extraccion purificacion dna
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ExtracciExtraccióón y purificacin y purificacióón n de ADNde ADN
Bioq. Florencia LongoBioq. Florencia Longo
Laboratorio de DetecciLaboratorio de Deteccióón de OGM n de OGM Instituto de BiotecnologInstituto de Biotecnologíía a –– INTAINTA
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Pasos del AnPasos del Anáálisis de lisis de OGMsOGMs
INFORMEINFORME
MuestraMuestra ExtracciExtraccióónnde ADNde ADN PCRPCR
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PreparaciPreparacióón de la muestra para la n de la muestra para la extracciextraccióón de ADNn de ADN
Cantidad de muestraCantidad de muestra
Grado de homogenizaciGrado de homogenizacióónn
TamaTamañño de parto de partíículacula
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ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN
ObjetivoObjetivo
CantidadCantidadIntegridadIntegridad
PurezaPurezaAusencia de contaminacionesAusencia de contaminaciones
PCRPCR
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ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN
Tipo de muestraTipo de muestraTargetTarget a analizara analizarGrado de procesamiento de la muestraGrado de procesamiento de la muestraTipo de anTipo de anáálisis requeridolisis requeridoResultados deseadosResultados deseados
Tener en cuentaTener en cuenta
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ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN
Tipo de muestras a analizarTipo de muestras a analizar
AlimentosAlimentos
Granos Granos
SemillasSemillas
HarinasHarinas
HojasHojas
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ExtracciExtraccióón de ADN n de ADN
PequePequeññososTamaTamañño o frag.ADNfrag.ADNMedianosMedianos
Mediana a Mediana a altaalta
Presencia de Presencia de inhibidoresinhibidores
BajaBaja
ComplejosComplejosProtocolos Protocolos extracciextraccióónn
SencillosSencillos
AltaAltaHomogenizaciHomogenizacióónnBajaBaja
BajaBajaCantidadCantidadAltaAltaBajaBajaCalidadCalidadAltaAlta
AlimentosAlimentosCaracterCaracteríísticassticasGranosGranos
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ExtracciExtraccióón de ADN de n de ADN de Alimentos Alimentos
Distintos Distintos tratamientostratamientos
FFíísico sico QuQuíímico mico EnzimEnzimááticotico
Distintos y mDistintos y múúltiples ltiples ingredientesingredientes
Cremas Cremas Salsas, especiasSalsas, especiasAzAzúúcarescaresSales, etc.Sales, etc.
DisminuciDisminucióón en la calidad y cantidad de ADNn en la calidad y cantidad de ADNPresencia de inhibidores de PCRPresencia de inhibidores de PCR
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Pasos de los mPasos de los méétodos de todos de ExtracciExtraccióón de ADNn de ADN
PrePre--tratamientotratamientoNeutralizaciNeutralizacióón (muestras n (muestras áácidas) cidas) Tratamiento con solventes orgTratamiento con solventes orgáánicos (grasas)nicos (grasas)
Lisis celularLisis celularDisrupciDisrupcióón mecn mecáánicanicaAgente quAgente quíímicosmicos
PurificaciPurificacióón de ADNn de ADNPrecipitaciPrecipitacióónnMatrices (Matrices (kitskits comerciales)comerciales)
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ExtracciExtraccióón de ADNn de ADNLisis celularLisis celular
Detergentes Detergentes SDS, CTABSDS, CTABEDTAEDTADigestiDigestióón n enzimenzimááticatica proteinasas, RNAsas, proteinasas, RNAsas,
amilasas, etcamilasas, etc
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ExtracciExtraccióón para n para remover contaminantesremover contaminantesFenolFenolCloroformoCloroformo
PrecipitaciPrecipitacióónnSustancias Sustancias coco--precipitantes (CTAB, PVP)precipitantes (CTAB, PVP)
PrecipitaciPrecipitacióón final con n final con IsopropanolIsopropanol y/oy/oetanol etanol
PurificaciPurificacióón de ADNn de ADNMMéétodos tradicionalestodos tradicionales
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PurificaciPurificacióón de ADNn de ADNMMéétodos comerciales todos comerciales
MetodoMetodo basados en basados en silicasilica
Columnas de Columnas de silicasilicaAgentes Agentes caotrcaotróópicospicosElusiElusióón con n con isopropanolisopropanol/etanol/etanol
ADNADN
ADN ADN purificadopurificado
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ElecciEleccióón del mn del méétodo de todo de extracciextraccióónn
Tipo de muestra Tipo de muestra TargetTarget a detectara detectarGrado de pureza requeridaGrado de pureza requeridaCantidad de ADN Cantidad de ADN RendimientoRendimientoIntegridad requeridaIntegridad requeridaPresencia de inhibidoresPresencia de inhibidores
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ElecciEleccióón del mn del méétodo de todo de extracciextraccióónn
Capacidades del laboratorio Capacidades del laboratorio Cantidad de muestras a analizarCantidad de muestras a analizarFacilidades de usoFacilidades de usoRepetibilidadRepetibilidadAplicaciones Aplicaciones Tiempo de anTiempo de anáálisislisisCostosCostos
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Resultados de la extracciResultados de la extraccióón n
Incluir siempre Incluir siempre CONTROLESCONTROLES
PositivosPositivos
Muestras positivasMuestras positivas
NegativosNegativos
Blanco de reactivosBlanco de reactivosBlanco de muestrasBlanco de muestras
Chequeo de ausencia Chequeo de ausencia de inhibicide inhibicióónn
Muestras positivasMuestras positivas
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Resultados de la extracciResultados de la extraccióón n
Resultado Resultado esperadoesperado
Falsos positivosFalsos positivos
ContaminacionesContaminaciones
Falsos negativosFalsos negativos
ADN degradado resultado ADN degradado resultado del procesamiento del procesamiento
ADN degradado resultado ADN degradado resultado de la extraccide la extraccióónn
Presencia de inhibidoresPresencia de inhibidores
óó
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Inhibidores de PCR Inhibidores de PCR
En los alimentosEn los alimentos
ProteProteíínasnasPolisacPolisacááridosridosGrasasGrasasSalesSalesÁÁcidoscidos
MMéétodo de extraccitodo de extraccióónn
DetergentesDetergentesFenol Fenol Residuos orgResiduos orgáánicos nicos EDTA EDTA EtanolEtanolIsopropanolIsopropanolSales Sales
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EvaluaciEvaluacióón del ADN extran del ADN extraíídodo
EspectrofotometrEspectrofotometríía (260/280 a (260/280 nmnm))EvalEvalúúo cantidad de ADNo cantidad de ADNNo evalNo evalúúo calidado calidad
Electroforesis/ Bromuro de Electroforesis/ Bromuro de etidioetidioEvalEvalúúo cantidad de ADN o cantidad de ADN EvalEvalúúo calidad (degradacio calidad (degradacióón, presencia de n, presencia de
RNA)RNA)
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EvaluaciEvaluacióón del ADN extran del ADN extraíídodo
FluorometrFluorometrííaaEvalEvalúúo cantidado cantidadNo evalNo evalúúo calidado calidad
PCR de genes endPCR de genes endóógenos genos EvalEvalúúo cantidad de ADN o cantidad de ADN EvalEvalúúo calidado calidadMatrices con poco DNAMatrices con poco DNA
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Muchas gracias Muchas gracias por su atencipor su atencióónn
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InformaciInformacióón de contacton de contactoLaboratorio de DetecciLaboratorio de Deteccióón de n de OGMsOGMsInstituto de BiotecnologInstituto de Biotecnologíía a –– INTAINTA
Contactos: Contactos: Dr. Esteban Dr. Esteban HoppHopp
Bioq. Florencia LongoBioq. Florencia Longo
TelTelééfono: (54fono: (54--11) 462111) 4621--1278/1447 1278/1447
EE--mail: mail: [email protected]@[email protected]@cicv.inta.gov.ar