facolta’ di science ff mm nn – chimica analitica e clinica trattamento dei fluidi biologici...

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TRATTAMENTO DEI FLUIDI BIOLOGICI

FLUIDI BIOLOGICI

• Volume totale 7-8% del peso corporeo 5-6 L di sangue in un

individuo di 70 Kg

• Componenti

Parte corpuscolata: eritrociti, leucociti, piastrine

Parte liquida: plasma

• Coagulazione / Sedimentazione

• Valore ematocrito (%) =

Sangue

X 100volume corpuscoli

volume totale

Componente Valori

Eritrociti U 4.5-5.9*1012/LD 4.1-5.1*1012/L

Reticolociti 25-100*109/L

Piastrine 150-450*109/L

Globuli Bianchi 4-10*109/L

Granulociti neutrofili 2-7*109/L

Granulociti eosinofili 0.1-0.2*109/L

Granulociti basofili 1-2*106/L

Linfociti 1-4.5*109/L

Monociti 0.1-0.8*109/L

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FLUIDI BIOLOGICI

• Valore ematocrito (%) =

Sangue

X 100volume corpuscoli

volume totale

45%

Normale

< 45%

Anemia

> 45%

Policitemia

> 45%

Leucemia

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FLUIDI BIOLOGICI

• Plasma– 90% di Acqua

– 10% di Sostanze solide

Sostanze solide del plasma

Proteine semplici

Albumina (69 kDa), 45 g/L, 21.8 mmHg

Globuline (1, 2, , ) (140 kDa), 25 g/l, 6.0 mmHg

Fibrinogeno (400 kDa), 3 g/l, 0.2 mmHg

Proteine coniugate (lipoproteine e glicoproteine)

Enzimi

Sali inorganici

• Siero– Plasma senza Fibrinogeno

Plasma e Siero

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FLUIDI BIOLOGICI

Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica

Il plasma è uno tra i fluidi biologici analizzati più frequentemente a scopi diagnostici perché riflette l’attività di altri organi e la sua composizione non è modificata sostanzialmente da una propria attività metabolica

La misura delle variazioni dell’attività di enzimi plasmatici può essere utilizzata, oltre che per la diagnosi, anche a scopo prognostico

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FLUIDI BIOLOGICI

Proteine plasmatiche e Diagnosi clinica

• Proteine semplici– Cirrosi epatica: diminuita sintesi di albumina

– Nefrosi: eliminazione di albumina nelle urine

– Anomalie ereditarie: incapacità di sintetizzare proteine plasmatiche (fibrinogeno, -globuline, albumina)

• Enzimi– Tumore prostatico: aumentata fosfatasi alcalina

– Pancreatiti: aumentata amilasi

– Distrofia muscolare: aumentate aldolasi e creatina chinasi

– Infarto del miocardio: aumentate GOT, LDH, MDH

– Danni epatici: aumentati isoenzimi del LDH

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FLUIDI BIOLOGICI

• Volume delle 24 ore nell’adulto– 1200 – 1500 mL (600 mL < normali < 2000 mL)

• Poliuria (> 2000 mL / 24 ore)– Diabete insipido (mancato riassorbimento tubulare dell’acqua)

– Insufficienza renale cronica (persa capacità di concentrare l’urina)

• Oliguria (< 600 mL / 24 ore)– Disidratazione

– Glomerulonefrite

Urina

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• Colore– Normale: giallo-paglierino, giallo-ambra, giallo

– Anormale: giallo-verdognolo, rosso-giallastro, rosso-bruno, …

• Limpidezza / Torbidità

• pH– Normalmente acido (5.5 – 6.5)

– pH < 5.0: acidosi diabetica, metabolica, respiratoria

– pH > 7.0: alcalosi metabolica, respiratoria

• Densità o peso specifico– Normalmente d = 1.016 – 1.022

40 – 70 g / 24 ore (urea, creatinina, cloruri, fosfati, solfati)

– Valori elevati: diabete mellito (aumento di glucosio), oliguria

– Valori bassi: diabete insipido, nefrite cronica

Urina

FLUIDI BIOLOGICI

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FLUIDI BIOLOGICI

• Liquido denso e viscoso di colore variabile dal giallo, al bruno, al verde coinvolto nel metabolismo dei lipidi (sali biliari)

• Volume giornaliero di 500 – 1000 mL

• Produzione nel fegato / Accumulo nella colecisti

• Prelievo mediante sondaggio duodenale (bile coledoica, colecistica, epatica)

• Studio della funzionalità della colecisti e delle vie biliari

• Cristalli di colesterolo (calcolosi biliare di colesterolo)

Bile

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• Volume– ~ 25 mL alla 10a settimana di gravidanza

– 800 – 1000 mL al termine

• Alla sua formazione contribuiscono:– Urine fetali (dalla 20a settimana)

– Secreti dell’albero tracheo-bronchiale, delle ghiandole salivari, della mucosa buccale

– Secrezioni dell’apparato respiratorio (fasi avanzate)

• L’analisi del liquido amniotico è di grande importanza dal punto di vista clinico perché consente di studiare lo stato e lo sviluppo del feto

Liquido amniotico

FLUIDI BIOLOGICI

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• Alfa-fetoproteina (AFP)– Diminuisce a partire dalla 14a settimana fino alla fine della gravidanza

– Utilizzata per determinare con una certa accuratezza l’età del feto

– Valori elevati di AFP sono presenti nel caso di difetti del tubo neurale

• Fosfolipidi (fosfatidilcolina / sfingomielina)– Indice di maturità polmonare fetale

– Valore massimo alla 38a settimana

• Creatinina– Indice di maturità fetale (sviluppo delle masse muscolari e maturazione del

rene)

– Valore soglia di maturità fetale: 2 mg / dL

Analiti nel liquido amniotico

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• Liquido viscoso, opalescente prodotto dalle ghiandole salivari

• Volume giornaliero di 1000 – 1500 mL

• pH compreso tra 6 e 7

• Principali componenti organici: ptialina (-amilasi) e mucina

• Attraverso le ghiandole salivari vengono escrete sostanze di natura farmacologica, sostanze tossiche (es. sali di mercurio e piombo), ormoni (es. cortisolo) e virus (es. rabbia)

Saliva

FLUIDI BIOLOGICI

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• Raccolte patologiche di liquido in cavità preformate rivestite di epitelio

• Principali cavità: pleurica, peritoneale, pericardica

• I trasudati si formano per ragioni idrodinamiche che provocano fuoriuscita della parte liquida del sangue (es. ascite nella cirrosi epatica)

• Gli essudati si formano per vasodilatazione attiva dei capillari in corso di processi infiammatori. Si ha fuoriuscita non solo di plasma, ma anche di cellule (leucociti)

• Analisi di versamenti cavitari– Ricerche batteriologiche

– Ricerche parassitologiche (es. echinococco nella cavità pleurica)

– Ricerca di cellule neoplastiche

Versamenti cavitari

FLUIDI BIOLOGICI

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CAMPIONAMENTO, PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI BIOLOGICI

• Queste fasi sono molto importanti da un punto di vista analitico

• La attendibilità del dato analitico finale, quindi la sua qualità, dipende non solo dalla “bontà” del metodo utilizzato e dalla qualità di esecuzione del metodo stesso, ma anche dalla appropriatezza delle modalità di campionamento, prelievo e conservazione dei campioni, che devono quindi essere standardizzate

• Queste fasi determinano la variabilità pre-analitica di un metodo

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CAMPIONAMENTO

• Scelta della fase del ciclo biologico più opportuna per la raccolta dei campioni

• La raccolta dei campioni deve essere effettuata nelle condizioni più idonee per fornire dati attendibili

• Le condizioni ottimali, inoltre, dovrebbero essere relativamente facili da riprodurre perché in esse vengono definiti i valori di riferimento

• Tali condizioni variano a seconda del tipo di indagine da effettuare

• In molti casi la condizione ideale è lo stato basale: paziente a riposo, a digiuno da 8 - 12 ore, esente dall’assunzione di farmaci o sostanze che potrebbero interferire con qualche processo metabolico

• Nello screening delle portatrici di distrofia muscolare di Duchenne il prelievo di sangue viene effettuato nel tardo pomeriggio, dopo una giornata di lavoro, perché in queste condizioni l’attività sierica della creatinfosfochinasi (CK) risulta più elevata rispetto ai controlli sani, mentre in condizioni basali rientra solitamente nell’intervallo di riferimento

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• Si adottano diverse modalità di campionamento a seconda dello scopo per cui il prelievo viene eseguito

– Indagine diagnostica

– Monitoraggio dell’azione di farmaci o di terapie fisiche

– Prove funzionali da carico

• Indagine diagnostica– Le condizioni basali non sono sufficienti per standardizzare il prelievo

– Altri fattori possono modificare significativamente qualche parametro biochimico o ematologico

• Esercizio muscolare (innalzamento LDH per 24 ore)

• Stato ansioso (aumento leucociti, alterazione equilibrio acido-base)

• Postura ed uso del laccio emostatico

CAMPIONAMENTO

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• Monitoraggio dell’azione di farmaci– Analisi del farmaco circolante (prelievi ad intervalli definiti in base alla

farmacocinetica)

– Monitoraggio degli effetti terapeutici (stato basale)

– Monitoraggio degli eventuali effetti tossici (stato basale)

• Prove funzionali da carico– Curva da carico con glucosio per via orale per valutare il metabolismo dei

glucidi (1 prelievo basale + 5 prelievi ogni 30 min)

– Glicemia post-prandiale per accertare sospetto diabete (prelievo 2 ore dopo un pasto ricco di glucosio)

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PRELIEVO

• Sangue venoso, capillare, arterioso

• Sangue venoso– Idoneo per la maggior parte delle analisi

– Prelevato dalle vene dell’avambraccio e della regione anteriore del gomito

– Prelevato con siringhe sterili in provette di plastica o in vacutainer di vetro siliconato

• Sangue capillare– In realtà è un misto di sangue arterioso, capillare, venoso e liquido interstiziale

– Prelevato dal lobo dell’orecchio o dalla falange distale mediante lancetta sterile per puntura cutanea

– Usato quando occorre un piccolo volume di sangue (< 1 mL), nei neonati e bambini piccoli, ustionati, ecc.

• Sangue arterioso– Utilizzato per determinare la concentrazione dei gas ematici (O2, CO2) e il pH, cioè

parametri misurati per valutare l’equilibrio acido-base del sangue

– Prelevato da arterie del braccio o dalla femorale mediante siringhe sterili

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PLASMA o SIERO ?

• Quando si deve analizzare la parte liquida del sangue, si potrebbero utilizzare indifferentemente plasma o siero, tranne quando si deve determinare il fibrinogeno

• Una tendenza è quella di utilizzare il plasma come oggetto di studio più “fisiologico” rispetto al siero

• Infatti, il processo della coagulazione in vitro coinvolge non solo la parte corpuscolata ed i fattori della coagulazione ma, attraverso i danni subiti dalle cellule inglobate nel coagulo, induce la liberazione di parte del contenuto cellulare, con conseguente variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma

• D’altra parte, per ottenere il plasma (per impedire la coagulazione) è necessario aggiungere sostanze chimiche che a loro volta potrebbero alterare il campione

• Si potrebbe anche effettuare la defibrinazione del sangue con metodo fisico (agitazione continua del sangue a contatto con bacchette o palline di vetro fino a deplezione completa di fibrinogeno e di piastrine). Questo sistema è però dispendioso e non applicabile all’analisi di routine. È riservato alla preparazione di materiale per il controllo di qualità in ematologia e alla ricerca clinica

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PLASMA

• Per molte indagini ematologiche e per le emocolture il sangue deve essere mantenuto fluido, evitando così la coagulazione

• Le indagini riguardanti la struttura e/o le funzioni delle cellule ematiche richiedono che le cellule stesse restino inalterate

• La scoagulazione del sangue si ottiene con l’aggiunta di sostanze chimiche (anticoagulanti) che esercitano il loro effetto con meccanismi diversi:

– Chelanti del calcio

– Eparina

• Normalmente le provette in cui si raccoglie il sangue sono già predisposte e contengono una quantità stabilita di anticoagulante in forma solida o di soluzione concentrata. È indicato il livello corrispondente alla quantità di sangue da raccogliere in modo da ottenere la concentrazione finale ottimale di anticoagulante

• L’uso improprio o inaccurato degli anticoagulanti può contribuire ad aumentare la variabilità pre-analitica

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ANTICOAGULANTI

• Chelanti del calcio

Legano in modo irreversibile gli ioni Ca2+ presenti nel sangue indispensabili in varie fasi della cascata emocoagulativa

– L’EDTA (acido etilendiamminotetracetico) è il più usato (sale disodico oppure bi- o tripotassico) È necessario per studi morfologici delle cellule ematiche

– Il citrato di sodio viene utilizzato per la determinazione della VES e per studi di funzionalità piastrinica, in cui EDTA ed eparina non possono essere usati perché provocano aggregazione piastrinica

– Un altro chelante del calcio è una miscela di ossalati di ammonio e di potassio

• Eparina

– Agisce come cofattore dell’antitrombina III, in combinazione con la quale inattiva rapidamente la trombina e il fattore X (dieci) attivato

– L’eparina è molto usata ma NON è utilizzabile per studi morfologici perché conferisce alle cellule una colorazione scura

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SIERO

• Se l’analisi viene effettuata sul siero il campione di sangue viene lasciato 1 – 2 ore a T.A. per consentire la formazione del coagulo

• Viene poi centrifugato a 3000 g (forza centrifuga relativa) per 10 min per consentire il recupero del maggiore volume possibile di siero

• Spesso, per facilitare la separazione tra coagulo e siero, le provette in cui il sangue viene raccolto contengono sostanze con peso specifico intermedio tra quelli delle cellule ematiche e del siero, ad esempio perline di polistirene che durante la centrifugazione si dispongono tra coagulo e siero

• Il siero deve essere separato dal coagulo il più presto possibile per evitare il rilascio di sostanze dalle cellule, che potrebbero alterarne la composizione

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Red top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

None

Blood clots and serum separated by centrifugation

Chemistries, Immunology,serology,Blood Bank

Red-Grey Mottled top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Serum separating tube with clot activatorForm clot quickly, separatethe serum at the bottom

Blood type screening and chemistries

Gold top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Separating gel and clot activatorgel at the bottom to separateblood from serum on centrif.

Serology, endocrine, immunology, HIV

Light green top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Plasma saeparating tube Na-HeparinPlasma separated at thebottom of the tube

Chemistries

Vacutainer tube®

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Lavender/Purple top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

EDTA (liquid form)

Forms calcium salt to remove calcium

Hematology andBlood Bank

Light blue top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Sodium citrate

Forms calcium salt to remove calcium

Coagulation tests, tubefilled 100%

Dark green top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Sodium heparin or litiumheparin

inactivates thrombin

ammonia,lactate,lithium level,

Dark blue top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Sodium heparin orNa2EDTA

Forms calcium salts

Toxicology and drugs test

Vacutainer tube®

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Light gray top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Sodium fluoridepotaxium oxalateAntyglycolitic agent to preserve glucose

Lithium level, glucose

Yellow top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

ACD (acid-citrate-dextrose)

Complement inactivation

Paternity tests, DNA studies

Tan/brown top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Sodium heparin

inactivates thrombin

serum lead determination

Black top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Sodium citrate (buffered)

Forms calcium salts

Westergren sedimentationrate

Vacutainer tube®

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Orange top

Contains:

Effect onspecimen:

Uses:

Thrombin

Quickly clots blood

STAT chemistries blood

Vacutainer tube®

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EMOLISI

• Rottura dei globuli rossi con conseguente liberazione di emoglobina nel siero o nel plasma

• Visibile macroscopicamente perché il colore passa dal giallo al rosato-rosso

• L’emolisi è una delle ragioni più frequenti di inadeguatezza qualitativa dei campioni di sangue

– Errori di tipo analitico-metodologico

– Errori dovuti a cause fisiologiche

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• Interferenze fisiche Assorbimento dell’emoglobina attorno a 405 nm e a 550-575 nm che interferisce

su analisi colorimetriche

Errori controllabili mediante strumenti che effettuano letture a due lunghezze d’onda

• Interferenze chimiche

Inibizione di reazioni di diazotazione o di reazioni enzimatiche utilizzate per la determinazione di certi analiti

Interferenze di tipo analitico-metodologico

EMOLISI

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Sono dovute ad ineguale distribuzione di molte sostanze tra la parte liquida e la parte corpuscolata del sangue

– Ad esempio, glucosio, colesterolo totale, esteri del colesterolo, Na+, Cl- hanno concentrazione più elevata nel plasma che nei globuli rossi, perciò nei casi di emolisi massiva si ha una diluizione di questi componenti

– Al contrario (più frequentemente e con maggiore rilevanza) enzimi quali fosfatasi acida, transaminasi, lattato deidrogenasi e ioni quali K+ hanno concentrazione più elevata all’interno degli eritrociti piuttosto che nel plasma, perciò in caso di emolisi si ha una sovrastima

Interferenze di tipo fisiologico

EMOLISI

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Livelli di concentrazione di alcuni analiti nei globuli rossi e nel plasma

Analiti Globuli rossi Plasma

Glucosio mg/dlAzoto non proteico mg/dlAcido urico mg/dlColesterolo totale mg/dlColesterolo esteri mg/dlNa+ mmol/lK+ mmol/lCl- mmol/lHCO3

-

LDH mU/mlGOT(AST) mU/ml

74,040,02,5139016100521958,000500

90,08,04,61941291404,41042636025

EMOLISI

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CAUSE DI EMOLISI

• Biologiche– Anemie emolitiche per difetti endogeni o esogeni

• Endogeni: difetti morfologici o deficienze di enzimi endoeritrocitari

• Esogeni: anticorpi (emolisine) acquisiti in seguito a reazioni trasfusionali, anemie emolitiche autoimmuni, infezioni, assunzione di farmaci

• Meccaniche– Uso di aghi troppo sottili e/o aspirazione eccessiva durante il prelievo

– Centrifugazione a velocità troppo elevata

• Chimiche o osmotiche– Presenza di disinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche sulla cute,

nell’ago o nella provetta

• Fisiche– Conservazione prolungata del campione in condizioni non idonee, soprattutto di

temeperatura (troppo elevata o troppo bassa) Ad esempio, il congelamento provoca cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria e

rottura delle membrabe

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Invio

Spedizione intra o extramurale

Ambulatori utenza esterna

Reparti clinici

Ricezione controllo selezione

Chimica

Centrifugazione

Ematologiamicrobiologia

emocoagulazioneecc...

Separazionesiero-plasma

Accettazione

Conservazione+4°C; -20°C

Consegna agli analisti

Eventuale deproteinizzazione Eventuale conservazione

TRATTAMENTO PRE-ANALITICO

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CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI

• Idealmente il campione biologico dovrebbe essere analizzato immediatamente

• Nella realtà questo accade solo per le urgenze, mentre in tutti gli altri casi i campioni vengono conservati per un certo tempo prima dell’analisi per ragioni economiche ed organizzative

• Inoltre, può essere necessario conservare i campioni per ripetere l’analisi o effettuare analisi diverse successivamente

• Un altro fattore critico da tenere in considerazione, per il suo possibile effetto sulla variabilità pre-analitica, è il trasporto dei campioni dal luogo di prelievo al laboratorio di analisi

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CAUSE DI ALTERAZIONE DEI CAMPIONI

I campioni biologici possono alterarsi per cause diverse ed in tempi diversi

Schematicamente:

• Cause di natura fisica Tempi relativamente lunghi

• Cause di natura chimico-fisica Tempi brevi o medi

• Cause di natura biochimica Tempi brevissimi o brevi e/o biometabolica

In realtà si può avere sovrapposizione di cause

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Riguardano prevalentemente cambiamenti di fase (liquido-solido, liquido-vapore)

• Evaporazione

Provoca aumento della concentrazione degli analiti, quindi inficia l’accuratezza della misura

Dipende da temperatura, umidità relativa, ventilazione, geometria e volume di riempimento del contenitore

• Solubilità

Sangue, siero e plasma hanno una componente proteica che funge da stabilizzatore

Nell’urina abbassamenti di temperatura a valori ambiente o di frigorifero (+4°C) e variazioni di pH possono ridurre la solubilità (precipitazione)

• Adsorbimento

Elementi oligominerali (metalli) possono essere adsorbiti sulla parete dei contenitori. Sono necessari materiali inerti

• Desorbimento

Cessione di materiale dai contenitori, in particolare metalli. Il vetro presenta questo problema, polipropilene e teflon sono più appropriati

Cause di natura fisica

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• Fotolisi Dovuta all’interazione della luce solare con molecole fotoassorbenti che vengono

alterate (ad es. bilirubina, composti porfirinici, vitamine)

• Denaturazione Modificazione sterica o strutturale di siti attivi di proteine enzimatiche o recettoriali

tissutali

Può dipendere da tempo, temperatura, pH, composizione della matrice biologica

• Aggregazione A carico di proteine tra cui si formano legami a basso contenuto energetico: ponti

disolfuro, legami idrogeno, forze di van der Waals ed elettrostatiche

Alterazione delle caratteristiche di legame delle proteine stesse

Cause di natura chimico-fisica

Includono processi chimico-fisici in grado di indurre modificazioni nella composizione o nella struttura di alcuni costituenti biochimici

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– C

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• In vivo è attivo un sistema di regolazione omeostatica che mantiene costante la concentrazione dei metaboliti

• In vitro questo sistema manca

Inoltre, cambiano la temperatura e la natura delle pareti del “contenitore” e si ha contatto con l’aria

• Anche in poche ore si possono avere drastici aumenti o decrementi di concentrazione di alcuni analiti

Cause di natura biochimica e/o biometabolica

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0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25 30

tempo (ore)

mg

/dl Variazione concentrazione

acido lattico in vitro a Tamb

0

200

400

600

800

1000

1200

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

tempo (giorni)

ug

/dl

eparina

EDTA

KF

Variazione concentrazioneammonica plasmatica in vitroa Tamb con anticoagulanti


Cause di natura biochimica e/o biometabolica

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• Conservazione alla temperatura ottimale

• Conservazione al buio

• Liofilizzazione

• Modificazione del pH

• Aggiunta di sostanze chimiche per evitare fenomeni indesiderati

(ad es. sostanze che impediscono l’ossidazione dei gruppi –SH e la formazione di ponti disolfuro, quali il ditiotreitolo, DTT)

Provvedimenti

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VARIABILITÀ GLOBALE

La variabilità globale di un test di laboratorio è espressa in termini statistici dalla varianza totale

S2totale = S2

pre-analitica + S2analitica + S2

post-analitica

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VARIABILITÀ PRE-ANALITICA

• Composizione del materiale biologico del soggetto– Campionamento

– Variabilità biologica (età, sesso, razza)

• Composizione del materiale biologico come conseguenza delle modalità di effettuazione del prelievo (ad es. emolisi)

• Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza del trattamento immediato (ad es. anticoagulanti)

• Composizione, proprietà o morfologia del materiale biologico come conseguenza della conservazione

La variabilità pre-analitica dipende da condizioni che possono influenzare:

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VALORI DI RIFERIMENTO

Per alcune patologie, la sola presenza dell’analita in oggetto costituisce la conferma che la patologia in esame è in atto.

In genere però una patologia si traduce in una semplice variazione del parametro in esame, quindi il risultato analitico deve essere confrontato con i valori “normali” per la popolazione, di solito indicati come “valori di riferimento”.

Per essere utile dal punto di vista diagnostico, un valore di riferimento deve spesso essere valutato all’interno di un solo settore della popolazione, che sia più “omogeneo” (es. con simili caratteristiche genetiche ed ambientali) e confrontabile con il paziente in esame. In questo modo il valore di riferimento acquista un rilevante “valore predittivo”.

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Quali parametri influenzano i valori di riferimento?

- Fattori genetici. Molte anomalie nel metabolismo sono legate a fattori genetici. Criteri distintivi importanti sono i gruppi sanguigni e gli antigeni di istocompatibilità.

- Fattori fisiologici. Molte condizioni fisiologiche determinano variazioni consistenti in alcuni parametri biochimici.

Età (livelli ormonali, azotemia, colesterolo…)Sesso (sideremia, acido urico, livello ormonale,gonadotropine, azotemia…)Eccesso di peso (colesterolo, trigliceridi…)Ora e giorno del prelievo (variazioni periodiche del colesterolo, catecolamine, sideremia…)Modalità del prelievo (bicarbonati, proteine…)Postura (attraverso la diversa distribuzione dell’acqua nell’organismo influenza calcio, proteine, colesterolo…)

Spesso problematico è il caso dei bambini, specialmente durante i primi giorni o le prime settimane di vita, in quanto esistono parametri fisiologici il cui range “normale” varia molto rapidamente col passare del tempo.

- Fattori esogeni. Includono l’alimentazione (colesterolo, trigliceridi), l’attività fisica o professionale, il fumo, l’alcool, l’assunzione di farmaci…


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Convenzionalmente, si definiscono “normali” i valori che comprendono il 95% dei risultati ottenuti in una popolazione apparentemente sana, supponendo con ciò che ogni specie tenda a contenere le variazioni delle grandezze biologiche entro certi limiti. L’intervallo corrispondente è l’intervallo di riferimento.

Il modo con cui si ricavano i valori “normali” dipende anche dal tipo di distribuzione statistica del parametro misurato nella popolazione:

- Distribuzione gaussiana

- Distribuzione log-gaussiana

- Distribuzione non classificabile o irregolare (es. distribuzione bimodale…)

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Distribuzione gaussiana. Se il parametro in esame presenta una distribuzione gaussiana all’interno della popolazione, l’intervallo di riferimento è quello compreso entro due deviazioni standard dalla media della popolazione.

- 2 + 2

95%

2,5%2,5%

Le percentuali in oggetto sono comunque arbitrarie. E’ stato infatti proposto anche un criterio in base al quale i valori nei quali rientra l’80% della popolazione sarebbero “normali”, i valori dall’80% al 98% dubbi ed i valori nei quali rientra il 2% della popolazione sarebbero patologici.

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Distribuzione log-gaussiana. Spesso la distribuzione si presenta asimmetrica rispetto ad una distribuzione gaussiana con una maggiore percentuale di valori elevati. E’ abbastanza comune che in questo caso la distribuzione sia assimilabile ad una gaussiana se il diagramma viene costruito utilizzando il logaritmo del parametro in esame (es. una concentrazione) piuttosto che il parametro stesso.

X Log X

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Per distribuzioni non gaussiane e non riconducibili in alcun modo ad una gaussiana (ad esempio le distribuzioni bimodali) si utilizza il metodo dei percentili. La popolazione viene divisa in un certo numero di categorie in base al valore del parametro e se ne traccia il profilo sotto forma di istogramma. Su questo grafico si determinano i valori del parametro al di sopra (o sotto) i quali cade una percentuale prefissata della popolazione.

Intervalli del parametro

Fre

quen

za n

ella

pop

olaz

ione

2,5% 95% 2,5%

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INTERPRETAZIONE DEL RISULTATO DI UN TEST

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La valutazione della capacità di un test di laboratorio di diagnosticare una determinata patologia (significato diagnostico) parte dall’esame delle differenze nel parametro in esame fra la popolazione sana e qualle malata, quindi dal confronto delle distribuzioni statistiche della grandezza nelle due popolazioni.

Siccome il risultato del test è affetto da varianze dovute alla reale distribuzione della grandezza in esame che agli errori associati all’analisi, in generale esiste un certo grado di sovrapposizione fra i valori delle due popolazioni. La linea di demarcazione (valore discriminante) che classifica il test come positivo deve quindi venire scelta in modo oculato, in funzione di

- forma della distribuzione nella popolazione normale e malata

- dimensione e proporzioni delle popolazioni considerate

- costo derivante da una decisione sbagliata

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Si definisce sensibilità clinica (positività) del test diagnostico la capacità del test di classificare come positivi gli individui veramente affetti dalla malattia. Essa viene comunemente espressa come:

Sensibilità clinica = 100 VP/(VP + FN)

dove VP (veri positivi) sono i risultati correttamente classificati dal test come positivi e FN (falsi negativi) sono i risultati di soggetti malati classificati erroneamente cone negativi (VP + FN sono ovviamente tutti i soggetti malati all’interno del campione esaminato).

La specificità clinica (negatività) del test diagnostico è invece la capacità del test di classificare come negativi gli individui sani. Per analogia essa è data da:

Specificità clinica = 100 VN/(VN + FP)

dove VN (veri negativi) sono i risultati correttamente classificati dal test come negativi e FP (falsi positivi) sono i risultati di soggetti sani classificati erroneamente cone positivi (VN + FP sono ora i soggetti sani all’interno del campione esaminato).

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La somma delle due grandezze viene talvolta definita potenza diagnostica (assoluta) del test.

sani malati

TEST IDEALESensibilità clinica

100%Specificità clinica

100%Potenza diagnostica

200%

sanimalati

TEST INUTILESensibilità clinica

50%Specificità clinica

50%Potenza diagnostica

100%

sani malati

TEST REALESensibilità clinica

50-100%Specificità clinica

50-100%Potenza diagnostica

100-200%

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Nel caso reale la classificazione dei risultati come positivi o negativi passa attraverso la definizione di un punto di separazione (livello di normalità o “cut off”) che viene operativamente utilizzato per classificare i risultati come negativi o positivi.

La scelta del valore specifico di “cut off”, che influenza sia la specificità che la sensibilità, dipende però dal particolare problema clinico considerato, dalla proporzione delle due popolazioni e dal costo relativo delle false attribuzioni positive o negative.

sani malati

“cut off”

sani malati

Sensibilità clinica = 100%specificità clinica bassa

Sensibilità clinica bassaspecificità clinica = 100%

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Il livello di normalità o “cut off” viene quindi scelto all’interno della zona di sovrapposizione fra le due popolazioni.

Un altro parametro spesso utilizzato per definire le capacità di un test diagnostico è il valore predittivo o discriminante, dato dalla:

sani malati

Valore predittivo = 100 VP/(VP + FP)

che indica quindi la percentuale dei casi positivi che risulta effettivamente affetta dalla malattia. In pratica questo parametro dipende non solo dalla sensibilità e dalla specificità, ma manche dalla prevalenza (percentuale della popolazione affetta dalla malattia).

Sensibilità 95% e specificità 95% danno un valore predittivo del 95% se la prevalenza è del 50%. Il valore predittivo scende però al 16% ed al 2% se la prevalenza è dell’1% e dello 0,1%.

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