EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS EN

LEVADURAS

Levaduras E. coliCel. Eucariotas superiores

Producción de proteínas biofarmaceúticas

Ferrer-Miralles et al. 2009, Microb. Cell Fact. 8,17.

Saccharomyces cerevisiae

Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad Levaduras transformacióna mitóticab Integrativo Yip ADN homólogo 102 > 1 0,1% Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable rADN rADN nd 100-200 Estable Episomal Replicación ARS 104 1-20 20% (YRp) Centromérico ARS/CEN 104 1-2 1% (YCp) Basados en 2µ ORI, STB, en 104 25 2-8% (YEp) huésped 2µ (Yep13) ORI, STB,REP1, REP2 104 50-100 0,6-1,8% FLP huésped 2µ0 (pJDB248) ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26% en huésped 2µ0 (pJDB219 ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20% D,FLP en huésped 2µ0

(pJB205) a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo

PLÁSMIDO 2 MICRONES

Vectores de Saccharomyces cerevisiae Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad Levaduras transformacióna mitóticab Integrativo Yip ADN homólogo 102 > 1 0,1% Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable rADN rADN nd 100-200 Estable Episomal Replicación ARS 104 1-20 20% (YRp) Centromérico ARS/CEN 104 1-2 1% (YCp) Basados en 2µ ORI, STB, en 104 25 2-8% (YEp) huésped 2µ (Yep13) ORI, STB,REP1, REP2 104 50-100 0,6-1,8% FLP huésped 2µ0 (pJDB248) ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26% en huésped 2µ0 (pJDB219 ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20% D,FLP en huésped 2µ0

(pJB205) a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo

Integración cromosómica de ADN por recombinación homóloga

Marcadores de selección

1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en cepas auxotróficas.

Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficaspara leucina, triptofano, uracilo e histidina

2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de cepas.

Ej: Tn903kanr: selección con G418DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamidaCmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol

Promotores y terminadores transcripcionales

Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables

Ej: PGK: fosfoglicerato quinasaGAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasaADH: alcohol deshidrogenasaSon inducidos varias veces por glucosa

Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados.Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa

Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL

Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2

Secreción de proteínas en Saccharomycescerevisiae

¿Para qué?

Plegamiento correctoEvitar efectos tóxicosFacilita la purificación

Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbicopropio de levaduras

MF1: feromonaSUC2: invertasaPHO5: fosfatasa ácida

MF1Proteína de 165 aa: prepro factor

Procesamiento: clivaje del péptido señalcorte de Lys-Arg por KEX2remoción de pares Glu-Ala por diaminopeptidasa STE1remoción de Lys-Arg terminal por KEX1

Construcción del gen para expresar en levaduras

• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción

• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentementeAAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción

• 3- Uso de codones propios del sistema

• 4- Usar ADNc

• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.

• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado

Expression of tetanus toxin fragment C in yeast: genesynthesis is required to eliminate fortuitous polyadenylationsites in AT-rich DNAMichael A.Romanos*, Andrew J.Makoff, Neil F.Fairweather, Katrina M.Beesley, Debbie E.Slater,Fred B.Rayment, Mike M.Paynel and Jeffrey J.ClareDepartments of Molecular Biology and 'Protein Chemistry, Wellcome Biotech, Langley Court,Beckenham, Kent BR3 3BS, UK. Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 7 1461, 1991

Northern blotting

Glicosilación de proteínas

• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgidonde los hidratos de carbono sufren modificacines

• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También ocurre O-Glicosilación.

• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150 manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones terminales 1-3 glicano

Transformación de levaduras

• Esferoplastos: remoción de la pared

• Litio, PEG

• Electroporación

•La mayoría son promotores constitutivos.

•Falta de promotores fuertes. El producto representa 1-5% del total de las proteínas producidas.

•Los promotores inducibles no producen grandes cantidades de mRNA cuando se desregulan.

•Inestabilidad plasmídica.

•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.

Problemas asociados a la producción en S. c.

Casi todos los productos derivados de levaduras que están en el mercado son producidos en Saccharomyces cereviciae

2009: la FDA apueba la 1era proteína biofarmaceútica producida en una levadura distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreínaproducida en Pichia pastoris por Dynax Inc.

LEVADURAS METILOTRÓFICAS

• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C

• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente escalable a grandes volúmenes de producción

• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles celulares.

• Sistema actualmente muy difundido

Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

Candida boidinii

Pichia methanolica

Pichia pastoris

Pichia pastoris

•Son las primeras enzimas del camino metabólico de metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.

•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de homología

•AOX esta constituída por un octámero de subunidadesidénticas a las que se le unen moléculas de FAD.

ALCOHOL OXIDASA

PEROXISOMA CITOSOL

CH3OHO2 AOX GSH FDH

H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2CATALASA FLDH NAD NAD

1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2Xu5P

GAP DHA 1/3 GAP constituyentes

DHA DHAP celularesATP

ADP FBP F6P

GAP P2

CH3OH

•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células compensan esta baja actividad catalítica sintetizando grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable, mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de las proteínas celulares solubles.

•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil

.

Peroxisomas

Vectores de expresión para Pichia pastoris

Inducción con metanol

Inducción con glucosa o glicerol

Inducción conmetil amina o metanol

Reemplazo génico

Integración del ADN en genoma

Inserción génicaRecombinación homóloga

Inserción génica en AOX

Reemplazo génico

Inserciones múltiples

Inserción génica en his4

Métodos de transformación de Pichia pastoris

Método Frecuencia de Conveniencia Integración transformación (por µg) múltiple

Esferoplastos 105 Baja Sí

Electroporación 105 Alta Sí

PEG1000 103 Alta No

LiCl 102 Alta No

Medio MD Medio MM

Muts

Muts

Mut +

Selección de cepas recombinantesHis+Mut+ e His+Muts

Confirmación por PCR y Southern blot

Selección de cepas recombinantesHis+Mut+ e His+Muts

MD MM

Selección de los clones recombinantes

MD

MD

MM

Caracterización del producto de expresión

SDS PAGE +/- DTT Western blot

Caracterización de la cepa productora

PCR: presencia y estabilidad del gen

Southern blot: Mut+/Muts

Dot Blot: Nº de copias del gen

PCR cuantitativa: Nº de copias del gen

Southern blot del gen de insulina

Southern blot del gen His4

C219 C146 GS115 C112 C27 25 C146

7.400 pb-5.800 pb-4.800 pb-

2.700 pb-

2.800 pb-

8.000 pb-

El ADN genómico de los distintos clones recombinantes (C219, C146, C112, C27 y 25) y de las levaduras sin transformar (GS115) fue digerido con la enzima BglII. La sonda empleada para determinar la presencia del gen HIS 4 corresponde a un fragmento de 1,5 Kb del mismo.

gen endógeno

Dot blot

25

B28.1

B13.3

B12.1

B110.3

F36

C27

F37

Insulina GPDH

GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS

El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos

GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS

1- N- GLICOSILACIÓN

2- O- GLICOSILACIÓN

Glicosilación de proteínas

• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgidonde los hidratos de carbono sufren modificacines

• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También ocurre O-Glicosilación.

• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150 manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones terminales 1-3 glicano

N- GLICOSILACIÓN

“Sequon”: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier aa menos Prolina

Asn

Se cortan las glucosas y una manosa α-1,2 y se transporta a Golgi en donde se adicionan otros azúcares y fosfato

Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas

La disposición del “sequon” en la estructura terciaria de la proteína es importante para la glicosilación:

“Competencia”: plegamiento vs. Glicosilación

Formación de puentes de H2

Cercanía a S-S (crecimiento de células con DTT)

Cercanía a COOH terminal (menos tiempo para glicosilarse)

Estabilidad de la estructura secundaria (pro péptido)

Disposición tridimencional de los sequones en la proteína, sobre todo cuando están cerca (glicosilación del 1º puede alterar al 2º)

Disponibilidad de precursores: oligosacárido dolicol, transferasa

La velocidad de síntesis de la proteína influencia el grado de glicosilación

Glicosilación y estabilidad de la proteína

En algunos casos la glicosilación confiere termoestabilidad: calor o frío

Puede conferir estabilidad estructural:Evitando proteólisisAyudando con el plegamiento correcto

Ser/Treo

α - manosa

α – 1,2 manosa

O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS

Sequon? Abundancia inusual de ser/treoProlinas cerca de ser/thraa cargados cerca de ser/treo

GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN LEVADURAS

El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del de mamíferos

Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras, pueden tener efectos inmunogénicos en humanos

Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras

TunicamicinaCepas mutantes

Enzimas para desglicosilarNo usar la vía de secreción

Mutagénesis dirigida

La productividad de un sistema recombinante estádeterminada por muchos factores genéticos y fisiológicos.

Posibles cuellos de botella:

Uso de codones

Número de copias del gen

Transcripción eficiente usando promotores fuertes

Señales de traducción

Translocación determinada por el péptido señal

Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi

Secreción

Proteólisis

A Single Mutation in the Activation Site of Bovine TrypsinogenEnhances Its Accumulation in the Fermentation Broth of the

Yeast Pichia pastorisJosé Hanquier,1 Yannick Sorlet,2 Dominique Desplancq,2 Laurence Baroche,2 Marc Ebtinger,3 Jean-François Lefèvre,2 Franc

Pattus,2 Charles L. Hershberger,1 and Alain A. Vertès3* Lilly Research Laboratories,Applied and Environmental Microbiology, February 2003, p. 1108-1113, Vol. 69, No. 2

Engineering of Pichia pastoris for Improved Production ofAntibody FragmentsBrigitte Gasser,1 Michael Maurer,1 Johannes Gach,1 Renate Kunert,1 Diethard Mattanovich1,2Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, No. 2, June 5, 2006

Retención de la cadena pesada, pero no de la liviana, del Fab a lo largo de la fermentación el plegamiento de la proteína y el ensamblado del dímero en el RE son pasos limitantes en la secreción del Fab

1- Uso de AOX1 vs GAP

2-

Efecto de la sobre expresión de HAC1 y PDI en la secreción del Fab

Cambio de escala

2.5 l Fermenters, with 1.5 l working

volume

50 mlShake-flask

cultures20 l Fermenters, with 15 l working

volume400 l Fermenters, with 300 l working

volume