entwicklung und charakterisierung adenosin- freisetzender
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Research Collection
Doctoral Thesis
Entwicklung und Charakterisierung AdenosinfreisetzenderZellsysteme für eine ex vivo Gentherapie fokaler Epilepsien
Author(s): Huber, Alexander F.
Publication Date: 2001
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-004281452
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ETH Library
Diss. ETH Nr. 14495
Entwicklung und Charakterisierung Adenosin-
freisetzender Zellsysteme für eine ex vivo Gentherapie
fokaler Epilepsien
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels
DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
ALEXANDER F. HUBER
Dipl. sc. nat. ETH Zürich
Geboren am 9. Januar 1973
von Winterthur und Walenstadt
Angenommen auf Antrag von
Prof. Dr. Hanns Möhler, Referent
PD Dr. Ned Mantei, Koreferent
2001
2 Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................... 5
SUMMARY ......................................................................................................................... 7
1. EINLEITUNG.................................................................................................................. 9
1.1. EPILEPSIE .................................................................................................................... 9
1.1.1. Temporallappen-Epilepsie.................................................................................. 11
1.1.2. Das Problem der Pharmakoresistenz................................................................... 12
1.1.3. Konventionelle antiepileptische Medikamente.................................................... 13
1.1.4. Ratten mit genetisch vererbter, primär generalisierter Epilepsie (GEPR-9) ......... 14
1.1.5. Das Kindling-Modell der Ratte........................................................................... 15
1.2. ADENOSIN ................................................................................................................. 17
1.2.1. Adenosin als neues pharmakologisches Prinzip zur Behandlung von Epilepsie... 17
1.2.2. Biologische Effekte von Adenosin im Zentralnervensystem ............................... 17
1.2.3. Adenosin-Metabolismus und Transport .............................................................. 21
1.3. ZELLTRANSPLANTATION ALS THERAPEUTISCHE OPTION.............................................. 23
1.3.1. Transplantation von Zellen ................................................................................. 23
1.3.2. Transplantation von eingekapselten Zellen ......................................................... 24
2. ZIEL DER DISSERTATION........................................................................................ 26
3. RESULTATE................................................................................................................. 27
3.1. ANTIKONVULSIVER EFFEKT DURCH AKTIVIERUNG DER ADENOSIN-REZEPTOREN
A1 UND A2 ................................................................................................................. 27
3.2. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ADENOSIN-FREISETZENDEN ZELLEN .. 29
3.2.1. Herstellung und Charakterisierung Adenosin-freisetzender BHK-Zellen ............ 30
3.2.2. Herstellung und Charakterisierung von ADA-0 Zellen ....................................... 32
3.2.3. Transfektion des Apoptoseinhibitors Bcl-2 in ADA-0 Zellen (ADA-7bcl2) ........ 33
3.2.4. Charakterisierung von D4 Zellen........................................................................ 34
3.2.5. Adenosinfreisetzung aus den Zelllinien ADA-0, ADA-7bcl2,
BHK-AK2 und D4............................................................................................. 37
3.3. ADENOSIN-FREISETZUNG VON EINGEKAPSELTEN ZELLEN IN VITRO.............................. 41
3.4. ANFALLSUNTERDRÜCKUNG DURCH ADENOSIN-FREISETZENDE ZELLKAPSELN IM
KINDLING-MODELL DER RATTE.................................................................................. 42
3.4.1. Antikonvulsive Wirkung von D4 Zellen ............................................................. 43
Inhaltsverzeichnis 3
3.4.2. Antikonvulsive Wirkung von ADA-0 Zellen ...................................................... 43
3.4.3. Antikonvulsive Wirkung von BHK-AK2 Zellen................................................. 47
3.5. EINFLUSS DER ANFALLSHÄUFIGKEIT AUF DEN ANTIKONVULSIVEN EFFEKT VON
ADENOSIN-FREISETZENDEN ZELLKAPSELN.................................................................. 49
3.5.1. Anfallsstärke in Abhängigkeit der Stimulationshäufigkeit .................................. 49
3.5.2. Intrahippokampale EEG Ableitungen ................................................................. 52
3.6. PHENYTOINRESISTENZ VON GEKINDELTEN RATTEN..................................................... 55
3.7. AUFHEBUNG DES ANTIKONVULSIVEN EFFEKTES DURCH DPCPX ................................. 55
3.8. ÜBERLEBENSPOTENTIAL DER ZELLEN IN DEN KAPSELN............................................... 56
3.9. KEINE SEDATION ALS UNERWÜNSCHTE NEBENWIRKUNG............................................. 60
4. DISKUSSION ................................................................................................................ 61
4.1. ADENOSIN-REZEPTOR AGONISTEN IM GEPR-9 TIERMODELL DER RATTE .................... 61
4.2. THERAPEUTISCHE EFFIZIENZ VON ADENOSIN-FREISETZENDEN ZELLLINIEN IM KINDLING-
MODELL DER RATTE .................................................................................................. 62
4.2.1. Rückgang der Anfallsunterdrückung................................................................. 64
4.2.2. Abschätzung der therapeutisch effektiven Adenosinkonzentration
am Wirkungsort................................................................................................ 65
4.2.3. Fehlende Adenosin-A1-Rezeptor Desensitivierung ............................................. 67
4.2.4. Kindling-induzierte Resistenz gegen Phenytoin.................................................. 68
4.2.5. Nebenwirkungen von Adenosin.......................................................................... 68
4.3. EINFLUSS DES KINDLING-PROZESSES AUF DIE THERAPEUTISCHE EFFIZIENZ DER
ZELLKAPSELN ............................................................................................................ 69
4.4. SCHLUSSFOLGERUNGEN ............................................................................................. 70
4.5. AUSBLICK.................................................................................................................. 71
5. MATERIAL UND METHODEN.................................................................................. 73
5.1. VERABREICHUNG VON PHARMAKA............................................................................. 73
5.2. REINIGUNG REKOMBINANTER ADENOSIN-KINASE....................................................... 73
5.3. ADENOSIN BESTIMMUNG DURCH ENZYM-GEKOPPELTE FLUORESZENZ......................... 74
5.4. AKTIVITÄTSMESSUNG DER ADENOSIN-KINASE ........................................................... 75
5.5. WESTERN-BLOT ........................................................................................................ 76
5.6. VERWENDETE ZELLLINIEN ......................................................................................... 76
5.6.1. Herstellung der BHK-AK2 und BHK-AK5 Zellen.............................................. 77
5.6.2. Herstellung von konditional immortalisierten Fibroblasten-Zelllinien................. 78
4 Inhaltsverzeichnis
5.6.3. Herstellung der ADA-7bcl2 Zellen..................................................................... 79
5.6.4. Charakterisierung der B-mix und D4 Zellen ....................................................... 81
5.7. NACHWEIS DES BCL-2 PROTEINS............................................................................... 81
5.8. HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON ZELLKAPSELN.................................... 82
5.9. TIERMODELLE DER EPILEPSIE..................................................................................... 82
5.9.1. Ratten mit genetisch vererbter audiogener Epilepsie (GEPR-9) .......................... 82
5.9.2. Kindling-Modell der Ratte.................................................................................. 83
5.10. EINKAPSELUNG UND ANSCHLIESSENDE IMPLANTATION VON ZELLEN ......................... 84
5.11. HISTOLOGIE VON ZELLKAPSELN ............................................................................... 86
5.12. QUANTIFIZIERUNG VON ZELLEN IN KAPSELSCHNITTEN ............................................. 86
5.13. HISTOLOGIE VON HIRNSCHNITTEN............................................................................ 86
5.14. VERHALTENSANALYSE DER RATTEN AUS DEM KINDLING-MODELL ........................... 87
5.15. MATERIALLISTE....................................................................................................... 88
5.15.1. Chemikalien ..................................................................................................... 88
5.15.2. Antikörper........................................................................................................ 89
5.15.3. Enzyme ............................................................................................................ 89
5.15.4. Lösungen und Medien ...................................................................................... 90
5.15.5. Bakterien, Zellen und Tiere .............................................................................. 91
5.15.6. Allgemeines Material ....................................................................................... 92
5.15.7. Operationsinstrumente und Kindlingapparatur.................................................. 92
5.15.8. Geräte .............................................................................................................. 94
6. REFERENZEN .............................................................................................................. 95
7. ABKÜRZUNGEN.........................................................................................................107
CURRICULUM VITAE...................................................................................................109
PUBLIKATIONEN ..........................................................................................................110
ABSTRACTS ....................................................................................................................110
DANKSAGUNG ...............................................................................................................111
Zusammenfassung 5
Zusammenfassung
Etwa ein bis zwei Prozent der Weltbevölkerung leidet an Epilepsie. Gegenwärtig lassen sich
nur etwa 70 % aller diagnostizierten Epilepsien medikamentös behandeln. Die übrigen, meist
fokalen Epilepsien mit Ursprung im Temporallappen des Gehirns, sind häufig
pharmakoresistent. Für solche Patienten bleibt als einzige Alternative die chirurgische
Entfernung des epileptischen Fokus, falls dieser nicht im Bereich von wichtigen
Hirnregionen, wie etwa dem Sprachzentrum oder dem Gedächtnis liegt. Selbst nach der
Operation haben noch etwa 20 % dieser Patienten weiterhin epileptische Anfälle (Dam,
1996). Daher sind neue Therapiestrategien notwendig.
Adenosin ist ein Inhibitor neuronaler Aktivität im Gehirn, der seine Wirkung über Adenosin-
Rezeptoren vermittelt. In einem Tiermodell der primär generalisierten Epilepsie, der genetisch
vererbten audiogenen Epilepsie der Ratte (Stamm GEPR9), wurde die Effizienz von
Adenosin-Rezeptor-Agonisten gegen generalisierte, epileptische Anfälle evaluiert. Injektion
der Adenosin A1- und A2A-Rezeptor Agonisten 2-Chloro-N6-cyclopentyladenosin und 5‘-(N-
Cyclopropyl)-carboxamidoadenosin vermochten die durch audiogene Reize ausgelösten
Anfälle vollständig zu unterdrücken. Wegen starker peripherer Nebenwirkungen muss
Adenosin jedoch lokal verabreicht werden. Dazu wurde eine neue Therapiestrategie gegen
Epilepsie entwickelt, die auf der lokalen Freisetzung von Adenosin aus implantierten Zellen
in Form einer ex vivo Gen Therapie beruht. Die für epileptische Anfälle typischen,
synchronen Entladungen konnten dadurch unterdrückt werden. Verschiedene Zelllinien
wurden gentechnisch so verändert, dass sie Adenosin in erhöhtem Masse freisetzen. Dies
wurde durch die Inaktivierung der zwei am Adenosinabbau beteiligten Enzyme, der Adenosin
Deaminase und der Adenosin Kinase, erreicht. Nach Einkapselung in semipermeable
Hohlfasermembranen wurden diese Zellen in den lateralen Hirnventrikel von epileptischen
Ratten implantiert. Als Tiermodell für Epilepsie wurde das hippokampale Kindling-Modell
der Ratte verwendet. Es eignet sich für das Studium humaner Temporallappen-Epilepsie, da
es deren Pathologie widerspiegelt.
Gekindelte Ratten mit implantierten Adenosin-freisetzenden Kapseln zeigten eine fast
vollständige Protektion vor epileptischen Anfällen, was sich einerseits in der massiven
Reduktion von neuronalen Entladungen im Elektroenzephalogramm (EEG) und andererseits
durch Verminderung des beobachtbaren epileptischen Verhaltens manifestierte. Diese
Anfallsunterdrückung konnte mit einem spezifischen Adenosin-A1-Rezeptor Antagonisten
6 Zusammenfassung
rückgängig gemacht werden. Damit wurde Adenosin als das von den Zellen freigesetzte
Antikonvulsivum identifiziert. Im Gegensatz zur Implantation von Adenosin-freisetzenden
Zellkapseln zeigten gekindelte Tiere mit Kontrollkapseln unveränderte, tonisch-klonische
Anfallsmuster. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Häufigkeit der elektrischen
Stimulationen im Kindling-Modell (1x pro Woche versus 3x pro Woche) keinen Einfluss auf
die Anfallsunterdrückung durch Adenosin-freisetzende Transplantate hatte.
Somit konnte in dieser Arbeit die lokale Freisetzung von Adenosin als neues
pharmakologisches Prinzip zur Behandlung von fokalen Epilepsien etabliert werden.
Innerhalb der Testparameter ist die antikonvulsive Wirkung unabhängig von der
Anfallshäufigkeit.
Summary 7
Summary
About one to two percent of the world population suffers from epilepsy. Only about 70 % of
all diagnosed epilepsies can presently be treated with antiepileptic drugs. The remaining,
usually focal epilepsies with origin in the temporal lobe of the brain are frequently
pharmacoresistent. The surgical resection of the epileptic focus remains the only alternative
for such patients, if the focus is not located within the range of important brain regions, as for
instance language or memory. Even after the surgery 20 % of these patients continue to have
epileptic seizures (Dam, 1996). Therefore new therapeutic strategies are necessary.
Adenosine is an inhibitor of neural activity in the brain that mediates its effect over adenosine
receptors. In an animal model for primary generalized epilepsy, the genetically epilepsy prone
rat (GEPR9), the efficiency of adenosine receptor agonists against generalized epileptic
seizures were evaluated. Injections of the adenosine A1- and A2A-receptor agonists 2-Chloro-
N6-cyclopentyladenosine and 5’-(N-Cyclopropyl)-carboxamidoadenosine were able to
suppress audiogenically induced seizures. However, due to severe peripheral side effects
adenosine has to be applied locally. Therefore a new pharmacological strategy against
epilepsy based on the local release of adenosine from implanted cells in an ex vivo gene
therapy approach has been developed to suppress the typically synchronous epileptic
afterdischarges. Different cell lines were genetically modified in such a way that they release
increased amounts of adenosine. This was made possible by inactivating two important
adenosine degrading enzymes, adenosine deaminase and adenosine kinase. After
encapsulation into semipermeable hollow fibres these cells were implanted into the lateral
brain ventricle of epileptic rats. As an animal model for epilepsy the rat hippocampal kindling
model was used, which is known to be suitable for the study of human temporal lobe epilepsy,
since it reflects all pathological findings. The kindling model therefore is widely used to test
new antiepileptic drugs.
Kindled rats with implanted adenosine-releasing capsules showed almost complete protection
from epileptic seizures, which manifested itself on the one hand in the substantial reduction of
neural afterdischarges in the electroencephalogram (EEG) and on the other hand by a
reduction of the epileptic behaviour. This seizure suppression could be reversed by a specific
adenosine A1-receptor antagonist. Thus, adenosine was identified as the anticonvulsant
substance released by the cells. In contrast, control animals that received control capsules
continued to show pre-surgery seizure patterns. In addition it was shown that the number of
8 Summary
electrical stimulations in the kindling model (one versus three stimulations per week) had no
influence on the effectiveness of seizure suppression by adenosine releasing transplants.
Thus, the local release of adenosine from bioengineered cells provides a new pharmacological
principle for the treatment of focal epilepsies. Within the test parameters the anticonvulsive
effect is independent of the seizure frequency.
1. Einleitung 9
1. Einleitung
1.1. Epilepsie
Epilepsie ist eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen: Etwa ein bis zwei Prozent der
Bevölkerung sind betroffen, wovon etwa 40 % komplexe partielle Epilepsie haben (Jallon,
1997) (McNamara, 1999). Die Inzidenz variiert stark in Abhängigkeit des Lebensalters der
Patienten: Während sie im Kindesalter am grössten ist, sinkt sie auf einen Tiefstpunkt bei
jungen Erwachsenen, um dann im Alter ab 50 Jahren wieder stark anzusteigen (Annegers et
al., 1979). Epilepsie wird durch wiederkehrende Anfälle charakterisiert, die durch abnormale,
synchrone Entladungen einer Neuronenpopulation im Gehirn eine Veränderung des Verhaltes
hervorrufen können. Als Ursache für solche hyperaktiven Neuronenpopulationen wird ein
Ungleichgewicht zwischen neuronaler Exzitation und Inhibition angenommen.
40 unterschiedliche epileptische Syndrome wurden von der Kommission zur Klassifikation
epileptischer Anfälle („International League Against Epilepsy“, 1989) nach (i) Anfallstyp und
(ii) Ätiologie klassifiziert:
(i) Partielle Anfälle, auch lokale oder fokale Anfälle genannt, entstammen einer
lokalisierbaren, hyperaktiven Neuronenpopulation (Dreifuss, 1996). Wenn das Bewusstsein
dabei nicht beeinträchtigt wird, handelt es sich um einen „einfachen“, bei gestörtem
Bewusstsein um einen „komplexen“, partiellen Anfall. Oft gehen einfache partielle Anfälle
mit fortschreitender Anfallszahl in komplexe, partielle Anfälle über. Ebenfalls möglich ist ein
weiterer Übergang zu sogenannten sekundär generalisierten, partiellen Anfällen, bei denen
dann beide Hirnhemisphären involviert sind. Wenn jedoch bei den ersten klinisch
auftretenden Anfällen bereits beide Hirnhemisphären beteiligt sind, spricht man von primär
generalisierten Anfällen.
(ii) Die Ätiologie der epileptischen Anfälle wird entweder als symptomatisch oder
idiopathisch klassifiziert. Als mögliche Ursache bei symptomatischer Epilepsie kann ein
Hirntrauma, ein Schlaganfall oder ein Tumor vorliegen (Witte und Freund, 1999). Ebenfalls
können Mutationen in Genen, die in der Signalerzeugung, Weiterleitung und Übertragung
involviert sind, Anfälle verursachen (Noebels, 1996).
Es wird angenommen, dass pathologische, synchrone Entladungen von Neuronen-
populationen entweder durch (i) abnormal andauernde Exzitation (hauptsächlich
10 1. Einleitung
glutamaterges System) oder (ii) von ineffektiver oder fehlender Inhibition (hauptsächlich
GABAerges System) hervorgerufen werden.
(i) Synchrone Entladungen von Neuronenpopulationen während eines epileptischen Anfalls
können zu einer stark erhöhten Ausschüttung von Glutamat führen, wodurch postsynaptische
NMDA und nicht-NMDA Rezeptoren aktiviert werden. Eine Aktivierung von NMDA
Rezeptoren mit gleichzeitiger Membrandepolarisation führt zu einer massiven Akkumulation
von Ca2+ in der Zelle, wodurch verschiedene Ca2+-abhängige Prozesse aktiviert werden, von
denen zwei möglicherweise in der Entwicklung und Erhaltung von Anfällen eine wichtige
Rolle spielen: (1) Stimulation von Phospholipase A2 (PLA2) und Stickoxyd-Oxydase (NOS)
durch hohe Ca2+-Konzentrationen führt zur Bildung von hochreaktiven Sauerstoffderivaten
(freie Radiakale), welche oxidativen Stress in diesen Neuronen hervorrufen und dadurch den
Tod dieser Zellen verursachen können. (2) Die Aktivierung von Ca2+-abhängigen Enzymen
wie Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaM-K II) und Proteinkinase C führt zur
Expression von sogenannten „immediate early genes“ (IEG) wie c-fos und c-jun (Watanabe et
al., 1996). IEGs können kurzlebige neuronale Aktivität in strukturelle Änderungen umsetzen,
indem sie die Expression von neurotrophen Faktoren, deren Rezeptoren und Proteinen, die
mit dem axonalen Wachstum zusammenhängen, induzieren. Die strukturelle Änderung, die in
diesem Zusammenhang wohl am meisten untersucht wurde, ist die hippokampale Sklerose,
bei der Moosfaser-Axone der Körnerzellen in die inneren molekularen Schichten des
Hippokampus hineinsprossen (McNamara, 1999; Watanabe et al., 1996).
(ii) Schnelle inhibitorische synaptische Signalübertragung wird im zentralen Nervensystem
(ZNS) primär durch den Neurotransmitter γ-Aminobuttersäure (GABA) vermittelt, der mit
GABAA Rezeptoren interagiert. Zwei Hypothesen wurden aufgestellt: Einerseits führen
epileptische Anfälle zu verminderter GABAerger Inhibition (Kapur und Macdonald, 1997;
Lowenstein und Alldredge, 1998), andererseits kann das Absterben anfälliger, GABAerger
Neuronen epileptische Anfälle hervorrufen (Robbins et al., 1991). Der dadurch entstehende
Teufelskreis führt zu einem zunehmenden Ungleichgewicht, welches zur Bildung
hyperaktiver Neuronenpopulationen beitragen kann. Dass das GABAerge System eine
wichtige Rolle spielt, wird durch zahlreiche antiepileptische Medikamente, wie
Benzodiazepine (Diazepam, Lorazepam) oder Barbiturate (Phenobarbital, Pentobarbital),
gestützt, die einen modulatorischen Effekt auf GABAA Rezeptoren ausüben (Macdonald und
Kelly, 1995). Ausserdem wurden mittlerweile zwei epileptische Syndrome identifiziert, die in
direktem Zusammenhang mit Mutationen im GABAergen System stehen: Das Angelman
Syndrom wird durch eine Mutation im Gen verursacht, das für die β3-Untereinheit des
1. Einleitung 11
GABAA Rezeptors kodiert (DeLorey und Olsen, 1999) und Mutationen in der γ2-Untereinheit
wurden in der Absenz-Epilepsie bei Kindern und bei fiebrigen Konvulsionen gefunden
(Baulac et al., 2001; Wallace et al., 2001).
1.1.1. Temporallappen-Epilepsie
Temporallappen-Epilepsie (TLE) ist die häufigste Form von Epilepsie bei Erwachsenen und,
wenn sie zusammen mit hippokampaler Sklerose (HS) auftritt, die Form mit den meisten
therapieresistenten Patienten, bei denen keine zur Zeit bekannten antiepileptischen
Medikamente wirken (Engel, 1998; Semah et al., 1998). Die klinischen Symptome der
Temporallappen-Epilepsie (TLE) sind meist komplexe partielle Anfälle (CPS) (Ojemann,
1997). Obwohl man bei TLE meistens an olfaktorische, visuelle oder auditorische
Halluzinationen oder Illusionen denkt und die Krankheit früher deshalb „psychomotorische“
Epilepsie genannt wurde, sind die anfangs am häufigsten auftretenden Symptome
bewegungsloses Vor-sich-hin-Starren mit zufälligen, repetitiven Lippenbewegungen oder
unkontrolliertes Herumtasten mit den Händen. Obwohl TLE und CPS oft als Synonyme
gebraucht werden, handelt es sich nicht um das gleiche: CPS, klinisch identisch mit Anfällen
in der TLE, können auch aus anderen Teilen des Cortex entspringen. Bei vielen Patienten mit
TLE findet man normalerweise einen ersten auslösenden Vorfall im Gehirn, der meist vor
dem 4. – 5. Lebensjahr auftritt. Oft handelt es sich dabei um fiebrige Konvulsionen, Status
Epilepticus, Infektionen oder Schädeltraumata (Dam, 1996; Mathern et al., 1995). TLE kann
aber auch auf Fehlentwicklungen wie Heterotopien oder Dysgenesien zurückgeführt werden.
Bei den meisten Patienten kommt nach diesem Vorfall eine längere, anfallsfreie Periode, der
dann eine lange Phase von partiellen epileptischen Anfällen folgt, die oft mit einer
Veränderung des Bewusstseins einher geht. Hippokampale Sklerose (HS) wird in den meisten
chirurgisch entfernten Gewebestücken gefunden (Mathern et al., 1995). HS beinhaltet
hippokampale Atropie, Verlust von Pyramidenzellen in den hippokampalen CA1, CA3 und
CA4 Regionen, Gliosis, Zerstreuung der Körnerzellen im Gyrus dentatus und Reorganisation
der Moosfasern (Cascino, 1995). Verschiedene molekulare Veränderungen wurden im
sklerotischen Hippokampus gefunden, zum Beispiel im GABAergen (Loup et al., 2000) und
im glutamatergen System (Mathern et al., 1999). Da TLE und HS oft miteinander verbunden
sind, können nach den oben erwähnten ersten auslösenden Vorfällen folgende möglichen
Schritte zur Ausbildung von TLE ablaufen: Durch Lesionen kann ein axonales Wachstum
ausgelöst werden, das zur Ausbildung von neuen synaptischen Verbindungen führt
12 1. Einleitung
(McKinney et al., 1997). So kommt es zur Ausbildung von pathologisch verknüpften
Neuronen, die fähig sind, synchrone Aktionspotentiale auszulösen (Bragin et al., 2000). Dies
kann in der postsynaptischen Zelle einen glutamatabhängigen Ca2+-Konzentrationsanstieg
verursachen, welcher über die Aktivierung von PLA2 und NOS zur Überproduktion von freien
Radikalen und zur Nekrose oder Apoptose führt (Leist und Nicotera, 1998). Während dieser
Phase können zwar keine offensichtlichen Anfälle beobachtet werden, aber man nimmt an,
dass ein Absterben von anfälligen Zellen und eine neuronale Reorganisation stattfindet. Da
eine Subgruppe von hippokampalen GABAergen Neuronen besonders anfällig auf
anfallsinduzierten Zelltod ist (Robbins et al., 1991), kann angenommen werden, dass deren
Tod die Möglichkeit von weiteren Anfällen erhöht und es zur Ausbreitung von
pathologischen, neuronalen Entladungen über weitere Regionen des limbischen Systems
kommt. Wenn sich das Netzwerk aus pathologisch verknüpften Neuronen bis zu den
motorischen Regionen ausdehnt, können die ersten epileptischen Symptome beobachtet
werden (Bragin et al., 2000). Für Patienten mit TLE ist es deswegen äusserst wichtig, dass mit
einer geeigneten Therapie so schnell wie möglich begonnen wird, um weitere Anfälle und die
damit verbundene Verschlechterung der Krankheit zu verhindern.
1.1.2. Das Problem der Pharmakoresistenz
Epileptische Anfälle können bei der Mehrheit der Patienten (ca. 70 %) mittels
antiepileptischer Medikamente (AED) unter Kontrolle gebracht und in der Regel nach
zweijähriger, anfallsfreier Periode wieder abgesetzt werden. Es gibt jedoch Patienten, die trotz
optimaler, medikamentöser Behandlung immer noch Anfälle haben. Schätzungsweise 35 %
aller Patienten mit partieller Epilepsie, vor allem diejenigen mit TLE, sind pharmakoresistent
gegen alle momentan bekannten AEDs (Dam, 1996; Devinsky, 1999). Warum einige
Patienten auf medikamentöse Behandlungen ansprechen und andere nicht, ist bisher nicht
bekannt. Die Überexpression des Gens für multiple Medikamentenresistenz (Mdr1), welches
für eine energieabhängige Efflux-Pumpe zur Entfernung von planaren, hydrophobischen
Molekülen kodiert, könnte jedoch eine mögliche Ursache dafür sein. In Gehirngewebe-
Extrakten von Patienten mit unbehandelbarer Epilepsie konnte eine 10mal höhere Menge
Mdr1 mRNA gefunden werden (Tishler et al., 1995), was darauf hindeutet, dass eine zu
niedrige intraparenchymale AED-Konzentration die Pharmakoresistenz verursachen könnte.
Für pharmakoresistente Patienten kann mit Hilfe von AEDs zumindest eine Verbesserung der
epileptischen Symptome erreicht werden. Dabei ist es sehr wichtig, die optimale Dosis zu
1. Einleitung 13
finden, welche das Verhältnis zwischen Anfallsstärke und Anfallshäufigkeit zu den
unerwünschten Nebenwirkungen in einer erträglichen Balance hält. Prinzipiell kommt auch
eine Kombinationstherapie mit mehreren AEDs in Frage. In einer klinischen Studie konnte
jedoch gezeigt werden, dass eine Polytherapie nur in seltenen Fällen (ca. 10 %) zur
vollständigen Kontrolle der Anfälle führt (Mattson et al., 1992). Ausserdem hat eine
Monotherapie oft weniger unerwünschte Nebenwirkungen, keine problematischen
Medikamenteninteraktionen und ist für den Patienten billiger und einfacher zu handhaben.
Kann die Anfallshäufigkeit und Anfallsstärke für den Patienten mit Hilfe von AEDs nicht auf
ein erträgliches Mass reduziert werden, bleibt zur Zeit nur noch die chirurgische Entfernung
des epileptischen Fokus (Ojemann, 1997), die mit sehr aufwendigen Abklärungen verbunden
ist. Damit keine essentiellen Hirnfunktionen, wie Gedächtnis oder Sprachzentrum, durch
einen operativen Eingriff beeinträchtigt werden und eine minimale Menge Hirngewebe
entfernt werden kann, kommen die folgenden nicht-invasiven Methoden zur exakten
Lokalisation des epileptischen Fokus zur Anwendung: EEG Ableitungen von der Kopfhaut,
fMRI („functional Magnetic Resonance Imaging“), PET („Positron-Emission Thomography“)
und SPECT („Single-Positron-Emission Computed Tomography“) (Engel, 1996). Wenn diese
nicht-invasiven Methoden keine zufriedenstellenden Ergebnisse liefern, können bei etwa
50 % dieser Patienten ins Hirn implantierte Elektroden zur genaueren topographischen
Bestimmung führen (Dam, 1996). Nach der operativen Entfernung des epileptischen Fokus ist
es jedoch nicht sicher, ob auch die epileptischen Anfälle eliminiert wurden. Die Erfolgsquote
hängt dabei stark von der epileptischen Hirnregion ab: Sie liegt bei 67.9 % für den vorderen
Temporallappen und nur bei 45.1 % für den Neocortex (Engel, 1996).
1.1.3. Konventionelle antiepileptische Medikamente
Konventionelle, antiepileptische Medikamente können Anfälle entweder durch direkte
Inhibition der Reizleitung, durch Verstärkung der inhibitorischen Neurotransmission oder
durch Reduktion der exzitatorischen Neurotransmission unterdrücken. Eine Auswahl von
bekannten antiepileptischen Medikamenten und ihrer Effekte auf verschiedene Ionenkanäle ist
in Tabelle 1.1 zusammengefasst.
14 1. Einleitung
Tab. 1.1: Antiepileptische Medikamente und ihre Wirkung auf verschiedene
Ionenkanäle
Natrium-
Kanal
T-type
Calcium-Kanal
GABA Rezeptor
/ Chlorid-Kanal
NMDA Rezeptor
/ Kationenkanal
Phenytoin ++ - - -
Carbamazepin ++ - - -
Valproat ++ + / ? - -
Ethosuximid - ++ - -
Barbiturate + - + -
Benzodiazepine + - ++ -
Lamotrigine + - - -
Felbamat + / ? - - + / ?
++, starker Effekt; +, schwacher Effekt; -, kein Effekt; ?, widersprüchliche Ergebnisse
Die momentan verfügbaren Pharmakotherapien gegen Epilepsie sind symptomatischer Natur:
Die erhältlichen AEDs können zwar Anfälle unterdrücken, sind aber in der Prävention
epileptischer Anfälle unwirksam. So wurde in Studien über den Effekt von häufig
gebrauchten AEDs wie Phenytoin und Carbamazepin auf die Entwicklung von post-
traumatischer Epilepsie gezeigt, dass diese die Anfälle nur in den ersten Wochen
unterdrücken, danach jedoch den zugrundeliegenden pathologischen Prozess nicht aufhalten
können (Hernandez, 1997). Eine therapeutische Strategie, die präventiv auf die Entwicklung
der Epilepsie wirkt und zudem den normalen Krankheitsverlauf ändert, könnte zu einer
vielversprechenden neuen Therapie führen (Pitkanen und Halonen, 1998).
1.1.4. Ratten mit genetisch vererbter, primär generalisierter Epilepsie (GEPR-9)
Das Modell genetisch vererbter Epilepsieanfälligkeit der Ratte („genetically epilepsy-prone
rat, GEPR) ist charakterisiert durch vererbte, primär generalisierte, tonisch - klonische
Anfälle. Es existieren zwei Rattenstämme, GEPR-3 mit moderaten und GEPR-9 mit starken
Anfällen (Dailey et al., 1989). Die GEPR sind ursprünglich durch selektive Inzuchtkreuzung
von Sprague – Dawley Ratten, die spontane epileptische Anfälle auf audiogene Reize zeigten,
entstanden. Es werden jedoch auch spontane, sowie durch Hyperthermie ausgelöste Anfälle
beobachtet (Statnick et al., 1996). Messungen von Neurotransmitter-Konzentrationen,
1. Einleitung 15
Enzymaktivität, Rezeptor-Bindung, neuronaler Transportfunktionen und der Reaktion auf
sekundäre Botenstoffe weisen auf massive Fehlfunktionen des serotoninergen und
noradrenergen Systems in diesen Ratten hin (Dailey et al., 1995).
Die audiogenen Anfälle der in dieser Arbeit zur Abklärung der antikonvulsiven Eigenschaften
von Adenosin-Rezeptor-Agonisten verwendeten GEPR-9 bestehen aus wildem Herumrennen,
gefolgt von einem generalisierten tonischen Krampf, der in die tonische Streckung der
Hinterläufe mündet. Diese Konvulsionen, welche primär generalisierte tonisch – klonische
Anfälle beim Menschen imitieren, und die erhöhte Anfälligkeit dieser Ratten auf weitere
Prozesse der Anfallsentwicklung, machen die GEPR zu einem wichtigen Modell der primär
generalisierten Epilepsie (Chakravarty und Faingold, 1996). Auch aus pharmakologischer
Sicht ist dieses Modell interessant: Alle klinisch etablierten, antiepileptischen Medikamente
reduzieren auch die Stärke der audiogenen Anfälle der GEPR.
1.1.5. Das Kindling-Modell der Ratte
Das Kindling-Modell der Ratte ist eines der am meisten verwendeten Tiermodelle der
Epilepsieforschung, das ebenso für das Studium der Entstehung von epileptischen Anfällen,
wie auch für das Testen neuer AEDs verwendet wird. Ausserdem ist es zur Zeit das einzige
Tiermodell, dass die antikonvulsiven Eigenschaften von bereits etablierten und neuen AEDs
gegen Temporallappen-Epilepsie (TLE), die häufigste Form von komplexer partielle
Epilepsie beim Menschen, korrekt vorhersagt (Racine, 1978) (Loscher und Fiedler, 2000). Es
gibt jedoch noch weitere Gründe, welche das Kindling-Modell für komplex partielle und
sekundär generalisierte Epilepsien relevant machen (Majkowski, 1999): (i) Das Phänomen des
Kindlings tritt in allen bisher erforschten Spezies auf, und es ist darum anzunehmen, dass dies
auch für den Menschen gilt. (ii) Wie bei der Epilepsie wird auch beim Kindlingprozess häufig
eine progressive Verstärkung der Anfälle beobachtet. (iii) Die klinischen Eigenschaften von
partiellen und sekundär generalisierten, tonisch-klonischen Anfällen und die EEG Muster in
gekindelten Tieren weisen eine auffallende Ähnlichkeit mit denen von epileptischen Patienten
auf.
Unilateral in den Hippokampus implantierte Elektroden erlauben die repetitive Applikation
von subkonvulsiven elektrischen Stimuli, welche diese Struktur des limbischen Systems zu
neuronalen Entladungen zwingen. Dadurch entsteht allmählich ein epileptischer Fokus im
Hippokampus, von dem bekannt ist, dass dort bei Patienten mit TLE verschiedene molekulare
Veränderungen ablaufen (Loup et al., 2000; Mathern et al., 1999). Ausserdem kann Kindling
16 1. Einleitung
auch als eine progressive Verstärkung der neuronalen Antwort einer Hirnregion angesehen
werden, die eng verwandt mit der Langzeitverstärkung synaptischer Aktivität zu sein scheint:
Ähnlich wie bei der Langzeitpotenzierung synaptischer Effizienz (LTP), die durch kurze
Salven hochfrequenter Stimulationen ausgelöst wird (Majkowski, 1999), führt die repetitive
Verabreichung hippokampaler Stimulationen mit fortschreitender Anzahl zur Verstärkung
neuronaler Entladungen. Dieses Phänomen der neuronalen Plastizität wird bei Lernprozessen
oder Konsolidierung des Gedächtnisses beobachtet (Majkowski, 1999). Darum wurden schon
in sehr frühen Stadien der Kindling-Forschung Ähnlichkeiten zwischen Kindling und Lernen
postuliert: Beide Prozesse zeigen (i) permanente und weitverbreitete Veränderungen von
neuronaler Aktivität durch repetitive Stimulation; (ii) rückwirkende Auslöschung alter
neuronaler Reaktionen durch den Aufbau von neuen Reaktionen; (iii) eine wichtige Rolle des
limbischen Systems; (iv) ähnlich starre Prinzipien, um in kürzester Zeit optimale Resultate
beim Lernen wie auch beim Kindling zu erreichen.
Die im Kindling-Modell der Ratte durch elektrische Stimulation ausgelösten, epileptischen
Anfälle werden auf einer Skala von 0 – 5 klassifiziert (Racine, 1978). Dabei representiert die
Stärke 0 keinen, und die Stärke 5 einen vollen tonisch – klonischen Anfall. Zusätzlich zu
diesen beobachtbaren Anfällen könnten die gleichzeitig auftretenden neuronalen,
epileptiformen Entladungen im EEG sichtbar gemacht und aufgenommen werden.
1. Einleitung 17
1.2. Adenosin
1.2.1. Adenosin als neues pharmakologisches Prinzip zur Behandlung von Epilepsie
Da alle in der Tabelle 1.1 aufgeführten antiepileptischen Medikamente gegen einige Formen
der Epilepsie versagen und den zugrundeliegenden pathologischen Prozess nicht aufhalten
können, wurde in dieser Arbeit ein neues pharmakologisches Prinzip verwendet, welches auf
einer Therapie mit Adenosin als inhibitorischen Neuromodulator basiert.
In humanen Microdialyse-Studien konnte gezeigt werden, welche wichtige Rolle Adenosin im
Bezug auf die Unterdrückung epileptischer Anfälle spielt: Der Adenosinspiegel im Liquor
cerebrospinalis dieser Patienten stieg nach einem epileptischen Anfall bis auf das 30fache an
(During und Spencer, 1992). Adenosin scheint beim Menschen die Funktion zu haben, einen
Anfall zu beenden und für die Refraktärzeit danach verantwortlich zu sein. Auch aus
Tiermodellen von Epilepsie, Schlaganfall und chronischem Schmerz ist bekannt, dass
Adenosin neuroprotektiv und neuromodulatorisch wirkt (Poon und Sawynok, 1998; Sawynok
et al., 1998; Schubert et al., 1997).
Trotz dieser Eigenschaften konnten weder Adenosin noch dessen Analoga bisher als mögliche
AEDs systemisch eingesetzt werden, da unerwünschte periphere Nebenwirkungen, wie die
Verminderung von Herzfrequenz, Blutdruck und Körpertemperatur, eine klinische
Anwendung verhinderten (Dunwiddie, 1999). Aufgrund dieser peripheren Nebenwirkungen
und der geringen Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke für Adenosin (Pardridge et al., 1994),
ergibt sich für die Therapie fokaler Epilepsie die Notwendigkeit einer lokalen Applikation
direkt ins Gehirn.
1.2.2. Biologische Effekte von Adenosin im Zentralnervensystem
Adenosin entfaltet seine Wirkung als inhibitorischer Neuromodulator durch Bindung an
Adenosin-Rezeptoren. Vier verschiedene Adenosin-Rezeptorsubtypen (A1, A2A, A2B, A3)
wurden kloniert und charakterisiert (Dunwiddie und Masino, 2001) (Tabelle 1.2). Es handelt
sich bei allen Subtypen um G-Protein-gekoppelte, metabotrope Rezeptoren mit sieben
Transmembranhelices.
18 1. Einleitung
Die neuroprotektiven und anfallssuppressiven Eigenschaften von Adenosin werden vor allem
über den Adenosin-A1-Rezeptor vermittelt, der im Gehirn am häufigsten vorkommt und mit
10nM von allen vier Adenosin-Rezeptorsubtypen die höchste Affinität für Adenosin hat
(Jacobson und van Rhee, 1997; Dunwiddie und Masino, 2001). Mindestens drei zelluläre
Mechanismen werden durch Aktivierung von Adenosin-A1-Rezeptoren ausgelöst (Abb. 1.1,
Tab. 1.2): (i) Der Adenosin-A1-Rezeptor stabilisiert das Membranpotential von
postsynaptischen Neuronen über Aktivierung von K+- und Ca2+-Kanälen (Wu und Saggau,
1994); (ii) Der Ca2+-Einstrom wird auch in der präsynaptischen Zelle durch direkte Inhibition
von Ca2+-Kanälen unterdrückt; (iii) Die Freisetzung von Neurotransmittern, vor allem von
Glutamat, wird gehemmt (Scanziani et al., 1992).
Diese Mechanismen drosseln den Energieverbrauch der Neuronen, und die intrazelluläre
ATP-Konzentration kann über einem kritischen Niveau gehalten werden, um Ca2+ wieder aus
den Zellen zu entfernen (Dunwiddie und Masino, 2001). Somit wird eine Akkumulation von
Ca2+ verhindert, die oxidativen Stress auslösen und zu Schäden führen könnte (Kap. 1.1.). In
einer Arbeit mit neuronalem Gewebe von neugeborenen Ratten liess sich die Affinität von A1-
Rezeptoren zu Adenosin durch einen allosterischen Verstärker (PD 81273) erhöhen, wodurch
ein protektiver Effekt erreicht wurde (Halle et al., 1997).
Der A2A-Rezeptor ist nur in wenigen Regionen des Gehirns exprimiert und aktiviert vor allem
die Adenylatcyclase. Adenosin-Rezeptor-Antagonisten, wie zum Beispiel Koffein, scheinen
ihren stimulierenden Effekt vor allem über A1- und A2A-Rezeptoren zu vermitteln (Fredholm
et al., 1999; Marston et al., 1998), wobei die Stimulation der Bewegungsaktivität
hauptsächlich ein A2A-Effekt sein könnte (El Yacoubi et al., 2000). Der A2A-Rezeptor kommt
vor allem im Striatum, den olfaktorischen Tuberkeln und im Nucleus Accumbens vor,
während der A2B-Rezeptor in allen Gehirnregionen gefunden wird. Der A2B-Rezeptor aktiviert
ebenso wie der A2A-Rezeptor die Adenylatcyclase, jedoch konnte ihm bisher keine
spezifische, physiologische Funktion zugeordnet werden, da keine geeigneten A2B-
spezifischen Agonisten oder Antagonisten zur Verfügung stehen. Ähnlich ist die Situation für
den A3-Rezeptor. Es wurde jedoch beschrieben, dass er A1-Rezeptoren über einen Protein-
Kinase-C abhängigen Mechanismus entkoppelt (Dunwiddie et al., 1997; Macek et al., 1998)
und somit die Aktivität der anderen Rezeptoren modulieren könnte.
1. Einleitung 19
Abb. 1.1: Adenosin-A1-Rezeptorfunktion in einer glutamatergen Synapse
Adenosin aktiviert A1-Rezeptoren, die dann pre- und postsynaptische Wirkungen
enfalten können: (i) Presynaptisch inhibieren sie über Gi/o-Proteine Ca2+-Kanäle und
damit vor allem die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat.
(ii) Postsynaptisch wird durch negative Modulation der Ca2+- und positive
Modulation der K+-Flüsse das Membranpotential stabilisiert.
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1. Einleitung 21
1.2.3. Adenosin-Metabolismus und Transport
Bildung, Abbau, Freisetzung und Aufnahme von Adenosin sind die vier wichtigsten
Parameter, welche die intra- und extrazelluläre Konzentration von diesem Nukleosid
bestimmen. Unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen können diese
Parameter stark variieren und sind die Grundlage für ein kompliziertes, regulatorisches
System. Die Bildung und der Abbau von Adenosin wird durch vier Enzyme kontrolliert,
während membrangebundene Transportproteine für die Freisetzung und Aufnahme
verantwortlich sind. Die vier Adenosin umsetzenden Enzyme sind Adenosin-Deaminase
(ADA; EC 3.5.4.4), Adenosin-Kinase (ADK; EC 2.7.1.20), 5‘-Nukleotidase (EC 3.1.3.5) und
S-Adenosylhomocysteinhydrolase (SAH-Hydrolase, EC 3.3.1.1) (Ijzerman und Van der
Wenden, 1997) (Abb. 1.2). In Neuronen akkumuliert Adenosin, wenn der ATP Verbrauch der
Zelle die Syntheserate von ATP übersteigt. Diese Situation kann bei hohen
Energieanforderungen, beispielsweise während epileptischen Entladungen, oder bei einem
Mangel an Sauerstoff, beispielsweise bei einer Ischämie, auftreten. Als Folge sinkt der ATP
Spiegel und die Konzentrationen von ADP, AMP und Adenosin steigen an. Weil die
intrazelluläre ATP-Konzentration unter normalen Bedingungen hoch ist, typischerweise im
Bereich von 3 mM, kann schon eine Umsetzung von 1 % ATP zu Adenosin zu einem
100fachen Anstieg des intrazellulären Adenosinspiegels führen (Dunwiddie und Masino,
2001).
Auch die Inhibition der beiden Adenosin-Abbauenden Schlüsselenzyme ADK oder ADA
führt zu einem intrazellulären Anstieg der Adenosinkonzentration (Brundege und Dunwiddie,
1998). Adenosin gelangt vor allem durch equilibrierende Nukleosid Transporter, auch
erleichterte Diffusionstransporter genannt, aus den Zellen hinaus (Dunwiddie und Diao, 2000;
Ward et al., 2000). Unter basalen Bedingungen konnte gezeigt werden, dass ADA-Inhibitoren
nur einen schwachen Anstieg der Adenosin-Konzentration verursachen (Lloyd und Fredholm,
1995), während die Inhibition von ADK zu einem viel höheren Anstieg führte (Lloyd und
Fredholm, 1995). Dies ist nicht verwunderlich, da der Km-Wert für ADA 1 – 2
Grössenordnungen über demjenigen von ADK liegt (Arch und Newsholme, 1978).
Eine experimentelle Erhöhung der Adenosinkonzentration kann somit durch genetische
Inaktivierung des Ada- oder Adk-Gens erreicht werden, wobei die Inaktivierung des Adk-Gens
zu einer höheren Adenosinfreisetzung führen sollte.
22 1. Einleitung
Abb. 1.2: Intra- und extrazellulärer Adenosinstoffwechsel
Die intrazelluläre Adenosinkonzentration wird durch die Enzyme 5‘-Nukleotidase,
S-Adenosylhomocysteinhydrolase (SAH-Hydrolase), Adenosinkinase (ADK),
Adenosindeaminase (ADA) und equilibrative Nukleosidtransporter reguliert
(Ijzerman und Van der Wenden, 1997).
AMP = Adenosinmonophosphat, ADP = Adenosindiphosphat, ATP = Adenosin-
triphosphat, IMP = Inosinmonophosphat, SAH = S-Adenosylhomocystein.
1. Einleitung 23
1.3. Zelltransplantation als therapeutische Option
Die Verwendung von neuroaktiven Substanzen als therapeutische Substanz im
Zentralnervensystem ist für die moderne Neurobiologie von zentraler Bedeutung. Eine
einfache orale oder transdermale Verabreichung einer solchen Substanz ist jedoch oft durch
verschiedene Faktoren limitiert. So können zum Beispiel Adenosin und A1-Rezeptor-
Agonisten wegen schweren peripheren Nebenwirkungen nicht systemisch als antiepiletisches
Medikament verabreicht werden. Oft verhindert auch die Blut-Hirn-Schranke, dass gewisse
Moleküle wegen mangelnder Permeabilität aus der Zirkulation ins Hirngewebe übertreten
können (Poduslo und Curran, 1996). Damit diese Moleküle das Zentralnervensystem
erreichen, müssen sie mittels eines adäquaten Systems, wie zum Beispiel mit Hilfe einer
Mikropumpe, direkt ins Gehirn injiziert werden. Diese Methode ist aber von limitiertem
Nutzen, einerseits wegen der geringen Stabilität gewisser therapeutischer Substanzen (Penn et
al., 1997) und andererseits wegen des Risikos einer Infektion, die beim periodischen
Auffüllen der Mikropumpe auftreten kann.
1.3.1. Transplantation von Zellen
Eine Möglichkeit therapeutisch aktive Substanzen direkt am benötigten Ort herzustellen, ist
die direkte Implantation von Zellen ins Gehirn. Zelltransplantationen wurden in zahlreichen
Tiermodellen von neurodegenerativen Krankheiten verwendet und bereits beim Menschen
gegen Chorea-Huntington und die Parkinsonsche Krankheit eingesetzt. Bei Patienten mit
Chorea-Huntington konnte nach direkter Transplantation von humanen, fötalen Neuroblasten
in das Striatum eine Verbesserung der koordinativen und kognitiven Funktionen bei drei von
fünf Patienten gefunden werden (Bachoud-Levi et al., 2000). In einer Doppelblindstudie zur
Behandlung der Parkinsonschen Krankheit wurden humane dopaminerge Zellen aus
mesencephalischem Gewebe von 7 – 8 Wochen alten, abgetriebenen, menschlichen
Embryonen bilateral ins Putamen injiziert (Freed et al., 2001). Bei Patienten unter 60 Jahren
verbesserte sich der Zustand im Vergleich zur Kontrollgruppe, gemessen an der
vereinheitlichten Bewertungsskala der Parkinsonschen Krankheit (Unified Parkinson’s
Disease Rating Scale, UPDRS), signifikant. Bei Patienten über dem 60. Altersjahr konnte
jedoch keine Verbesserung beobachtet werden. Die Studie wurde ohne immunsupprimierende
Substanzen durchgeführt, da allogene Nervenzell-Transplantate keine Immunantwort
24 1. Einleitung
produzieren (Ansari et al., 1995). Für die Therapie wurde jedoch pro Patient
mesencephalisches Gewebe von 4 Embryonen verwendet, wodurch sich zahlreiche praktische
und ethische Probleme ergaben. Darum sind alternative Quellen für therapeutische
Transplantate nötig. So wurden in einer anderen Studie fötale dopaminerge Zellen von
Schweinen für Transplantationen verwendet (Fink et al., 2000). 10 Patienten wurden ein Jahr
nach intrastriataler Injektion von je 12 Millionen fötaler Schweinezellen, die aus dem
ventralen Mesencephalon gewonnen wurden, auf ihren klinischen Zustand geprüft. Nach den
UPDRS Kriterien konnte eine Verbesserung von 19 % festgestellt werden. Nachdem jedoch
bekannt wurde, dass menschliche Zellen in vitro mit endogenen Schweine-Retroviren (Pig
Endogenous Retrovirus, PERV) infiziert werden können, sind Sicherheitsbedenken für neue
Therapien mit Xenotransplantaten aufgetaucht (Martin et al., 2000). Ebenfalls können bei
nicht autologen Transplantaten immunologische Abstossungsreaktionen erfolgen, was das
Überleben von Xenotransplantaten vermindert (Hottinger und Aebischer, 1999). Das Gehirn
ist ein immunprivilegiertes Organ, welches eine niedrige Expression von MHC Proteinen
aufweist. Dies ändert sich jedoch unter pathologischen Bedingungen: Aktivierte
Lymphozyten können die Blut-Hirn-Schranke durchqueren, und Mikroglia sowie Astrozyten
bilden MHC-I und II Proteine aus (Gehrmann et al., 1995). Durch Immunsuppression mit
Cyclosporin A oder FK 506 kann das Überleben von Xenotransplantaten zwar verbessert
werden, aber diese Behandlung kann viele unerwünschte Nebenwirkungen mit sich bringen.
1.3.2. Transplantation von eingekapselten Zellen
Zellen können in selektive, semipermeable Membranen eingekapselt werden, wodurch
Probleme der Immunabstossung vermieden werden: Die Membran umgibt die Zellen und ist
so beschaffen, dass ihre Porengrösse durchlässig für Sauerstoff und benötigte Nährstoffe,
sowie für die in den Zellen hergestellte therapeutische Substanz ist. Normalerweise wird ein
molekulares Ausschluss-Gewicht von 50 kD verwendet. So wird auch verhindert, dass
grössere, zytotoxische Bestandteile des Immunsystems eindringen können. Ausserdem erlaubt
diese physikalische Barriere die Transplantation von verschiedensten, auch xenogenen
Zelllinien. Bei unerwünschten Nebeneffekten kann eine solche Zellkapsel jederzeit wieder
entfernt werden.
Erste klinische Versuche mit in den Intrathekalraum transplantierten Zellkapseln wurden an
Patienten durchgeführt, die an amyotropher Lateralsklerose (ALS) oder an chronischem
Schmerz leiden (Aebischer et al., 1996; Buchser et al., 1996). Im ALS Versuch wurden
1. Einleitung 25
eingekapselte, manipulierte Babyhamster-Nierenzellen (BHK-Zellen) verwendet, die
humanes CNTF („ciliary neurotrophic factor“) freisetzen und gute neuroprotektive
Eigenschaften in vivo und in vitro zeigten (Baumgartner und Shine, 1997). In einer klinischen
Testphase I/II wurden keine der bei einer systemischen Gabe von hCNTF auftretenden
unerwünschten Nebenwirkungen beobachtet, und die Freisetzung des therapeutischen Faktors
hielt bis zu 20 Wochen an (Zurn et al., 2000). Es trat jedoch kein signifikanter
Behandlungseffekt ein, was eventuell darauf zurückzuführen war, dass sich die Patienten alle
in einem weit fortgeschrittenen Stadium von ALS befanden. Im klinischen Versuch gegen
chronischen Schmerz wurden xenogene Chromaffinzellen, welche starke analgesische
Komponenten freisetzen, eingekapselt und in den Intrathekalraum implantiert. Das Überleben
und die biochemische Funktion der eingekapselten Zellen für eine Dauer bis zu 6 Monaten
wurde nach Explantation der Zellen mittels Histologie und Analyse der sekretorischen
Eigenschaften ermittelt. Bei einigen Patienten dieser Studie war eine Reduktion der
Morphinmedikation möglich, und es wurde eine Verbesserung der Schmerzen beobachtet
(Buchser et al., 1996).
Abb. 1.3: Prinzip der Immunisolation durch Einkapselung
Adenosin-freisetzende Zellen sind in einer Kollagenmatrix eingebettet. Die Poren
der Membran erlauben die Diffusion von Nährstoffen in die Kapsel hinein und von
Adenosin aus der Kapsel hinaus. Die Membran verhindert das Eindringen von
Komponenten des Immunsystems und das Ausbreiten der eingekapselten,
xenogenen Zellen ausserhalb der Kapsel.
26 2. Ziel der Dissertation
2. Ziel der Dissertation
Aufgrund des hohen Anteils an Pharmakoresistenz bei der Behandlung von Epilepsien, ergibt
sich die Notwendigkeit zur Entwicklung neuer Therapien. Ziel der vorliegenden Arbeit war
es, ein neues pharmakologisches Prinzip zu etablieren. Die lokale Freisetzung von Adenosin
sollte als potentiell antikonvulsive Therapie evaluiert werden. Die Entwicklung eines neuen
Therapiemodells sollte in folgenden Schritten erfolgen:
1. Demonstration der antikonvulsiven Eigenschaften von systemisch verabreichten
Adenosin-Rezeptor Agonisten in einem Tiermodell der generalisierten Epilepsie (GEPR-9
Ratten)
2. Herstellung und Charakterisierung von Adenosin-freisetzenden Zellen für die lokale
Freisetzung von Adenosin im Hirnventrikel.
3. Verkapselung von Adenosin-freisetzenden Zellen in semipermeable Polymer-Hohlfasern.
4. Demonstration der antikonvulsiven Eigenschaften von Adenosin-freisetzenden
Transplantaten in einem Tiermodell der fokalen Epilepsie (Hippokampales Kindling-
Modell der Ratte).
3. Resultate 27
3. Resultate
3.1. Antikonvulsiver Effekt durch Aktivierung der Adenosin-Rezeptoren
A1 und A2
Es wurde zunächst pharmakologisch geprüft, ob beide Adenosin-Rezeptoren (A1 und A2) in
der Vermittlung antikonvulsiver Eigenschaften eine Rolle spielen. Dies ist von Bedeutung,
um eine potentiell antikonvulsive Wirkungsselektivität des physiologischen Liganden
Adenosin abschätzen zu können. Experimentell wurde hierzu das Tiermodell der primär
generalisierten Epilepsie, die genetisch Epilepsie-anfälligen Ratte („genetically epilepsy-
prone rat, GEPR-9), verwendet. Die GEPR-9 Ratten zeigen durch audiogene Reize
ausgelöste, tonisch-klonische Anfälle. In diesem Modell wurde die Wirkung von systemisch
verabreichten Adenosin-Rezeptor Agonisten auf epileptischen Anfälle bisher noch nicht
erforscht. Zunächst wurde geprüft, ob beide Adenosin-Rezeptoren für eine antikonvulsive
Wirkung als Zielstruktur in Frage kommen. Im ZNS sind A1-Rezeptoren vorherrschend.
Daher wurde die antikonvulsive Wirkung (i) des A1-Rezeptor-Agonisten 2-chloro-N6-
cyclopentyladenosin (CCPA, 3 mg/kg Körpergewicht, i.p.) verglichen mit (ii) dem
A2A-Rezeptor-Agonisten 5‘-(N-Cyclopropyl)-carboxamidoadenosin (CPCA, 10 mg/kg
Körpergewicht, i.p.) und (iii) dem bereits etablierten, antiepileptischen Medikament
Phenytion (60 mg/kg Körpergewicht, i.p.). Als Kontrolle dienten Vehikel-Injektionen
(1 ml/kg Körpergewicht, i.p.). Nach der Injektion der jeweiligen Substanz oder Vehikel
wurden die Tiere in einer gepolsterten Testbox einem 30 s dauernden, 120 dB lauten,
audiogenen Teststimulus ausgesetzt und die Anfallsstärke bestimmt. Die mit CCPA
behandelten GEPR-9 Ratten (Anfallsstärke 1.17 ± 0.88; n = 11) zeigten keinen statistisch
signifikanten Unterschied zu den mit Phenytoin behandelten Tieren (Anfallsstärke
0.82 ± 0.44; n = 11) (Abb. 3.1). Nach der Injektion des A2A-selektiven Agonisten CPCA
(n = 9) wurde sogar eine komplette Unterdrückung der Anfälle beobachtet (Abb. 3.1). Alle
getesteten Substanzen zeigten somit eine hochsignifikante Verminderung der Anfallsstärke
gegenüber der Vehikelbehandlung (P < 0.001). Dadurch konnte gezeigt werden, dass die
Adenosinrezeptor-Agonisten CCPA und CPCA mindestens so effizient wie Phenytoin zur
Unterdrückung von primär generalisierten Anfällen im GEPR-9-Modell eingesetzt werden
können. Ausserdem ist damit gezeigt worden, dass beide Adenosin-Rezeptoren für die
28 3. Resultate
antikonvulsive Wirkung von Bedeutung sind. Dies unterstützt die Hypothese, dass Adenosin,
welches an A1 und an A2 Rezeptoren bindet, als Antikonvulsivum wirksam sein könnte.
Nach der Behandlung mit CCPA, CPCA und Phenytoin zeigten sämtliche Tiere im Vergleich
zur Vehikel-Injektion Anzeichen einer Sedation, welche sich in herabgesetztem Muskeltonus,
Ataxie und Schläfrigkeit äusserte. Wegen der starken Nebenwirkungen von systemisch
verabreichtem Adenosin (Dunwiddie, 1999) kann die therapeutische Wirkung von Adenosin
nur nach lokaler Freisetzung genutzt werden. Dies setzt die Herstellung und Charakterisierung
von Adenosin-freisetzenden Zellen voraus.
Abb. 3.1: Antikonvulsiver Effekt von Adenosinrezeptor-Agonisten im Vergleich zu
Phenytoin in GEPR-9 Ratten
GEPR-9 Ratten wurden mit Adenosinrezeptor-Agonisten CCPA (A1-Agonist,
3 mg/kg Körpergewicht, i.p.) und CPCA (A2A-Agonist, 10 mg/kg Körpergewicht,
i.p.) sowie Phenytoin (60 mg/kg Körpergewicht, i.p.) behandelt. Die
antikonvulsive Wirkung dieser Substanzen gegen audiogen ausgelöste,
generalisierte Anfälle wurde getestet. Dabei zeigten alle drei Substanzen eine
statistisch hoch signifikante Anfallsunterdrückung (P < 0.001): Mit CCPA oder
Phenytoin behandelte Tiere zeigten eine Anfallsstärke von 1.17 ± 0.88 (n = 11)
bzw. 0.82 ± 0.44 (n = 11), während diejenigen mit einer CPCA Behandlung
(n = 9) komplett vor audiogenen Anfällen geschützt waren. Als statistische
Methode wurde Einweg ANOVA mit wiederholer Messung der gleichen Werte
verwendet. *** = P < 0.001 im Student’s t-Test; Fehlerbalken sind als
Standardabweichung vom Mittelwert angegeben.
3. Resultate 29
3.2. Herstellung und Charakterisierung von Adenosin-freisetzenden Zellen
Als Quelle stetiger, lokaler Adenosin-freisetzung sollten Zellen dienen, die durch
Inaktivierung eines der beiden Schlüsselenzyme im Adenosinstoffwechsel, Adenosin-Kinase
(ADK) und Adenosin-Deaminase (ADA), erwartungsgemäss eine intrazelluläre Anreicherung
von Adenosin zeigen und damit zu dessen Freisetzung aus der Zelle über equilibrierende
Adenosin-Transporter fähig sind. Deshalb wurden mehrere Zelllinien mit Defekten in ADA
und ADK hergestellt und charakterisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden diese Zelllinien in
semipermeable Hohlfaserkapseln eingeschlossen und in den lateralen Hirnventrikel von
Ratten implantiert. Eine gute Überlebensfähigkeit der Adenosin-freisetzenden Zellen in
implantierten Kapseln war eine Voraussetzung für die Entwicklung eines effizienten,
antikonvulsiven ex vivo Gentherapie-Ansatzes. Darum wurden Zelllinien zur Herstellung von
Adenosin-freisetzenden Zellen verwendet, die (i) bekanntermassen in implantierten
Zellkapseln lange überleben oder (ii) konditional immortalisiert sind, und darum in den
implantierten Kapseln nicht mehr weiterwachsen, wodurch der Energiebedarf gesenkt und ein
Überwachsen der Kapseln verhindert wird oder (iii) durch die Expression von BCL-2 vor
Apoptose geschützt sind.
Zur Herstellung von Adenosin-freisetzenden Zellen wurden folgende Experimente
durchgeführt: (i) BHK-Zellen wurden chemisch mutagenisiert und mit Vidarabin (AraA) auf
eine defekte ADK selektioniert. (ii) Transgene Mäuse, die das konditional immortalisierende
Onkogen TsA58 tragen (Jat et al., 1991), wurden mit ADA defizienten Mäusen (Wakamiya et
al., 1995) gekreuzt, um ADA-defiziente Fibroblasten mit unbegrenztem Wachstum bei 33°C
zu erhalten. (iii) ADA-defiziente Fibroblasten wurden viral mit dem Apoptose-Inhibitor Bcl-2
transfiziert, um die Zellen in den Kapseln vor Apoptose zu schützen.
Die Zelllinie D4, mit Defekten in den beiden Enzymen ADA und ADK, von Prof. John
Drach, University of Michigan (Ann Arbor, USA) für diese Arbeit zur Verfügung gestellt.
30 3. Resultate
3.2.1. Herstellung und Charakterisierung Adenosin-freisetzender BHK-Zellen
Die Einkapselungstechnik wurde ursprünglich für BHK-WT Zellen (Wildtyp Baby-Hamster-
Kidney-Zellen) entwickelt (Aebischer et al., 1995). In eingekapselter Form haben BHK-
Zellen ein langes Überlebenspotential (> 20 Wochen) (Zurn et al., 2000). Aus diesem Grund
wurden BHK Zellen verwendet, um Adensin-freisetzende Zellen herzustellen. Dazu wurden
zunächst BHK-Zellen (5 x 106 Zellen) durch Ethylmethansulfonat (EMS) mutagenisiert und
dann mit steigenden 9-β-D-Arabinofuranosyladenin-Konzentrationen (Vidarabin, AraA)
zusammen mit Erythro-9-[3-(2-hydroxynonyl)]adenin (EHNA) zur Selektion eingesetzt
(Chan und Juranka, 1981): Dabei wird AraA durch eine aktive ADK zu einem Nukleotid
phosphoryliert, welches seine toxische Wirkung über die Hemmung der DNA Synthese
ausübt. Gleichzeitig wird eine Detoxifikation von AraA zu 9-β-D-
Arabinofuranosylhypoxanthin (AraH) durch den spezifischen ADA-Inhibitor EHNA
verhindert. Ausserdem wurde das zur Selektion verwendete Kulturmedium durch Zugabe von
10 % Horse-Serum (HS) komplettiert, da HS im Gegensatz zum standardmässig verwendeten
fötalen Kälberserum (FCS) keine ADA-Aktivität ausfweist. Die Verwendung von HS
verstärkt somit die Selektion und nur Zellen mit defekter ADK können diese überleben.
Ausgehend von 5 x 106 Zellen konnten nach der Selektion 10 Einzelklone isoliert werden, die
gegen 100 µM AraA und 10 µM EHNA resistent waren. Die ADK-Aktivität dieser Klone
wurde durch die Phosphorylierung von radioaktivem Adenosin bestimmt. Bei sämtlichen
Klonen wurden reduzierte ADK-Aktivitäten festgestellt. Zwei Zelllinien, BHK-AK2 und
BHK-AK5, wurden aufgrund ihrer niedrigen ADK-Aktivität von 12.7 ± 1.2 % bzw.
19.8 ± 2.1 % im Vergleich zu BHK-WT Zellen ausgewählt. Durch Inkubation einer
definierten Anzahl Zellen in Zellkulturmedium und deren Zählung nach 64 Stunden, konnte
die Proliferationsrate der Zellen bestimmt werden: Während für BHK-WT Zellen eine
Verdoppelungszeit von etwa 19 Stunden gemessen wurde, lag diese für BHK-AK2 und
BHK-AK5 Zellen bei 35 bzw. 30 Stunden.
Zur Bestätigung der Reduktion der ADK-Aktivität wurde ein Western-Blot mit den
Zellextrakten von BHK-WT und BHK-AK2 angefertigt (Abb. 3.2). Dazu wurden je
107 Zellen in PBS gewaschen, mit Trypsin geerntet und durch dreimaliges Auftauen und
Einfrieren in flüssigem Stickstoff lysiert. Die Proteinmenge in den Zellextrakten wurde
bestimmt und jeweils 40 µg Protein für einen Western-Blot eingesetzt. Zum Nachweis der
ADK wurde spezifisches, polyklonales Antiserum von Kaninchen verwendet. Spezifisch an
ADK gebundene primäre Antikörper wurden dann mit sekundären Antikörpern über eine
3. Resultate 31
gekoppelte Peroxidase, die den Lumineszentfarbstoff „Western-Blot Chmemoluminescence
Reagent Plus“ aktiviert, gefärbt. BHK-AK2 Zellen zeigten im Vergleich zu BHK-WT Zellen
auf dem Western-Blot eine deutliche Reduktion der Bandenstärke von etwa 95 % (Abb. 3.2).
Wegen der stark reduzierten ADK-Aktivität wurde von BHK-AK2 Zellen erwartet, dass sie
Adenosin freisetzen (Kap. 3.2.5) und wegen ihrer Abstammung von BHK-WT Zellen lange in
Zellkapseln überleben.
Abb 3.2: Western-Blot der Adenosin-Kinase aus Zellextrakten
In einem Western-Blot mit Zellextrakten aus BHK-AK2, BHK-WT, B-mix und
D4 Zellen wurde das Enzym Adenosin-Kinase (ADK) durch spezifisches,
polyklonales Antiserum von immunisierten Kaninchen nachgewiesen. Spezifisch
gebundene, primäre Antikörper wurden dann über sekundäre Antikörper gegen
Kaninchenantiserum angefärbt, die durch eine gekoppelte Peroxidase einen
Chemolumineszenzfarbstoff aktivierten. Als Kontrolle dienten 1/1000 U
gereinigte ADK (ADK). In den restlichen Spuren wurden jeweils 40 µg Protein
aufgetragen (D4, B-mix, BHK-AK2, BHK-WT). Links neben dem Blot sind
Grössenmarker mit bekanntem Molekulargewicht in kD angegeben. Bei den D4
Zellen handelt es sich um eine aus B-mix Zellen abstammende Zellinie mit ADA
und ADK Defizienz (Kap. 3.2.4.).
94 kD
67 kD
43 kD
30 kD
32 3. Resultate
Ein möglicher Grund für das lange Überlebenspotential von BHK-WT Zellen in
eingekapselter Form könnte die Expression des Apoptoseblockers BCL-2 sein. In einem
adherent wachsenden Monolayer von BHK-WT Zellen wurde durch
Immunperoxidasefärbung von spezifischen Antikörpern gegen humanes BCL-2
nachgewiesen, dass in BHK-WT Zellen endogen BCL-2 exprimiert wird (Abb. 3.4).
3.2.2. Herstellung und Charakterisierung von ADA-0 Zellen
Eine weitere Möglichkeit, therapeutisch wirksame Zelllinien zu erhalten, besteht in der
Verwendung von transgenen Mäusen als Zellspender. In der vorliegenden Arbeit wurden
deshalb ADA+/- Mäuse (Wakamiya et al., 1995) zur Herstellung von ADA-defizienten,
Adenosin-freisetzenden Zelllinien eingesetzt. Damit solche ADA-defizienten Zellen in vitro
vermehrt werden können und nicht jedes Mal Primärzellen aus ADA-defizienten Mäusen
hergestellt werden müssen, sollten ADA-defiziente Zellinien einen konditional
immortalisierten Phänotyp aufweisen. ADA-/- Mäuse sterben im Embryonalstadium und
standen somit nicht zur Verfügung. Deshalb wurden ADA+/- Mäuse mit Immortomäusen™
(Jat et al., 1991) verpaart. Die verwendeten Immortomäuse™ besassen einen homozygoten
Genotyp für das konditional immortalisierende Onkogen TsA58. Zellen, die dieses Onkogen
exprimieren, zeigen bei 33°C einen konditional immortalisierten Phänotyp: Bei Temperaturen
von 37°C und höher wird TSA58 inaktiviert und das Wachstum der Zellen gestoppt.
Zusätzlich zu dieser temperaturabhängigen Kontrollmöglichkeit wird die Expression von
TsA58 über einen IFN-γ abhängigen Promotor gesteuert. Diese beiden Mechanismen erlauben
es, Zelllinien aus Immortomäusen™ bei 33°C und Zugabe von IFN-γ in vitro unlimitiert zu
kultivieren. Zur Herstellung von ADA-defizienten Zellen wurden die Nachkommen von
ADA+/- Mäusen und Immortomäusen™ wiederum mit ADA+/- Mäusen verpaart. Am
Embryonaltag 14.5 wurden Mäuseembryonen entnommen, unter welchen auch solche mit
dem gewünschten, durch PCR bestimmten Genotypen ADA-/-tsA58+/- gefunden wurden. Aus
diesen Embryos wurden Fibroblasten präpariert und eine ADA-defiziente Zelllinie ADA-0
isoliert, die bei 33°C unter Zugabe von IFN-γ einen immortalisierten Phänotyp aufweist.
Durch die ADA-Defizienz waren diese Zellen in der Lage, Adenosin freizusetzen (Kap.
3.2.5). Mit der gleichen Methode wurde aus einem Embryo der selben Verpaarung mit einem
ADA+/+tsA58+/- Genotyp die Zelllinie ADA-WT erhalten, die zu Kontrollzwecken eingesetzt
wurde.
3. Resultate 33
Damit das Überlebenspotential der ADA-0 oder ADA-WT Zellen in implantierter Form
abgeschätzt werden konnte, wurden diese Zellen in vitro in künstlicher
Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) bei 33°C oder 37°C inkubiert. ADA-0 und ADA-WT Zellen
zeigten bei beiden getesteten Temperaturen innerhalb von 24 h eine veränderte Morphologie,
welche auf Apoptose-Prozesse hindeuten könnte. Da es bekannt ist, dass Zellen für die
Einkapselung robust sein müssen, um sich an ein verändertes Millieu gut anzupassen, könnte
die Übertragung des Apoptoseinhibitorgens Bcl-2 das Überlebenspotential von ADA-0 Zellen
verbessern (Emerich und Winn, 2000).
3.2.3. Transfektion des Apoptoseinhibitors Bcl-2 in ADA-0 Zellen (ADA-7bcl2)
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass BHK-Zellen den Apoptoseinhibitor
BCL-2 exprimieren. Da von BHK-WT Zellen bekannt ist, dass sie mehr als 20 Wochen in
implantierten Kapseln überleben (Zurn et al., 2000), könnte die Übertragung des Bcl-2 Gens
zur Verbesserung der Überlebenseigenschaften von Adenosin-freisetzenden ADA-0 Zellen
durch Inhibition von Apoptose führen. Darum wurde durch virale Transfektion des Vektors
pBPNhBcl-2 (Abb. 3.3) das menschliche Bcl-2 Gen in die ADA-7 Zelllinie, einen Subklon
der ADA-0 Zelllinie mit höherer Adenosin-Freisetzung, übertragen. Bei den viralen Vektoren
handelte es sich um Mo-MLV Retroviren (Moloney Murine Leukemia Viren), die mit Hilfe
einer Verpackungs-Zelllinie hergestellt wurden. Im Gegensatz zu Adenoviren, die nur
transiente Transfektionen erlauben, vermittelt die reverse Transkriptase dieser Retroviren eine
stabile, chromosomale Integration einer von 5‘- und 3‘-LTR flankierten Sequenz (Naldini et
al., 1996). Mit aphotropen Mo-MLV lassen sich proliferierende Zellen mit hoher Effizienz
(bis zu 95 %) transformieren, wodurch sich die Methode von anderen, wie zum Beispiel der
Ca3(PO4)2-Methode, unterscheidet. Da die Viruspartikel keine Gene für den Viruskern und die
Replikation enthielten, wurde eine Vermehrung in den transfizierten Zellen ausgeschlossen.
Es wurden 5 Mal je 105 Zellen in komplettem DMEM ausplattiert und anschliessend mit
unterschiedlichen Virusmengen (104 – 2 x 105 TU) behandelt. Untransfizierte Zellen dienten
als Kontrollen. Sämtliche Zellen wurden mit Puromycin auf ein stabil ins Genom eingebautes,
zwischen 5‘- und 3‘-LTR liegendes Puromycinresistenz-Gen selektioniert. Die Transfektions-
Effizienz wurde in ADA-7 Zellen mit einem durch Mo-MLV Viruspartikel eingebrachten
LacZ-Gen abgeschätzt: Etwa 60 % der mit 2 x 105 TU transfizierten Zellen zeigten eine
Blaufärbung nach Behandlung mit X-Gal. Aus dem Ansatz mit der grössten Anzahl
resistenter Klone wurde die polyklonale Zelllinie ADA-7bcl2 isoliert. Diese Zelllinie wies im
34 3. Resultate
Gegensatz zu den ADA-7 Zellen eine ungehemmte Proliferation bei 37°C auf: Die ADA-
7bcl2 Zellen verdoppelten sich etwa alle 18 Stunden, ohne dass IFN-γ zugegeben werden
musste. Unveränderte ADA-7 Zellen hatten eine Verdoppelungsrate von etwa 80 Stunden bei
33°C und Zugabe von IFN-γ.
In einem Test auf Aktivität des Retrovirus-spezifischen Enzymes reverse Transkriptase
wurden die verwendeten Zellkulturen auf eine mögliche Virus-Kontamination untersucht. Die
Zellkulturmedium-Überstände von konfluent wachsenden ADA-7bcl2-Zellen wurden dazu
ultrazentrifugiert (100'000 g), um allfällig vorhandene Viruspartikel anzureichern. Es konnte
in keinem Zellkulturmedium-Überstand eine Enzymaktivität der reversen Transkriptase des
Mo-MLV Retrovirus nachgewiesen werden.
Die Expression des viral übertragenen Apoptosehemmers BCL-2, wurde in den ADA-7bcl2
Zellen durch eine Immunperoxidasefärbung von spezifischen Antikörpern gegen humanes
BCL-2 nachgewiesen (Abb. 3.4). Im Gegensatz zu den ADA-7bcl2 Zellen zeigten die
unbehandelten ADA-7 Zellen keine BCL-2 Expression. Ausserdem hatten die ADA-7 Zellen
eine lang ausgestreckte und grossflächige Gestalt mit stachelartigen Fortsätzen, während die
ADA-7bcl2 Zellen generell kleiner waren und eine eher rundliche Morphologie aufwiesen.
Wurden die ADA-7bcl2 Zellen in ACSF inkubiert, überlebten sie mehrere Tage ohne
Anzeichen von Zelltod, wodurch sie sich gut für die Einkapselung eignen sollten.
3.2.4. Charakterisierung von D4 Zellen
Durch die Eliminierung beider Adenosin-abbauender Enzyme, ADA und ADK, sollten Zellen
in der Lage sein, mehr Adenosin zu produzieren, als wenn nur eines der beiden Enzyme
ausgeschaltet ist. Deshalb wurde die Zelllinie D4 mit Defekten in ADA und ADK und deren
Ausgangszelllinie B-mix in dieser Arbeit untersucht (Prof. J.C. Drach, University of
Michigan, Ann Arbor, USA). Bei den B-mix Zellen, handelt es sich um grosse, epitheloide,
immortalisierte Tumorzellen der Ratte, die eine ADA-Defizienz aufweisen. B-mix Zellen
wurden über mehrere Wochen durch kontinuierlich gesteigerte AraA-Konzentrationen auf
eine defekte ADK selektioniert. Verschiedene Klone wurden isoliert, die eine Resistenz gegen
bis zu 200 nM AraA aufwiesen. Einer dieser Klone (D4) zeigte Defekte in den Enzymen
ADA und ADK und wurde für diese Arbeit verwendet. Bei den Zelllinien B-mix und D4 gab
es keine morphologischen Unterschiede. Die Verdoppelungsrate beträgt für B-mix Zellen 20
Stunden und für D4 Zellen 44 Stunden.
3. Resultate 35
Die Messung der ADK-Aktivität in D4 Zellen ergab eine Restaktivität von 3.0 ± 0.3 %
gegenüber den B-mix Zellen (100 %) bestimmt werden. Die Reduktion der ADK-Aktivität
wurde zusätzlich durch einen Western-Blot mit den Zellextrakten aus je 107 B-mix und D4
Zellen bestätigt: D4 Zellen zeigten im Vergleich zu B-mix Zellen auf diesem Western-Blot
eine deutliche Reduktion der Bandenstärke von etwa 90 % (Abb. 3.2).
Abb. 3.3: Das retrovirale Expressionsplasmid pBPNhBcl-2
Zur viralen Übertragung von Bcl-2 in Adenosin-freisetzende Zellen wurde das
Expressionsplasmid pBPNhBcl-2 in eine Helferzellinie übertragen, die in der
Lage war, den durch einen gestrichelten Halbkreis markierte Bereich zwischen
5‘-LTR und 3‘-LTR in Moloney-Murine-Leukemia-Viruspartikel (Mo-MLV) zu
verpackt. Mit deren Hilfe wurde die Sequenz in Zielzellen übertragen und dort
durch die reverse Transcriptase ins Genom integriert.
LTR = „Long Terminal Repeats“; Psi = Virales Verpackungssignal; hBcl-2 =
Humanes Bcl-2 Gen; pBS Ori = Bakterielle Replikations-Sequenz.
36 3. Resultate
Abb. 3.4: Immunoperoxidasefärbung von BCL-2-Antikörpern bei adherenten ADA-7,
ADA-7bcl2 und BHK-WT Zellen
(a) ADA-7 Zellen zeigten eine auf der Fläche ausgedehnte Gestalt mit stachelartigen
Fortsätzen. Die Produktion von BCL-2 mit spezifischen Antikörpern liess sich in der
hier abgebildeten Immunperoxidasefärbung nicht nachweisen. (b) ADA-7bcl2 Zellen
zeigten deutlich erkennbare, morphologische Unterschiede zu den ADA-7 Zellen: (i)
Die Ausbreitung der Zellen ist weniger ausgeprägt und sie zeigen eine verminderte
Grösse. (ii) Die stachelartigen Fortsätze der Zellen treten nur noch selten auf. (c)
BHK-WT Zellen exprimierten BCL-2 und zeigen eine kugelförmige Morphologie.
Die Expression des retroviral eingebrachten Apoptosehemmers BCL-2 liess sich durch
eine Immunperoxidasefärbung von spezifischen Antikörpern gegen humanes BCL-2
nachweisen, welche die Zellen rotbraun einfärbte: Pfeile zeigen auf typische, stark
gefärbte Beispiele. Grössenmarker: 20 µm. Eine Auflistung der untersuchten Zellen
findet sich in Tab. 3.1.
a b c
3. Resultate 37
3.2.5. Adenosinfreisetzung aus den Zelllinien ADA-0, ADA-7bcl2, BHK-AK2 und D4
Die Adenosinkonzentration in Mediumüberständen der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten
Zelllinien wurde zu verschiedenen Zeitpunkten mit einer enzymgekoppelten
Fluoreszenzmessung bestimmt: Adenosin wird dabei zu ATP phophoryliert, welches das
Enzym Luciferase zur Emission von Licht einer bestimmten Wellenlänge anregt. Die
Intensität des emittierten Lichtes ist dabei proportional zur ATP Konzentration und somit zu
Adenosin. Dabei galt es, wenn möglich, eine Adenosin-Konzentration zu bestimmen, bei der
in zeitlich nachfolgenden Messungen kein Anstieg der Adenosinmenge mehr gefunden
werden konnte. Bei dieser Steady-State-Konzentration (SSK) halten sich Abbau und
Produktion von Adenosin die Waage, und somit ist die von den Zellen maximal produzierbare
Adenosinkonzentration in den Mediumüberständen erreicht. Die Adenosin-
Konzentrationsbestimmungen wurden jeweils in serumfreiem Medium bei 37°C durchgeführt.
Jeweils 500 µl Aliquots der Mediumüberstände wurden für die Messungen eingesetzt.
ADA-defiziente ADA-0 Zellen erreichten eine Adenosin SSK von 5.7 ± 1.9 ng/ml (n = 6) für
105 Zellen nach ~8 Stunden (Abb.3.3). Unter gleichen Bedingungen wurde in den
Überständen von ADK-defizienten BHK-AK2 Zellen nach 24 Stunden eine
Adenosinkonzentration von 39.7 ± 6.7 ng/ml (n = 6) gemessen (Abb.3.5), ohne die SSK dabei
erreicht zu haben. Diese unterschiedliche Dauer bis zum Erreichen der SSK zwischen ADA-0
und BHK-AK2 lässt sich durch die niedrige Expression des Adenosin abbauenden Enzymes
ADA in BHK-AK2 Zellen erklären. Im Gegensatz dazu wird in ADA-0 Zellen Adenosin über
ADK effizient abgebaut. Die ADA-0 Zellen setzten 8.4 ± 2.6 ng (n = 6) Adenosin während
der ersten Stunde der Inkubation frei, während BHK-AK2 Zellen mit einer Freisetzung von
19.5 ± 1.3 ng (n = 6) Adenosin etwa 2.3 mal mehr produzierten (Abb.3.5). Diese höhere
Produktionsrate erklärt sich aus dem etwa 10 mal niedrigeren Km Wert der ADK im Vergleich
zur ADA (Arch und Newsholme, 1978). Jedoch muss beachtet werden, dass proliferierende
BHK-AK2 Zellen im Gegensatz zu teilungsunfähigen ADA-0 Zellen einen erhöhten
Stoffwechsel haben, welcher die Adenosin-Freisetzung ebenfalls beeinflussen könnte.
In den Überständen von jeweils 105 BHK-WT oder ADA-WT Zellen wurden während der
ersten Stunde erwartungsgemäss niedrige Adenosinkonzentrationen von 2.6 ± 1.8 ng (n = 6)
und 1.4 ± 1.0 ng (n = 6) Adenosin gemessen (Abb.3.5). ADA-7bcl2 Zellen setzten während
der gleichen Periode 4 – 8 ng Adenosin frei. Diese Adenosinmenge lag in der gleichen
Grössenordnung wie die von ADA-0 Zellen produzierte. Da die Messwerte von ADA-7bcl2
38 3. Resultate
Zellen jedoch stark schwankten, wurde auf eine statistische Auswertung verzichtet (Daten
nicht gezeigt).
Die Adenosin-Produktion von 105 D4 Zellen betrug in der ersten Stunde 30 ± 5 ng (n = 3)
Adenosin. Im Vergleich zu BHK-AK2 Zellen setzen sie somit etwa 1.5 mal mehr Adenosin
während der gleichen Zeitspanne frei. Da die Zelllinie D4 Defekte in beiden Adenosin
umsetzenden Enzymen ADK und ADA aufweist, wurde eine hohe Produktion von Adenosin
erwartet. Die Adenosin SSK war nach 24 Stunden noch nicht erreicht. Wegen der defekten
ADA wurde erwartet, dass B-mix Zellen ebenfalls Adenosin freisetzen. Jedoch konnte in
Adenosin-Messungen von Mediumüberständen der B-mix Zelllinie kein Adenosin gemessen
werden. Darum wurde die ADK-Aktivität von BHK-WT, ADA-0 und B-mix Zellen
untereinander verglichen, um festzustellen, ob möglicherweise durch eine erhöhte
ADK-Aktivität in den B-mix Zellen Adenosin sehr effizient abgebaut wird und somit kein
Adenosin mehr freigesetzt werden kann. Die B-mix Zellen zeigten in einer radioaktiven
ADK-Aktivitätsmessung von Zellextrakten zwar eine 22 % höhere Aktivität der ADK als die
BHK-WT Zellen, jedoch eine 14 % tiefere als diejenige der ADA-0 Zellen. Da ADA-0 Zellen
jedoch Adenosin freisetzen, ist die Aktivität der ADK-Aktivität offenbar nicht alleine für eine
mangelnde Adenosinfreisetzung verantwortlich. Möglicherweise ist in diesem Fall die erhöhte
Proliferationsrate im Gegensatz zu den ebenfalls ADA-defizienten ADA-0 Zellen die Ursache
für eine mangelnde Adenosin-Freisetzung.
Die verwendeten Adenosin-freisetzenden Zelllinien und ihre Ausgangszellen sind mit ihren
Eigenschaften in Tabelle 3.1 zusammengefasst.
Tab
.3.1
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40 3. Resultate
Abb. 3.5: Akkumulation von Adenosin in Überständen von Zellen
(a) Die Adenosinmenge in den Überständen von BHK-AK2 (grüne Kreise), ADA-0
(blaue Dreiecke), BHK-WT (violette Kreise) und ADA-WT (rote Dreiecke) wurde
mittels enzymgekoppelter Fluoreszenzmessung für je 105 Zellen in 5 ml Medium zu
den angegebenen Zeitpunkten für eine Periode von 24 h bestimmt. (b) Die
Adenosinkonzentrationen aus a wurden auf die Akkumulation von Adenosin
innerhalb eines Zeitintervalls umgerechnet (ng Adenosin pro 105 Zellen pro h). Für
jeden Datenpunkt in a und b wurden 6 Messwerte bestimmt. Fehlerbalken wurden
als Standardabweichung vom Mittelwert angegeben.
3. Resultate 41
3.3. Adenosin-Freisetzung von eingekapselten Zellen in vitro
Die Adenosin-freisetzenden Zelllinien ADA-0, ADA-7bcl2, BHK-AK2 und D4 wurden in
semipermeable Hohlfasern eingekapselt, damit diese als kontnuierlich Adenosin-freiestzende,
intraventrikuläre Zellkapsel-Systeme verwendet werden konnten. Je 2 x 105 Zellen der
entsprechenden Zelllinien wurden zusammen mit Kollagen als Matrix antiseptisch in 7 mm
lange PES-Hohlfasern injiziert und verkapselt. Die verschiedenen eingekapselten Zellen
wurden auf ihr Überleben und ihre Adenosin-Freisetzung in Zellkulturmedium getestet.
BHK-AK2 Kapseln wurden in komplettem Nährmedium bei 37°C inkubiert. Nach ein, zwei,
4 und 8 Wochen wurde je eine Kapsel entnommen und anschliessend in Paraformaldehyd
(4 %) fixiert. Danach wurden die Kapseln in einer Alkohol-Konzentrationsreihe entwässert
und in Glycol-Methacrylat eingegossen. Mit Hilfe eines Glas-Mikrotomes wurden 1.5 µm
dicke Längsschnitte angefertigt, welche mit Toluidinblaulösung (3 %) gefärbt wurden.
Nach einer Woche in komplettem Zellkulturmedium konnte der Kapselwand entlang eine
mehrschichtige, vitale BHK-AK2 Zellpopulation beobachtet werden, während im inneren der
Kapseln mehr Matrixmaterial und eine niedrigere Zelldichte sichtbar waren (Abb. 3.12 a und
b). Auch nach 8-wöchiger Inkubation zeigten die Zellen in den Kapsel keine Anzeichen von
nachlassender Vitalität. Zudem waren in Zellkulturmedium inkubierte BHK-AK2 Zellkapseln
(n = 8) in der Lage, eine Adenosinproduktion während mindestens 14 Tagen aufrecht zu
erhalten. Nach Auswechseln des Zellkulturmediums wurde jeweils innerhalb von 8 h eine
Steady-State Adenosin-Konzentration von bis zu 29 ng/ml erreicht. Zum Vergleich dazu fand
man in den Überständen von ADA-0 Kapseln (n = 8) und ADA-7bcl2 Kapseln (n = 10)
innerhalb von 8 Stunden 3 - 7 ng/ml bzw. 4 - 10 ng/ml Adenosin. Diese Werte waren über
einen Zeitraum von 14 Tagen in hohem Masse konstant. Folglich überlebten die BHK-AK2,
ADA-0 und ADA-7bcl2 Zellen in der Zellkapselmatrix in vitro mindestens 14 Tage.
Die D4 Zellen wurden direkt für die Versuche im Kindling-Modell eingesetzt, ohne die
Überlebensrate und die Adenosin-Freisetzung in vitro zu testen.
42 3. Resultate
3.4. Anfallsunterdrückung durch Adenosin-freisetzende Zellkapseln im
Kindling-Modell der Ratte
Das Kindling-Modell der Ratte ist eines der am meisten verwendeten Tiermodelle der
Epilepsieforschung: Unilateral in den Hippokampus implantierte Elektroden verursachen
durch repetitive Verabreichung von subkonvulsiven, elektrischen Stimuli Veränderungen im
Hippokampus, welche allmählich einen epileptischen Fokus entstehen lassen. Mit diesem
Modell konnten die antikonvulsiven Eigenschaften von bereits etablierten AEDs gegen
humane Temporallappen-Epilepsie korrekt reproduziert werden. Deshalb wurde das Kindling-
Modell im Rahmen dieser Arbeit verwendet, um die antikonvulsive Effizienz von Adenosin-
freisetzenden Zellkapseln zu bestimmen.
Für den Kindling-Prozess wurden männlichen Oncins France Stamm A Ratten (n = 120) mit
einem Gewicht von 240 – 280 g bipolare Elektroden in die CA1-CA3 umfassende Region des
ventralen Hippokampus implantiert und repetitive, subkonvulsive Stimuli über einen
Zeitraum von zwei Wochen verabreicht. Die Tiere entwickelten im Laufe des Prozesses sich
progressiv verstärkende, epileptische Anfälle. Nur vollständig gekindelte Ratten (n = 80), die
nach diesen zwei Wochen auf jeden Teststimulus spontan mit einem tonisch – klonischen
Anfall der Stärke 5 reagierten, wurden für die Transplantation von Adenosin-freisetzenden
Zellkapseln verwendet: Jeweils eine Zellkapsel wurde in den lateralen Hirnventrikel der
stimulierten Seite stereotaktisch implantiert. Folgende Koordinaten wurden relativ zum
Bregma zur korrekten Platzierung der Kapseln verwendet: 1.8 mm caudal zum Bregma,
1.4 mm lateral zur Mittellinie und 8.5 mm ventral zur Dura (Zahnhalter bei –8.3 mm). Die
korrekte Positionierung wurde in Frontalschnitten des Gehirnes von transplantierten Ratten
bestätigt.
Nach der Implantation der verschiedenen Zellkapseln in den lateralen Hirnventrikel von
vollständig gekindelten Ratten, wurde die beobachtbare Anfallsstärke, sowie die neuronalen
Entladungen im Hippokampus durch die bilateral implantierten Elektroden über einen
Zeitraum von 24 Tagen aufgezeichnet. Die therapeutische Effizienz der eingekapselten,
Adenosin-freisetzenden Zellen D4, ADA-0, ADA-7bcl2 und BHK-AK2 wurde durch deren
antikonvulsive Wirkung im Kindling-Modell der Ratte evaluiert (Kap. 3.4.1. bis 3.4.3.).
3. Resultate 43
3.4.1. Antikonvulsive Wirkung von D4 Zellen
Von der Adenosin-freisetzenden Zelllinie D4 und deren Ausgangszelllinie B-mix wurden je
2 x 105 Zellen zusammen mit Kollagen als Matrix in semipermeable Hohlfasern eingekapselt
und in den lateralen Hirnventrikel von vollständig gekindelten Ratten implantiert. Die
therapeutische Effizienz von implantierten D4 Zellkapseln (n = 5) wurde im Verhältnis zu
B-mix Kontrollzellkapseln (n = 3) gemessen. Durch Verabreichung von Teststimuli,
beginnend mit dem 4. Tag nach der Implantation, wurden die Anfallsstärken und deren
Entwicklung über einen Zeitraum von 24 Tagen verfolgt (Abb. 3.5). Aufgrund der niedrigen
Tierzahl konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Tieren mit
implantierten D4 und B-mix Zellkapseln bestimmt werden. Es liess sich jedoch ein Trend
feststellen, der bis zum Tag 12 anhielt. Während dieser Periode wurden bei D4-Rezipienten
Anfällsstärken von 1.25 ± 1.25 gemessen, während bei B-mix-Rezipienten unverändert Grad
3 – 5 Anfälle auftraten.
3.4.2. Antikonvulsive Wirkung von ADA-0 Zellen
ADA-0 und ADA-WT Zellen sind aus Nachkommen einer Kreuzung von ADA-defizienten
Mäusen und ImmortomäusenTM isoliert worden. Aufgrund ihrer genetischen ADA-Defizienz
setzen ADA-0 Zellen im Gegensatz zu ADA-WT Zellen bis zu 8.4 ± 2.6 ng Adenosin pro
Stunde frei. Beide Zelllinien zeigen einen immortalisierten Phänotypen bei 33°C unter
Zugabe von IFN-γ und stellen ihr Wachstum bei Temperaturen ≥ 37°C ein. Jeweils 2 x 105
Zellen wurden zusammen mit Kollagen als Matrix in semipermeable Hohlfasern eingekapselt
und in den lateralen Hirnventrikel von vollständig gekindelten Ratten implantiert. Aufgrund
der Teilungsunfähigkeit in vitro bei Temperaturen ≥ 37°C wurde angenommen, dass sich die
Zellen in den Kapseln im Rattengehirn (39°C) ebenfalls nicht mehr teilen. ADA-0
Zellkapseln (n = 6) wurden im Vergleich zu ADA-WT Zellkapseln (n = 9) als Kontrollen
durch Transplantation in gekindelte Ratten auf ihre antikonvulsive Wirkung geprüft (Abb.
3.7). Bei Tieren mit Kontrollkapseln konnte keine signifikante Veränderung der Anfallsstärke
nach der Transplantation beobachtet werden. Sie zeigten über den gesamten Zeitraum von
24 Tagen tonisch – klonische Anfälle der Stärken 3 - 5. Tiere mit transplantierten ADA-0
Zellkapseln hingegen wiesen während der ersten 14 Tage signifikant schwächere Anfälle
ohne tonisch – klonische Komponenten (Grad 3 – 5) auf (P < 0.01). In der dritten Woche nach
44 3. Resultate
der Transplantation verschwand der signifikante antikonvulsive Effekt von ADA-0
Zellkapseln.
Abb. 3.6: Unterdrückung von epileptischen Anfällen durch Transplantation von
D4 Zellkapseln
Adenosin-freisetzende D4 Zellkapseln (grüne Quadrate) und B-mix
Kontrollkapseln (rote Kreise) wurden am Tag 0 in den lateralen
Hirnventrikel von gekindelten Ratten implantiert und dann die Anfallsstärke
an den angegebenen Tagen gemessen. Vor der Transplantation (Tag –2, Tag
0) verursachte der Teststimulus jeweils einen Anfall der Stärke 5. Nach der
Transplantation (Tag 4 – 24) zeigten die Kontrolltiere mehrheitlich
weiterhin tonisch – klonische Anfälle (Grad 3-5). Tiere mit D4 Zellkapseln
hingegen hatten in den ersten 12 Tagen deutlich tiefere Anfallsstärken von
1.25 ± 1.25. Der Effekt war jedoch statistisch nicht signifikant. Fehlerbalken
sind als Standardabweichung vom Mittelwert angegeben.
3. Resultate 45
Abb. 3.7: Unterdrückung von epileptischen Anfällen durch Transplantation von ADA-0
Zellkapseln
Adenosin-freisetzende ADA-0 Zellkapseln (grüne Quadrate) und ADA-WT
Kontrollkapseln (rote Kreise) wurden am Tag 0 in den lateralen Hirnventrikel von
gekindelten Ratten implantiert und die Anfallsstärke nach einem elektrischen
Teststimulus an den angegebenen Tagen gemessen. Vor der Transplantation
(Tag –2, Tag 0) verursachte der Teststimulus jeweils einen Anfall der Stärke 5.
Nach der Transplantation (Tag 4 – 24) zeigten Tiere, die ADA-0 Kapseln (n = 6)
erhalten hatten, 14 Tage lang eine signifikante Reduktion der Anfallsstärken im
Vergleich zu ADA-WT (n = 9) Kontrollen.
46 3. Resultate
Der antiepileptische Effekt der ADA-0 Zellkapseln wurde zudem mit intrahippokampalen
EEG Ableitungen nachgewiesen. Am Tag vor der Implantation der Kapsel wurde jeweils nach
elektrischer Stimulation starke neuronale Entladungen mit einem beobachtbaren epileptischen
Anfall der Stärke 5 beobachtet (Abb. 3.8 oben). Dabei entstand die Entladung auf der
stimulierten Seite und breitete sich danach auch auf die kontralaterale Hemisphäre aus, was
sich in einem sekundär generalisierten tonisch – klonischen Anfall äusserte. Nach der
Implantation von ADA-0 Zellkapseln waren die neuronalen Entladungen nach einem
Stimulus stark unterdrückt (Abb. 3.8 unten), was sich in einer geringeren Amplitude und
kürzerer Dauer der Nachentladungen äusserte. Diese Beobachtung korrelierte mit der
Unterdrückung von beobachtbaren, epileptischen Anfällen während der gleichen Zeitpunkte.
Abb. 3.8: Bilaterale, intrahippokampale EEG Ableitungen nach einem Teststimulus in
gekindelten Ratten
In jedem der zwei EEGs repräsentiert die obere Spur die ipsilateral (i) zur
stimulierten Seite liegende Aufnahme und die untere Spur die dazu kontralaterale
(k). Die vertikale, mit einem Pfeil markierte Linie markiert den Endpunkt des 10 s
dauernden, elektrischen Stimulus. Die EEG Ableitungen eines repräsentativen
Tieres wurden vor der Implantation und 4 Tage danach aufgenommen.
3. Resultate 47
3.4.3. Antikonvulsive Wirkung von BHK-AK2 Zellen
Von BHK-WT Zellen ist bekannt, dass sie länger als 20 Wochen in transplantierten
Zellkapseln überleben können (Zurn et al., 2000). Die aus den BHK-WT Zellen hergestellte
BHK-AK2 Zelllinie wurde als vielversprechende Zelllinie angesehen, da sie aufgrund ihrer
Abstammung möglicherweise ebenso lange wie BHK-WT Zellen in implantierter Form
überleben. Deshalb wurden je 2 x 105 BHK-AK2 Zellen zusammen mit Kollagen als Matrix
in Hohlfasern eingekapselt. Der antikonvulsive Effekt von BHK-AK2 Zellkapseln (n = 9, ab
Tag 14 n = 6 wegen Verlust der Elektrodenhalterung) wurde mit demjenigen von zellfreien
Matrixkapseln (n = 12; Kollagenmatrix) als Kontrollen verglichen (Abb. 3.9). Dabei zeigten
Tiere mit Kontrollkapseln keine Veränderung der Anfallsstärke und reagierten mit einem
vollen tonisch – klonischen Anfall der Stärke 5 auf jeden Teststimulus während der gesamten
Testperiode von 24 Tagen. Im Gegensatz dazu konnte ein sehr starker antikonvulsiver Effekt
der implantierten BHK-AK2 Zellkapseln auf gekindelte Ratten in den ersten 14 Tagen nach
der Transplantation beobachtet werden: Die Anfälle hatten im Mittel eine Stärke von 0.3 bis
0.8. Zu den gleichen Zeitpunkten wurde eine hoch signifikante Reduktion der Anfallsstärke
gegenüber den Kontrolltieren (P < 0.001) beobachtet. Während der dritten Woche
verminderte sich der antikonvulsive Effekt auf Anfallsstärken von 1.1 bis 1.8 (P < 0.01). Am
Tag 21 und 24 nach der Transplantation schliesslich blieben die Tiere von generalisierten
tonisch – klonischen Anfällen der Stärken 3 – 5 verschont, jedoch waren die Anfälle im Mittel
stärker als zuvor und stiegen auf Werte von 2.2 ± 0.9 an. Damit blieben sie signifikant
(P < 0.05) unter den Anfallsstärken der Kontrolltiere.
Der antiepileptische Effekt der BHK-AK2 Zellkapseln wurde zudem durch EEG Ableitungen
bestätigt, deren Ergebnisse in Kap. 3.5.2. ausführlich beschrieben werden.
48 3. Resultate
Abb. 3.9: Unterdrückung von epileptischen Anfällen durch Transplantation von
BHK-AK2 Zellkapseln
Adenosin-freisetzende BHK-AK2 Zellkapseln (grüne Quadrate; n = 9, ab Tag 14
n = 6 wegen Verlust der Elektrodenhalterung) und zellfreie Kapseln mit
Kollagenmatrix (rote Kreise; n = 12) wurden am Tag 0 in den lateralen
Hirnventrikel von gekindelten Ratten implantiert und die Anfallsstärke nach
einem elektrischen Teststimulus an den angegebenen Tagen gemessen. Vor der
Transplantation (Tag –2, Tag 0) verursachte der Teststimulus jeweils einen Anfall
der Stärke 5. Nach der Transplantation (Tag 4 – 24) zeigten Tiere mit
Matrixkapseln über den ganzen Testverlauf weiterhin tonisch – klonische Anfälle
der Stärke 5, während gekindelte Ratten mit BHK-AK2 Zellkapseln mindestens
24 Tage lang gegen tonisch – klonische Anfälle (Stärke 3 – 5) geschützt waren.
Fehlerbalken sind als Standardabweichung vom Mittelwert gegeben.
3. Resultate 49
3.5. Einfluss der Anfallshäufigkeit auf den antikonvulsiven Effekt von
Adenosin-freisetzenden Zellkapseln
Die Anfallsstärke von epileptischen Anfällen von Ratten im Kindling-Modell nimmt mit
jedem Anfall zu. Inwiefern die Anzahl der verabreichten Kindling-Stimulationen die
therapeutische Effizienz transplantierter, Adenosin-freisetzender Zellkapseln beeinflusst, war
nicht bekannt. Darum wurden vollständig gekindelte Ratten mit implantierten, Adenosin-
freisetzenden BHK-AK2 Zellkapseln in zwei Gruppen aufgeteilt, die verschiedenen
Stimulationsintervallen ausgesetzt waren: Gruppe I (n = 9) wurde einmal pro Woche getestet,
während Gruppe II (n = 13) drei Stimuli pro Woche erhielt. Die beobachtbaren epileptischen
Anfälle wurden registriert, um statistische Unterschiede zwischen den Gruppen feststellen zu
können (Kap. 3.5.1.) und Aufzeichnungen von intrahippokampalen EEGs machten Vergleiche
von neuronalen Entladungen der verschieden oft stimulierten Tiere möglich (Kap. 3.5.2.).
3.5.1. Anfallsstärke in Abhängigkeit der Stimulationshäufigkeit
Nach der intraventrikulären Implantation von BHK-AK2 Zellkapseln wurde den vollständig
gekindelten Ratten eine Erholungsphase von 4 Tagen gewährt. Danach wurden die Ratten in
zwei Gruppen eingeteilt, die entweder einmal (Gruppe I; n = 9) oder dreimal wöchentlich
(Gruppe II; n = 13) stimuliert wurden, um die Reduktion der Anfallsstärke gegenüber
Kontrollkapseln, die nur Kollagen-Matrix enthielten, zu bestimmen. Während einer Periode
von 4 Wochen wurde die Stärke der epileptischer Anfälle ermittelt und über die Zahl der
wöchentlichen Teststimulationen gemittelt (n = 9 für die Gruppe I und n = 39 für die Gruppe
II) (Abb. 3.10). Ratten mit Kontrollkapseln zeigten nach der Transplantation weiterhin
epileptische Anfälle der Stärke 5. Wurden jedoch BHK-AK2 Zellkapseln in den lateralen
Hirnventrikel der stimulierten Seite implantiert, zeigten beide Gruppen eine nahezu
vollständige Unterdrückung der Anfälle während der ersten Woche (p < 0.001). Während der
zweiten und dritten Woche blieb die Anfallsaktivität nach weiteren Stimuli im Vergleich zu
Kontrolltieren signifikant reduziert. Durch einen Vergleich der beiden Gruppen (Tab. 3.2)
konnte die Wirkung der BHK-AK2 Zellkapseln statistisch evaluiert werden. Dabei führte die
Anzahl der Stimulationen pro Woche zu keinem statistisch signifikanten Unterschied der
Anfallsstärke zwischen Gruppe I und Gruppe II, und die therapeutische Effizienz der
implantierten Zellkapseln wurde somit nicht beeinflusst.
50 3. Resultate
Abb. 3.10: Vergleich der Anfallsstärke epileptischer Anfälle in unterschiedlich oft
stimulierten Ratten mit implantierten BHK-AK2 Zellkapseln
Gekindelte Ratten wurden vor und 1, 2, 3 und 4 Wochen nach unilateraler,
ventrikulärer Transplantation von Kontrollkapseln (Kontrollgruppe, n = 12) oder von
Adenosin-freisetzenden BHK-AK2-Kapseln (Gruppe I und II, n = 9 und n = 13) auf
Anfallsunterdrückung nach Applikation eines elektrischen Stimulus analysiert. Tiere
aus der Kontrollgruppe und von Gruppe II wurden jeweils 3 mal wöchentlich, Tiere
aus Gruppe I nur einmal wöchentlich stimuliert. Die ausgelöste Anfallsstärke von 0
(kein Anfall) bis 5 (tonisch – klonischer Anfall) wurde über die gesamte Anzahl
wöchentlicher Stimulationen gemittelt (Kontrollgruppe, n = 12; Gruppe I, n = 9;
Gruppe II, n =13).
Der Vergleich von Gruppe I und II mit der Kontrollgruppe zeigte eine starke
Reduktion der Anfallsstärke während der ersten und zweiten Woche nach der
Transplantation. Der Vergleich der beiden BHK-AK2 Gruppen untereinander
hingegen ergab, dass zu keinem Zeitpunkt der Analyse ein statistisch signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen vorlag (siehe auch Tabelle 3.2). Fehlerbalken
sind als Standardabweichung vom Mittelwert angegeben.
3. Resultate 51
Tabelle 3.2: Epileptische Anfallsstärken in gekindelten Ratten mit implantierten BHK-AK2
Zellkapseln in Abhängigkeit der Stimulationsfrequenz
Anfallsstärken (Grad 0 – 5)
Vor derImplantation
1 Wochedanach
2 Wochendanach
3 Wochendanach
4 Wochendanach
Kontrollgruppe (3x)
n = 12 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00 5.00 ± 0.00
Gruppe I (BHK-AK2)
n = 9 5.00 ± 0.00 1.11 ± 0.73 2.78 ± 0.88 3.89 ± 0.73 3.89 ± 0.73
Gruppe II (BHK-AK2)
1. Stimulation (n = 13)
2. Stimulation (n = 13)
3. Stimulation (n = 13)
Mittelwert (n = 39)
5.00 ± 0.00
5.00 ± 0.00
5.00 ± 0.00
5.00 ± 0.00
1.39 ± 0.58
1.45 ± 0.58
1.54 ± 0.57
1.46 ± 0.41
1.85 ± 0.63
2.30 ± 0.76
2.50 ± 0.83
2.22 ± 0.41
2.70 ± 0.78
3.10 ± 0.78
3.30 ± 0.72
3.03 ± 0.42
3.30 ± 0.70
3.90 ± 0.60
4.50 ± 0.50
3.90 ± 0.30
P (Gruppe I : Kontrolle) < 0.001 < 0.05 n.s. n.s.
P (Guppe II : Kontrolle) < 0.001 < 0.01 < 0.05 n.s.
P (Gruppe I : Gruppe II) n.s. n.s. n.s. n.s.
Die Anfallsstärke (Grad 0 – 5) nach einem elektrischen Stimulus in gekindelten Ratten wurde vor, sowie
1, 2, 3 und 4 Wochen nach der Transplantation von Kontrollkapseln (Kontrollgruppe) oder Adenosin-
freisetzenden BHK-AK2 Kapseln (Gruppe I und II) in den lateralen Hirnventrikel gemessen. Tiere aus
der Kontrollgruppe und aus Gruppe II wurden 3 mal wöchentlich, Tiere aus Gruppe I nur einmal
wöchentlich stimuliert. Es wurde der Mittelwert über die gesamte Anzahl an wöchentlichen Stimulationen
gebildet (Kontrollgruppe, n = 12; Gruppe I, n = 9; Gruppe II, n =13) und P-Werte für einen paarweisen
Vergleich der Gruppen bestimmt. Als statistische Methode wurde Einweg ANOVA mit wiederholter
Messung der gleichen Werte verwendet. Fehler sind als Standardabweichung vom Mittelwert angegeben.
n.s. = nicht signifikant im Student’s t-Test;
52 3. Resultate
3.5.2. Intrahippokampale EEG Ableitungen
EEG Ableitungen aus der CA1 – CA3 Region des Hippokampus mittels bilateral
implantierten Elektroden, erlaubten es, die epileptischen, neuronalen Entladungen nach einer
elektrischen Stimulation im Kindling-Modell der Ratte zu analysieren. So konnten die
beobachtbaren, epileptischen Verhaltensmuster mit den zugrundeliegenden, neuronalen
Entladungen in Verbindung gebracht und die antiepileptische Effizienz von BHK-AK2
Zellkapseln weiter untersucht werden. Die EEG Ableitungen bestanden bei sämtlichen
gekindelten Ratten (n = 80) aus Messungen der intrahippokampalen Hirnströme mit einer
Abtastfrequenz von 128 Hz, die jeweils von 1 min vor bis 5 min nach dem Start der 10 s
dauernden, elektrischen Stimulation reichten.
Vor der Transplantation von Zellkapseln wurden bei sämtlichen Ratten starke, neuronale
Entladungen, die zusammen mit einem epileptischen Anfall der Stärke 5 auftraten, beobachtet
(Abb. 3.11). Die neuronale Entladung trat dabei generell zunächst ipsilateral zur elektrischen
Stimulation im Hippokampus auf und breitete sich dann auf die kontralaterale Seite aus, was
sich in der Manifestation eines tonisch – klonischen Anfalles der Stärke 5 äusserte. Die
epileptischen Nachentladungen dauerten dabei 90 ± 20 s (n = 22). Den Anfang dieser
Entladungen bildete das Ende des 10 s langen, elektrischen Stimulus. Das Ende der
Nachentladung war in den EEG Ableitungen durch eine abrupte Änderung der Amplitude
charakterisiert. Bei den meisten gekindelten Tieren zeigte das EEG nach dem Abbruch der
Nachentladungen eine starke Unterdrückung der neuronalen Aktivität (Refraktärzeit), welche
sich in niedrigeren Amplituden in EEG Ableitungen im Vergleich zu der neuronalen
Aktivität vor der Stimulation äusserte.
Intraventrikuläre Transplantation von Kontrollkapseln bewirkten keine Veränderung der
epileptischen, neuronalen Entladungen vollständig gekindelter Ratten im Vergleich zu
untransplantierten Tieren. Die Ratten mit Kontrollkapseln wurden 1, 2, 3 und 4 Wochen nach
der Implantation getestet und die EEGs aufgenommen (Abb. 3.11). Im Gegensatz dazu
zeigten EEG Ableitungen, die ein oder zwei Wochen nach der Implantation von Adenosin-
freisetzenden BHK-AK2 Zellkapseln aufgenommen worden waren, eine starke
Unterdrückung der neuronalen Entladungen. Der Effekt der transplantierten Zellkapseln
äusserte sich in einem früheren Abbruch der neuronalen Nachentladungen und in niedrigeren
Amplituden im Vergleich zu Ratten mit Kontrollkapseln (Abb. 3.11). Dabei spielte es keine
Rolle, ob es sich um ein Tier handelte, das einmal (Gruppe I; n = 9) oder dreimal wöchentlich
(Gruppe II; n = 13) stimuliert wurde. Diese Beobachtung im EEG korrelierte mit der
3. Resultate 53
Unterdrückung der epileptischen Anfälle dieser Ratten (Kap. 3.5.1.). Drei bzw. vier Wochen
nach der Implantation von BHK-AK2 Zellkapseln wurden länger andauernde, neuronale
Entladungen mit höheren Amplituden in EEG-Aufzeichnungen festgestellt. Gleichzeitig
konnten auch teilweise wieder tonisch – klonische Anfälle der Stärke 3 - 5 beobachtet werden
(Tab. 3.2), was mit den EEG-Aufzeichnungen korrelierte (Abb. 3.11).
Tiere der Gruppe I, die pro Woche weniger oft als Tiere der Gruppe II stimuliert wurden,
zeigten eine schlechtere Anfallssuppression als Tiere der Gruppe II, verglichen zur
Kontrollgruppe: Nach 3 Wochen war kein statistisch signifikanter Unterschied von Gruppe I
zur Kontrollgruppe mehr messbar, während die Gruppe II noch signifikant tiefere
Anfallsstärken aufwies (P < 0.05; Tab. 3.2). Dies korrelierte mit der Dauer der epileptischen
Nachentladung in den EEGs, welche in Gruppe I verglichen mit Gruppe II im Durchschnitt
länger waren und höhere Amplituden aufwiesen. Demzufolge konnte auch im EEG gezeigt
werden, dass eine höhere Anzahl an Teststimulationen pro Woche keinen negativen Effekt auf
die therapeutische Effizienz der implantierten Zellkapseln im Kindling-Modell der Ratte
hatte.
(nächste Seite)
Abb. 3.11: Unterdrückung von neuronalen Entladungen im EEG durch Adenosin-
freisetzende Zellkapseln
Dargestellt sind repräsentative EEG-Aufzeichnungen gekindelter Ratten vor und
1, 2, 3 und 4 Wochen nach intraventrikulärer Transplantation von
Kontrollkapseln (Kontrollen) oder Adenosin-freisetzenden BHK-AK2-Kapseln.
Tiere der Kontrollgruppe wurden 3 mal pro Woche stimuliert, während die
Tiere der BHK-AK2 Gruppen I und II, wie angegeben, entweder einmal oder 3
mal pro Woche stimuliert wurden. Die umrandete Zahl zwischen den EEG
Spuren repräsentiert die Stärke des beobachteten, epileptischen Anfalles des
jeweiligen Tieres.
i = EEG ipsilateral zur stimulierten Seite; k = EEG kontralateral zur stimulierten
Seite; Massstäbe für Zeit und Amplitude der EEGs sind in Sekunden und mV
angegeben.
54 3. Resultate
Abb. 3.11
3. Resultate 55
3.6. Phenytoinresistenz von gekindelten Ratten
Es ist bekannt, dass der Kindling-Prozess eine Resistenz gegen Phenytoin induziert, welche
als künstlich herbeigeführte Therapieresistenz von epileptischen Anfällen interpretiert werden
kann (Loscher et al., 2000). Bei einigen Ratten, auf welche Phenytoin vor dem Kindling-
Prozess antikonvulsiv wirkte, konnte nach dem Prozess kein Effekt von Phenytoin auf die
epileptischen Anfälle beobachtet werden. Das Umgekehrte, wobei einige Ratten zunächst
resistent gegen Phenytoin waren, wurde ebenfalls beschrieben (Loscher et al., 2000).
Sämtliche Tiere wurden deshalb am Tag 24 nach der Implantation von Zellkapseln in den
lateralen Hirnventrikel auf Phenytoin-Resistenz (60 mg/kg Phenytoin, i.p.) getestet, um
diejenigen Tiere auszuschliessen, bei denen eine durch das Kindling induzierte Veränderung
im Gehirn antikonvulsive Therapien verunmöglichte: Es handelte sich dabei insgesamt jedoch
nur um drei Tiere, die jeweils BHK-AK2 Kapseln erhalten hatten. Auch unter Einbezug dieser
Tiere in die statistische Auswertung waren die epileptischen Anfälle im betreffenden
Experiment durch BHK-AK2 Zellkapseln über den gesamten Verlauf von 24 Tagen im
Vergleich zu Kontrolltieren signifikant reduziert.
3.7. Aufhebung des antikonvulsiven Effektes durch DPCPX
Durch Verabreichung von DPCPX, einem spezifischen Adenosin-A1-Rezeptor Antagonisten,
sollte bestätigt werden, dass Adenosin die von Zellkapseln freigesetzte, antikonvulsiv
wirksame Substanz ist. Drei vollständig gekindelten Ratten waren durch intraventrikulär
implantierte ADA-0 Zellkapseln gegen epileptische Anfälle geschützt und zeigten einen Tag
vor der Injektion von DPCPX eine mittlere Anfallsstärke von 0.2 ± 0.3. Den drei Tieren mit
Implantaten wurde am Tag 5 und 10 nach der Transplantation der Zellkapseln DPCPX
(1 mg/kg, i.p.) injiziert und 20 min danach die Anfallsstärken im Kindling-Modell
aufgezeichnet. Eine mittlere Anfallsstärke der Tiere von 4.7 ± 0.3 wurde gemessen.
Ausserdem konnten die in intrahippokampalen EEG Ableitungen zuvor unterdrückten
neuronalen Entladungen wieder beobachtet werden. Dieser Effekt wurde auch bei einer Ratte
mit implantierter BHK-AK2 Kapsel bestätigt: Am Tag 5 nach der Transplantation war die
Ratte vollständig gegen epileptische Anfälle geschützt (Grad 0). Zwanzig Minuten nach der
Injektion von DPCPX (1 mg/kg, i.p.) zeigte dieselbe Ratte nach einem Teststimulus einen
vollen tonisch – klonischen Anfall der Stärke 5 und starke, neuronale Nachentladungen im
56 3. Resultate
EEG. Bei sämtlichen getesteten Ratten wurde nur ein transienter Effekt von DPCPX auf die
antikonvulsive Eigenschaft von Adenosin-freisetzenden Zellkapseln festgestellt. Drei Tage
nach der Injektion des A1-Rezeptor-Antagonisten (Tag 13) waren sämtliche Tiere erneut
durch die Adenosin-freisetzenden Zellkapseln vor tonisch – klonischen Anfällen (Grad 3 – 5)
geschützt: Die Ratten mit ADA-0 Zellkapseln zeigten eine mittlere Anfallsstärke von
0.9 ± 0.7, und die Ratte mit der BHK-AK2 Zellkapsel war vollständig vor Anfällen geschützt
(Anfallsstärke 0). Somit konnte gezeigt werden, dass der antikonvulsive Effekt der
Zellkapseln vor allem auf der Aktivierung von A1-Rezeptoren durch freigesetztes Adenosin
beruht. Es ist jedoch möglich, dass eine Entkopplung und Desensitivierung der A1-Rezeptoren
über die Aktivierung von A3-Rezeptoren stattfindet (Dunwiddie et al., 1997). Da der
therapeutische Effekt der Adenosin-freisetzenden Zellkapseln drei Tage nach der DPCPX
Behandlung wieder einsetzte (Tag 13 nach der Zellkapselimplantation), konnte eine
Desensitivierung von A1-Rezeptoren mindestens bis zum Tag 13 nach der Implantation
ausgeschlossen werden.
3.8. Überlebenspotential der Zellen in den Kapseln
Da die antikonvulsive Aktivität von Adenosin-freisetzenden Zellkapseln über den Zeitraum
des Experimentes nachliess und auch transplantierte BHK-AK2 Zellen mit der Zeit abstarben,
wurde die Überlebensrate der eingekapselten Zelllinien genauer untersucht.
Eingekapselte BHK-AK2 und BHK-WT Zellen wurden entweder in den lateralen
Hirnventrikel von unbehandelten Kontrollratten (n = 7) implantiert, oder in vitro in
komplettem Zellkulturmedium inkubiert (n = 7). Die BHK-AK2 Zellkapseln wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten, am Tag 1, 7, 14, 21, 24, 28 und 42, entweder aus dem lateralen
Hinrventrikel entfernt (in vivo) oder aus dem Kulturmedium genommen (in vitro). Die
Kapseln wurden anschliessend in Paraformaldehyd (4 %) fixiert und durch eine Alkohol-
Konzentrationsreihe entwässert. Danach wurden die Kapseln in Glycol-Methacrylat
eingegossen. Es wurden 1.5 µm dicke Lämgsschnitte angefertigt und mit Toluidinblau (3 %)
gefärbt, um vitale Zellen sichtbar zu machen.
Nach einem Tag in vivo oder in vitro konnten keine Unterschiede in gefärbten Längsschnitten
von BHK-AK2 Zellkapseln gefunden werden: Weder abgestorbene Zellen noch ein
Unterschied in der Zellzahl wurden beobachtet. Erste Unterschiede fanden sich erst nach zwei
Wochen in Längsschnitten der Zellkapseln, als Gebiete mit Zelltrümmern in vivo festgestellt
werden konnten (Abb. 3.12 c). Je länger die BHK-AK2 Zellkapseln implantiert waren, desto
3. Resultate 57
grösser wurden diese Gebiete. Nach 24 Tagen konnten schliesslich nur noch wenige Zellen in
den Kapseln gefunden werden (Abb. 3.12 e), was auf ein massives Absterben der Zellen
zwischen Tag 14 und Tag 24 hindeutet. Im Gegensatz dazu überlebten eingekapselte
BHK-AK2 Zellen in vitro über den gleichen Zeitraum, ohne dass Bereiche mit Zelltrümmern
auftraten.
Im Gegensatz zu den BHK-AK2 Zellen wurde bei transplantierten BHK-WT Zellen in
Kapseln kein Zelltod beobachtet: 24 Tage nach der Implantation von BHK-WT Zellkapseln in
den lateralen Hirnventrikel von Kontrollratten waren noch gleich viele lebende Zellen in den
Kapselschnitten zu beobachten (Abb. 3.12 f) wie bei BHK-WT Zellen in vitro. Das gleiche
Bild zeigte sich auch 8 Wochen nach der Implantation (Daten nicht gezeigt). Diese
Beobachtung bestätigte das ausgezeichnete Überlebenspotential von BHK-WT Zellen,
welches schon in einer anderen Studie beschrieben wurde, in der implantierte, eingekapselte
BHK-Zellen über 20 Wochen in vivo überlebten (Zurn et al., 2000).
(nächste Seite)
Abb. 3.12: Histologie eingekapselter, Toluidinblau-gefärbter Zellen
(a) BHK-AK2 Zellen vor der Implantation in 100-facher Vergrösserung. Lebende
Zellen wurden vor allem nahe der Kapselwände (Streifen auf der linken und rechten
Seite) gefunden, wobei im Inneren der Kapsel die Struktur der Kollagen-Matrix
sichtbar war. Die schwarz umrandete Region ist in b 400-fach vergrössert
dargestellt. (b) BHK-AK2 Zellen vor der Implantation in 400-facher
Vergrösserung. (c) BHK-AK2 Zellen in Kapseln, die zwei Wochen nach
Implantation in den lateralen Hirnventrikel von Kontrollratten entnommen wurden.
Eine Region nahe der Kapselwand ist gezeigt, in der eine dichte Anhäufung von
lebenden Zellen beobachtet werden konnte. (d) BHK-AK2 Zellen aus Kapseln, die
zwei Wochen in Kulturmedium inkubiert wurden. (e) BHK-AK2 Zellen aus
Kapseln, die 24 Tage nach der Transplantation in den lateralen Hirnventrikel von
Kontrollratten entfernt wurden. Vereinzelte Zellen sind von Zelltrümmern
umgeben. (f) BHK-WT Kontrollzellen aus Kapseln 24 Tagen Implantation in den
lateralen Hirnventrikel von Kontrollratten. Balken, 20 µm ausser in a (200 µm).
Vergrösserung: 400-fach, ausser in a (100-fach). Dicke der Schnitte: 1.5 µm.
58 3. Resultate
Abb. 3.12
3. Resultate 59
Die Abnahme der Zellzahl in den transplantierten BHK-AK2 Zellkapseln wurde quantifiziert,
indem Toluidinblau gefärbte Zellen in den Kapseln zu verschiedenen Zeitpunkten vor und
nach der Transplantation auf einer Fläche von 400 x 400 µm2 (n = 5) ausgezählt wurden. Die
Zellzahl vor der Transplantation diente dabei als Ausgangswert (100 %). Am Tag 7 war die
Zellzahl auf 63 ± 2.8 %, am Tag 14 auf 59 ± 15.8 % gesunken (Abb. 3.13). Durch ein
massives Absterben der Zellen bis zum Tag 21 wurden dann noch 15.5 ± 1% vitale Zellen im
Vergleich zum Ausgangswert gefunden (Abb. 3.13). Dies steht im Einklang mit dem
zwischen Tag 14 und Tag 21 nachlassenden, therapeutischen Effekt, der bei Ratten mit
BHK-AK2 Transplantaten beobachtet wurde. Es konnte somit gezeigt werden, dass das
Absterben der Zellen für das Nachlassen der therapeutischen Effizienz verantwortlich war.
Ein ähnlicher Verlauf des Zellverlustes wurde bei ADA-0 und D4 Zellen beobachtet. Hier
kam es allerdings schon am Tag 12 zu einer deutlichen Reduktion der Zellzahl in den Kapseln
(Daten nicht gezeigt).
Abb. 3.13: Relative Anzahl vitaler eingekapselter BHK-AK2 Zellen nach
Transplantation in den Hirnventrikel von Kontrollratten
Die Zellzahl wurde in einem Quadrat der Fläche 400 x 400 µm2 (n = 5) von
Toluidinblau-gefärbter, 1.5 µm dicker Kapselschnitte bestimmt. Die Zellen in
den Kapseln wurden an den Tagen 7, 14, and 21 nach Implantation in naive
Ratten entnommen und fixiert. Die Zahlen wurden im Verhältnis zum Zeitpunkt
vor der Implantation bestimmt (Tag 0). Tag 0: 100%; Tag 7: 63 ± 2.8 %; Tag
14: 59 ± 15.8 %; Tag 21: 15.5 ± 1 %. Die Fehler sind als Standardabweichung
vom Mittelwert angegeben.
60 3. Resultate
3.9. Keine Sedation als unerwünschte Nebenwirkung
Adenosin scheint unter normalen, physiologischen Bedingungen verschiedene Rollen zu
spielen, welche unter anderem die Regulation der Vigilanz bei Tier und Mensch beinhalten
(Dunwiddie und Masino, 2001). Es stellte sich deshalb die Frage, inwieweit eine lokale
Freisetzung von Adenosin unerwünschte Nebenwirkungen wie Sedation oder Ataxie auslöst.
Dazu wurden vollständig gekindelte Ratten, denen entweder Adenosin-freisetzende
Zellkapseln oder Kontrollkapseln in den lateralen Hirnventrikel implantiert wurden, jeden Tag
eine Stunde lang beobachtet. Es konnten keine Unterschiede des spontanen Verhaltens der
Bewegungs- und Erkundungsaktivität sowie des Sozialverhaltens gefunden werden (Daten
nicht gezeigt). Auch in den Perioden zwischen zwei Stimulationen wurden keine
Verhaltensstörungen beobachtet. Somit fanden sich zu keinem Zeitpunkt der Untersuchungen
Anzeichen von Sedation oder Ataxie, wodurch gezeigt wurde, dass die lokale Freisetzung von
Adenosin keine offensichtlichen Nebenwirkungen besitzt.
4. Diskussion 61
4. Diskussion
In dieser Arbeit wurden zur Unterdrückung epileptischer Anfälle von gekindelten Ratten die
bekannten, antikonvulsiven Eigenschaften von Adenosin ausgenützt. Adenosin ist ein
inhibitorischer Neuromodulator mit neuroprotektiven Eigenschaften, die auf der Aktivierung
von Adenosin-A1-Rezeptoren beruhen. Da nach epileptischen Anfällen im liquor
cerebrospinalis von Patienten stark erhöhte Adenosinkonzentrationen gemessen werden, wird
vermutet, dass Adenosin für den Abbruch des Anfalls verantwortlich ist (During und Spencer,
1992). Daher wird Adenosin als endogene, antikonvulsive Substanz diskutiert (Dragunow,
1986).
In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die antikonvulsiven Eigenschaften von
Adenosin-Rezeptor Agonisten in einem Tiermodell der primär generalisierten Epilepsie
(GEPR-9 Ratten) ermittelt. Die systemische Gabe von Adenosin-Rezeptor Agonisten wurde
in diesem Modell bisher noch nicht erforscht. Es konnten starke, antikonvulsive Effekte
beobachtet werden. Jedoch verlangten sedative Nebeneffekte nach einer lokalen Applikation
von Adenosin im Gehirn.
Als Quelle stetiger Adenosin-Freisetzung zur lokalen Verabreichung dienten Zellen mit
gentechnisch modifiziertem Adenosin-Metabolismus. Die Zellen wurden in semipermeable
Hohlfasern eingekapselt und in den lateralen Hirnventrikel von hippokampal gekindelten
Ratten implantiert, um dort Adenosin lokal freizusetzten. Der antikonvulsive Effekt hielt bis
zu 24 Tagen an, wobei das Nachlassen des therapeutischen Effektes durch akuten Zelltod von
Adenosin-freisetzenden Zellen in den transplantierten Kapseln zustande kam.
Im Folgenden wird zuerst diskutiert, ob sich Adenosin-Agonisten auch zur Behandlung
primär generalisierter Epilepsien einsetzen lassen (Kap. 4.1.). Dann wird die therapeutische
Effizienz der verschiedenen, in dieser Arbeit verwendeten, eingekapselten Zelllinien
analysiert (Kap. 4.2.) und die Abhängigkeit der therapeutischen Effizienz Adenosin-
freisetzender Zellkapseln von der Stimulationshäufigkeit im Kindling-Modell evaluiert (Kap.
4.3.).
4.1. Adenosin-Rezeptor Agonisten im GEPR-9 Tiermodell der Ratte
Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Adenosin effizient gegen sekundär
generalisierte, fokale Epilepsie eingesetzt werden kann. Es sollte zusätzlich geprüft werden,
62 4. Diskussion
ob sich das Therapieprinzip auch auf primär generalisierte Epilepsie übertragen lässt. Dazu
wurde das Modell der genetisch vererbten Epilepsie-anfälligen Ratte („genetically epilepsy-
prone rat, GEPR-9) ausgewählt. GEPR-9 Ratten zeigen durch audiogene Reize ausgelöste,
primär generalisierte, tonisch – klonische Anfälle. Es wurde analysiert, ob Adenosin und
dessen Analoga auch zur Unterdrückung dieser audiogen ausgelösten, epileptischen Anfälle
verwendet werden kann. Dazu wurde entweder der A1-Agonist CCPA oder der A2A-Agonist
CPCA injiziert und die antikonvulsive Wirkung mit dem klinisch oft verwendeten,
antiepileptischen Medikament Phenytoin verglichen. Alle drei Substanzen waren in der Lage,
eine signifikante Reduktion der Anfallsstärke zu erzielen. Da alle klinisch etablierten,
antiepileptischen Medikamente, wie zum Beispiel Phenytoin, auch die Stärke der audiogenen
Anfälle der GEPR-9 vermindern (Dailey et al., 1995), konnte gezeigt werden, dass Adenosin
und dessen Analoga mindestens so effizient zur Unterdrückung von primär generalisierten
Anfällen eingesetzt werden können wie gegen sekundär generalisierte, fokale Epilepsie
(Kindling-Modell). Wegen starker, peripherer Nebenwirkungen verlangen Adenosin-
Rezeptor-Agonisten analog zu Adenosin nach einer lokalen Applikation im Gehirn. Da bei
primär generalisierter Epilepsie jedoch kein epileptischer Fokus vorliegt, kann die
antikonvulsive Therapie mit Zellkapseln nicht lokal beschränkt eingesetzt werden. Eine
Therapie mit Adenosin und dessen Analoga ist darum vermutlich nicht möglich, da bei einer
generellen Verabreichung von Adenosin-Rezeptor-Agonisten im gesamten Gehirn die selben,
aus dem Down-Syndrom bekannten, zentralnervösen Nebenwirkungen auftreten würden
(Kap. 4.2.5.).
4.2. Therapeutische Effizienz von Adenosin-freisetzenden Zelllinien im
Kindling-Modell der Ratte
In der vorliegenden Arbeit wurden epileptische Anfälle im Kindling-Modell der Ratte durch
lokal im lateralen Hirnventrikel freigesetztes Adenosin fast vollständig unterdrückt. Die
Anfallsunterdrückung wurde durch Transplantation der eingekapselten Zelllinien ADA-0,
BHK-AK2 und D4 erreicht, die durch Defekte in einem oder beiden der Adenosin-
abbauenden Schlüsselenzyme (ADA und / oder ADK) charakterisiert sind. Es wurde erwartet,
dass eine defekte ADK einen stärkeren Effekt auf die Freisetzung von Adenosin hat, da der
Km-Wert dieses Enzymes 10 – 100 mal niedriger ist, als derjenige von ADA (Arch und
Newsholme, 1978).
4. Diskussion 63
Erwartungsgemäss setzte die ADA- und ADK-defiziente Zelllinie D4 in der ersten Stunde
einer Inkubation in Zellkulturmedium die höchste Adenosinmenge (30 ± 5 ng) frei. In vitro
produzierten diese Zellen während der gleichen Periode etwa 1.5 mal mehr Adenosin als
BHK-AK2 Zellen (19.5 ± 1.3 ng) und etwa 3.5 mal mehr als ADA-0 (8.4 ± 2.6 ng) und ADA-
7bcl2 Zellen (4 – 8 ng). Epileptische Anfälle gekindelter Ratten konnten durch
D4-Zellkapseln bis zum Tag 11 nach der Transplantation unterdrückt werden. Anschliessend
kehrten die tonisch – klonischen Anfälle der Stärke 3 – 5 grösstenteils wieder zurück. Eine
vergleichbar nachlassende, therapeutische Effizienz wurde auch bei ADA-0 Zellen
beobachtet: Bis zum Tag 14 wurden die tonisch – klonischen Anfälle statistisch signifikant
unterdrückt und kehrten anschliessend wieder grösstenteils zurück. In Längsschnitten der
Zellkapseln von D4 Zellen sowie von ADA-0 Zellen wurde nach dem Tag 11 bzw. Tag 14
eine akute Abnahme der Zelldichte gefunden, welche auf ein massives Absterben der Zellen
mit der daraus folgenden Abnahme des therapeutischen Effektes der Zellkapseln hindeutet.
Im Gegensatz zu D4 und ADA-0 Zellen zeigten BHK-AK2 Zellen das günstigste Verhältnis
zwischen Adenosin-Produktion und Überlebensfähigkeit in implantierten Kapseln. In vitro
wurde im Vergleich zu ADA-0 Zellen nach der ersten Stunde etwa 2.3 mal mehr Adenosin
gemessen. Während 24 Tagen konnte eine signifikante Reduktion der Anfallsstärke im
Vergleich mit Kontrollen beobachtet werden. Der Effekt war in den ersten 14 Tagen am
stärksten: In dieser Zeitspanne wurden die epileptischen Anfälle beinahe vollständig
unterdrückt, wobei die mittlere Anfallsstärke zu jedem Zeitpunkt tiefer als bei allen anderen
verwendeten Zellkapseln war.
Der antikonvulsive Effekt von intraventrikulär implantierten, Adenosin-freisetzenden ADA-0
Zellkapseln konnte bei drei Tieren durch Injektion des Adenosin-A1-Rezeptor Agonisten
DPCPX aufgehoben werden. Die Tiere zeigten dann wieder tonisch – klonische Anfälle der
Stärke 3 – 5. Drei Tage später waren diese Tiere wieder vor epileptischen Anfällen geschützt.
Der gleiche Effekt wurde nach Injektion von DPCPX bei einer durch eine implantierte BHK-
AK2 Zellkapsel vor epileptischen Anfällen geschützten Ratte beobachtet. Die therapeutische
Substanz, die von den Zellen freigesetzt wird und zur Anfallsunterdrückung führt, muss
demzufolge Adenosin sein. Bei einem Tier gelang es zudem nach Versuchsende die
implantierte Zellkapsel zu entfernen und die Anfallsstärke zu messen: Die zuvor vor Anfällen
geschützte Ratte (Anfallsstärke 0) hatte nach der Entfernung der Kapsel wieder einen Anfall
der Stärke 5. Dieses Experiment bestätigte die antikonvulsive Wirkung von Adenosin-
freisetzenden Zellkapseln. Aufgrund der Konstruktion der Elektrodenhalterung, die für die
64 4. Diskussion
Verabreichung eines Kindlingstimulus unerlässlich ist, war es jedoch in den meisten Fällen
nach Versuchsende nicht möglich, die Kapsel zu entfernen und dann das Tier zu testen.
Die im Rahmen dieser Dissertation erarbeiteten Ergebnisse belegen die antiepileptischen
Eigenschaften von Adenosin aus implantierten Zellkapseln durch: (i) Eine hoch signifikante
Reduktion der beobachtbaren, epileptischen Anfallsstärken bis zu 24 Tagen nach der
Implantation, wobei der Effekt bei allen Zelllinien in den ersten 12 Tagen am stärksten war;
(ii) Eine starke Reduktion der epileptiformen, neuronalen Entladungen in EEG Ableitungen
während des gleichen Zeitraumes; (iii) Protektierte Tiere, die nach der Injektion von DPCPX
nicht mehr gegen epileptische Anfälle geschützt waren; (iv) Bestätigung der therapeutischen
Eigenschaften von Adenosin mit Hilfe von drei unterschiedlichen Zellkapsel-Systeme mit
ADA- und / oder ADK-defizienten, Adenosin-freisetzenden Zellen.
4.2.1. Rückgang der Anfallsunterdrückung
Zwischen Tag 12 und Tag 24 wurde bei allen untersuchten Zellkapseln eine Verminderung
der antikonvulsiven Effizienz beobachtet. Es war zu vermuten, dass ein Absterben der Zellen
in den implantierten Kapseln diesen Effekt verursachte. Durch Längsschnitte von Zellkapseln,
die zu verschiedenen Zeitpunkten aus den lateralen Hirnventrikeln von Kontrolltieren entfernt
wurden, konnte der Zustand der Zellen analysiert werden.
ADA-WT Zellen und ADA-0 Zellen zeigten dieselben eingeschränkten
Überlebenseigenschaften in implantierten Zellkapseln. Das Überleben dieser Zelllinien ist
somit unabhängig vom entsprechenden Ada-Allel. Der Verlust der Teilungsfähigkeit dieser
konditional immortalisierten Zellen im Rattenhirn (39°C) könnte dazu geführt haben, dass
abgestorbene Zellen nicht mehr durch nachwachsende ersetzt werden. Da Apoptose eine
mögliche Ursache für den Zelltod in den implantierten Zellkapseln ist, wurde das Gen für den
Apoptosehemmer Bcl-2 mit Hilfe eines Retrovirus (Mo-MLV) in diese ADA-defizienten
Zellen übertagen (ADA-7bcl2). Die stark proliferierenden ADA-7bcl2 Zellen überlebten
jedoch nicht länger als ADA-0 Zellen in implantierten Kapseln. Daraus kann geschlossen
werden, dass entweder die ursprünglich für BHK Zellen entwickelten Einkapselungs-
Bedingungen für ADA-WT, ADA-0 und ADA-7bcl2 Zellen ungeeignet sind, oder diese
Fibroblastenzelllinien das im Gehirn vorherrschende Milieu nicht vertragen. Dasselbe gilt
auch für D4 Zellen, die als schnell proliferierende Tumorzelllinien, ähnlich wie BHK Zellen,
für die Einkapselung geeignet sein müssten. In den D4-Zellkapseln setzte jedoch nach Tag 11
ein massives Absterben von Zellen ein, wie in Kapselschnitten demonstriert wurde.
4. Diskussion 65
Die einzigen Zellen in dieser Studie, die über mehr als 8 Wochen in implantierten Kapseln
überlebten, waren BHK-WT Zellen. Es ist bekannt, dass sie in implantierten Zellkapseln mehr
als 20 Wochen überleben können (Zurn et al., 2000). Auch in Adenosin-freisetzenden BHK-
AK2 Zellkapseln waren 2 Wochen nach der Transplantation in den lateralen Hirnventrikel
hauptsächlich lebende Zellen zu finden. Im Gegensatz dazu wurden jedoch 3 Wochen nach
der Transplantation nur noch vereinzelt BHK-AK2 Zellen, umgeben von Zelltrümmern,
beobachtet (Abb. 3.11). Im Prinzip könnte die chemische Mutagenese, die zur Herstellung
dieser BHK-AK2 Zellen verwendet wurde, für die verminderte Lebensfähigkeit
verantwortlich sein. Eine weitere Hypothese ist, dass durch eine verminderte ADK Aktivität
der Adenosinstoffwechsel und damit eventuell die Energieversorgung stark proliferierender
BHK-AK2 Zellen dergestalt limitiert wurde, dass ein Energiemangel der BHK-AK2 Zellen in
den Kapseln zum Zelltod geführt hat.
Zur Lösung des Problems könnte die Verwendung einer Zelllinie mit niedrigerem
Energieverbrauch zur Herstellung von Adenosin-freisetzenden Zellen beitragen. C2C12-Zellen
können zum Beispiel zu Muskelfasern fusionieren. Daraufhin teilen sie sich nicht mehr,
wodurch diese Zellen weniger Energie als stark proliferierende BHK-AK2 Zellen benötigen.
Der verminderte Energieverbrauch könnte zu einem besseren Überlebenspotential von
möglichen Adenosin-freisetzenden C2C12-Zellen im Vergleich zu BHK-AK2 Zellen in
transplantierten Kapseln führen.
4.2.2. Abschätzung der therapeutisch effektiven Adenosinkonzentration am
Wirkungsort
Die Konzentrationsspanne von Adenosin, die am Wirkungsort für eine Anfallsunterdrückung
benötigt wird, wurde durch die Freisetzung der Adenosinmenge aus einzelnen Zellkapseln in
vitro abgeschätzt, da eine direkte Bestimmung der freigesetzten Adenosin-Konzentration im
lateralen Ventrikel, bedingt durch die Konstruktion der Elektrodenhalterung, neben der keine
Mikrodialysevorrichtung hätte platziert werden können, nicht möglich war. Darum wurden
die freigesetzten Adenosin-Mengen einzelner in jeweils 500 µl Zellkulturmedium inkubierter
Zellkapseln bestimmt. Da angenommen werden kann, dass um die implantierten Zellkapseln
herum konstante Adenosin-Gradienten vorhanden sind und deshalb kein Steady-State erreicht
wird, wurde die freigesetzte Adenosin-Menge in den Medumüberständen jeweils nach einer
Stunde Inkubation bestimmt. Zu diesem Zeitpunkt herrschte auch in vitro keine Steady-State
Situation.
66 4. Diskussion
Durch eine einzelne ADA-0 oder BHK-AK2 Zellkapsel wurden in einer Stunde maximal
Konzentrationen von 25 – 100 nM Adenosin (7 beziehungsweise 29 ng/ml Adenosin)
freigesetzt. Die therapeutisch wirksame Adenosin-Konzentration in extrazellulären Bereichen
am Ort der antikonvulsiven Wirkung (Adenosin-Rezeptoren) wird durch (i) equilibrierende
Adenosin-Transporter, (ii) enzymatischen Abbau und (iii) Diffusionseffekte beeinflusst:
(i) Für die beiden equilibrativen Adenosin-Transporter, ENT1 und ENT2, wurden
KM Werte von 40 µM bzw. 140 µM bestimmt (Ward et al., 2000; Yao et al., 1997):
Die KD-Werte von ENT1 und ENT2 liegen drei Grössenordnungen über den von
Zellkapseln freigesetzten Adenosin-Konzentrationen. Eine Verminderung des
therapeutischen Effektes der Zellkapseln durch diese Transporter kann somit
ausgeschlossen werden.
(ii) Ein enzymatischer Abbau von Adenosin durch ADA findet nicht statt, da ADA im
Gehirn kaum exprimiert wird (Mohamedali et al., 1993). Ein intrazellulärer Abbau
durch ADK wird ebenfalls nicht erwartet, da Adenosin bei niedrigen Konzentrationen
durch equilibrative Adenosin-Transporter nicht aufgenommen werden kann.
(iii) Die lokale Produktion von Adenosin führt zu einem Konzentrationsgradienten, der
unter anderem durch Diffusionseffekte hervorgerufen wird. Dadurch wird die Dosis
von Adenosin am Wirkungsort herabgesetzt.
Aus diesen Gründen kann angenommen werden, dass eine Adenosin-Konzentration von
< 25 nM, die einer Freisetzung von 7 – 29 ng Adenosin pro Tag durch eine einzelne
Zellkapsel entspricht, an den entscheidenden Stellen im Gehirn ausreicht, um die Adenosin-
Rezeptorsubtypen A1 (KD = 10 nM) und A2A (KD = 30 nM) (Jacobson und van Rhee, 1997) zu
aktivieren und damit epileptische Anfälle effektiv zu unterdrücken.
Unter normalen, physiologischen Bedingungen wirkt eine basale Adenosin-Konzentration der
gleichen Grössenordnung von 32.8 ± 3.0 nM auf Adenosin-Rezeptoren, wie aus
Mikrodialyse-Studien bekannt ist (Porkka-Heiskanen et al., 2000). Dass einer Änderung der
Adenosin-Konzentration von < 25 nM eine physiologische Bedeutung beigemessen werden
kann, lässt sich wie folgt belegen: Es ist bekannt, dass epileptiforme, neuronale Entladungen
vor allem während des Schlafs auftreten, mit der höchsten Aktivität im non-REM („rapid eye
movement“) Schlaf (Mendez und Radtke, 2001). Ausserdem wurde beobachtet, dass bei
Epilepsie-Patienten nach Schlafenzug während des Schlafes im EEG häufiger epileptiforme,
neuronale Entladungen gemessen werden konnten, als bei den selben Patienten in Routine-
4. Diskussion 67
EEG Ableitungen (Bazil, 2000; Fountain et al., 1998). Die Aktivierung von epileptiformer,
neuronaler Entladungen korreliert mit den Adenosin-Spiegel in den meisten Gehirnregionen:
Während des Schlafens sinken sie um etwa 20 % (Porkka-Heiskanen et al., 2000). Somit
könnten sinkende Adenosin-Konzentration währen des Schlafes epileptische Anfälle
begünstigt. Bei Schlafentzug hingegen kann in den meisten analysierten Hirnregionen etwa
eine Verdoppelung der Adenosin-Konzentration gemessen werden (Porkka-Heiskanen et al.,
2000). Im anschliessenden, intensivierten Schlaf sinken die Adenosin-Spiegel viel stärker als
unter normalen Bedinungen, wodurch eine stärkere epileptiforme, neuronale Aktivität
erwartet werden kann. Da die Konzentrationsschwankungen des Schlaf / Wach - Zyklus und
bei Schlafentzug in derselben Grössenordnung liegen, wie die durch Zellkapseln freigesetzten
Adenosin-Mengen, ist eine physiologische Beeinflussung von Adenosin-Rezeptoren und der
damit verbundene antikonvulsive Effekt durch diese Konzentrationsänderung (< 25 nM)
möglich.
4.2.3. Fehlende Adenosin-A1-Rezeptor Desensitivierung
Es wurde berichtet, dass eine chronische Behandlung von Hirngewebe mit Adenosin-Analoga
zu einer schnellen Desensitivierung (15 – 30 min) von Adenosin-A1-Rezeptoren führen kann
(Abbracchio et al., 1992; Adami et al., 1995). Die antikonvulsive Wirkung von Adenosin-A1-
Rezeptor-Agonisten geht dabei verloren. Wird hingegen ein A1-Rezeptor-Antagonist wie
Koffein chronisch verabreicht, tritt der gegenteilige Effekt auf, und die Anzahl der A1-
Rezeptoren nimmt zu (Ramkumar et al., 1988). In Gegensatz dazu wurde in anderen Arbeiten
durch chronische Behandlung mit Adenosin-Analoga keine Änderung der A1-Rezeptor-
Anzahl im Gehirn beobachtet (Georgiev et al., 1993; von Lubitz et al., 1994). Die
unterschiedlichen Ergebnisse können möglicherweise durch den Unterschied in den
verwendeten Methoden erklärt werden.
In dieser Arbeit wurde jedoch aus folgenden zwei Gründen ebenfalls keine Desensitivierung
von Adenosin-Rezeptoren gefunden: (i) Drei Tage nach vollständiger Aufhebung der
Anfallsunterdrückung durch den spezifischen A1-Rezeptor-Antagonisten DPCPX waren die
Tiere wieder durch die Adenosin-freisetzenden Zellkapseln geschützt. Demzufolge fand eine
Verringerung der Anfallsunterdrückung Adenosin-freisetzender Zellkapseln durch
Desensitivierung von Adenosin-A1-Rezeptoren – mindestens bis zum Tag 14 – nicht statt.
(ii) Eine Entkopplung der A1-Rezeptoren über die Aktivierung von A3-Rezeptoren erfolgt in
mikromolaren Konzentrationen von Adenosin (Dunwiddie et al., 1997). Die hier freigesetzten
68 4. Diskussion
Adenosinmengen der Zellkapseln lagen deutlich darunter (Adenosin-Konzentration < 25 nM,
Kap. 4.2.2.), so dass eine heterologe Desensitivierung von A1-Rezeptoren nicht erfolgen kann.
4.2.4. Kindling-induzierte Resistenz gegen Phenytoin
Es wurde berichtet, dass die antikonvulsive Wirkung des antiepileptischen Medikamentes
Phenytoin bei Ratten durch den Kindling-Prozess entweder erhöht oder erniedrigt werden
kann (Loscher et al., 2000): Es wurden Ratten beobachtet, die vor dem Kindling-Prozess
sensitiv auf Phenytoin reagierten und nach einer Phenytoin-Injektion eine Erhöhung des
Grenzwertes zur Auslösung epileptischer Nachentladungen zeigten. Im vollständig
gekindelten Zustand hingegen wurde durch Injektion von Phenytoin in denselben Tieren keine
antikonvulsive Wirkung mehr erreicht. Umgekehrt war es möglich, dass Ratten, die vor dem
Kindling nicht auf Phenytoin reagierten, im gekindelten Zustand auf dessen antikonvulsive
Wirkung ansprachen. Demzufolge kann der Kindling-Prozess bei einzelnen Ratten zu einer
Veränderung der Wirkungsweise von Phenytoin führen (Loscher et al., 2000). Dabei handelt
es sich möglicherweise um Kindling-induzierte Veränderungen des Gehirns, die in keinem
Zusammenhang mit dem Prozess der Epileptogenese stehen. Eine mögliche Erklärung dafür
ist, dass im Kindling-Modell der epileptische Fokus in Form von implantierten Elektroden
vorliegt und Adenosin deren elektrische Aktivität nicht beeinflussen kann. Diese nur im
Kindling-Modell vorliegende, künstliche Situation könnte eine Adenosin-Therapie
verunmöglichen. Deswegen wurden sämtliche Tiere in dieser Arbeit, die am Tag 24 resistent
gegen eine Behandlung mit Phenytoin waren - es handelte sich dabei um drei Tiere mit
implantierten BHK-AK2 Kapseln – aus den Statistiken ausgeschlossen. Auf einen Test mit
Phenytoin vor der Implantation der Kapseln in den lateralen Ventrikel der Ratten wurde
verzichtet, um eine mögliche Beeinflussung des nachfolgenden Experimentes mit Adenosin-
freisetzenden Zellkapseln zu vermeiden.
4.2.5. Nebenwirkungen von Adenosin
Aus dem Down-Syndrom ist bekannt, dass eine etwa 50 % erhöhte Adenosin-Konzentration
im zentralen Nervensystem zu Sedation, reduziertem Schmerzempfinden, zentraler Schlaf-
Apnoe und Lernstörungen führen kann (Dunwiddie und Masino, 2001). Sämtliche in dieser
Arbeit für Kindling-Experimente verwendeten Tiere wurden deshalb auf Anzeichen von
4. Diskussion 69
Sedation oder Ataxie getestet: Es wurden keine Unterschiede im explorativen Verhalten
zwischen den behandelten Tieren und den Kontrollratten gefunden. Die Tiere zeigten zudem
normales, gegenseitiges Putzverhalten und keine Aggressionen gegenüber Käfiggefährten. Im
Gegensatz zum Down-Syndrom, bei dem die Adenosin-Konzentration im gesamten Gehirn
erhöht ist (Dunwiddie und Masino, 2001), scheint eine lokal begrenzte Freisetzung keine
unerwünschten Nebenwirkungen zu verursachen: Durch Diffusionseffekte und die Entfernung
von Adenosin durch equilibrative Adenosin-Transporter aus extrazellulären Kompartimenten
(Dunwiddie und Diao, 1994) wird eine Anreicherung vermieden. Somit ist zu erwarten, dass
nur die nächste Umgebung der Kapseln ausreichend mit Adenosin versorgt wird.
4.3. Einfluss des Kindling-Prozesses auf die therapeutische Effizienz der
Zellkapseln
Da bekannt ist, dass der Kindling-Prozess eine progressive Verstärkung von Anfällen bewirkt,
war unklar, ob die Anzahl der Teststimuli, neben dem Absterben der Zellen in den Kapseln,
einen Einfluss auf den Verlauf der Anfallsunterdrückung durch Adenosin-freisetzende
Zellkapseln hatte. Es wurden darum zwei gekindelte Rattengruppen, die Adenosin-
freisetzende BHK-AK2 Implantate erhalten hatten, untersucht und entweder einmal oder
dreimal wöchentlich stimuliert. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen
beobachtet und die Anfälle durch epileptische Anfallsstärken und neuronale Entladungen im
EEG analysiert. Beide Gruppen zeigten im Vergleich zu einer Kontrollgruppe zunächst eine
beinahe vollständige, signifikante Unterdrückung der epileptischen Anfälle. Ein statistisch
signifikanter Unterschied der Anfallsstärken zwischen den beiden Testgruppen war jedoch
nicht zu beobachten. Im Zeitraum von 4 Wochen liess die antikonvulsive Wirkung der BHK-
AK2 Kapseln im Verhältnis zu den Kontrollkapseln gleichermassen nach, und es konnte zu
keinem Zeitpunkt der Studie ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den
Testgruppen gefunden werden.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Stimulationshäufigkeit keinen Einfluss auf den
Behandlungsverlauf mit Adenosin-freisetzenden Implantaten hat. Die Umgebung der Kapsel
ist somit über eine gewisse Zeitspanne durch die protektiven Eigenschaften von Adenosin vor
epileptiformen, neuronalen Entladungen geschützt. Der Rückgang des antikonvulsiven
Effektes von Adenosin-freisetzenden Zellkapseln ist darum auf das Absterben der Zellen in
den Kapseln und nicht auf die Anzahl der Teststimulationen zurückzuführen.
70 4. Diskussion
4.4. Schlussfolgerungen
Adenosin-freisetzende Zellkapseln konnten effektiv zur Unterdrückung von Anfällen im
Kindling-Modell der fokalen Epilepsie der Ratte verwendet werden. Folgende Resultate
liegen dem zugrunde:
(i) Bei lokaler Applikation von Adenosin wurde nach Implantation von Adenosin-
freisetzenden Zellkapseln eine hoch signifikante Reduktion der epileptischen
Anfallsstärke im Kindling-Modell der Ratte bis zu 24 Tage im Vergleich zu
Kontrollratten beobachtet. Am stärksten war dieser Effekt in den ersten 12 Tagen der
Behandlung.
(ii) In demselben Zeitrahmen erfolgte bei Ratten mit Adenosin-freisetzenden Zellkapseln
eine starke Reduktion von epileptiformen, neuronalen Entladungen im EEG nach einer
elektrischen Stimulation.
(iii) Die Anfallsunterdrückung konnte in Ratten mit Adenosin-freisetzenden Zellkapseln
durch Injektion des Adenosin-A1-Rezeptor Antagonisten DPCPX rückgängig gemacht
werden. Damit wurde Adenosin als die für die Anfallsunterdrückung verantwortliche
Substanz identifiziert.
(iv) Eine Desensitivierung von A1-Rezeptoren ist unwahrscheinlich, da die antikonvulsive
Wirkung Adenosin-freisetzender Transplantate nach DPCPX Injektion voll reversibel
war.
(v) Durch den Vergleich von zwei gekindelten Rattengruppen mit gleichen
Zellkapselimplantaten, aber unterschiedlicher Stimulationsfrequenz wurde gezeigt,
dass die Anfallshäufigkeit keinen Einfluss auf die therapeutische Wirkung von
Adenosin-freisetzenden Zellkapseln hat. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das
Absterben der Zellen und nicht die Anzahl der Teststimulationen für den Rückgang
des antikonvulsiven Effektes der Zellkapseln verantwortlich ist.
Diese Resultate beweisen die Tauglichkeit von Adenosin als neues pharmakologisches
Prinzip gegen fokale Epilepsie. Dies ist aus folgenden Gründen von Bedeutung:
(i) Eine anhaltende lokale Freisetzung von Adenosin ist eine alternatives Prinzip zur
Unterdrückung von epileptischen Anfällen. Periphere Nebenwirkungen, die bei einer
systemischen Gabe von Adenosin zu erwarten sind, können vermieden werden.
4. Diskussion 71
Ausserdem bewirkt die lokale Freisetzung von Adenosin keine zentralnervösen,
unerwünschten Nebenwirkungen wie Sedation oder Ataxie.
(ii) Adenosin reichert sich im Gewebe nicht an, da es durch Nukleosid-Transporter (Ward
et al., 2000) von Zellen aufgenommen werden kann. Der Abbau von Adenosin erfolgt
durch die Enzyme ADA und ADK (Abb. 1.2).
(iii) Adenosin könnte klinisch gegen verschiedene epileptische Anfallstypen verwendet
werden. Neben der Transplantation des Zellkapselsystems wäre auch die Freisetzung
von Adenosin oder Analoga aus synthetischen Polymeren oder Mikropumpen
denkbar.
4.5. Ausblick
Die lokale Freisetzung von Adenosin konnte als ein neues pharmakologisches Prinzip zur
Therapie von Epilepsie etabliert werden. Ein ungelöstes Problem stellt jedoch die mangelnde
Überlebensfähigkeit der Adenosin-freisetzenden Zellen in den transplantierten Hohlfasern
und der damit einhergehende Rückgang der Anfallsprotektion zwischen Tag 12 bis 24 nach
Implantation dar.
Mit folgenden Experimenten könnte das beschriebene Projekt weitergeführt werden:
(i) Eine Quelle für therapeutisch langfristig wirksame Zelltypen könnte in der
Verwendung von Zellen bestehen, die ein bekanntes Langzeit-Überlebenspotential
besitzen. Von der Myoblastenzelllinie C2C12 ist bekannt, dass verkapselte Zellen nach
der Transplantation weit mehr als 80 Tage lang überleben können (Regulier et al.,
1998). C2C12 Zellen besitzen die Fähigkeit innerhalb der Kapseln zu Muskelfasern zu
fusionieren. Die entstehenden mehrkernigen Muskelfasern teilen sich nicht mehr und
der damit verbundene verminderte Energiebedarf könnte sich als Vorteil für mögliche
Adenosin-freisetzende C2C12 Zellen in implantierten Kapseln erweisen. Ein
Überwachsen der Kapseln und eine mögliche Verstopfung durch abgestorbenes
Zellmaterial kann dadurch ebenfalls vermieden werden, was eine ausreichende
Sauerstoff- und Nährstoffversorgung der Zellen in den Kapseln begünstigen würde.
(ii) Eine weitere Quelle für Adenosin-freisetzende Zellen bilden embryonale Stammzellen
(ES Zellen) mit einem genetischen Defekt der Adenosin-Kinase. Von ES Zellen ist
bekannt, dass sie theoretisch in jeden beliebigen Zelltyp differenzieren können. Durch
72 4. Diskussion
in vitro Differenzierung von Adenosin-freisetzenden ES Zellen in Neuronen oder
Gliazellen (Brustle et al., 1999), ist es möglich, Zellen zu erhalten, die optimal an das
Milieu im Gehirn angepasst sind und dadurch möglicherweise eine längere
Lebensdauer nach der Transplantation aufweisen. Diese Zellen würden sich zudem
nach erfolgter Differenzierung nicht mehr teilen, was die bereits genannten Vorteile
mit sich brächte.
(iii) Die lokale Freisetzung von niedrigen Adenosinmengen könnte auch mit Hilfe von
Mikropumpen erreicht werden, vor allem wenn diese mit einem integrierten System
zur Anfallsvorhersage gekoppelt wären (Elger und Lehnertz, 1998). Ein solches
System hätte den Vorteil, dass die injizierte Adenosin-Dosis genau kontrollierbar wäre
und über längere Zeit konstant gehalten werden könnte.
5. Material und Methoden 73
5. Material und Methoden
5.1. Verabreichung von Pharmaka
DPCPX (8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthine; Research Biochemicals) wurde in DMSO
gelöst (1 mg/ml). Phenytoin (5,5-diphenylhydantoin; Sigma) wurde in 50 %
polyethylenglycol 400 gelöst (30 mg/ml). CCPA (2-Chloro-N6-cyclopentyladenosin; Sigma)
wurde in 10 % polyethylenglycol 400 gelöst (6 mg/ml). CPCA (5‘-(N-Cyclopropyl)-
carboxamidoadenosin; Sigma) wurde in 10 % polyethylenglycol 400 / 0.9 % NaCl gelöst (20
mg/ml). DPCPX (1 mg/kg), Phenytoin (60 mg/kg), CPCA (10 mg/kg) oder CCPA (3 mg/kg)
wurden i.p. verabreicht.
5.2. Reinigung rekombinanter Adenosin-Kinase
Zur Herstellung rekombinanter, aktiver Adenosin-Kinase in Bakterien wurde die komplette
cDNA Sequenz des Enzymes in den Expressionsvektor pQE-60 (The QIAexpressionistTM Kit,
Quiagen) ohne (His)6 Sequenz eingebracht. Das Plasmid wurde in kompetente E. coli
M15[pREP4] durch Hitzeschock-Methode übertragen (The QIAexpressionistTM Kit,
Quiagen). Ein gegen die entsprechenden Antibiotika (Ampicillin und Kanamycin) resistenter
Einzelklon wurde in 20 ml LB-Medium übertragen und zusammen mit 100 µg Ampicillin und
25 µg Kanamycin über Nacht bei 37°C geschüttelt. Diese 20 ml Vorkultur wurde dann in 750
ml frisches LB-Medium mit 100 µg Ampicillin gegeben und 3 Stunden bei 37°C unter
ständiger Agitation inkubiert. Danach wurde die Bakteriensuspension auf 25°C abgekühlt und
IPTG (1 mM Endkonzentration; Pharmacia) zur Induktion der ADK-Epression zugegeben.
Nach 5 Stunden wurde die Bakterienkultur abzentrifugiert und das Pellet in 10 ml
Waschlösung (30 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10 % Glycerin) resuspendiert. Durch
Ultraschall-Behandlung (1 min) wurden die Bakterien lysiert. Zu diesem Lysat wurde 100 ml
Waschlösung zugegeben und der pH-Wert mit 1 M HCl auf pH 5.5 eingestellt. Anschliessend
wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation (10 min bei 15'000 g) entfernt. Der Zellfreie
Überstand wurde auf eine AMP-Sepharose-Säule (1 cm Durchmesser, 5 ml Inhalt; Pharmacia)
aufgetragen und mit Waschlösung solange gewaschen, bis kein Protein in der aus der Säule
austretenden Lösung mehr nachgewisen werden konnte. Mit Elutionslösung (20 mM Tris pH
74 5. Material und Methoden
8.3, 30 % Glycerin) wurde die ADK von der Säule in 1 ml Fraktionen enluiert. Aktive
Fraktionen wurden vereinigt und der pH-Wert der ADK-Lösung mit NaH2PO4 auf pH 6.5
eingestellt. Pro Ansatz (750 ml LB-Medium) konnten so etwa 20 U aktive ADK gewonnen
werden, die in der Elutionslösung bei –20°C gelagert werden konnten.
5.3. Adenosin Bestimmung durch Enzym-gekoppelte Fluoreszenz
Zur Bestimmung von Adenosin-Konzentrationen in Zellkultur Überständen wurden je
105 „Baby Hamster Kidney“ (BHK)-AK2, ADA-0, BHK-wild type (WT) und ADA-WT
Zellen auf sterile 10 cm Petrischalen (Nunclon) ausplattiert und für 16 h in 5 ml komplettem
DMEM inkubiert. Vor der Entnahme von Überständen wurden die Zellen oder Kapseln in
serumfreien QBSF-56 Medium (Sigma) für 1 h inkubiert, welche anschliessend durch
frisches, auf 37°C vorgewärmtes QBSF-56 ersetzt wurden. 0.5 ml Aliquots wurden
entnommen, um die Adenosinkonzentration zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem
Mediumwechsel zu bestimmen. Zunächst wurde jegliche Enzymaktivität in den Proben durch
2 minütige Inkubation bei 90°C eliminiert. Bekannte Mengen von Adenosin (0, 5, 10 und 20
ng/ml) wurden den Aliquots als interne Standardkonzentration beigefügt. Dann wurden je 10
µl der Proben mit 20 µl eines Enzym-Mixes, der aus Pufferlösung (25 mM Na-Hepes, 1 mM
MgCl2, 200 mM KCl, pH 7.7), 30 nM GTP, 20 µM Phosphoenolpyruvat, 1 U/ml Myokinase
(Böhringer), 1 U/ml Pyruvatkinase (Böhringer) und 1 mU/ml Adenosin-Kinase
(Selbstherstellung, 1 U Adenosin-Kinase phosphoryliert 1 µMol Adenosin in einer Minute bei
25°C) bestand, beigegeben. Die Reaktionen wurden jeweils im Doppel erstellt und für 1 h bei
25°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion bei 80°C für 30 s gestoppt. 100 µl ATP-Assay
Mix (ATP Biolumineszenz Kit, Sigma), 1:10 im mitgelieferten Verdünnungspuffer verdünnt,
wurde zugegeben und anschliessend sofort die Lumineszenz als Zählereignisse pro Minute in
einem „Liquid Scintillations Analyzer“ (Modell 2500TR; Packard) in Intervallen von 10 s
gemessen. Zur Bestimmung des Nullwertes der Fluoreszenzreaktionen wurde gleichermassen
vorgegangen, ausser dass jeweils weder Adenosin noch Adenosin-Kinase zugegeben wurde.
Die Adenosinkonzentration der Proben wurde dann wie folgt berechnet: (Konzentration von
Adenosin in der Probe) = (Konzentration des zugegebenen Adenosinstandards) x
(Zählereignisse der Probe – Zählereignisse der Nullwerte) / (Zählereignisse der Probe mit
zugegebenem Adenosinstandards – Zählereignisse der Probe). Die bestimmbare
Mindestmenge war in diesem Assay 0.5 pg Adenosin pro Probe.
5. Material und Methoden 75
5.4. Aktivitätsmessung der Adenosin-Kinase
Zur Bestimmung der Adenosin-Kinase-Aktivität einer Zellinie wurden jeweils 5 x 106 Zellen
auf eine sterile 10 cm Petrischale (Nunclon) gegeben und solange in komplettem DMEM
inkubiert, bis ein konfluenter Monolayer den Plattenboden bedeckte. Die Zellen wurden dann
mit Trypsin (0.4 % in PBS) abgelöst, dreimal mit kaltem PBS gewaschen und in 1 ml 10 mM
Tris HCl, pH 7.4 resuspendiert. Die Suspension aus ca. 107 Zellen wurde durch dreimaliges
Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschliessenden Auftauen lysiert. Das Lysat wurde 60
min bei >12‘000 g in einer Eppendorfzentrifuge bei 4°C abzentrifugiert und die Proteinmenge
des erhaltenen, zellfreien Überstandes mittels standardisiertem Bradfordtest quantifiziert. Die
Aktivität der Adenosin-Kinase wurde dann im Doppel in jeweils 10 µl und 20 µl
Proteinextrakt bestimmt. Die Proteinextrakte wurden dazu mit einer 2-fach konzentrierten
Inkubationslösung und H2O auf 100 µl ergänzt, sodass Proteinextrakt, 50 mM Maleat NaOH,
pH 5.5, 100 µM [14C]-Adenosin (5 µCi/µmol), 4 mM ATP, 1 mM MgCl2 und 5 µM Erythro-
9-[3-(2-hydroxynonyl)]adenin (EHNA, Sigma) in der Lösung enthalten waren. Diese Lösung
wurde bei 37°C für 15 min inkubiert. Dabei wird [14C]-Adenosin durch eine vorhandene ADK
zu [14C]-AMP phosphoryliert und der Abbau von [14C]-Adenosin zu [14C]-Inosin durch
Blockierung der ADA durch EHNA verhindert. Das Reaktionsgemisch wurde daraufhin
direkt auf Filterpapier (Whatman Chromatography Paper, Katalog #3030917) aufgetragen, an
welchem [14C]-AMP bindet, [14C]-Adenosin jedoch nicht. Die Reaktion wurde sofort mit 5 x
5 ml 4°C kaltem 1 mM HCOONH4 gestoppt und mit 2 x 5 ml 4°C kaltem Ethanol gewaschen.
Das Filterpapier wurde bei Raumtemperatur getrocknet und anschliessend in
Scintillationsflüssigkeit (Ultima Gold, Packard) gegeben, um die auf dem Filterpapier
gebundene Radioaktivität zu bestimmen. Zur Bestimmung des Nullwertes des
Reaktionsgemisches wurde dieses ohne Zugabe von Proteinextrakt auf Filterpapier
aufgetragen und die Radioaktivität auf dem Filterpapier wie beschrieben bestimmt. Zur
Bestimmung der Adenosin-Kinase-Aktivität wurde der Nullwert der entsprechenden Zellinie
vom Messwert abgezogen und auf Zählereignisse pro Proteinmenge umgerechnet. Daruch
konnte die Aktivität der Adenosin-Kinase einer Zellinie mit einer anderen verglichen werden.
76 5. Material und Methoden
5.5. Western-Blot
Für den Western-Blot wurden die selben Proteinextrakte wie in der Adenosin-Kinase-
Aktivitätsmessung (Kap. 5.4.) verwendet. Die Konzentration der Proteinextrakte wurden nach
Proteinbestimmung mittels standardisiertem Bradfordtest durch Zugabe von PBS auf 4 µg
Protein/µl verdünnt. Dann wurden jeweils 10 µl der Probe (40 µg Protein) zusammen mit
10 µl Probenpuffer (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 20 % Glycerin, 0.002 % Bromphenolblau,
10 % β-Mercaptoethanol und 4 % SDS) für 5 min bei 60°C denaturiert und anschliessend mit
einem 1.5 mm dicken, 10 %-igem SDS-PAGE („sodium-dodecyl-sulfate-polyacrylamid-gel-
electrophoresis“) Minigel aufgetrennt (Mini Protean II, Bio-Rad). Das Minigel wurde
anschliessend 15 min in Blotpuffer (39 mM Glycin, 48 mM Tris und 0.04 % SDS) bei
Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Proteine in einem halbtrockenen
Elektroblotingverfahren (Trans Blot, Bio-Rad) bei 15 V für 60 min auf eine
Nitrozellulosemembran übertragen. Für die Immunfärbung wurden der Blot während 1 h bei
Raumtemperatur in TBST (10 mM Tris, 0.15 M NaCl und 0.05 % Tween-20) mit 5 %
fettfreier Trockenmilch (Blocking Reagent, Bio Rad) blockiert und anschliessend
polyklonales Antiserum gegen Adenosin-Kinase (rabbit O1D3-C3A1; Zur Verfügung gestellt
von D. Benke) 1:2000 in TBST/5 % Blocker verdünnt zugegeben und 16 h bei 4°C inkubiert.
Der Blot wurde dann bei Raumtemperatur einmal für 10 min mit 20 mM Tris pH 7.5, 60 mM
NaCl, 2 mM EDTA, 0.4 % SDS, 0.4 % Triton X-100 und 0.4 % Deoxychlorat und dann
dreimal für 10 min mit TBST gewaschen. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper
(„horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG“, 1:2500 verdünnt in TBST/5 %
Blocker) wurde 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach den gleichen, oben genannten
Waschschritten, wurde die Immunoraktivität mit der Chemolumineszenzmethode („Western-
Blot chmemoluminescence reagent plus“, DuPont NEN) auf Röntgenfilm festgehalten.
5.6. Verwendete Zelllinien
B-mix (B-mix K-44/6) und D4 Zellen wurden von Prof. John Drach, University of Michigan
(Ann Arbor, USA) zur Verfügung gestellt. Bei den B-mix Zellen handelt es sich um eine
embryonale Rattenzelllinie, die keine ADA Aktivität mehr besitzt (Schlossberg und
Hollander, 1973). Die grossen epithelialen Zellen bilden bösartige Tumore in homologen
Rattenstämmen und enthalten das Genom des Rous Sarcoma Virus (Verhoef et al., 1981);
5. Material und Methoden 77
(Peterson, 1977). B-mix Zellen wurden einer steigenden Konzentration
9-β-D-Arabinofuranosyladenin (AraA, Sigma) ausgesetzt, bis sie resistent gegen 215 µM
AraA waren. Daraufhin wurden Subklone gebildet und ein Klon „D4“ wurde erhalten. Die
D4 Zelllinie zeichnet sich durch fehlende ADA Aktivität und eine sehr geringe ADK Aktivität
(3.0 ± 0.3 %) aus.
Zur Herstellung von Adenosin-freisetzenden BHK Zellen wurden BHK-21(C-13) (American
Tye Culture Collection (ATCC) #CCL-10) verwendet, welche in dieser Arbeit als wild-typ
BHK Zellen (BHK-WT) bezeichnet sind.
5.6.1. Herstellung der BHK-AK2 und BHK-AK5 Zellen
Als Ausgangszelllinie wurden BHK Zellen (Baby Hamster Kidney Zellen) verwendet, die als
50 %-konfluenter Monolayer in DMEM mit 10 % FCS und 200 µg/ml Ethylmethansulfonat
(EMS, Sigma) 18 h bei 37°C mutagenisiert wurden. Danach wurden je 105 Zellen in 10 ml
komplettem DMEM auf fünf 10 cm Petrischalen ausplattiert und 3 Tagen bei 37°C inkubiert.
Dann wurde das Medium durch DMEM, komplettiert mit 10 % Pferdeserum (HS) und 50 µM
9-β-D-Arabinofuranosyladenin (AraA, Sigma), ersetzt und bei 37°C inkubiert. In diesem
Schritt wird AraA wird in den Zellen durch eine aktive ADK zu einem toxischen Nukleotid
phosphoryliert und das verwendete, ADA freie HS verstärkt diesen toxischen Effekt.
Jedesmal, wenn die Zellen konfluent gewachsen waren, wurde jeweils ein Drittel der Zellen
auf neue 10 cm Petrischalen ausplattiert, das Medium (DMEM + 10 % HS) gewechselt und
die AraA Dosis jeweils um 50 µM erhöht. Nachdem die Zellen gegen 200 µM AraA resistent
waren, wurden sie mit Trypsin (0.4 % in PBS) abgelöst, 105 Zellen pro 10 cm Petrischalen
ausplattiert und in DMEM mit 10 % HS, 10 µM Erythro-9-[3-(2-hydroxynonyl)]adenin
(EHNA, Sigma) und 100 µM AraA auf eine defekte Adenosin-Kinase selektiert. Die Zugabe
von EHNA diente dabei zur Inhibition der intrazellulären Abbau von AraA durch ADA. Es
konnten Einzelklone isoliert und auf Adenosinfreisetzung getestet wurden. So wurde im
Rahmen dieser Arbeit ein Klon mit geringer (BHK-AK2) und einer mit mittlerer Adenosin-
Kinase-Aktivität (BHK-AK5) erhalten.
78 5. Material und Methoden
5.6.2. Herstellung von konditional immortalisierten Fibroblasten-Zelllinien
Als Quelle für Adenosin-freisetzende Zellen wurden ADA-/- Mäuse hergestellt: ADA+/- Mäuse
(Wakamiya et al., 1995) wurden mit Immortomäusen™ TsA58+/+ (Jat et al., 1991) verpaart,
um eine neue Mäuselinie mit dem Genotyp ADA+/-TsA58+/+ zu erhalten. Diese Mäuse wurden
wiederum mit ADA+/- Mäuse verpaart. Da ADA-/- Mäuse im Embryonalstadium sterben,
wurden Embryonen vom Tag 14.5 zur Präparation von Zellen verwendet. Den Embryonen
wurden Kopf, Eingeweide, Herz, Leber, Lunge und Niere entfernt. Das übrige Gewebe der
ADA-/-TsA58+/- Embryos wurde wie folgt zur Gewinnung von konditional immortalisierten
Fibroblasten verwendet: Das Gewebe wurde klein geschnitten, mit DMEM gewaschen und
für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert. Das Sediment wurde für 10 min in 2 ml PBS mit
0.4 % Trypsin und 1 mM EDTA bei Raumtemperatur inkubiert und dann etwa 20 Mal durch
eine Pasteurpipette passagiert um eine möglichst homogene Zellsuspension zu erhalten. Diese
Suspension wurde für 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert und das Zellsediment (etwa
107 Zellen) in 5 ml komplettem DMEM mit 10 u/ml rekombinantem Maus IFN-γ (Life
Technologies) resuspendiert. Nach 5 min hatten sich grössere Zell- oder Gewebeklumpen
gesetzt und der Überstand wurde auf neue 10 cm Petrischalen übertragen und in 10 ml
komplettem DMEM mit 10 u/ml IFN-γ bei 33°C bei 5 % CO2 inkubiert. Unter diesen
Bedingungen war die Proliferation der Zellen gewährleistet.
Aus eingefrorenen Geweberesten der urprünglichen Embryonen wurde mittels PCR bestimmt,
welche der hergestellten, pimären Zelllinien den gewünschten Genotyp ADA-/-TsA58+/-
besassen. Dazu wurden 3 verschiedene PCR-Reaktionen mit allelspezifischen Primern und
mit DNA, die durch Standardprozesse aus gefrorenen Embryogeweben gewonnenen wurde,
durchgeführt. Für den Nachweis der Genotypen ADA+/- und ADA-/- wurde einerseits der
Primer pGK (5‘-ATG CTC CAG ACT GCC TTG GGA AAA GC-3‘), welcher spezifisch für
den PGK-Promotor der Neomycinresistenzkassette ist, die für das Knock-Out Allel verwendet
wurde, und andererseit der Primer ExVI-A (5‘-TAC ACA GCT CCA ACA CCT CAA GGG
AC-3‘), welcher für das ADA Gen spezifisch ist, verwendet. Zum Nachweis des ADA
Wildtypgens (zur Diagnose von ADA+/- und ADA+/+) wurden einerseits der oben bereits
erwähnte Primer ExVI-A und andererseits der Primer Ex5-S (5‘-AAA GTC CTC CCT CTT
CCT CTC TCC AC-3‘), der spezifisch für das ADA Gen ist, eingesetzt. Das TsA58 Allel
wurde durch die Primer SV40S (5‘-CTC CTA GCT CAA AGT TCA GCC TGT CC-3‘) und
SV40A (5‘-ACT CCA CAC AGG CAT AGA GTG TCT GC-3‘) nachgewiesen. Sämtliche
PCR Reaktionen wurden in 50 µl Volumina durchgeführt, die aus folgenden Bestandteilen
5. Material und Methoden 79
zusammengesetzt waren: 32.75 µl H2O, 1 µl DNA (300 bis 600 ng), 5 µl 10 x PCR-buffer
(166mM Ammoniumsulfat; 670mM Tris, pH 8.8; 67mM MgCl2; 50 mM 2-Mercaptoethanol;
67µM EDTA), 0.4 µl 1 % Gelatine, 5 µl DMSO, 5 µl 10 mM dNTP-mix, 0.6 µl 10µM
Primer-mix (Enthalten die beiden entsprechenden Primer in einer Konzentration von je
10 µM), 0.25 µl Taq-Polymerase (5 U/µl Life Technologies).
Eine Zelllinie mit dem Gewünschten Genotyp wurde ADA-0 (ADA-/-TsA58+/-) getauft. Zu
Kontrollzwecken wurde eine weitere Zelllinie ADA-WT (ADA+/+TsA58+/-) aus dem gleichen
Wurf verwendet, die entsprechend homozygot für das WT Ada Allel war.
5.6.3. Herstellung der ADA-7bcl2 Zellen
Die ADA-7 Zelllinie wurde als Subklon mit höherer Adenosinfreisetzung aus ADA-0 Zellen
hergestellt. Damit ADA-7 Zellen in implantierten Kapseln vor einer möglichen Apoptose
geschützt waren, wurde das menschliche Bcl-2 Gen mit mit Hilfe von replikationsdefizienten
Moloney Murine Leukemia Retroviren (Mo-MLV) auf dem Plasmid pBPNhBcl-2 (fertige
Viruspartikel zur Verfügung gestellt von P. Aebischer, CHUV Lausanne) in ADA-7 Zellen
übertragen. Das Expressionsplasmid pBPNhBcl-2 (Abb. 3.2) enthält ein Resistenzgen gegen
Ampicillin und die pBS ORI-Sequenz („origin of DNA Replication) zur Vervielfältigung in
E.coli Bakterien. Zur Herstellung der replikationsdefekten Mo-MLV Viren wurde eine
eukaryotische Verpackungszelllinie (P. Aebischer, CHUV Lausanne) verwendet, die unter der
Kontrolle des CMV-Promotors stehende Viruskernproteine (gag) und Replikationsenzyme
(pol) exprimiert. Damit keine virale Rekombinationsereignisse auftreten konnten, wurde das
virale Hüllprotein für Mo-MLV Viren (env) auf einem separaten Plasmid kodiert. Das
Plasmid für die Herstellung der Hülle, das vom Mo-MLV-LTR Promotor und das
SV40-Polyadenylierungssignal eingerahmt wird, wurde dann zusammen mit dem
Expressionsplasmid pBPNhBcl-2 in die Verpackungszelllinie übertragen. Das
Expressionsplasmid pBPNhBcl-2 trägt das humane Bcl-2 Gen unter der Kontrolle des
Mo-MLV-LTR Promotors. Es enthält zudem das Verpackungssignal Ψ (Psi), welches von
den in Verpackungszellen exprimierten Replikationsenzyme erkannt wird. Die
Verpackunszellinie ist nun durch die übertragenen Plasmide in der Lage, die zwischen 5‘- und
3‘-LTR eingefügte Sequenz auf dem Plasmid pBPNhBcl-2 in Virushüllen zu verpacken und
somit Viruspartikel herzustellen. Mit diesen amphotropen Viruspartikeln können dann vor
allem teilungsaktive Zellinien infiziert werden und über die reverse Transkriptase des Mo-
MLV in das Zielgenom stabil integriert werden. Zur Selektion infizierter Zellen ist ein unter
80 5. Material und Methoden
der Kontrolle des SV40-Promotors stehendes Puromycin-Resistenzgen zwischen den LTR
Sequenzen enthalten. Da die Gene für Viruskernproteine und Replikationsenzyme durch das
beschriebene System nicht in Viruspartikel verpackt werden, kann eine Herstellung von Viren
in den Zielzellen ausgeschlossen werden.
Auf eine 6-Loch Plasikschale (Nunclon) wurden je Loch 105 ADA-7 Zellen in 2 ml
komplettem DMEM ausplattiert. Am nächsten Tag wurde frisches, komplettes DMEM
Medium mit 5 µg/ml Hexadimethrinbromid (Sigma) zugegeben. Pro Loch wurde in
aufsteigender Menge folgende Mengen der viralen Stocklösung (105 – 106 TU/ml
(transfecting units)) zugegeben: 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl. Die Zellen im letzten
Loch dienten als untransfizierte Kontrolle. Die Zellen wurden über Nacht zusammen mit den
Viren inkubiert, anschliessend mit PBS gewaschen und frisches komplettes DMEM
zugegeben. Nach erneuter Inkubation über Nacht wurde das Medium gewechselt und 2 µg/ml
Puromycin (Sigma) für die Selektion zugegeben. Aus den resistenten Klonen wurde eine
Zelllinie ADA-7bcl2 isoliert und die Expression von Bcl-2 mit Hilfe eines Bcl-2-Antikörpers
(Anti-bcl-2 Oncoprotein, human; Böhringer, #1624989) nachgewiesen. Zur Abschätzung der
Transfektions-Effizienz wurden ADA-7 Zellen mit dem Mo-MLV-Vektor LNL-SLX-
CMVβ-gal (zur Verfügung gestellt von N. Déglon, CHUV Lausanne) transfiziert und die
Zellen auf die Expression des E. coli LacZ-Gens geprüft. Die Transfektion mit LNL-SLX-
CMVβ-gal wurde analog zu der mit pBPNhBcl-2 durchgeführt: 105 ADA-7 Zellen wurden
mit 2 x 105 TU transfiziert. Die Zellen wurden daraufhin mit PBS gewaschen und mit für 5
min auf Eis in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Dann wurden sie 2 Mal mit PBS gewaschen und
mit einer Lösung überschichtet, die 1 mg/ml X-Gal (Sigma), 5 mM K4Fe(CN)6 (Sigma), 5
mM K3Fe(CN)6 (Sigma) und 2 mM MgCl2 in PBS (pH 7.4) enthielt. Nach 1 h Inkubation bei
37°C wurden diejenigen Zellen gefärbt, die LACZ exprimierten. Die Transfektions-Effizienz
wurde aus dem prozentualen Anteil an blau gefärbten Zellen berechnet und angenommen,
dass die Transfektionseffizienz für pBPNhBcl-2 etwa gleich ist.
Die viral mit pBPNhBcl-2 transfizierte Zelllinie wurde anschliessend auf Abwesenheit von
viralen Partikeln untersucht. Dazu wurde ein konfluenter Monolayer von ADA-7bcl2 Zellen
2 Tage lang in 10 ml komplettem DMEM inkubiert. Der Mediumüberstand wurde dann bei
4°C in einem SS-34 Rotor (Sovall Instruments) in verschliessbaren Falcon-Tubes 15 min lang
mit 6000 U/min zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile zu entfernen. Der Überstand wurde
dann in neue Plastikröhrchen (10 ml Inhalt; Sorvall Instruments, Katalog Nr. 03699) überführt
und eventuell enthaltene Viruspartikel in einem Ausschwing-Rotor (TH641, Sorvall
Instruments) bei 100'000 g in einer Ultrazentrifuge (OTD Combi, Sorvall Instruments) für 10
5. Material und Methoden 81
min pelletiert. Da retrovirale, reverse Transkriptase Digoxigenin-gekoppeltes dUTP in DNA
einbaut, konnte deren Aktivität durch den Nachweis des Digoxigenin durch spezifische
Antikörper nachgewiesen werden. Es wurde dazu das Kit von Böhringer verwendet (Katalog
Nr. 1 468 120).
5.6.4. Charakterisierung der B-mix und D4 Zellen
B-mix K-44/6 Zellen (B-mix) entstammen einer embryonalen Rattenzelllinie mit fehlender
Adenosin-Deaminaseaktivität, die in vitro mit dem prager Stamm des „Rous Sarkoma Virus“
transformiert wurde (Svoboda et al., 1965). Diese grossen, epitheloiden Zellen bilden Tumore
in homologen Rattenstämmen und enthalten das Genom des Rous Sarcoma Virus. Aus B-mix
Zellen wurde durch kontinuierliche Konzentrationserhöhung der karzinostatischen Substanz
9-β-D-Arabinofuranosyladenin (AraA) mehrere AraA-resistente Subklon von B-mix Zellen
erhalten. Ein Klon (D4) war hoch resistenz gegen bis zu 400 µM AraA. Diese Zelllinie D4,
die keine Adenosin-Kinase- und Adenosin-Deaminaseaktivität mehr besitzt, wurde von Prof.
John C. Drach (Universität von Michigan, USA) für diese Studie zur Verfügung gestellt.
Durch die Defekte in den beiden Schlüsselenzymen des Adenosin-Stoffwechsels setzen die
D4 Zellen Adenosin frei.
5.7. Nachweis des BCL-2 Proteins
ADA-7bcl2 Zellen und ADA-7 Kontrollzellen wurden auf einer 48-Loch Petrischalen, jeweils
etwa 104 Zellen pro Lcoh, ausplattiert und über Nacht in je 500 µl komplettem DMEM
inkubiert. Am nächsten Tag wurden die adherenten Zellen mit –20°C kaltem Methanol
überschichtet und so während 10 min fixiert. Das Methanol wurde vorsichtig abgesaugt und
die Proben bei Raumtemperatur getrocknet. Danach wurden die Proben mit
Bcl-2-Antikörperlösung (1 : 40 in PBS verdünnte Anti-BCL-2-Oncoproteinlösung
(Boehringer Mannheim, Kat. #1624 989)) überschichtet und 1 h bei 30°C in einem Inkubator.
Danach wurden die Proben 3 x mit PBS gewaschen und anschliessend die Bcl-2-Antikörper
mit sekundären Antikörpern und Immunoperoxidasefärbung (Elite ABC Kit, Vector
Laboratoirs) nachgewiesen.
82 5. Material und Methoden
5.8. Herstellung und Charakterisierung von Zellkapseln
BHK-AK2, BHK-WT, ADA-0, ADA-7bcl2, ADA-WT, D4 und B-mix Zellen wurden in
Polyethersulfonpolymer (PES Polymer) Hohlfaserkapseln (7 mm lang, 0.5 mm innerer
Durchmesser und 50 µm Wanddicke) wie beschrieben eingekapselt (Aebischer et al., 1996).
Die Kapseln wurden mit Ethylenoxyd sterilisiert und antiseptisch mit je 2 x 105 Zellen in
einer Kollagenmatrix gefüllt. Vor der Implantation wurden die Kapseln jeweils eine Woche
bei 37°C in komplettem DMEM inkubiert, um eine vollständige Anpassung an die
Kollagenmatrix und die Differenzierung der Zellen innerhalb der Kapsel zu gewährleisten.
Zur Adenosin-Bestimmung wurden einzelne ADA-0, ADA-7bcl2 und BHK-AK2 Kapseln
wurden in 1 ml QBSF-56 Medium (serumfreies Medium, Sigma) inkubiert um anschliessend
nach 1, 2, 4, 8 und 24 h 100 µl Aliquots der Mediumüberstände zu entnehmen. Die von den
Zellkapseln freigesetzte Adenosin-Konzentration konnte dann mit Hilfe einer Enzym-
gekoppelten Fluoreszenzmessung bestimmt werden (Kap. 5.3.).
5.9. Tiermodelle der Epilepsie
Alle Tierexperimente wurden in Übereinstimmung mit den schweizerischen
Tierschutzbestimmungen durchgeführt. Es herrschten bei der Haltung kontrollierten
Umweltbedingungen (Raumtemperatur, 23 – 25°C; Luftfeuchtigkeit, 50 – 60 %; 12 stündiger
hell - dunkel Zyklus). Standard Rattenfutter und Trinkwasser wurden in unbegrenzten
Mengen zur Verfügung gestellt und die Gehege zwei Mal wöchentlich ausgemistet.
5.9.1. Ratten mit genetisch vererbter audiogener Epilepsie (GEPR-9)
Bei den GEPR-9 Ratten („genetically epilepsy prone rats“; ein Inzuchtstamm, abstammend
von Sprague-Dawley Ratten; Dailey et al., 1989), handelt es sich um ein Modell für primär
generalisierte epileptische Anfälle, welche durch audiogene Reize ausgelöst werden können.
Den Ratten wurden audiogene Stimuli in einem Kunststoffzylinder (40 cm Durchmesser)
verabreicht, der in einer schalldicht verschliessbaren und mit Schaumstoff gepolsterten Kiste
stand (50 cm Höhe, Breite und Tiefe). Ein akustischer Stimulus hat jeweils eine Intensität von
120 dB, war aus einer Frequezmischung von 12 - 16 kHz zusammengesetzt und dauerte 30 s.
Für die folgenden Versuche wurden nur solche Ratten verwendet, welche auf einen Stimulus
5. Material und Methoden 83
jedesmal spontan mit einem maximalen epileptischen Anfall der Stärke 9 auf der audiogenen
Anfallsskala (De Sarro et al., 1996) antworteten. Diesen GEPR-9, an denen später die
antikonvulsiven Substanzen getestet werden sollten, wurde zunächst das für diese Substanzen
verwendete Lösungsmittel 10 % Polyethylenglycol 400 / 0.9 % NaCl (1 ml/kg
Körpergewicht, i.p.) verabreicht, dann mit einem audiogenen Stimulus auf die Anfallsstärke
getestet und diese Messergebnisse als Nullwerte zur Kontrolle verwendet. Dann wurden
Adenosin-A1- und Adenosin-A2A-Rezeptor Agonisten CCPA (3 mg/kg Körpergewicht) und
CPCA (10 mg/kg Körpergewicht), sowie Phenytoin (60 mg/kg Körpergewicht) 10 – 16
Wochen alten, 200 – 350 g schweren Ratten intraperitoneal injiziert. Eine Stunde nach der
Injektion, wurde ein audiogener Stimulus verabreicht, die Anfallsstärke durch einen
ganzzahligen Wert von 0 – 9 auf der audiogene Anfallsskala quantifiziert und somit der
antikonvulsive Effekt gemessen. Dabei bedeutet eine Anfallsstärke 0 keinen Anfall und die
Anfallsstärken von 1 – 9 sind wie folgt definiert: 1 = Wildes Herumrennen; 2 = Zwei Phasen
wilden Herumrennens gefolgt von einer klonischen Konvulsion (Klonus der vorderen und
hinteren Extremitäten, Kopf, Pinnae, Vibrissae und Schwanz); 3 = Eine Phase wilden
Herumrennens gefolgt von einer klonischen Konvulsion (Klonus der vorderen und hinteren
Extremitäten, Kopf, Pinnae, Vibrissae und Schwanz); 4 = Zwei Phasen wilden Herumrennens
gefolgt von einem Tonus des Nackens und Oberkörpers sowie einem Klonus der
Extremitäten; 5 = Eine Phase wilden Herumrennens gefolgt von einem Tonus des Nackens
und Oberkörpers sowie einem Klonus der Extremitäten; 6 = Zwei Phasen wilden
Herumrennens gefolgt von einer nahezu vollständigen tonischen Streckung des Körpers,
jedoch ohne Hinterpfoten; 7 = Eine Phase wilden Herumrennens gefolgt von einer nahezu
vollständigen tonischen Streckung des Körpers, jedoch ohne Hinterpfoten; 8 = Zwei Phasen
wilden Herumrennens gefolgt von einer vollständigen tonischen Streckung des Körpers; 9 =
Eine Phase wilden Herumrennens gefolgt von einer vollständigen tonischen Streckung des
Körpers.
5.9.2. Kindling-Modell der Ratte
Männliche OFA (Oncins France Stamm A) Ratten (Labor für Labortierkunde, Universität
Zürich) wurden für das Kindling im Hippocampus und für die anschliessende Transplantation
von Adenosin freisetzenden Zellen verwendet. Tiere mit einem Körpergewicht von 200 – 250
g wurden zuerst 1 Woche lang an die neue Umgebung und an den Experimentator gewöhnt.
Für die Operation wurden die nun ca. 300 g schweren Ratten mit Pentobarbital (50 mg/kg i.p.)
84 5. Material und Methoden
betäubt und in einen stereotaktischen Rahmen der Firma „Kopf“ eingespannt. Dann wurden
bipolare, isolierte, rostfreie Elektroden (0.2 mm Durchmesser; Bilaney Consultants,
Düsseldorf, Deutschland) bilateral in die Hippocampi implantiert und zusammen mit dem
Elektroden-verbindungsstecker durch Acrylat aus der Zahntechnik befestigt. Die Koordinaten
zur korrekten Positionierung einer Hypocampuselektrode waren: 5.0 mm caudal zum Bregma,
4.8 mm lateral zur Mittellinie und 7.3 mm ventral zur Dura (Zahnhalter bei 0.0 mm). Eine
Woche nach der Implantation wurden die Tiere unilateral bis zu 12 Mal täglich, 6 Mal am
Vormittag und 6 Mal am Nachmittag, mit einem Grass S-88 Stimulusgenerator stimuliert (1
ms rechteckswellen Pulse von 50 V bei einer Frequenz von 10 Hz und 10 s Dauer, 5 min
Intervalle zwischen den Stimulationen). Die Stimulationen wurden bis maximal 12 Tage lang
fortgeführt und nur diejenigen Tiere weiterverwendet, die in dieser Zeitspanne an zwei
aufeinanderfolgenden Tagen spontan mit einem Anfallsgrad 5 auf die erste elektrische
Stimulation reagierten. Die Stromstärke wurde so angepasst, dass sie genau über dem
Schwellenwert zur Auslösung von epileptiformer Aktivität lag (Afterdischarges und/oder wet
dog shakes). Das Elektroencephalogramm (EEG) wurde jeweils 1 min vor bis 5 min nach der
elektrischen Stimulation mit der „Human Scoring Registration Software“ Einheit (B.
Geehring, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Univrsität Zürich) aufgezeichnet. Die
Anfälle wurden nach dem beobachtbaren epileptischen Verhalten der Ratten nach der Racine-
Skala klassifiziert (Racine, 1978). Grad 0: Anhalten, „wet dog“ Schütteln; Grade 1:
Zuckungen im Gesicht; Grad 2: Kaubewegungen, Kopfnicken; Grade 3: Klonus der vorderen
Extremitäten; Grade 4: Aufrichten auf die Hinterbeine; Grad 5: Aufrichten auf die
Hinterbeine, Verlust des Gleichgewichtes und Fallen auf den Rücken.
5.10. Einkapselung und anschliessende Implantation von Zellen
Kapseln mit Adenosin-freisetzenden Zellen wurden vollständig gekindelten Tieren in den
lateralen Hirnventrikel der stimulierten Seite transplantiert. Die Ratten wurden für diese
zweite Operation wiederum mit Pentobarbital (50 mg/kg i.p.) betäubt und in einen
stereotaktischen Rahmen der Firma „Kopf“ eingespannt. Die Koordinaten zur Platzierung
einer Zellkapsel in den lateralen Hirnventrikel waren: 1.8 mm caudal zum Bregma, 1.4 mm
lateral zur Mittellinie und 8.5 mm ventral zur Dura (Zahnhalter bei –8.3 mm). Die Zellkapsel
wurde mit einem Kapselapplikator durch die vorgefertigte Führungsöffnung an die angebenen
Koordinaten gebracht (Abb. 5.1). Wegen der Konstruktion der Elektrodenhalterung war es
5. Material und Methoden 85
danach nicht mehr möglich, die implantierten Kapseln wieder zu entfernen und durch neue zu
ersetzen.
Abb. 5.1: Schematische Darstellung der Zellkapselimplantation
(a) Schematischer Rattenkopf von oben mit Elektrodenhalterung und
Führungsöffnung zur Einführung des Kapselapplikators. Der Sagittalschnitt
durch die Führungsöffnung (gestrichelte Linie) ist in den Abbildungen b – e
gezeigt. (b) Halterung und die mit Wachs und einer Schraube verschlossene
Führungsöffnung vor der Implantation. (c) Nach Entfernung des Wachses und
der Schraube wird der Applikator mit der zu implantierenden Zellkapsel
eingeführt. (d) Die Zellkapsel wird mit Hilfe des Applikators auf die richtigen
Koordinaten gebracht. (e) Der Schaft des Applikators wird zurückgezogen und
die Kapsel freigesetzt.
86 5. Material und Methoden
5.11. Histologie von Zellkapseln
24 Tage nach der Kapselimplantation wurden die Tiere getötet und die Kapseln entnommen.
Die entfernten Kapseln wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in PBS gewaschen und dann
in je 1 ml 70 %, 80 %, 95 % und 100 % Ethanol für jeweils 1 h entwässert. Danach wurden
die Kapseln mit einem kommerziellen Glycol-Methacrylat Kit (Sigma) eingebettet. Das
Glycol-Methacrylat wurde bei 60°C für 5 Tage vollständig ausgehärtet und anschliessend
wurden 1.5 µm dicke Schnitte (Supercut Mikrotom 2065; Reichert) auf Mikroskopgläser
aufgetragen, mit 3 % Toluidinblaulösung gefärbt und bei 50°C für 10 min getrocknet.
Anschliessend wurde überflüssiges Toluidinblau mit Leitungswasser weggewaschen und die
Schnitte bei 50°C für 30 min getrocknet.
5.12. Quantifizierung von Zellen in Kapselschnitten
Die Anzahl lebender Zellen in den Kapseln wurde mit Hilfe toluidinblau gefärbter
Kapselschnitte auf einer Fläche von 400 x 400 µm visuell unter einem Mikroskop mit
400- facher Vergrösserung bestimmt. 5 Ausschnitte wurden pro Zeitpunkt gewählt und der
Mittelwert gebildet. Die Fehler wurden als ± Standardabweichung berechnet. Die
Zellenanzahl in den Kapseln zum Zeitpunkt der Implantation wurde als 100 % Wert
festgesetzt. Zellzahlen zu späteren Zeitpunkten sind als relative Werte im Bezug auf diesen
100 % Wert zu verstehen.
5.13. Histologie von Hirnschnitten
Anesthesierte Ratten wurden dekapitiert und das Gehirn sofort mit zerkleinertem Trockeneis
überhäuft. Anschliessend wurden die Gehirne bei –80°C eingefroren. Mit einem Mikrotom
(2800 Frigocut E; Reichert-Jung) bei –20°C wurden 25 µm dicke Hirnschnitte angefertigt und
auf Objektträger übertragen. Die Hirnschnitte auf den Objektträgern wurden in mit PBS
gefüllten Glasgefässen gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd in PBS 30 min fixiert.
Danach wurden die Schnitte 2 Mal mit PBS gespühlt und dann folgender Lösungsmittel
ausgesetzt: 2 Mal 20 min in Xylen, 2 Mal 20 min in 100 % Alkohol, 10 min in 70 % Alkohol
und 5 min in destilliertem H2O. Dann wurden die Hirnschnitte auf den Objektträgern durch
5. Material und Methoden 87
0.5 %-iger Cresyl Violet Lösung (Sigma) gefärbt. Durch Inkubation der Schnitte in 70 %
Alkohol mit wenig Essigsäure kann die gewünschte Farbintensität eingestellt werden. Ist die
gewünschte Farbe erreicht, werden die Schnitte wieder 2 Mal 5 min 100 % Alkohol und
2 Mal 5 min in Xylen gegeben und anschliessend mit einem Deckglas versehen. Die korrekte
Lokalisation der Kapsel und das die Kapsel umgebende Gewebe kann daraufhin
mikroskopisch untersucht werden.
5.14. Verhaltensanalyse der Ratten aus dem Kindling-Modell
Die folgenden Parameter des Tierverhaltens wurden untersucht: Zeichen für Sedation oder
Ataxie, spontane und explorative Aktivität und Sozialverhalten gegenüber Käfiggefährten.
Vollständig gekindelte Ratten, denen entweder Adenosin-freisetzende Zellkapseln oder
Kontrollkapseln in den lateralen Hinrventrikel implantiert worden waren, wurden jeden Tag
eine Stunde lang beobachtet, um das spontane Verhalten und die Bewegungs- und
Erkundungsaktivität zu analysieren. Das soziale Verhalten wurde auf fehlendes gegenseitiges
Putzen oder Aggressivität gegenüber Käfiggefährten geprüft. In all diesen Beobachtungen
wurden keine Unterschiede zwischen dem Verhalten von Ratten mit implantierten Adenosin
freisetzenden Kapseln und Ratten mit Kontrollkapseln gefunden.
88 5. Material und Methoden
5.15. Materialliste
5.15.1. Chemikalien
Adenosin Sigma (Buchs, SG)
Agarose Life Technologies (Basel, BL)
Ammoniumchlorid Sigma (Buchs, SG)
AMP-Sepharose Pharmacia Biotech AG (Dübendorf, CH)
Ampicillin Sigma (Buchs, SG)
ATP Sigma (Buchs, SG)
[γ-33P] dATP (3000Ci/mmol) 10µCi/µl NEN DuPont (Regensdorf, CH)
Blocking Reagent BioRad
Bromphenolblau Sigma (Buchs, SG)
CCPA Sigma (Buchs, SG)
CPCA Sigma (Buchs, SG)
DPCPX RBI (Rahn AG; Zürich, ZH)
EDTA Sigma (Buchs, SG)
EHNA Sigma (Buchs, SG)
Ethanol Merck (Dietikon, ZH)
Ethidiumbromid Sigma (Buchs, SG)
FCS Life Technologies (Basel, BL)
Formamid Sigma (Buchs, SG)
Glycin Sigma (Buchs, SG)
GTP (Lithium Salz) Sigma (Buchs, SG)
H2O2 (30%) Sigma (Buchs, SG)
HCl (32%) Merck (Dietikon, ZH)
Hexadimethrinbromid Sigma (Buchs, SG)
Isoamylalkohol Dr. Bender + Dr. Holbein AG (Poole, UK)
Isopropanol Merck (Dietikon, ZH)
K3Fe(CN)6 Sigma (Buchs, SG)
K4Fe(CN)6 Sigma (Buchs, SG)
Kanamycin Life Technologies (Basel, BL)
Kresyl Violet Acetat Sigma (Buchs, SG)
Natriumacetat Sigma (Buchs, SG)
Natriumchlorid Sigma (Buchs, SG)
5. Material und Methoden 89
Natriumcitrat Sigma (Buchs, SG)
Natriumhydroxid Merck (Dietikon, ZH)
Paraformaldehyd Sigma (Buchs, SG)
Penicillin Life Technologies (Basel, BL)
Phenytoin Sigma (Buchs, SG)
Phosphoenolpyruvat Sigma (Buchs, SG)
Polyethylenglycol 400 Sigma (Buchs, SG)
SDS Calbiochem (Juro Supply AG, Luzern, LU)
Streptomycin Life Technologies (Basel, BL)
Tris Base Calbiochem (Juro Supply AG, Luzern, LU)
Triton X-100 Sigma (Buchs, SG)
Tween-20 Sigma (Buchs, SG)
Xylen Sigma (Buchs, SG)
5.15.2. Antikörper
Anti-bcl-2-Oncoprotein, menschlich Boehringer Mannheim, #1624989
Polyklonales Antiserum gegen ADK rabbit O1D3-C3A1; D. Benke
5.15.3. Enzyme
Restriktionsendonukleasen Boehringer Mannheim, Pharmacia
Restriktionsendonukleasepuffer (10x) Boehringer Mannheim, Pharmacia
One-Phor-All-Puffer Pharmacia Biotech AG (Dübendorf, CH)
T4-DNA-Ligase Life Technologies (Basel, BL)
T4-DNA-Ligase Puffer (5x) Life Technologies (Basel, BL)
RNaseA (Ribonuclease A) Boehringer Mannheim (Rotkreuz, CH)
Proteinase K Life Technologies (Basel, BL)
Myokinase Boehringer Mannheim (Rotkreuz, CH)
Pyruvatkinase Boehringer Mannheim (Rotkreuz, CH)
TAQ Polymerase (+ Puffer) Life Technologies (Basel, BL)
PfuTurbo DNA Polymerase Stratagene (Amsterdam, NL)
90 5. Material und Methoden
5.15.4. Lösungen und Medien
20x SSC 3 M NaCl, 0.3 M Na-Citrat, pH 7.0
50x TAE 2 M Tris/Acetat, 0.4 M EDTA
ADK Extraktionslösung 30 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl,
10 % Glycerin
Blockierungslösung für Western-Blot 5 % Blocking Reagent (Bio Rad)
gelöst in TBST
Blotpuffer für Western-Blot 39 mM Glycin, 48 mM Tris und 0.04 % SDS
DMEM Life Technologies (Basel, BL)
EDTA 0.5 M Stocklösung, pH 8.0
IPTG 200 mg/ml Stocklösung
Pharmacia Biotech AG (Dübendorf, CH)
LB-Medium (Luria Broth Base) Gelöst in H2O (bidest.).
Life Technologies (Basel, BL)
NaCl 5 M Stocklösung
NaOH 10 N Stocklösung
PBS Pro Liter zwei Tabletten gelöst in H2O
(bidest.). Life Technologies (Basel, BL)
Probenpuffer für Western-Blot 125 mM Tris-HCl pH6.8, 20 % Glycin,
0.002 % Bromphenolblau, 4 % SDS,
10 % β-Mercaptoethanol
QBSF-56 Sigma (Buchs, SG)
5. Material und Methoden 91
TBST 10 mM Tris, 0.15 M NaCl,
0.05 % Tween-20
X-Gal 20 mg/ml Stocklösung in Formamid
Pharmacia Biotech AG (Dübendorf, CH)
5.15.5. Bakterien, Zellen und Tiere
ADA+/- Mäuse Wakamiya et al., 1995
ADA-0 Zellen ADA-/- Fibroblastenzellen
ADA-7bcl2 ADA-/- Fibroblastenzellen mit BCL-2 Expression
BHK-Zellen BHK-21 (C-13); ATCC #CCl-10
BHK-AK2 Zellen ADK defiziente BHK-Zellen
B-mix K-44/6; D4-Zellen Prof. John Drach, University of Michigan
(Ann Arbor, USA). ADA bzw. ADA / ADK
defiziente Zellinien.
ImmortomäuseTM Jat et al., 1991
OFA-Ratten (männlich) Institut für Labortierkunde
der Universität ZH
XL-1-Blue Bakterien Stratagene (Amsterdam, NL)
92 5. Material und Methoden
5.15.6. Allgemeines Material
ATP Biolumineszenz Kit Sigma (Buchs, SG)
Digoxigenin-Nachweis Kit Boehringer Mannheim, # 1468120
DNA-Molekulargewichtsmarker Boehringer Mannheim (Rotkreuz, CH)
1kb-Leiter mit folgenden Fragmenten:
12200, 11200, 10200, 9160, 8140, 7130,
6100, 5100, 4072, 3054, 2036, 1635, 1018,
506, 394, 433, 298, 220, 200
RNA Isolationskit Sigma (Buchs, SG)
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen AG (Basel, CH)
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen AG (Basel, CH)
QIAquick Säulen Qiagen AG (Basel, CH)
QIAGEN Plasmid Midi Kit Qiagen AG (Basel, CH)
Glycol-Methacrylat Einbett Kit Sigma (Buchs, SG)
Hybond N-Membran Amersham (Zürich, ZH)
Sterilfilter (0.45µm, pyrogen frei) Schleicher & Schuell (Riehen, BS)
Western-Blot Chemoluminescence Reagent Plus: Du Pont NEN
X-Omat™ AR-Film Kodak SA (Lausann, VD)
Biomax™ MR-Film Kodak SA (Lausann, VD)
X-ray fixer AL4 Kodak SA (Lausann, VD)
X-ray developer LX24 Kodak SA (Lausann, VD)
M1-Embedding Matrix Lipshaw
Programm Human Scoring by B.Geering (Institut für Pharmakologie der
Universität Zürich)
5.15.7. Operationsinstrumente und Kindlingapparatur
Nembutal® Kantonsapotheke ZH
(50mg/ml Pentobarbital Sodium)
Stainless Steel Electrodes E363/2 Bilaney Consultants GmbH
Durchmesser 0.20mm, Länge 25mm (Düsseldorf, D)
(.008") (Kindlingelektroden)
5. Material und Methoden 93
Drill Bit use with 0-80 screws Bilaney Consultants GmbH
(Fixierschrauben) (Düsseldorf, D)
Drill holder Bilaney Consultants GmbH
(Bohrer für Fixierschrauben) (Düsseldorf, D)
Screw holding screwdriver Bilaney Consultants GmbH
(Schraubendreher für Fixierschrauben) (Düsseldorf, D)
Plastic Pedestal MS363 Bilaney Consultants GmbH
(Anschluss-Stecker) (Düsseldorf, D)
Dust cap 363DC Bilaney Consultants GmbH
(Kappe für Anschluss-Stecker) (Düsseldorf, D)
Small animal stereotaxic instrument David Kopf® Instruments (California, USA)
Model 900 (Stereotaktischer Rahmen)
Paladur® (Zahnzement-Lösungsmittel) Heraeus Kulzer GmbH (Wehrheim, D)
Candulor® Physioset Polymer Min.25 Candulor AG(Zürich, ZH)
(Zahnzement)
Miralene® 45cm blau USP 5/0 Braun-SS AG (Emmenbrücke, CH)
gammasterilisiert (Sterilfaden)
Braunol 200 Braun-SS AG (Emmenbrücke, CH)
Miolectric Typ 4810/N (Bohrer) und Setelec® (France), Indulab AG (Gams, CH)
Typ NG2-S (Netzgerät)
Servotome Classic Systeme
Grass S88 Stimulator + Grass SI45 Stimulus-Isolations Unit (Kindlingapparatur)
Ausserdem: Rasierapparat, Scalpelle, Scheren, Pinzetten, Arterienklemmen
94 5. Material und Methoden
5.15.8. Geräte
Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 DNA-Sequenzanalyse
ABI Prism 310 Genetic Analyzer DNA-Sequenzanalyse
BioRad GenePulser™ Elektroporationen
BioRad Pulse Controller Elektroporationen
Liquid Scintillation Analyzer 2500 TR Packard Radioaktivitätsbestimmung
Agfa Curvix 60 Filmentwicklungen
Gelprint 200 Digital Graphic Printer UP-D860 E Gelphotographien
Heraeus Varifuge RF Zentrifugationen
DuPont RC5C Sorvall® instruments Zentrifugationen
Eppendorf Centrifuge 5417 C Zentrifugationen
SpeedVac Plus SC 110 A Savant Trocknen von Nukleinsäuren
Merck JuLaBo 5a (Wasserbad)
OTD Cmbi, Sorvall Instruments Ultrazentrifuge
2800 Frigocut, Reichert-Jung Organschnitte
Vortex Genie 2 (SI) (Vortex)
Merck Heidolpf MR3001 (Heizplatte und Magnetrührer)
BioRad Mini Protean II Western-Blot Minigel
BioRad Model 200/2.0 Power Supply DNA/RNA-Gelelektrophorese
BioRad Gelkammern DNA Sub cell™ DNA/RNA-Gelelektrophorese
BioRad Trans Blot Western-Blot
6. Referenzen 95
6. Referenzen
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7. Abkürzungen 107
7. Abkürzungen
ACSF Künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (artificial cerebrospinal fluid)
ADA Adenosin Deaminase
ADA-0 ADA-/-, tsA58+/- Fibroblastenzellinie
ADA-7bcl2 Immortalisierte ADA-/- Fibroblastenzellinie mit BCL-2 Expression
ADK Adenosin Kinase
ADP Adenosin-5‘-diphosphat
AED Antiepileptisches Medikament (anti epileptic drug)
ALS Amyotrophe Lateralsklerose
AMP Adenosin-5‘-monophosphat
AraA 9-β-D-Arabinofuranosyladenin
AraH 9-β-D-Arabinofuranosylhypoxanthin
ATP Adenosin-5‘-triphosphat
BHK Baby Hamster Kidney Zellen (BHK-21 (C-13); ATCC #CCl-10)
BHK-AK2 ADK defiziente BHK-Zelllinie
B-mix B-mix K-44/6; ADA defiziente, immortalisierte Fibroblastenzellinie
CCPA 2-Chloro-N6-cyclopentyladenosin
CNTF Ciliary neurotrophic factor
CPCA 5‘-(N-Cyclopropyl)-carboxamidoadenosin
CPS Komplexe partielle Anfälle
D4 ADA und ADK defiziente, aus B-mix Zellen abstammende Zellinie
DMEM Dulbecos Modified Eagle Medium
DMSO Dimethyl Sulfoxid
DPCPX 8-cyclopentyl-1,3-dipropylxanthin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EEG Elektroencephalogramm
EHNA Erythro-9-[3-(2-hydroxynonyl)]adenin
EMS Ethylmethansulfonat
FCS Fötales Kälberserum
GABA γ-Aminobuttersäure
HS Hippokampale Sklerose / Horse Serum (Pferdeserum)
i.p. Intraperitoneal
108 7. Abkürzungen
i.v. Intravenös
IEG „Immediate Early Genes“, früh exprimierte Gene
IFN-γ Interferon γ
IMP Inosin-5‘-monophosphat
IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactosid
kD Kilo Dalton
LTR Long Terminal Repeats
Mo-MLV Moloney Murine Leukemia Virus
OFA Oncins France Stamm A
PBS Phosphate-buffered saline (pH 7.4)
PCR Polymerase Chain Raction
REM Rapid Eye Movement (während des Schlafes)
SAH S-Adenosyl-L-homocystein
SSK Steady-State-Konzentration
TLE Temporallappen-Epilepsie
TU Transfecting Units (Virenpartikel)
Tween-20 Polyoxyethylensorbitan
WT wild type
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactosid
Curriculum vitae 109
Curriculum vitae
Name: Alexander HuberGeburtstag: 9.1.1973
Heimatort / Nationalität: Winterthur / SchweizAnschrift: Palmstr. 28
8400 WinterthurTelefon / Fax Privat: 052 246 12 00
E-Mail: [email protected]: http://www.alexhuber.ch
AUSBILDUNG
seit 9/‘98 Doktorarbeit Dr.sc.nat. Entwicklung Adenosin-freisetzender Zellsysteme für dieex vivo Gentherapie fokaler Epilepsien
Fachrichtung: NeurobiologieInstitut: Pharmakologisches Institut Uni/ETH
Ort: Zürich
10/‘98 - 10/‘99 Introductory course Obl. Kurs mit Prüfung für neue Doktorandenin neuroscince
Notendurchschnitt: 5.5 (Zweitbester des Jahrganges)Institut: Neuro Science Center Zürich
10/‘92 - 4/‘98 Studium BiochemieAbschluss: dipl. sc. nat. ETH
Fachrichtung: BiotechnologieNotendurchschnitt: 5.1
Institut: Eidgenössische Technische Hochschule ETHOrt: Zürich
1986 - 1992 MittelschuleMatura Typus: B
Institut: Kantonsschule RychenbergOrt: Winterthur
WEITERBILDUNG
Okt. – Nov. ‘01 Programmierung: Java 2.0Institut: Volkshochschule des Kantons Zürich
2. – 6. Juli ‘01 Bioinformatik: Training KursFirma: GeneBio, Geneva Bioinformatics SA
Juni ‘00 Internet: Webmaster und HTML ProgrammierungFirma: Level School, IBM Zürich
110 Curriculum vitae
Publikationen
Nienaber, A., Huber, A., Göttfert, M., Hennecke, H. und Fischer, H.M. (2000). Three New
NifA-Regulated Genes in the Bradyrhizobium japonicum symbiotic Gene Region Discovered
by Competitive DNA-RNA Hybridization.
J Bacteriol, 182, 1472-1480.
Huber, A., Padrun, V., Déglon, N., Aebischer, P., Möhler, H. und Boison, D. (2001). Grafts of
adenosine-releasing cells suppress seizures in kindling epilepsy.
Proc Natl Acad Sci USA, 98, 7611-7616.
Boison, D., Huber, A., Padrun, V., Déglon, N., Aebischer, P. und Möhler, H. (2001). Seizure
suppression by adenosine releasing cells is independent of the frequency of brain stimulation.
(submitted to Epilepsia)
Huber, A., Möhler, H. und Boison, D. Seizure suppression by adenosine A1 receptor
activation in a model of audiogenic brainstem epilepsy.
(in preparation)
Abstracts
Huber, A., Padrun, V, Aebischer, P., Möhler, H. und Boison, D. (2001). Grafts of adenosine-
releasing cells suppress seizures in kindling epilepsy. The Neuroscience at the Turn of the
Century. Proceedings of the 4th Meeting of the German Neuroscience Society, 1, 215.
Huber, A., Padrun, V., Aebischer, P., Möhler, H. und Boison, D. (2001). Grafts of adenosine-
releasing cells suppress seizures in kindling epilepsy. ZNZ Symposium 2001 - Neuroscience
Center Zurich, 54 – 55. Poster and short plenary presentation.
Danksagung 111
Danksagung
Vielen Dank all den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern, die während meiner Doktorarbeit am
Institut für Pharmakologie und Toxikologie arbeiteten und mich durch ihre Hilfsbereitschaft
und Kameradschaft unterstützt und motiviert haben. Es war eine angenehme Zeit in einem
sehr guten Team!
Besonderer Dank gilt jedoch...
Dr. Detlev Boison für seine hervorragende Arbeit, mich durch die Freuden und Leiden des
wissenschaftlichen Alltags zu führen, die mir die nötige wissenschaftliche Reife vermittelte.
Er hat es wie kein anderer verstanden, mich zum rechten Zeitpunkt entweder aufzumuntern
oder zu ermahnen. Seine ausgeglichene Art, die hilfreichen Ratschläge und interessanten
Diskussionen werde ich nie vergessen. Vielen Dank für die freundschaftliche
Zusammenarbeit. Einen besseren Chef kann man sich nicht wünschen!
Prof. Dr. Hanns Möhler für die ausgesprochen grosszügige Unterstützung meiner Arbeit.
Wegen der einzigartigen Infrastruktur am Institut für Pharmakologie und Toxikologie war das
Arbeiten und verwirklichen von Ideen eine grosse Freude. Herzlichen Dank auch für das in
mich gesetzte Vertrauen.
Louis Scheurer für seine äusserst wertvolle Beratung und Hilfe bei alltäglichen
Laborarbeiten der Molekularbiologie. Seine fachkundige Betreuung ermöglichte mir ein
ausserordentlich effizientes Arbeiten.
Silvia Balsiger, Cornelia Schwerdel, Valérie Zumsteg, Panos Fakitsas und Martin
Güttinger für die freundschaftliche, entspannte Atmosphäre im Labor J74 und Umgebung.
Meinen Eltern für die moralische und finanzielle Unterstützung, wodurch mein Leben neben
der Doktorarbeit lebenswerter wurde.
Meiner Lebenspartnerin Esther für ihre Liebe, Geduld und Unterstützung, auch wenn es
einmal nicht so gut lief.