es uno de los factores abióticos más importantes para los hongos

entomopatógenos debido a que puede afectar el grado y velocidad de la germinación de

los conidios, el desarrollo y penetración del tubo germinativo y la colonización y

reproducción. Los requerimientos térmicos de los hongos entomopatógenos son variables

en función de la especie, cepa y fase de desarrollo. El desarrollo de las enfermedades

fúngicas en los insectos puede ser perjudicado por temperaturas superiores a 30 °C

(Costal et al., 2001).

Las esporas de hongos entomopatógenos germinan a temperaturas entre 15ºC y 35°C,

siendo el rango óptimo entre 25ºC y 30°C y se requi eren al menos cuatro días para la

esporulación de hongos como Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana. La

esporulación es inhibida a temperaturas inferiores de 10°C y superiores a 35°C (Costal et

al., 2001).La temperatura óptima se sitúa por arriba de los 25°C (Bircher et al., 1990).

Sólo un escaso número de especies disponen de una temperatura óptima de desarrollo

superior a los 35°C, pero por esta razón, se presta particular atención a su patogenicidad

potencial para los humanos, tal como es, por ejemplo, el caso del género Aspergillus.

7.5.3. MICROAMBIENTE:

La temperatura y humedad y su acción combinada, crean condiciones para el

funcionamiento fisiológico de los distintos organismos. Así, estas variables influyen

directamente en el desempeño de los hongos entomopatógenos contra el hospedero.

Algunos hongos pueden entrar en latencia cuando las condiciones ambientales no son

favorables para su desarrollo, asi también, la mayoria de los hongos pueden acelerar su

crecimiento en condiciones favorables de humedad y temperatura (Rodríguez et al.,

2005). De esta forma facilitando la infección sobre su hospedero.

26

7.5.4. RADIACIÓN SOLAR (RS):

Para evaluar el efecto de la radiación solar sobre los hongos y sobre la ocurrencia de las

enfermedades es necesario considerar los siguientes aspectos: espectro de luz visible

con sus diferentes longitudes de onda (luz verde, amarilla, azul, etc.), fotoperíodo y faja

de luz ultravioleta germicida (Costal et al., 2001). La exposición a la luz ultravioleta puede

ser letal para los conidios de los hongos entomopatógenos. El crecimiento y esporulación

de los hongos es retrasado o impedido por la radiación solar jugando está un papel

importante en el desarrollo de las epizootias causadas por los hongos (Cagan et al.,

2001).

La luz influencia el desarrollo de los microorganismos y en algunos casos puede

funcionar como inhibidor del crecimiento y otras funciones vitales. En los hongos el efecto

de la luz puede dividirse en dos aspectos: efectos morfogeneticos, en los cuales la luz

incide o inhibe el desarrollo de una estructura, y efectos no morfogeneticos, en los cuales

la luz influye en la velocidad de síntesis de un compuesto. Sin embargo se ha

demostrado que la mayoría de los hongos filamentosos no son influenciados fuertemente

por los períodos de oscuridad o luz (Urón, 2004).

La influencia y las interacciones entre la radiación y las características UV del hongo B.

bassiana con una exposición a largo plazo puede inhibir el crecimiento del hongo (Urón,

2004). La supervivencia de los conidios de éste hongo entomopatógeno a la exposición

de luz UV puede cambiar la forma de nutrición de prototrófica (Capaz de sintetizar

compuestos orgánicos) a auxotrófica (Organismo incapaz de sintetizar una molécula

orgánica indispensable para su propio crecimiento éste se consigue administrando la

sustancia con los otros nutrientes) (Cagan et al, 2001). La exposición de la luz UV en el

hongo puede interferir con sus características fisiológicas, morfológicas y características

bioquímicas. Se confirmo que la patogenicidad puede ser inhibida debido a las

radiaciones, aunque se a trabajado en nuevas cepas con mutagenes para la resistencia a

la luz, además de tener una alta patogenicidad, algunas de estas cepas fueron probadas

con tratamiento laser donde las esporas de Beauveria bassiana aumentaron el índice de

mortalidad en polillas de pino (Dendrolimus sp), estás esporas crecieron a mayor

velocidad con un mayor resistencia a la luz UV (Cagan et al, 2001).

27

7.6. LOS AGROQUÍMICOS Y SU INTERACCIÓN CON HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS:

La susceptibilidad de los hongos entomopatógenos a los agroquímicos puede variar de

acuerdo con el grupo y cepa del hongo, con la naturaleza química del producto y con la

dosis empleada. Existen sustancias que son letales para estos microorganismos que

poseen un efecto fungistático. De esta forma afecta la viabilidad de las esporas y por lo

tanto la virulencia y eficacia de los hongos entomopatógenos contra la plaga (Baxter et

al., 1998). Generalmente, distintas especies de hongos pertenecientes a grupos

taxonómicos diferentes, son afectadas en forma diferencial por fungicidas específicos

para cada grupo, con mecanismos de acción a su vez distintos. Esto permite, por

ejemplo, el uso de fungicidas químicos que son basidiomiceticidas (contra royas y

carbones), con una seguridad relativamente amplia, a favor de hongos entomopatógenos

pertenecientes a los grupos de Deuteromycotina o Ascomycotina (Valencia, 2002).

7.7. GENERALIDADES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria

bassiana Y Metarhizium anisopliae:

La subdivisión Deuteromycotina comprende una gran variedad de especies de hongos

(aproximadamente 15.000), de los cuales se conocen alrededor de 750 especies capaces

de infectar insectos y artrópodos. La reproducción de estos hongos se realiza por

mecanismos asexuales o parasexuales, debido a que los Deuteromicetos aparentemente

carecen de una fase de reproducción también llamada perfecta, por lo común son

denominados “hongos imperfectos”, al menos en las condiciones típicas de los medios de

cultivo artificiales. En algunos casos los micólogos han encontrado los estados sexuales

en la naturaleza, o han conseguido desarrollarlos en condiciones de cultivo en el

laboratorio, mucho tiempo después de que los hongos fueron descritos como hongos

perfectos (Carrillo, 2003). En este caso los hongos pueden ser clasificados en el grupo

de Ascomycotina, como ha sido descrito por algunos autores al hacer referencia de la

clasificación taxonómica de Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, debido a que se

ha conocido en los últimos años sus estados sexual, conocidos de esta forma como

Cordyceps spp. (Ascomicete). No obstante esto, cabe destacar que en general y para

efectos prácticos, las formas no sexuales o anamorfas de los hongos son las que se

producen y cultivan en condiciones de medios de cultivo y de birreactor, por lo cual

resultaría funcional seguir describiéndolas como Deuteromycetos (Carrillo, 2003 ; Barnett

et al., 1998) .

28

Estos microorganismos típicamente forman un micelio bien desarrollado, septado y

ramificado, con los compartimentos o células multinucleadas; los septos en sus hifas

presentan un poro central que permite el paso de núcleos y organelos citoplasmáticos de

un compartimiento a otro. También son de gran importancia para el hombre ya sea por su

utilización en la industria, o como participantes de fenómenos biológicos y ecológicos

muy interesantes que suceden en el suelo, como saprófito o como patógenos de algunos

invertebrados (Herrera y Ulloa, 1990).

7. 7.1 Beauveria bassiana. Bassi, 1835 (Mehrotra et al., 1990):

El primer hongo descubierto y estudiado en detalle fue Beauveria bassiana en 1835 por

Agostino Bassi. Desde entonces las especies de este hongo, que es ubicuo en la

naturaleza, han sido usadas a gran escala para la producción de bioplaguicidas. El

genero esta compuesto por varias especies, entre ellas; B. bassina, B. brongniarttii, B.

velata, B. caledonica, B. densa, B. amorpha, B. vermiconia, B. alba. (Herrera y Ulloa,

1990). Se caracteriza por tener crecimiento moderado y simpodial, lento, por poseer

colonias de color blanco a canela, que con el tiempo pasan de algodonosa a

pulverulentas (Figura 3). Sus conidióforos están agrupados en forma apiñada o

verticilados, sus conidios son lisas e hialinas redondeadas a ovoides, de pared lisa, de 2

a 3 µm de diámetro, unicelulares que emergen en pequeños esterigmas. B. bassiana,

producen tres tipos de esporas que se diferencian por su morfología y tamaño: los

conidios aéreos o conidiosporas aéreas, blastosporas y conidiosporas sumergidas. Como

mecanismo de acción las esporas que contiene el hongo, llegan a invadir la superficie de

su huésped específicamente en la cutícula o exoesqueleto, para así formar un tubo

germinativo, el cual penetra e invade el interior del hospedero. Una vez dentro, el hongo

empieza a multiplicarse rápidamente de manera que su dispersión es por todo el cuerpo

(Herrera y Ulloa, 1990). Este hongo ataca diversas especies de insectos perteneciente a

las clases Lepidóptera y Coleóptera, al igual que algunos miembros de a clase Aracnida

como es el caso de los ácaros plaga (Figura 4).

29

Figura 3 . Crecimiento de B. bassiana en medio PDA, observación macroscópica y microscópica

(Svetlana, 2005).

Figura 4. Microscopía electrónica de los conidios de B. bassiana en el proceso de infección de Amblyomma americanum (Svetlana, 2005).

7.7.2. Metarhizium anisopliae. Metschnikoff, 1879 (Mehrotra et al., 1990):

Este hongo se caracteriza por ser patógeno obligado de insectos que frecuentemente es

aislado de éstos o del suelo, puede infectar alrededor de 200 especies de mas de 50

familias de insectos y artrópodos. Este hongo también puede adaptarse a la vida en la

rizósfera del suelo. M. anisopliae presenta un amplio espectro de acción y su capacidad

para crear epizootias bajo condiciones favorables hace de este microorganismo un

elemento muy eficaz y apreciado en el control fitosanitario y en el control de insectos

plaga (Torres, 1998). Existen varias especies del género Metarhizium, como M.

anisopliae, M. album, M.flavoviride, pero el más conocido en cuanto a su papel regulador

de poblaciones de insectos plaga es M. anisopliae. Como muchos otros hongos

entomopatógenos esta especie es un saprófito facultativo pudiéndose desarrollar en el

suelo o como parásito facultivo de algunos insectos. Cuando M. anisopliae atraviesa la

cutícula y entra a la hemolinfa del insecto, debe adaptarse a diferentes condiciones del

ambiente interno del hospedero, para ello hay la expresión de diferentes genes

involucrados en procesos metabólicos (metabolismo de carbohidratos), proteolisis y

30

síntesis de metabolitos tóxicos (Chengshu et al., 2005). Se caracteriza por hifas hialinas

y septadas, conidioforos cortos, las fialides pueden encontrarse solas, en pares o en

manojos, y de ellas se forman los conidios en cadena (Figura 5). Los conidios son ovales-

oblongos o cilíndricos unicelulares de 3,5 a 8µm de longitud y 1.5-2.5µm de ancho,

hialios o ligeramente pigmentados y con estomas carnosos (Kendrick, 1992). Su

crecimiento es blanco amarillento cuando joven pero conforme madura toma una

coloración verde oscura característico de la especie.

Figura 5. Características macroscopicas y microscopicas de una cepa madura de M. anisopliae. (Fotografia de Svetlana Gouli para la Universidad de Vermont, 2005). 7.8. TAXONOMÍA DE Beauveria bassiana (Bassi, 1837) Y Me tarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1879)

Clasificación taxonómica basada en el estado asexual (anamorfo) de los hongos

entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae. Clasificación según Barnett y Hunter

(1998).

Reino: Fungi

División: Mycota

Subdivisión: Eumycotina (Teleomorfo) Anamorfo: Ascomycotina

Clase: Deutoromycetes

Orden: Moniliales

Familia: Moniliaceae

Género: Metarhizium, Beauveria

Especie: anisopliae, bassiana

31

7.9. ANTECEDENTES DE LA UTILIZACIÓN DE Beauveria bassiana Y Metarhizium

anisopliae EN EL CONTROL BIOLÓGICO DE LA GARRAPATA Rhipicephalus

(Boophilus) microplus:

En el control biológico de garrapatas se conoce que por lo menos seis géneros de

hongos patógenos podrían jugar algún papel dentro de la aplicación de esquemas de

Manejo Integrado de Plagas (MIP); estos incluyen a los géneros Metarhizium, Beauveria,

Paecilomyces, Lecanicillium, Rhizopus y Fusarium sobre los que se han adelantado

investigaciones, con resultados experimentales promisorios, aunque falta bastante para

su validación y aplicación práctica.

Para el caso de América Latina, ya los grupos de investigación han abordado esta

temática, iniciándose la obtención de importante información que luego podrá ser puesta

en la práctica, al desarrollar formulaciones de hongos. En Brasil se evaluaron 12

aislamientos del hongo Metarhizium anisopliae (Frazzon et al., 2000), el aislamiento más

patógeno causó un 100% de mortalidad a una concentración de 107 conidios /ml; los

aislamientos a partir de garrapatas infectadas probaron ser más patógenos que los

cultivados en medio sintético. En Colombia se evaluó de forma comparativa 10

aislamientos de Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre

teleoginas de la garrapata B. microplus (Moreno et al., 2001); el mayor efecto sobre la

reproducción se obtuvo con el aislamiento Mt019 de M. anisopliae alcanzando un 87% de

inhibición a la concetración de 108 conidios/ml. En Cuba la creciente necesidad de

reducir el uso de agroquímicos para el control fitosanitario hizo necesario desarrollar

tecnologías y estudios, con el fin de obtener productos a partir de microorganismos,

insectos o nemátodos con calidad y en cantidades suficientes para su aplicación masiva

en las áreas de cultivos. Estos estudios fueron realizados con un producto formulado, con

ingrediente activo del hongo Lecanicillium lecanii en campo para el control de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus encontrándose una efectividad entre el 75 y 80%

del producto.

Otros estudios realizados por Alves y colaboradores (1993) y Fiorin (1993), demostraron

el efecto de Metarhizium anisopliae sobre teleoginas y huevos de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus, causando mortalidad y reducción significativa en la fecundidad y

en la incubación larval. Algunos estudios realizados en otros géneros de garrapatas han

demostrado una gran efectividad de estos hongos entomopatógenos. En ninfas y adultos

de Rhipicephalus appendiculatus (Kaaya et al., 1996), encontró que M. anisopliae indujo

una alta mortalidad de hembras encontradas en los oídos de ganado Cebú con respecto

a los resultados obtenidos para B. bassiana.

32

Estudios realizados por (Fiorin,1993), en ninfas y adultos de la especie de garrapata

Amblyomma americanum y Amblyomma maculatum con conidios y blastosporas de los

hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en condiciones

de laboratorio, demostraron a una concentración de 108 conidios/ml de los hongos, una

mortalidad mayor al 90% en garrapatas adultas del genero Amblyomma maculatum y del

10% en adultos de Amblyomma americanum con B. bassiana, y 60% y 10% de

mortalidad en A. maculatum y A. americanum con M. anisopliae, respectivamente. En

ninfas se encontró una mortalidad del 100% para A. maculatum y 35% A. americanum

con los dos hongos. La formación de micelio sobre la superficie de la cutícula de las

garrapatas fue observada en los dos hongos. Estos resultados no concuerdan con lo

encontrado por otros autores en Rhipicephalus (Boophilus) microplus, debido a que la

mayoría de éstos han reportado una mayor mortalidad de garrapatas con el hongo

Metarhizium anisopliae.

Un aspecto importante que se ha determinado mediante estudios realizados por (Kaaya

et al., 1995) es la alta compatibilidad que presentan B. bassiana y M. anisopliae con

insecticidas órganofosfatados, encontrándose que pueden mantener un crecimiento

normal sobre las orejas del ganado bañado con estos insecticidas de una a tres semanas

respectivamente. Por esta razón el control microbiológico es una buena estrategia para el

control de garrapatas. En otros países como EEUU se han realizado muchas

investigaciones sobre control biológico para otros géneros de garrapatas como

Amblyomma sp, debido a que las pérdidas en el sector ganadero son considerables ya

que presentan una alta incidencia de éste genero, a diferencia de esto, en nuestro país la

presencia de Rhipicephalus (Boophilus) microplus es muy alta, encontrándose en

algunas regiones una incidencia del 100% y en otras del 80%. Por esta razón este trabajo

de investigación esta enfocado en desarrollar una nueva alternativa para el control y la

regulación de poblaciones de Rhipicephalus (Boophilus) microplus y con ello disminuir las

pérdidas económicas ocasionadas por este género en nuestro país.

7.10. FORMULACIÓN DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS:

La producción de hongos entomopatógenos se basa en la multiplicación masiva del

hongo y sus estructuras reproductivas en un sustrato. La formulación del hongo es el

proceso mediante el cual el ingrediente activo, es decir los conidios del hongo, se

mezclan con materiales inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros

aditivos. Estos materiales inertes ayudan a que el hongo este más protegido al momento

de la aplicación, así mismo, evita que se sedimente fácilmente y/o que forme grumos que

33

tapen las boquillas de las bombas de fumigación, todo esto se hace con el fin de lograr

una buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder ser

manipuladas y aplicadas adecuadamente (Moreno, 2001). Hay dos tipos de

formulaciones; la primera es una formulación seca o polvo mojable en la cual se utiliza un

vehículo, el cual puede ser de origen mineral o vegetal, que ayuda a absorber la

humedad de los conidios y mantiene la viabilidad por un tiempo considerable, el segundo

tipo de formulación es líquida o emulsificable que utiliza un líquido solvente y un

emulsificante. El líquido utilizado tiene la función de mantener suspendidos los conidios

en el medio para lograr una mezcla homogénea que garantice una buena aplicación.

Además este líquido debe evitar la absorción de agua por los conidios y mantener su

viabilidad (Moreno, 2001).

La comercialización de insecticidas basados en hongos entomopatógenos requiere un

control de las propiedades biológicas, físicas y químicas. Para esto se realizan pruebas

microbiológicas como concentración de esporas, germinación de esporas y prueba de

pureza. Además de las pruebas físico-químicas de determinación de pH, porcentaje de

humedad, humectabilidad, suspensibilidad y taponamiento de boquillas, que aseguren al

usuario un producto con la máxima eficacia de control en el campo (Carrillo, 2003).

7. 11. INSECTICIDAS BIORRACIONALES:

En el tema de control de plagas pecuarias actualmente se maneja el término de

insecticidas biorracionales, los cuales son sustancias que se derivan de

microorganismos, plantas o minerales. También, pueden ser sustancias sintéticas

similares o idénticas a otras que se encuentran en la naturaleza. Estos insecticidas se

caracterizan por tener una toxicidad muy baja para los humanos y otros vertebrados, por

descomponerse en pocas horas después de aplicados y por ser específicos para las

plagas que deseamos controlar. Por estas razones son considerados ambientalmente

benignos. Su efecto en la vida silvestre y el medio ambiente es menos perjudicial que el

de los insecticidas convencionales (Samson y Rombach 1985). Los insecticidas

microbiales contienen como ingrediente activo bacterias, hongos, nematodos

protozoarios o virus. La mayoría de estos insecticidas son específicos para las plagas y

representan en general, muy poco riesgo para los humanos, las mascotas y la vida

silvestre. Tienen la desventaja de deteriorarse rápidamente con el calor, sequía y la

radiación ultravioleta, siendo muchas veces poco viables y efectivos en el momento de

controlar una plaga .En la actualidad existe un gran número de éstos insecticidas, entre

los cuales se manejan los hongos entomopatógenos para el control de ácaros plaga,

34

tanto en la parte agrícola como pecuaria, entre los cuales tenemos Beauveria bassiana y

Metarhizium anisopliae (Samson y Rombach 1985).

Estos son hongos del suelo que infectan y matan plagas como mosca blanca, afidos y

ácaros plaga. Cuando el bioinsecticida se aplica por aspersión, sus esporas se adhieren

a la superficie de los insectos o artrópodos y germinan formando un tubo germinativo.

Mediante procesos enzimáticos este tubo degrada la cubierta de los insectos y penetra

en el cuerpo. Una vez en el interior, el hongo prolifera y promueve la formación de toxinas

mortales para los insectos o artrópodos. En los insectos blandos como la mosca blanca y

algunos géneros de garrapatas, el efecto mecánico del tubo germinativo es suficiente

para matarlos entre 24 y 48 horas (Samson y Rombach 1985).

Los productos de Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae tienen una mayor

eficacia si se aplican tan pronto aparecen las primeras infestaciones de los insectos

porque las esporas tardan unos siete días en germinar, penetrar, crecer y matar los

insectos de cuerpo duro. Estos hongos no afectan a los humanos ni a otros vertebrados

ni causan gran impacto al medio ambiente, por esta razón hacen parte del grupo de los

insecticidas biorracionales, concepto que en la actualidad ha encontrado gran acogida.

Sin embargo, esta ultima afirmación fue puesta en duda por estudios realizados por

Genthner y Middaugh (1992), quienes realizaron un ensayo de toxicidad y teratogenicidad

para demostrar los efectos adversos causados por Beauveria bassiana sobre un

organismo no objetivo como lo son la especie de pescado (Menidia beryllina). Estos

estudios demostraron que los embriones expuestos a los conidios del hongo presentaron

ruptura de su cutícula y muerte en algunos de ellos, demostrando que los estados

juveniles son más sensibles al ataque de los hongos entomopatógenos. Encontrándose

diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos de embriones tratados

con las esporas y los no tratados. La ruptura del embrión no siempre resultó en la muerte

de éste, pero si se asocio la ruptura de los embriones a los procesos de adherencia,

seguido por la germinación y penetración del tubo germinativo.

Este nuevo concepto busca implementar nuevas alternativas de control de plagas

mediante la utilización de compuestos ambientalmente amigables, que regulen

poblaciones de insectos plaga y no de la fauna benéfica, buscando siempre mantener el

equilibrio ecológico.

35

8. GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Canestrini, 1887 (Rodriguez et

al., 2005)

8.1 GENERALIDADES

Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos principalmente de climas medios y

cálidos, prácticamente de todos los vertebrados terrestres, aves y algunos anfibios,

aunque son parásitos cosmopolitas, aunque numerosas especies están restringidas en

hábitats específicos (ICTTD ,2004; Hernández, 2003).

Se reconocen alrededor de 870 especies de garrapatas que se agrupan junto con los

ácaros en el orden Acarina. Las mismas poseen importancia médica- veterinaria debido

al daño directo que causan cuando se alimentan y a la transmisión de microorganismos

patógenos como protozoos, bacterias, rickettsias y virus, además de la extracción de

sangre al hospedador (1 a 5 ml) y la inoculación de sustancias tóxicas a sus huéspedes

(ICTTD , 2004).

El suborden Ixodida, al que pertenecen las garrapatas, se divide en tres familias: la

familia Ixodidae, con alrededor de 685 especies en el mundo, que se distingue por la

presencia de placas o escudos de quitina por lo cual se les conoce usualmente como

garrapatas “duras o acorazadas” y adicionalmente por sus características morfológicas

y/o epidemiológicas los ixódidos se subdividen en garrapatas de rostro corto o largo y en

garrapatas de uno, dos o tres huéspedes, además, existe un dimorfismo sexual marcado

(tamaño de los adultos) y los orificios respiratorios (estígmatos) se localizan posteriores al

cuarto par de patas. La familia Argasidae, cuenta con aproximadamente 185 especies en

el mundo, se identifican por no poseer engrosamientos cuticulares, por lo que se les

denomina comúnmente como garrapatas “blandas o coriáceas”; las cuales además de

encontrarse en mamíferos, los miembros de esta familia también se encuentran

parasitando aves, se caracterizan por un dimorfismo sexual poco marcado, por la

localización de los estígmatos entre la tercera y cuarta pata, las piezas bucales atrofiadas

en adultos y la ausencia de áreas porosas en las hembras. Por último, la familia

Nuttalliellidae, la cual posee características intermedias entre las familias Argasidae e

Ixodidae y está compuesta por una sola especie establecida en África (Nutalliella

namaqua) (Cordero y Rojo, 1999; ICTTD, 2004).

Dentro de la familia Ixodidae, las garrapatas se clasifican de acuerdo a dos conceptos

diferentes: Inicialmente por la longitud de los segmentos de los palpos, división donde se

encuentran las garrapatas de rostro largo, en las cuales el segundo segmento es más

36

largo que ancho y las de rostro corto en las cuales el segundo segmento es tan largo

como ancho, además, las garrapatas pertenecientes a esta familia, también se clasifican

en tres tipos de acuerdo con el número de animales que requieran para desarrollar su

ciclo de vida (Núñez et al., 1982).

Las garrapatas pueden ser clasificadas por la cantidad de huéspedes que utilizan para

completar su ciclo de vida, están las garrapatas de un solo huésped, comprenden

aquellas que pasan desde el estadio de larva a adulto sin cambiar de hospedero,

abandonándolo solamente cuando están llenas de sangre y desprendiéndose de él para

ovipositar en el suelo; de los huevos ovipositados, eclosionan las larvas que sufrirán una

muda sobre el animal parasitado, como Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Parra et al.,

1999).

Las garrapatas de dos huéspedes cumplen sus fases de larva y ninfa en un solo

hospedero y lo abandonan para mudar en el suelo, transformándose en adultas para

buscar un segundo hospedador y completar su ciclo de vida, como Rhipicephalus evertsi.

Finalmente, las garrapatas de tres huéspedes se caracterizan porque siendo larvas,

parasitan a un huésped, al que abandonan después de alimentarse de su sangre, se

dejan caer al suelo, donde mudan a ninfas y suben a parasitar a un segundo huésped, el

cual es nuevamente abandonado y en el suelo se transforman en adultos y vuelven a

parasitar a un tercer huésped, como Amblyomma cajennense (Parra et al., 1999).

El género de mayor importancia médica veterinaria es Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, reclasificado actualmente de esta forma, debido a recientes estudios

moleculares a nivel de ADN ribosomal subunidad 12S (Beati y Keirans, 2000)

encontrando relaciones filogenéticas entre los géneros Rhipicephalus y Boophilus,

específicamente, el género Boophilus pasó a ser un subgénero del género Rhipicephalus

(Murrell y Barker, 2004). Este género establece una interacción con el huésped, cuyas

consecuencias sobre los mecanismos vitales del mismo, son de mayor consideración,

tanto desde el punto de vista zoosanitario como del económico (Trapaga, 1989).

Dentro de los factores de relevancia en las explotaciones pecuarias con presencia de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus, se destaca una importante disminución en la

producción de carne y leche, así como un deterioro de las pieles a consecuencia de los

mecanismos de fijación de este artrópodo, por otro lado también se ha visto, que las

infestaciones ocasionan una disminución de las defensas inmunológicas, generando un

incremento en la presentación de otras enfermedades (Quiroz, 1994). De otra parte, las

garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus y Rhipicephalus (Boophilus) annulatus

37

son transmisores de graves enfermedades al bovino, como la Babesiosis y la

Anaplasmosis, formando un síndrome que incluye varios sistemas orgánicos (FAO,

2004).

El Instituto Agropecuario Colombiano ICA, estimó para Colombia pérdidas económicas

anuales causadas por Rhipicephalus (Boophilus) microplus; que para el año de 1999

correspondieron a $38.233 millones de pesos a causa de las garrapatas y de $6.660

millones de pesos debido a los hemoparásitos transmitidos por las mismas (Benavides et

al., 2000).

Todo lo anterior permite establecer las razones por las cuales la garrapata Rhipicephalus

(Boophilus) microplus es la principal causa de pérdidas a la ganadería nacional y

constituye una limitante crítica para la introducción de razas altamente especializadas, en

la producción de leche y carne. Por esta razón es muy importante para el país buscar

nuevas alternativas para su control, las cuales deben estar dentro de un manejo racional

e integrado de plagas.

8.2. TAXONOMÍA DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus) microplus

según Kessler y Moreira (1998):

Nivel Ubicac ión

Reino Animalia

Subreino Metazoarios

Phylum Arthropoda

Subphylum Chelicerata - Traqueata

Clase Arachnida

Subclase Acari

Orden Acarina - Parasitiformes

Suborden Ixodida - Metastigmata

Familia Ixodidae

Subfamilia Rhipicephalinae

Género Rhipicephalus

Subgénero Boophilus

Especie(s): microplus Canestrini, 1887.

annulatus, decoloratus, kohlsi y geigyi.

38

8.3. DISTRIBUCIÓN:

Las garrapatas se encuentran distribuidas en todo el mundo, sobre todo en las regiones

tropicales y subtropicales (Davey et al., 1997). En Oceanía, Europa, norte de Asia y

China, la garrapata Rhipicephalus appendiculatus es la más importante, mientras que en

América, Asia y África se reportan Rhipicephalus (Boophilus) microplus, Rhipicephalus

appendiculatus y Amblyomma hebraeum. Es así que de las 81 especies reportadas en

Estados Unidos, la más común en pequeños mamíferos corresponde a Dermacentor

variabilis (Klompen et al., 2000). Específicamente, el género Rhipicephalus (Boophilus)

presenta cinco especies a nivel mundial Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus, que se

encuentra distribuida en casi todo el continente Africano, excepto en las áreas secas y

tropicales lluviosas; Rhipicephalus (Boophilus) kohlsi localizada en los climas secos de

Jordania; Rhipicephalus (Boophilus) geigyi que se encuentra en el Oeste y Centro de

África; Rhipicephalus (Boophilus) annulatus que se encuentra en México y África y por

último, Rhipicephalus (Boophilus) microplus que se encuentra distribuida entre los

paralelos 32° norte y 35° sur encontrándose especia lmente en regiones tropicales de

América, África, Australia y Asia.

Figura 6. Distribución de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el cinturón tropical del mundo (Núñez et al., 1982; Kessler y Moreira, 1998).

En Colombia, las primeras referencias sobre garrapatas aparecen en descripciones de

las colecciones entomológicas de Osorno Mesa (1939), en estudios realizados en

bovinos de cuatro municipios del norte de Antioquia se identificó la especie Rhipicephalus

(Boophilus) microplus en el 100% de las muestras obtenidas. Resultados similares fueron

obtenidos por Callejas y colaboradores (1979), citados por López (1990). En Colombia

se reportó la existencia de 44 especies de la familia mostradas en la Tabla 2.

39

Tabla 2 . Especies de la familia Ixodidae encontradas en Colombia. Fuente: (Evans, 1978, citado por López, 1990).

GÉNERO NÚMERO

Ixodes 10

Amblyomma 28 Haemaphysalis 2 Dermacentor 2 Rhipicephalus 1

*Boophilus 1

TOTAL 44

Adicionalmente, Betancourt (1973) identificó 5.710 garrapatas colectadas de bovinos en

12 departamentos de Colombia. 95.34% de éstas eran Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, 2.69% Amblyomma cajennensis y 1.96% Dermacentor nitens. Piedrahita y

Restrepo (1974), estudiaron la fauna de garrapatas en el Valle de Aburrá (Antioquia) y

encontraron que 99.7% de los especímenes recuperados eran Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, 0.16% Dermacentor nitens y 0.12% Rhipicephalus sanguineus.

Estudios realizados por López (1989) colectaron 17.500 garrapatas de varias especies de

animales domésticos en el departamento de Antioquia e identificaron el 68.33% de éstas

como Rhipicephalus (Boophilus) microplus, 27.61% como Dermacentor nitens, 4.02%

como Rhipicephalus sanguineus, 0.03% como Amblyomma cajennense y 0.006% como

Amblyomma ovale. Encontraron Rhipicephalus (Boophilus) microplus casi exclu-

sivamente en bovinos y en algunas ocasiones también en ovejas y cabras. Dermacentor

nitens se halló principalmente en caballos, solo unas pocas en bovinos, Rhipicephalus

sanguineus en perros y Amblyomma cajennensis y A. ovale en caballos y perros.

En estudios realizados por Hernández (1980) se colectaron 15.809 garrapatas en 33

localidades diferentes del Tolima e identificaron 96.46% de éstas como Rhipicephalus

(Boophilus) microplus, 3.2% Dermacentor nitens y 0.36% como Amblyomma cajennense.

En estudios realizados en la población del Tolima (Flandes) 51.31% de las garrapatas

eran Dermacentor nitens y solo 48.6% Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Griffiths y

colaboradores (1982) examinaron los bovinos de 113 fincas lecheras de producción

intensiva, la mayoría de ellas localizadas en las mesetas libres de garrapatas.

Encontraron Rhipicephalus (Boophilus) microplus en 40 de ellas y Amblyomma

cajennense en ocho. Betancourt (1973) estudió la fauna de garrapatas de Córdoba y

40

áreas adyacentes de Sucre y Antioquia, dentro del marco de trabajo de una encuesta

general, organizada a través del Proyecto ICA/GTZ para la Intensificación del Control de

las Enfermedades Animales en Colombia. Las garrapatas colectadas durante la encuesta

(2.169) se identificaron como Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el 95.93% de los

casos, Amblyomma cajennense en el 3.93% y Dermacentor nitens en 0.13%.

Rhipicephalus (Boophilus) microplus predominaba en todas las fincas mientras

Amblyomma cajennense se encontró solamente en algunas áreas restringidas (Valencia,

Arboletes, Tolú Viejo) y alcanzó proporciones considerables en los sitios las Córdobas,

Canaletes y Monitos. Dermacentor nitens se halló únicamente en la vecindad de

Montería.

De acuerdo con una revisión hecha por Evans (1975) en Colombia, se reporta la

existencia de 45 especies de la familia Ixodidae discriminadas así: Ixodes 10 especies,

Amblvomma 28 especies, Haemaphvsalis 2 especies y una especie de Rhipicephalus

(Boophilus). De la familia Argasidae 14 especies de las cuales 12 corresponden al

género Ornithodoros, una especie del género Argas y 1 especie del género Antricola

(Tabla 3).

Tabla 3. Número de especies de garrapatas encontradas en Colombia, en Latinoamérica y en todo el mundo (Evans, 1975).

*12 Si se consideran Dermacentor/Anocentor géneros diferentes ++ Rodríguez P. Julio Mario reportó por primera vez en Colombia el género Otobius megnini (1984).

Familia Género Colombia

Lat América

Mundial

Ixodidae

Ixodes

12 48 250

Amblyomma 30 52 100

Dermacentor 1 11 31

(Anocentor) 1 1 1

Haemaphysalis 4 6 150

Rhipicephalus 1 2 63

*Boophilus 1 2 5

Argasidae Nothoasphis 0 1 -

Argas 4 7 50

Ornithodorus 13 34 94

Otobius 0 ++ 2 2

Antricola 1 4 4

TOTAL 11 (12)* 68 (9%) 170 (23%) 750 (100%)

41

De lo anterior se desprende que todavía existen en Colombia muchas especies sin

identificar y los proyectos de investigación que se deriven deben seguir una misma

metodología para lograr la obtención precisa de un mapa sobre la identificación y

distribución de especies de garrapatas tanto en animales domésticos como en silvestres.

Particularmente, de las cinco especies existentes de Rhipicephalus (Boophilus), han

existido registros de tres en Colombia; Rhipicephalus (Boophilus) microplus,

Rhipicephalus (Boophilus) annulatus y Rhipicephalus (Boophilus) decoloratus (Duehnen y

Otte, 1994).

En Colombia, se encuentra en determinadas regiones con ciertas altitudes, en el Valle del

Cauca se encontró bien establecida hasta los 2000 msnm, se consideró que una altitud

hasta 2500 msnm como marginal para el desarrollo de Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, pero también se observó en tierras bajas alrededor de 1000 y 1700 msnm

(Tabla 3) (Evans, 1978), siendo considerada como la de mayor importancia zoosanitaria

y económica, por los problemas que ocasiona en la ganadería bovina.

La significancía predominante de Rhipicephalus (Boophilus) microplus ha sido destacada

por muchos autores (Evans, 1978; Friedhoff y Hadani, 1980; Liebisch, 1984). Siendo

esto un gran punto de partida para fijar nuestra atención en la búsqueda de nuevas

alternativas para el control de éste genero de garrapata en el país.

8.4. MORFOLOGÍA:

Las garrapatas tienen morfología diferenciada entre familias, géneros y especies, pero

también entre las fases de su ciclo de vida; es decir, durante la fase larvaria presenta

tres pares de patas como los insectos, contrario a las fases de ninfa y adulta en las

cuales presentan cuatro pares de patas distinguiéndolas de esta forma de los insectos

(Liebisch, 1984). A su vez, el orden Acarina se encuentra dividido en tres familias, siendo

dos las más importantes; la familia Argasidae, también llamadas “garrapatas blandas” por

carecer de una lámina o escudo dorsal y resistir a la desecación y la Ixodidae o

“garrapatas duras” caracterizadas por tener un escudo dorsal y no poder sobrevivir por

largo tiempo sin un ambiente adecuado, adicionalmente, estas son de forma oval

aplanadas dorso - ventralmente en estado de ayuno y globosas cuando están pletóricas;

sus dimensiones van desde 1mm hasta los 15mm de longitud y con una variación en su

color de amarillo al café rojizo oscuro (Núñez et al., 1982).

42

La cutícula o sistema de protección de la garrapata esta constituida por tres capas; la

primera de ellas es la epicutícula compuesta de lípidos, sustancias de cemento,

cuticulina y polifenol que la protegen de la desecación, seguidamente la mesocutícula y

por último la endocutícula en la cual se encuentran poros, canales y espiráculos o

estígmatos. Asimismo, este sistema tiene la particularidad de sufrir elongaciones cuando

la garrapata esta pletórica (Wall y Shearer, 2001).

Las garrapatas pertenecientes a la familia Ixodidae se caracteriza por poseer un escudo

dorsal; este escudo es completo en el caso de los machos e incompleto en el caso de las

hembras, lo cual permite que el abdomen de las hembras pueda crecer y agrandarse lo

suficiente para contener hasta dos centímetros cúbicos de sangre. En todos los estados

evolutivos de esta familia se presenta un rostro terminal, con hipostoma grande y

dentado. Los palpos se insertan a los lados de las piezas bucales y están compuestos de

cuatro segmentos; el segundo segmento de los palpos sirve para diferenciar los distintos

géneros. En la parte media se encuentran un par de organos aplanados lateralmente con

unas pequeñas puntas o digitaciones; estos órganos se llaman quelíceros y sirven para

rasgar la piel del hospedero e introducir el hipostoma para alimentarse (Figura 7). Otra

estructura que se puede observar es el capitulo, formación recubierta de sustancia

quitinosa que permite a la garrapata proteger su sistema nervioso (Parra et al., 1999).En

la región dorsal de las garrapatas pertenecientes a este genero se encuentran un par de

ojos, que se localizan uno a cada lado del escudo, mas o menos entre el primer y

segundo par de patas; son de tipo simple, muy imperfectos y se cree que solo perciben

luz y movimiento. Presenta un dimorfismo sexual muy marcado, siendo la hembra de

tamaño mayor que el del macho. La familia Ixodidae presenta un órgano adhesivo

(ventosa) que le permite a la garrapatas caminar por todo el cuerpo del animal y

sostenerse sobre el éste; esta ventosa se llama curúncula, ambúlacro o pulvillum; por

ultimo se encuentran un par de uñas o garras que le permiten afianzarse mejor a

cualquier superficie (Parra et al., 1999).

43

Figura 7. Partes bucales de las garrapatas (Wall y Shearer, 2001).

Posteriormente, aparecen las extremidades o patas que constan de ocho artejos: coxa,

trocánter, fémur, patela, tibia, pretarso, tarso y postarso, adicionalmente un par de uñas y

una ventosa (Figura 8) (Wall y Shearer, 2001); Las larvas tienen en el tarso del primer par

de patas un órgano sensitivo llamado órgano de Haller, formado por una serie de pelillos

que detectan diferentes tipos de onda; esta recibe estímulos de tipo vibrátil o sea la

vibración que produce el ganado por el golpeteo sobre el suelo; otras cerdas o pelillos

que perciben olores ya que todo animal vertebrado emite una serie de gases u olores y

por último, otro tipo de pelillos o cerdas que perciben ondas de calor , pues todo animal

viviente emite una serie de ondas de calor, resultado de su circulación sanguínea y del

desprendimiento de energía de su cuerpo (Trujillo M, 1999).

Figura 8 . Vista dorsal de macho y hembra de Boophilus microplus respectivamente (Wall y Shearer, 2001).

44

Particularmente, la garrapata del género Rhipicephalus (Boophilus) microplus presenta

rostro corto, hipostoma dentado y una espina caudal en el dorso la cual puede

observarse desde el vientre característica de los machos denominado proceso o lóbulo

caudal; la primera coxa presenta dos espolones en forma de triángulo, el interno es más

ancho y largo que el externo, las coxas II y III presentan dos espolones de borde

redondeado y una escotadura profunda. Las placas adenales presentan en su borde

posterior una escotadura, donde se origina una espina hacia el borde interno, las placas

accesorias son agudas en su parte posterior y dejan visible el proceso caudal (Núñez et

al., 1982). Cabe resaltar que entre la hembra y el macho de este género existen

diferencias en la primera coxa, ya que en la hembra es casi es tan larga como ancha y

los espolones son redondos, por otra parte la IV coxa puede poseer un pequeño espolón

o carecer de él.

La morfología de Rhipicephalus (Boophilus) annulatus a diferencia de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus, dorso-ventralmente no presenta visible el lóbulo caudal. La coxa I

tiene dos espolones; el externo es menor y más agudo que el interno, y da lugar a una

escotadura poco profunda. Las coxas II, III y IV son rectangulares u ovales y carecen de

espolones y escotaduras. Por su parte, las placas adanales y accesorias no presentan

escotaduras y su extremo posterior es romo, finalmente, las hembras y los machos de

esta especie en ayuno, alojan el orificio genital a la altura de la II coxa (Bazán, 2002;

Cupp, 1991).

Otra característica del género Rhipicephalus (Boophilus) spp es el escudo, ya que en las

hembras es muy pequeño y tiene forma de lengüeta es decir es más largo que ancho

encontrándose los ojos en la parte más ancha del escudo; en los machos se extiende a lo

largo del cuerpo, sin patrón ornamental, liso, brillante y de color café rojizo (Núñez et al,

1982). Las placas estigmáticas o peritremos en ambos géneros son redondeadas

(microplus) y ovales (annulatus). Los machos de Rhipicephalus (Boophilus) annulatus

carecen de pedúnculo o proceso caudal (Núñez et al, 1982).

8.5. MECANISMOS DE SUPRESIÓN DE LA RESPUESTA INM UNE POR PARTE DE

Rhipicephalus (Boophilus) microplus:

Las garrapatas modulan la respuesta inmune del hospedero inhibiendo procesos

involucrados en la resistencia adquirida y la resistencia innata. La inmunosupresión

inducida por garrapatas no altera totalmente las defensas del hospedero ya que esto lo

haría más susceptible a otras infecciones y eventualmente privaría de alimento al

artrópodo. La inmunomodulación mediada por garrapatas facilita la alimentación sobre

45

un hospedero inmunocompetente por un período de tiempo prolongado (Preston y

Jongejan, 1997).

La vía alterna del complemento juega un papel importante en la resistencia adquirida ya

que activa mecanismos de defensa en ausencia de anticuerpos. En el caso de las

garrapatas del género Ixodes spp en su saliva genera componentes que inhiben la unión

a sitios de activación de las fracciones C3b y C5b por lo que no se produce la

anafilotoxina C3a y contiene un inhibidor de la hidrólisis de C3 (Preston y Jongejan,

1997). Mediante una enzima similar a una carboxipeptidasa – N se inhibe la anafilotoxina

ya generada. Este proceso inhibe la generación de quimioatrayentes y moléculas

biológicamente activas involucradas en la inflamación e inmunidad (Wikel y Bergman,

1997).

La supresión de N y K (Tabla 4) por la saliva de las garrapatas induce una baja en la

inducción de la respuesta Th1 que es básica en las respuestas de hipersensibilidad tardía

por lo que se presenta una supresión de la respuesta pro inflamatoria favoreciendo la

alimentación de las garrapatas (Preston y Jongejan, 1997).

Tabla 4. Interacción respuesta hospedero-garrapata (Preston y Jongejan, 1997).

Componente del sistema inmune del hospedero

Mecanismos de la garrapata contra la respuesta del hospedero

Complemento Vía clásica y alternativa

Células N K Citotoxicidad a tumores y a células infectadas con virus

Macrófagos Producción de citokinas pro – inflamatoria/inmunoreguladora IL – 1 y TNF - ϑ

Células T Proliferación Producción de citokinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-6

Anticuerpos Producción de anticuerpos homocitotrópicos y circulantes

Inhibición de anafilatoxinas y deposición de C3b / C5B Reducción en la habilidad para destruir células tumorales in vitro Reducción en la elaboración de de IL-1 y TNF -ϑ Inhibición de la proliferación mitógeno – inducida. Regulación negativa de mRNA o elaboración de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 y IFN -Λ Supresión de respuesta de anticuerpos a la inmunización con inmunógenos heterólogos.

46

La producción disminuida de Ac (anticuerpos) favorece que la garrapata pueda obtener

alimento. Se ha observado en conejos y cobayos que hay disminución de los títulos de

Ac frente a Ags (antigenos) y que los niveles normales se recuperan después de eliminar

las garrapatas. Ademas estas garrapatas contienen en su saliva anticoagulantes que

ayudan a facilitar su alimentación.

La función de las células T se altera. Son importantes células reguladoras y efectoras por

lo que son un blanco para la inmunosupresión mediada por garrapatas. Las respuestas

proliferativas de estas células se alteran en animales infestados, sin embargo la

proliferación de células B es normal. La supresión de las células T se hace menos

intensa con infestaciones repetidas. La linfoproliferación de linfocitos de sangre periférica

se disminuye en animales con garrapatas (Preston y Jongejan, 1997).

8.6. CICLO DE VIDA DE LOS IXÓDIDOS

El ciclo de vida de las garrapatas (Figura 9) puede considerarse en dos fases: la fase

parasítica durante la cual la garrapata se nutre del animal y la fase no parasitaria o no

parasítica en la que la garrapata esta en el suelo (Parra et al., 1999) (Tabla 5). En la fase

parasítica, las larvas de la garrapata infestan al hospedero, generalmente se fijan de

inmediato y comienzan a alimentarse. Sin embargo, los dos primeros días después de la

infestación, las larvas se alimentan de manera intermitente y frecuentemente se

desprenden y se mueven de un lugar a otro en el animal; después de cinco a seis días,

ingieren una cantidad de sangre y fluidos de los tejidos y luego mudan a ninfas de ocho

patas. Las ninfas también se nutren de la sangre del animal y de seis a siete días

posteriores se transforman en adultos jóvenes.

Tabla 5 . Duración de la fase en el ciclo de vida parasitaria de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini, 1887) (González, J.C 1974, citado por Mateus, 1980)

FASE ETAPA PRIMER DIA ÚLTIMO DIA MODA (DIAS)

LARVA 01 03 - LARVA

METALARVA 04 07 04

NINFA 05 13 08 NINFA

METANINFA 09 16 11

MACHO NEANDRO 12 15

GONANDRO 15 39

HEMBRA NEOGINA 13 20

PARTENOGINA 16 34

ADULTO

TELEOGINA 18 35

47

Figura 9 . Ciclo de vida de las garrapatas duras (González, J.C 1974, citado por Mateus 1980).

La fase parasítica termina entre 8 y 12 días después de la transformación ninfal, y por lo

tanto, esta fase dura en total de 19 a 26 días. Las hembras ya llenas, se desprenden y

caen del hospedero. Los machos pueden permanecer en el animal o caer junto con la

hembra.

La fase no parasítica es un período de vida libre que comprende cuatro etapas: la

preoviposición, la oviposición, la incubación y el período de supervivencia de las larvas

sobre el pasto. Esta fase comienza cuando la hembra que ha sido fecundada, se llena de

sangre, separa sus piezas bucales y se deja caer al suelo, donde buscara un lugar

protegido del sol y del viento; la duración de la postura de los huevos depende de la

temperatura y puede variar de 2 a 44 días, cada garrapata hembra puede colocar hasta

3.500 huevos (Parra et al., 1999).

Cuando la temperatura y la humedad sean optimas, ocurrirá la eclosión de los huevos

aproximadamente de 18 a 21 días. Al bajarse la temperatura ambiental, también tiende a

bajarse el porcentaje de eclosión de los huevos. Las larvas eclosionan de los huevos con

48

seis patas y son muy activas en responder al movimiento de un animal que pase cerca y

estimule su subida a la parte alta del pasto facilitando así su adhesión al hospedero. La

longevidad de estas varía de 21 a 240 días (Parra et al., 1999).

Adicionalmente, las garrapatas sufren una serie de transformaciones durante el período

parasitario sobre el animal, pasando de larva a metalarva, a ninfa, a metaninfa y en el

caso de los machos a neandros y gonandros (Tabla 5). En caso de las hembras las

metaninfas se transforman en neoginas, partenoginas y teleoginas. El período parasitario

comienza con una larva infestante y termina en un gonandro (machos) o una teleogina

(hembras) que cae al suelo para iniciar el período de vida libre. Los machos pueden

permanecer sobre los bovinos durante períodos de hasta 90 días en el mismo lugar, su

comportamiento de movilidad es nulo (Núñez et al., 1982; Alvarado et al., 1979).

En Colombia, se estableció según Benavides (1984) bajo condiciones de los Llanos

Orientales la biología de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, con una fase no parasítica

o fase conocida como período Adulto – Larva que va desde teleogina a nueva

generación de larvas, con un tiempo promedio de 26 a 38 días permitiendo el desarrollo

de 5.7 generaciones al año; a su vez subdividido en:

• Período de preoviposición: teleogina en el piso sin colocar huevos, de 2 a 6 días.

• Período de oviposición: teleogina en el piso colocando sus huevos. 2056 huevos

promedio por teleogina, de 7 a 12 días.

• Período de incubación: huevos en incubación hasta la eclosión de las larvas, de

21 a 28 días.

• Período de supervivencia larvaria: eclosión de las larvas hasta que encuentran un

hospedero susceptible. Muy variable y puede llegar hasta 6 meses.

Para continuar con una fase parasítica, sobre el bovino susceptible, de 20 a 22 días. Con

una fase de Larva: de cinco a seis días. Viene la primera muda pasando a la fase de

Ninfa: de siete días para finalmente la segunda muda y convertirse en Adultos: de cinco

a ocho días.

49

8.7. HÁBITOS Y ECOLOGÍA:

Las garrapatas en general pueden vivir desde el nivel del mar hasta los 2600 msnm y con

fluctuaciones de lluvia de 400 a 2800 mm anuales (Lima et al., 2000). Pueden sobrevivir

en condiciones adversas, pero la falta de humedad atmosférica puede disminuir o romper

el ciclo de vida de las Ixodidae. En general prefieren alta humedad y temperaturas de los

20°C, ya que se reporta que las larvas de Rhipicephalus (Boophilus) spp sobreviven

hasta 43 días con 20°C y 4% de humedad relativa; se presentan efectos negativos

cuando la humedad es menor de 63%. Normalmente las larvas suben a las plantas de los

pastizales para facilitar el acceso a los hospederos moviéndose horizontalmente debido a

que sus órganos sensoriales perciben el dióxido de carbono y las feromonas de los

animales hospederos hacia los cuales se desplazan para infestar (Hugh Jones, 1991).

Las secreciones de sus glándulas salivales son importantes en la transmisión de agentes

infecciosos de varios tipos de patógenos, estas secreciones ingresan a los fluidos de los

tejidos del hospedero, donde se provoca la eliminación de agua y electrolitos. El agente

infeccioso se encuentra en la saliva de la garrapata y se inocula en el hospedero después

de la fijación en la piel (Bazán, 2002).

Una vez la hembra (teleogina) completa el ciclo, coloca los huevos en sitios húmedos,

frescos y libres de la radiación solar, de preferencia en la parte baja de la vegetación

asegurando así una eclosión alta, al emerger las larvas, estas se protegen de la

desecación del sol incluso bajo el suelo y durante las horas más frescas del día

ascienden a la vegetación con el fin de buscar un hospedero para alimentarse (Bernard,

1989).

La temperatura disminuye el umbral de postura de los huevos en un rango inferior de

15°C y superior de 37°C; La supervivencia de las he mbras en ayuno depende de la

temperatura del ambiente y la edad fisiológica de las mismas. Las garrapatas adultas son

más susceptibles a las altas temperaturas que las garrapatas jóvenes debido a que su

cutícula es más permeable, adicionalmente, la temperatura modula el índice del estado

de letargo y de los cambios de muda (Bernard, 1989).

Las condiciones ambientales son importantes ya que si no existe una adecuada

temperatura y humedad relativa se retrasa la postura y desarrollo de los huevos y larvas

de la garrapata, en condiciones extremas éstas pueden deshidratarse. La altura del

50

pasto, el tipo de pastura (Melinis minutiflora) y la resistencia de cada animal son también

parámetros fundamentales en el desarrollo de las garrapatas (Bazán, 2002).

Las épocas secas se constituyen en los períodos con mayores problemas de garrapatas

en los animales. Existen diferentes estudios realizados en el país sobre la dinámica de la

población de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en bovinos, los cuales

revelan mayores poblaciones de tales parásitos o mayor número de animales infestados

en época seca, o en la transición verano a lluvias (Evans, 1978; Betancourt, 1984).

Varios de estos autores atribuyen mayores poblaciones de garrapatas en verano a la baja

en las defensas y por la pobre alimentación de los animales en esta época del año

(Duehnen y Otte, 1994). No obstante, existen reportes como el de Aycardi (1984), que

evidencian mayores poblaciones de garrapatas sobre los bovinos, en época lluviosa en la

altillanura (Betancourt, 1993).

Uno de los fenómenos que tiene una particular significancia en los estudios de la fase no

parásita de garrapatas es la sobrevivencia larval, ya que contribuye a la determinación

del encuentro de hospederos y su conocimiento es importante para el desarrollo de

programas de control basados en la rotación de pastos (Trapaga, 1989). El control de la

fase no parasítica o de vida libre de las garrapatas, sería fundamental para afectar la tasa

de dispersión de esta plaga entre el ganado y en los potreros. Si bien, los costos iniciales

de una estrategia de control de las formas no parasíticas en los potreros pueden ser

elevados, es muy probable que la relación beneficio/costo sea para los ganaderos en el

mediano y largo plazo.

En estudios realizados sobre el tema se ha observado que en los meses húmedos se

presenta una longevidad más prolongada que en los meses secos, registrándose una

duración desde 22 días, hasta ocho meses; este período también puede ser afectado por

otros factores climáticos, al respecto, investigadores australianos, observaron una media

de sobrevivencia larval de sólo una semana cuando las temperaturas máximas del aire

estuvieron alrededor de 40° C y de 3 a 4 semanas cu ando las temperaturas estuvieron

por debajo de 25° C (Núñez et al., 1982).

8.8. HUÉSPEDES:

La localización de las garrapatas sobre el huésped depende específicamente del género;

así por ejemplo, existen géneros como Amblyomma spp. que afectan varios tipos de

hospederos como bovinos, perros, venados, pájaros y humanos (Lavender et al., 1996);

51

las garrapatas del género Ixodes prefieren humanos, perros, caballos, venados,

pequeños mamíferos, ratones y aves, finalmente, las del género Rhipicephalus

(Boophilus) microplus, las cuales afectan específicamente un solo hospedero, en este

caso el ganado bovino o vacuno, en el cual, se distribuye por todo el animal haciéndose

más notoria la infestación en las orejas, tablas del cuello, región pectoral, axilas, ubre,

escroto, región inguinal, base de la cola y la región perineal (Figura 10); en estos sitios

se encuentra en todos sus estadios parasitarios(Jittapalapong et al., 2000).

Existen varios géneros de garrapatas que afectan diversos hospederos (Spickett, 1995;

Gómez et al., 1994); sin embargo, en el caso de Rhipicephalus (Boophilus) microplus al

no encontrar el hospedero específico, puede afectar a otras especies diferentes a las

acostumbradas (Friedhoff, 1990). Normalmente afectan el ganado bovino y a los

venados, pero también puede encontrarse afectando otras especies animales como:

humanos, perros, gatos, ratones y pájaros entre otros (Pereira et al., 2000).

Figura 10 . Infestaciones de bovinos con Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Sutherst, 1989).

8.9. IMPORTANCIA SANITARIA:

Muchos trastornos y enfermedades del hombre y de los animales se pueden atribuir a las

garrapatas; entre éstas se encuentran:

- La dermatosis, inflamación, prurito, edema, ulceración en el sitio de la picadura y las

lesiones de la piel como resultado de la extracción inadecuada o parcial de las partes

bucales de la garrapata.

- La exsanguinación, una condición grave en la que un animal altamente infestado

desarrolla una condición anémica.

52

- La otoacariosis, o sea la infestación en el conducto auditivo por garrapatas con posibles

infecciónes secundarias graves.

- Las infecciones transmitidas por garrapatas, incluyendo piroplasmosis o Babesiosis (por

ejemplo la Fiebre de Texas), la Rickettsiosis (por ejemplo, la Fiebre Manchada de las

Montañas Rocosas), los virus, (por ejemplo, la Fiebre del Colorado), las espiroquetosis

(por ejemplo, la Fiebre Recurrente transmitida por garrapatas), las bacteriosis (por

ejemplo, la diseminación de la Tularemia por garrapatas.) La transmisión de una filaria y

el aislamiento de un piroplasma de las garrapatas, las cuales afectan a roedores, también

se presentan, pero parecen ser excepcionales.

Las garrapatas son parásitos de animales silvestres en la naturaleza. Parasitan al hombre

y a sus mamíferos domésticos al azar, aunque estos últimos pueden ser fuertemente

afectados debido a las condiciones creadas por el hombre (Harwood et al., 1987).

Las pérdidas producidas por la garrapata tropical del ganado se deben principalmente a

la acción expoliatriz, irritativa y tóxica de la misma, adicionalmente, actúan como

transmisores mecánicos y biológicos de numerosos organismos patógenos (Jones et al.,

1972; Trapaga, 1989), los cuales son transmisores de enfermedades entre las que se

encuentran la Babesiosis y Anaplasmosis; particularmente, se ha descrito la infección

transovárica en Anaplasma marginale, pero parece que el principal mecanismo de

transmisión es la infección transestadial. El vector principal es el género Rhipicephalus

(Boophilus) y la especie microplus.

La garrapata se alimenta con la sangre del bovino a través de la herida que hacen en la

piel, por un período que va de 19 a 22 días aproximadamente, dependiendo de la zona

ecológica en particular. Durante este lapso el volumen de sangre ingerido puede alcanzar

3 ml a 5 ml. por espécimen de cada generación; 166 ml. en infestaciones medianas o

intensas al día y de 40 a 60 lts de sangre por animal extraídos al año. Si se considera el

porcentaje de animales infestados, el número de garrapatas por animal y el número de

generaciones del parásito en el curso del año, es fácil determinar el volumen de sangre

extraída (Springell, 1974; FAO, 1984).

Este efecto se ve incrementado por la acción tóxica de cierta fracción proteica presente

en la saliva de la garrapata, que al ser introducida al bovino durante el proceso de

alimentación altera el comportamiento bioquímico del hepatocito, ocasionando un

53

desequilibrio en el metabolismo y consecuentemente, en el estado nutricional del

hospedero (FAO, 1984).

Así mismo, las infestaciones medias y altas de garrapatas tienen un efecto negativo en la

respuesta inmunológica y posiblemente en su especificidad, lo cual se debe seguramente

a los estados anoréxicos ocasionados y a la subnutrición concomitante, debido a que

cada garrapata al finalizar su ciclo, afectaría en un 35 % por la pérdida de sangre y en un

65 % por disminución del apetito (Radostits et al., 2002).

Las garrapatas afectan también la esfera reproductiva de sus hospederos, ya que los

niveles de progesterona en las vacas parasitadas se encuentran disminuidos, debido a la

depresión del factor liberador de las gonadotropinas hipofisiarias y en la síntesis hepática

de la globulina transportadora de progesterona, lo cual se traduce en alteraciones del

ciclo estral y a pobres índices de reproducción. (López, 1990; Fortes, 1997).

También el metabolismo de los lípidos se ve alterado debido a la presencia de enzimas

lipolíticas en la saliva de la garrapata (Fortes, 1997). Además, debe considerarse que las

garrapatas son responsables de heridas en la piel cuyo proceso de cicatrización

generalmente se ve alterado por infecciones por gérmenes piógenos y que así mismo,

son sitios de predilección para que la mosca del gusano barrenador del ganado

(Cochliomyia hominivorax) (Nuche), deposite sus huevos y ocasione una infestación

cuyas consecuencias son bien conocidas (FAO 2004; Quiroz, 1994).

8.10. CONTROL INTEGRADO DE GARRAPATAS:

Las pérdidas económicas ocasionadas por los artrópodos y los perjuicios que ocasionan

en las diferentes explotaciones y en la salud humana y animal, hacen necesaria la

búsqueda permanente de medidas eficientes de control (López, 1996). Sin embargo, el

problema de infestación por garrapatas en el país, obedece a un esquema tradicional,

desordenado y antieconómico, que no consulta la información generada en Colombia

sobre el tema.

El incremento constante de los precios de los acaricidas y el peligro de la aparición de

resistencia a estos productos en poblaciones de parásitos expuestos a una presión

selectiva constante, indican la necesidad de reducir la dependencia de estos químicos

para su control (Wharton, 1976). Ante estas consideraciones, se torna urgente la

necesidad de disponer de medidas efectivas para disminuir las pérdidas económicas

54

producidas por garrapatas y hemoparásitos, por lo cual es una estrategia que ha

despertado altas expectativas es la utilización de modelos de “Manejo Integrado de

Plagas” (MIP) (control químico, control cultural, control biológico y microbiano, manejo de

resistencia y vacunación), lo que implica el uso conjunto de diferentes métodos de

control, integrados de tal manera que los costos de cada uno sean reducidos y que la

combinación de ellos produzca un mejor resultado que su uso por separado (Parra et al.,

1999).

Este concepto de MIP fue desarrollado inicialmente para el control de plagas de cultivos

agrícolas, sin embargo, paulatinamente se ha venido adaptando para los parásitos del

ganado. De acuerdo con la FAO, el concepto de MIP es la combinación de diferentes

medios de control de manera que se reduzcan efectivamente las poblaciones parasitarias

y se minimice el desarrollo de resistencia parasitaria, este concepto es aplicable en el

control de una especie de parásito, en el control de dos o más especies de parásitos que

coexisten en el huésped y el control de una o más especies de parásitos, integrando los

aspectos socioeconómicos de las prácticas de manejo y particularidades del sistema de

producción (Benavides et al., 2000).

La aplicación del esquema MIP requiere de un adecuado conocimiento de la biología y la

dinámica poblacional de la especie blanco, tanto en sus fases parasíticas como en las de

vida libre, adicionalmente, también es importante conocer si existe resistencia a los

productos utilizados para el control y el grado de extensión de este fenómeno (Walker et

al., 1988).

8.10.1. CONTROL QUÍMICO:

Los garrapaticidas químicos han sido hasta el momento la estrategia de control de

garrapatas utilizada en la gran mayoría de los casos, casi única para controlar artrópodos

de importancia económica. Estos compuestos químicos son solo una alternativa para

disminuir las poblaciones y están disponibles en el mercado en una gran variedad de

presentaciones para aplicación por aspersión, inmersión, dorsal sobre el lomo , parenteral

(endectocidas) y tópica (aretes, implantes, etc.) y su formulación difiere tanto en su

composición como en el ingrediente químico activo (López et al., 1996).

El control químico de garrapatas mediante la utilización de productos acaricidas-

garrapaticidas, supone una correcta manipulación, y preparación de la solución

garrapaticida, para evitar posibles fenómenos de resistencia por parte del ectoparásito.

55

La condición innata de las garrapatas a desarrollar resistencia a los acaricidas se debe al

uso indiscriminado de éstos, ha ocasionado la aparición de cepas resistentes de

garrapatas a estos químicos. Casos comprobados de resistencia en garrapatas a los

acaricidas se han reportado en Brasil, Venezuela, Colombia, por citar sólo algunos

(Herrera y Romero, 1995).

Adicionalmente, se han descubierto otras desventajas diferentes a la generación de

resistencia por parte de las garrapatas, como el rápido incremento de los costos, la

contaminación ambiental, especialmente de las fuentes de agua por el mal manejo de los

productos y la contaminación residual de la carne y la leche (López et al., 1996).

Los principales compuestos acaricidas utilizados por muchos años en nuestro país son

los clorinados (Ej. Hexacloruro de benceno, heptacloro, clordano etc.), los cuales son

compuestos estimulantes del sistema nervioso central produciendo manifestaciones

neuromusculares. Los compuestos organofosforados (Ej. Dimetoato, malation, paration,

tiofós, triclorfón etc.), utilizados para el control de garrapatas, se caracterizan por tener la

habilidad para inhibir la actividad de la colinesterasa, produciendo un exceso de estimulo

colinérgico de tipo muscarínico, nicotínico y central. Los carbamatos (Ej. Carbofurán,

metonilo etc.), actúan de forma similar a los organofosforados, inhibiendo la

colinesterasa.Los piretroides, actúan sobre el ácaro provocando un bloqueo de toda

actividad motriz o bien por la producción de excitabilidad, parálisis, letargo y muerte. Los

compuestos del grupo de las formamidinas, este grupo de compuestos acaricidas por

inhibición de la monoaminooxidasa causando la muerte del ectoparásito, siendo la

sustancia más reconocida el Amitraz. Una nueva alternativa que se ha desarrollado para

disminuir la aparición de resistencia por las garrapatas, es la utilización de ecdisonas

(inhibidores de crecimiento), cuya acción principal es la inhibición de la formación de

quitina, impidiendo la muda (Lopez et al., 1996).

Dentro de los mecanismos de control químico más utilizados, se encuentran:

8.10.1.1. Placas en orejas:

Consisten en placas impregnadas de un acaricida o un insecticida sistémico que son

colocadas en las orejas de los bovinos, con el fin de controlar garrapatas y dípteros. El

sistema puede funcionar bien para Amblyomma maculatum, localizada en las orejas,

pero no para especies que se adhieren en otros sitios del animal, como Rhipicephalus

(Boophilus) microplus (Betancourt, 1980).

56

8.10.1.2. Acaricidas sistémicos generales:

Se afirma que varios acaricidas sistémicos han controlado las garrapatas, al ser

administrados en forma oral diariamente. El sistema se puede mejorar si se combina con

un sistema de liberación lenta. El producto también puede ser inyectado en forma de

microcápsulas. El desarrollo de las Ivermectinas es un ejemplo, las cuales podrían

administrarse en dosis muy pequeñas (20-50 microgramos/ Kg/día) vía oral o mediante

implantación para la liberación lenta (Betancourt, 1980).

8.10.1.3. Feromonas:

La concentración de grandes poblaciones de garrapatas (larvas) en las hojas de los

pastos y en el animal (orejas, periné, etc) parece estar regulada por hormonas de tipo

sexual y feromonas sexuales y de agregación. Estos compuestos se obtienen lavando las

garrapatas con solventes orgánicos especiales. Los productos garrapaticidas a base de

feromonas, son la combinación de estas con acaricidas, que al ser aplicados en una zona

anatomica del bovino, las garrapatas son atraídas a la zona de aplicación donde mueren

por el efecto acaricida. El uso de feromonas, potencialmente ofrece ventajas, ya que

permitiría concentrar grandes poblaciones de garrapatas en un solo sitio del animal, lo

cual no solo facilita el tratamiento acaricida, sino que aumenta su efectividad y reduce

considerablemente su costo (Betancourt, 1980).

8.10.1.4. Baños de inmersión:

Este es uno de los principales métodos conocidos para el control de garrapatas, ya que

con este se logra completo mojado de toda la superficie corporal del bovino, haciendo

posible el contacto del compuesto con todos los estadios presentes en el huésped,

además de la rapidez en su ejecución, especialmente en ganaderías con alto número de

animales (Núñez et al., 1982). Sin embargo este método presenta algunas desventajas

como la exigencia de grandes volúmenes de agua para la preparación del baño y las

dificultades para mantener una correcta concentración de ixodicida, debido a la

evaporación del agua en períodos de intenso calor o por la contaminación provocada por

el paso de animales, pero la mayor dificultad se presenta en el vaciado del tanque, sin

contaminar las aguas y la fauna, lo que produce un grave deterioro de los recursos

naturales (López, 1992).

57

8.10.1.5. Baños de aspersión:

Este método es ampliamente difundido por las ventajas que ofrece al permitir el

conocimiento exacto de la concentración del producto y la utilización de un baño limpio y

recientemente preparado. Es un sistema económico, ya que solo se requiere una

cantidad determinada del producto acaricida para realizar el baño, permite además,

aplicar diferentes tipos de ixodicidas, dependiendo de la época del año o seguir una

estrategia de alternancia de productos, no requiere excesiva cantidad de agua y hay

menos predisposición de traumatismos de los animales, especialmente en los de leche

(Núñez et al., 1982). Sin embargo. A pesar de las ventajas existentes, este sistema

presenta también notorias desventajas ya que no siempre el mojado resulta completo y el

tiempo de exposición es menor, adicionalmente, se presenta con frecuencia la

obstrucción de las boquillas (López, 1992).

Para la aplicación de estos compuestos acaricidas, es importante conocer en que épocas

del año las garrapatas son más numerosas; en Colombia, las investigaciones han

demostrado que la época crítica para realizar estas aplicaciones es el período seco,

comprendido entre los meses de enero y abril. Cuando se inicia el esquema tres o cuatro

semanas luego de finalizar la temporada de lluvias, generalmente cuatro a seis baños,

correctamente aplicados cada 21 días a todo el ganado, son suficientes para obtener

una reducción poblacional durante el resto de año. Este esquema es particularmente

favorable en las zonas del trópico seco y húmedo del país (Costa Atlántica y Llanos

Orientales) iniciando el esquema en el mes de enero (Walker et al., 1988; Benavides et

al., 2000).

8.10.2. CONTROL CULTURAL:

8.10.2.1. Rotación de praderas:

Esta estrategia se basa en la rotación de las praderas hasta que la mayoría de las larvas

que se encuentra en fase libre mueran al no encontrar hospedero. Consiste,

básicamente, en la eliminación por inanición de una parte de la población de garrapatas,

especialmente de las larvas, debido a la ausencia del hospedador (Bazán, 2002).

Para la utilización de esta práctica es necesario conocer en cada zona, el período de

sobrevivencia de las larvas en las pasturas para así establecer el tiempo de descanso de

las mismas. En algunas zonas de Colombia por ejemplo, en épocas cálidas y secas, las

larvas sólo pueden sobrevivir sobre las hojas de los pastos entre cuatro y seis semanas.

58

Si una pradera se deja libre de ganado durante este período y se tratan los animales

antes de su reintegro a la pradera, se reducirá la necesidad de tratamiento (Herrera y

Romero, 1995).

Estudios realizados en la época de verano en Australia, demostraron que la

sobrevivencia de las larvas de Riphicephalus (Boophilus) microplus fue de 50% durante

las dos primeras semanas de edad y solo de 10% durante la cuarta semana de edad. La

sobrevivencia de los estadios de la garrapata y en especial de las larvas, además de los

factores microclimáticos antes mencionados se ven afectados también por el tipo de

vegetación o pastura (González, 1996).

En Colombia se ha obtenido un promedio de tiempo de sobrevivencia de larvas de

Riphicephalus (Boophilus) microplus de cuatro a seis semanas durante la época de

verano o sequía. Esto significa que mientras más tiempo de descanso se le de a los

potreros mayor será la mortalidad de larvas y en consecuencia menor será el número de

larvas disponibles dentro de la población de garrapatas a parasitar a los bovinos

(González, 1996).

8.10.2.2. Quema dirigida de potreros:

La práctica de quemar los potreros esta ampliamente difundida en las diversas regiones

de producción ganadera de América tropical. La quema de potreros tiene efectos

directos sobre el microclima y hábitat de las garrapatas debido al aumento de la

temperatura y al cambio de la composición vegetal. La disminución de la viabilidad de los

huevos o la elevación de la mortalidad de sus diversos estadíos evolutivos,

especialmente las larvas, disminuye la población de las garrapatas en el potrero. Sin

embargo, debido a los riesgos y efectos secundarios de la quema de potreros, es

recomendable efectuarla de una forma supervisada por personal técnico capacitado

(López, 1996). Adicionalmente, al pasar el efecto de las quemas, las garrapatas aparecen

nuevamente transportadas por animales silvestres, por lo que se concluye que este

sistema no es efectivo en la eliminación de las garrapatas (Betancourt et al., 1992).

8.10.2.3. Inundación de potreros:

Este tipo de control lleva a modificar el hábitat de las garrapatas debido a la condición

de humedad extrema durante cierto período de tiempo que se produce por efecto de la

inundación del potrero. Las hembras ingurgitadas (teleoginas) de Riphicephalus

59

(Boophilus) microplus pueden sobrevivir máximo dos días sumergidas en agua, con el

agravante de que la mortalidad con dos días de inmersión es más elevada y que la

oviposición de estas teleoginas también es menor con dos días sumergidas en agua. Sin

embargo, los huevos pueden sobrevivir y ser viables aún después de haber permanecido

sumergidos en agua hasta por seis días. En el caso de las larvas, el efecto de la

inundación de potreros no es realmente significativo debido a la habilidad de

sobrevivencia de estos estadíos evolutivos sobre las hojas de los pastos, además pueden

flotar y ser llevados a lugares distantes en caso de haber corrientes de agua (López,

1996).

8.10.2.4. Labores de preparación y/o conservación d e potreros:

La utilización de implementos de labranza tales como arados, rastras, rastrillos, etc. en

labores agrícolas conllevan a una modificación de las condiciones microclimáticas del

suelo, a la vez que cambios micro y mesoclimáticos en los nichos ecológicos de las

garrapatas. La variación del microhábitat de las garrapatas debido a labores culturales

agrícolas, trae como consecuencia un efecto negativo en la dinámica poblacional de las

garrapatas con la disminución de la población debido a la exposición directa al medio

ambiente de los estadíos de vida libre de las garrapatas, y en especial de las larvas

(Bazán, 2002).

De igual forma, el corte de los pastos crea también una situación de espacio abierto y

desprotegido contra los rayos solares para las garrapatas y en especial contra las larvas,

lo que incrementa su mortalidad por efecto de la alteración del equilibrio electrolítico y en

el gradiente de evapotranspiración. Otras labores de cultivo utilizadas para combatir

malezas tales como la fumigación, pudiera tener algún tipo de acción tóxica contra las

garrapatas y en especial contra las larvas (González, 1996).

8.10.2.5. Pastos antigarrapata:

Existen reportes de que el “pasto gordura” (Melinis minutiflora) reduce severamente las

infestaciones por Riphicephalus (Boophilus) microplus (Thompson et al., 1976). En

consecuencia recomendaron su uso en zonas propensas a la infestación por garrapatas,

también se cuenta con la acción del pasto Andropogon gayanus, que mantiene una

población baja de Riphicephalus (Boophilus) microplus. La posibilidad de utilizar pastos

de gordura para el control de garrapatas esta dada por las condiciones de

60

establecimiento, nutrición, capacidad de carga, resistencia, que justifiquen su introducción

en una zona determinada (Betancourt, 1980).

En la actualidad un tipo de leguminosa del área tropical y subtropical denominada

Stylosanthes spp (Dorado et al., 2001), es una de las plantas antigarrapata halladas para

su control, las hojas de esta nutritiva variedad de pastura presenta la característica de

estar cubierta por pelos glandulares que segregan un fluido viscoso. A través de ensayos

que comprobaron que esta pegajosa secreción ocasiona la inmediata inmovilidad de las

neolarvas de la garrapata Riphicephalus (Boophilus) microplus, que buscan ascender por

los tallos a la espera del pasaje de hospedadores. Además dichas larvas son intoxicadas

durante 24 horas por un vapor aún no identificado químicamente que emana de esas

secreciones (Bazán, 2002).

Estas leguminosas parecen tener un enorme potencial en la sustancial reducción de las

poblaciones no parasitarias de todas las especies de garrapatas (Mateus, 1981).Debido A

que estas plantas poseen propiedades, para repeler las garrapatas como la leguminosa

Stylosanthes spp o para eliminar las garrapatas tales como Melinis minutiflora,

Gynandropsis ginandra, Brachiaria decumbens, Hiparrhenia ruffa, Sabana nativa y la

comúnmente conocida como Neem (Azadirachta indica), se espera una reducción de la

población de garrapatas disponible para infestar al ganado, por lo que la incorporación de

este tipo de plantas en la planificación de un Manejo Integrado de Garrapatas debe ser

tomada en consideración (Núñez, et al., 1982).

8.10.3. CONTROL BIOLÓGICO:

El control biológico, es un método de control de plagas, enfermedades y malas hierbas,

que consiste en utilizar organismos vivos con el objetivo de controlar las poblaciones de

otro organismo. Este método se presenta como una alternativa eficaz cuando se pretende

reducir el uso de plaguicidas e integrar una estrategia de manejo integrado de plagas.

Actualmente a esta opción es a la que se le dado prioridad y el mayor éxito se ha

alcanzado en la producción masiva y aplicación de entomopatógenos (Brisola, 2001). El

control biológico esta dado por mecanismos tales como: depredación, especialmente por

aves, parasitismo, patogenicidad o competencia.

61

8.10.3.1. Hongos entomopatógenos para el control de garrapatas:

Actualmente se investiga activamente el posible uso de hongos entomopatógenos para el

control de ectoparásitos. Recientemente se han concluido evaluaciones preliminares de

hongos tales como: Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, entre otros, que han

demostrado actividad biológica sobre garrapatas. Sin embargo, el uso de este método

por parte de los ganaderos requerirá de bastante investigación sobre el tema, incluyendo

aspectos como la formulación apropiada y estabilidad del hongo que evite la destrucción

de los conidios del hongo por la luz solar y la cuantificación de su efecto poblacional

(Benavides et al., 2000; Bittencourt, 2004).

8.10.3.2. Control biológico mediante el uso de depr edadores:

El control biológico a nivel de depredadores para el control de garrapatas es una de las

alternativas viables para disminuir las poblaciones de esta plaga. Muchos de los

entomófagos que se han registrado como reguladores de las poblaciones de garrapatas,

dentro de estos, las hormigas, hay referencias en Australia de los géneros Iridomyrmex,

Asphaenogaster y Pheidole como depredadores de adultos repletos en el suelo. Además

hay referencias que las hembras de Amblyomma cajennense y de Rhipicephalus

(Boophillus) microplus son atacados por la hormiga Solenopsis germinata (Cerny, 1969).

Se señala cuatro especies de hormigas, entre ellas Solenopsis saevissima como el más

importante biorregulador de R. microplus, también depreda Amblyomma cajennense y

Rhipicephalus sanguineus. En segundo lugar refiere la especie Camponotus rengeri, que

presenta mayor actividad forrajera al anochecer y al amanecer y la hormiga Ectatomma

quadridens que ataca a las garrapatas menos desarrolladas o menos ingurgitadas,

principalmente en días húmedos (Walker et al., 1998).

Unos de los factores adversos consiste en que todavía no se conoce lo suficiente sobre

los tipos de suelo más apropiados para el establecimiento de su nido, como tampoco es

posible prever la intensidad del ataque, el cual probablemente varía con algún

requerimiento fisiológico (Cerny, 1969).

8.11. RESISTENCIA DE LAS GARRAPATAS A LOS ACARICIDA S:

La resistencia que las garrapatas desarrollan a los acaricidas constituye una seria

limitante para el control de las mismas y de las enfermedades que transmiten. En el caso

de la garrapata del ganado el problema de la resistencia se ha venido presentando

desde 1937, cuando se reporto por primera vez la resistencia al arsénico en Australia

62

(Nolan, 1981). Posteriormente se ha demostrado el desarrollo de resistencia a todos y

cada uno de los productos químicos para el control de las garrapatas (Kemp et al.,1998).

El término de de resistencia se aplica a las poblaciones pertenecientes a una especie

normalmente sensible a plaguicidas, que ya no pueden ser eliminados por los mismos

productos químicos usados en un área (Benavides, 1989). Se considera resistencia a la

habilidad de cepas o de poblaciones de organismos para tolerar dosis de tóxicos que

serían letales para la mayoría de los individuos de la población normal (susceptibles) de

la misma especie (Stone, 1972). Esta es una respuesta genética y evolutiva de las

poblaciones de organismos expuestas a presión de selección permanente, para tolerar

los plaguicidas, entre otros agentes de control (Conway y Comins, 1979; Grillo, 1976;

Benavides, 1993).

La resistencia de las garrapatas a los acaricidas responde a un fenómeno eminentemente

genético y se acepta la preexistencia de genes resistentes en frecuencias bajas en

poblaciones de campo, antes de la introducción del producto (Stone, 1972). El número

de cromosomas en Rhipicephalus (Boophilus) microplus es de 2n=21 en machos y en las

hembras 2n=22 (Stone, 1972). La resistencia generalmente se asume como

monofactorial, es decir, involucra a un solo gen, el cual opera igualmente en ambos sexos

(Conway y Comins, 1979).

8.11.1. MECANISMOS DE RESISTENCIA:

Los diferentes mecanismos de resistencia pueden actuar independientemente o

combinados (Stone, 1972; Betancourt, 1990), dentro de estos se encuentran:

a. Penetración reducida del acaricida.

b. Almacenaje incrementado o excreción rápida de los tóxicos invariados.

c. Toxicidad reducida del acaricida aplicado.

d. Detoxificación aumentada dentro del cuerpo del artrópodo por caída metabólica

del acaricida penetrado, antes de que este alcance su sitio de acción, este es un

mecanismo mediado por enzimas (hidrolasas, esterasas, transferasas, oxidasas,

entre otras) que transforman el tóxico en compuestos auxiliares.

e. Sensibilidad reducida y/o permeabilidad disminuida en el sitio de acción: este

mecanismo hace que la plaga resistente sea menos sensible al mecanismo por el

cual el compuesto afecta.

63

f. Alteración de las propiedades del sitio de acción del acaricida: este mecanismo

capacita la tolerancia de un incremento de concentración del acaricida en el sitio

de acción.

g. Cambio en la velocidad de transporte.

8.11.2. MANEJO DE LA RESISTENCIA DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus:

Las medidas que pueden ser empleadas en el manejo de la resistencia en poblaciones

de garrapatas, se agrupan en tres categorías: Manejo por moderación, manejo por

saturación y manejo por ataque múltiple.

8.11.2.1. MANEJO POR MODERACIÓN :

Las medidas agrupadas en esta categoría incluyen dosis bajas, aplicaciones poco

frecuentes, uso de plaguicidas poco persistentes y conservación de los refugios de genes

susceptibles. Se considera que estas medidas son conservativas y en la mayoría de los

casos, se deben complementar con medidas de combate no químicas tales como el uso

de tratamientos estratégicos y selectivos. Esta estrategia esta basada bajo el principio de

“rotación a largo plazo para bajar la presión de selección”. Con este manejo la plaga

resistente pueden presentar ciclos de vida mas largos, menor fertilidad, menor

fecundidad, en resumen menor competitividad biológica (Fragoso, 2001).

El manejo por moderación reúne los estándares ambientales y es menos destructivo a los

agentes de control biológico. En el manejo por moderación, se reconoce que los genes

de susceptibilidad en la población son un recurso valioso, por lo que es importante

conservarlos mediante el uso de dosis que no maten a todos los individuos susceptibles,

realizando aplicaciones menos frecuentes, uso de ixodicidas poco persistentes y la

preservación de refugios.

Una medida que en muchas regiones del mundo ha sido, al menos empíricamente

aplicada para reducir el problema de la garrapata y por ende la necesidad de tratamientos

muy frecuentes, es la explotación de ganado europeo encastado con cebú, con la

finalidad de obtener las ventajas del híbrido resultante en cuanto a su resistencia a los

parásitos y a las garrapatas (Fragoso; 2001).

64

8.11.2.2. MANEJO POR SATURACIÒN:

El término “saturación” no implica la saturación de la población objetivo con plaguicidas.

Lo que se intenta hacer, es saturar las defensas de los insectos o ácaros, por medio del

uso de dosis suficientemente altas o una dosis eficaz, para anular la resistencia, por

reducción drástica de los homocigotos resistentes (RR) y la eliminación total de los

heterocigotos (Rs). Este enfoque es más adecuado durante los primeros estados de la

selección, cuando los genes de resistencia son poco frecuentes. El plan operacional

incluye el tratamiento sistemático del 100% del ganado, dentro de un intervalo corto (6

meses) de tiempo. Las recomendaciones conjuntas deberán de realizarse bajo

tratamientos secuenciales en los que la movilización de ganado con o sin garrapatas sea

perfectamente controlada. Un programa de intervalos de 14 días es el que más se logra

ajustar, sin embargo, teóricamente un intervalo de 21 días también puede funcionar,

aunque exista todavía cierto poder residual del producto en el hospedero que evita la

reinfestación por 2 ó 3 días en este tipo de manejo, algunas garrapatas logran

ingurgitarse y desprenderse antes del siguiente tratamiento, existiendo un riesgo

potencial a una nueva infestación (Fragoso, 2001).

8.11.2.3 MANEJO POR ATAQUE MÚLTIPLE:

Este método se basa en la acción de varios agentes controladores que actúan de manera

independiente, incluyendo diversos ixodicidas, donde cada uno ejerce una presión de

selección a un nivel tan bajo que no conlleva al desarrollo de resistencia. Con esta

estrategia se busca diversificar los genes involucrados en la resistencia de la plaga. Este

enfoque incluye la aplicación de químicos en mezcla y en rotaciones. El uso de mezclas

es diferente, ya que inicialmente, existe una frecuencia tan baja de genes de resistencia

simultánea a dos o más productos, que prácticamente excluye la posibilidad de que

dichos genes ocurran juntos en un solo individuo de una población dada. Por lo tanto el

ácaro que sobrevive a un plaguicida, en la mezcla, es eliminado por el otro plaguicida.

Estudios han demostrado que se podrían aplicar hongos entomopatógenos como

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae mezclados con compuestos químicos sin

que se produzca una inhibición del producto biológico (coformulaciones). Este tipo de

pruebas sin embargo, debe estar precedido por la ejecución de antibiogramas en medios

de cultivo artificiales que permitan verificar la compatibilidad fisicoquímica y biológica del

microbial con el plaguicida químico.Estos dos hongos han presentado una alta

compatibilidad con acaricidas organofosforados, encontrándose que pueden sobrevivir

65

sobre las orejas del ganado con un normal crecimiento por una y tres semanas

respectivamente y de esta forma realizando un control eficaz de esta plaga (Godwin et

al., 1995).

8.12. VACUNAS:

Muchas investigaciones sobre los mecanismos inmunológicos de resistencia a las

garrapatas han indicado diversas maneras de intentar vacunar contra estos ectoparásitos

(Walker, 1992). La vacunación contra las garrapatas puede ser usada para reducir la

infestación de los animales y proveer suficientes niveles de protección, de tal manera que

pueden ser mantenidos en condiciones de estabilidad endémica en la que haya un

mínimo requerimiento en el uso de acaricidas (Morrison, 1989; Jonsson et al., 2000).

La mayoría de trabajos de vacunación hasta 1988 habían sido realizados a partir de

glándulas salivares, homogenizados crudos de garrapatas completas y otros órganos

internos (Willadsen, 1980 y Kemp et al., 1989). Posteriormente, se encontró que las

glicoproteínas localizadas en la superficie de la membrana plasmática de las células

intestinales epiteliales de la garrapata son capaces de estimular una respuesta inmune

que protegía al ganado contra subsecuentes infestaciones con garrapatas (González,

1996).

Es así, como el control inmunológico contra Rhipicephalus (Boophilus) microplus se ha

realizado con el antígeno Bm 86, una de las glicoproteínas de la membrana plasmática

de las células epiteliales del intestino de la garrapata, cuya función no ha sido establecida

totalmente pero se cree que esta regula el crecimiento celular y facilita la digestión de la

sangre consumida; esta proteína ha sido purificada por homogenización (Kemp et al.,

1989) y obtenida recombinantemente por la transformación celular en los siguientes

organismos: Escherichia coli (Rand et al., 1989), Aspergillus nidulans , Aspergillus Níger

y la levadura metilotrófica Pichia pastoris (Rodríguez et al., 1994; Ruíz et al., 2007) con la

finalidad de producir grandes cantidades de este antígeno el cual es capaz de inducir un

alto grado de protección contra la infestación por Rhipicephalus (Boophilus) microplus

para producir las vacunas a nivel industrial (González, 1996; Ruíz et al., 2007).

Por otra parte, Bm 86 constituye un antígeno escondido, debido a que las garrapatas no

entran en contacto con el mismo durante la infestación natural, estos antígenos están

asociados con partes del parásito que no están expuestas normalmente; de esta manera

el uso de estos antígenos tiene considerables ventajas ya que es improbable que el

66

parásito desarrolle formas de evasión inmune a dichos antígenos al estar escondidos del

huésped (González, 1996). Los blancos de ataque inmunológico de este antígeno

fueron estudiados por Kemp y colaboradores (1989) quienes encontraron mediante

histología que el principal sitio de daño es el intestino, presentando un daño extenso al

epitelio intestinal y numerosos eritrocitos y leucocitos del huésped en la hemolinfa de la

garrapata, en algunas de las garrapatas que presentaron ruptura del intestino, hubo

evidencia de daño a los músculos y túbulos de malpighi, lo cual produjo una coloración

roja de la garrapata; este daño intestinal puede afectar la ovoposición en las hembras por

detenimiento de la digestión o bloqueo de las síntesis viteleogeninas por células

intestinales (González, 1996; Ruíz et al., 2007).

En Colombia (García et al., 1994) evaluaron la vacuna recombinante Gavac en

condiciones controladas de laboratorio obteniendo una disminución en el conteo de

teleoginas del 41%, del porcentaje de ovoposición del 25.3% , del porcentaje de fertilidad

del 9%, dando un porcentaje de eficacia integral del 61%; concluyendo que para su

recomendación de uso en campo seria necesario estudios posteriores en zonas

endémicas , ya que la molécula es inmunoprotectora pero no terapéutica, es decir, la

vacuna reduce la población de Rhipicephalus (Boophilus) microplus sin esperar

resultados inmediatos.

Esta nueva alternativa no química para el control, es un biológico constituido por

proteínas del intestino de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, las que al ser

aplicadas al ganado inducen una respuesta inmune que afecta el intestino del parásito,

produciéndole una tonalidad rojiza de la garrapata por la destrucción de la pared

intestinal, debido al escape de las células sanguíneas que ha extraído del hospedero

hacia su propia hemolinfa, los daños causados por la vacuna sobre la garrapata se

manifiestan principalmente la oviposición y la viabilidad de las larvas (García et al.,

1994).

8.13. OTRAS ALTERNATIVAS DE CONTROL:

8.13.1. Extractos vegetales

Se han adelantado observaciones usando extractos de la semilla del árbol del Neem

(Azadirachta indica) aplicados por aspersión, demostrando que reducen los niveles de

garrapatas sobre los animales. Esta alternativa se torna interesante por cuanto el árbol ha

demostrado un adecuado desarrollo en la mayoría de zonas cálidas del país; pero se

67

requiere de mayor investigación antes de poder recomendar ampliamente esta estrategia.

El Neem (Azadiractha indica, A. juss) generalmente tiene un amplio rango de condiciones

bajo las cuales puede prosperar. Requiere de precipitaciones anuales entre 800 a 1800

mm para un crecimiento vegetativo óptimo (Benavides et al., 2000).

El árbol necesita mucha luz y resiste altas temperaturas de hasta 40ºC, pero es muy

sensible al frío, principal limitante de su siembra en zonas altas. El pH óptimo es de 6.2,

sin embargo prospera en suelos ácidos a suelos salinos. Prefiere para su desarrollo

suelos profundos conteniendo 50%-75% de arena, con poca posibilidad de humedad

excesiva debido al estancamiento del agua gravitante. El Neem (Azadirachta, indica A.

Juss) puede resistir bien la sequía y años extremadamente secos con precipitaciones de

150 mm así como períodos secos de seis a nueve meses (Benavides et al., 2000).

Durante los últimos años, han sido aislados 25 diferentes ingredientes activos, entre ellos

por lo menos nueve afectan el crecimiento y el comportamiento de insectos. Los

ingredientes típicos de Azadirachta indica son Tri-terpenoides o también llamados

Limonoides. De los cuales los derivados de Azadirachta, Nimbin y Salannin son los más

importantes, con efectos específicos en las diferentes fases de crecimiento de los

insectos (González et al., 2004).

El Azadirachta y sus derivados causan generalmente una inhibición del crecimiento y

alteran la metamorfosis. Estas sustancias provocan un desorden hormonal en diferentes

etapas en el desarrollo del proceso de crecimiento del insecto, influyendo las hormonas

de muda y de las juveniles. Así los insectos no son capaces de desarrollarse de una

manera normal y resultan deformaciones de la piel, de las patas y otras partes del

cuerpo. La mayoría de estos efectos se pueden notar en los estados larvales, como son

los estados de los insectos que más se alimentan de las sustancias vegetales tratadas

con Neem (González et al., 2004). Los derivados de Azadirachta también puede reducir

la fecundidad de las hembras y causar la esterilidad parcial o total de los huevos de la

garrapata. Este efecto también se debe a cambios en el equilibrio hormonal.

8.13.2. Aceites

Los aceites han sido utilizados desde hace un siglo para controlar plagas en cultivos y

explotaciones pecuarias. Los de origen vegetal son eficaces para controlar ácaros e

insectos de cuerpo blando. El modo de acción de los aceites sobre los artrópodos no esta

68

completamente definido, una de las teorías mas aceptada establece que los aceites

congestionan los orificios (espiráculos) por donde entra el aire al cuerpo de los artrópodos

y causan la muerte por sofocación. Otra teoría establece que los aceites actúan como

repelentes. La repelencia puede deberse a que irritan el cuerpo de los artrópodos y a la

formación de una barrera sobre la superficie del follaje, este método de control puede ser

incorporado a un programa de manejo integrado de plagas (Radostits et al., 2002)

8.13.3. Resistencia del hospedero

Esta resistencia se de define como la habilidad del huésped para limitar el número de

garrapatas que van a madurar sobre el, es la capacidad del huésped para imponer

limitaciones sobre el parásito en cualquier etapa de su relación (Sutherest et al., 1986).

La utilización de ganado resistente, especialmente animales tipo Cebú (Bos indicus) y sus

cruces, reduce notablemente las poblaciones de garrapatas. La resistencia del ganado a

las garrapatas se debe a formas de comportamiento y reacciones inmunitarias que cada

animal adquiere a medida que madura (Kunz y Kemp, 1994). Las razas cebuínas

presentan una gran habilidad para adquirir resistencia, mientras que en la mayoría de las

razas europeas es pobre. En condiciones de finca es posible incrementar la resistencia

del hato mediante la observación y descarte de los animales que portan una alta

infestación natural de garrapatas o a través del cruzamiento progresivo con razas tipo

Cebú.

La resistencia de los bovinos puede ser de dos tipos:

� Innata: largo del pelo, espesor y dureza de la piel, secreción de las glándulas

sebáceas y sudoríparas, movilidad de la piel y hábitos del animal.

� Adquirida: se manifiesta después que el animal ha sido expuesto a algunas

infestaciones (Ferrati, 1999).

Los mecanismos relacionados con el rechazo de las larvas son hipersensibilidad,

anticuerpos, aumento del flujo sanguíneo y anastomosis arteriovenosas en los lugares de

las picaduras y todo esto produce una interferencia con su nutrición, prolonga el tiempo

de su nutrición, reduce el peso, inhibe la postura y disminuye la viabilidad de los huevos

(González, 1996). Adicionalmente, estudios recientes muestran relación entre la

resistencia a la garrapata y el complejo máyor de histocompatibilidad del bovino , el cual

ha sido asociado con la susceptibilidad o resistencia del ganado a la infección por este

ectoparásito (González, 1996).

69

9. MATERIALES Y MÉTODOS

9.1. LOCALIZACIÓN

Este trabajo se desarrolló en dos fases. La primera, la fase de campo (fase de establo)

comprendió el estudio de la patogenicidad de los hongos Beauveria bassiana y

Metarhizium anisopliae sobre ninfas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus,

y la segunda, la fase de laboratorio se evaluó la patogenicidad de estos hongos a

diferentes concentraciones sobre larvas de la garrapata R. microplus bajo condiciones

controladas en el laboratorio. El estudio se llevó acabo de enero del 2007 a junio del

2007.

La fase de campo de esta investigación se realizó en el Departamento de Casanare, en el

municipio de Sabanalarga ubicado a N 04°51'15'' - W 73°02'39'', en la finca ganadera La

Pradera. Las características climáticas son una temperatura promedio de 26 a 28°C y una

precipitación anual de 450 mm, con un período relativamente seco de Enero a Marzo.

La fase de laboratorio se llevo a cabo en la Universidad Nacional de Colombia de

Bogotá en el Laboratorio de Parasitología en donde se realizó la cría de las larvas de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus. La evaluación de las diferentes concentraciones de

los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae se llevo a cabo en el

laboratorio Life Systems Technology S.A. (LST) ubicado en Bogotá- Colombia.

9.2. FASE DE CAMPO (ESTABLO):

9.2.1. ANIMALES:

En la finca La pradera, Ubicada en Sabanalarga – Casanare presentaba 4 lotes de

animales distribuidos de la siguiente manera: dos lotes de animales para lechería, un lote

para animales de producción de carne y un lote con animales destetos. Cada lote

presentaba aproximadamente 30 a 35 animales. En la selección de animales para el

estudio, se tomó la muestra del lote de animales destetos, debido a la facilidad de su

manejo. Estos animales presentaron características de homogeneidad en cuanto a raza

(Cebú), tipo de explotación, edad (uno a dos años), peso (180 a 230 kg) manejo y

alimentación, se utilizó un muestreo aleatorio simple donde cada animal del lote tuvo la

misma probabilidad de ser escogido directamente como parte de la muestra. El tamaño

de la muestra fue de nueve animales.

70

9.2.2. RECOLECCIÓN DE TELEOGINAS DE LA GARRAPATA Rhipicephalus

(Boophilus) microplus

El muestreo de teleoginas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, se realizó

en los cuatro lotes de animales de la finca La Pradera en horas de la mañana, en los

animales donde se observó mayor prevalencía de teleoginas. La recolección de

teleoginas se realizó siguiendo el procedimiento utilizado por Hernández (1978), pasando

la mano suavemente sobre las diferentes regiones del cuerpo del hospedero donde

habitualmente se localizan las garrapatas: región mamaria, patas traseras, ancas,

flancos, abdomen, costillar y patas delanteras incluidas las axilas, cuello y cuartos

delanteros, papada y cabeza. Al detectar la teleogina, esta fue desprendida directamente

con la mano mediante los dedos índice y pulgar, agarrándola suavemente evitando que el

hipostoma de la teleogina quedara adherido a la piel del hospedero ya que este órgano

de fijación representa un carácter taxonómico muy importante para la identificación a

nivel de especie.

Se tomaron las teleoginas y se colocaron en cajas Petri las cuales presentaban en la

base huecos para permitir la aireación, al igual se colocó en la caja gasa y papel filtro

humedecidos para mantener una humedad adecuada. Para el trasporte de las teleoginas

hacia la ciudad de Bogotá se utilizó una nevera de icopor para mantener la temperatura

promedio de crecimiento de estos ácaros.

9.2.3 EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA E N CAMPO DE LOS

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana Y Metarhizium anisopliae

SOBRE NINFAS DE R. microplus

Para la evaluación de las cepas formuladas y no formuladas de los hongos

entomopatógenos en campo, se determinó la mortalidad producida sobre ninfas de la

garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El tamaño de muestra utilizado fueron 9

animales con un peso aproximado de 180 a 230 kg de raza Cebú, una de las más

comunes en la explotación ganadera colombiana (Parra et al.,1999).

Se tomó cada animal y por cada lado se le dibujó un cuadrante de 30 x 30 cm en su parte

delantera y papada (Figura 11) .Luego de dibujar los cuadrantes se contó manualmente

dentro de los cuadrantes la población de ninfas y teleoginas de la garrapata

Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El conteo se realizó según el procedimiento

utilizado por Hernández (1978) citado por Quijada et al. (1997). Al realizar el conteo sobre

los animales tenían un parasitismo medio-bajo.

71

Figura 11 . Cuadrante de medición para el conteo de la garrapata sobre el ganado.

Para aplicación de los hongos entomopatógenos se utilizó una bomba de espalda de 22

litros plástica (marca Bellota) con una boquilla graduable de cono solido convencional.

Fue necesario, antes de la aplicación de los hongos entomopatógenos la calibración de la

bomba de espalda con agua en la aplicación sobre uno de los animales a utilizar en el

ensayo, para determinar qué cantidad de producto era requerida (cepas de los hongos)

en el baño de los animales. Se determinó que se utilizaban 500 ml para bañar un animal.

La aplicación de los hongos entomopatógenos se realizó con bomba de espalda debido a

que de esta manera se realiza el baño convencional con productos químicos

garrapaticidas en la mayoría de explotaciones ganaderas.

Los animales se aislaron en un corral de 6 x 5 metros, donde la mitad se encontraba

techado (Figura 12). Se mantuvieron los animales durante los 10 días de evaluación, el

corral se limpio todos los días para controlar las posibles garrapatas que se encontraban

en el suelo, los animales fueron alimentados dos veces por día en el corral con pasto

Brachiaria y agua, cada dos días se les dío melaza para alimentarlos. Todos los animales

estuvieron bajo las mismas condiciones de radiación solar, temperatura y humedad.

Antes de colocar los animales del ensayo en el corral, se realizó un muestreo de

garrapatas presentes. Este muestreo se realizó mediante la utilización de zapatos de tela

(velo) y realizando un recorrido por todo el corral, luego de revisar la tela de los zapatos.

Se encontró la presencia de una sola larva lo cual no tiene relevancia para el ensayo.

72

Figura 12. Corral donde se almacenaron los animales del ensayo.

Para la preparación de los inóculos de los hongos entomopatógenos se tomaron 100 ml

del producto formulado de Beauveria bassiana con nombre comercial AgroNova (Anexo

1) producido por el laboratorio LST, y se le adicionó 1 litro de agua y se mezclo

homogéneamente (este volumen es necesario para bañar dos animales completos con

bomba de espalda). Para la preparación del producto formulado con Metarhizium

anisopliae con nombre comercial DeepGreen (Anexo 1) producido por el laboratorio LST,

se tomaron 100 ml del producto y se adicionó 1 litro de agua y se mezcló

homogéneamente. Las concentraciones de estos productos formulados fueron ajustadas

a 1x108 conidios /ml para evaluar esta concentración en campo.

Para la preparación de las cepas no formuladas, aisladas por el laboratorio LST de los

hongos B.bassiana y M. anisopliae, se tomaron 5 g de la cepa no formulada de

Beauveria bassiana y se le adicionó 4 ml de tween 20, finalmente se le adicionó un litro

de agua y se mezcló. Se realizó el mismo procedimiento con la cepa no formulada del

hongo Metarhizium anisopliae. Las concentraciones de las cepas no formuladas fueron

ajustadas a 1x108 conidios /ml para la evaluación en campo.

Los nueve animales utilizados para este ensayo, fueron sometidos a los tratamientos con

cepas formuladas y no formuladas de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y

Metarhizium anisopliae del laboratorio LST y a tratamientos de control comparativo y

absoluto (Tabla 6). La aplicación de los tratamientos sobre los animales se realizó con

bomba de espalda a las 4:00 p.m., para evitar que la fuerte radiación solar de la mañana,

ya que esta puede afectar la viabilidad de los conidios de los hongos entomopatógenos.

73

Tabla 6. Tratamientos evaluados por la aplicación de cepas formuladas del laboratorio LST y no formuladas de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre los animales para el control de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

TRATAMIENTO TRATAMIENTO LADO

DERECHO

TRATAMIENTO LADO

IZQUIERDO

CONTROL

Control comparativo. aplicación de agua.

Control Absoluto. Ninguna aplicación.

Metarhizium anisopliae

Aplicación de cepa formulada.

Aplicación de cepa no formulada.

74

Beauveria bassiana

Aplicación de cepa formulada.

Aplicación de cepa no formulada.

La mortalidad (presencia o ausencia) de ninfas de R. microplus evaluada en cada

tratamiento fue realizada diariamente durante 9 días, mediante el conteo manual de

ninfas y teleoginas, dentro de los cuadrantes dibujados. Las ninfas y teleoginas

encontradas dentro de los cuadrantes se les dibujo un círculo alrededor, para mayor

confiabilidad en los resultados. Se realizarón croquis de posición de ninfas y teleoginas

dentro del cuadrante para observar si la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus

tenía movilidad.

9.2.4 OBSERVACIÓN DEL EFECTO DE LOS HONGOS Beauveria bassiana (Bassi) Y

Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) EN SU PERÍODO DE PROTECCIÓN:

Después de 30 días de la aplicación de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M.

anisopliae sobre el ganado (ensayo de campo 9.2.3), se tomaron los animales utilizados

durante el ensayo para determinar la población de ninfas de la garrapata Rhipicephalus

(Boophilus) microplus y de esta forma evaluar período de protección de los hongos

entomopatógenos en el tiempo. A cada animal se le dibujó nuevamente un cuadrante de

30 x 30 cm en el mismo lugar donde había realizado el ensayo anterior. Se contó

manualmente dentro de los cuadrantes la población de ninfas y teleoginas de la garrapata

Rhipicephalus (Boophilus) microplus. El conteo se realizó según el procedimiento

utilizado por Hernández (1978). Se evaluó el número de población de ninfas y teleoginas

presentes sobre los animales de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus con el

75

fin de observar la mortalidad causada por los hongos entomopatógenos B.bassiana y

M.anisopliae después de 30 días de aplicación para evaluar su período de protección.

Para asegurar que la respuesta de mortalidad de ninfas de R. microplus fue causada por

los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae, al final de los ensayos se

recolectaron ninfas de los animales a los que se les había realizado la aplicación de

hongos y se colocaron en cámara húmeda donde se pudo observar la presencia de

micelio aéreo correspondiente a los hongos B. bassiana y M. anisopliae.

9.3. FASE DE LABORATORIO:

9.3.1. CONFIRMACIÓN DE ESPECIE DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus)

microplus:

La identificación de las garrapatas obtenidas en campo fue realizada en el Laboratorio de

Parasitología de la Universidad Nacional de Colombia por el médico veterinario, M. Sc.,

Jesús Cortés. Se tomaron varios individuos en los cuatro estadios de desarrollo de la

garrapata; huevo, larva, ninfa y teleogina. Estos se observaron bajo el estereoscopio para

su determinación taxonómica, con base en claves de texto y pictóricas validadas y

reconocidas para este propósito (Parra et al., 1999; Krantz, 1978; Nuñez,1987; Borrow et

al., 1964; Pcarp, 2007).

9.3.2 CRÍA DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Canestrini) (Acari: Ixodidae):

La cría de las garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus fue realizada en el

laboratorio de Parasitología de la Universidad Nacional de Colombia-Bogotá. Se tomaron

las teleoginas recolectadas en las cajas Petri, en un rango de 20 a 25 teleoginas por caja

y se colocaron en una incubadora con temperatura de 26.5°C y con una humedad relativa

del 70%.

Se mantuvieron de esta forma para la cría artificial de las garrapatas. Esperando que las

teleoginas ingurgitadas realizaran la ovoposición. Después de 29 días se observó la

puesta de los primeros huevos, los cuales presentaban un color café; cada teleogina

puso de 200 a 250 huevos (Figura 13). Posteriormente la teleogina hembra adulta murió.

Luego de esto se tomaron tubos de ensayo de 13x100 mm y se les colocó toallas de

76

papel absorbente humedecidas con agua destilada estéril, después se colocaron

aproximadamente de 800 a 1000 huevos por tubo y se taponaron con algodón para su

aireación. Los tubos fueron llevados al laboratorio LST donde cada tercer día se

humedecía el papel con agua destilada para mantener la humedad, los tubos fueron

puestos en una incubadora con una temperatura de 26.5°C.

Figura 13. Puesta de huevos durante la cría de teleoginas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Después de 34 días aparece la emergencia de las primeras larvas. Durante la

emergencia su humedecieron los tubos con agua destilada y otros con una solución de

agua y azúcar, con el fin de mantener la supervivencia. Las larvas pueden sobrevivir

hasta 6 meses sin alimentarse de la sangre de un hospedero.

9.3.3. EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULAD AS DE LOS

HONGOS B. bassiana y M. anisopliae SOBRE LARVAS DE R.microplus EN

CÁMARA HÚMEDA:

Se evaluaron las cepas formuladas (productos formulados por el laboratorio LST S.A) y

cepas no formuladas de los hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae sobre

larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en laboratorio en cámara húmeda a una

concentración de 1x108 conidios /ml. En este ensayo de laboratorio se evalúo la

mortalidad producida por las cepas formuladas y las cepas no formuladas de los hongos

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae.

77

Se realizaron cinco tratamientos con cuatro repeticiones cada uno (Tabla 7), manejando

una población por cada repetición de 50 larvas de la garrapata de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus por caja Petri, la población(N) total para este ensayo fue de 1000

larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. En total se utilizaron 20 cajas de Petri

pequeñas, las cuales fueron puestas en una solución de hipoclorito al 70%, con el fin de

evitar contaminaciones del ambiente, aumentando de esta forma la confiabilidad de

nuestros resultados. En cada caja fue puesta una rueda de papel filtro con el objetivo de

mantener una humedad y brindar condiciones favorables para la germinación de los

hongos y desarrollo de las larvas. Las larvas fueron pasadas una a una con un pincel de

los tubos a las cajas de Petri, luego se observaron las cajas bajo estereoscopio para

verificar que se encontraran vivas, esto con el fin de obtener datos confiables.

Tabla 7 .Tratamiento realizados para la comparación de cepas formuladas y cepas no formuladas sobre larvas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en cámara húmeda.

N° DE

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

1 Control comparativo, aplicación de agua.

2 Aplicación de cepa no formulada de Beauveria bassiana

3 Aplicación de cepa formulada de Beauveria bassiana

4 Aplicación de cepa no formulada de Metarhizium anisopliae

5 Aplicación de cepa formulada de Metarhizium anisopliae

La aplicación de los hongos se realizó con microaspersor con dos bares de presión, esto

con el fin de realizar una aplicación puntual del producto sobre las larvas. Para cada

tratamiento se utilizaron 200 ml de la cepa no formulada de cada hongo a una

concentración de 1x108 conidios /ml. Después de la aplicación de los hongos

entomopatógenos, se observaron de nuevo las cajas bajo el estereoscopio, verificando

que todas las larvas estuvieran vivas. Al control comparativo se le aplicó agua por

microaspersión. Finalmente las cajas fueron incubadas a 26.5°C y todos los días se

humedeció el papel filtro con agua destilada estéril.

En ensayo se evaluaron los tratamientos realizados en campo, con el fin de comparar la

tasa de mortalidad obtenida y la eficacia de los hongos biocontroladores B. bassiana y M.

anisopliae en el control de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. La evaluación de

mortalidad en cada tratamiento fue realizada diariamente durante nueve días, mediante

78

la observación de las cajas bajo estereoscopio, evaluando la mortalidad diaria de las

larvas y observando de esta forma también movilidad, color y aspectos físico, así como

otros síntomas comunes de la infección por hongos biocontroladores como B.bassiana y

M.anisopliae.

9.3.4. EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULADAS DE L OS

HONGOS B. bassiana y M. anisopliae SOBRE LARVAS DE R. microplus EN

CÁMARA SECA:

Se evaluaron las cepas formuladas y cepas no formuladas de los hongos Beauveria

bassiana y Metarhizium anisopliae del laboratorio LST para el control de larvas de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus en laboratorio, en cámara seca, a una

concentración de 1x108 conidios /ml. La metodología y el diseño experimental de los

tratamientos en este ensayo fue el mismo diseño experimental que en el punto 9.3.3., con

la diferencia que se evaluó la mortalidad en cámara seca. El papel filtro de las cajas sólo

fue humedecido con agua destilada únicamente el primer día de evaluación, luego las

cajas fueron incubadas a 26.5°C.

La evaluación de mortalidad en cada tratamiento fue realizada diariamente durante 9

días, mediante la observación de las cajas al estereoscopio, evaluando la mortalidad

diaria de las larvas, este ensayo se realizó en cámara seca con el fin de evaluar el papel

que juega el microclima de las larvas de R. microplus desarrollado por la transpiración y

como este puede beneficiar el crecimiento y desarrollo de los hongos entomopatógenos.

9.3.5. EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE LOS HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae SOBRE

LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus:

Este ensayo se realizó con el objetivo de determinar la concentración letal (CL50 y CL90) y

el tiempo letal (TL50 y TL90) de las cepas de Beauveria bassiana y Metarhizium

anisopliae sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en 9 días de evaluación.

Determinar de esta forma la concentración con mayor eficacia.

79

Para este ensayo se manejaron cinco concentraciones de cada hongo 1x106, 1x107,

1x108, 5x108 y 1x109 conidios/m. En total se utilizaron 36 cajas de Petri pequeñas, las

cuales fueron puestas en hipoclorito al 70%, con el fin de evitar contaminaciones del

ambiente. En cada caja fue puesta una rueda de papel filtro y se humedeció con agua

destilada con el objetivo de mantener una humedad interna alta y brindar buenas

condiciones para la germinación de los hongos y desarrollo de las larvas.

Se realizaron 12 tratamientos con tres repeticiones cada uno (Tabla 8), manejando una

población por cada repetición de 50 larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por

caja Petri, la población(N) total para este ensayo fue de 1800 larvas de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus.

Tabla 8. Tratamientos probados para evaluar diferentes concentraciones de B. bassiana y M. anisopliae bajo condiciones de campo.

N° DE TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

CONCENTRACIÓN

(conidios /ml)

1 Control absoluto (sin agua)

2 Control comparativo (Con agua)

3 Metarhizium anisopliae 1x106





8 Beauveria bassiana 1x106





80

Se traspasaron las larvas de los tubos a las cajas de Petri con un pincel, hasta completar

50 larvas por cada caja. Cada caja Petri luego fue puesta bajo estereoscopio para

observar y verificar que todas estuvieran vivas, esto con el fin de obtener datos

confiables. Las cajas fueron incubadas a 26.5°C y t odos los días de evaluación se

humedeció el papel filtro, excepto las cajas del tratamiento 1: control absoluto, esto nos

permitió evaluar la mortalidad natural de larvas y evaluar el papel que juega la humedad

relativa en la patogenicidad de los hongos.

Las concentraciones de los hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae fueron

ajustadas por el laboratorio LST. Para este ensayo soló se utilizaron cepas no formuladas

de los hongos entomopatógenos. La aplicación de los hongos se realizó con

microaspersor con dos bares de presión, esto con el fin de realizar una aplicación

puntual del producto sobre las larvas. Para cada tratamiento se utilizaron 200 ml de la

cepa no formulada de cada hongo en la concentración correspondiente para cada

tratamiento. En los tratamientos de control absoluto (1) y comparativo (2) se realizó una

aplicación con agua de 200 ml por microaspersor. El tratamiento 2: control comparativo,

nos permitió evaluar el posible daño mecánico que puede ser causado por la aspersión,

además de evaluar el efecto del agua por posibles agentes contaminantes del ambiente,

que puedan interferir con la confiabilidad de nuestros resultados. Después de la

aplicación de los hongos entomopatógenos, se observaron nuevamente las cajas bajo el

estereoscopio, verificando que todas estuvieran vivas.

La mortalidad en cada tratamiento se evaluó diariamente durante nueve días observando

la mortalidad de larvas de Rhipicephalus bajo el estereoscopio, además de la

observación de la sintomatología causada por los hongos sobre la garrapata evaluando

de esta forma movilidad, color y aspecto físico, debido a que las larvas muertas no

presentan movilidad, adquieren un color opaco y presentan un aspecto deshidratado. Con

los resultados obtenidos se determinó la mortalidad absoluta en cada tratamiento y la

mortalidad corregida mediante la formula de Abbott (1925).

81

9.3.6. EVALUACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LAS CEPAS RE ACTIVADAS DE LOS

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS B. bassiana Y M. anisopliae:

Este ensayo tiene como objetivo determinar la virulencia producida por las cepas

reactivadas de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium

anisopliae sobre larvas de la garrapata Rhipicephlaus (Boophilus) microplus.

Para este ensayo se utilizarón larvas infectadas por los hongos entomopatógenos

obtenidas en los ensayos anteriores. Estas larvas fueron puestas en cámara humeda

para promover el crecimiento de micelio aéreo visible de los hongos entomopatógenos.

Cuando el micelio aéreo se presento sobre las larvas, estas fueron puestas sobre cajas

Petri con agar selectivo Agar Dextrosa Saboraud (SDA) y se llevaron a incubar a 28°C

por ocho días, con el fin de reaislar las cepas de B. bassiana y M. anisopliae a partir de

larvas de R. microplus.

Posteriormente se observo un crecimiento visible de los hongos B. bassiana Y M.

anisopliaeen el agar. A partir de este primer aislamiento, por punción se realizaron

reaislamientos de cada hongo en medio PDA, con el fin de obtener cepas reactivadas

puras (libres de otros microorganismos). Este procedimiento se realizó tres veces con

períodos de incubación de ocho días cada uno.

A partir de los hongos reactivados se preparó una suspensión de propágulos (inoculo),

raspando el crecimiento de las cepas reactivadas de los hongos B. bassiana y M.

anisoplaie, estos fueron adicionados en un tubo con 9 ml de solución Tween 20. Luego

se ajustaron las concentraciones de las dos suspensiones a 1x108 conidios/ml, mediante

el recuento de conidios en cámara de Neubauer. Finalmente se realizó un promedio de

los dos conteos realizados por cada cepa del hongo y se multiplicó por el factor 5x104

para establecer la concentración final.

Para este ensayo se realizaron tres tratamientos (Tabla 9), cada uno con tres

repeticiones, manejando una población por cada repetición (n) de 50 larvas de la

garrapata de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por caja Petri, la población(N) total

para este ensayo fue de 450 larvas. Luego se realizó el montaje de las cajas de Petri, se

les colocó a cada caja papel filtro y se humedeció previamente con agua destilada, luego

se empezaron a pasar las larvas de los tubos a las cajas de Petri con un pincel, hasta

completar 50 larvas por cada caja de Petri. Este ensayo se realizó bajo condiciones de

cámara húmeda.

82

Tabla 9.Tratamientos para la aplicación de las cepas reactivas de los hongos B. bassiana y M. anisopliae sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

N° DE

TRATAMIENTO

TRATAMIENTO

1 CONTROL

2 Metarhizium anisopliae

3 Beauveria bassiana

La aplicación de los hongos reactivados se realizó con microaspersor con dos bares de

presión, para cada tratamiento se utilizaron 200 ml del inóculo. Después de la aplicación

del inóculo de los hongos entomopatógenos, se observaron nuevamente las cajas bajo el

estereoscopio, verificando que todas las larvas estuvieran vivas. Las cajas fueron

incubadas a 26.5°C y todos los días de evaluación s e humedeció el papel filtro. La

mortalidad en cada tratamiento se evaluó diariamente durante nueve días. Mediante los

resultados obtenidos se determinó la mortalidad absoluta en cada tratamiento y la

mortalidad corregida mediante la formula de Abbott (1925).

Al final de este ensayo se realizó un montaje de larvas infectadas en láminas portaobjetos

con azul de lactofenol, para observarlas bajo el microscopio a 40x la infección causada

por los hongos B. bassiana y M. anisopliae en larvas de R. microplus.

9.4. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Los parámetros a medir en el ensayo de campo fue presencia o ausencia de ninfas y

teleoginas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, así como mortalidad de

las mismas después de la aplicación de los hongos entomopatógenos Beauveria

bassiana y Metarhizium anisopliae sobre el ganado. Con los resultados de mortalidad

obtenidos se determinó la mortalidad absoluta en cada tratamiento y la mortalidad

corregida mediante la formula de Henderson y Tilton (Anexo 13).

En los ensayos de laboratorio en cámara seca, cámara humeda y en el ensayo de

reactivación de cepas de los hongos entomopatógenos, los parámetros a medir fueron la

mortalidad de larvas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus después de la

aplicación de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae

por microaspersión. Con los resultados de mortalidad obtenidos se determinó la

mortalidad absoluta en cada tratamiento y la mortalidad corregida mediante la formula de

Abbott (Anexo 12).

83

En el ensayo de laboratorio donde se evaluó la mortalidad de larvas a diferentes

concentraciones de los hongos entomopatógenos, se determinó la mortalidad acumulada

mediante el método de Reed and Muench (1938) (Anexo 11) para poder obtener los

Tiempos Letales (TL50 y TL90). Para calcular Concentración Letal (CL50 y CL90) se utilizó

el análisis Probit (Finney, 1971) utilizando el programa estadístico SAS v.8.0 .

En todos los ensayos para relacionar la patogenicidad y virulencia de los hongos

biocontroladores con la mortalidad de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus

en su estado de larva y ninfa, se utilizó un modelo estadístico (Anexo 2) donde se realizó

el análisis de normalidad con la prueba de Shapiro Wilk (SW), homogeneidad de

varianzas con la prueba de Barlett (B) o Levene (L), según el modelo estadístico,

pruebas de comparación de Krukal Wallis (KW) o ANOVA (AN) (α=0.05) y prueba de

contraste Fisher (LSD) con el programa estadístico R (2006) y Stagraphics (1996), con el

fin de determinar si existían diferencias significativas entre los tratamientos.

10. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

10.1. EVALUACIÓN DE LA PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA E N CAMPO DE LOS

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana Y Metarhizium anisopliae

SOBRE NINFAS DE R. microplus

El trabajo en campo se realizó bajo condiciones semi-controladas, debido a que durante

el ensayo se tuvieron condiciones desfavorables para el desarrollo de las cepas de B.

bassiana y M. anisopliae como son la radiación solar y las altas temperaturas

características del mes de marzo en el departamento de Casanare.

84

% DE MORTALIDAD DE NINFAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus EN CAMPO

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 DIA 6 DIA 7 DIA 8 DIA 9

TIEMPO

% D

E M

OR

TA

LID

AD

DE

NIN

FA

S

CONTROL LADO A CONTROL LADO BMetarhizium anisopliae LADO A CEPA FORMULADA Metarhizium anisopliae LADO B CEPA DESNUDABeauveria bassiana LADO A CEPA FORMULADA Beauveria bassiana LADO B CEPA DESNUDA

Figura 14. Porcentaje de mortalidad promedio de ninfas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus en cada tratamiento, después de la aplicación de los dos hongos entomopatógenos a una concentración de 1x108 conidios/ml.

En esta investigación se mostró el efecto acaricida de las cepas formuladas y no

formuladas de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae aisladas y

formuladas por el laboratorio LST. Como resultado se obtuvo en el día final de evaluación

una mortalidad del 69% de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en los animales

tratados con la cepa formulada de M. anisopliae, un porcentaje relativamente alto para

los estándares conocidos de productos biológicos. Este tratamiento presentó mayor

efectividad en comparación con las mortalidades presentadas en los tratamientos con la

cepa formulada de B. bassiana con una mortalidad del 57% y cepa no formulada de B.

bassiana con una mortalidad del 46% (Figura 14) .Los tratamientos con la cepa formulada

de M. anisopliae, en comparación con los tratamientos de la cepa formulada de B.

bassiana, demostrando una mayor rapidez en la colonización de su hospedero por parte

del hongo M. anisopliae, bajo condiciones de campo, lo cual se podría atribuir a la

capacidad que presenta este hongo para sobrevivir y desarrollarse bajo condiciones

desfavorables o de estrés.

Esta capacidad del M. anisopliae de soportar condiciones desfavorables, se podria deber

posiblemente a que presenta la característica de formar apresorios durante su proceso de

infección, estructura adhesiva, a partir de la cual se origina una hifa afilada que rompe la

Tiempo (días)

MO

RT

ALI

DA

D D

E N

IFA

S (

%)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

85

cutícula de una célula epidérmica del huesped por punción permitiendo la penetración del

micelio para establecer la infección del hongo(Hernández,2003).Esta estructura se

melaniza, permitiéndole al hongo llevar acabó su proceso de penetración y ser más

resistente ante condiciones adversas como las altas temperaturas, baja humedad relativa

y alta radiación solar principalmente que otros hongos que no tienen la capacidad de

formar este tipo de estructura. El hongo B. bassiana no presenta esta característica para

llevar acabo su proceso infectivo. Este hongo se caracteriza por la formación de una hifa

infectiva, estructura que puede ser mucho más sensible al efecto de las condiciones

ambientales desfavorables, impidiendo de esta forma el desarrollo del hongo sobre su

hospedero (Kaaya et al., 1996).

Los resultados de mortalidad de ninfas obtenidos en campo concuerdan con los estudios

realizados en ninfas y adultos de Rhipicephalus appendiculatus, por Kaaya y compañía

(1996), quien encontró que M. anisopliae indujo una alta mortalidad de ninfas y

teleoginas encontradas en los oídos de ganado Cebú con respecto a los resultados

obtenidos para B. bassiana.

Se pudo observar en el tratamiento control un comportamiento estable durante los días

de evaluación. La población en el tratamiento control se mantuvo constante durante el

ensayo y la mortalidad fue baja (22%). Otro aspecto muy interesante evaluado, es la poca

o nula movilidad que presentan las garrapatas en su estado de ninfa sobre los animales,

debido a que algunas de éstas fueron marcadas fuera del área de evaluación al inicio del

ensayo y permanecieron en el mismo sitio al final del mismo.

Se mostró en este ensayo una mayor velocidad de penetración y germinación del hongo

M.anisopliae sobre su hospedero comparado con B. bassiana, basado en una mayor

velocidad en la mortalidad de ninfas. En la Figura 14 de mortalidad de ninfas en campo

se puede mostrar el comportamiento de crecimiento de los hongos entomopatógenos

sobre sus hospederos, donde la curva de mortalidad causada por la cepa formulada del

hongo B. bassiana presenta un comportamiento sigmoidal, debido a que llega a su pico

de mortalidad, el cual no varía mucho a través del tiempo. La curva de mortalidad de la

cepa no formulada de B. bassiana y de la cepa formulada y no formulada de M.

anisopliae muestran una tendencia sigmoidal.También se puede observar que la cepa de

M. anisopliae tarda menor tiempo en alcanzar su fase exponencial que B. bassiana,

siendo esto una diferencia muy importante, ya que demuestra la rápida colonización del

hospedero y su velocidad de crecimiento en comparación con el hongo B. bassiana el

cual presentó una menor estabilidad bajo condiciones desfavorables.

86

% DE MORTALIDAD CORREGIDA (HENDERSON y TILTON) DE N INFAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

DIA 1 DIA 2 DIA 3 DIA 4 DIA 5 DIA 6 DIA 7 DIA8 DIA 9

TIEMPO

% D

E M

OR

TA

LID

AD

CO

RR

EG

IDA

DE

NIN

FA

S

ANIMAL 1 CONTROL LADO AANIMAL 1 CONTROL LADO BANIMAL 2 TRATADO CON Metarhizium anisopliae LADO A CEPA FORMULADAANIMAL 2 TRATADO CON Metarhizium anisopliae LADO B CEPA DESNUDAANIMAL 3 TRATADO CON Beauveria bassiana LADO A CEPA FORMULADAANIMAL 3 TRATADO CON Beauveria bassiana LADO B CEPA DESNUDA

Figura 15. Porcentaje de mortalidad corregida de ninfas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus hallada mediante la fórmula de Henderson y Tilton a una concentración de 1x108 conidios/ml, bajo condiciones de campo.

La mortalidad corregida de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en campo fue

de un 68% para el tratamiento con la cepa formulada de M. anisopliae, mientras que,

para la cepa formulada de B. bassiana fue de 49%(Figura 15), encontrándose diferencias

estadísticamente significativas entre los dos tratamientos (α=0.05, SW P<F 0.005327, L

P<F 1.304e-05, KW P<F 0.0007786). Donde se refleja una mayor eficacia de la cepa

formulada de M. anisopliae y una mayor velocidad de colonización de su hospedero. Esta

eficacia presnetada en la cepa formulada posiblemente este dada por la presencia de

algunos compuestos orgánicos que permiten proteger las esporas del hongo contra la

radiación solar y facilitan su adherencia al animal, teniendo mayor probabilidad de

colonizar su hospedero. Contrario a lo que podría esperarse con la cepa no formulada, la

cual no presenta ninguno de estos compuestos coadyuvantes. Es muy importante

proteger los hongos frente a condiciones ambientales adversas para obtener éxito en su

manejo en el control de plagas agrícolas y pecuarias, debido a que las condiciones

desfavorables como la alta temperatura pueden afectar la estabilidad de los hongos

entomopatógenos durante las aplicaciones en el campo y en su ocurrencia natural en el

agroecosistema (Costal et al, 2001). La protección de los hongos ante estas condiciones

se hace esencial si se conoce que éstos no poseen condiciones biológicas para tolerar

las grandes variaciones de temperatura, y puede ser limitante para su desarrollo sobre

MO

RT

ALI

DA

D C

OR

RE

GID

A D

E N

IFA

S (

%)

Tiempo (días)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

87

cualquier hospedero. La temperatura tanto del animal como del ambiente es una variable

limitante en la viabilidad del hongo bajo condiciones de campo. La temperatura

encontrada en la superficie del animal, varía de acuerdo al lugar que se trabaje. Amplias

fluctuaciones son encontradas en las orejas, alcanzándose temperaturas entre 28-35°C y

sobre la región dorsal entre 30-41°C. Los rangos de temperatura encontrada sobre éstas

partes de animal son suficientes para causar un efecto inhibitorio sobre la germinación,

radio de la colonia y esporulación del hongo Metarhizium anisopliae como también del

hongo B. bassiana ( Moore y Morley-Davies, 1994). Es por esta razón que la formulación

de los productos biológicos juega un papel muy importante en la infección de los hongos

entomopatógenos en campo.

La temperatura es uno de los factores abióticos más importantes para los hongos

entomopatógenos, debido a que puede afectar la germinación de las esporas, el

desarrollo y penetración del tubo germinativo, la colonización y reproducción. Otro factor

limitante para la viabilidad de los hongos entomopatógenos en campo y del cual se

deben proteger las cepas, es la radiación solar, debido a que la exposición a la luz

ultravioleta puede ser letal para los conidios de estos hongos. El crecimiento y

esporulación de los hongos es retrasado por la radiación solar, teniendo un papel

importante en el desarrollo de las epizootias causadas por estos hongos

entomopatógenos (Cagan et al., 2001). La luz influencia también el desarrollo de los

microorganismos y en algunos casos puede funcionar como inhibidor del crecimiento y

otras funciones vitales. Este efecto de radiación solar fueron evaluados por Cagan et al,

2001, encontrando que la supervivencia de los conidios del hongo entomopatógeno

Beauveria bassiana a la exposición de luz UV puede cambiar la forma de su nutrición de

prototròfica (capaz de sintetizar compuestos orgánicos) a auxotrofica (Organismo incapaz

de sintetizar una molécula orgánica indispensable para su propio crecimiento éste se

consigue administrando la sustancia con los otros nutrientes) (Cagan et al, 2001). La

exposición de la luz UV en el hongo puede interferir con sus características fisiológicas,

morfológicas y características bioquímicas. Es posible que si la formulación de los hongos

entomopatógenos protegiera los conidios de factores limitantes como son la alta

temperatura, fuerte radiación y desecación, los porcentajes de mortalidad aumentarían

siendo directamente proporcionales; a una mayor protección, una mayor mortalidad de la

plaga.

88

DESVIACIO N ESTANDAR

TR ATAMIENTO

MO

RTA

LID

AD

1 2 3 4 5 60

4

8

12

16

20a

a bb

bb

b

Figura 16. Mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación de los tratamientos 1: Control ,2: Control, 3: Cepa formulada de M .anisopliae ,4: Cepa no formulada de M .anisopliae ,5: Cepa formulada de B. bassiana y 6: Cepa no formulada de B. bassiana. Los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de contraste de Fisher con un nivel de significancia 0.05.

En la Figura 16 se puede observar que existen diferencias estadísticamente significativas

en el tratamiento 3: Cepa formulada de M.anisopliae con respecto a los demás

tratamientos. En los tratamientos 1 ,2 de control, 5 y 6 tratados con B. bassiana no se

presentaron diferencias estadísticamente significativas. La respuesta de mortalidad de

Beauveria bassiana sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus se podría

atribuir a las condiciones desfavorables presentadas durante el ensayo. La temperatura

ambiental estaba entre los 36 y 38°C con una humeda d relativa del 50%, por lo cual

existe la posibilidad de que el hongo B. bassiana halla inhibido su desarrollo y limitado

sucrecimiento. Con lo anterior se pudo deducir que el hongo Metarhizium anisopliae

presenta una mayor eficacia en campo que el hongo B. bassiana.

DESVIACION ESTANDAR

TRATAMIENTO

VA

LO

RE

S

1 2 30

3

6

9

12

15

18

MO

RTA

LID

AD

(a) (b)

Figura 17 .Box plot de respuesta de mortalidad de larvas de R. microplus en la comparación entre las cepas formuladas y no formuladas de los hongos B, bassiana y M. anisopliae (a) Tratamiento 1: control, 2: cepa fórmula de M. anisopliae y 3: cepa fórmula de B. bassiana (b) 1: control, 2: cepa no formulada de M. anisopliae y 3: cepa no formulada de B. bassiana

DESVIACION ESTANDAR

TRATAMIENTO

MO

RT

ALI

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1 2 35

8

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14

17

20

N° d

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divi

duos

mue

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(N

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N° d

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duos

mue

rtos

(N

infa

s)

N° d

e in

divi

duos

mue

rtos

(N

infa

s)

89

. En la comparación de cepas formuladas de B. bassiana y M. anisopliae incluyendo los

controles (Figura 17), mostró diferencias estadísticamente significativas P < F0.059 con

un nivel de significancia de (p<0.05), Igualmente mostró diferencias significativas en la

comparación de las cepas no formuladas de los dos hongos.

La humedad relativa, la radiación solar y la temperatura son factores de gran

importancia, tanto para el hospedante como para el patógeno, debido a que se demostró

que tienen un efecto directo sobre la germinación, penetración y para la reproducción de

los hongos entomopatógenos. La falta de humedad relativa adecuada puede limitar la

ocurrencia de una epizootia (Hernández, 2003).Se requiere de humedad relativa alta para

la germinación de los hongos entomopatógenos Metarhizium anisopliae y Beauveria

bassiana. Estos factores se deben tener en cuanta en la elaboración de una formulación,

debido a que pueden mejorar la efectividad de estos hongos contra la plaga.

Con todo lo anterior podemos deducir el papel que juegan las condiciones ambientales

sobre la viabilidad y vitalidad de los hongos entomopatógenos en condiciones de campo

es de gran importancia para el proceso de infección. Condiciones que fueron

desfavorables para los tratamientos con la cepa no formulada de B. bassiana durante el

transcurso del ensayo, siendo los resultados de mortalidad (46%) (Figura 14 y 15). Los

resultados fueron consecuentes con el tipo de condiciones ambientales a los que se

sometieron. Posiblemente, si las condiciones ambientales fueran las apropiadas, los

porcentajes de mortalidad aumentarían. Se confirmó que la patogenicidad puede ser

inhibida debido a las fuertes radiaciones solares, altas temperaturas y baja humedad.

Factores limitantes para el proceso de infección de los hongos entomopatógenos.

Una de las observaciones importantes realizadas durante el ensayo fue la poca movilidad

que presentan las garrapatas en su estado de ninfa sobre los animales, debido a que

algunas de éstas fueron marcadas fuera del área de evaluación al inicio del ensayo y

permanecieron en el mismo sitio al final de éste. Este comportamiento también es

comprobado con los resultados obtenidos para el control, debido a su comportamiento

estable durante el tiempo de evaluación.

Mediante ésta investigación y muchos otros trabajos realizados sobre el control biológico

de garrapatas queda demostrado que la utilización de hongos entomopatógenos para

éste fin es una de las mejores alternativas para disminuir de forma racional la población

de estos ectoparásitos. Es por esto, que actualmente se busca implementar un nuevo

90

concepto que aunque para muchas personas suena absurdo, es la mejor forma de evitar

que las poblaciones de estos ácaros llegan hasta un nivel de daño económico en

cualquier explotación ganadera y es el de buscar “convivir con las garrapatas”. Esto

incluye la integración de varias medidas de control ambientalmente amigables (Manejo

Integrado de Plagas) que mediante su uso combinado puedan producir mejores

resultados en la regulación de las poblaciones de garrapatas. Es por esta razón que el

control biológico debe ser integrado con otras alternativas como el control químico y el

control cultural (manejo del hábitat), y no ser utilizado de manera individual en una

explotación ganadera, debido a que la población de la plaga no es controlada en su

totalidad. Los organismos entomopatógenos pueden colonizar fácilmente a su hospedero

en sus estadíos más jóvenes; por esta razón se recomienda el uso de estos hongos

controladores acompañados de otras estrategias de control para alcanzar el éxito en el

manejo de esta plaga.

Estos resultados obtenidos en campo se convierten en un gran avance hacia la búsqueda

de nuevas alternativas para el manejo de una plaga pecuaria tan importante como lo son

las garrapatas. La utilización de hongos entomopatógenos para el control de estos ácaros

se constituye en una gran alternativa para la regulación de estas poblaciones, las cuales

provocan grandes pérdidas económicas en la ganadería nacional como en la de otros

países.

10.2. EFECTO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana (Bassi)

Y Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) EN TÉRMINOS DE SU PERÍODO DE

PROTECCIÓN EN CAMPO SOBRE EL GANADO

Se puede observar en la Figura 18 una población superior a 25 ninfas de Rhipicephalus

en todos los tratamientos. En los tratamientos evaluados con las cepas no formuladas y

cepas formuladas de los hongos B. bassiana y M. anisopliae se presentó un aumento de

la población de ninfas de Rhipicephalus, por esto se infiere que estos hongos

entomopatógenos pierden su eficacia acaricida después de 30 días posterior a la

aplicación. En los tratamientos evaluados con las cepas formuladas de B. bassiana y M.

anisopliae se puede atribuir el aumento de la población de ninfas de Rhipicephalus a las

condiciones climáticas desfavorables para el establecimiento de los dos hongos y

posiblemente a las características de formulación del hongo, al ser comparados los

tratamientos evaluados con cepas formulas con las cepas no formuladas tienen un

comportamiento similar, lo que indica que la formulación de estos hongos

entomopatógenos no tiene eficacia a largo plazo, esto puede deberse posiblemente a los

91

condiciones climáticas desfavorables como temperatura, humedad y radiación solar que

pudieron afectar la calidad de la formulación y causando disminución en la viabilidad,

adherencia y permanencia de este producto (Hernandez,2003; Boucias et al., 1988).

CONTROLCONTROL

M. anisopliaeCepa Formulada M. anisopliae

Cepa Desnuda B. bassianaCepa Formulada B. bassiana

Cepa Desnuda

C1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

TRATAMIENTOS

POBLACION DE NINFAS

POBLACION DE NINFAS DE Rhipicephalus (Boophilus) mi croplus DESPUES DE 30 DIAS DE LA APLICACION DE LOS HONGOS ENTOMOPATOGENOS B.bassi ana Y M. anisopliae

Figura 18. Efecto de las cepas formuladas y no formuladas de los hongos entomopatógenos B.

bassiana y M. anisopliae después de 30 días de aplicación sobre la población de ninfas de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Para utilizar hongos entomopatógenos como bioinsecticidas deben producirse cantidades

masivas del hongo, el cual debe mantener su capacidad infectiva por un período de

tiempo considerable, una buena formulación es la base para el éxito de un bioplaguicida

de origen microbiano; la posibilidad de obtener productos adecuados depende de las

propias características del microorganismo (Khachantourians,1991), B. bassiana y M.

anisopliae necesitan condiciones ambientales favorables para mejorar su velocidad de

colonización y establecimiento sobre las garrapatas. Es necesario que la formulación del

hongo tenga componentes que hagan favorable y faciliten la colonización del hongo,

además de otros componentes que ayuden a mantener su viabilidad al ser almacenado el

producto y después de la aplicación.

Control comparativo Control

absoluto

TRATAMIENTOS

M. anisopliae Cepa Formulada

M. anisopliae cepa no Formulada

B. bassiana Cepa Formulada

B. bassiana Cepa no Formulada

N° d

e in

divi

duos

(ni

nfas

)

92

La formulación del hongo es el proceso mediante el cual el ingrediente activo, es decir los

conidios del hongo, se mezclan con materiales inertes, tales como vehículos, solventes,

emulsificantes y otros aditivos. Estos materiales inertes ayudan a que el hongo este más

protegido al momento de la aplicación, así mismo, la facilita evitando que se sedimente

fácilmente y/o que forme grumos que tapen la boquillas. Todo esto se hace con el fin de

lograr una buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder ser

manipuladas y aplicadas adecuadamente (Monzón, 2001). Es de gran importancia que

estos componentes tengan un estricto control de calidad, y sean evaluados para asegurar

la viabilidad y efectividad de los hongos entomopatógenos a largo plazo, además que el

producto permanezca si llueve o el animal se baña para asegurar su efecto , además

para evitar mayor número de aplicaciones reduciendo de esta manera los costos de

producción.

Las formulaciones granuladas y polvos mojables son las que mayor éxito han tenido en la

presentación de este tipo de productos biológicos, pero se necesita un mayor esfuerzo en

investigaciones en esta línea a fin de obtener formulaciones de mayor estabilidad. Los

materiales utilizados en la formulación no deben tener actividad biológica; ni afectar la

actividad del hongo, deben ser inocuos al ambiente, presentar características físicas

adecuadas para mezclarse con los conidios; facilitar la aplicación del producto y ser

económicamente rentables (Kirkland et al., 2004).La utilización de productos biológicos

como los hongos entomopatógenos para el control de garrapatas en Colombia cada día

recibe más atención debido a que la utilización de estos productos para uso veterinario

podría implementarse como una estrategia de control dentro de un manejo integrado de

plagas.

10.3. CONFIRMACIÓN DE ESPECIE DE LA GARRAPATA Rhipicephalus (Boophilus)

microplus.

La identificación de las garrapatas fue realizada en el Laboratorio de Parasitología de la

Universidad Nacional de Colombia por el médico veterinario, M. Sc., Jesús Cortés. Para

la confirmación de la especie de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus, se

estudiaron las características taxonómicas más importantes en la observación de huevos,

larvas, ninfas y teleoginas de esta garrapata con base en claves de texto y pictóricas

validadas y reconocidas para este propósito (Parra et al., 1999; Krantz, 1978;

Nuñez,1987; Borrow et al., 1964; Pcarp, 2007).

93

Las características taxonómicas observadas mas relevantes fueron la longitud de los

pedípalpos, los cuales son cortos y gruesos en este género, se observó también la base

del gnatosoma la cual era de forma hexagonal y ensanchada lateralmente, el escudo en

hembras de color pequeño y rojizo y festones ligeramente marcados en algunas hebras y

no distinguibles fácilmente en machos (Figuras 19 y 20)

Figura 19. Macho de la garrapata bovina, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Pcarp, 2007).

Figura 20 .Hembra de la garrapata bovina, Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Pcarp, 2007).

10.4. EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULADA S DE LOS

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae

SOBRE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus EN CÁMARA HÚMEDA

Se evaluaron las cepas formuladas y no formuladas de los hongos Beauveria bassiana y

Metarhizium anisopliae en cámara húmeda a una concentración de 1x108 conidios/ml en

condiciones de laboratorio, con el fin de corroborar la tasa de mortalidad obtenida en el

ensayo de campo y observar la respuesta de mortalidad de larvas de Rhipicephalus con

una humedad relativa del 85%.

94

Este ensayo presentó un mayor porcentaje de mortalidad promedio de larvas de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus con la cepas formuladas de los hongos Beauveria

bassiana con un porcentaje de mortalidad del 81% y Metarhizium anisopliae con un

porcentaje de mortalidad del 79.5%, teniendo un comportamiento similar en condiciones

de laboratorio y de acuerdo con la prueba de Kruskal (α=0.05, P>F 0.6876) muestra

diferencias significativas entre los tratamientos y el control. En este ensayo se pudo

observar que la cepa formulada del hongo B. bassiana presentó una mayor velocidad de

infección sobre su hospedero (Figura 21). El crecimiento micelial sobre las larvas fue más

rápido en los tratamientos con las cepas de B. bassiana que en las cepas formuladas de

M. anisopliae posiblemente B. bassiana presente mayor eficacia bajo condiciones de

humedad favorables para el crecimiento del hongo. La diferencia mas notable se

presentó entre los tratamientos 2 (B. bassiana cepa no formulada) y el 3 (B. bassiana

cepa formulada), encontrándose una mayor mortalidad con la cepa formulada. Estas

diferencias aunque no son tan amplias, podrían atribuirse a la acción que ejercer algunos

aceites vegetales presentes en la formulación de algunos hongos, los cuales

congestionan los espiráculos (orificios respiratorios) de insectos de cuerpo blando y

ácaros por donde entra el aire al cuerpo de los artrópodos y causan la muerte por

sofocación, o causando un estrés que permite alcanzar en el mediano plazo una mayor

mortalidad (Benavides et al., 1990). HUMEDA

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


TIEMPO

% D

E M

OR

TALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TRATAMIENTO 1: CONTROLTRATAMIENTO 2: Beauveria bassiana CEPA DESNUDATRATAMIENTO 3: Beauveria bassiana CEPA FORMULADATRATAMIENTO 4: Metarhizium anisopliae CEPA DESNUDATRATAMIENTO 5: Metarhizium anisopliae CEPA FORMULADA

Figura 21. Porcentaje de mortalidad promedio de larvas por la aplicación de los hongos entomopatógenos B.bassiana y M.anisopliae con respecto al tiempo a una concentración de 1 x 108 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara húmeda.

Tiempo (días)

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

95

Las larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tratadas con el hongo Beauveria

bassiana a partir del día siete de evaluación mostraron crecimiento un micelio aéreo en

su superficie de color blanco que luego fue tornándose rosado (Figura 22), mientras que

en las larvas tratadas con Metarhizium anisopliae se observó un crecimiento micelial de

color verde que luego fue convirtiéndose en gris (Figura 23), a partir de los ocho días de

evaluación. El crecimiento micelial de los hongos se evidenció después de la muerte de

las larvas y a medida que se aumentaba la humedad

Figura 22 . Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Beauveria bassiana en cámara húmeda, presencia de micelio aéreo a los 12 días.

Figura 23 . Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Metarhizium anisopliae en cámara húmeda, presencia de micelio aéreo a los 12 días.

96

La poca diferencia encontrada en la mortalidad producida por estos dos hongos,

concuerda con estudios realizados por (Godwin et al., 1995), los cuales han demostrado

que los hongos B. bassiana y M. anisopliae inducen aproximadamente una mortalidad

del 30 y 28% respectivamente, en garrapatas adultas de Rhipicephalus appendiculatus

encontradas sobre conejos, y que ambas especies provocaron una disminución en la

fecundidad de las hembras y la viabilidad de sus huevos. En este mismo estudio, el

ganado Cebú infestado naturalmente con R. appendiculatus en campo, tanto B. bassiana

como M. anisopliae provocaron una alta mortalidad (entre 76-85%), una marcada

reducción en la fecundidad (85-99%) y una reducción significativa en la viabilidad de los

huevos (94-100%). Con esto se deduce que los hongos B. bassiana y M. anisopliae

presentan el mismo comportamiento bajo condiciones de laboratorio.

La mortalidad obtenida para el tratamiento control en el laboratorio fue muy estable y

concuerda con la mortalidad natural encontrada bajo condiciones de campo. Estos

resultados fueron altos comparados con los obtenidos en estudios realizados por

Bittencourt, y colaboradores (1994), en donde esta mortalidad no sobrepasaba el 10%.

En nuestro trabajo se encontraron porcentajes de mortalidad en un rango entre 20-25%

en larvas control. Estas diferencias se pueden explicar con base en la metodología de

aplicación de agua manejada para los tratamientos, en nuestro caso, la aplicación de

agua se realizó con un microaspersor y para otros estudios se sumergían en agua las

larvas (Benavides et al., 2000) de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Se puede explicar

de esta forma el aumento de la mortalidad en los controles de nuestro estudio, debido a

que la presión producida por el microaspersor puede de algún modo producir daños

mecánicos sobre la superficie de las larvas o la obstrucción de espiráculos, y de esta

forma, aumentar los porcentajes de mortalidad con respecto a los encontrados en la

metodología de sumergimiento.

La respuesta de mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Figura 24),

se encontró que el tratamiento 1: control, presentó diferencias respecto a los demás

tratamientos (P<F 0.00239), mientras que en los tratamientos 2, 3 ,4 y 5 no se

encontraron diferencias significativas, ya que en la prueba de contrastes para estos

tratamientos, se obtuvo un P mayor a 0.05 (Anexo 5 y 6).

97

TRATAMIENTO1 2 3 4 5

0

TRATAMIENTO

MO

RTALI

DAD

0

10

20

30

40

50

a

bc

bc

c

bc

Figura 24. Respuesta de mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación de los tratamientos en cámara hùmeda 1: Control 2: Cepa formulada de M .anisopliae ,3: Cepa no formulada de M .anisopliae ,4: Cepa formulada de B. bassiana y 5: Cepa no formulada de B. bassiana. Los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de contraste de Fisher con un nivel de significancía 0.05.

Mediante el análisis de los resultados de mortalidad corregida (Figura 25) para este

ensayo se observa el mayor porcentaje de mortalidad en el tratamiento 3 (B. bassiana

cepa formulada), aunque al compararse con la cepa formulada de M. anisopliae no

existen diferencias significativas. Este resultado demuestra que las condiciones

controladas de laboratorio favorecen el desarrollo de los hongos.

Según estos resultados, los hongos entomopatógenos requieren los primeros cuatro días

para alcanzar una infección visible de su hospedero, tiempo durante el cual no se

observan mortalidades significativas de la plaga. Este comportamiento hace que los

resultados esperados para un producto biológico sean completamente diferentes a los

obtenidos con un compuesto químico. Un producto biológico requiere mas tiempo en

causar la mortalidad en una población plaga, mientras el producto químico tiene una

respuesta de mortalidad casi inmediata. Siendo complementarios los resultados

esperados con estas dos alternativas, podríamos pensar en integrarlas e introducirlas en

programas de manejo de poblaciones de garrapatas en fincas ganaderas del país,

esperando obtener mejores resultados que al utilizar las estrategias por separado.

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BAJO CAMARA HUMEDA

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TRATAMIENTO 2: Beauveria bassiana CEPA DESNUDATRATAMIENTO 3: Beauveria bassiana CEPA FORMULADATRATAMIENTO 4: Metarhizium anisopliae CEPA DESNUDATRATAMIENTO 5: Metarhizium anisopliae CEPA FORMULADA

Figura 25. Porcentaje de mortalidad corregida (Abbott) de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación de los hongos entomopatógenos B.bassiana y M.anisopliae en una concentración de 1x108 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara húmeda.

En la observación de la curva de porcentaje de mortalidad corregida (Figura 25) de larvas

de Rhipicephalus (Boophilus) microplus bajo condiciones de laboratorio en cámara

húmeda, podemos observar el comportamiento de los hongos en sus fases de

crecimiento (fase lag, fase log, fase de adaptación y fase de equilibrio). Este

comportamiento es similar para los dos hongos, desarrollándose de una forma

sigmoidal... Durante los primero cuatro días de evaluación la curva de mortalidad de

larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus para los dos hongos son similares y se

comportan de manera constante, no encontrándose diferencias estadísticamente

significativas entre los tratamientos en el día 4. Este es el tiempo requerido por los

hongos entomopatógenos para adaptarse a las diferentes condiciones encontradas en su

hospedero. Este tiempo según algunos autores es entre 4-6 días después de la

aplicación de los hongos (Bazán, 2002).

Mor

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(%

)

Tiempo (días)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

99

Los eventos tempranos de la infección son críticos debido a que tienen lugar fuera del

insecto, así se expone el hongo a factores ambientales no favorables. Por esta razón, se

recomienda la selección de cepas de hongos de rápido desarrollo, es un criterio

promisorio para una buena selección de aislamientos de hongos para el control de plagas

(Valencia y Khachatourians, 1999).

Durante este tiempo de adaptación en el caso de B. bassiana, sus conidios se adhieren

a la superficie de su huésped específicamente en la cutícula o exoesqueleto, para así

formar un tubo germinativo, el cual penetra e invade el interior del hospedero. Una vez

dentro, este hongo empieza a multiplicarse rápidamente de manera que su dispersión es

por todo el cuerpo (Herrera y Ulloa, 1990). En el caso de M. anisopliae, cuando este

atraviesa la cutícula y entra a la hemolinfa del ácaro, debe adaptarse a diferentes

condiciones del ambiente interno del hospedero, para ello hay la expresión de diferentes

genes involucrados en procesos metabólicos (metabolismo de carbohidratos), proteólisis

y síntesis de metabolitos tóxicos (Chengshu et al, 2005). Posiblemente al quinto día del

ensayo (Figura 25) los hongos entomopatógenos, presenten esta fase de adaptación en

el hospedero.

Para que la manifestación epizoótica de los hongos entomopatógenos tenga lugar, los

factores bióticos y abióticos tienen una enorme influencia. En la fase de adaptación de los

hongos entomoptaogenos estos factores pueden inhibir o estimular la colonización del

hongo. Entre los factores abióticos que afectan la viabilidad y la persistencia de los

hongos entomopatógenos en su hospedero se encuentran los rayos ultravioleta, la

temperatura, la humedad relativa, pH y los funguicidas (López et al, 1995). La

susceptibilidad y la relación con los hospederos se relacionan con los nutrientes

presentes en los insectos, que son el medio para la propagación, dispersión y período de

protección de los hongos.

En el período de adaptación de los hongos entomopatógenos a su hospedero, la

penetración del hongo desde la cutícula del ácaro hasta el hemocele, la hifa queda

inmersa en proteínas, quitina, lípidos, melanina, difenoles y carbohidratos; algunos de

ellos son nutrientes pero otros pueden inhibir su crecimiento, ya que el hospedero activa

su sistema inmune a través de procesos como la melanización, fagocitosis, nodulación y

encapsulamiento. Sin embargo, los hongos desarrollan una serie de actividades que les

permiten evitar este tipo de defensas, tales como cambios en la pared celular y

producción de sustancias inmunomodulatorias o toxinas fúngicas (Pucheta et al, 2006).

100

Los hongos entomopatógenos como Beauveria bassiana producen toxinas que son

capaces de destruir los granulomas, las cuales permiten a las blastosporas invadir la

hemolinfa. El hongo B. bassiana al producir una toxina depsipéptida cíclica (beauvericin)

que posee un mecanismo de acción similar a las toxinas del hongo Metarhizium

anisopliae, como son las destruxinas aisladas por Naganawa (1975).

Luego de presentarse estas interacciones patógeno-hospedero y de ser vencida la

resistencia del organismo plaga por parte de los hongos, estos pueden desarrollarse

dentro del ácaro y realizar una producción masiva de blastosporas (Willadsen, 2006), las

cuales son de naturaleza infectiva y permiten el establecimiento de epizootias en la

explotación ganadera, la cual se ve presentada en un comportamiento sigmoidal en la

mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Figuras 21 y 25).

10.5. EVALUACIÓN DE CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULADA S DE LOS

HONGOS B. bassiana y M. anisopliae SOBRE LARVAS DE R. microplus EN

CAMARA SECA:

Se evaluaron las cepas formuladas y no formuladas de los hongos entomopatógenos

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en cámara seca a una concentración de

1x108 conidios/ml en condiciones de laboratorio, con el fin de evaluar el papel que juega

la humedad relativa en la patogenicidad de los hongos, al igual que la humedad

microclimática desarrollada por la transpiración de las larvas de Rhipicephalus


Los resultados obtenidos para este ensayo mostraron mayor mortalidad promedio en el

tratamiento cinco (M. anisopliae cepa formulada) y en el tratamiento cuatro (M. anisopliae

cepa no formulada) con respecto a los otros tratamientos de B. bassiana (Figura 26) y

presentan diferencias estadísticamente significativas entre estos tratamientos de acuerdo

a la prueba de Kruskal Wallis (p<0.05). Esta alta eficacia de M. anisopliae no concuerda

con lo encontrado en el ensayo realizado en cámara húmeda, demostrando que el hongo

M. anisopliae tiene mayor eficacia que B. bassiana en condiciones de estrés, resultados

que al ser comparados con el ensayo realizado en campo presentan el mismo

comportamiento.

101

0

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TIEMPO

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AS

TRATAMIENTO 1: CONTROLTRATAMIENTO 2:Beauveria bassiana CEPA DESNUDATRATAMIENTO 3: Beauveria bassiana CEPA FORMULADATRATAMIENTO 4: Metarhizium anisopliae CEPA DESNUDATRATAMIENTO 5: Metarhizium anisopliae CEPA FROMULADA

Figura 26. Porcentaje de mortalidad de larvas por la aplicación de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae con respecto al tiempo a una concentración de 1 x 10 8 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara seca.


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TRATAMIENTO

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bcbc

bc

Figura 27. Respuesta de la mortalidad de ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación en cámara seca de los tratamientos 1: Control 2: Cepa formulada de M .anisopliae ,3: Cepa no formulada de M .anisopliae ,4: Cepa formulada de B. bassiana y 5: Cepa no formulada de B. bassiana. Los tratamientos con la misma letra no son significativamente diferentes de acuerdo con la prueba de contraste de Fisher con un nivel de significancía 0.05.

Mor

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102

El análisis de contrastes de Fisher para la respuesta de mortalidad de larvas de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus, se encontró que el tratamiento 1: control, presentó

diferencias respecto a los demás tratamientos (P<F 0.0068), mientras que en los

tratamientos 2, 3 ,4 y 5 no se encontraron diferencias significativas (Figura 27), ya que en

la prueba de contrastes para estos tratamientos, se obtuvo un P mayor a 0.05 (Anexo 7).

El efecto de los hongos entomopatógenos sobre la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus depende definitivamente del tipo de hongo, tipo de aislamiento y concentración

de conidios/ml. A causa de esto, Frazzon et al, 2000, investígo doce aislamientos de

Metarhizium anisopliae aislados de insectos en el control de esta especie de garrapata,

encontrando gran variedad en los resultados de mortalidad entre los aislamientos,

obteniendo mortalidades desde 53-100% de larvas de este género de garrapata. Estos

resultados concuerda con los obtenidos durante el ensayo, ya que se presentaron

mortalidades mayores del 50%, se puede deducir con esto que los hongos producen la

respuesta de mortalidad en larvas de R. microplus y las cepas utilizadas definitivamente

tinen un efecto acaricida haciendo que sean mas específicas al momento de colonizar su

hospedero.

Se observó una mayor velocidad de crecimiento de las cepas del hongo M. anisopliae

con respecto a las cepas de B. bassiana (Figura 26); resultado que al ser comparado con

el ensayo realizado en cámara húmeda presenta diferencias significativas. Se observaron

a través de este ensayo diferencias marcadas entre la respuesta de mortalidad de las

cepas formuladas y las cepas no formuladas de los dos hongos. Los resultados obtenidos

para el tratamiento control son constantes en el tiempo y relativamente bajos, semejantes

a los ensayos anteriores, con lo que se puede deducir que la metodología es válida. Se

observó en las curvas de moratalidad corregida (Figura 28) el mismo comportamiento de

las curvas de mortalidad promedio absoluta .La mayor efectividad encontrada por M.

anisopliae creciendo en una humedad relativa del 40 % en este ensayo, según los

porcentajes de mortalidad promedio obtenidos podría atribuirse a la mayor capacidad

adaptativa que presenta este hongo ante condiciones ambientales desfavorables.

Este resultado concuerda con lo encontrado en algunos estudios realizados en

Colombia, donde se evaluaron de forma comparativa 10 aislamientos de Metarhizium

anisopliae, Beauveria bassiana y Lecanicillium lecanii sobre teleoginas de la garrapata B.

microplus (Moreno et al., 2001). El mayor efecto sobre la reproducción y mortalidad de

larvas se obtuvo con el aislamiento Mt019 de M. anisopliae alcanzando un 87% de

inhibición a la dosis de 108 conidios/ml. En otros estudios realizados por Fernández et al.,

2003, sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus sensibles y resistentes a

103

organofosforados, demostraron que el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae es

altamente infectivo a una concentración de 1x108 conidios/ml, provocando mortalidades

del 100% en ambas cepas de larvas tanto la resistente a organofosforados como la

susceptible a estos productos. Estos resultados concuerdan con lo obtenido en este

trabajo de investigación, debido a que las cepas de M. anisopliae fueron altamente

infectivo a una concentración de 1x108 conidios/ml, presentando una mortalidad del 70-

77% de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, y se podría pensar a futuro en

este hongo entomopatógeno, como una opción en el manejo integrado de garrapatas en

fincas ganadera del país.

Los porcentajes de mortalidad coregida de larvas de R. microplus (Figura 28) muestran la

importancia de la humedad relativa en el establecimiento y desarrollo de los hongos

entomopatógenos sobre su hospedero, debido a que las conidiosde éstos hongos tienen

requerimientos específicos de agua y temperatura, así como de otros factores

ambientales que en conjunto funcionan como inductores para la activación de receptores

presentes en el patógeno y que les permiten llevar a cabo el proceso infectivo sobre el

hospedero (Pucheta et al., 2006). Con este ensayo se pudo deducir que el microclima del

insecto plaga y de los animales afectados influye directamente sobre la patogenicidad los


Figura 28. Porcentaje de mortalidad corregida (Abbott) de larvas por la aplicación de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae con respecto al tiempo a una concentración de 1 x 10 8 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara seca.

% DE MORTALIDAD CORREGIDA MEDIANTE ABBOTT DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus EN CAMARA SECA

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TRATAMIENTO 2: Beauveria bassiana CEPA DESNUDA TRATAMIENTO 3: Beauveria bassiana CEPA FORMULADA

TRATAMEINTO 4: Metarhizium anisopliae CEPA DESNUDA TRATAMIENTO 4: Metarhizium anisopliae CEPA FORMULADA

Tiempo (días)

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(%

)

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104

La mortalidad corregida (Figura 28) obtenida para el tratamiento con la cepa formulada de

M. anisopliae presentó los porcentajes de mortalidad más altos en comparación con el

tratamiento evaluado con la cepa formulada de B. bassiana, encontrándose diferencias

estadísticamente significativas entre los dos tratamientos de acuerdo con la prueba de

Kruscal Walis (p<0.05). El comportamiento de las curvas de mortalidad demuestra un

desarrollo sigmoidal y una mayor velocidad en la mortalidad de larvas de Rhipicephalus

(Boophilus) causada por la cepa formulada de M. anisopliae. El comportamiento de estos

hongos durante el ensayo demostró la importancia de la humedad relativa en el proceso

de germinación y crecimiento de los hongos entomopatógenos. Los resultados obtenidos

para el tratamiento control son constantes en el tiempo y con un porcentaje de mortalidad

bajo (21%), esto se demuestra en la baja variación de los resultados obtenidos en la

mortalidad corregida.

El crecimiento micelial aereo sobre las larvas, fue mas rápido en los tratamientos con las

cepas de M. anisopliae al ser comparados con los tratamientos de las cepas de B.

bassiana (Figuras 29 y 30), demostrándose una mayor efectividad y una mayor tasa de

crecimiento de la cepa formulada bajo condiciones desfavorables para el desarrollo del

hongo. La mayor efectividad encontrada por M. anisopliae podría atribuirse a la mayor

capacidad adaptativa a condiciones desfavorables y de estrés por la formación de

apresorios en le proceso de infeccion. Los resultados obtenidos durante este ensayo son

similares con los estudios realizados por Beati y colaboradores (2000), donde demuestra

que M. anisopliae produce mas conidios que B. bassiana sobre cadáveres de la langosta

Rhammatocerus schistocercoides en una humedades relativas de 50 %, con esto

podemos deducir que la producción de conidios en estos hongos depende directamente

de la humedad relativa, por que al comparar el ensayo realizado en cámara húmeda y el

ensayo realizado en cámara seca ,tanto para los tratamientos evaluados con B. bassiana

como los evaluados con M. anisopliae su velocidad de crecimiento y eficacia fue menor

en los ensayos en cámara seca.

105

Figura 29 . Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Beauveria bassiana en cámara seca, presencia de micelio aéreo a los doce días.

Figura 30 . Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo Metarhizium anisopliae en cámara húmeda, presencia de micelio aéreo a los doce días.

La disminución de la mortalidad de larvas Rhipicephalus (Boophilus) microplus a una

menor humedad, es una evidencia clara de la importancia de la humedad relativa en el

establecimiento y desarrollo de los hongos entomopatógenos sobre su hospedero, debido

a que las esporas de éstos hongos tienen requerimientos específicos de agua y

temperatura, así como de otros factores ambientales que en conjunto funcionan como

inductores para la activación de receptores presentes en el patógeno y que les permiten

llevar a cabo el proceso infectivo sobre el hospedero (Pucheta et al., 2006). Existe la

posibilidad que la respuesta de la mortalidad en larvas de Rhipicephalus por la aplicación

de los hongos entomopatógenos este dada por la humedad microclimática de la

garrapata por su proceso de transpiración, debido a que este proceso pudo aumentar la

humedad relativa durante el ensayo favoreciendo el crecimiento y desarrollo de los


106

Estudios realizados por (Hallsworth et al, 1999), demuestran un crecimiento óptimo de

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae a una humedad relativa (aw) de 0,90 y

0,998 respectivamente. Condiciones que son críticas para el desarrollo de un hongo

bicontrolador, debido a que en el caso de la humedad relativa, esta es un factor abiótico

indispensable para los procesos de germinación de esporas, crecimiento e infección.

Para el desarrollo de una buena formulacion de hongos entomopatógenos es necesario

que se utilicen hongos que puedan soportar porcentajes bajos de humedad relativa sin

afectar su eficacia sobre la plaga o que contengan compuestos para conservar la

humedad de los conidios para que favorescan el desarrollo y patogenicidad del hongo.

10.6. EVALUACIÓN DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE L OS HONGOS

ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae SOBRE

LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus:

Los resultados obtenidos muestran que todas las concentraciones utilizadas de los

hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae tuvieron un

efecto infectivo y letal sobre las larvas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus.

De acuerdo con la prueba de comparación múltiple de Fisher (Anexo 8) se observó que

los tratamientos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 presentan diferencias sigificativas con el

control absoluto (tratamiento 1) y con el control comparativo (tratamiento 2) (Figura 31).

Esto indica un claro efecto virulento de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M.

anisopliae sobre las larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, lo cual abre la

posibilidad de utilizar estos hongos en una excelente alternativa para el manejo de

poblaciones de garrapatas en explotaciones ganaderas comerciales. La mortalidad

encontrada en el control relativo no presentó diferencias estadísticamente significativas

con respecto a la mortalidad encontrada en el control absoluto, demostrándose que no se

presentó contaminación de los ensayos con patógenos del ambiente además de validar la

metodología utilizada.

107

DESVIACION ESTANDAR

TRATAMIENTO

MO

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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 120

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c c

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a ababc ab

aba

ab

Figura 31. Desviación estándar y prueba de contraste de Fisher para los tratamientos: (1) control absoluto (2)control comparativo (3)M. anisopliae 1x106conidios/ml, (4) M. anisopliae 1x107conidios/ml, (5) M. anisopliae 1x108conidios/ml, (6) M. anisopliae 5x108conidios/ml, (7) M. anisopliae 1x109conidios/ml, (8) B. bassiana 1x106conidios/ml, (9) B. bassiana 1x107 conidios/ml (10) B. bassiana 1x108conidios/ml (11) B. bassiana 5x108conidios/ml (12) B. bassiana 1x109conidios/ml. Barras con la misma letra no difieren significativamente.

En los tratamientos evaluados se observó (Figura 31) el mayor porcentaje de mortalidad

en el tratamiento 11 (Beauveria bassiana a una concentración de 5x108 conidios/ml) con

un 90%, aunque al ser comparado con el tratamiento (6) con M. anisopliae manejado a la

misma concentración no presentan diferencias significativas de acuerdo con la prueba de

contrastes de Fisher.

La mortalidad absoluta de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus por la aplicación

de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae a diferentes

concentraciones (Figuras 32 y 33), mostró que a medida que se aumentaba la

concentración, la mortalidad también aumentaba. Se pudo observar en la Figura 31 que

no siempre la mayor concentración produce la mayor mortalidad, ya que la concetracion

de 5x108 conidios /ml produjo mayor mortalidad que la concentración de 1x109 conidios

/ml.

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(la

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)

108

En los tratamientos evaluados con el hongo B. bassiana, existe una tendencia al aumento

de la mortalidad producida por la concentración 5x108 conidios/ml con respecto a la

producida por 1x108 conidios/ml donde la prueba de Fisher muestra que no existen

diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (Figura 32). Un

comportamiento similar se encontró en los resultados obtenidos en la mortalidad de

larvas producida por el hongo M.anisopliae (Figura 33), para las concentraciones 1x108,

5x108 y 1x109 conidios/ml los porcentajes de mortalidad promedio fueron iguales,

encontrándose que no existen diferencias estadísticamente significativas entre los

tratamientos de acuerdo con la prueba de Fisher (p>0.05).

POR LA APLICACION DE Beauveria basssiana

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CONTROL ABSOLUTO CONTROL+H2O Beauveria bassiana 1x106 Beauveria bassiana 1x107

Beauveria bassiana 1x108 Beauveria bassiana 5x108 Beauveria bassiana 1x109

Figura 32. Porcentaje de mortalidad promedio de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el tiempo, por la aplicación de Beauveria bassiana a concentraciones de 1x106, 1x107 ,1x108, 5x108 y 1x109 conidios/ml.

La mayor mortalidad se presentó en el tratamiento con la cepa de B. bassiana a una

concentración de 5x108 conidios/ml, demostrándose una mayor velocidad mortalidad en

las larvas y un menor tiempo en alcanzar mortalidad en comparación con las otra

concentraciones evaluadas de B. bassiana. La cepa menos efectiva entre los

tratamientos de B. bassiana fue con la concentración 1x106 conidios/ml, demostrando que

las variables son dependientes una de la otra, donde ha mayor concentración mayor

mortalidad de la plaga.

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

Tiempo (días)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

109

Por este motivo, la concentración que siempre fue utilizada en campo fue 1x108

conidios/ml de B. bassiana y M. anisopliae, siendo altamente la concentración con mayor

eficacia sobre ninfas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en ganado Cebú,

convirtiéndose estos hongos entomopatógenos en una muy buena opción en el manejo

integrado de garrapatas.

Al analizar las curvas de mortalidad para los tratamientos de B. bassiana a una

concentración de 1x106 y 1x107 conidios/ml, podemos observar un comportamiento

irregular en la mortalidad de larvas, debido a que antes de alcanzar su fase exponencial

hay una pequeña fase estacionaria para los dos tratamientos (Figura 32). De acuerdo a

esto, se podría pensar que la susceptibilidad y la relación de los hongos

entomopatógenos con sus hospederos pueden ser afectadas por los nutrimentos

presentes en los insectos, los cuales son el medio para la propagación, dispersión y

persistencia de los hongos. En este período de adaptación de los hongos

entomopatógenos a su hospedero, cave comentar que durante la penetración del hongo

desde la cutícula del ácaro hasta el hemocele, la hifa queda inmersa en proteínas,

quitina, lípidos, melanina, difenoles y carbohidratos; algunos de ellos son nutrimientos

pero otros pueden inhibir su crecimiento, ya que el hospedero activa su sistema inmune a

través de procesos como la melanización, fagocitosis, nodulación y encapsulamiento

(Rodríguez et al., 1994; Ruíz et al., 2007). Podríamos entonces pensar, que en estos dos

tratamientos, la resistencia desarrollada por las larvas frente al proceso de infección

realizado por el hongo fue mayor en comparación a los otros tratamientos, donde no fue

tan marcado este comportamiento y para los cuales esta resistencia fue vencida en

menor tiempo por parte de los hongos. Posiblemente la virulencia de los hongos B.

bassiana y M. anisopliae puede estar relacionada con evitar o activar el sistema inmune

del insecto plaga así como también de los requerimientos nutricionales necesarios para el

crecimiento del hongo.

110

% DE MORTALIDAD DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophius) microplus EN EL TIEMPO POR LA APLICACION DE Metarhizium anisopliae

0

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TIEMPO

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CONTROL ABSOLUTO CONTROL+H2O Metarhizium anisopliae1x106Metarhizium anisopliae 1x107 Metarhizium anisopliae 1x108 Metarhizium anisopliae 5x108Metarhizium anisopliae 1x109

Figura 33. Porcentaje de mortalidad absoluta de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el tiempo, por la aplicación de Metarhizium anisopliae concentraciones de 1x106,1x107 ,1x108, 5x108 y 1x109 conidios/ml.

Los resultados obtenidos de mortalidad para los tratamientos de B. bassiana en este

ensayo fueron siempre mayores comparados con los encontrados con M. anisopliae,

demostrando una mayor velocidad de crecimiento bajo condiciones de laboratorio de éste

hongo. Esto lo demuestran algunos estudios realizados por Gindin y colaboradores

(2001), los cuales han demostrado una mayor eficacia del hongo entomopatógeno

Beauveria bassiana en la reducción de la población de larvas de Boophilus annulatus,

con porcentajes de mortalidad de 93.73% a una concentración de 1x107 conidios/ml,

comparada con la mortalidad producida por Metarhizium anisopliae, la cual fue de

80.51% manejando la misma concentración. Estas mortalidades son atribuidas a la rápida

penetración de la cutícula de la garrapata por el hongo y a la rápida invasión de los

tejidos del hospedero provocando altas mortalidades en menor tiempo con respecto a M.

anisopliae.

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

Tiempo (días)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

111

Aunque las diferencias en los porcentajes de mortalidad entre estos hongos no son tan

altas, se demuestra una ligero aumento en la mortalidad de larvas de Rhipicephalus

(Boophilus) microplus producida por B. bassiana en comparación a la encontrada con M.

anisopliae bajo condiciones de laboratorio (Figuras 32 y 33). Estos resultados concuerdan

con los estudios realizados por Kaaya y colaboradores (1996), quienes demostraron la

superioridad Beauveria bassiana para infectar larvas de R. appendiculatus. En este

trabajo de investigación se encontró que bajo condiciones de laboratorio B. bassiana

presentá una mayor infectividad sobre larvas de garrapata que Metarhizium anisopliae,

con mortalidades entre 75-95% para B. bassiana y 36-64% para M. anisopliae,

presentando diferencias estadísticamente significativas (α=0.05, (SW) P<F 7.715e-08,

(L) P<F 0.001871, (KW) P<F 0.01287). Estos resultados también evidencía un potencial

genético promisorio de B. bassiana para el control de la garrapata del ganado, el cual

debe ser asegurado con base en el desarrollo de nuevas formulaciones más compatibles

con el perfil fisiológico de esta especie.

De acuerdo al análisis de resultados de los ensayos evaluados, la mortalidad bajo

condiciones de laboratorio es mucho mas alta que la encontrada bajo condiciones de

campo, demostrándose un claro efecto inhibitorio de las condiciones ambientales

desfavorables sobre la viabilidad de las cepas de los hongos B. bassiana y M. anisopliae

al ser aplicadas en campo, por el contrario, en el laboratorio, estas condiciones están

controladas con el fin de estimular la germinación y crecimiento de los hongo,

encontrándose una mayor mortalidad que en campo. Es muy importante realizar nuevas

investigaciones, con el fin de evaluar diferentes formulaciones, que puedan ser utilizadas

para proteger a los hongos de las condiciones desfavorables del medio ambiente, las

cuales juegan un papel vital en la aplicación de estos microorganismos sobre la superficie

de los animales.

La mortalidad determinada para la concentración 1x108 conidios/ml de B. bassiana

presentó un 89% de mortalidad y para el hongo M. anisopliae presentó un 85% de

mortalidad de acuerdo con la prueba contrastes de Fisher (Anexo 8) estòs dos

tratamientos no presentaron diferencias estadísticamente significativas. Estos resultados

muestran que los dos hongos entomopatógenos presentan en condiciones de laboratorio

el mismo efecto patogénico sobre las larvas de Rhipicephalus. Los resultados obtenidos

en este ensayo de laboratorio difieren con los estudios realizados por Kirkland y

colaboradores (2004), en ninfas y adultos de la especie de garrapata Amblyomma

americanum y Amblyomma maculatum, con conidios y blastosporas de los hongos

entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae en condiciones de

112

laboratorio, mostraron a una concentración de 108 conidios/ml, una mortalidad del 90% en

garrapatas adultas del genero Amblyomma maculatum y del 10% en adultos de

Amblyomma americanum con B. bassiana. Con el hongo M. anisopliae en A. maculatum

y A. americanum, se presento una mortalidad del 60% y 10% respectivamente,

encontrándose diferencias entre los dos tratamientos.Esto puede deberse en primer lugar

a la susceptibilidad de las garrapatas en sus estados inmaduros y segundo a que algunas

especies de garrapatas muestran una diferente susceptibilidad a la infección por los

hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae y que la

habilidad de vencer la acción de los componentes fungistáticos presentes en la cutícula

de las garrapatas, esto podría disminuir la capacidad de infección y virulencia del hongo.

Algunos estudios han demostrado el efecto inhibitorio de algunos lípidos presentes en la

cutícula de las garrapatas sobre la geminación de los hongos entomopatógenos como M.

anisopliae (Sosa-Gómez et al., 1997).

En el análisis de resultados al observar el tratamiento 12 (B. bassiana a una

concentración de 1x109 conidios/ml), era la concentración probada mas alta, pero no

presentó el mayor porcentaje de mortalidad durante el ensayo, demostrándo que no

siempre la mayor concentración de un biológico produce la mayor mortalidad de una

población plaga como Rhipicephalus (Boophilus) microplus. La concentración probada

con mayor eficacia tanto para el hongo B. bassiana como para el hongo M. anisopliae

fue 5x108 conidios/ml presentando los porcentajes de mortalidad mas altos a los nueve

días de evaluación, esta investigación abre la posibilidad de buscar una concentración

ideal para el control de Rhipicephalus bajo condiciones de campo. En el desarrollo de

formulaciones de hongos entomopatógenos se busca una concentración mínima con

mayor eficacia con el fin de reducir los costos de producción.

Al comparar los porcentajes de mortalidad obtenidos en campo, con los obtenidos en este

ensayo de laboratorio, pudimos deducir que los estados inmaduros de las garrapatas R.

microplus son mucho más susceptibles que los estados adultos, por esto razón los

porcentajes de mortalidad en campo son menores que los porcentajes de mortalidad de

los ensayos en laboratorio. La posibilidad de controlar en campo los estados màs

juveniles de Rhipicephalus no parece ser económicamente rentable debido a que sería

necesario realizar la aplicación sobre el suelo para el control de larvas de Rhipicephalus,

por esta razón se busca un control de garrapatas en su fase parasítica por su fácil

manejo y aplicación para la explotación ganadera. Pero en este sentido, se debe evaluar

a futuro la relación beneficio/costo de nuevas tecnologías en el control de las formas no

parasíticas.

113

10.6.1. CONCENTRACIÓN LETAL CINCUENTA Y NOVENTA (CL 50 y CL90)

Para los hongos M. anisopliae y B. bassiana evaluados, a mayor concentración se

presentó mayor mortalidad de larvas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, lo cual mostró una respuesta de la concentración al tratamiento con estos

hongos. El análisis probit mostró para el hongo M. anisopliae una CL50 correspondiente a

la concentración de 8.16x104 conidios/ml y una CL90 con una concentración de 2.60x109

conidios/ml (Tabla 10); mientras que para el hongo B. bassiana mostró una CL50 con una

concentración de 1.36x103 conidios/ml y una CL90 con una concentración de 9.94x108

conidios/ml a los nueve días de evaluación con un límite de confianza del 95% (Tabla 11).

Estos resultados plantean la necesidad de utilizar concentraciones altas de estos hongos

entomopatógenos en campo para obtener la máxima eficacia de control. Estos resultados

difieren con los estudios realizados por Bittencourt y colaboradores (2004), sobre larvas

de las garrapata Rhipicephalus sanguineous y Anocentor nitens, donde se obtuvieron

para el hongo M. anisopliae una concentraciones letales 50 de 1,2 x 106 conidios/ml para

Anocetor y 1,8 x 108 conidios/ml para Rhipicephalus y concentraciones letales 90 de 1,8 x

107conidios/ml para Anocetor y 2,5 x 107 conidios/ml para Rhipicephalus. En este estudio

también se evaluaron las concentraciones letales para el hongo B. bassiana sobre las

larvas de estas garrapatas, donde la concentración CL 50 fueron 1.2 x 106 conidios/ml,

para Anocetor y 1.8 x 108 conidios/ml y para Rhipicephalus.

El análisis de resultados mostro, que los aislamientos de los hongos entomopatógenos B.

bassiana y M. anisopliae de los laboratorios LST, presentaban una alta virulencia

comparada con los aislamientos evaluados en los estudios realizados por Bittencourd

(2003) ya que nuestro ensayo mostro mediante el análisis probit una buena eficacia sin

utilizar la concentración mas alta en condiciones de laboratorio.

114

Tabla 10. Análisis Probit para el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae en el día final de

evaluación.

Procedimiento Probit Análisis Probit en (concentracion)

Probabilidad Concentracion Límites fiduciales

0.01 5.46E-04 4,73E-11 2,32E-02

0.45 2,95E+04 0.0009351 0.18938

0.50 8,16E+04 0.00406 0.41912

0.55 2,25E+05 0.01748 0.93509

0.85 3,58E+08 1,40E+07 1,54E+03

0.90 2,60E+09 7,31E+07 2,44E+04

0.91 4,20E+09 1,07E+03 4,83E+04

0.99 1,22E+13 5,17E+05 5,10E+09

Tabla 11. Análisis Probit para el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana en el día final de evaluación.

Procedimiento probit Análisis Probit en (concentracion)

Probabilidad Concentracion Límites fiduciales

0.01 3,11E-08 5,71E-22 1,24E-04

0.45 3,63E+02 4,21E-03 0.01360

0.50 1,36E+03 4,36E-02 0.03472

0.55 5,13E+03 4,49E-01 0.08905

0.85 7,52E+07 2,36E+06 3,45E+07

0.90 9,94E+08 2,40E+07 2,02E+04

0.91 1,85E+09 3,90E+07 5,79E+04

0.99 5,99E+13 6,82E+05 4,73E+17

La tendencia de la mortalidad de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a través del

tiempo, con concentraciones de 1x106, 1x107, 1x108, 5x108 y 1x109 conidios/ml, fue lineal,

presentando un alto coeficiente de correlación, donde a mayor concetracion se

presentaba mayor mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, por lo

que la tasa de mortalidad fue calculada directamente. La respuesta observada en las

curvas originales de mortalidad fue un comportamiento sigmoidal y las curvas fueron

ajustadas mediante Probit a una regresión lineal. En la regresión logarítmica de las

concentraciones para los hongos B. bassiana y M. anisoplia. Se puede observar que el

hongo B. bassiana presenta una mayor eficacia con una menor concentración que el

hongo M. anisopliae. Estos resultados evidencian el efecto patogénico de los hongos

evaluados sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus, además de modelar el

115

efecto de las diferentes concentraciones de estos hongos sobre las garrapatas, se pudo

observar la concentración mínima con mayor eficacia (Tablas 10 y 11) y los valores

previstos por el modelo, con el cual se podría determinar la concentración ideal para

obtener mortalidad en un número determinado de la garrapatas Rhipicephalus

(Boophilus) microplus por los aislamientos de los hongos entomopatógenos B. bassiana y

M. anisopliae, y crear a partir de este modelo una estrategia en el control integrado de

plagas.

10.6.2. TIEMPO LETAL CINCUENTA Y NOVENTA (TL 50 y TL90)

Se pudo observar (Figura 34) en las concentraciones probadas del hongo

entomopatógeno M. anisopliae que el tiempo letal 50 fue alcanzado por todas las

concentraciones en diferentes momentos después de la aplicación, donde la

concentración 1x109 conidios/ml, alcanzó un tiempo letal 50 al tercer día de evaluación,

lo cual indica que esta concentración presenta mayor eficacia que las otras 4 evaluadas

durante este ensayo. En la determinación del tiempo letal 90 de las concentraciones de

M. anisopliae mostró que solo las concentraciones 5x108 y 1x109 conidios/ml alcanzaron

un TL90 al sexto y octavo dia de evaluación respectivamente (Figura 35), con lo que

pudimos deducir que las concentraciones 1x106, 1x107 y 1x108 conidios/ml tienen poca

virulencia sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Estos tratamientos

presentaron diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con la prueba de

contrastes de Fisher (Anexo 11).

116

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 dia 7 dia 8 dia 9

Tiempo(dias)

Mor

talid

ad d

e la

rvas

1x109

5x108

1x108

1x107

1x106


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


Tiempo(dias)

Mor

talid

ad d

e la

rvas

1x109

5x108

1x108

1x107

1x106


1 2 3 4 5 6 7 8 9

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

) M

orta

lidad

de

larv

as (

%)

117

En las concentraciones evaluadas del hongo entomopatógeno B. bassiana se pudo

observar que el tiempo letal 50 fue alcanzado por las concentraciones 1x107, 1x108,

5x108 y 1x109 conidios/ml a diferentes momentos después de la aplicación (Figura 36),

donde la concentración 1x109 conidios/ml fue la primera en alcanzar un tiempo letal 50 al

tercer dìa de evaluación, lo cual indica que esta concentración presenta mayor eficacia

que las otras 4 evaluadas durante este ensayo. La concentración 1x106 conidios/ml

presentó de acuerdo a la prueba de contraste de Fisher diferencias estadísticamente

significativas con respecto a los demás tratamientos. En la determinación del tiempo letal

90 de las concentraciones de B. bassiana mostró que sólo las concentraciones 5x108 y

1x109 conidios/ml alcanzaron un TL90 al sexto y octavo dia de evaluación (Figura 37), con

lo que pudimos deducir que las concentraciones 1x106, 1x107 y 1x108 conidios/ml tienen

poca virulencia sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Estos tratamientos

presentaron diferencias estadísticamente significativas de acuerdo con la prueba de

contrastes de Fisher (Anexo 11).

TIEMPO LETAL 50 DE Beauveria bassiana

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


Tiempo (dias)

Mor

talid

ad

1x109

5x108

1x108

1x107

1x106


1 2 3 4 5 6 7 8 9

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

118

Los tiempos letales 50 de las concentraciones evaluadas de B. bassiana presentan una

diferencia considerable entre la concentración más baja 1x106 conidios/ml y la

concentración más alta 1x109 conidios/ml siendo TL50 a los tres días y seis días,

respectivamente. Esto podría indicar que a mayor concentración menor tiempo de

alcanzar una concentración letal sobre la plaga.

TIEMPO LETAL 90 DE Beauveria bassiana

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


Tiempo (dias)

Mor

talid

ad

1x109

5x108

1x108

1x107

1x106


En este ensayo se pudo observar la velocidad de crecimiento de los hongos

entomopatógenos sobre larvas de Rhipicephalus, donde se pudo deducir que la mayor

velocidad se presentó en la mayor concentración, siendo directamente proporcionales,

donde a mayor concentración se presentó mayor mortalidad. El ensayo mostró tanto en

las concentraciones del hongo B. bassiana como del hongo M. anisopliae que

presentaron diferencias estadísticamente significativas (α=0.05, (SW) P<F 7.715e-08, (L)

P<F 0.001871, (KW) P<F 0.01287) con respecto al control a los nueve días de

evaluación.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

119

10.7. EVALUACIÓN DE LA VIRULENCIA DE LAS CEPAS REA CTIVADAS DE LOS

HONGOS ENTOMOPATÓGENOS B. bassiana Y M. anisopliae:

Este ensayo se realizó con el fin de obtener un inóculo a partir de cultivos puros de la

cepa no formulada de M. anisopliae y B. bassiana (Figura 38) a una concentración de

1x108 conidios/ml, para luego ser aplicado sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus)

microplus y evaluar durante nueve días la mortalidad de larvas. Este ensayo se realizó

en condiciones de humedad, donde todos los días se humedecieron las cajas Petri con

agua destilada, para favorecer la germinación del hongo sobre larvas de R. microplus.

Figura 38. Aislamientos realizados y purificados de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae a partir de larvas infectadas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

Tanto Beauveria como Metarhizium pertenecen a la clase Hyphomycetes, dentro de la

división Deuteromycotina, la cual se caracteriza por producir sus conidios libres, en lugar

de estar encerradas dentro de un cuerpo fructífero. Esto permite que las esporas queden

inmediatamente disponibles para repetir el ciclo a partir de los insectos parasitados.

Además, los Hyphomycetes son generalmente más productivos en medios artificiales, de

ciclos más cortos y relativamente fáciles de producir en forma masiva, por lo cual no es

casualidad que estos dos géneros sean los más frecuentemente citados y utilizados en

patología de insectos (Alves, 1998). Por esta razón se facilito el aislamiento de los

hongos, a partir de los aislamientos de las garrapatas infectadas por los hongos para la

preparación del inóculo.

En el día final de evaluación, la respuesta de mortalidad promedio observada en larvas

de R. microplus con la cepa no formulada del hongo Beauveria bassiana fue del 79% y

con la cepa no formulada del hongo Metarhizium anisopliae fue del 62% (Figura 39 ),

estos resultados al ser comparados con el ensayo realizado en camara humeda, siendo

la respuesta de mortalidad a los nueve dias para la cepa no formulada del hongo B.

bassiana del 68 % y para la cepa no formulada del hongo M. anisopliae un 63%,

120

muestran mayor eficacia las cepas reactivadas, posiblemente al ser estas reactivadas

adquieran mayor virulencia, esto pude deberse a la estimulación del metabolismo de los

hongos por el contacto con el insecto, a una mayor especificidad por su hospedero y

también por la inducción de grupos enzimáticos particulares (Valencia, 2002), además es

posible que las cepas utilizadas en el ensayo de cámara húmeda no hallan sido

reactivadas por algún tiempo y probablemente se halla perdido la viabilidad de algunas

esporas. Al comparar los resultados se pudo observar en este ensayo y en el ensayo

en cámara humeda, que el hongo B. bassiana presento porcentajes de mortalidad mas

altos que el hongo M. anisopliae, con lo que se podría deducir que el hongo B. bassiana

en condiciones favorables presenta una mayor eficacia que M. anisopliae.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


TIEMPO

% D

E M

OR

TA

LID

AD

DE

LA

RV

AS

CONTROL+ H2O R 1 Metarhizium anisopliae 1x10 8 R2 Beauveria bassiana 1x10 8 R3

Figura 39. Porcentaje de mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a partir de inóculos realizados de B. bassiana y M. anisopliae, reaislados de larvas tratadas en el laboratorio, a una concentración de 1x108 conidios/ml.

En este ensayo se observó (Figura 39) la disminución en el tiempo requerido para la

adaptación a las condiciones de su hospedero por parte de los hongos entomopatógenos,

encontrándo mortalidades mayores al 12% a partir del día dos. Esta mortalidad es

representativa siendo un producto biologico, que necesita aproximadamente 5 días para

producir infección y causar la muerte sobre su hospedero (Valencia, 2002). Lo anterior,

demuestra una mayor eficacia de las cepas reactivadas de los hongos entomopatógenos

M. anisopliae y B. bassiana en comparación con las cepas utilizadas en los ensayos de

Tiempo (días)

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

121

cámara humeda y seca, las cuales probablemente han sido guardadas por mucho

tiempo sin reactivarse.

Al igual que los anteriores ensayos la mortalidad para el tratamiento control en el

laboratorio tuvo un comportamiento estable en el tiempo con una mortalidad del 16%,

està mortalidad concuerda con la mortalidad natural encontrada bajo condiciones de

campo. Se observó una pequeña disminución en la mortalidad natural de las larvas

control del ensayo con las cepas reactivadas al ser comparadas con los ensayos de

laboratorio bajo cámara húmeda y seca con mortalides del 20%. Esto podría deberse a

las posibles condiciones de estrés de la cría de larvas de la garrapata R. microplus a las

que fue sometida en el momento de la aplicaciòn.

Los resultados obtenidos en este ensayo, concuerdan con los estudios realizados por

Frazzon (2000), los cuales encontraron mayores rendimiento en las cepas del hongo

Metarhizium anisopliae que fueron reaisladas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus y luego aplicadas sobre teleoginas, que de las cepas que no fueron

reactivadas, esto posiblemente debido a la estimulación de toda la maquinaria enzimática

y mecanismos que intervienen en el proceso de infección del hongo, aumentando la

especificidad y virulencia del hongo por su hospedero. Otros estudios realizados por

Guedes y colaboradores (2000), en Brasil, quienes evaluaron 12 aislamientos del hongo

Metarhizium anisopliae, encontraron que el aislamiento más patógeno causó un 100% de

mortalidad a una dosis de 108 conidios /ml; los aislamientos a partir de garrapatas

infectadas probaron ser más virulentos que los cultivados en medio sintético.

Los resultados de mortalidad corregida obtenidos (Figura 40) para este ensayo muestran

el mayor porcentaje de mortalidad en el tratamiento 3 (B. bassiana cepa no formulada).

Este resultado complementa lo expresado anteriormente en donde se demuestra la

superioridad del hongo B. bassiana bajo condiciones de laboratorio. En la grafica de

mortalidad corregida para este ensayo, se puede observar una mayor velocidad en la

mortalidad producida por el hongo B. bassiana, demostrándose una mayor velocidad de

crecimiento de éste hongo bajo condiciones de laboratorio; diferente a lo encontrado en

los ensayos de campo en donde la mayor mortalidad es producida por M. anisopliae.

También se puede observar que los resultados encontrados en la mortalidad corregida de

larvas difieren muy poco de los obtenidos en la mortalidad absoluta, debido a la poca

mortalidad presentada en el tratamiento control.

122

microplus POR LA APLICACIÓN DE INOCULO DE LOS HONGOS B. bassiana Y M. anisopliae

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


TIEMPO

% D

E M

OR

TA

LID

AD

DE

LA

RV

AS

Metarhizium anisopliae 1x10 8 Beauveria bassiana 1x10 8

Figura 40. Porcentaje de mortalidad corregida (Abbott) de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus a partir de inóculos realizados de B. bassiana y M. anisopliae, reaislados de larvas tratadas en el laboratorio, a una concentración de 1x108 conidios/ml.

El comportamiento de crecimiento de los hongos entomopatógenos observado en la

Figura 41 de mortalidad corregida de larvas de Rhipicephalus para este ensayo, difiere

con el comportamiento de los anteriores ensayos, debido a que hacia los días ocho y

nueve no se observa la fase estacionaria típica del crecimiento de los hongos

entomopatógenos, evidenciada por los anteriores ensayos. Este comportamiento sugiere

que las cepas reactivadas presentan una mayor eficacia a largo plazo y velocidad de

acción sobre las larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

De acuerdo al análisis realizado a los resultados obtenidos en los ensayos evaluados en

éste trabajo, la mortalidad bajo condiciones de laboratorio es mucho más alta que la

encontrada en campo, demostrándose un claro efecto inhibitorio de las condiciones

ambientales desfavorables sobre la viabilidad de las cepas cuando éstas aplicadas

directamente sobre los animales. Por el contrario, en el laboratorio estas condiciones

están controladas con el fin de estimular la germinación y crecimiento de los hongos,

encontrándose una mayor mortalidad.

Mor

talid

ad d

e la

rvas

(%

)

Tiempo (días)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

123

En la observación de láminas infectadas al miroscopio, se onservaron larvas infectadas

por B. bassiana (Figura 41) y M. anisopliae (Figura 42), donde se pudo observar el

crecimiento de los hongos sobre las larvas de Rhipicephlaus (Boophilus) microplus. Se

observaron esporas y cuerpos hifales. En las láminas de los tratamientos control (Figura

43), donde se observó que las larvas de R. microplus no presentaban ningún

microorganismo que pudiera causar su muerte.

Figura 41. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo B. bassiana

Figura 42. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus infectadas por el hongo M. anisopliae

Figura 43. Larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en los tratamientos control .

124

11. CONCLUSIONES

11.1. En el presente estudio se encontró variabilidad en la respuesta de mortalidad de las

cepas no formuladas y formuladas de los hogos entomopatógenos B. bassiana y M.

anisopliae sobre larvas y ninfas de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

11.2. La mayor eficacia en campo se presentó con la cepa formulada del hongo

Metarhizium anisopliae, con una mortalidad promedio de ninfas de la garrapata

Rhipicephalus (Boophilus) microplus del 69% y una mortalidad corregida del 60%.

11.3. Al evaluar la mortalidad de larvas de Rhipicephalus en cámara húmeda bajo

condiciones de laboratorio, los porcentajes de mortalidad promedio más altos se

presentaron en la cepa formulada del hongo B. bassiana. Se comprobó que para las

cepas de los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae su respuesta de

patogenicidad y niveles de virulencia depende de factores ambientales como la humedad,

temperatura.

11.4. La CL50 para el hongo M. anisopliae fue de 8.16x104 conidios/ml y una CL90 de

2.60x109 conidios/ml a los nueve días de evaluacion con un límite de confianza del 95%,

mediante este analisis se mostró una buena eficacia sin utilizar la concentración mas alta.

11.5. La CL50 para el hongo B. bassiana fue de 1.36x103 conidios/ml y una CL90 de 9.94 x

108 conidios/ml a los nueve días de evaluación con un límite de confianza del 95%,

mostrando que a mayor concentración se presentaba mayor mortalidad de larvas de

Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

11.6. Para el hongo B.bassiana el tiempo letal 50 (TL50) fue alcanzado por las

concentraciones 1x107, 1x108, 5x108 y 1x10 conidios/ml en diferentes momentos

despues de la aplicación, donde la concentración 1x109 conidios/ml fue la primera en

alcanzar un tiempo letal 50 al tercer día de evaluación. La concentración 1x106

conidios/ml no alcanzó en ningún momento el (TL50). Esto podría indicar que a mayor

concentración se requiere un menor tiempo para alcanzar mortalidad de la plaga. El

tiempo letal (TL90) de las concentraciones evaluadas del hongo B. bassiana mostró que

sólo las concentraciones 5x108 y 1x109 conidios/ml alcanzaron un TL90 al sexto y octavo

día de evaluación, respectivamente.

125

11.7. Para el hongo M. anisopliae el tiempo letal 50 (TL50) fue alcanzado por todas las

concentraciones en diferentes momentos después de la aplicación, donde la

concentración 1x109 conidios/ml fue la primera en alcanzar un tiempo letal 50 al tercer día

de evaluación. El tiempo letal 90 de las concentraciones evaluadas del hongo M.

anisopliae mostró que sólo las concentraciones 5x108 y 1x109 conidios/ml alcanzaron un

TL90 al sexto y octavo día de evaluación, respectivamente. Estos resultados evidencian la

virulencia de los hongos evaluados sobre larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus,

mostrando que a una mayor concentración menor tiempo en alcanzar la mortalidad de la

plaga.

11.8. El estado de desarrollo de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus

evaluado más susceptible a los hongos entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae es

el larval. Esto favorece el manejo integrado del artrópodo pues se reflejaría en un menor

consumo del producto.

11.9. Al evaluar indirectamente la susceptibilidad de las teleoginas a la infección de

Metarhizium anisopliae y Beauveria bassiana, se demostró que éstos hongos tienen la

capacidad de atacar este estado de desarrollo de la garrapata aunque con una menor

eficacia que en estados inmaduros (larvas).

11.10. Se confirmó en este trabajo de investigación que los hongos entomopatógenos

Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae pueden producir mortalidad en poblaciones

de Rhipicephalus (Boophilus) microplus.

11.11. En conclusión los resultados encontrados en este trabajo muestran que los hongos

entomopatógenos B. bassiana y M. anisopliae presentaban diferentes grados de

virulencia en las concentraciones evaluadas sobre larvas de la garrapata Rhipicephalus


126

12. RECOMENDACIONES

La utilidad de los hongos entomopatógenos en programas de manejo de garrapatas,

dependerá de las características que afecten su funcionamiento en pruebas de campo.

Pruebas de virulencia en campo indicaran la habilidad de los hongos para infectar

múltiples estados de desarrollo, y la capacidad para diseminarse horizontalmente dentro

de la población de su hospedero. Las condiciones experimentadas en campo son mucho

más variables que las encontradas en laboratorio; esto podría mostrar diferencias

representativas en los resultados encontrados en los dos escenarios. La viabilidad de los

conidios de los hongos también disminuiría rápidamente bajo condiciones de campo.

Uno de los grandes inconvenientes que presenta esta alternativa son los altos costos que

representa aplicar los productos biológicos ante la extensión de los terrenos de las fincas

ganaderas, siendo una alternativa poco llamativa para los productores. Así mismo el

riesgo que podría representar estos microorganismos para los artrópodos no plaga

presentes en los pastos, principalmente por transmisión horizontal de los conidios de los

hongos. La principal ventaja que tiene esta alternativa, es el control de la garrapata antes

de subir al animal, y evitar con esto la pérdida de sangre y la transmisión de

enfermedades al ganado.

Aunque algunos estudios han reportado resultados de alta mortalidad de teleoginas por

la infección provocada por hongos entomopatógenos, es claro que este no es el estado

más susceptible de ser atacado, posiblemente debido al tiempo de permanecia sobre el

animal y ser el estado de desarrollo más avanzado; a su vez, es un estado crítico ya que

provoca pérdida de sangre y posible la transmisión de enfermedades a su hospedero.

Estudios realizados por Frazzon et al, 2000, evaluaron los efectos del hongo

entomopatógeno Metarhizium anisopliae sobre teleoginas de Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, encontrando una alta susceptibilidad de este estado de desarrollo al ataque

del hongo. En este estudio se obtuvó mortalidades del 100% con una concentración de

1x107 conidios/ml, demostrando con esto el gran potencial que tiene M. anisopliae para

controlar diferentes estados de desarrollo de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus)

microplus, siendo una excelente alternativa en programas de manejo integrado de

garrapatas. Similares resultados fueron obtenidos por Kaaya et al., 1996, encontrando

una mortalidad del 100% de teleoginas de Ixodes scapularis expuestas a los conidios del

hongo M. anisopliae. A estos resultados de investigación básica, habría que agregar

futuros estudios sobre esquemas de manejo en campo y de Manejo Integrado de

127

Garrapatas (MIG), que permitan incorporar estos hallazgos a modelos prácticos de

manejo de ectoparásitos en los hatos ganaderos a gran escala.

Este manejo integrado de garrapatas, implica el uso conjunto de diferentes métodos de

control, integrados de tal manera que los costos sean reducidos y que la combinación de

ellos produzca mejores resultados que su uso por aislado. Los métodos de control

recomendados para integrar en el manejo de garrapatas son el control biológico,

vacunación, manejo de resistencia del hospedero y las prácticas culturales (manejo del

hábitat). Cuando se implementan programas de manejo de garrapatas basados

únicamente en un control químico, podremos obtener mortalidades altas en poco tiempo,

aunque estas mortalidades pueden disminuir en poco tiempo, por el desarrollo de

resistencia por parte d ela garrapata.

Cuando los programas de manejo de garrapatas incluyen agentes de control biológico,

se alcanzan mortalidades significativas en un mayor rango de tiempo pero con un alto

período de protección en la explotación. Al integrar las dos alternativas, se logra

relacionar dos conceptos fundamentales en el manejo de poblaciones, como lo son la

velocidad y residualidad en el control de la plaga. Esto se podría complementarse

mediante la implementación de un manejo cultural en la explotación ganadera; como lo

son la rotación de praderas cada 30 días como mínimo, con el fin de interrumpir el ciclo

de vida de la garrapata durante su fase no parasítica (vida libre). Para la utilización de

esta práctica es necesario conocer en cada zona, el período de sobrevivencia de las

larvas en las pasturas para así establecer el tiempo de descanso de las mismas. En

algunas zonas de Colombia por ejemplo, en épocas cálidas y secas, las larvas sólo

pueden sobrevivir sobre las hojas de los pastos entre cuatro y seis semanas. Si una

pradera se deja libre de ganado durante este período y se tratan los animales antes de su

reintegro a la pradera, se reducirá enormemente la necesidad de tratamiento (Herrera y

Romero, 1995).

Los efectos patogénicos tienden a incrementar a medida que aumenta la dosis del hongo,

es sugerido entonces de acuerdo a lo estudios de laboratorio realizados en esta

investigación la utilización de ≥1x107 conidios/ml. Las concentraciones que demostraron

ser efectivas para el manejo de garrapatas en este trabajo, concuerdan con las utilizadas

para el manejo de otros artrópodos plaga de cultivos comerciales en el país.

128

Un aspecto muy interesante que ha sido demostrado por muchos autores es la

compatibilidad que existe entre Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae con

compuestos químicos acaricidas convencionales que son utilizados para el control de

garrapatas. Estos resultados son promisorios, debido a que se podría usar mezclas de

compuestos acaricidas químicos con biológicos para el manejo de las garrapatas y

disminuir de esta forma la posibilidad de adquirir resistencia.

Las altas mortalidades producidas por los hongos entomopatógenos B. bassiana y M.

anisopliae sobre las poblaciones de garrapatas, resultan en la supresión de las

infestaciones y de las enfermedades transmitidas por éstas. Este tipo de control reduce

en forma significativa la aplicación de acaricidas químicos y en el uso de drogas

curativas para estas enfermedades, reduciendo de esta forma el impacto ambiental

ocasionado por estas sustancias, el riesgo de adquirir resistencia por parte de la plaga y

las pérdidas económicas en la industria pecuaria, de esta forma obtener una mayor

rentabilidad en las explotaciones ganaderas del país.

Es importante realizar nuevas investigaciones, con el fin de evaluar diferentes

formulaciones, que puedan ser utilizadas para proteger a los hongos de las condiciones

desfavorables del medio ambiente, las cuales juegan un papel vital en la aplicación de

estos microorganismos sobre la superficie de los animales.

129

13. GLOSARIO

Acaricidas; Los acaricidas se encuentran incluidos en la clasificación general de los

plaguicidas. Son aquellas sustancias químicas que son especialmente efectivas en el

combate de los ácaros y las garrapatas.

Acetilcolina: neurotransmisor liberado por el sistema nervioso de los insectos, el cual

participa en la regulación de impulsos nerviosos.

Babesia: parásito de la sangre transmitido por varias especies de garrapatas al ganado

bovino.

Blastospora: Tipo de espora de los hongos que se reproducen asexualmente por un

proceso específico de división celular conocido como gemación. Este proceso de división

implica la producción de nuevo material celular proveniente de la superficie de la

blastospora. Cuando el brote o yema ha crecido y se encuentra en su tamaño óptimo, se

suscita la división celular y se forma un tabique o septo entre las dos células.

Carbamatos: Son compuestos quimicos que presentan un efecto neurotoxico en sus

hospederos. Este tipo de sustancias son muy utilizadas en el control de poblaciones de

garrapatas en ganado bovino.

Concentración Letal 50: Es la concentración, obtenida por estadística, de una sustancia

de la que puede esperarse que produzca la muerte, durante la exposición o en un plazo

definido después de ésta, del 50% de los animales expuestos a dicha sustancia durante

un período determinado. El valor de la CL50 se expresa en peso de sustancia por unidad

de volumen de aire normal (miligramos por litro, mg/L).

Control microbiano: Mecanismo por el cual se reducen las poblaciones de organismos

plaga a traves de microorganismos.

Cutícula: Capa cerosa sobre la superficie externa de una planta o de un insecto, que

tiende a evitar la pérdida de agua.

Dosis Letal 50: Dosis individual de una sustancia que provoca la muerte del 50% de la

población animal debido a la exposición a la sustancia por cualquier vía distinta a la

inhalación. Normalmente expresada como miligramos o gramos de material por kilogramo

de peso del animal.

Endectocidas: Compuestos quimicos reguladores del crecimiento.

Enzootico: Presenta constante la enfermedad o agente infeccioso en los animales de un

área geográfica.

Epizootico : Enfermedad generalizada en una población a manera de epidemia.

Esterasas: Enzimas que catalizan reacciones de hidrólisis, que permiten que algunos

insectos puedan ser resistentes a la aplicación de algunos insecticidas.

130

Fagocitosis: Proceso de ingestión de material particulado, como bacterias, esporas,

realizado por organismos con un sistema inmune desarrollado.

FAO: organización de alimentos y agricultura

Fertilidad : Porcentaje de eclosión de huevos.

Fecundidad: Número de huevos por hembra.

Fenilpirazoles:

Gen: Unidad hereditaria; segmento de DNA que codifica una determinada proteína.

Granulocitos: Son células de la sangre caracterizadas por los modos de colorear los

orgánulos de su citoplasma, en microscopía de luz. También se les conoce como

leucocitos polimorfonucleares, debido a las formas variables de núcleo que pueden

presentar. Su núcleo suele estar lobulado en varios segmentos.

Haustorio: Hifa especializada por la cual los hongos y algunas plantas parasitas extraen

alimento de su hospedero.

Hemocitos: Elementos circulantes de la hemolinfa, que ayudan al hospedero a

defenderse de agentes extraños.

Hemolinfa: Sistema circulatorio de los insectos (sangre de los insectos)

Hibridación; formación natural o construcción artificial de una molécula de acido nucleico

dúplex (doble) por apareamiento de bases complementarias entre dos cadenas de acido

nucleico procedentes de distintas fuentes.

Hidrólisis: Descomposición de un polímero en unidades mas pequeñas, generalmente

monómeros, por adición de agua; digestión.

Hidrocarburo: Compuesto que contiene solo átomos de carbono e hidrógeno.

Hifa: Unidad vegetativa estructural de los hongos.

Hongo: Órganismo eucariota no fototrofo de pared celular rígida.

Inmunidad: Capacidad de un organismo para resistir alguna infección.

Lípido: Molécula orgánica no soluble en agua importante en la cutícula de insectos.

Lisosoma: Órgano celular que contiene enzimas digestivas.

Metabolismo: Suma total de las reacciones químicas que ocurren en un organismo

MIP: Manejo Integrado de Plagas

Organoclorados: Es un compuesto químico orgánico, es decir, compuesto por un

esqueleto de átomos de carbono, en el cual, algunos los átomos de hidrógeno unidos al

carbono, han sido reemplazados por átomos de cloro, cuya estabilidad química lo

convierte en ingrediente de plaguicidas.

Pared celular : Estructura relativamente rígida que encierra las células de plantas,

hongos, muchos protistas y la mayoría de las bacterias. La pared celular brinda a estas

células su forma y limita su expansión en diferentes medios.

Patogenicidad: Capacidad que presenta un organismo para producir enfermedad.

131

Patógeno: Organismo que produce enfermedad.

Profenoloxidasas: Enzimas proteolíticas que hacen parte del sistema inmune de

insectos.

Subtilisinas: Enzimas proteoliticas producidas principalmente por Bacillus subtilis.

Teleogina: Hembra adulta de la garrapata.

Teratogenicidad : Se refiere a las malformaciones fetales macroscópicas que se

producen por efecto de la exposición a estos contaminantes durante los primeros meses

de vida intrauterina. Estas son muy evidentes macroscópicamente o bien por la

sintomatología clínica a que dan lugar, lo cual facilita la identificación del agente causante

que originó el efecto durante la vida embrionaria o fetal.

Tripsina: Enzima que digiere proteínas.

Tubos de malpighi: Son órganos excretores propios de arácnidos e insectos.

Virulencia: Es el grado patogénico, nocivo y violento de un microorganismo, como una

bacteria, hongo o virus), o en otras palabras, la capacidad de un microbio de causar

enfermedad.

132

14. LITERATURA CITADA

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144

15. ANEXOS

ANEXO 1.

FICHAS TECNICAS DE LOS PRODUCTOS FORMULADOS

AgroNova WG

Composición garantizada Ingrediente Activo: Beauveria bassiana (Cepa DSM 14943) Concentración : Cada gramo contiene 2.5 x 1010 (25 mil millones) de Conidiosporas viables. Formulación: Gránulos Dispersables en agua (WG). MODO DE ACCIÓN AgroNova Actúa por contacto con el insecto. El producto además de causar una alta mortalidad de la plaga, altera sus hábitos alimenticios y su vigor y disminuye el número de las nuevas generaciones. AgroNova protege mucho antes de la muerte de la plaga por la infección invasiva que produce en ella, lo que deteriora muy rápidamente su capacidad de hacer daño. MOMENTO DE APLICACIÓN AgroNova debe aplicarse siempre al inicio de la infestación, a la aparición de primeros estadios de la plaga y en estadios expuestos al contacto con el producto. Antes de aplicar el producto asegúrese que no se encuentren residuos de otros productos en los tanques o canecas de mezcla, ni en las mangueras de aplicación, para lo cuál se recomienda lavarlos varias veces con abundante agua. PREPARACION DE LA MEZCLA AgroNova ® se debe remojar durante 10 minutos en una pequeña cantidad de agua (20 g / litro de agua). Después agite vigorosamente la mezcla y complete el volumen de agua a emplear en la aplicación. Después de realizar la mezcla con agua se debe aplicar el producto en el menor tiempo posible. Si el volumen de la mezcla es muy grande y toma varias horas, agite la mezcla periódicamente.

INTEGRABILIDAD

AgroNova ® puede ser incorporado en programas de manejo integrado de plagas y enfermedades, en rotación con extractos botánicos y productos agroquímicos. No mezcle AgroNova ® con fungicidas químicos. Consulte las tablas de integrabilidad con el Departamento Técnico de LST S.A. PRESENTACIONES: En granulo dispersable (WG) en empaques de 500 gramos, 200 gramos y 125 gramos.

PRODUCIDO Y FORMULADO POR:

LIVE SYSTEMS TECHNOLOGY S.A – LSTS.A, Bogotá, Colom bia

145

ANEXO 1.

(Continuación)

DeepGreen

COMPOSICIÓN GARANTIZADA Ingrediente Activo: Metarhizium anisopliae (Cepa DSM 15168) Concentración : Cada mililitro contiene 1 x 109 (1000 millones) de Conidiosporas viables. Formulación : Suspensión Concentrada (SC) en aceite emulsionable en agua MODO DE ACCIÓN DeepGreen Actúa por contacto con el insecto. Por lo tanto la aplicación debe hacerse dirigida hacia donde se ubica la plaga y hacia las áreas de desplazamiento de esta. Para aspersiones sobre follaje o frutos, deben usarse boquillas de baja descarga, alta nebulización (microgotas) y alta turbulencia. La aplicación debe tener muy buen cubrimiento, es decir, alto número de microgotas por unidad de área, para aumentar la probabilidad del contacto con el cuerpo del insecto. Para uso en suelo puede aplicarse por drench o por inyección, según el caso. Consulte al técnico. MOMENTO DE APLICACIÓN DeepGreen debe aplicarse siempre al inicio de la infestación, a la aparición de primeros estadios de la plaga y en estadios expuestos al contacto con el producto. Para aplicaciones mas tardías, aumente la dosis y la frecuencia de aplicación teniendo siempre en cuenta que la plaga debe estar expuesta al contacto con el producto. Antes de aplicar el producto asegúrese que no se encuentren residuos de otros productos en los tanques o canecas de mezcla, ni en las mangueras de aplicación, para lo cuál se recomienda lavarlos por lo menos varias veces con abundante agua. PREPARACION DE LA MEZCLA DeepGreen se usa en dosis de 2 ml de producto por litro de mezcla de aplicación. Coloque primero parte del volumen de agua y luego agregue el producto en la medida correspondiente a la aplicación que vaya a realizar. Enjuague los recipientes que se hayan untado de producto, vertiendo el enjuague sobre la mezcla a aplicar. Mezcle muy bien. Agregue el agua restante para ajustar la dosis correcta. Agite de nuevo la mezcla total hasta que quede homogénea y emulsionada. Aplique inmediatamente. No guarde mezcla para ser aplicada mas tarde. Agite periódicamente la mezcla durante la aplicación si esta toma más de media hora.

COMPATIBILIDAD : Puede ser usado en programas de manejo integrado de plagas MIP y manejo integrado de cultivos MIC, en rotación con otros plaguicidas. Consulte la tabla de compatibilidades de DeepGreen ® con otros insumos agrícolas en el Departamento Técnico de LST o con el distribuidor.

FITOTOXICIDAD: DeepGreen ® no es fitotóxico, ni fitopatogeno. PRESENTACIONES: En suspensión concentrada (SC) en envases de 1litro.

PRODUCIDO Y FORMULADO POR: LIVE SYSTEMS TECHNOLOGY S.A – LSTS.A, Bogotá Colomb ia

146

ANEXO 2.

MODELO ESTADISTICO

Shapiro Wilk Ho: Si hay normalidad si p<0.05 rechazo la Ho si p>0.05 acepto la Ho Levene Ho: Si hay homogeneidad de varianzas Si p< 0.05 rechazo la Ho Si p >0.05 acepto la Ho ANOVA Ho: No hay diferencias significativas Si p<0.05 rechazo la Ho Si p > 0.05 acepto la Ho KruskalWallis Ho: No hay diferencias significativas Si p<0.05 rechazo la Ho Si p>0.05 acepto la Ho Bartlett Ho: Si hay homogeneidad de varianzas Si p< 0.05 rechazo la Ho Si p >0.05 acepto la Ho SI HAY HOMOGENIDAD ANOVA SI ACEPTO Ho BARLETT (HOMOGENIDAD) NO HAY HOMOGENIDAD SHAPIRO WILK KRUSKAL WALLIS (Normalidad) SI HAY HOMOGENIDAD ANOVA NO ACEPTO Ho LEVENE NO HAY HOMOGENIDAD KRUSKAL WALLIS

147

ANEXO 3.

ESTADÍSTICA CAMPO: COMPARACIÓN ENTRE CONTROLES Y CEPAS FORMULADAS Y NO FORMULADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGERNOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae Shapiro-Wilk normality test data: resultado$residuals W = 0.9753, p-value = 0.005327

-2 -1 0 1 2

-50

5

Normal Q-Q Plot

Theoretical Quantiles

Sam

ple

Qua

ntile

s

EL VALOR DE P EN SHAPIRO WILK (SW) FUE <0.05 RECHAZO Ho LO QUE INDICA QUE NO HAY NORMALIDAD ENTRE LOS DATOS. CONTINÚA LA PRUEBA DE LEVENE (L). > levene.test(values,ind) Levene's Test for Homogeneity of Variance Df F value Pr(>F) group 17 3.5759 1.304e-05 *** 144 --- Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 LEVENE EL VALOR DE P FUE < A 0.05 RECHAZO Ho LO QUE ME INDICA QUE NO HAY HOMOGENIDAD ENTRE LAS VARIANZAS. CONTIMUA KRUSCAL WALLIS (KW). > kruskal.test(values~ind,data=datos) Kruskal-Wallis rank sum test data: values by ind Kruskal-Wallis chi-squared = 41.55, df = 17, p-value = 0.0007786 EL VALOR DE P EN KRUSCAL WALLIS (KW) FUE <0.05 RECHAZO Ho INDICA QUE HAY DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS.

148

ANEXO 3.

(Continuación)

ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA Summary Statistics for MORTALIDAD Count = 162 Average = 9,33333 Variance = 9,62733 Standard deviation = 3,10279 Minimum = 4,0 Maximum = 20,0 Stnd. skewness = 5,76724 Stnd. kurtosis = 3,29095 Sum = 1512,0 The StatAdvisor This table shows summary statistics for MORTALIDAD. It includes measures of central tendency, measures of variability, and measures of shape. Of particular interest here are the standardized skewness and standardized kurtosis, which can be used to determine whether the sample comes from a normal distribution. Values of these statistics outside the range of -2 to +2 indicate significant departures from normality, which would tend to invalidate any statistical test regarding the standard deviation. In this case, the standardized skewness value is not within the range expected for data from a normal distribution. The standardized kurtosis value is not within the range expected for data from a normal distribution. MEDIDAS DE TENDENCIA CENTRAL. Confidence Intervals for MORTALIDAD 95,0% confidence interval for mean: 9,33333 +/- 0,481417 [8,85192,9,81475] 95,0% confidence interval for standard deviation: [2,79771,3,48317] INTERVALOS DE CONFIANZA. Summary Statistics for MORTALIDAD TRATAMIENTO Count Average Variance Standard deviation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 27 9,22222 1,17949 1,08604 2 27 8,37037 1,24217 1,11452 3 27 12,037 22,6524 4,75946 4 27 9,92593 10,4558 3,23355 5 27 8,2963 7,29345 2,70064 6 27 8,14815 5,2849 2,29889 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 162 9,33333 9,62733 3,10279 TRATAMIENTO Minimum Maximum Stnd. skewness Stnd. kurtosis ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 7,0 12,0 1,04966 0,748337 2 7,0 10,0 0,556509 -1,32116 3 5,0 20,0 -0,0918993 -1,52703 4 4,0 17,0 1,16871 0,33051 5 5,0 14,0 1,2917 -0,522183 6 5,0 12,0 0,760392 -1,20406 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 4,0 20,0 5,76724 3,29095

149

ANEXO 3.

(Continuación)

TRATAMIENTO Sum ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 249,0 2 226,0 3 325,0 4 268,0 5 224,0 6 220,0 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 1512,0 This table shows various statistics for MORTALIDAD for each of the 6 levels of TRATAMIENT. The one-way analysis of variance is primarily intended to compare the means of the different levels, listed here under the Average column. CONTRASTE: MUESTRA LAS DIFERENCIAS MÍNIMAS SIGNIFICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS. Multiple Range Tests for MORTALIDAD by TRATAMIENTO -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD TRATAMIENTO Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 27 8,14815 X 5 27 8,2963 X 2 27 8,37037 X 1 27 9,22222 XX 4 27 9,92593 X 3 27 12,037 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 0,851852 1,52229 1 - 3 *-2,81481 1,52229 1 - 4 -0,703704 1,52229 1 - 5 0,925926 1,52229 1 - 6 1,07407 1,52229 2 - 3 *-3,66667 1,52229 2 - 4 *-1,55556 1,52229 2 - 5 0,0740741 1,52229 2 - 6 0,222222 1,52229 3 - 4 *2,11111 1,52229 3 - 5 *3,74074 1,52229 3 - 6 *3,88889 1,52229 4 - 5 *1,62963 1,52229 4 - 6 *1,77778 1,52229 5 - 6 0,148148 1,52229 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. The StatAdvisor This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others. The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of means. An asterisk has been placed next to 8 pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level. At the top of the page, 3 homogenous groups are identified using columns of X's. Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences. The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure. With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals 0.

150

ANEXO 3.

(Continuación)

COMPARACIÓN ENTRE CONTROLES Y CEPAS FORMULADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae Shapiro-Wilk normality test data: resultado$residuals W = 0.962, p-value = 0.01679

-2 -1 0 1 2

-50

5

Normal Q-Q Plot


Sam

ple

Qua

ntile

s

EL VALOR DE SHAPIRO WILK (SW).05 LO QUE INDICA QUE RECHAZO Ho Y ME INDICA QUE LOS DATOS NO TIENEN UNA DISTRIBUCIÓN NORMAL. CONTINUO (L) > levene.test(values,ind) Levene's Test for Homogeneity of Variance Df F value Pr(>F) group 8 3.9627 0.0006227 *** 72 Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 EL VALOR DE P EN LEVENE FUE <0.05 POR ESTO RECHAZO Ho LO QUE ME INDICA QUE NO HAY HOMOGENIDAD ENTRE LAS VARIANZAS Y REALIZÓ KRUSCAL. > kruskal.test(values~ind,data=datos) Kruskal-Wallis rank sum test data: values by ind Kruskal-Wallis chi-squared = 19.6151, df = 8, p-value = 0.01189 EL VALOR DE P EN KRUSCAL FUE <0.05 LO QUE ME INDICA QUE RECHAZO Ho Y EXISTEN DIFERENCIAS ESTADÍSTICAMENTE SIGNIFICATIVAS ENTRE L OS TRATAMIENTOS. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA Summary Statistics for MORTALIDAD Count = 81 Average = 9,85185 Variance = 12,6778 Standard deviation = 3,56059 Minimum = 5,0 Maximum = 20,0 Stnd. skewness = 3,42488 Stnd. kurtosis = 0,665783 Sum = 798,0

151

ANEXO 3.

(Continuación)

INTERVALOS DE CONFIANZA. Summary Statistics for MORTALIDAD TRA Count Average Variance Standard deviation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 27 9,22222 1,17949 1,08604 2 27 12,037 22,6524 4,75946 3 27 8,2963 7,29345 2,70064 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 81 9,85185 12,6778 3,56059 TRA Minimum Maximum Stnd. skewness Stnd. kurtosis ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 7,0 12,0 1,04966 0,748337 2 5,0 20,0 -0,0918993 -1,52703 3 5,0 14,0 1,2917 -0,522183 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 5,0 20,0 3,42488 0,665783 TRA Sum ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 249,0 2 325,0 3 224,0 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 798,0 The StatAdvisor This table shows various statistics for MORTALIDAD for each of the 3 levels of TRA. The one-way analysis of variance is primarily intended to compare the means of the different levels, listed here under the Average column. CONTRASTE: MUESTRA DIFERENCIAS MINIMAS SIGNIFICATIV AS ENTRE LOS TRATAMIENTOS. Multiple Range Tests for MORTALIDAD by TRA -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD TRA Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 27 8,2963 X 1 27 9,22222 X 2 27 12,037 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-2,81481 1,74529 1 - 3 0,925926 1,74529 2 - 3 *3,74074 1,74529 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. The StatAdvisor- This table applies a multiple comparison procedure to determine which means are significantly different from which others. The bottom half of the output shows the estimated difference between each pair of means. An asterisk has been placed next to 2 pairs, indicating that these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level. At the top of the page, 2 homogenous groups are identified using columns of X's. Within each column, the levels containing X's form a group of means within which there are no statistically significant differences. The method currently being used to discriminate among the means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure. With this method, there is a 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual difference equals 0.

152

ANEXO 3.

(Continuación)

COMPARACIÓN ENTRE CONTROLES Y CEPAS NO FORMULADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae Shapiro-Wilk normality test data: resultado$residuals W = 0.9836, p-value = 0.3892

-2 -1 0 1 2

-4-2

02

4

Normal Q-Q Plot


Sam

ple

Qua

ntile

s

EL VALOR DE P EN SHAPIRO WILK (SW) FUE <0.05 LO QUE ME INDICA QUE ACEPTO Ho Y EXISTE HOMOGENIDAD ENTRE LOS DATOS. UTILIZÓ BARLETT (B). Bartlett test of homogeneity of variances data: values by ind Bartlett's K-squared = 34.7188, df = 8, p-value = 3.008e-05 EL VALOR DE BARLETT FUE <0.05 LO QUE INDICA QUE REC HAZO Ho Y ME INDICA QUE NO HAY HOMOGENIDAD ENTRE LAS VARIANZAS. REALIZÓ KRUSKAL WA LLIS (KW). Kruskal-Wallis rank sum test data: values by ind Kruskal-Wallis chi-squared = 20.4496, df = 8, p-value = 0.008763 EL VALOR DE P EN KRUSKAL FUE <0.05 LO QUE INDICA QU E RECHAZO Ho QUE ME INDICA QUE EXISTEN DIFERENCIAS ESTADISTICAMENTE SIGNIFICATIVA S ENTRE LOS TRATAMIENTOS. ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA Summary Statistics for MORTALIDAD Count = 81 Average = 8,81481 Variance = 6,15278 Standard deviation = 2,48048 Minimum = 4,0 Maximum = 17,0 Stnd. skewness = 3,63156 Stnd. kurtosis = 3,33393 Sum = 714,0

153

ANEXO 3.

(Continuación)

INTERVALOS DE CONFIANZA. Summary Statistics for MORTALIDAD TRA Count Average Variance Standard deviation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 27 8,37037 1,24217 1,11452 2 27 9,92593 10,4558 3,23355 3 27 8,14815 5,2849 2,29889 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 81 8,81481 6,15278 2,48048 TRA Minimum Maximum Stnd. skewness Stnd. kurtosis ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 7,0 10,0 0,556509 -1,32116 2 4,0 17,0 1,16871 0,33051 3 5,0 12,0 0,760392 -1,20406 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 4,0 17,0 3,63156 3,33393 TRA Sum ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 226,0 2 268,0 3 220,0 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 714,0 The StatAdvisor This table shows various statistics for MORTALIDAD for each of the 3 levels of TRA. The one-way analysis of variance is primarily intended to compare the means of the different levels, listed here under the Average column. CONTRASTE, MUESTRA LAS DIFERENCAS MINIMAS SIGNIFICA TIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS Multiple Range Tests for MORTALIDAD by TRA -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD TRA Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 3 27 8,14815 X 1 27 8,37037 X 2 27 9,92593 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-1,55556 1,28919 1 - 3 0,222222 1,28919 2 - 3 *1,77778 1,28919 --------------------------------------------------------------------------------

*denotes a statistically significant difference

154

ANEXO 4.

EFECTO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS ATRAVEZ DEL TI EMPO (PERÍODO DE PROTECCIÓN)

DATOS CRUDOS

TRATAMIENTO POBLACION CONTROL 30 CONTROL 32 M. anisopliae Cepa Formulada 24 M. anisopliae Cepa No formulada 23 B. bassiana Cepa Formulada 31 B. bassiana Cepa No formulada 26

155

ANEXO 5.

COMPARACIÓN DE LAS CEPAS DE LOS HONGOS B. bassiana Y M. anisopliae EN CÁMARA HUMEDA shapiro.test(resultado$residuals) Shapiro-Wilk normality test data: resultado$residuals

W = 0.9668, p-value = 0.0001923

-2 -1 0 1 2

-20

-10

010

20

Normal Q-Q Plot


Sam

ple

Qua

ntile

s

EL VALOR DE P EN SHAPIRO FUE <0.05 POR LO QUE RECHAZO Ho QUE ME INDICA QUE NO HAY NORMALIDAD ENTRE LOS DATOS. REALIZÓ LEVENE > levene.test(values,ind) Levene's Test for Homogeneity of Variance Df F value Pr(>F)

group 20 3.049 2.536e-05 *** 168 --- Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 EL VALOR DE P EN LEVENE FUE <0.05 POR ESTO RECHAZO Ho LO QUE ME INDICA QUE NO HAY HOMOGENIDAD ENTRE LAS VARIANZAS Y REALIZÓ KR USCAL. > kruskal.test(values~ind,data=datos) Kruskal-Wallis rank sum test

data: values by ind Kruskal-Wallis chi-squared = 42.2186, df = 20, p-value = 0.00239 EL VALOR DE P EN KRUSCAL FUE <0.05 ENTONCES RECHAZO Ho Y ME INDICA QUE EXISTEN DIFERENCIAS ESTADÍSTICAMENTE SIGNIFICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS. Analysis Summary Data variable: MORTALIDAD Selection variable: TRA Fitted normal distribution: mean = 16,5661 standard deviation = 14,304

156

ANEXO 5. (Continuación)

INTERVALOS DE CONFIANZA Summary Statistics for MORTALIDAD TRA Count Average Variance Standard deviation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5,96296 6,5755 2,56427 2 27 6,03704 9,34473 3,05692 3 27 13,0 99,3846 9,96918 4 27 17,4074 128,866 11,3519 5 27 23,4074 212,866 14,5899 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 135 16,5661 204,619 14,3045 TRA Minimum Maximum Stnd. skewness Stnd. kurtosis ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 2,0 11,0 0,909298 -0,642262 2 1,0 11,0 0,030855 -1,36737 3 0,0 31,0 0,840446 -0,961833 4 1,0 42,0 1,15905 -0,470353 5 1,0 44,0 -0,580479 -1,48451 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 0,0 44,0 3,71868 -2,97101 TRA Sum ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 161,0 2 163,0 3 351,0 4 470,0 5 632,0 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 1777,0 Multiple Range Tests for MORTALIDAD by TRA -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD TRA Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 13,0 X 2 27 17,4074 XX 3 27 23,0741 XX 4 27 23,4074 X 5 27 27,0741 X


0

TRATAMIENTO

MO

RT

ALI

DA

D

0

10

20

30

40

50

157

ANEXO 6.

PORCENTAJE DE MORTALIDAD DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus EN CAMARA HUMEDA CÀMARA HÙMEDA

NÚMERO DE TRATAMIENTO Pre-ENSAYO 2 MORTALIDAD PORCENTAJE

TRATAMEINTO MARCA DIA 1

DIA 2

DIA 3

DIA 4

DIA 5

DIA 6

DIA 7

DIA 8

DIA 9

1 CONTROL +H2O

E2-T 1 TC H2O

3.5 4 6 6 6.5 12 16 19.5 20.5

2 Beauveria bassiana + CEPA NO FORMULADA

E2-T2 B.b C.D

4 8 12.5 24.5 30.5 40.5 50 64 68

3 Beauveria bassiana + CEPA FORMULADA

E2-T3 B.b C.F

3 9 13 23 26.5 74.5 79.5 81 81

4 Metarhizium anisopliae + CEPA NO FORMULADA

E2-T4 M.a C.D

4 13.5 20 23 26.5 48.5 53 63 69

5 Metarhizium anisopliae + CEPA FORMULADA

E2-T5 M.a C.F

2.5 10.5 15.5 20.5 26 55 62.5 76 79.5

Porcentaje de mortalidad absoluta de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus producida por la aplicación de los hongos entomopatógenos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae a una concentración de 1x108 conidios/ml, bajo condiciones de laboratorio en cámara húmeda.

158

ANEXO 7. COMPARACIÓN DE LAS CEPAS DE LOS DOS HONGOS EN CAMARA SECA > shapiro.test(resultado$residuals)

Shapiro-Wilk normality test data: resultado$residuals

W = 0.9627, p-value = 6.095e-08

-3 -2 -1 0 1 2 3

-30

-20

-10

010

20

Normal Q-Q Plot


Sam

ple

Qua

ntil

es

EL VALOR DE P EN SHAPIRO FUE <0.05 POR LO QUE RECHAZO Ho QUE ME INDICA QUE NO HAY NORMALIDAD ENTRE LOS DATOS. REALIZÓ LEVENE > levene.test(values,ind) Levene's Test for Homogeneity of Variance Df F value Pr(>F) group 20 2.8585 0.0002619 *** 168 ---

Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 EL VALOR DE P EN LEVENE FUE <0.05 POR ESTO RECHAZO Ho LO QUE ME INDICA QUE NO HAY HOMOGENIDAD ENTRE LAS VARIANZAS Y REALIZÓ KR USCAL. > kruskal.test(values~ind,data=datos) Kruskal-Wallis rank sum test

data: values by ind Kruskal-Wallis chi-squared = 37.354, df = 20, p-value = 0.0075 EL VALOR DE P EN KRUSCAL FUE <0.05 ENTONCES RECHAZO Ho Y ME INDICA QUE EXISTEN DIFERENCIAS ESTADISTICAMENTE SIGNIFICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS. -------------------------------------------------------------------------------- Stnd. error TRA Count Mean (pooled s) Lower limit Upper limit -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5,96296 2,57273 2,37354 9,55239 2 27 6,03704 2,57273 2,44761 9,62646 3 27 15,7778 2,57273 12,1883 19,3672 4 27 19,3333 2,57273 15,7439 22,9228 5 27 24,1852 2,57273 20,5958 27,7746 -------------------------------------------------------------------------------- Total 135 18,329

159

ANEXO 7.

(Continuación)

Method: 95,0 percent LSD TRA Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5,96296 X 2 27 6,03704 XX 3 27 15,7778 XX 4 27 19,3333 XX 5 27 24,1852 XX --------------------------------------------------------------------------------


0

TRATAMIENTO

MO

RT

ALI

DA

D

0

10

20

30

40

50

160

ANEXO 8.

ESTADÍSTICA LABORATORIO COMPARACIÓN DE LAS CINCO CONCENTRACIONES EVALUADAS DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS B . bassiana Y. M anisopliae COMPARACIÓN ENTRE LOS DOS HONGOS BV Y MT CONTROL ABSOLUTO Y CON AGUA: DESPUES DE TENER ORGANIZADOS MIS DATOS REALIZÓ LA PRUEBA DE NORMALIDAD CON SHAPIRO: > shapiro.test(resultado$residuals) Shapiro-Wilk normality test data: resultado$residuals W = 0.9593, p-value = 7.715e-08

-3 -2 -1 0 1 2 3

-30

-20

-10

010

20

Normal Q-Q Plot


Sam

ple

Qua

ntile

s

EL VALOR DE P ES MENOR A 0.05 RECHAZO LA Ho LO QUE QUIERE DECIR QUE LOS DATOS NO SE DISTRIBUYEN NORMALMENTE. Y REALIZÓ LA P RUEBA DE LEVENE. > levene.test(values,ind) Levene's Test for Homogeneity of Variance Df F value Pr(>F) group 35 1.935 0.001871 ** 288 --- Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 EL VALOR DE P EN LEVENE FUE MENOR A 0.05 Y RECHAZO LA Ho LO QUE QUIERE DECIR QUE NO HAY HOMOGENIDAD ENTRE LAS VARIANZAS. C OMO NO HAY HOMOGENIDAD UTILIZO KRUSCAL. > kruskal.test(values~ind,data=datos)

Kruskal-Wallis rank sum test data: values by ind Kruskal-Wallis chi-squared = 56.2361, df = 35, p-value = 0.01287 EL VALOR DE P EN KRUSKAL FUE <0.05 ENTONCES RECHAZO Ho LO QUE QUIERE DECIR QUE EXISTEN DIFERENCIA SIGNIFICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS.

161

ANEXO 8.

(Continuación)

ESTADÍSTICA DESCRIPTIVA

Summary Statistics for VALORES Count = 324 Average = 19,0185 Variance = 234,743 Standard deviation = 15,3213 Minimum = 0,0 Maximum = 47,0 Stnd. skewness = 2,62485 Stnd. kurtosis = -5,28249 Sum = 6162,0

INTERVALOS DE CONFIANZA DE LOS TRATAMIENTOS. Summary Statistics for VALORES TRATA Count Average Variance Standard deviation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5,96296 6,5755 2,56427 2 27 6,03704 9,34473 3,05692 3 27 13,0 99,3846 9,96918 4 27 17,4074 128,866 11,3519 5 27 23,4074 212,866 14,5899 6 27 27,0741 308,61 17,5673 7 27 23,0741 260,84 16,1506 8 27 15,7778 151,41 12,3049 9 27 19,3333 253,154 15,9108 10 27 24,1852 257,618 16,0505 11 27 27,7778 333,256 18,2553 12 27 25,1852 239,618 15,4796 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 324 19,0185 234,743 15,3213 TRATA Minimum Maximum Stnd. skewness Stnd. kurtosis ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 2,0 11,0 0,909298 -0,642262 2 1,0 11,0 0,030855 -1,36737 3 0,0 31,0 0,840446 -0,961833 4 1,0 42,0 1,15905 -0,470353 5 1,0 44,0 -0,580479 -1,48451 6 0,0 43,0 -1,40808 -1,57015 7 1,0 43,0 -0,213081 -1,75916 8 0,0 40,0 0,788174 -0,964999 9 1,0 42,0 0,491742 -2,0239 10 1,0 45,0 -0,337862 -1,58652 11 0,0 47,0 -1,28333 -1,55606 12 1,0 45,0 -0,931631 -1,51586 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 0,0 47,0 2,62485 -5,28249

162

ANEXO 8.

(Continuación)

TRATA Sum ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 1 161,0 2 163,0 3 351,0 4 470,0 5 632,0 6 731,0 7 623,0 8 426,0 9 522,0 10 653,0 11 750,0 12 680,0 ---------------------------------------------------------------------------------------------------- Total 6162,0

The StatAdvisor This table shows various statistics for VALORES for each of the 12 levels of TRATA. The one-way analysis of variance is primarily intended to compare the means of the different levels, listed here under the Average column.

CONTRASTE: MUESTRA LAS DIFERENCIAS MÍNIMAS SIGNIFICATIVAS ENTRE LOS TRATAMIENTOS.

Multiple Range Tests for VALORES by TRATA -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95,0 percent LSD TRATA Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 27 5,96296 X 2 27 6,03704 X 3 27 13,0 XX 8 27 15,7778 XX 4 27 17,4074 XXX 9 27 19,3333 XXXX 7 27 23,0741 XXXX 5 27 23,4074 XXX 10 27 24,1852 XXX 12 27 25,1852 XX 6 27 27,0741 X 11 27 27,7778 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0,0740741 7,3516 1 - 3 -7,03704 7,3516 1 - 4 *-11,4444 7,3516 1 - 5 *-17,4444 7,3516 1 - 6 *-21,1111 7,3516 1 - 7 *-17,1111 7,3516 1 - 8 *-9,81481 7,3516 1 - 9 *-13,3704 7,3516

163


1 - 10 *-18,2222 7,3516 1 - 11 *-21,8148 7,3516 1 - 12 *-19,2222 7,3516 2 - 3 -6,96296 7,3516 2 - 4 *-11,3704 7,3516 2 - 5 *-17,3704 7,3516 2 - 6 *-21,037 7,3516 2 - 7 *-17,037 7,3516 2 - 8 *-9,74074 7,3516 2 - 9 *-13,2963 7,3516 2 - 10 *-18,1481 7,3516 2 - 11 *-21,7407 7,3516 2 - 12 *-19,1481 7,3516 3 - 4 -4,40741 7,3516 3 - 5 *-10,4074 7,3516 3 - 6 *-14,0741 7,3516 3 - 7 *-10,0741 7,3516 3 - 8 -2,77778 7,3516 3 - 9 -6,33333 7,3516 3 - 10 *-11,1852 7,3516 3 - 11 *-14,7778 7,3516 3 - 12 *-12,1852 7,3516 4 - 5 -6,0 7,3516 4 - 6 *-9,66667 7,3516 4 - 7 -5,66667 7,3516 4 - 8 1,62963 7,3516 4 - 9 -1,92593 7,3516 4 - 10 -6,77778 7,3516 4 - 11 *-10,3704 7,3516 4 - 12 *-7,77778 7,3516 5 - 6 -3,66667 7,3516 5 - 7 0,333333 7,3516 5 - 8 *7,62963 7,3516 5 - 9 4,07407 7,3516 5 - 10 -0,777778 7,3516 5 - 11 -4,37037 7,3516 5 - 12 -1,77778 7,3516 6 - 7 4,0 7,3516 6 - 8 *11,2963 7,3516 6 - 9 *7,74074 7,3516 6 - 10 2,88889 7,3516 6 - 11 -0,703704 7,3516 6 - 12 1,88889 7,3516 7 - 8 7,2963 7,3516 7 - 9 3,74074 7,3516 7 - 10 -1,11111 7,3516 7 - 11 -4,7037 7,3516 7 - 12 -2,11111 7,3516 8 - 9 -3,55556 7,3516 8 - 10 *-8,40741 7,3516 8 - 11 *-12,0 7,3516 8 - 12 *-9,40741 7,3516 9 - 10 -4,85185 7,3516 9 - 11 *-8,44444 7,3516 9 - 12 -5,85185 7,3516 10 - 11 -3,59259 7,3516 10 - 12 -1,0 7,3516 11 - 12 2,59259 7,3516 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference.

164


TRATAMIENTO Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5

CONTROL ABSOLUTO 6,6 6,6 9,3 10 10

CONTROL+H2O 4 4,6 6,6 9,3 12

Metarhizium anisopliae1x106 1,3 2 8,6 24 25,3

Metarhizium anisopliae 1x107 3,3 14 19,3 24,6 32,6

Metarhizium anisopliae 1x108 3,3 8,6 19,3 43,3 52,6

Metarhizium anisopliae 5x108 1,3 3,3 15,3 64 74

Metarhizium anisopliae 1x109 2 7,3 13,3 36 44

Beauveria bassiana 1x106 0,6 2,6 9,3 28,6 30

Beauveria bassiana 1x107 2,6 6,6 12 16 19,3

Beauveria bassiana 1x108 2 8,6 18 41,3 49,3

Beauveria bassiana 5x108 1,3 2,6 16 65,3 73,3

Beauveria bassiana 1x109 2,6 8,6 20,6 49,3 57,3

Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9

11,3 14,6 19,3 19,3

16 16,6 18 21,3

27,3 32,6 52,6 60

38 43,3 64,6 73,3

69,3 67,3 78,6 85,3

78,6 82 83,3 85,3

68,6 76 82,6 85,3

31,3 46,6 63,3 71,3

66,6 68 75,3 81,3

65,3 77,3 84,6 88,6

78,6 83,3 89,3 90

72,6 76 79,3 86,6

165

ANEXO 9.

ANALISIS PROBIT

Análisis Probit para el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana en el día final de evaluación (Día 9).

Procedimiento probit Análisis Probit en (concentracion)

Probability Concentracion Límites fiduciales

0.01 3,11E-08 5,71E-22 1,24E-04

0.02 5,49E-07 9,39E-20 9,19E-04

0.03 3,39E-06 2,39E-18 3,27E-03

0.04 1,33E-05 2,73E-18 8,51E-03

0.05 4,07E-05 1,98E-16 1,85E-02

0.06 1,05E-04 1,07E-15 3,59E-02

0.07 2,42E-04 4,68E-16 6,41E-02

0.08 5,09E-04 1,76E-14 1,08E-01

0.09 1,00E-03 5,86E-15 1,73E-01

0.10 1,87E-03 1,77E-13 2,67E-01

0.15 2,47E-02 1,74E-11 0.0000162

0.20 1,92E-01 6,62E-10 0.0000682

0.25 1,12E+0 1,50E-08 0.0002337

0.30 5,45E+0 2,48E-07 0.0007080

0.35 2,36E+01 3,33E-06 0.00198

0.40 9,46E+01 3,90E-04 0.00527

0.45 3,63E+02 4,21E-03 0.01360

0.50 1,36E+03 4,36E-02 0.03472

0.55 5,13E+03 4,49E-01 0.08905

0.60 1,96E+04 0.0000478 0.23354

0.65 7,90E+04 0.0005427 0.64044

0.70 3,41E+05 0.00687 1,90E+05

0.75 1,66E+06 0.10036 6,49E+05

0.80 9,62E+06 1,67E+05 3,04E+06

0.85 7,52E+07 2,36E+06 3,45E+07

0.90 9,94E+08 2,40E+07 2,02E+04

0.91 1,85E+09 3,90E+07 5,79E+04

0.92 3,65E+09 6,54E+07 1,85E+05

0.93 7,69E+09 1,14E+03 6,69E+05

0.94 1,76E+10 2,10E+03 2,84E+06

0.95 4,56E+10 4,19E+03 1,49E+07

0.96 1,39E+11 9,34E+03 1,06E+08

0.97 5,48E+11 2,48E+04 1,18E+09

0.98 3,38E+12 9,03E+04 2,94E+15

0.99 5,99E+13 6,82E+05 4,73E+17

166

Recta de regresión lineal del Probit para la mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus al día nueve con cinco concentraciones diferentes del hongo B. bassiana después de la aplicación.

Dosis

MO

RT

ALI

DA

D (

%)

167

ANEXO 9.

(Continuación)

Análisis Probit para el hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae en el día final de evaluación.

Procedimiento Probit Análisis Probit en (concentracion)

Probability Concentracion Límites fiduciales

0.01 5.46E-04 4,73E-11 2,32E-02

0.02 4,95E-03 1,20E-09 1,24E-01

0.03 2.00E-02 9,29E-09 3,60E-01

0.04 5,75E-02 4,34E-08 8,02E-01

0.05 1,35E-01 1,52E-07 0.0000154

0.06 2,80E-01 4,42E-07 0.0000268

0.07 5,32E-01 1,13E-06 0.0000436

0.08 9,43E-01 2,60E-06 0.0000675

0.09 1,58E+0 5,57E-06 0.0001003

0.10 2,56E+0 1,12E-04 0.0001445

0.15 1,86E+01 2,04E-04 0.0006566

0.20 9,01E+01 2,04E-02 0.00219

0.25 3,48E+02 1,47E-02 0.00617

0.30 1,70E+03 8,62E-01 0.01566

0.35 3,62E+03 0.0000443 0.03724

0.40 1,05E+04 0.0002092 0.08495

0.45 2,95E+04 0.0009351 0.18938

0.50 8,16E+04 0.00406 0.41912

0.55 2,25E+05 0.01748 0.93509

0.60 6,34E+05 0.07605 2,14E+05

0.65 1,84E+06 0.33937 5,17E+05

0.70 5,68E+06 1,56E+05 1,37E+06

0.75 1,91E+07 7,27E+05 4,40E+06

0.80 7,40E+07 3,24E+06 2,00E+07

0.85 3,58E+08 1,40E+07 1,54E+03

0.90 2,60E+09 7,31E+07 2,44E+04

0.91 4,20E+09 1,07E+03 4,83E+04

0.92 7,07E+09 1,62E+03 1,02E+05

0.93 1,25E+10 2,55E+03 2,31E+05

0.94 2,37E+10 4,20E+03 5,81E+05

0.95 4,92E+10 7,42E+03 1,67E+06

0.96 1,15E+11 1,44E+04 5,77E+06

0.97 3,32E+11 3,25E+04 2,66E+07

0.98 1,34E+12 9,54E+04 2,04E+08

0.99 1,22E+13 5,17E+05 5,10E+09

168

Recta de regresión lineal del Probit para la mortalidad de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus al día nueve con cinco concentraciones diferentes del hongo M. anisopliae después de la aplicación.

Dosis

MO

RT

ALI

DA

D (

%)

169

ANEXO 9.

(Continuación)

PORCENTAJES DE MORTALIDAD CORREGIDA EN LA EVALUACIÓ N DE LAS CONCENTRACIONES PARA LOS HONGOS B. bassiana Y M. anisopliae

% DE MORTALIDAD CORREGIDA ABBOTT DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophilus) microplus EN EL TIEMPO POR LA APLICACION DE Beauveria bassiana

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


TIEMPO

% D

E M

OR

TA

LID

AD

DE

LA

RV

AS

CONTROL+H2O Beauveria bassiana 1x106 Beauveria bassiana 1x107

Beauveria bassiana 1x108 Beauveria bassiana 5x108 Beauveria bassiana 1x109

Porcentaje de mortalidad corregida de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el

tiempo, por la aplicación de Beauveria bassiana a concentraciones de 1x106,1x107 ,1x108, 5x108 y

1x109 conidios/ml.

% DE MORTALIDAD CORREGIDA DE LARVAS DE Rhipicephalus (Boophlus) microplus EN EL TIEMPO POR LA APLICACION DE Metarhizium anisopliae

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90


TIEMPO

% D

E M

OR

TA

LID

AD

DE

LA

RV

AS

CONTROL+H2O Metarhizium anisopliae1x106 Metarhizium anisopliae 1x107

Metarhizium anisopliae 1x108 Metarhizium anisopliae 5x108 Metarhizium anisopliae 1x109

Porcentaje de mortalidad corregida de larvas de Rhipicephalus (Boophilus) microplus en el tiempo,

por la aplicación de Metarhizium anisopliae a concentraciones de 1x106,1x107 ,1x108, 5x108 y

1x109 conidios/ml.

170

ANEXO 10.

TIEMPO LETAL CINCUENTA Y NOVENTA (CL 50 y CL 90 )

Metarhizium anisopliae 1x106 conidias/ml TIEMPO LETAL 50 Y 90

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

Metarhizium anisopliae 1x107conidias/ml TIEMPO LETAL 50 Y 90

05

101520253035404550556065707580859095

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TL 50


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RTA

LID

AD

DE

LA

RV

AS

TL 50


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RTA

LID

AD

DE

LA

RV

AS

TL 90TL 50


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TL 50TL 90

Beauveria bassiana 1x106 conidias/ml TIEMPO LETAL 50 Y 90

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

Beauveria bassiana 1x107 conidias /ml TIEMPO LETAL 50 Y 90

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TL 50


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RTALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TL 50


0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TL 50 TL 90

Beauveria bassiana 1x109 conidias/ml TIEMPO LETAL 5 0 Y 90

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100


TIEMPO (DIAS)

MO

RT

ALI

DA

D D

E L

AR

VA

S

TL 50TL 90

171

ANEXO 11.

TIEMPO LETAL 50 Y 90 MORTALIDAD ACUMULADO MÉTODO DE REED AND MUENCH

DIA 1

CONCENTRACIONES VIVOS MUERTOS ACUMULADO

MUERTOS ACUMULADO

VIVOS TOTAL FRACCION Metarhizium anisopliae1x106 148 2 2 733 735 0,2

Metarhizium anisopliae 1x107 145 5 7 585 592 1,1




Beauveria bassiana 1x106 149 1 1 736 737 0,1 Beauveria bassiana 1x107 146 4 5 587 592 0,8 Beauveria bassiana 1x108 147 3 8 441 449 1,7 Beauveria bassiana 5x108 148 2 10 294 304 3,2 Beauveria bassiana 1x109 146 4 14 146 160 8,7

DIA 2


MUERTOS ACUMULADO

VIVOS TOTAL FRACCION

% Metarhizium

anisopliae1x106 147 3 3 697 700 0,4 Metarhizium anisopliae

1x107 129 21 24 550 574 4,1 Metarhizium anisopliae

1x108 137 13 37 421 458 8 Metarhizium anisopliae


1x109 139 11 53 139 192 27,6

Beauveria bassiana 1x106 146 4 4 706 710 0,5 Beauveria bassiana 1x107 140 10 14 560 574 2,4 Beauveria bassiana 1x108 137 13 27 420 447 6 Beauveria bassiana 5x108 146 4 31 283 314 9,8 Beauveria bassiana 1x109 137 13 44 137 181 24,3

172


DIA 3


MUERTOS ACUMULADO


% Metarhizium

anisopliae1x106 137 13 13 636 649 2 Metarhizium anisopliae




1x109 130 20 114 130 244 46,7

Beauveria bassiana 1x106 136 14 14 636 650 2,1 Beauveria bassiana 1x107 132 18 32 500 532 6 Beauveria bassiana 1x108 123 27 59 368 427 13,8 Beauveria bassiana 5x108 126 24 83 245 328 25,3 Beauveria bassiana 1x109 119 31 114 119 233 48,9

DIA 4


MUERTOS ACUMULADO

VIVOS TOTAL FRACCION Metarhizium





1x109 96 54 288 96 384 75


173


DIA 5


MUERTOS ACUMULADO






1x109 84 66 343 84 427 80,3


DIA 6


MUERTOS ACUMULADO



1x107 93 57 98 218 316 31 Metarhizium anisopliae



1x109 47 103 423 47 470 90

Beauveria bassiana 1x106 103 47 47 278 325 14,4 Beauveria bassiana 1x107 50 100 147 175 322 45,6 Beauveria bassiana 1x108 52 98 245 125 370 66,2 Beauveria bassiana 5x108 32 118 363 73 436 83,2 Beauveria bassiana 1x109 41 109 472 41 513 92

174


DIA 7


MUERTOS ACUMULADO


% Metarhizium





1x109 36 114 452 36 488 92,6

Beauveria bassiana 1x106 80 70 70 223 293 23,8





DIA 8


MUERTOS ACUMULADO


% Metarhizium





1x109 26 124 543 26 569 95,4


Beauveria bassiana 1x107 37 113 208 107 315 66




175


DIA 9


MUERTOS ACUMULADO






1x109 22 128 584 22 606 96,3


176

ANEXO 12.

FÓRMULA DE ABBOTT (1925) PARA MORTALIDAD CORREGIDA EN MUESTRAS CON IGUAL NÚMERO DE POBLACIÓN.

Vivos en el testigo- Vivos en el tratamiento x 100

Vivos en el testigo

(Fórmula de Abbott (1925))

177

ANEXO 13.

FÓRMULA DE HENDERSON Y TILTON PARA MUESTRAS CON DIF ERENTE NÚMERO DE POBLACIÓN

% Mortalidad = 100 x [1 - (Ta x Cb)/(Tb x Ca)]

Donde:

Tb = insectos en el recuento previo al tratamiento

Ta = insectos después del tratamiento

Cb = insectos en el recuento previo en el testigo sin tratar

Ca = insectos después de los tratamientos en el testigo sin tratar

entomopatÓgenos beauveria bassiana (bassi) y metarhizium

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