fosfatasa acida

5/12/2018 FOSFATASA ACIDA - slidepdf.com

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ESTUDIO DE LOS PRINCIPALES FACTORES CINETICOS DE LA FOSFATASA ACIDA.

Experimento 1: Efecto del tiempo.

Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3 B4 4

Buffer acetato 0.1 M pH 5

p-Nitrofenilfosfato 1x10-2 M.

Agua destilada

Preincubar 2 min a 37oC (min)

Enzima

Incubar a 37oC (min)

NaOH 1N

1.0

0.2

0.8

-

1

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

1

3.0

1.0

0.2

0.8

-

2

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

2

3.0

1.0

0.2

0.8

-

5

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

5

3.0

1.0

0.2

0.8

-

10

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

10

3.0

UK Tubo UK Neta Ab Tiempo(min)

Concentración(µmol)

Velocidad(µmol/min)

102

195

103

236

107

320

105

405

B1

1

B2

2

B3

3

B4

4

93

133

213

300

0.186

0.266

0.426

0.600

1

2

5

10

10.33

14.77

23.66

33.33

0.051

0.074

0.133

0.166

La medida de la rapidez de reacción implica la medida de la concentración de uno de los reactivos o productos a

lo largo del tiempo, esto es, para medir la rapidez de una reacción necesitamos medir, bien la cantidad de

reactivo que desaparece por unidad de tiempo, o bien la cantidad de producto que aparece por unidad de

tiempo.

0

0.02

0.04

0.060.08

0.1

0.12

0.14

0.16

0.18

0 2 4 6 8 10 12

V l o

c i d a d

Tiempo (min)



Experimento 2: Efecto de la Concentración de enzima.

Tubo Nº B1 1 2 3 4

Buffer Acetato 0.1 M pH5

p-Nitrofenilfosfato

1X10

2

mAgua destilada

Preincubar 2 min a 37oC

Enzima

Incubar 3 mina 37OC

NaOH 1N

1.0

0.2

0.8

-

3.0

1.0

0.2

0.75

0.05

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

3.0

1.0

0.2

0.65

0.15

3.0

1.0

0.2

0.6

0.2

3.0

Tubo Uk UK neta Ab [E] Concentración

(µmol)

Velocidad

(µmol/min)

B1

12

3

4

65

14

5224

248

380

80159

183

315

0.1600.318

0.366

0.630

0.050.1

0.15

0.2

8.8917.67

20.33

35.00

0.014

70.0295

0.0339

0.0583

La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración de la enzima a cualquier

concentración de substrato. Por ejemplo, si la concentración de enzima es disminuida a la mitad, la velocidadinicial de la reacción (v0) es reducida también a la mitad de la original

Con respecto a la concentración de la enzima la grafica obtenida expresa que la máxima velocidad de reaccion

obtenida en la experimentación realizada se nota cuando agregamos de .4 a .5 así observamos con nuestro

fundamento que también se cumple con lo esperado donde la mayor velocidad de reaccion es cuando hay una

elevada cantidad de enzimas.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

V e l o

c i d a d

[E]



Experimento 3: Efecto del pH

Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3



Buffer acetato 0.1 M pH 8p- Nitrofenilfosfato 1 x102 M

Agua destilada

Preincubar 2 min a 37 OC

Enzima

Incubar 3 min a 37 OC

NaOH 1N

1.0

-

-0.2

0.8

0.1

3.0

1.0

-

-0.2

0.7

0.1

3.0

-

1.0

-0.2

0.8

0.1

3.0

-

1.0

-0.2

0.7

0.1

3.0

-

-

1.00.2

0.8

0.1

3.0

-

-

1.00.2

0.7

0.1

3.0

Tubo Nº UK UK neta Ab pH Concentració

n

(µmol)

Velocidad

(µmol/min)

B1

1

2

3

40

160

42

30

20

141

25

12

0.040

0.282

0.50

0.024

3

5

8

10

2.22

15.69

2.78

13.33

0.004

0.026

0.065

0.022

Afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas

no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos

disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay

pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede

afectar de dos maneras:

- La unión del sustrato es mejor o peor que antes.

- Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción.

Al observar la grafica realizada en el pH nos damos cuenta que el punto

donde se nota el mejor rendimiento de la enzima con respecto al pH es

de 8



Experimento 4: Efecto de la Temperatura.

Tubo Nº B1 1 B2 2 B3 3


p-Nitrofenil fosfato 1x 102M

Agua destilada

Preincubar 2 min a 37 O C

Enzima

Incubar 3 min

NaOH 1N

1.0

0.2

0.8

0.1

20

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

20

3.0

1.0

0.2

0.8

0.1

37

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

37

3.0

1.0

0.2

0.8

0.1

60

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

60

3.0

Tubo Nº UK UK neta Ab T OC Concentración

(µmol)

Velocidad

(µmol/min)

B1

1

2

3

64

128

340

168

51

107

383

87

0.202

0.214

0.626

0.174

20

30

60

80

5.67

11.89

33.67

9.67

0.009

0.020

0.056

0.016

Las velocidades de reacción son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las reacciones

biomoleculares, un aumento de 10º C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para explicar este hecho se

postuló que al acrecentar la temperatura aumenta la fracción de moléculas capaces de tener una energíasuficiente para alcanzar un "estado activado" que luego se transforme en producto de la reacción por formación

o ruptura de enlaces químicos.

0

0.01

0.020.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0 2 4 6 8 10 12

V e l o c i d a d

pH



Experimento 5: Efecto de la concentración de sustrato.

Conc. Inicial de p-NO2 1 x 10-2 M 1 x 10-3 M

Conc. final de p-NO2 1x10-3 B 5x 10-4 B 2x10-4 B 1x10-4 B 5x 10-5


p-NO2

Agua destilada

Preincubar 2 min a 37O

C

Enzima

Incubar 3 min

NaOH 1N

1.0

0.2

0.7

0.1

3.0

1.0

0.2

0.8

-

3.0

1.0

0.1

0.8

0.1

3.0

1.0

0.1

0.9

-

3.0

1.0

0.1

0.5

0.1

3.0

1.0

0.1

0.6

-

3.0

1.0

0.2

0.7

0.1

3.0

1.0

0.2

0.8

-

3.0

1.0

0.1

0.8

0.1

3.0

1.0

0.1

0.9

-

3.0

Blanco Uk

Blanco

UK T UK

neta

Ab [S]

x10-4

1/[S]

x10-4

Concentración

(µmol)

Velocidad

(µmol/min)

1/Vel.

B1

B2

B3

B4

B5

21

13

8

5

1

163

154

126

97

65

1

2

3

4

5

142

141

118

92

64

0.284

0.282

0.296

0.184

0.128

10

5

2

1

0.5

0.1

0.2

0.5

1

2

15.78

15.67

13.11

10.22

7.11

0.026

0.026

0.022

0.017

0.012

38.02

38.31

45.45

58.82

83.33

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0 20 40 60 80 100

V e l o c

i d a d

T OC



b= 1/Vmax

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0 2 4 6 8 10 12

V e l o

c i d a d

[S]

y = 24.495x + 34.17

R² = 0.9976

0

10

20

30

40

50

60

7080

90

0 0.5 1 1.5 2 2.5

1 / V

1/[S]



Haciendo Regresión lineal:

y = 24.495x + 34.17

R² = 0.9976

Entonces Vmax = 1/31.17 = 0.029µmol/min

Km= -1/Km = 1.395 µmol



Cuestionario.

1. Describa el mecanismo de la reacción de la fosfatasa acida.

Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto artificial: p-Nitrofenil-fosfato que, al

poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser reconocido por la enzima.

El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol, compuesto coloreado que en soluciónalcalina absorbe a una longitud deonda de 405 nm, por lo que su aparición en el transcurso de la

reacción puede seguirse colorimétricamente. Para detener la reacción se añadirá fosfato, ya que el

exceso de este producto de la reacción inhibe la actividad enzimática.

2. Cuál es el Km, Vmax y pH óptimo obtenido para la fosfatasa acida. Cuál es su significado.

V max = 0.029µmol/min

Km= 1.395 µmol

pH optimo 8

Estos datos nos indican las condiciones a las cuales la enzima tiene mejor eficiencia

3. Se ha determinado la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente para diversas

concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes:

[S] (µmol/L) V [(µmol/L)min] 1/[S] 1/V

5

10

20

50

100

200

22

39

65

102

120

135

0.2

0.1

0.05

0.02

0.01

0.005

0.045

0.026

0.015

0.009

0.008

0.007

a) Estime Vmax y Km usando las representaciones graficas de Michaellis-Menten



En esta forma de cálculo se representa 1/V frente a 1/[S], obteniéndose una recta cuya intersección con

el eje X es 1/Km y con el eje Y es 1/Vmax, siendo la pendiente Km/Vmax.

Vmax = 175.44

Km = 34.61

b) Calcule Kcat/Km

4. El efecto de la temperatura en la hidrolisis de la lactosa mediante una -galactosidasa se muestra a

continuación. Calcular la energía de activación y también Q 10.(Q 10)t = Vt+10/Vt

T OC T (K) Vmax

(µM/min/mg proteína)

(Q 10)t = Vt+10/Vt Ln V 1000/T

20

30

35

40

45

293

303

308

313

318

4.50

8.65

11.80

15.96

21.36

1.92

0.54

1.81

1.50

2.16

2.47

2.77

3.06

3.41

3.30

3.25

3.19

3.14

Pendiente: m= -Ea/RT Ea : energía de activación

-5.76 = -Ea/(1,9872 cal K-1mol-1)(298K)

-5.76 = Ea/ 592.1856

Ea = 3,411 Kcal K-1mol-1

y = 0.1973x + 0.0057

R² = 0.9988

0

0.005

0.01

0.015

0.02

0.025

0.03

0.035

0.04

0.045

0.05

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

1 / V

1/[S]



5. Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y en presencia de un

inhibidor. La velocidad inicial viene dada en función de la concentración del sustrato en la siguiente

tabla.

V[mmol/L)-1

min-1

[S](mmol/L) Sin inhibidor Inhibidor A Inhibidor B 3mM Inhibidor B 5mM

1.25

1.67

2.5

5.00

10.00

1.72

2.04

2.63

3.33

4.17

0.98

1.17

1.47

1.96

2.38

1.25

1.54

2.00

2.86

3.7

1.01

1.26

1.72

2.56

3.49

1/V[mmol/L)-1 min-1

1/[S](mmol/L) Sin inhibidor Inhibidor A Inhibidor B 3mM Inhibidor B 5mM

0.80

0.60

0.40

0.20

0.10

0.58

0.49

0.38

0.30

0.24

1.02

0.85

0.68

0.51

0.42

0.8

0.65

0.50

0.35

0.27

0.99

0.79

0.58

0.39

0.29

Sin Inhibidor Inhibidor A Inhibidor B 3mM Inhibidor B 3mM

Vmax 5.12 2.97 5.08 5.33

Km 2.5 2.54 3.83 5.33

Inhibidor competitivo (Km alterada y la Vmax. es igual). Por los métodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-

Burk

y = -5.7608x + 21.161

R² = 0.9988

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

3.1 3.15 3.2 3.25 3.3 3.35 3.4 3.45

L n V

1000/T (1/K)



y = 0.4823x + 0.1954

R² = 0.9977

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1 / V

1/[S]

Sin Inhibidor

y = 0.7549x + 0.197

R² = 0.9999

0

0.1

0.2

0.30.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1 / V

1/[S]

Inhibidor B 3mM

y = 0.8549x + 0.337

R² = 0.9999

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1 / V

1//[S]

Inhibidor A



y = 1.0006x + 0.1877

R² = 0.99980

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1 / V

1/[S]

Inhibidor B 5mM

fosfatasa acida

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