estudo da síntese de carbon dots via carbonização hidrotérmica...

i

MATEUS BATISTA SIMÔES

ESTUDO DA SÍNTESE DE CARBON DOTS VIA CARBONIZAÇÃO

HIDROTÉRMICA E AVALIAÇÃO FRENTE A BIOSSISTEMAS

CAMPINAS

2014

iii

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUÍMICA

MATEUS BATISTA SIMÕES



ORIENTADOR: PROF. DR. OSWALDO LUIZ ALVES

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA

AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA

NA ÁREA DE QUÍMICA INORGÂNICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA

POR MATEUS BATISTA SIMÕES, E ORIENTADA PELO PROF.DR. OSWALDO LUIZ ALVES.

_______________________

Assinatura do Orientador

CAMPINAS

2014

iv

Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas

Biblioteca do Instituto de Química Simone Lucas Gonçalves de Oliveira - CRB 8/8144

Si51e

Simões, Mateus Batista, 1990-

SimEstudo da síntese de carbon dots via carbonização hidrotérmica e avaliação

frente a biossistemas / Mateus Batista Simões. – Campinas, SP : [s.n.], 2014.

SimOrientador: Oswaldo Luiz Alves. SimDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de

Química.

Sim1. Nanoestruturas de carbono. 2. Fluorescência. 3. Nanotoxicologia. I. Alves,

Oswaldo Luiz. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Química. III.

Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Study on the synthesis of carbon dots via hydrothermal

carbonization and evaluation towards biosystems Palavras-chave em inglês: Carbon nanostructures

Fluorescence

Nanotoxicology Área de concentração: Química Inorgânica Titulação: Mestre em Química na área de Química Inorgânica Banca examinadora: Oswaldo Luiz Alves [Orientador]

Adley Forti Rubira Juliano Alves Bonacin Data de defesa: 17-07-2014 Programa de Pós-Graduação: Química

vii

Dedico esta dissertação aos meus pais,

José Carlos e Isabel, pelo seu

incondicional amor, incentivo e

compreensão! Esta conquista é nossa!

ix

“Eu sei que o meu trabalho é uma gota no oceano, mas sem ele, o

oceano seria menor.”

Madre Teresa de Calcutá

xi

Agradecimentos

Primeiramente agradeço a Deus pelas oportunidades que recebi durante toda

minha vida e hoje me colocaram em uma das melhores universidades do

Brasil, a UNICAMP, tendo a oportunidade de trabalhar com pessoas de

imenso talento e competência.

Agradeço os sacrifícios que meus pais se propuseram e ainda se propõe a

enfrentar com o objetivo de me ajudar a conquistar meus sonhos e toda a

paciência e incentivo ao longo desta jornada, que por vezes é incerta e

tenebrosa.

Agradeço ao Professor Oswaldo a possibilidade de desenvolver este trabalho e

conviver em um ambiente cientificamente rico. Levarei comigo exemplos do

LQES por toda a vida.

Giulianna, sua presença me completa e me faz querer ser um homem melhor a

cada dia! Sua compreensão e respeito sobre as minhas escolhas, seu apoio e

suporte foram fundamentais para a conclusão desta dissertação. Amo você

incondicionalmente!

Agradeço aos meus irmãos, Fernando e Simone, por todos os momentos que

compartilhamos. Como caçula, os exemplos deles ajudaram a moldar o que eu

sou hoje.

Agradeço os amigos de Campinas e LQES, em especial a Ana Carolina, por

todas as discussões científicas e por fazer os momentos em Campinas mais

agradáveis.

xii

Agradeço os amigos que ficaram em São Carlos, que mesmo com a distância

nunca se esqueceram de mim e sempre se preocuparam comigo. Desejo a

todos vocês – Anderson, Elias, Isaias, Giorgio, Glauco, Lucas Quintal, Lucas

Sponton, Luis Felipe, Michelle, Natan, Pedro Barrenha, Pedro Martins,

Ricardo – sucesso e felicidade sempre!

Agradeço ao Roberto pela disponibilidade e ajuda nas análises de

internalização celular realizadas na UNIFESP.

Agradeço a Marilia Horn e Virginia, estas duas pessoas incríveis, que foram

responsáveis pelo meu ingresso na pesquisa e me deram uma base muito boa

para desenvolver este trabalho! A competência e sabedoria delas me causa

admiração!

Agradeço à FAPESP pela bolsa concedida e todo o suporte financeiro para o

desenvolvimento deste trabalho (processo 2012/22612-5).

Por fim, agradeço todos os funcionários do Instituto de Química e da

UNICAMP por suas contribuições para a execução deste trabalho.

xiii

Súmula Curricular

Dados Pessoais:

Nome: Mateus Batista Simões

E-mail: [email protected]

Formação Acadêmica:

Mestrado em Química Inorgânica (Agosto/2012 – Julho/2014)

Local: Laboratório de Química do Estado Sólido (LQES) – Instituto de

Química – Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) – Campinas/SP.

Título: “Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e

Avaliação Frente à Biossistemas”

Orientador: Prof. Dr. Oswaldo Luiz Alves

Bacharelado em Química com Ênfase Tecnológica (Fevereiro/2008 –

Julho/2012)

Local: Instituto de Química de São Carlos (IQSC) – Universidade de São

Paulo (USP), São Carlos/SP.

Produção Bibliográfica:

Capítulo de Livro:

1. ALVES, O. L.; MORAES, A. C. M.; SIMÕES, M. B.; FONSECA, L. C.;

NASCIMENTO, R. O.; HOLTZ, R. D.; FARIA, A. F. Nanomaterials. In:

DURÁN, N.; GUTERRES, S. S.; ALVES, O. L. (Eds.). Nanotoxicology:

Materials, Methodologies and Assessments. Nova Iorque: Springer, 2014, p. 1

– 29.

xiv

2. Aceito para publicação: SIMÕES, M. B.; HORN, M. M.; MARTINS, V. C.

A.; PLEPIS, A. M. G. Influence of Starch Oxidation in Drug Delivery

Behavior of Chitosan/Corn Starch Films. In: CAMPANA-FILHO, S. P. (Ed.)

Advances in Chitin Science – Volume XIV.

Resumos expandidos publicados em anais de congressos

1. SIMÕES, M. B.; HORN, M. M.; PLEPIS, A. M. G.; MARTINS, V. C. A. .

Chitosan/Starch Films as Controlled Drug Delivery System. In: 7th

International Symposium on Natural Polymers and Composites, 2010,

Gramado. CD-Rom do 7th International Symposium on Natural Polymers and

Composites, 2010., 2010.

Resumos publicados em anais de congressos

1. SIMÕES, M. B. ; HORN, M. M. ; PLEPIS, A. M. G. ; MARTINS, V. C. A.

. Comportamento Reológico de Blendas Quitosana/Amido/Ciprofloxacina:

Efeito do Poliol. In: 18º Simpósio Internacional de Iniciação Científica da

USP, 2010, São Paulo. Anais do 18º SIICUSP, 2010.

2. SIMÕES, M. B. ; PLEPIS, A. M. G. ; HORN, M. M. ; MARTINS, V. C. A.

. Géis de Quitosana/Amido/Ciprofloxacina: Efeito da Oxidação do Amido e

da Adição de Glicerol. In: 7º Encontro de Bioengenharia, 2010, São Carlos.

Cd-Rom do 7º Encobio, 2010.

3. HORN, M. M. ; SIMÕES, M. B. ; PLEPIS, A. M. G. ; MARTINS, V. C. A.

. Blends based on modified starch and chitosan: effect of ciprofloxacin

xv

addition in rheological properties and in drug delivery behaviour. In: Polychar

19 - World Forum on Advanced Materials, 2011, Kathmandu. Book of

Abstracts. Kathmandu: Tribhuvan University and the Nepal Polymer Institute,

2011. p. 195.

4. SIMÕES, M. B. ; HORN, M. M. ; PLEPIS, A. M. G. ; MARTINS, V. C. A.

. Influência da Oxidação do Amido em Filmes de Quitosana/Amido na

Liberação Controlada de Ciprofloxacina. In: 19º Simpósio Internacional de

Iniciação Científica da USP, 2011, São Carlos. Anais do 19º SIICUSP, 2011.

5. SIMÕES, M. B.; ALVES, O. L.; Synthesis of Carbon Dots by

Hydrothermal Carbonization of Glucose. In: 1st International Symposium on

Nanoparticles/Nanomaterials and Applications, 2014, Caparica. Proceedings

of the 1st International Symposium on Nanoparticles/Nanomaterials and

Applications. Caparica: Proteomass Scientific Society, 2014, p.413.

xvii

Resumo



Carbon dots foram obtidos por meio da carbonização hidrotérmica de

glicose e as condições de síntese foram otimizadas utilizando-se um

planejamento fatorial. Os carbon dots foram caracterizados por espectroscopia

na região do infravermelho, espectroscopia na região do ultravioleta-visível,

microscopia eletrônica de transmissão, além de ter seu perfil de fluorescência

estudado, sendo que o máximo de excitação ocorre na região do ultravioleta e

o máximo de emissão na região do azul. Testes hemolíticos foram realizados

com as nanopartículas que apresentaram maior rendimento quântico e

mostraram que não há indução de hemólise, demonstrando que o material tem

elevado potencial para aplicação in vivo. Carbon dots também foram

sintetizados adicionando-se um precursor contendo nitrogênio à glicose, e

conseguiu-se um aumento de 2,3 vezes no rendimento quântico dos carbon

dots, considerando a condição de síntese otimizada pelo planejamento fatorial

(rendimento quântico de 13,2%). O comprimento de onda de excitação e

emissão não foi modificado e o material também não apresentou efeito

hemolítico. Por fim, utilizando-se as condições ótimas de síntese, carbon dots

também foram obtidos por meio da carbonização hidrotérmica de pectina,

demonstrando que o método de síntese é robusto e válido para fontes de

carbono alternativas. Os carbon dots obtidos de pectina apresentam um

rendimento quântico de 3,6% e foram caracterizados pelas mesmas técnicas

utilizadas para os carbon dots de glicose.

Palavras chaves: nanoestruturas de carbono, fluorescência, nanotoxicologia

xix

Abstract

STUDY ON THE SYNTHESIS OF CARBON DOTS VIA

HYDROTHERMAL CARBONIZATION AND EVALUATION TOWARDS

BIOSYSTEMS

Carbon dots were obtained by hydrothermal carbonization of glucose

and the synthesis parameters were optimized by a factorial design of

experiments. The carbon dots were characterized by infrared spectroscopy,

ultraviolet-visible spectroscopy, transmission electron microscopy, beyond to

have its fluorescence profile studied, and it was observed that the maximum

excitation occurs at the ultraviolet range and the maximum emission at the

blue range of the spectrum. Hemolytic trials were performed with the

nanoparticles of highest quantum yield, and the results showed that no

hemolysis was provoked, demonstrating that he material have a raised

potential to in vivo applications. Carbon dots were also synthetized adding a

precursor containing nitrogen to the glucose and an increase of 2.3 times was

observed on the quantum yield, already taking into account the optimizes

synthesis condition by the factorial design (quantum yield of 13.2%). The

wavelength of excitation and emission was not modified and the material do

not showed hemolytic effect again. Lastly, with the optimized synthesis

parameters, carbon dots were also obtained by hydrothermal carbonization of

pectin, evidencing that the synthesis protocol is robust and effectual to

alternatives carbon sources. The carbon dots of pectin presented a quantum

yield of 3.6% and were characterized by the same techniques utilized to the

carbon dots of glucose.

Keywords: carbon nanostructures, fluorescence, nanotoxicology

xxi

Sumário

Lista de Tabelas .......................................................................................... xxiii

Lista de Figuras ............................................................................................ xxv

1 Introdução ...................................................................................................... 1

1.1 Carbon Dots .............................................................................................. 5

1.2 Sínteses Hidrotérmicas ............................................................................. 9

1.3 Relevância do Trabalho .......................................................................... 11

2 Objetivos....................................................................................................... 13

3 Procedimento Experimental ....................................................................... 15

3.1 Materiais ................................................................................................. 15

3.1.1 Reagentes .......................................................................................... 15

3.1.2 Equipamentos ................................................................................... 15

3.2 Métodos................................................................................................... 15

3.2.1 Planejamento fatorial para síntese de carbon dots ........................... 16

3.2.2 Purificação dos carbon dots ............................................................. 17

3.2.3 Caracterização dos carbon dots........................................................ 18

3.2.4 Aplicações Biológicas ...................................................................... 19

4 Resultados e Discussão ................................................................................ 23

4.1 Obtenção dos Carbon Dots a Partir da Glicose ...................................... 23

xxii

4.1.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão .......................................... 26

4.1.2 Espectrofluorimetria e Rendimento Quântico .................................. 30

4.1.3 Planejamento Fatorial ....................................................................... 40

4.1.4 Espectroscopia de UV-Vis ............................................................... 42

4.1.5 Espectroscopia de Infravermelho ..................................................... 43

4.2 Obtenção dos Carbon Dots a Partir de Pectina ...................................... 47

4.3 Obtenção de Carbon Dots Contendo Nitrogênio ................................... 52

4.4 Aplicações Biológicas ............................................................................ 57

4.4.1 Ensaios Hemolíticos ......................................................................... 58

4.4.2 Internalização Celular....................................................................... 62

5 Conclusões .................................................................................................... 67

6 Perspectivas .................................................................................................. 69

Referências Bibliográficas ............................................................................. 71

Anexo A ........................................................................................................... 79

xxiii

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Planejamento fatorial para avaliar a influência do tempo de reação,

temperatura e concentração dos reagentes na síntese dos carbon dots via HTC

.......................................................................................................................... 16

Tabela 2 – Tamanho médio dos carbon dots obtidos a partir da carbonização

hidrotérmica da glicose, determinado por meio das análises das imagens de

microscopia eletrônica de transmissão. ............................................................ 29

Tabela 3 – Valores da largura à meia altura das bandas de excitação e emissão

máximas das diferentes amostras de carbon dots sintetizados a partir da

carbonização hidrotérmica da glicose. ............................................................. 37

Tabela 4 – Rendimento quântico médio dos carbon dots obtidos utilizando-se

glicose como fonte de carbono. ........................................................................ 39

Tabela 5 – Dados estatísticos (limite de confiança de 95%) para o

planejamento fatorial sobre a síntese de carbon dots utilizando glicose como

fonte de carbono. .............................................................................................. 40

Tabela 6 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da

amostra Gli_E em diferentes concentrações. ................................................... 58

Tabela 7 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da

amostra Gli_E_TTDDA em diferentes concentrações. ................................... 60

xxv

Lista de Figuras

Figura 1 – Ilustração esquemática da densidade de estados de um sólido

expandido (“bulk”), quantum dots de diferentes tamanhos e uma molécula

diatômica (adaptado de Alivisatos9). .................................................................. 3

Figura 2 – Fotografia de quantum dots de Seleneto de Cádmio sintetizados no

LQES, evidenciando a alteração na coloração do material com a variação do

tamanho das nanopartículas (adaptado de Romano, 200711

). ............................ 4

Figura 3 – Levantamento sobre a produção científica relacionada ao tema

carbon dots, realizada em junho de 2014 (Web of Science, topic = “carbon

dots”). ................................................................................................................. 6

Figura 4 – Diagrama com propriedades e aplicações dos carbon dots

(adaptado de Li et al.23

) ...................................................................................... 8

Figura 5 – Fotografia de uma autoclave moderna, utilizada no LQES, com

controle de temperatura e agitação e medidor digital de pressão. ................... 11

Figura 6 – Fotografia das soluções antes e após a carbonização hidrotérmica,

sendo (a) a solução de glicose em NaOH 0,15mol.L-1 e (b) a solução obtida

após a reação na autoclave. .............................................................................. 23

Figura 7 – Imagem de TEM mostrando a presença de grandes aglomerados no

produto de reação. ............................................................................................ 24

Figura 8 – Representação esquemática mostrando as soluções antes e após o

processo de purificação, bem como a fotografia digital evidenciando o

fenômeno de Espalhamento Tyndall. ............................................................... 26

xxvi

Figura 9 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras (a)

Gli_A, (b) Gli_B, (c) Gli_C e (d) Gli_D, juntamente com os respectivos

histogramas de distribuição do tamanho das partículas. .................................. 27

Figura 10 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras

(a) Gli_E, (b) Gli_F, (c) Gli_G e (d) Gli_H, juntamente com os respectivos

histogramas de distribuição do tamanho das partículas. .................................. 28

Figura 11 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_A mostrando que a

emissão em 445 nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em

detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com

comprimento de onda de 380 nm). ................................................................... 30

Figura 12 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_B mostrando que a




Figura 13 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_C mostrando que a




Figura 14 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_D mostrando que a




Figura 15 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E mostrando que a


xxvii



Figura 16 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_F mostrando que a




Figura 17 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_G mostrando que a




Figura 18 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_H mostrando que a

emissão em 440 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em



Figura 19 – Superfície de resposta para otimização das condições de síntese.41

Figura 20 – Espectro UV-Vis das soluções de carbon dots (glicose como fonte

de carbono) diluídas em água deionizada em concentração de 0,1 mg.mL-1

. . 42

Figura 21 – Espectro de infravermelho da glicose em pastilha de KBr. ......... 43

Figura 22 – Espectro de infravermelho das amostras Gli_A, Gli_B, Gli_C e

Gli_D em pastilha de KBr. ............................................................................... 44

Figura 23 – Espectro de infravermelho das amostra Gli_E, Gli_F, Gli_G e

Gli_H em pastilha de KBr. ............................................................................... 45

xxviii

Figura 24 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra

CdotPec, juntamento com o respectivo histograma de distribuição do tamanho

das partículas. ................................................................................................... 47

Figura 25 – Espectro de fluorescência da amostra CdotPec mostrando que a

emissão em 430 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em



Figura 26 – Espectro UV-Vis da solução de CdotPec diluída em água

deionizada na concentração de 0,1 mg.mL-1

. ................................................... 50

Figura 27 – Espectro de infravermelho da amostra CdotPec e do precursor

pectina em pastilha de KBr. ............................................................................. 51

Figura 28 – Estrutula molecular do reagente 4,7,10-trioxa-1,13-

tridecanodiamina (TTDDA). ............................................................................ 53

Figura 29 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra

Gli_E_TTDDA, juntamento com o respectivo histograma de distribuição do

tamanho das partículas. .................................................................................... 53

Figura 30 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E_TTDDA mostrando

que a emissão em 445 nm é independente do comprimento de onda da

excitação (em detalhe a amostra iluminada com luz branca (a) e sob luz UV

(b) com comprimento de onda de 380 nm). ..................................................... 54

Figura 31– Espectro de infravermelho das amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA

em pastilha de KBr. .......................................................................................... 56

Figura 32 – Espectro UV-Vis da solução de Gli_E_TTDDA diluída em água

deionizada na concentração de 0,1 mg.mL-1

. ................................................... 57

xxix

Figura 33 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra

Gli_E diluídas em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico. ........................... 59

Figura 34 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra

Gli_E_TTDDA diluídas em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico. ............ 61

Figura 35 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com

a amostra Gli_E em um concentração de 100 µg.mL-1

, com excitação em 405

nm. .................................................................................................................... 63

Figura 36 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com

a amostra Gli_E_TTDDA em um concentração de 100 µg.mL-1

, com

excitação em 405 nm. ....................................................................................... 65

Figura 37 – Espectro de emissão da amostra Gli_E diluída em tampão PBS na

concentração de 0,5 mg.mL-1, com excitação em 405 nm. ............................. 79

Figura 38 – Espectro de emissão da amostra Gli_E_TTDDA diluída em

tampão PBS na concentração de 0,2 mg.mL-1, com excitação em 405 nm. ... 79

Estudo da Síntese de Carbon Dots via Carbonização Hidrotérmica e Avaliação Frente a Biossistemas

Dissertação de Mestrado

1

1 Introdução

Richard Philips Feynman, em conferência realizada em 1959 no

Encontro Anual da Sociedade Americana de Física, foi o primeiro cientista a

indagar quais seriam os efeitos nos materiais quando estes fossem

manipulados próximos à escala atômica1, apresentando grande contribuição

para o que se entende por nanotecnologia nos dias atuais. Hoje, o investimento

global em nanotecnologia supera a cifra de cinco bilhões de dólares,

demonstrando ser uma área de muito interesse científico e tecnológico2. Este

interesse advém do fato das propriedades dos nanomateriais poderem ser

moduladas pelo tamanho de suas partículas3, sendo que as características do

material no seu estado macro (bulk) podem divergir consideravelmente de

quando na escala nanométrica. Esta discrepância tem duas causas principais4:

Efeitos de superfície causados pela elevada razão de átomos

superficiais. Átomos na superfície apresentam menos vizinhos do que no

interior, gerando um número de coordenação menor e ligações deficientes.

Assim, os átomos na superfície são menos estáveis do que no interior do

sólido, podendo-se observar alterações na temperatura de fusão, nas transições

de fase e até mesmo em algumas propriedades termodinâmicas, como por

exemplo, apresentar capacidade calorífica negativa3.

Efeitos quânticos causados pelo confinamento quântico em

materiais com elétrons delocalizados, no qual a densidade de estados e a

energia das partículas terão uma dependência com o tamanho3.

Semicondutores no estado bulk possuem uma energia mínima para excitar um

elétron do estado fundamental de valência para uma vacância na banda de



2

condução, denominada de energia de band-gap (Eg), cujo valor irá depender

da composição do semicondutor. Quando um elétron consegue vencer esta

barreira tem-se o surgimento de um éxciton. Este éxciton apresenta um

tamanho finito, definido pelo diâmetro do éxciton de Bohr (aB), que se for

maior do que o tamanho da partícula acarretará num confinamento espacial

dos transportadores de carga, aumentando sua energia. Assim, as propriedades

óticas e eletrônicas passam a depender do tamanho da partícula, quando neste

regime de confinamento5.

Um exemplo marcante da nanotecnologia é a Taça de Licurgo, uma

peça romana com mais de 1600 anos, a qual já apresentava a utilização de

nanopartículas de ouro e prata na sua constituição6. Esta taça,

surpreendentemente, muda sua coloração dependendo se a luz é transmitida ou

refletida por ela, devido ao fenômeno de ressonância superficial de banda

plasmônica, no qual acontecem transições eletrônicas coletivas de elétrons

livres na superfície do metal nanoestruturado7.

Outro exemplo emblemático da nanotecnologia são os quantum dots.

Quantum dots são materiais nanométricos que apresentam efeitos de

confinamento quântico, fato que altera suas propriedades eletroeletrônicas,

sendo muito conhecidos por sua alta fotoluminescência, podendo ser

utilizados em LEDs, monitores e como agentes biológicos de imagem8. Os

primeiros quantum dots estudados para estes fins eram baseados em

semicondutores, tais como InAs, CdS, CdSe.

Para se entender os fenômenos que levam a estas diferentes

propriedades, alguns aspectos da mecânica quântica devem ser mencionados.

Cada átomo apresenta seu próprio orbital atômico. Quando dois átomos se



3

combinam entre si, observa-se a interação destes dois orbitais atômicos

gerando dois orbitais moleculares: um ligante, que apresenta menor energia e

estabiliza a ligação química; e outro antiligante, que apresenta maior energia e

desestabiliza a ligação. Entretanto, quando um número muito grande de

átomos interagem entre si, observar-se uma grande quantidade de níveis de

energia próximos um dos outros, levando a formação de bandas de energia.

Estas bandas serão centradas próximas aos níveis moleculares diatômicos,

gerando o que conhecemos por banda de condução e banda de valência.

Figura 1 – Ilustração esquemática da densidade de estados de um sólido expandido

(“bulk”), quantum dots de diferentes tamanhos e uma molécula diatômica (adaptado de

Alivisatos9).

Entretanto, para os quantum dots, descontinuidades começam a ser

observadas em virtude do efeito confinamento quântico. A estrutura eletrônica



4

do material é modificada, surgindo elétrons delocalizados. Estes elétrons

fazem com que níveis discretos de energia passem a ser observados, como

pode ser observado na Figura 1. Esta Figura também permite observar que a

energia do band-gap de um quantum dot ficará entre a do sólido expandido e

da molécula. Sendo assim, é possível modular a estrutura eletrônica do

material, controlando o tamanho de suas partículas, levando às propriedades

eletroeletrônicas desejadas10

.

Figura 2 – Fotografia de quantum dots de Seleneto de Cádmio sintetizados no LQES,

evidenciando a alteração na coloração do material com a variação do tamanho das

nanopartículas (adaptado de Romano, 200711

).

Como exemplo, tem-se o sulfeto de cádmio (CdS), o qual apresenta

um band-gap de 1,7 eV quando em partículas de 20 nm contra um Eg de 2,4

eV quando em partículas de 2 nm9. A dependência do valor da energia do

band-gap reflete-se, em casos específicos de energia, na cor dos compostos,

como pode ser observado nos quantum dots de seleneto de cádmio (CdSe)



5

sintetizados no LQES (Figura 2)11

. Porém, apesar do elevado rendimento

quântico e controlável luminescência, os tradicionais quantum dots

inorgânicos apresentam como desvantagem a conhecida e elevada toxicidade

de alguns destes elementos12

, impossibilitando o uso destes materiais na área

biomédica.

1.1 Carbon Dots

Diversas classes de nanomateriais já foram estudadas. Após a

descoberta do fulereno (C60)13

e dos nanotubos de carbono14

, a utilização de

nanomateriais baseados em carbono passou a atrair enorme interesse nas

pesquisas em virtude da potencial aplicação nas mais diversas áreas15

: catálise,

aproveitamento energético, eletrônica, biomedicina, sensores, entre outras,

possibilitando o surgimento de novas nanoestruturas, tais como o grafeno,

nanofios, filmes, membranas e quantum dots de carbono16

.

Os quantum dots de carbono, também denominados carbon dots, são

um dos mais recentes alótropos de carbono descobertos. A descoberta de tais

nanomateriais ocorreu de maneira acidental, quando pesquisadores tentavam

purificar nanotubos de carbono17

. Primeiramente, houve um hiato sobre as

pesquisas envolvendo tal material, conforme levantamento realizado no Web

of Science® em junho de 2014, porém nos últimos três anos observa-se um

aumento brusco nos artigos publicados sobre carbon dots, bem como o

número de citações destes artigos.



6

Figura 3 – Levantamento sobre a produção científica relacionada ao tema carbon dots,

realizada em junho de 2014 (Web of Science, topic = “carbon dots”).

Estas nanoestruturas de carbono quando suficientemente pequenas (2-

10 nm) começam a apresentar luminescência, possivelmente devido a efeitos

de confinamento quântico aliados com defeitos na sua superfície16; 18; 19

, sendo

que algumas partículas maiores do que este tamanho crítico podem também

apresentar luminescência após terem sua superfície passivada16; 20

. Os carbon

dots, apesar de possuírem menor rendimento quântico quando comparados aos

quantum dots de semicondutores19

, apresentam menor citotoxicidade, maior

biocompatibilidade, resistência a fotodegradação e inércia química em relação

a degradação metabólica16; 18; 19; 20

, sendo um possível substituto dos quantum

dots que possuem elementos tóxicos na sua composição (principalmente Cd,

Se, Te e As), com potencial aplicação na área biomédica como sensores e

agentes de imagem. Trabalhos recentes comparam a eficiência dos carbon

dots com a de já comercializados quantum dots de seleneto de cádmio

recobertos com sulfeto de zinco (CdSe/ZnS). Foi observado que os carbon



7

dots são tão eficientes quanto aos já utilizados quantum dots aliados a uma

menor toxicidade12

. Contudo, para a aplicação destes materiais na área

biomédica, muitas vezes torna-se necessário sua funcionalização, seja para

aumentar sua solubilidade em meio aquoso ou mesmo diminuir respostas

imunológicas. Dentre as alternativas possíveis, destaca-se o recobrimento das

partículas com polietilenoglicol (PEG), que aumenta a solubilidade das

partículas em meio aquoso e aumenta o tempo de circulação venosa21

. Pode

ainda ser usado o ácido fólico, que atua como sensor para distinguir células

cancerígenas de células normais22

.

Além da possível aplicação na área biomédica, os carbon dots

apresentam potencial papel em fotocatálise, optoeletrônica, sensores para

efeito Raman intensificado pela superfície (SERS, do inglês surface enhanced

raman scattering)23

, entre outros, como exemplificado na Figura 4.

Para exemplificar a ampla gama de aplicação dos carbon dots, a

literatura descreve sua utilização em sensores para detecção seletiva de íons

divalentes de mercúrio24; 25

e cobre26

, detecção de íons férrico27

, íons sulfeto28

,

glicose quando aliado em um nanocompósito com grafeno e nanopartículas de

ouro29

, quercetina30

, tintas biocompatíveis31

, tinta fluorescente para evitar

falsificação e garantir autenticidade27

, sensibilizador para células

fotoeletroquímicas32

, fabricação de nanocompósitos de polímeros

luminescentes33

, entre outras.



8

Figura 4 – Diagrama com propriedades e aplicações dos carbon dots (adaptado de Li et

al.23

)

Vários métodos de síntese dos carbon dots são descritos na literatura.

Podem-se utilizar duas estratégias para a síntese de nanomateriais: em uma,

chamada de “top-down”, parte-se de um material bulk e o desgasta até a

escala nanométrica, geralmente por um processo físico; a outra estratégia,

chamada de “bottom-up”, baseada na organização de precursores moleculares

para a criação da nanoestrutura, ou seja, um processo mais químico. Para a

síntese dos carbon dots, ambas as estratégias têm sido utilizadas. Dentre os

processos top-down, destaca-se a obtenção de carbon dots por exfoliação

eletroquímica de grafite32

ou fibras de carbono34

e a ablação a laser de

grafite35

. Os processos bottom-up são mais reportados na literatura e envolvem

uma extensa gama de métodos de síntese e fontes de carbono, destacando-se a

carbonização de glicose mediada por ultrassom36

, pirólise de precursores

orgânicos, como carboidratos37

e ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)38

,



9

carbonização e oxidação ácida de fuligem12; 15; 39; 40

, oxidação térmica de sais

de amônio quaternários41; 42

, carbonização de polietilenoglicol (PEG)43

ou de

ácido cítrico com uréia31

ou etilenodiamina28; 44

assistida por micro-ondas e

carbonização de glicose utilizando micelas reversas45

. Entretanto, muitas

destas técnicas são trabalhosas e exigem a utilização de equipamentos ou

reagentes caros, tornando-as pouco atrativas19

. Assim, um método que se

mostra viável, uma vez que é simples e requer materiais de baixo custo, é a

carbonização hidrotérmica (HTC, do inglês Hydrothermal Carbonization)46; 47;

48; 49. Várias fontes de carbono já foram utilizadas para a síntese de carbon

dots via HTC, tais como ácido ascórbico50

, ácido cítrico27

, albumina de soro

bovino (BSA)51

, carboidratos40

, casca de frutas24; 29

, citrato de sódio25

,

gelatina52

, glicose53

, glucosamina54

, polissacarídeos33

, quitosana55

, seda56

, suco

de laranja57

, tabaco26

e muitas outras. Nota-se que uma grande parte destes

materiais de partida apresentam baixo valor e algumas vezes são até mesmo

resíduos industriais, os quais podem ter seu valor agregado aumentado quando

utilizados como precursores para a obtenção de carbon dots.

1.2 Sínteses Hidrotérmicas

O termo hidrotérmico tem origem na geologia, sendo usado para

designar a ação da água em elevadas temperaturas e pressão, levando à

formação de minerais e modificações na crosta terrestre58

. Apesar das

confusões existentes sobre a definição da técnica, em grande parte pela

presença do prefixo hidro, que tem origem do grego hydros (água), a síntese

hidrotérmica pode ser compreendida como um conjunto de reações químicas



10

heterogêneas que ocorrem em um sistema fechado na presença de solvente,

aquoso ou não59

. O primeiro registro da utilização de condições hidrotérmicas

para a síntese de materiais é de 1845, quando E. T. Schafthual preparou

partículas finas de quartzo. Posteriormente, teve-se o início das sínteses de

vários silicatos, argilas, hidróxidos e óxidos, sendo que já em 1900, mais de

150 espécies já haviam sido sintetizadas. Em 1940, iniciou-se o crescimento

de cristais sob condições hidrotérmicas e estudos sobre equilíbrios de fase.

Atualmente, uma ampla gama de materiais pode ser obtida por esta técnica,

até mesmo nanopartículas com tamanho e morfologia controlados58

.

A síntese hidrotérmica apresenta uma grande quantidade de vantagens,

podendo-se destacar a possibilidade de obtenção de produtos com elevada

pureza e homogeneidade, distribuição estreita de tamanho de cristais,

processos de etapa única, sínteses rápidas e com baixo consumo energético,

crescimento de cristais de baixa solubilidade, variação de composição química

e muitas outras aplicações59

. Além disso, hoje são disponíveis autoclaves

modernas (Figura 5), que permitem o controle rigoroso da temperatura e

agitação do meio reacional, além de permitir trabalhar sob uma atmosfera

específica e controlada, potencializando, assim, as vantagens da síntese

hidrotérmica.

Utilizando-se como substrato qualquer tipo de biomassa, pode-se

realizar a carbonização hidrotérmica – expandindo a visão de que os

tratamentos hidrotérmicos são utilizados somente para substâncias inorgânicas

– sendo possível a obtenção de carvões com diferentes morfologias e materiais

nanoestruturados de carbono com diversos tamanhos e formas48; 49

.



11

Figura 5 – Fotografia de uma autoclave moderna, utilizada no LQES, com controle de

temperatura e agitação e medidor digital de pressão.

A carbonização hidrotérmica é uma técnica simples, econômica e

eficiente, que vem sendo citada dentro de uma proposta ambientalmente

amigável, visto que não causa danos ao meio ambiente, além de ser uma

maneira de evitar/diminuir a emissão de gases causadores do efeito estufa46

.

1.3 Relevância do Trabalho

Considerando a obtenção de nanoestruturas por meio da síntese

hidrotérmica, é importante a realização de estudos visando a elaboração de

protocolos de síntese que sejam reprodutivos e bem compreendidos. Ademais,

Forno

Sistema de

arrefecimento

Controlador digital

de temperatura e

agitação e medidor

digital de pressão.

Medidor analógico

de pressão.

Haste de agitação

Conectores do reator

(termopar, haste de

agitação, tubos de

injeção e remoção de

material)



12

deve-se trabalhar com a possibilidade do escalonamento da produção, bem

como a diminuição dos custos envolvidos, objetivando a produção industrial

dos sistemas de interesse.

A síntese dos carbon dots é de fundamental importância para sua

aplicação, visto que o perfil de fotoluminescência é dependente do tamanho

das partículas. Assim, para sua utilização em larga escala, é necessária uma

rota de síntese que seja bem conhecida, possibilitando direcionar o material

para a aplicação de desejada16; 19

. A HTC tem demonstrado grande potencial

para a síntese de materiais de carbono com diferentes formas e tamanhos,

mesmo em escala nanométrica48

. A HTC, a partir de resíduos de biomassa e

sacarídeos, vem demonstrando ser extremamente viável para a síntese de

nanomateriais de carbono e apresenta como vantagens agregar valor a uma

matéria prima de baixo custo e abundante além de diminuir a emissão de gases

que contribuem para o efeito estufa46

. Entretanto, apesar de promissora, ainda

há poucos estudos sobre os mecanismos envolvidos e quais os parâmetros que

influenciam efetivamente a obtenção dos diferentes materiais.



13

2 Objetivos

Considerando os aspectos apresentados, os Objetivos Gerais deste

Projeto podem ser divididos em dois grupos: inicialmente busca-se realizar

uma avaliação das condições da síntese hidrotérmica sobre as propriedades

dos carbon dots e, posteriormente, obter o mesmo material com a

incorporação de nitrogênio na sua estrutura com o intuito de verificar seu

comportamento frente à biossistemas. Finalmente, os objetivos específicos

deste trabalho são discriminados mais detalhadamente a seguir:

Avaliar, como o auxílio de um planejamento fatorial, como os

diferentes parâmetros de síntese (temperatura, tempo de reação e concentração

da fonte de carbono) afetam o rendimento quântico, tamanho e morfologia dos

carbon dots obtidos por meio de sacarídeos com diferente grau de

complexidade;

Caracterizar estruturalmente e morfologicamente os carbon

dots, bem como avaliar sua luminescência;

Otimizar as condições de síntese para obter carbon dots com

elevada fluorescência, criando um rota de síntese robusta;

Obter carbon dots com a incorporação de nitrogênio e estudar a

influência desta incorporação na luminescência do material, objetivando sua

aplicação in vivo;

Prova de conceito, avaliando a hemólise provocada pelo

material com e sem nitrogênio na sua estrutura.



14



15

3 Procedimento Experimental

3.1 Materiais

3.1.1 Reagentes

Ácido sulfúrico P.A. Synth, água deionizada Milli-Q®, brometo de

potássio grau espectroscópico Merck, D-glicose Anidra P.A. Synth, etanol

absoluto P.A. Neon, hidróxido de sódio em pastilha P.A. Synth, pectina obtida

de maçã Sigma-Aldrich®, sacarose anidra P.A. Synth, sulfato de quinino 98%

Sigma-Aldrich®, tampão Dubelcco Sigma-Aldrich

® e tampão PBS Sigma-

Aldrich®.

3.1.2 Equipamentos

Reator Parr – Modelo 4843; sistema de filtração à vácuo Millipore;

liofilizador Terroni – modelo LD300TT; espectrofluorímetro Varian – modelo

Cary Eclipse; prensa hidráulica Carver – Modelo 3855; espectrofotômetro de

infravermelho ABB Bomem, série MB – modelo FTLA2000-102;

espectrofotômetro de UV-Vis Shimadzu – modelo 1650PC; leitor de

microplacas Anthos – modelo Zenith 200RT e microscópio eletrônico de

transmissão Zeiss – modelo Libra.

3.2 Métodos



16

3.2.1 Planejamento fatorial para síntese de carbon dots

Utilizou-se um planejamento fatorial completo, avaliando a

combinação de 3 fatores (temperatura, tempo e concentração da fonte de

carbono) em dois níveis (+ e -), consistindo em um planejamento 23. Este tipo

de planejamento é um dos mais utilizados como triagem, a fim de se

determinar quais são as variáveis que mais influenciam uma determinada

resposta60

. Construiu-se uma tabela (Tabela 1) para a realização do

planejamento fatorial, sendo que as variáveis avaliadas foram: temperatura

(condição -: 120ºC; condição +: 160ºC), tempo (condição -: 4 h; condição +: 8

h) e concentração inicial da fonte de carbono (condição -: 2% massa/volume;

condição +: 6% massa/volume). Os valores utilizados foram baseados em

dados reportados na literatura47; 55

. O rendimento quântico foi selecionado

como resposta para a alteração dos diferentes parâmetros.

Tabela 1 – Planejamento fatorial para avaliar a influência do tempo de reação, temperatura

e concentração dos reagentes na síntese dos carbon dots via HTC

Experimento Tempo Temperatura Concentração Denominação

1 + + + Gli_A

2 - + + Gli_B

3 + - + Gli_C

4 - - + Gli_D

5 + + - Gli_E

6 - + - Gli_F

7 + - - Gli_G

8 - - - Gli_H



17

Numa síntese típica, uma massa adequada de glicose (1,4 g ou 7,8

mmol nas condições - ; 4,2 g ou 23,4 mmol nas condições +) era dissolvida

em 70 mL de uma solução de NaOH 0,15 mol.L-1

previamente preparada. Esta

solução foi então transferida para o reator Parr com capacidade de 100 mL, ou

seja, o volume ocupado do reator era de 70%. Após o fechamento do reator, o

aquecimento era iniciado, sob agitação de 100 rpm para homogeneizar o meio

reacional. O tempo de reação começava a ser contabilizado no momento em

que a temperatura de interesse era atingida.

3.2.2 Purificação dos carbon dots

O processo de purificação dos carbon dots foi realizado baseado em

informações literatura53

. A solução marrom escuro obtida após o tratamento

no reator foi filtrada em membrana de acetato de celulose de 0,22 µm – Merck

Millipore.

O filtrado foi transferido para tubos Falcon de 50 mL, congelado em

nitrogênio líquido (-196ºC) e liofilizado durante cinco dias. Posteriormente, o

sólido marrom/preto obtido foi disperso em etanol com a ajuda de um banho

de ultrassom (15 min) e deixou-se decantar por 2 h. O material foi filtrado em

membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) de 0,22 µm – Merck

Millipore, gerando uma solução amarelada.

O solvente foi removido com o auxílio de um evaporador rotativo e o

sólido obtido (carbon dots purificados) foi redisperso em água deionizada e

armazenado em geladeira protegido da luz.



18

3.2.3 Caracterização dos carbon dots

3.2.3.1 Espectroscopia de Fluorescência e Determinação de Rendimento

Quântico

Levou-se uma solução 0,1 mg.mL-1

de carbon dots diluída em água

deionizada ao espectrofluorímetro e avaliou-se o máximo de excitação e

emissão. Os espectros foram obtidos utilizando os valores máximos

encontrados de excitação e emissão, utilizando abertura de fenda de 10 nm.

A determinação do rendimento quântico61

(Q) foi realizada em

triplicata utilizando sulfato de quinino como referência (Qref = 54%),

empregando soluções com absorbância inferior a 0,1 no comprimento de onda

de excitação, por meio da seguinte equação:

(

) (

) (

)

Equação 1

Sendo Q o rendimento quântico, I a área integrada do espectro de

emissão, A a absorbância no comprimento de onda de excitação e n o índice

de refração do solvente. O sub-índice “ref” refere-se aos valores obtidos para o

sulfato de quinino, o qual apresenta rendimento quântico conhecido.

3.2.3.2 Espectroscopia de UV-Vis

Uma solução 0,1 mg.mL-1

de carbon dots diluída foi colocada em uma



19

cubeta de quartzo e foi registrado o espectro entre 190 e 800 nm, utilizando

água deionizada como referência.

3.2.3.3 Espectroscopia de Infravermelho

Transferiu-se uma alíquota de 100 µL de uma solução concentrada de

carbon dots (10 mg.mL-1

) para um almofariz de ágata e levou-se a uma estufa

à 80ºC para a evaporação do solvente. Posteriormente, adicionou-se

aproximadamente 100 mg de brometo de potássio (KBr) e pastilhou-se a

amostra, prensando-a em uma prensa hidráulica sob 4 toneladas de pressão

durante 30 s. Foram realizados 64 scans por espectro, com resolução de 4 cm-1

e a faixa de medição foi de 4000 a 400 cm-1

.

3.2.3.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

As análises de microscopia foram realizadas sob voltagem de

aceleração de 120 kV. Para o preparo da amostra, gotejou-se uma solução 25

µg.mL-1

de carbon dots diluída em água deionizada em um grid de cobre

recoberto com carbono (300 mesh) e o solvente foi seco em estufa à 40ºC.

A determinação da distribuição de tamanho das partículas foi realizada

com o auxílio do software ImageJ, contando-se 150 partículas.

3.2.4 Aplicações Biológicas



20

3.2.4.1 Ensaio Hemolítico

O protocolo para avaliar a resposta hemolítica das nanopartículas foi

adaptado do método descrito na norma técnica E2524-08(2013) da ASTM (do

inglês, American Society for Testing and Materials)62

. Concentrado de

hemácias de sangue tipo B+ foi obtido do Hemocentro da Universidade

Estadual de Campinas (Unicamp). Um volume de 2 mL do concentrado de

hemácias foi transferido para um tubo plástico e completou-se o volume para

10 mL com tampão fosfato salino Dulbecco livre de Ca2+

e Mg2+

(DPBS). A

solução resultante foi homogeneizada levemente e, posteriormente,

centrifugada a 10000 rpm por 10 minutos à 4ºC. Após a centrifugação, o

sobrenadante foi descartado e as hemácias foram lavadas por mais três vezes

com DPBS. Após a lavagem, as hemácias foram reconstituídas em 10 mL de

DPBS, formando a solução HTS (Hemoglobina Total do Sangue).

O controle positivo do teste (100% de hemólise) foi preparado

adicionando-se 100 µL da solução HTS em um tubo Eppendorf contendo 900

µL de água deionizada. O controle negativo (0% de hemólise) foi preparado

adicionando-se 100 µL da solução HTS em um tubo Eppendorf contendo 900

µL de DPBS. Ambos os controles foram realizados em triplicata.

Para os testes com as nanopartículas, 100 µL da solução HTS foi

adicionada a um tubo Eppendorf e adicionou-se volumes adequados de DPBS

e de uma solução estoque dos carbon dots testado (15 mg.mL-1

em DPBS), de

maneira que o volume final fosse de 1 mL, nas diferentes concentrações de

carbon dots: 3,750; 1,500; 0,750; 0,375; 0,150; 0,075 e 0,015 mg.mL-1

. Todas

as concentrações foram testadas em triplicata.



21

Os tubos foram homogeneizados e incubados em banho seco por 3

horas à 25ºC, sendo homogeneizados a cada 30 minutos. Após o período de

incubação, os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10000 rpm.

Posteriormente, 100 µL dos sobrenadantes foram recolhidos, transferidos para

uma microplaca de 96 poços e leu-se o valor de absorbância em 540 nm em

um leitor de microplacas. O valor de absorbância em 540 nm das soluções de

carbon dot nas concentrações utilizadas sem adição da solução HTS foi

medido para minimizar qualquer possível interferência da absorção dos

carbon dots nas medidas de absorbância do ensaio hemolítico.

A porcentagem de hemólise é calculada pela seguinte equação63

:

( ) (

) Equação 2

onde, Absam é o valor de absorbância em 540 nm do sobrenadante da

solução de carbon dot incubada com as hemácias, Absb é o valor de

absorbância em 540 nm da solução de carbon dot não incubadas, AbsC- é o

valor de absorbância em 540 nm do controle negativo e AbsC+ é o valor de

absorbância em 540 nm do controle positivo.

3.2.4.2 Imunofluorescência e Análise por Microscopia Confocal da

Internalização dos Carbon Dots

As células HeLa foram cultivadas em placas de 6 poços (1x105 células

por poço) sobre lamínula de vidro e, após 24 horas, as células foram tratadas



22

por 24 horas adicionais com 100 µg.mL-1

das soluções de carbon dots

testadas. As células foram lavadas com solução salina balanceada de Hanks

(HBSS) [10 mM Hepes (pH 7,4); 1,4 M NaCl; 1,26 mM CaCl2; 0,34 mM

Na2HPO4; 0,4 mM MgSO4; 0,4 KH2PO4; 0,5 mM MgCl2; 5,5 mM KCl] e

incubadas por 30 minutos com 3 µg.mL-1

de WGA conjugado com Alexa

Fluor 594 (Invitrogen, Eugene, OR, EUA), para marcação da membrana

plasmática. A seguir, as células foram lavadas com HBSS. As lâminas foram

analisadas em microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP8

(Leica, Mannheim, Alemanha), com objetiva 63x (Plan-Neofluar, abertura

numérica de 1.75) sob óleo de imersão. Os carbon dots foram excitados com

laser de diodo (λexc = 405 nm, λem = 430-550 nm), enquanto que o WGA-

Alexa Fluor 594 foi excitado com laser HeNe (λexc = 552 nm, λem = 600-640

nm). As imagens foram tratadas utilizando-se o programa Adobe Photoshop

CS5 e Adobe Illustrator CS5.



23

4 Resultados e Discussão

4.1 Obtenção dos Carbon Dots a Partir da Glicose

Após a dissolução da quantidade adequada de glicose na solução 0,15

mol.L-1

de NaOH, obteve-se uma solução transparente, a qual foi adicionada

ao reator. Ao fim dos tratamentos térmicos, obtiveram-se soluções marrom

escuro com a presença ou não de sólidos pretos dependendo da temperatura e

tempo de reação estabelecida pelo planejamento fatorial, como pode ser

observado na Figura 6:

(a) (b)

Figura 6 – Fotografia das soluções antes e após a carbonização hidrotérmica, sendo (a) a

solução de glicose em NaOH 0,15mol.L-1 e (b) a solução obtida após a reação na

autoclave.

Respeitando-se a aleatoriedade na ordem da realização dos

experimentos no planejamento fatorial, a primeira condição de síntese

realizada utilizou um tempo de reação de 4 h, temperatura de 160ºC e 6% de

concentração massa/volume da fonte de carbono (condição referente a amostra



24

Gli_B). Inicialmente, seguiu-se os procedimentos estabelecidos na literatura

que utilizam centrifugação a 16000 rpm por 45 min para separar aglomerados

e grandes partículas formadas durante a síntese47

. Entretanto, após a

centrifugação não foi observada a formação de precipitado e a análise da

amostra por microscopia de transmissão mostrou a presença de grandes

aglomerados, conforme observado na Figura 7, confirmando que a simples

centrifugação não é suficiente para a obtenção uma solução pura de carbon

dots.

Figura 7 – Imagem de TEM mostrando a presença de grandes aglomerados no produto de

reação.

A simples centrifugação não foi suficiente para a purificação dos

carbon dots, mesmo com a modificação das condições de síntese, por

exemplo, aumentando o tempo de reação para 24 h e aumento da temperatura



25

de síntese para 200ºC. Sendo assim, foi necessário encontrar uma maneira de

purificar e isolar os carbon dots antes de dar continuidade nas demais

caracterizações do material. Um novo levantamento bibliográfico foi realizado

a fim de verificar quais outros métodos poderiam ser empregados para o

isolamento dos carbon dots. Observou-se que outros trabalhos reportados na

literatura utilizavam o método de diálise40; 54; 61

, cromatografia de exclusão

molecular12

, cromatografia líquida de alta eficiência64; 65

, precipitação por

troca de solvente39; 41

e extração por solventes53

, sendo que estes dois últimos

foram testados inicialmente por serem mais simples e acessíveis. A

precipitação por troca de solvente não se mostrou eficiente, visto que mesmo

com a adição de considerável volume de acetona, um solvente com constante

dielétrica conhecidamente bem inferior ao da água, não foi observado

precipitação. Por outro lado, o método de extração por solvente, descrito no

item 3.2.2 deste documento, mostrou-se eficiente para a purificação e

isolamento dos carbon dots, conforme será evidenciado adiante com as

imagens de microscopia eletrônica de transmissão.

Seguindo o protocolo desenvolvido para a purificação dos carbon dots,

a solução obtida após o tratamento hidrotérmico foi filtrada em membrana de

acetato de celulose, sendo retida uma quantidade expressiva de material

aglomerado. Esta quantidade dependia das condições de síntese utilizadas. O

filtrado ainda apresentava uma coloração escura. Dando continuidade com o

processo de purificação, após a liofilização do filtrado, resuspensão do sólido

obtido em etanol absoluto e filtração em membrana de PVDF de 0,22 µm,

uma solução amarelada era obtida. O etanol era eliminado com o auxílio de

um evaporador rotativo e as partículas eram novamente suspensas em água



26

deionizada, gerando uma solução amarelada, conforme pode ser observado na

Figura 8.

Figura 8 – Representação esquemática mostrando as soluções antes e após o processo de

purificação, bem como a fotografia digital evidenciando o fenômeno de Espalhamento

Tyndall.

É interessante destacar que, ao incidir um laser nesta solução, foi

observado o fenômeno de espalhamento Tyndall, indicando a presença de

partículas dispersas em solução. Ou seja, tem-se uma suspensão, em princípio,

de carbon dots purificados.

4.1.1 Microscopia Eletrônica de Transmissão

A observação das imagens obtidas por microscopia de transmissão

mostra a presença de pequenas partículas com formato aproximadamente

esférico e poucos aglomerados em todas as amostras, evidenciando a formação



27

dos carbon dots, conforme pode ser observado na Figura 9 e na Figura 10. A

distribuição do tamanho das partículas foi realizado com o auxílio do software

ImageJ, contabilizando-se 150 partículas.

Figura 9 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras (a) Gli_A, (b)

Gli_B, (c) Gli_C e (d) Gli_D, juntamente com os respectivos histogramas de distribuição

do tamanho das partículas.



28

Figura 10 – Imagens de microscopia eletrônica de transmissão das amostras (a) Gli_E, (b)

Gli_F, (c) Gli_G e (d) Gli_H, juntamente com os respectivos histogramas de distribuição



29

do tamanho das partículas.

É interessante observar nas imagens de microscopia eletrônica de

transmissão das amostras que a distribuição de tamanho nas diferentes

amostras não é homogênea. Os valores médios, bem como seu desvio, estão

reportados na Tabela 2.

Tabela 2 – Tamanho médio dos carbon dots obtidos a partir da carbonização hidrotérmica

da glicose, determinado por meio das análises das imagens de microscopia eletrônica de

transmissão.

Amostra Tamanho Médio (nm)

Gli_A 4,8 ± 1,4

Gli_B 5,6 ± 1,6

Gli_C 15,9 ± 5,4

Gli_D 4,7 ± 0,8

Gli_E 4,1 ± 0,5

Gli_F 3,9 ± 0,7

Gli_G 3,1 ± 0,5

Gli_H 4,4 ± 1,0

Observa-se que em todas as amostra, há partículas entre 2 e 10 nm,

com a presença de poucos aglomerados. A amostra Gli_C é uma exceção,

sendo que apresenta partículas variando entre 5 e 30 nm, com tamanho médio

de 15,9 ± 5,4 nm. As demais amostram apresentam tamanho médio inferior a

5,6 nm, indicando que as partículas são de fato muito pequenas, permitindo a

manifestação do fenômeno de confinamento quântico.



30

4.1.2 Espectrofluorimetria e Rendimento Quântico

As medidas de espectrofluorimetria mostraram que o comprimento de

onda máximo no qual ocorre a excitação e emissão dos carbon dots é

praticamente independente das condições de síntese utilizadas. Somente

pequenas diferenças são observadas nos espectros de emissão e excitação nas

diferentes condições, o mesmo acontecendo quando se altera a fonte de

carbono utilizada para a obtenção dos carbon dots, onde sempre é observada

uma fluorescência na região azul do espectro visível.

Na amostra Gli_A, observa-se que o máximo de emissão ocorre com

comprimento de onda de excitação em 350 nm (ultravioleta próximo) e

emissão em 445 nm, ou seja, apresenta fluorescência azul.

Figura 11 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_A mostrando que a emissão em 445

nm é dependente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada

com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).



31

Além disso, conforme pode ser observado na Figura 11, nota-se que a

emissão é dependente do comprimento de onda da excitação, ou seja,

alterando-se a excitação, desloca-se o comprimento de onda no qual ocorre a

emissão, comportamento este já observado e descrito na literatura para os

carbon dots19; 66; 67

. Outro fator interessante de se observar é a largura à meia

altura das bandas de excitação e de emissão, as quais apresentam os valores de

83 e 96 nm, respectivamente.

A amostra Gli_B também apresenta como máximo de excitação o

comprimento de onda de 350 nm e o máximo de emissão em 455 nm, bem

como o comportamento de emissão dependente do comprimento de onda de

excitação, conforme pode ser observado na Figura 12:

Figura 12 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_B mostrando que a emissão em 445





32

A largura à meia altura da banda de excitação da amostra Gli_B é de

77 nm e da banda de emissão máxima é de 106 nm.

A amostra Gli_C apresenta um leve deslocamento para o vermelho na

excitação e emissão, sendo que o máximo de excitação ocorre em 360 nm e o

máximo de emissão em 450 nm, conforme observado na Figura 13.

Figura 13 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_C mostrando que a emissão em 450



Novamente pode ser observado que o máximo de emissão é

dependente do comprimento de onda no qual ocorre a excitação. O valor da

largura à meia altura da banca de excitação é de 85 nm e da banca de emissão

é de 97 nm.

O mesmo comportamento da amostra Gli_C foi observado na amostra

Gli_D, a qual apresenta comprimento de onda máximo de excitação em 360



33

nm e emissão máxima em 450 nm. O máximo do espectro de emissão também

mostra uma dependência com o comprimento de onda de excitação. A largura

à meia altura da banda de excitação é de 87 nm e da banda de emissão é de 96

nm, como mostra a Figura 14.

Figura 14 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_D mostrando que a emissão em 450



Já a amostra Gli_E apresenta um comprimento de onda máximo de

excitação de 345 nm. O máximo de emissão ocorre em 450 nm. É interessante

observar que a amostra Gli_E apresentou um deslocamento para o azul no

espectro de excitação. A amostra apresenta o mesmo comportamento em que a

emissão depende do comprimento de onda de excitação. A largura à meia

altura da banda de excitação é de 85 nm e da banda de emissão é de 105 nm.



34

Figura 15 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E mostrando que a emissão em 450



A amostra Gli_F também apresentou o máximo de excitação em 345

nm, porém o máximo de emissão ocorre em 445 nm.

Figura 16 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_F mostrando que a emissão em 445





35

A largura à meia altura da banda de excitação da amostra Gli_F é de

88 nm e da banda de emissão é de 100 nm.

O mesmo perfil também foi observado na amostra Gli_G. O máximo

de excitação ocorre em 345 nm, sendo que a largura à meia altura desta banda

é de 83 nm. Já o máximo de emissão ocorre em 445 nm, com largura à meia

altura de 100 nm. Novamente observa-se que o máximo de emissão é

dependente do comprimento de onda de excitação, conforme pode ser

observado na Figura 17.

Figura 17 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_G mostrando que a emissão em 445



Finalmente, como pode ser observado na Figura 18, a amostra Gli_H

apresenta como comprimento de onda máximo de excitação o valor de 345

nm. O valor do comprimento de onda máximo de emissão é de 440 nm.



36

Diferente das demais amostras, o comprimento de onda máximo de

emissão é independente do comprimento de onda no qual ocorre a excitação.

Além disso, a largura à meia altura da banca de excitação máxima é de 100

nm e da banda de emissão máxima é de 98 nm.

Figura 18 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_H mostrando que a emissão em 440

nm é independente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra iluminada


A origem da fluorescência dos carbon dots ainda não é totalmente

compreendida e conhecida. Acredita-se que a fluorescência possa ser fruto de

dois fatores: o primeiro, relacionado ao próprio fenômeno de confinamento

quântico; e o segundo, devido a diferentes traps de energia na superfície das

carbon dots, originados pela presença de grupos funcionais oxigenados na

superfície das partículas66; 67

.

Estes dois fatores nos ajudam a compreender as pequenas diferenças



37

observadas nos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão dos

carbon dots, bem como o motivo das bandas de excitação e emissão serem

alargadas.

A Tabela 3 apresenta os valores da largura à meia altura das bandas de

excitação e emissão, bem como os valores máximos de emissão e excitação.

Tabela 3 – Valores da largura à meia altura das bandas de excitação e emissão máximas das

diferentes amostras de carbon dots sintetizados a partir da carbonização hidrotérmica da

glicose.

Amostra λexc (nm)

Largura à meia

altura da banda de

excitação (nm)

λem (nm)

Largura à meia

altura da banda

de emissão (nm)

Gli_A 350 83 445 96

Gli_B 350 77 445 106

Gli_C 360 85 450 97

Gli_D 360 87 450 96

Gli_E 345 85 450 105

Gli_F 345 88 445 100

Gli_G 345 83 445 100

Gli_H 345 100 440 98

A observação dos dados da Tabela 3, juntamente com os valores de

tamanho médio dos carbon dots (apresentados na Tabela 2), não permite

distinguir claramente qual dos dois fatores – tamanho ou traps superficiais de

energia – é dominante na fluorescência do material.

Sendo conhecida a seguinte relação:



38

Equação 03

onde, E é energia, h a constante de Planck, c a velocidade da luz no vácuo e λ

o comprimento de onda da radiação. Espera-se que as amostras que

apresentam menor tamanho de partícula, emitam em menor comprimento de

onda, uma vez que, de acordo com o efeito de confinamento quântico, as

partículas menores apresentam maior energia. É observada certa tendência

neste comportamento. A amostra Gli_C é a que apresenta o maior tamanho

médio (15,9 ± 5,4 nm) e emite no maior comprimento de onda observado entre

as amostras (450 nm). Entretanto, apesar desta tendência, alguns desvios são

observados. Por exemplo, a amostra Gli_H é a que emite no menor

comprimento de onda, porém não é a amostra que apresenta a menor

distribuição de tamanho (4,4 ± 1,0 nm contra 3,1 ± 0,5 nm da amostra Gli_G).

Sendo assim, observa-se que os dois fatores atuam simultaneamente na

fluorescência do material. Este fato dificulta a modulação da energia de band-

gap, como é possível com os tradicionais quantum dots inorgânicos.

Além disso, a máxima emissão dependente do comprimento de onda

de excitação pode ser compreendida pelos fenômenos de confinamento

quântico e a presença de diferentes traps de energia na superfície dos carbon

dots66; 67

. Alterando-se o comprimento de onda de excitação, alteram-se as

partículas que estão sendo excitadas – em virtude da distribuição de tamanho

não ser totalmente homogênea, conforme relatado na Tabela 2 – e também são

alterados os traps de energia que serão excitados, os quais, consequentemente,

emitirão em novos comprimentos de onda.

Para a determinação do rendimento quântico dos carbon dots obtidos a



39

partir de glicose, selecionou-se o sulfato de quinino como referência, o qual

apresenta os máximos de excitação e emissão numa região muito próxima da

dos materiais obtidos.

A Tabela 4 mostra o valor médio obtido pela realização em triplicata

para cada amostra.

Tabela 4 – Rendimento quântico médio dos carbon dots obtidos utilizando-se glicose como

fonte de carbono.

Amostra Rendimento Quântico Médio (%)

Gli_A 4,4 ± 0,2

Gli_B 4,5 ± 0,2

Gli_C 4,4 ± 0,1

Gli_D 3,6 ± 0,3

Gli_E 5,8 ± 0,1

Gli_F 3,6 ± 0,1

Gli_G 4,7 ± 0,2

Gli_H 3,3 ± 0,1

Os valores de rendimento quântico determinados variam entre 3,3 e

5,8%, sendo coerentes com os valores descritos na literatura36; 40; 47; 53

utilizando-se glicose como fonte de carbono, os quais dificilmente ultrapassam

7%.



40

4.1.3 Planejamento Fatorial

Com o auxílio do software STATISTICA foi possível avaliar

estatisticamente quais variáveis interferem significativamente no valor do

rendimento quântico do material obtido, sendo possível otimizar as condições

de síntese.

A Tabela 5 apresenta os valores dos dados estatísticos utilizando um

limite de confiança de 95% (nível de significância = 0,05).

Tabela 5 – Dados estatísticos (limite de confiança de 95%) para o planejamento fatorial

sobre a síntese de carbon dots utilizando glicose como fonte de carbono.

Efeitos Erro t (16) p

Média das

interações 4,2917 0,0328 130,8101 0,000000

Tempo (1) 1,0667 0,0656 16,2560 0,000000

Temperatura (2) 0,5833 0,0656 8,8900 0,000000

Concentração

(3) -0,1667 0,0656 -2,5400 0,021840

1*2 -0,0333 0,0656 -0,5080 0,061838

1*3 -0,7500 0,0656 -11,4300 0,000000

2*3 -0,1333 0,0656 -2,0320 0,059101

1*2*3 -0,4167 0,0656 -6,3500 0,000010

Nota-se que tanto o aumento do tempo de reação como da temperatura

exercem uma influência positiva na síntese, contribuindo para um maior



41

rendimento quântico. Por outro lado, o aumento da concentração inicial dos

reagentes leva a uma diminuição do rendimento quântico. É interessante notar

também que os efeitos das interações de segunda ordem

(temperatura/concentração e tempo/temperatura) não são significativos, visto

que o valor de p calculado é maior do que o nível de significância 0,05. Além

disso, as interações tempo/concentração e tempo/temperatura/concentração

apresentam efeito negativo, evidenciando que o aumento da concentração

inicial dos reagentes contribui para a diminuição do rendimento quântico,

mesmo quando combinada com outro parâmetro.

Desta forma, é possível observar a condição otimizada de síntese

através de um gráfico contendo a superfície de resposta, no caso o rendimento

quântico, em função dos parâmetros de síntese (Figura 19).

Figura 19 – Superfície de resposta para otimização das condições de síntese.



42

Observa-se que o máximo de rendimento quântico é obtido utilizando

um maior tempo de síntese (6 h) e maior temperatura (160ºC) em conjunto

com uma menor concentração inicial de reagentes (2% massa/volume).

4.1.4 Espectroscopia de UV-Vis

O espectro UV-Vis das amostras obtidas a partir da glicose pode ser

observado na Figura 20.

Figura 20 – Espectro UV-Vis das soluções de carbon dots (glicose como fonte de carbono)

diluídas em água deionizada em concentração de 0,1 mg.mL-1

.

Observa-se que em todos os espectros há a presença de uma banda

intensa na faixa entre 260 e 280 nm, característica de transições π-π*, típica de



43

ligação C=C de aromáticos. Além disso, algumas amostras apresentam um

ombro em 340 nm característico de transições n-π*, típica de ligações C=O. A

observação destas duas bandas é um forte indicativo da formação dos carbon

dots43; 67; 68

.

4.1.5 Espectroscopia de Infravermelho

Os espectros de infravermelho obtidos para as diferentes amostras

apresentam grande similaridade, porém são muito diferentes do material de

partida, indicando a formação dos carbon dots. O espectro infravermelho de

carboidratos é muito complexo e de difícil interpretação, pois abaixo da região

de 1500 cm-1

há uma série de modos vibracionais das ligações C-H e C-O, que

são característicos do carboidrato em questão69; 70

. A Figura 21 apresenta o

espectro de infravermelho da glicose.

Figura 21 – Espectro de infravermelho da glicose em pastilha de KBr.



44

Além das bandas características abaixo de 1500 cm-1

, é possível

observar a presença de uma banda larga e intensa próximo de 3400 cm-1

referente ao estiramento da ligação O-H, além de bandas estreitas e de baixa

intensidade em 2949, 2915 e 2892 cm-1

referentes aos diferentes modos de

estiramento dos grupos C-H, C-H2 e O-C-H70

.

A Figura 22 apresenta os espectros das amostras Gli_A, Gli_B, Gli_C

e Gli_D os quais apresentam praticamente bandas na mesma região espectral.

Figura 22 – Espectro de infravermelho das amostras Gli_A, Gli_B, Gli_C e Gli_D em

pastilha de KBr.

Em todas as amostras nota-se claramente uma banda estreita e intensa

em 1600 cm-1

característica da vibração da ligação C=C polarizada pela

vizinhança, corroborando as transições eletrônicas observadas na



45

espectroscopia UV-Vis36

. Observa-se uma banda em 2931 cm-1

característica

do estiramento da ligação C-H. Ainda, a grande hidrofilicidade e estabilidade

coloidal das partículas pode ser atribuídas a grupos funcionais presentes na

superfície do material, como evidenciado pela banda em 3415 cm-1

característica do estiramento da ligação –OH, a banda de carbonila (C=O) em

torno de 1770 cm-1

e a banda em 1415 cm-1

típica de estiramento do íon

carboxilato (–COO-)

24; 53.

O espectro das demais amostras – Gli_E, Gli_F, Gli_G e Gli_H – pode

ser visualizado na Figura 23.

Figura 23 – Espectro de infravermelho das amostra Gli_E, Gli_F, Gli_G e Gli_H em

pastilha de KBr.



46

Observa-se que os espectros também são muito similares com os

espectros apresentados na Figura 22. A única diferença apreciável se dá na

ausência da banda em torno de 1770 cm-1

, característica do estiramento da

ligação C=O e na diminuição da banda em 1415 cm-1

referentes aos

estiramentos do íon carboxilato. Entretanto, as partículas continuam

apresentando alta solubilidade em meio aquoso e excelente estabilidade

coloidal, indicando a presença de grupos funcionais oxigenados em sua

superfície.

As diferenças observadas na Figura 23 nos ajudam a compreender o

motivo pelo qual as amostras Gli_E e Gli_G apresentam os maiores

rendimentos quânticos observados. Carbon dots submetidos a um tratamento

oxidante com permanganato de potássio (KMnO4), um agente oxidante que

converte grupos hidroxila em grupos carboxílicos e/ou carbonilas, tiveram sua

fluorescência suprimida71; 72

. Além disso, o caráter doador de elétrons dos

grupamentos hidroxila pode contribuir para o aumento da fluorescência73; 74

.

Ou seja, as condições de síntese nestas amostras podem ter favorecido a

conversão de grupos carboxílicos e carbonila em grupamentos hidroxila.

Ainda assim, as amostras Gli_F e Gli_H apresentaram um baixo

rendimento quântico. Apesar de não ter sido identificada a presença de grupos

carbonilas nestas amostras através da espectroscopia de infravermelho, é

necessária a utilização de uma técnica que seja mais quantitativa para

determinar com rigor a presença de diferentes grupos funcionais nos carbon

dots, como a espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios-X (XPS).



47

4.2 Obtenção dos Carbon Dots a Partir de Pectina

Com a intenção de verificar se o protocolo de síntese obtido é de fato

robusto e válido para outras fontes de carbono, utilizou-se a condição de

síntese otimizada (8 h de síntese, 160ºC e concentração de 2% em massa de

fonte de carbono) para a obtenção de carbon dots a partir de pectina. A pectina

é um carboidrato muito mais complexo do que a glicose. É um polissacarídeo

muito abundante e um dos principais resíduos da indústria de suco de frutas

cítricas, correspondendo a até 42,5% da massa do resíduo sólido gerado por

este tipo de indústria75

.

Após o tratamento hidrotérmico, obteve-se uma solução marrom, a

qual foi purificada segundo o mesmo protocolo utilizado para os carbon dots

obtidos a partir de glicose. Após a purificação, obteve-se uma solução

marrom/amarelada, a qual foi nomeada CdotPec.

As imagens de microscopia eletrônica de transmissão confirmam a

obtenção das partículas, conforme pode ser visualizado na a seguir:

Figura 24 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra CdotPec,

juntamento com o respectivo histograma de distribuição do tamanho das partículas.



48

A distribuição do tamanho de partículas foi realizado com o auxílio do

software ImageJ, contabilizando-se 150 partículas. Observa-se a formação de

partículas com formato aproximadamente esférico, sem a presença de

aglomerados, com tamanho médio de 8,4 ± 2,4 nm. Entretanto, a distribuição

de tamanhos é larga, sendo possível encontrar partículas com tamanho

variando de 4 a 16 nm.

Uma solução diluída em água deionizada da amostra foi levada ao

espectrofluorímetro e novamente observou-se uma fluorescência azul (Figura

25).

Figura 25 – Espectro de fluorescência da amostra CdotPec mostrando que a emissão em

430 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra

iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).



49

O espectro de excitação dos CdotPec é similar ao dos carbon dots

obtidos da glicose com máximo em 360 nm. Por outro lado, observa-se que o

máximo de emissão se dá em 430 nm, ou seja, houve um deslocamento para o

azul (blue-shift) em relação aos carbon dots de glicose. Novamente, observa-

se que a fluorescência não obedece a Equação 03. Segundo esta equação,

partículas grandes deveriam apresentar um red-shift na fluorescência.

Entretanto, os CdotPec apresentam um dos maiores tamanho médio

observados (8,4 ± 2,4 nm) e emitem no menor comprimento de onda (430 nm)

entre as amostras estudadas. Isso é um indicativo de que a origem da

fluorescência nos carbon dots é muito complexa e pode ser influenciada por

vários fatores.

Além disso, como pode ser observado na Figura 25, a emissão é

independente do comprimento de onda de excitação do material. Isso pode ser

um indicativo que os grupos funcionais presentes na superfície das partículas

sejam mais homogêneos, fazendo com que a emissão ocorra com um

comprimento de onda fixo. Esta homogeneidade é corroborada pelo menor

valor da largura à meia altura das bandas de excitação e emissão, os quais são,

respectivamente, de 55 e 73 nm.

É interessante destacar que os carbon dots obtidos a partir de pectina

são inéditos, haja vista que não há reportado na literatura a obtenção de

carbon dots utilizando tal fonte de carbono.

O rendimento quântico dos CdotPec foi determinado em 3,6 ± 0,2%, o

qual é próximo ao valor encontrado para os carbon dots de glicose. As

similaridades observadas nos carbon dots obtidos por diferentes fontes de

carbono (glicose e pectina) pode ser compreendida pelo fato dos materiais



50

pertencerem à mesma classe química: carboidratos. A diferente complexidade

de cada um – glicose, um monossacarídeo, e pectina, um polissacarídeo –

parece não influenciar no produto final, fazendo com o comportamento dos

diferentes materiais sejam bastante similares.

O espectro UV-Vis da amostra CdotPec também corrobora a formação

dos carbon dots, conforme observado na Figura 26:

Figura 26 – Espectro UV-Vis da solução de CdotPec diluída em água deionizada na

concentração de 0,1 mg.mL-1

.

Observa-se um pico intenso em 280 nm referente a transições π-π* de

compostos aromáticos e um ombro em torno de 340 nm característico de

transições n-π* de ligação C=O.



51

O espectro de infravermelho dos CdotPec e da pectina também são

muito distintos, corroborando a formação das nanopartículas, conforme pode

ser observado na Figura 27.

Figura 27 – Espectro de infravermelho da amostra CdotPec e do precursor pectina em

pastilha de KBr.

Novamente observa-se uma banda em 1625 cm-1

característica de

dupla ligação entre carbonos quando polarizadas pela vizinhança e uma banda

em 3440 cm-1

característica de estiramento da ligação –OH. Nota-se também a

ausência de bandas de carbonila e íons carboxilato, as quais estavam presentes

para algumas amostras dos carbon dots de glicose. Ainda assim, apesar da

menor quantidade de grupos funcionais oxigenados na superfície, os CdotPec



52

também apresentam boa estabilidade coloidal e elevada solubilidade em água.

4.3 Obtenção de Carbon Dots Contendo Nitrogênio

Com o auxílio do planejamento fatorial foi possível determinar as

condições de síntese que levam a obtenção de carbon dots com elevado

rendimento quântico. Entretanto, mesmo com as condições otimizadas, o

maior rendimento quântico obtido é relativamente baixo (5,8%) se comparado

com os tradicionais quantum dots inorgânicos. Desta maneira, algumas

estratégias são utilizadas para aumentar o rendimento quântico dos carbon

dots, destacando-se o tratamento ácido da superfície do material39; 76

,

passivação com polietilenoglicol12; 21; 68

e incorporação de outros elementos na

estrutura do material. Entre estes elementos, já foram reportados na literatura a

utilização de boro77

, nitrogênio26; 56; 78

, enxofre79; 80

e fósforo81; 82

.

A vantagem de incorporar outros elementos na estrutura do material se

dá pelo fato de, geralmente, não ser necessário aumentar o número de etapas

de síntese e a possibilidade de modificar o comprimento de onda no qual

ocorre a fluorescência56; 82

. Considerando estes aspectos, carbon dots foram

sintetizados na mesma condição da amostra Gli_E (8 h, 160ºC e 2% em massa

de glicose), utilizando-se glicose como fonte de carbono e adicionando-se 3

mL de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (TTDDA), cuja estrutura está

representada na Figura 28, o qual é uma conhecida e utilizada fonte de

nitrogênio para a síntese de carbon dots modificados51; 71; 83

. Esta quantidade

de TTDDA adicionada equivale a uma proporção em mol de glicose:TTDDA

de 1:2.



53

Figura 28 – Estrutula molecular do reagente 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina

(TTDDA).

O mesmo protocolo de síntese e purificação foi utilizado para a síntese

dos carbon dots contendo nitrogênio, os quais serão denominados

Gli_E_TTDDA. Após todos os tratamentos, obteve-se uma solução

marrom/amarelada. A análise por microscopia eletrônica de transmissão

confirma a obtenção das partículas, conforme evidencia a Figura 29, as quais

apresentam tamanho médio de 4,6 ± 1,0 nm, com a presença de alguns

aglomerados, os quais não foram observados na amostra Gli_E.

Figura 29 – Imagem de microscopia eletrônica de transmissão da amostra Gli_E_TTDDA,

juntamento com o respectivo histograma de distribuição do tamanho das partículas.



54

A amostra Gli_E_TTDDA também apresenta fluorescência azul, com

excitação no ultravioleta próximo. O máximo de excitação ocorre em 350 nm

e o máximo de emissão em 445 nm. O valor é muito próximo ao encontrado

para a amostra Gli_E, indicando que a incorporação de nitrogênio na estrutura

não altera o perfil de fluorescência do material. Novamente observa-se que a

emissão é dependente do comprimento de onda no qual ocorre a excitação.

Isso é esperado, visto que a amostra apresenta uma distribuição larga de

tamanho, com partículas variando de 2 a 7 nm. Além disso, espera-se que haja

diferentes traps de energia na superfície do material, que são excitados com

diferentes valores de energia e, consequentemente, emitem em diferentes

comprimentos de onda.

Figura 30 – Espectro de fluorescência da amostra Gli_E_TTDDA mostrando que a emissão

em 445 nm é independente do comprimento de onda da excitação (em detalhe a amostra

iluminada com luz branca (a) e sob luz UV (b) com comprimento de onda de 380 nm).



55

A observação da Figura 30 permite destacar que há outro máximo no

espectro de excitação em 295 nm, porém não há emissão apreciável quando a

amostra é excitada com este comprimento de onda. Fazendo a deconvolução

da curva de excitação, é possível observar que a largura à meia altura da banda

é de 95 nm e a largura à meia altura da banda de emissão é de 103 nm. Estes

valores elevados corroboram a hipótese de que a fluorescência é afetada pela

larga distribuição de tamanho das partículas e pela presença de diferentes

traps de energia na estrutura do material66

.

A incorporação de nitrogênio no material não causou mudanças

significativas nos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão do

material, porém observou-se um substancial aumento no rendimento quântico.

O valor determinado em triplicata foi de 13,2 ± 0,2%, o que corresponde a um

aumento de 2,3 vezes em relação à amostra Gli_E, a qual apresentou um

rendimento quântico de 5,8%.

O espectro de infravermelho da amostra Gli_E_TTDDA comprova a

incorporação de nitrogênio na estrutura do material, como pode ser

visualizado na Figura 31.

Observa-se uma banda larga e intensa em torno de 3400 cm-1

,

característica do estiramento da ligação –OH e uma banda intensa e estreita

em 1600 cm-1

, característica da ligação C=C polarizada pela vizinhança. É

interessante destacar que esta banda em 1600 cm-1

está sobreposta por outra

banda muito intensa e estreita em 1636 cm-1

referente ao modo de deformação

da ligação N-H55

. Além desta banda, outra banda bem estreita em 1350 cm-1

referente ao estiramento da ligação C-N78

e a banda estreita e intensa em 1115

cm-1

, característica do estiramento da ligação C-NH-C84

, confirmam a



56

incorporação de nitrogênio na estrutura do carbon dots.

Figura 31– Espectro de infravermelho das amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA em pastilha de

KBr.

O espectro UV-Vis da amostra Gli_E_TTDDA é apresentado na

Figura 32. Assim como a amostra Gli_E, a amostra Gli_E_TTDDA apresenta

uma banda em 280 nm característica de transições π-π* de ligações C=C de

compostos aromáticos e um ombro em 340 nm, referente à transições

eletrônicas do tipo n-π* de ligação C=O.

É interessante notar que as bandas não estão bem definidas,

possivelmente graças à presença de transições de grupos nitrogenados, os

quais também absorvem no ultravioleta, causando a sobreposição das bandas

observadas85

.



57

Figura 32 – Espectro UV-Vis da solução de Gli_E_TTDDA diluída em água deionizada na

concentração de 0,1 mg.mL-1

.

A influência do nitrogênio não é bem compreendida no aumento do

rendimento quântico dos carbon dots. Acredita-se que sua presença contribui

para a formação de defeitos e traps de energia que irão contribuir de maneira

cooperativa com o efeito de confinamento quântico para o aumento do

rendimento quântico do material78; 86

. Desta maneira, nota-se que a

incorporação de nitrogênio na estrutura dos carbon dots pode ser considerada

benéfica para a obtenção de partículas com maior fluorescência.

4.4 Aplicações Biológicas

Considerando a aplicação potencial dos carbon dots como sondas

fluorescentes para bioimagem celular37; 56; 57; 83; 87

, foram realizados ensaios



58

hemolíticos e testes de internalização celular, para garantir que os carbon dots

obtidos apresentam capacidade de utilização in vivo.

4.4.1 Ensaios Hemolíticos

As amostra Gli_E e Gli_E_TTDDA foram submetidas aos ensaios

hemolíticos pelo fato de apresentarem os maiores valores de rendimento

quântico entre as amostras obtidas. Estes ensaios são importantes para garantir

que o material não causa danos significativos às hemácias e, desta maneira,

possam apresentar potencial utilização em aplicações intravenosas.

Ambas as amostras não apresentaram hemólise. O rompimento das

hemácias provoca a liberação da hemoglobina na solução, o qual apresenta um

máximo de absorção em 540 nm. Entretanto, a leitura em triplicata da

absorbância em 540 nm foi nula em todas as concentrações testadas,

evidenciando que não houve hemólise provocada pelos carbon dots.

Tabela 6 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da amostra Gli_E em

diferentes concentrações.

Concentração

(mg.mL-1

)

Absorbância

(540 nm)

Concentração

(mg.mL-1

)

Absorbância

(540 nm)

C+ 0,4 0,375 0,0

C- 0,0 0,750 0,0

0,015 0,0 1,500 0,0

0,075 0,0 3,750 0,0

0,150 0,0



59

Na Tabela 6 a concentração C+ é o controle positivo no qual ocorre

100% de hemólise (hemácias em solução hipotônica – água deionizada) e a

concentração C- é o controle negativo no qual não ocorre hemólise (hemácias

em tampão DPBS – tampão fosfato-salino). Desta maneira, nota-se que houve

0% de hemólise em todas as concentrações testadas, as quais são

concentrações muito elevadas considerando quaisquer ensaios biológicos. A

observação visual das soluções centrifugadas também permite confirmar que

não houve hemólise, conforme a Figura 33.

Figura 33 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra Gli_E diluídas

em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico.

Observa-se que em todas as soluções houve a formação de um

precipitado de hemácias no fundo dos tubos e não houve alteração na



60

coloração das soluções, assim como ocorre no controle negativo.

O mesmo comportamento foi observado na amostra Gli_E_TTDDA,

conforme pode ser observado na Tabela 7.

Tabela 7 – Valores de absorbância em 540 nm no ensaio hemolíticos da amostra

Gli_E_TTDDA em diferentes concentrações.

Concentração

(mg.mL-1

)

Absorbância

(540 nm)

Concentração

(mg.mL-1

)

Absorbância

(540 nm)

C+ 0,8 0,375 0,0

C- 0,0 0,750 0,0

0,015 0,0 1,500 0,0

0,075 0,0 3,750 0,0

0,150 0,0

Novamente observa-se que houve 0% de hemólise em todas as

concentrações testadas. Dado confirmado pela observação visual das soluções

centrifugadas, conforme observado a seguir:



61

Figura 34 – Fotografia das soluções de diferentes concentrações da amostra Gli_E_TTDDA

diluídas em DPBS submetidas ao ensaio hemolítico.

Observa-se que todas as soluções mantiveram o mesmo aspecto do

controle negativo, com a formação de um precipitado de hemácias e sem

alteração de coloração das soluções. Ou seja, em todas as concentrações

testadas, não foi observada hemólise.

Este resultado concorda com o fato da literatura apresentar os carbon

dots como sistemas de baixa toxicidade. Além da baixa toxicidade, foi

reportado na literatura a internalização dos carbon dots pelas hemácias,

indicando que o material tem uma capacidade praticamente nula de destruir

este tipo de célula88

.



62

4.4.2 Internalização Celular

A fluorescência apresentada pelos carbon dots, aliada a sua baixa

toxicidade celular, fazem deste material um promissor agente de imagem para

marcador celular. Partindo-se desta premissa, ensaios de internalização foram

realizados como “prova de conceito”, avaliando a internalização dos carbon

dots em células HeLa, uma linhagem de células muito utilizado como modelo

para estudos de internalização22; 37

.

Os testes foram realizados com as amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA,

as quais apresentaram excelente comportamento frente aos ensaios

hemolíticos, reforçando seu potencial de utilização in vivo. A internalização

foi avaliada com o auxílio da microscopia confocal, entretanto só era possível

realizar a excitação em 405 nm, valor fora do máximo de excitação das

amostras. Ainda assim, as amostras apresentam fluorescência quando

excitadas neste comprimento de onda, porém a emissão ocorre em 500 nm,

conforme pode ser observado no Anexo A. Ou seja, com a excitação em 405

nm, observa-se que as amostras Gli_E e Gli_E_TTDDA emitem uma

fluorescência verde.

Conforme pode ser observado na Figura 35, não há comprovação da

internalização da amostra Gli_E. Uma vez que a excitação ocorreu fora da

região máxima da amostra, não é possível afirmar com segurança se houve ou

não internalização ou se não foi possível detectar sua fluorescência. É

interessante relembrar que o rendimento quântico da amostra Gli_E é

relativamente baixo e foi determinado com excitação em 360 nm. Ou seja,

fora do comprimento de onda máximo de excitação, o rendimento quântico



63

será ainda menor.

Figura 35 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com a amostra

Gli_E em um concentração de 100 µg.mL-1

, com excitação em 405 nm.

Além disso, a amostra Gli_E não foi funcionalizada com nenhuma



64

molécula que conferisse especificidade para a internalização das

nanopartículas pelas células HeLa. Por estas razões não é possível afirmar

categoricamente se houve internalização ou se a fluorescência não foi

detectada pela microscopia confocal.

Por outro lado, quando observamos as células HeLa incubadas com a

amostra Gli_E_TTDDA na Figura 36, notamos pequenas regiões dentro das

células emitindo uma fluorescência verde. Considerando que a amostra

Gli_E_TTDDA emite fluorescência verde quando excitada em 405 nm,

garante-se que houve a internalização do material.

O corante WGA-594 é um marcador para a membrana plasmática das

células HeLa, delimitando a extensão da célula. A sobreposição das imagens

(merge) de excitação da amostra Gli_E_TTDDA e do corante WGA-594

evidencia que as partículas estão no interior das células, comprovando a

internalização. Sendo assim, observa-se que a amostra Gli_E_TTDDA

apresenta grande potencial para ser utilizado como marcador celular, visto que

sua internalização foi observada mesmo sem a funcionalização do material,

fato que pode aumentar sua capacidade de marcação celular.



65

Figura 36 – Imagens de microscopia confocal de células HeLa incubadas com a amostra

Gli_E_TTDDA em um concentração de 100 µg.mL-1

, com excitação em 405 nm.

Entretanto, mesmo com a confirmação da internalização, há a

necessidade de se realizar ensaios com marcadores específicos de organelas

para compreender melhor quais delas participam no processo de internalização

e compreender melhor o processo de internalização celular como um todo.



66



67

5 Conclusões

Foi possível por meio de um planejamento fatorial elaborar um

protocolo de síntese robusto, que permite a obtenção de carbon dots utilizando

diferentes fontes de carbono. Nas condições de síntese otimizadas, carbon

dots obtidos a partir de glicose (amostra Gli_E) apresentaram um rendimento

quântico de 5,8% e tamanho médio de 4,1 nm. Carbon dots sintetizados a

partir de pectina (CdotPec) apresentam rendimento quântico de 3,6% e

tamanho médio de 8,4 nm. Ambas nanopartículas apresentaram fluorescência

azul, com um pequeno deslocamento no máximo de emissão.

Com o intuito de se obter nanopartículas com maior rendimento

quântico, carbon dots foram sintetizados com a incorporação de nitrogênio na

sua estrutura (Gli_E_TTDDA). O rendimento quântico foi elevado para

13,2%, um aumento de aproximadamente 2,5 vezes com relação aos carbon

dots sem a incorporação de nitrogênio. O perfil de fluorescência não foi

modificado, com excitação no ultravioleta próximo e emissão no azul. O

tamanho médio das partículas foi de 4,6 nm.

Vale ressaltar que com as técnicas de caracterização utilizadas –

espectroscopia de infravermelho, espectroscopia UV-Vis, fluorescência e

microscopia eletrônica de transmissão – não foi possível determinar a origem

da fluorescência das nanopartículas. Considerando as explicações descritas na

literatura, acredita-se que haja um efeito cooperativo entre traps de energia na

superfície dos carbon dots e efeito de confinamento quântico nas

nanopartículas que levam a fluorescência do material, porém não permitem a

previsão do seu perfil de fluorescência. Além disso, este efeito cooperativo



68

nos ajuda a compreender o motivo das bandas de emissão e excitação serem

alargadas, além do comprimento de onda máximo de emissão ser dependente

do comprimento de onda no qual ocorre a excitação.

Por fim, para garantir a potencial aplicação in vivo do material como

agente de imagem, testes hemolíticos mostraram que as amostras Gli_E e

Gli_E_TTDDA não causam hemólise. Além disso, comprovou-se que a

amostra Gli_E_TTDDA é internalizada por células HeLa, uma linhagem de

células amplamente utilizada como modelo para ensaios de internalização,

comprovando a capacidade das nanopartículas serem utilizadas como agente

de imagem.

É interessante observar que a amostra foi internalizada mesmo sem ser

funcionalizada com alguma molécula que confere especificidade para a

internalização e não é tóxica, haja vista que não apresentou hemólise. Ou seja,

o material obtido apresenta grande potencial para aplicações in vivo como

agente de imagem para determinadas linhagens de células.



69

6 Perspectivas

O estabelecimento de uma rota de síntese robusta, que permite a

obtenção de carbon dots a partir de diversas fontes de carbono é emblemático,

de alto impacto e elevada importância. Todavia, este trabalho – pioneiro na

ciência brasileira – abre novas e amplas perspectivas de pesquisas.

A origem da fluorescência dos carbon dots ainda é um desafio para

toda a comunidade científica. A compreensão deste fenômeno pode tornar

possível a modulação da fluorescência do material, assim como é observado

nos tradicionais quantum dots inorgânicos. Para tanto, técnicas mais

complexas de caracterização – espectroscopia de fotoelétrons de raios-X

(XPS), ressonância magnética de carbono 13 (RMN-C13

), espectrometria de

massas, entre outras – aliada a cálculos teóricos, podem trazer resultados

promissores. Uma extensiva caracterização estrutural de um material tão

pequeno e complexo também é um desafio, na qual a microscopia eletrônica

de transmissão de alta resolução pode contribuir com informações relevantes.

A incorporação de outros elementos além do nitrogênio na estrutura do

material pode levar a carbon dots com maior rendimento quântico e com

diferentes faixas espectrais de emissão e excitação.

A abundância de grupos funcionais oxigenados na superfície dos

carbon dots abre a possibilidade de funcionalização com moléculas que

confiram especificidade para o material atuar como marcador específico para

determinados grupos celulares. Além disso, é necessária uma investigação

mais refinada sobre o processo de internalização dos carbon dots, avaliando

quais organelas atuam ativamente neste processo.



70

Ensaios de genotoxicidade também são de grande relevância para

ampliar e concretizar a potencial aplicação in vivo dos carbon dots.

Sendo assim, nota-se que este trabalho inovador e pioneiro abre novas

possibilidades em várias áreas da química e da biologia. Efetivamente, os

estudos realizados são de grande importância, abrindo as portas e

estabelecendo uma nova plataforma de pesquisa, na qual, certamente, ainda

existem muitas e relevantes perguntas a serem respondidas.



71

Referências Bibliográficas

1 FEYNMAN, R. P. There's Plenty of Room at the Bottom. Engineering and

Science, v. 23, n. 5, p. 22-36, 1960.

2

ALVES, O. L. Cartilha sobre Nanotecnologia. Agência Brasileira de

Desenvolvimento Industrial (ABDI), 2010. 60 p.

3

RODUNER, E. Size matters: why nanomaterials are different. Chemical Society

Reviews, v. 35, n. 7, p. 583-592, 2006.

4

BUZEA, C.; PACHECO, I. I.; ROBBIE, K. Nanomaterials and nanoparticles:

Sources and toxicity. Biointerphases, v. 2, n. 4, p. 17-71, 2007.

5

DA SILVA, J. C. G. E.; GONCALVES, H. M. R. Analytical and bioanalytical

applications of carbon dots. Trac-Trends in Analytical Chemistry, v. 30, n. 8, p.

1327-1336, 2011.

6

FREESTONE, I. et al. The Lycurgus Cup - A Roman nanotechnology. Gold

Bulletin, v. 40, n. 4, p. 270-277, 2007.

7

KAWAMURA, G.; NOGAMI, M.; MATSUDA, A. Shape-Controlled Metal

Nanoparticles and Their Assemblies with Optical Functionalities. Journal of

Nanomaterials, v. 2013, Article ID 631350, 17 p., 2013.

8

POZNYAK, S. K. et al. Quantum dot chemiluminescence. Nano Letters, v. 4, n. 4,

p. 693-698, 2004.

9

ALIVISATOS, A. P. Semiconductor clusters, nanocrystals, and quantum dots.

Science, v. 271, n. 5251, p. 933-937, 1996.

10

SMITH, A. M.; NIE, S. Semiconductor Nanocrystals: Structure, Properties, and

Band Gap Engineering. Accounts of Chemical Research, v. 43, n. 2, p. 190-200,

2010.

11

ROMANO, R. Nanocompósitos e nanoestruturas de semicondutores das

famílias II-VI e IV-VI. 2007. 147 (Tese de Doutorado). Instituto de Química,

Universidade Estadual de Campinas, Campinas.

12

YANG, S. T. et al. Carbon Dots as Nontoxic and High-Performance Fluorescence

Imaging Agents. Journal of Physical Chemistry C, v. 113, n. 42, p. 18110-18114,

2009.

13

KROTO, H. W. et al. C-60 - Buckminsterfullerene. Nature, v. 318, n. 6042, p.



72

162-163, 1985.

14

IIJIMA, S. Helical Microtubules of Graphitic Carbon. Nature, v. 354, n. 6348, p.

56-58, 1991.

15

TIAN, L. et al. Nanosized Carbon Particles From Natural Gas Soot. Chemistry of

Materials, v. 21, n. 13, p. 2803-2809, 2009.

16

LU, A. H. et al. Chemical Synthesis of Carbon Materials With Intriguing

Nanostructure and Morphology. Macromolecular Chemistry and Physics, v. 213,

n. 10-11, p. 1107-1131, 2012.

17

XU, X. Y. et al. Electrophoretic analysis and purification of fluorescent single-

walled carbon nanotube fragments. Journal of the American Chemical Society, v.

126, n. 40, p. 12736-12737, 2004.

18

BAKER, S. N.; BAKER, G. A. Luminescent Carbon Nanodots: Emergent

Nanolights. Angewandte Chemie-International Edition, v. 49, n. 38, p. 6726-

6744, 2010.

19

HSU, P. C.; CHANG, H. T. Synthesis of high-quality carbon nanodots from

hydrophilic compounds: role of functional groups. Chemical Communications, v.

48, n. 33, p. 3984-3986, 2012.

20

CAO, L. et al. Carbon dots for multiphoton bioimaging. Journal of the American

Chemical Society, v. 129, n. 37, p. 11318-11319, 2007.

21

GONCALVES, H.; ESTEVES DA SILVA, J. C. G. Fluorescent Carbon Dots

Capped with PEG(200) and Mercaptosuccinic Acid. Journal of Fluorescence, v.

20, n. 5, p. 1023-1028, 2010. 22

SONG, Y. C. et al. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for

distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. Journal of

Materials Chemistry, v. 22, n. 25, p. 12568-12573, 2012.

23

LI, H. T. et al. Carbon nanodots: synthesis, properties and applications. Journal of

Materials Chemistry, v. 22, n. 46, p. 24230-24253, 2012.

24

LU, W. B. et al. Economical, Green Synthesis of Fluorescent Carbon Nanoparticles

and Their Use as Probes for Sensitive and Selective Detection of Mercury(II) Ions.

Analytical Chemistry, v. 84, n. 12, p. 5351-5357, 2012.

25

GUO, Y. M. et al. Hydrothermal synthesis of highly fluorescent carbon

nanoparticles from sodium citrate and their use for the detection of mercury ions.

Carbon, v. 52, p. 583-589, 2013.



73

26

SHA, Y. F. et al. Hydrothermal synthesis of nitrogen-containing carbon nanodots

as the high-efficient sensor for copper(II) ions. Materials Research Bulletin, v. 48,

n. 4, p. 1728-1731, 2013.

27

ZHU, S. J. et al. Highly Photoluminescent Carbon Dots for Multicolor Patterning,

Sensors, and Bioimaging. Angewandte Chemie-International Edition, v. 52, n.

14, p. 3953-3957, 2013.

28

HOU, X. et al. Carbon-dot-based fluorescent turn-on sensor for selectively

detecting sulfide anions in totally aqueous media and imaging inside live cells.

Nanotechnology, v. 24, n. 33, p. 335502-335510, 2013.

29

QIN, X. Y. et al. Green, low-cost synthesis of photoluminescent carbon dots by

hydrothermal treatment of willow bark and their application as an effective

photocatalyst for fabricating Au nanoparticles-reduced graphene oxide

nanocomposites for glucose detection. Catalysis Science & Technology, v. 3, n. 4,

p. 1027-1035, 2013.

30

XIAO, D. L. et al. Microwave assisted one-step green synthesis of fluorescent

carbon nanoparticles from ionic liquids and their application as novel fluorescence

probe for quercetin determination. Journal of Luminescence, v. 140, p. 120-125,

2013.

31

QU, S. N. et al. A Biocompatible Fluorescent Ink Based on Water-Soluble

Luminescent Carbon Nanodots. Angewandte Chemie-International Edition, v.

51, n. 49, p. 12215-12218, 2012.

32

YU, X. et al. Carbon quantum dots as novel sensitizers for photoelectrochemical

solar hydrogen generation and their size-dependent effect. Nanotechnology, v. 24,

n. 33, p. 335401-335407, 2013.

33

ZHOU, L.; HE, B. Z.; HUANG, J. C. Amphibious fluorescent carbon dots: one-step

green synthesis and application for light-emitting polymer nanocomposites.

Chemical Communications, v. 49, n. 73, p. 8078-8080, 2013.

34

BAO, L. et al. Electrochemical Tuning of Luminescent Carbon Nanodots: From

Preparation to Luminescence Mechanism. Advanced Materials, v. 23, n. 48, p.

5801-5806, 2011.

35

HU, S. L. et al. Laser synthesis and size tailor of carbon quantum dots. Journal of

Nanoparticle Research, v. 13, n. 12, p. 7247-7252, 2011.

36

LI, H. T. et al. One-step ultrasonic synthesis of water-soluble carbon nanoparticles



74

with excellent photoluminescent properties. Carbon, v. 49, n. 2, p. 605-609, 2011.

37

BHUNIA, S. K. et al. Carbon Nanoparticle-based Fluorescent Bioimaging Probes.

Scientific Reports, v. 3, 2013.

38

ZHAO, L. X. et al. Chemiluminescence of carbon dots under strong alkaline

solutions: a novel insight into carbon dot optical properties. Nanoscale, v. 5, n. 7, p.

2655-2658, 2013.

39

RAY, S. C. et al. Fluorescent Carbon Nanoparticles: Synthesis, Characterization,

and Bioimaging Application. The Journal of Physical Chemistry C, v. 113, n. 43,

p. 18546-18551, 2009.

40

PENG, H.; TRAVAS-SEJDIC, J. Simple Aqueous Solution Route to Luminescent

Carbogenic Dots from Carbohydrates. Chemistry of Materials, v. 21, n. 23, p.

5563-5565, 2009.

41

BOURLINOS, A. B. et al. Luminescent Surface Quaternized Carbon Dots.

Chemistry of Materials, v. 24, n. 1, p. 6-8, 2012.

42

MAITI, S.; DAS, K.; DAS, P. K. Label-free fluorimetric detection of histone using

quaternized carbon dot–DNA nanobiohybrid. Chemical Communications, v. 49, n.

78, p. 8851-8853, 2013.

43

JAISWAL, A.; GHOSH, S. S.; CHATTOPADHYAY, A. One step synthesis of C-

dots by microwave mediated caramelization of poly(ethylene glycol). Chemical

Communications, v. 48, n. 3, p. 407-409, 2012.

44

YU, C. et al. A fluorescent ratiometric nanosensor for detecting NO in aqueous

media and imaging exogenous and endogenous NO in live cells. Journal of

Materials Chemistry B, v. 1, n. 33, p. 4152-4159, 2013.

45

KWON, W.; RHEE, S. W. Facile synthesis of graphitic carbon quantum dots with

size tunability and uniformity using reverse micelles. Chemical Communications,

v. 48, n. 43, p. 5256-5258, 2012.

46

LU, X. W.; JORDAN, B.; BERGE, N. D. Thermal conversion of municipal solid

waste via hydrothermal carbonization: Comparison of carbonization products to

products from current waste management techniques. Waste Management, v. 32,

n. 7, p. 1353-1365, 2012.

47

HE, X. D. et al. Water soluble carbon nanoparticles: Hydrothermal synthesis and

excellent photoluminescence properties. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, v.

87, n. 2, p. 326-332, 2011.



75

48

HU, B. et al. Engineering Carbon Materials from the Hydrothermal Carbonization

Process of Biomass. Advanced Materials, v. 22, n. 7, p. 813-828, 2010.

49

TITIRICI, M. M.; ANTONIETTI, M. Chemistry and materials options of

sustainable carbon materials made by hydrothermal carbonization. Chemical

Society Reviews, v. 39, n. 1, p. 103-116, 2010.

50

ZHANG, B.; LIU, C. Y.; LIU, Y. A Novel One-Step Approach to Synthesize

Fluorescent Carbon Nanoparticles. European Journal of Inorganic Chemistry, v.

2010, n. 28, p. 4411-4414, 2010.

51

ZHANG, Z. et al. Protein as the source for synthesizing fluorescent carbon dots by

a one-pot hydrothermal route. Rsc Advances, v. 2, n. 23, p. 8599-8601, 2012.

52

LIANG, Q. H. et al. Easy synthesis of highly fluorescent carbon quantum dots from

gelatin and their luminescent properties and applications. Carbon, v. 60, p. 421-

428, 2013.

53

YANG, Z. C. et al. Intrinsically fluorescent carbon dots with tunable emission

derived from hydrothermal treatment of glucose in the presence of monopotassium

phosphate. Chemical Communications, v. 47, n. 42, p. 11615-11617, 2011.

54

YANG, Z. C.; LI, X.; WANG, J. Intrinsically fluorescent nitrogen-containing

carbon nanoparticles synthesized by a hydrothermal process. Carbon, v. 49, n. 15,

p. 5207-5212, 2011.

55

YANG, Y. H. et al. One-step synthesis of amino-functionalized fluorescent carbon

nanoparticles by hydrothermal carbonization of chitosan. Chemical


56

WU, Z. L. et al. One-pot hydrothermal synthesis of highly luminescent nitrogen-

doped amphoteric carbon dots for bioimaging from Bombyx mori silk - natural

proteins. Journal of Materials Chemistry B, v. 1, n. 22, p. 2868-2873, 2013. 57

SAHU, S. et al. Simple one-step synthesis of highly luminescent carbon dots from

orange juice: application as excellent bio-imaging agents. Chemical


58

YOSHIMURA, M.; BYRAPPA, K. Hydrothermal processing of materials: past,

present and future. Journal of Materials Science, v. 43, n. 7, p. 2085-2103, 2008.

59

BYRAPPA, K.; ADSCHIRI, T. Hydrothermal technology for nanotechnology.

Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials, v. 53, n. 2, p.

117-166, 2007.



76

60

TEOFILO, R. F.; FERREIRA, M. M. C. Chemometrics II: Spreadsheets for

experimental design calculations, a tutorial. Quimica Nova, v. 29, n. 2, p. 338-350,

2006.

61

MAO, X. J. et al. Study on the fluorescence characteristics of carbon dots.

Spectrochimica Acta Part a-Molecular and Biomolecular Spectroscopy, v. 75,

n. 2, p. 553-557, 2010.

62

ASTM. ASTM Standard E2504 - Standard Test Method for Analysis of

Hemolytic Properties of Nanoparticles: ASTM International 2013.

63

PAULA, A. J. et al. Suppression of the hemolytic effect of mesoporous silica

nanoparticles after protein corona interaction: independence of the surface

microchemical environment. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 23, n.

10, p. 1807-1814, 2012.

64

VINCI, J. C.; COLON, L. A. Fractionation of Carbon-Based Nanomaterials by

Anion-Exchange HPLC. Analytical Chemistry, v. 84, n. 2, p. 1178-1183, 2012.

65

VINCI, J. C. et al. Hidden Properties of Carbon Dots Revealed After HPLC

Fractionation. Journal of Physical Chemistry Letters, v. 4, n. 2, p. 239-243, 2013.

66

XIAO, D. et al. Microwave-assisted one-step green synthesis of amino-

functionalized fluorescent carbon nitride dots from chitosan. Luminescence, v. 28,

n. 4, p. 612-615, 2013.

67

ZHANG, R. et al. Preparation of high-quality biocompatible carbon dots by

extraction, with new thoughts on the luminescence mechanisms. Nanotechnology,

v. 24, n. 22, p. 225601-225608 2013.

68

SACHDEV, A. et al. A novel one-step synthesis of PEG passivated multicolour

fluorescent carbon dots for potential biolabeling application. Rsc Advances, v. 3, n.

38, p. 16958-16961, 2013.

69

VASKO, P. D.; BLACKWEL.J; KOENIG, J. L. Infrared and Raman Spectroscopy

of Carbohydrates .1. Identification of O-H and C-H-Related Vibrational Modes for

D-Glucose, Maltose, Cellobiose, and Dextran by Deuterium-Substitution Methods.

Carbohydrate Research, v. 19, n. 3, p. 297-310, 1971.

70

VASKO, P. D.; BLACKWEL.J; KOENIG, J. L. Infrared and Raman Spectroscopy

of Carbohydrates .2. Normal Coordinate Analysis of Alpha-D-Glucose.

Carbohydrate Research, v. 23, n. 3, p. 407-416, 1972.



77

71 TAN, M. Q. et al. Enhanced photoluminescence and characterization of multicolor

carbon dots using plant soot as a carbon source. Talanta, v. 115, p. 950-956, 2013.

72

TENG, P. et al. Chemiluminescence behavior of the carbon dots and the reduced

state carbon dots. Journal of Luminescence, v. 146, p. 464-469, 2014.

73

ZHENG, H. Z. et al. Enhancing the luminescence of carbon dots with a reduction

pathway. Chemical Communications, v. 47, n. 38, p. 10650-10652, 2011.

74

TIAN, R. X. et al. Tailoring surface groups of carbon quantum dots to improve

photoluminescence behaviors. Applied Surface Science, v. 301, p. 156-160, 2014.

75

RIVAS, B. et al. Submerged citric acid fermentation on orange peel

autohydrolysate. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, n. 7, p.

2380-2387, 2008.

76

LIU, H.; YE, T.; MAO, C. Fluorescent Carbon Nanoparticles Derived from Candle

Soot. Angewandte Chemie International Edition, v. 46, n. 34, p. 6473-6475,

2007.

77

SHAN, X. et al. B-doped carbon quantum dots as a sensitive fluorescence probe for

hydrogen peroxide and glucose detection. The Analyst, v. 139, n. 10, p. 2322-2325,

2014.

78

XU, Y. et al. Nitrogen-Doped Carbon Dots: A Facile and General Preparation

Method, Photoluminescence Investigation, and Imaging Applications. Chemistry-a

European Journal, v. 19, n. 7, p. 2276-2283, 2013.

79

DONG, Y. Q. et al. Carbon-Based Dots Co-doped with Nitrogen and Sulfur for

High Quantum Yield and Excitation-Independent Emission. Angewandte Chemie-

International Edition, v. 52, n. 30, p. 7800-7804, 2013.

80

KWON, W. et al. Sulfur-incorporated carbon quantum dots with a strong long-

wavelength absorption band. Journal of Materials Chemistry C, v. 1, n. 10, p.

2002-2008, 2013.

81

ZHOU, J. et al. Facile synthesis of P-doped carbon quantum dots with highly

efficient photoluminescence. Rsc Advances, v. 4, n. 11, p. 5465-5468, 2014.

82

WANG, W. et al. Water-soluble and phosphorus-containing carbon dots with

strong green fluorescence for cell labeling. Journal of Materials Chemistry B, v.

2, n. 1, p. 46-48, 2014.

83

DING, H. et al. Luminescent carbon quantum dots and their application in cell



78

imaging. New Journal of Chemistry, v. 37, n. 8, p. 2515-2520, 2013.

84

SHI, Q. Q. et al. High-yield and high-solubility nitrogen-doped carbon dots:

formation, fluorescence mechanism and imaging application. Rsc Advances, v. 4,

n. 4, p. 1563-1566, 2014.

85

YANG, Z. et al. Nitrogen-doped, carbon-rich, highly photoluminescent carbon dots

from ammonium citrate. Nanoscale, v. 6, n. 3, p. 1890-1895, 2014.

86

ZHANG, Y. Q. et al. One-pot synthesis of N-doped carbon dots with tunable

luminescence properties. Journal of Materials Chemistry, v. 22, n. 33, p. 16714-

16718, 2012.

87

LIU, J. H. et al. Fluorescent Carbon Dots and Nanodiamonds for Biological

Imaging: Preparation, Application, Pharmacokinetics and Toxicity. Current Drug

Metabolism, v. 13, n. 8, p. 1046-1056, 2012.

88

CHANDRA, S. et al. Synthesis, functionalization and bioimaging applications of

highly fluorescent carbon nanoparticles. Nanoscale, v. 3, n. 4, p. 1533-1540, 2011.



79

Anexo A

Figura 37 – Espectro de emissão da amostra Gli_E diluída em tampão PBS na concentração

de 0,5 mg.mL-1, com excitação em 405 nm.

Figura 38 – Espectro de emissão da amostra Gli_E_TTDDA diluída em tampão PBS na

concentração de 0,2 mg.mL-1, com excitação em 405 nm.

estudo da síntese de carbon dots via carbonização hidrotérmica...

Documents