Fermentation of Soybean Meal Hydrolyzates with Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis for Ethanol Production

Abstract: Most of the ethanol currently produced by fermentation is derived from sugar cane, corn, or beets. However, it makes good ecological and economic sense to use the carbohydrates contained in by-products and coproducts of the food processing industry for ethanol production. Soybean meal, a co-product of the production of soybean oil, has a relatively high carbohydrate content that could be a reasonable substrate for ethanol production after fermentable sugars are released via hydrolysis. In this research, the capability of Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2233 and Zymomonas mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286 to produce ethanol was evaluated using soybean meal hydrolyzates as substrates for the fermentation. These substrates were produced from the dilute-acid hydrolysis of soybean meal at 135 °C for 45 min with 0, 0.5%, 1.25%, and 2% H2SO4 and at 120 °C for 30 min with 1.25% H2SO4. Kinetic parameters of the fermentation were estimated using the logistic model. Ethanol production using S. cerevisiae was highest with the substrates obtained at 135 °C, 45 min, and 0.5% H2SO4 and fermented for 8 h, 8 g/L (4 g ethanol/100 g fresh SBM), while Z. mobilis reached its maximum ethanol production, 9.2 g/L (4.6 g ethanol/100 g fresh SBM) in the first 20 h of fermentation with the same hydrolyzate.

Introduction

Ethanol is 1 of the only 2 transportation fuels on the market that is used primarily as part of a mixture with petroleum-based gasoline. Currently, most ethanol is produced by fermentation of sugars derived from cereals or sugar crops, which raises concerns about the use of food crops for the biofuel industry. Therefore, production of bioethanol from nonhuman food sources is becoming attractive, especially from coproducts associated with food production (Neureiter and others 2002; Karmee and Lin 2014). A potential source of fermentable sugars that has been overlooked is soybean meal (SBM), a coproduct of soybean oil production.

Soybean meal, a premium protein source for animal feed, contains approximately 42% total carbohydrates and 55% protein (Baker and Stein 2009; Da Silva and others 2009). Of the total carbohydrates, half are structural and the other half are comprised of low-molecular weight sugars, oligosaccharides, and starch in relatively small quantities (Karr-Lilienthal and others 2005). Around 17% of low-molecular-weight sugars consist of a mixture of glucose, arabinose, galactose, fructose, and sucrose (Grieshop and others 2003). An additional merit of SBM as a potential source of fermentable sugars for ethanol production is that after sugars are selectively extracted, a high-protein meal is left behind which can be used for animal feed. Before SBM can be used as a substrate, fermentable sugars need to be released from the solid matrix, by hydrolysis with dilute acid or other methods.

For this research, the capability of 2 microorganisms —Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis— to ferment SBM hydrolyzates was tested. S. cerevisiae is one of the most common organisms used in industrial ethanolic fermentations. It is highly robust, resistant to toxic inhibitors, and highly tolerant of low pH levels, which minimizes the risk of contamination (Weber

and others 2010). Z. mobilis, a gram-negative bacterium, is attractive for ethanol production due to its high productivity. A downside is that Z. mobilis has low resistance to toxic inhibitors and can ferment only glucose, fructose, and sucrose (Rogers and others 1982; Doran 1997; Weber and other 2010). The objective of this research was to evaluate the ability of S. cerevisiae and Z. mobilis to produce ethanol using acid hydrolyzates of SBM as substrates. The kinetic parameters of the fermentation were determined using the logistic model.

Materials and Methods

Substrates for fermentation

Five hydrolyzates of commercial SBM were used as substrates for the fermentations. The hydrolyzates were obtained by treating soybean meals with dilute sulfuric acid under the following conditions: 135 °C for 45 min at 4 acid concentrations (0.0%, 0.5%, 1.25%, and 2.0% H2SO4) and 120 °C, 1.25% H2SO4 for 30 min. In previous research, these conditions have proven to produce the highest concentrations of fermentable sugars (Luj´an-Rhenals 2013).

Hydrolyzates were prepared by treating 50 g of SBM with 250 mL of H2SO4 solution in 500-mL PYREXR media storage bottles with screw caps (Luj´an-Rhenals 2013). To avoid pressure buildup inside the bottles during the heat treatment, caps were not completely tightened. A Tuttnauer 2340E Steam Autoclave (Tuttnauer U.S.A, Delran, N.J., U.S.A.) operated according to the preset program #1 (fast exhaust without drying) was used for the hydrolysis. Transient heating was not considered in the analysis. After the heat treatment, the reaction was stopped by cooling the mix in an ice-water bath followed by the modification of pH to a range between 5.0 and 5.5 with NaOH pellets. Solids and liquid were then separated by centrifugation at 3900 × g for 35 min at 10 °C in an Allegra X-22R centrifuge with an SX4250 Rotor (Beckman Coulter Inc., Brea, Calif., U.S.A.). Afterwards, the supernatants were filtered through Whatman #4 filter paper (Whatman Plc., Maidstone, Kent, U.K.), analyzed for the concentration of fermentable sugars, and used as substrates for the fermentation. From this point forward, these substrates will be referred to as soybean meal broth (SBMB) as listed in Table 1.

Microbial strains

Strains of S. cerevisiae NRRL Y-2233 and Z. mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286 were provided as lyophilized powders from the culture collection of the United States Dept. of Agriculture (USDA), Agriculture Research Service (Peoria, Ill., U.S.A.).

Fermentable sugar analysis

Fermentable sugars in the hydrolyzates were analyzed with High-Performance Size Exclusion hromatography and Refractive Index (HPSEC-RI) detection. The chromatograph was aWaters, (Milford, Mass., U.S.A.) with a 5 15 HPLC pump, a manual injector with a 50-μL sample loop, and a 2410 refractive index detector set at 40 °C. Columns used for the separation of sugars were a Shodex OH Pack SB-804 HQ (300 × 8 mm) followed by Shodex OH Pack SB-802 HQ (300 × 8 mm) (Showa Denko America, Inc., New York, N.Y., U.S.A.) connected in series. Columns were preceded

by a Shodex OH pack SB-G (50 × 6 mm) guard column. Columns and guard column were maintained at 55 °C in a column heater. A solution of 0.1 M NaNO3 with 0.2% NaN3 run isocratically at a flow rate of 0.4 mL/min was used as the mobile phase. Sugars were quantified using 6-point calibration curves with fructose and glucose as standards. Cells reactivation and preparation of preinoculum and inoculum Both S. cerevisiae and Z. mobilis were reactivated in 5 mL of yeast malt (YM) broth (Dickinson and Company, Sparks, Md., U.S.A.) and incubated at 30 °C for 24 h in an orbital shaker (Thermo Scientific Max Q 4450, Dubuque, Iowa, U.S.A.) set at 150 rpm. The preinoculum consisted of 5 mL of sterileYMbroth at 30 °C where both S. cerevisiae and Z. mobilis were inoculated separately and grown overnight in the orbital shaker. For each respective strain, 0.2 mL of the culture was plated out with a loop over the surface of 2 petri dishes containing YM agar (20 g/L of glucose, 3 g/L of yeast extract, 5 g/L of peptone, and 3 g/L of malt extract) and grown overnight at 30 °C before adding to the final inoculum. The inoculum was prepared by adding all the colonies formed in both dishes to 80 mL of SBMB and allowing the cells to adapt by incubating overnight at 30 °C in the orbital shaker.

Fermentation

Fermentations were conducted at 30 °C for 36 h with an initial pH of 5 to 5.5, dissolved oxygen (%DO) less than 1% after stabilization, and an initial biomass concentration between 7×106 and 1×107 cells/mL (Mullins and Nesmith 1987; Siqueira and others 2008; Laopaiboon and others 2009). The fermentor was a 1.3-LBioflo/CellinGen 115 Benchtop Fermentor & Bioreactor (New Brunswick Scientific, Edison,N.J.,U.S.A.) with control systems for temperature, pH, %DO, agitation, and foam level. During fermentation, samples were taken every 4 h to estimate fermentation kinetic parameters maximum specific growth rate (μmax), biomass yield from sugar (Yx/s), and ethanol yield from sugar (Yp/s)—along with volumetric ethanol productivity, rp (g/L/h). Cell density (nr. of cells/L) was determined with a hemacytometer (Double Neubauer Counting Chamber, 3110, Hausser Scientific, Horsham, Pa., U.S.A.) and a phase contrast microscope (Nikon Eclipse E400, Nikon Corporation, Tokyo, Japan). The cell density was correlated with a calibration curve of cell dry weight obtained by drying aqueous solutions of known concentrations of cells at 80 °C for 20 to 24 h (Alfenore and others 2002; Buhner and Agblevor 2004). All kinetic parameters were calculated using the following equations:

Growth kinetics and model development for the ethanol fermentation

The kinetic parameters of biomass production were determined with the logistic model (Eq (6)) (Wang and others 2004).

(6)

where dx/dt is the rate of biomass during the time of fermentation (g cell/ h), μmax is the maximum specific growth rate (h-1), x is the biomass concentration (g/L), and xmax is the maximum biomass concentration (g/L).

Considering the following boundary conditions: t = 0, x = xo, S = So, and P = 0, Eq (6) was integrated and Eq (7) was obtained as a result, which relates biomass production (X) and fermentation time (t) and was used to fit the experimental data.

(7)

For the calculation of the kinetics parameters, only glucose and fructose were considered as growth-limiting-substrates because these sugars were consumed in the highest and most consistent quantities by the microorganisms according to the HPLC analysis.

Experimental design

For the fermentation, the experimental design was a complete randomized block design with microorganism type and broth as factors (Table 1). At each level, experiments were run twice.

Statistical analysis

Data was analyzed with SAS Version 9.2 software (SAS Inst. Inc., Cary, N.C., U.S.A.) and the kinetic parameters μmax, xmax, and xo determined. Analysis of covariance (ANCOVA) was used to fit the data to the logistic model using the Gauss-Newton nonlinear regression method and comparisons of each regression coefficient across the treatments. For the minimum inhibitor concentrations and kinetics parameters, data were analyzed with JMPR version 9.0.0 (SAS Inst. Inc.). To analyze the kinetic parameters (Yp/s, Yx/s, ms, and qp), an analysis of variance (ANOVA) was used and differences in the mean of the kinetic parameters were analyzed using the Tukey–Kramer test (α = 0.05).

Results and Discussion

Ethanol fermentation with S. cerevisiae and Z. mobilis S. cerevisiae exhibited optimal responses for the production of ethanol, sugars consumption, and cell growth in all the SBM broths used in this study (Figure 1). However, in most fermentation broths, Z. mobilis was not as efficient (Figure 2). This bacterium exhibited no growth with the hydrolyzate SBMB3 (135 °C, 2% H2SO4, 45 min), but with the SBMB1 (135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min) displayed its maximum ethanol production. S. cerevisiae, on the other hand, demonstrated rapid sugar consumption, likely because it is a robust microorganism that was not critically affected by the inhibitors present in most of the hydrolyzate SBMB (Luj´an-Rhenals and others 2014). Zymomonas mobilis was affected by inhibitory compounds of the SBMB ((Luj´an-Rhenals and others 2014) and also by the presence of salts coming from the hydrolyzate, such as sodium acetate (CH3COONa) which is the sodium salt of acetic acid formed during the reaction and sodium sulfate (Na2SO4) formed during the neutralization of the sulfuric acid with sodium hydroxide. (Yang and others 2010) demonstrated that the combination of elevated Na+ and acetate ions led to a synergistic inhibitory effect on strain ZM4.

Kinetics of substrate consumption during fermentation

S. cerevisiae exhibited its most rapid sugar consumption of 15.6 g/L during the initial 12 h of fermentation with the SBMB4 (120 °C, 1.25% H2SO4, 30 min) and 15.1 g/L during the 1st 12 h of fermentation with the SBMB1 (135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min) (Figure 1e). On the other hand, the SBM broths from the most severe hydrolysis treatments appeared to result in a low rate of sugar use from the fermentation broth by S. cerevisiae (Figure 1e). This low rate of sugar consumption occurred due to toxic compounds formed during the hydrolysis process that reduces the yeast growth (Luj´an-Rhenals and others 2014). Z. mobilis also expressed its most rapid sugar uptake of 15.0 g/L per 16 h of fermentation with the SBMB1 (135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min) (Figure 2b). Similar to S. cerevisiae, Z. mobilis had low rates of apparent sugar consumption during growth in the broths (Figure 2c and 2d) resulting from the most severe pretreatments, particularly SBMB2 (135 °C, 1.25% H2SO4, 45 min), which is probably due to the inhibitory effect of acetic acid and salts as previously discussed.

Overall, the maintenance coefficient ms (g sugar consumed/ g cell h) for both microorganisms did not yield statistically significant differences except for S. cerevisiae with SBMB2 and SBMB3, which gave higher values (2.7 and 2.8 g sugar/g cell h, respectively) than the other coefficients (Table 2). However, numerically, all ms coefficients for Z. mobilis were lower than the ms coefficients calculated for S. cerevisiae which means that the bacteria apparently required less carbon substrate per cell than the yeast. This result has also been previously reported by (Dien and others 2003). Therefore, Z. mobilis utilizes less substrate per gram of cells produced than S. cerevisiae and has more carbon available for the production of ethanol (Dien and others 2003).

Kinetics of ethanol production

S. cerevisiae exhibited its maximum ethanol production of 8 g/L during the 1st 8 h of fermentation of the SBMB1 (135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min) and SBMB4 (120 °C, 1.25% H2SO4, 30 min). In contrast, the lowest ethanol production (5.67 g/L ethanol) occurred with the SBMB3 (135 °C, 2% H2SO4, 45 min) after 28 h of fermentation, where possibly some inhibitor compounds (salts, acetate from acetic acid, and other unidentified toxic substances) could have reduced the ethanol productivity. Ethanol production by Z. mobilis peaked at 9.2 g/L ethanol after 20 h of fermentation with the SBMB1 (135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min). The SBMB0 (135 °C, 0% H2SO4, 45 min) allowed a maximum ethanol rate of 3.9 g/L ethanol after 20 h of fermentation. However, the lowest ethanol production levels—1 g/L at 20 h—were attained with the SBMB2 (135 °C, 1.25% H2SO4, 45 min) and SBMB4 (120 °C, 1.25% H2SO4, 30 min), which is likely caused by inhibitors (acetate from acetic acid, other salts, and unknown compounds). There have been previous reports that ethanol production with Z. mobilis and its growth can be reduced substantially even with low concentrations (2 to 8 g/L) of acetic acid (Wang 2008).

The ethanol yield (Yp/s, g ethanol/g of sugars) reported in Table 2 did not show significant statistical differences between the 2 microorganisms and the respective SBM broths used. However, numerically both microorganisms showed similar ethanol yields to the theoretical values, which is 100% for 0.51 g ethanol/g of sugars (Doran 1997). Fermentations in the SBM0 and SBMB1 gave the highest ethanol yields, 96% of the theoretical yield for both microorganisms,

which are comparable or even higher than values reported in previous research (Siqueira and others 2008; Zhang and Feng 2010; Da Cunha-Pereira and others 2011; Letti and others 2012; Romao and others 2012). Additionally, the highest ethanol volumetric productivity (rp) for S. cerevisiae was achieved with the SBM1 (1.01g ethanol/L h) and SBMB4 (1.00 g ethanol/L h), with no significant difference between the 2, but differed with respect to the other broths used in this research (Table 2). These values for S. cerevisiae are comparable to, and some higher than those reported by other researchers (Da Cunha-Pereira and others 2011). However, Z. mobilis reached a maximum ethanol volumetric productivity (rp) of 0.61 g ethanol/Lh only with the SBM1, which is lower than the values, 1.4 to 1.8 g ethanol/Lhwith Z. mobilis during the production of ethanol using SBM molasses (Letti and others 2012). Also, it is lower than 2.8 g ethanol/Lh obtained for the production of ethanol with Z. mobilis from sweet potato (Zhang and Feng 2010); however, it is higher than 0.59 g/Lh using lignocellulosic material as substrate (Mohagheghi and others 2002). These results demonstrate that the application of Z. mobilis for ethanol fermentation is not feasible when the substrate is SBM broth obtained under the conditions applied in these experiments. This is probably due to the high concentration of acetic acid, salts, and other toxic unknown compounds formed during the acid hydrolysis in the broths obtained under severe treatments.

Kinetics of biomass growth and model development for the fermentation

Data reported in Figure 1a indicate that S. cerevisiae yielded its maximum biomass concentration (2.3 g/L) after 12 h of anaerobic fermentation when exposed to the SBM0 (135 °C, 0% H2SO4, 45 min) followed by enzymatic treatment with cellulase. Likewise, this maximum concentration of biomass (2.3 g/L) was also reached with SBMB4 (120 °C, 1.25% H2SO4, 30 min) at 24 h.

However, SBMB3 (135 °C, 2% H2SO4, 45 min) exhibited a major inhibition of yeast growth since the biomass yielded no more than 0.5 g/L after 32 h of fermentation. Overall, production of biomass by S. cerevisiae appeared to be directly associated with ethanol production.

Z. mobilis exhibited its highest biomass concentration, 3.9 g/L, after 20 h of fermentation (Figure 7.2a) with the SBMB0 (135 °C, 0%, H2SO4, 45 min), followed by enzymatic treatment with cellulase.

Likewise, the biomass produced (3.3 g/L) when fermenting the SBMB1 (135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min) was very close to the former but required 24 h to reach this level. In contrast, SBM2 (135 °C, 2% H2SO4, 45 min) exhibited the primary inhibitory effects on Z. mobilis growth due to higher concentrations of salts, acetic acid, and other inhibitors in the broth that restricted its growth (Doran 1997; Yang and others 2010). In general, Z. mobilis also showed growth-associated ethanol production with the exception of those broths where the bacteria were considerably inhibited.

Data of cell growth responses fitted to a logistic model during the 1st 24 h of fermentation are shown in Table 3. The maximum specific growth rates (μmax) shows that in the SBM0 and SBMB4, μmax for S. cerevisiae (0.63 and 0.60 h-1, respectively) were higher but not significantly different than μmax for Z. mobilis, 0.55 h-1, in the substrate T3C0t3. Wang and others (2004), also using the

logistic model, reported a μmax of 0.1 h-1 for the ethanolic fermentation of apple juice with S. cerevisiae ( Huang andWang 2010) obtained a μmax of 5.2 h–1 using Saccharomyces diastaticus with mixed sugars as a substrate. Mohagheghi and others (2002) reported for Z. mobilis a μmax of 0.34 h-1 for ethanolic fermentation of hydrolyzed lignocellulosic biomass. In general, μmax for S. cerevisiae was higher for substrates obtained with pretreatments of less severity; Z. mobilis μmax did not show the same pattern due to the effect of inhibitors present in some of the SBM broths.

The initial concentration of biomass (x0) was not significantly different among all the broths for both microorganisms, which is an indication that the inoculum was homogeneously prepared and introduced to each SBM broth. The other kinetic parameter derived by fitting the logistic model to the 1st 24 h of fermentation was the maximumconcentration of biomass (xmax). For S. cerevisiae, xmax was 2.28 and 2.23 g/L for SBMB0 and SBMB4, respectively, while the maximum xmax for Z. mobilis was 3.79 g/L and 5.1 g/L for the SBMB0 and SBMB1, respectively. The biomass yield from substrate (Yx/s) listed in Table 2 was significantly higher (P = 0.05) for S. cerevisiae (0.1 g cell/g sugar consumed) than Z. mobilis (0.08 g cell/ g sugar consumed) when fermenting the SBMB1. Higher values with S. cerevisiae than Z. mobilis have also been reported by other researchers (Dien and others 2003, Aitabdelkader and Baratti 1993). This is a function of the better resistance of the yeast to the inhibitors present in these substrates (Weber and others 2010). However, with SBM2 the effect was the opposite, the value for Z. mobilis was 0.15 g cell/g sugar and for S. cerevisiae was 0.04 g cell/g sugar. Nonetheless, most of the values for S. cerevisiae were higher than the previous reports (Siqueira and others 2008) for the production of bioethanol from soybean molasses and similar to values (0.14 g/g) reported in other work (Ahmad and others 2011).

Conclusions

S. cerevisiae exhibited good qualities in the production of ethanol, sugars consumption, and cell growth for all acidhydrolyzed soybean meal broths tested without any additional nutrients, while Z. mobilis had a lower performance for most broths. The highest ethanol production of S. cerevisiae, 8 g ethanol/L, (4 g ethanol/100 g fresh SBM) was reached during the 1st 8 h of fermentation with the broth obtained at 135 °C, 0.5% H2SO4, 45 min and the one at 120 °C, 1.25% H2SO4, and 30 min. However, Z. mobilis yielded maximum ethanol production, 9.2 g/L ethanol, (4.6 g ethanol/100 g fresh SBM) only after the 1st 20 h with the hydrolyzate obtained at 135 °C, 0.5%H2SO4, 45 min.

La fermentación del hidrolizado harina de soja con Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis para producción de etanol

Resumen: La mayor parte del etanol producido actualmente por la fermentación se deriva de la caña de azúcar, maíz o remolacha. Sin embargo, es de sentido común ecológica y económica de utilizar los carbohidratos contenidos en los subproductos y coproductos de la industria de procesamiento de alimentos para la producción de etanol. La harina de soja, un co-producto de la producción de aceite de soja, tiene un contenido relativamente alto de hidratos de carbono que

podría ser un sustrato razonable para la producción de etanol después de azúcares fermentables son liberados a través de la hidrólisis. En esta investigación, la capacidad de Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-2233 y Zymomonas mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286 para producir etanol se evaluó utilizando harina de soja hidrolizado como sustratos para la fermentación. Estos sustratos se producen a partir de la hidrólisis de ácido diluido de la harina de soja a 135 ° C durante 45 min con 0, 0,5%, 1,25%, y 2% de H2SO4 y a 120 ° C durante 30 min con 1,25% de H2SO4. Los parámetros cinéticos de la fermentación se calcula utilizando el modelo logístico. La producción de etanol usando S. cerevisiae fue más alta con los sustratos obtenidos a 135 ° C, 45 min, y 0.5% de H2SO4 y fermentados durante 8 h, 8 g / L (4 g de etanol / 100 g SBM fresca), mientras Z. mobilis alcanzó su producción de etanol máximo, 9,2 g / L (4,6 g de etanol / 100 g SBM fresco) en la primera 20 h de fermentación con la misma hidrolizado.

Introducción

El etanol es 1 de los 2 únicos combustibles para el transporte en el mercado que se utiliza principalmente como parte de una mezcla con la gasolina a base de petróleo. Actualmente, la mayor parte del etanol se produce por fermentación de azúcares derivados de cereales o cultivos de azúcar, lo que plantea preocupaciones sobre el uso de cultivos alimenticios para la industria de los biocombustibles. Por lo tanto, la producción de bioetanol a partir de fuentes de alimentos no humanos es cada vez atractiva, especialmente de co-productos asociados a la producción de alimentos (Neureiter y otros 2002; Karmee y Lin 2014). Una posible fuente de azúcares fermentables que se ha pasado por alto es la harina de soja (SBM), un co-producto de la producción de aceite de soja.

La harina de soja, una fuente de proteína de alta calidad para la alimentación animal, contiene aproximadamente el 42% de carbohidratos totales y proteína de 55% (Baker y Stein 2009; Da Silva y otros 2009). De los carbohidratos totales, la mitad son estructural y la otra mitad está compuesta por azúcares de bajo peso molecular, oligosacáridos y almidón en cantidades relativamente pequeñas (Karr-Lilienthal y otros 2005). Alrededor de 17% de azúcares de bajo peso molecular consisten en una mezcla de glucosa, arabinosa, galactosa, fructosa, y sacarosa (Grieshop y otros 2003). Un mérito adicional de SBM como una fuente potencial de azúcares fermentables para la producción de etanol es que después de azúcares se extraen selectivamente, una comida alta en proteínas se deja detrás de la cual puede ser utilizada para la alimentación animal. Antes de SBM se puede utilizar como un sustrato, azúcares fermentables necesitan para ser liberado de la matriz sólida, por hidrólisis con ácido diluido u otros métodos.

Para esta investigación, la capacidad de 2 microorganismos -Saccharomyces cerevisiae y Zymomonas mobilis- fermentar hidrolizados SBM se puso a prueba. S. cerevisiae es uno de los organismos más comunes utilizados en las fermentaciones industriales etanólicos. Es muy robusto, resistente a los inhibidores tóxicos, y altamente tolerante de los niveles de pH bajos, lo que minimiza el riesgo de contaminación (Weber y otros 2010). Z. mobilis, una bacteria gram-negativa, es atractivo para la producción de etanol debido a su alta productividad. Un inconveniente es que Z. mobilis tiene una baja resistencia a los inhibidores tóxicos y puede fermentar solamente

glucosa, fructosa, y sacarosa (Rogers y otros 1982; Doran 1997; Weber y otros 2010). El objetivo de esta investigación fue evaluar la capacidad de S. cerevisiae y Z. mobilis para producir etanol utilizando hidrolizados ácidos de SBM como sustratos. Los parámetros cinéticos de la fermentación se determinaron utilizando el modelo logístico.

Materiales y METODOS

Los sustratos para la fermentación

Cinco hidrolizados de SBM comercial se utilizaron como sustratos para las fermentaciones. Los hidrolizados se obtuvieron mediante el tratamiento de harinas de soja con ácido sulfúrico diluido en las siguientes condiciones: 135 ° C durante 45 min a 4 concentraciones de ácido (0,0%, 0,5%, 1,25%, y 2,0% de H2SO4) y 120 ° C, 1,25% de H2SO4 durante 30 min. En investigaciones anteriores, estas condiciones han demostrado producir las más altas concentraciones de azúcares fermentables (Luj'an-Rhenals 2013).

Los hidrolizados se prepararon por tratamiento de 50 g de SBM con 250 ml de H2SO4 solución en botellas de 500 ml PYREXR de almacenamiento de medios de comunicación con tapones de rosca (Luj'an-Rhenals 2013). Para evitar la acumulación de presión dentro de las botellas durante el tratamiento térmico, tapones no fueron completamente apretados. Un Autoclave de vapor Tuttnauer 2340E (Tuttnauer EE.UU., Delran, NJ, EE.UU.) operado de acuerdo con el programa preestablecido # 1 (de escape rápido sin secado) se utilizó para la hidrólisis. Calefacción transitoria no fue considerado en el análisis. Después del tratamiento térmico, la reacción se detuvo por enfriamiento de la mezcla en un baño de hielo-agua seguido por la modificación del pH a un rango entre 5,0 y 5,5 con gránulos de NaOH. Los sólidos y líquidos fueron separados por centrifugación a 3900 xg durante 35 min a 10 ° C en una centrífuga Allegra X-22R con un rotor SX4250 (Beckman Coulter Inc., Brea, Calif., EE.UU.). Después, los sobrenadantes se filtraron a través de papel de filtro Whatman # 4 (Whatman Plc., Maidstone, Kent, Reino Unido), se analizaron para la concentración de azúcares fermentables, y se utiliza como sustratos para la fermentación. Desde este punto en adelante, estos sustratos se denominarán como caldo de harina de soja (SBMB) como se indica en la Tabla 1.

Cepas microbianas

Las cepas de S. cerevisiae NRRL Y-2233 y Z. mobilis subsp. mobilis NRRL B-4286 se ofrece como polvos liofilizados de la colección de cultivos del Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA), Servicio de Investigación Agrícola (Peoria, Ill., EE.UU.).

Análisis azúcar fermentable

Azúcares fermentables en los hidrolizados fueron analizados con de alto rendimiento hromatography Tamaño exclusión y detección de índice de refracción (HPSEC-RI). El cromatógrafo fue aWaters, (Milford, Mass., EE.UU.) con una bomba de 5 15 HPLC, un inyector manual con un bucle de muestra de 50 l, y un detector de índice de refracción 2410 fijado en 40 ° C. Columnas utilizadas para la separación de azúcares eran un Pack OH HQ SB-804 Shodex (300 × 8 mm),

seguido de Shodex OH Paquete HQ SB-802 (300 × 8 mm) (Showa Denko America, Inc., Nueva York, NY, EE.UU.) conectado en serie. Las columnas fueron precedidos por una manada Shodex OH SB-G (50 × 6 mm) columna de seguridad. Columnas y columna de seguridad se mantuvieron a 55 ° C en un calentador de columna. Una solución de 0,1 M NaNO3 con 0,2% NaN3 funcionar isocráticamente a un caudal de 0,4 ml / min fue utilizado como la fase móvil. Los azúcares se cuantificaron utilizando curvas de calibración de 6 puntos con fructosa y glucosa como estándares. Las células reactivación y preparación de preinóculo y inóculo Tanto S. cerevisiae y Z. mobilis se reactivaron en 5 ml de malta levadura (YM) caldo (Dickinson and Company, Sparks, Md., EE.UU.) y se incubaron a 30 ° C durante 24 h en un agitador orbital (Thermo Scientific Max Q 4450, Dubuque, Iowa, EE.UU.) fijó en 150 rpm. El preinóculo consistía en 5 ml de sterileYMbroth a 30 ° C, donde tanto S. cerevisiae y Z. mobilis se inocularon por separado y se cultivaron durante la noche en el agitador orbital. Para cada cepa respectiva, 0,2 ml del cultivo se sembró a cabo con un bucle sobre la superficie de 2 platos de petri que contienen agar YM (20 g / L de glucosa, 3 g / L de extracto de levadura, 5 g / L de peptona, y 3 g / L de extracto de malta) y se cultivaron durante la noche a 30 ° C antes de añadir al inóculo final. El inóculo se preparó añadiendo todas las colonias formadas en ambos platos a 80 ml de SBMB y permitiendo que las células se adaptan mediante la incubación durante la noche a 30 ° C en el agitador orbital.

Fermentación

Las fermentaciones se llevaron a cabo a 30 ° C durante 36 h con un pH inicial de 5 a 5,5, oxígeno disuelto (DO%) de menos de 1% después de la estabilización, y una concentración de biomasa inicial entre 7 × 106 y 1 x 107 células / ml (Mullins y Nesmith 1987; Siqueira y otros 2008; Laopaiboon y otros 2009). El fermentador fue un sobremesa fermentador y biorreactor (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, EE.UU.) con sistemas de control de temperatura, pH, DO%, agitación, y el nivel de espuma de 1,3 LBioflo / CellinGen 115. Durante la fermentación, se tomaron muestras cada 4 h para estimar los parámetros cinéticos de fermentación tasa máxima de crecimiento específico (μmax), producción de biomasa a partir de azúcar (Yx / s), y el rendimiento de etanol a partir de azúcar (Yp / s) -junto con productividad volumétrica etanol, rp (g / l / h). La densidad celular (nr. De las células L /) se determinó con un hemocitómetro (Doble Neubauer Contando Cámara, 3110, Hausser Científico, Horsham, Pa., EE.UU.) y un microscopio de contraste de fase (Nikon Eclipse E400, Nikon Corporation, Tokio, Japón) . La densidad celular se correlaciona con una curva de calibración de peso seco celular obtenido mediante el secado de soluciones acuosas de concentraciones conocidas de células a 80 ° C durante 20 a 24 h (Alfenore y otros 2002; Bühner y Agblevor 2004). Todos los parámetros cinéticos se calcularon utilizando las siguientes ecuaciones:

Cinética de crecimiento y desarrollo de modelos para la fermentación de etanol

Los parámetros cinéticos de la producción de biomasa se determinaron con el modelo logístico (ecuación (6)) (Wang y otros, 2004).

(6)

donde dx / dt es la tasa de biomasa durante el tiempo de fermentación (g célula / h), μmax es la tasa de crecimiento específica máxima (h-1), x es la concentración de biomasa (g / L), y xmax es el máximo concentración de biomasa (g / L).

Teniendo en cuenta las siguientes condiciones de contorno: t = 0, x = xo, S = Por lo tanto, y P = 0, la ecuación (6) se integró y la ecuación (7) se obtuvo como un resultado, que se refiere producción de biomasa (X) y tiempo de fermentación (t) y se utilizó para ajustar los datos experimentales. (7)

Para el cálculo de los parámetros cinéticos, solamente glucosa y fructosa fueron considerados como limitantes del crecimiento-sustratos debido a que estos azúcares se consumen en las cantidades más altas y más consistentes por los microorganismos de acuerdo con el análisis HPLC.

Diseño experimental

Para la fermentación, el diseño experimental fue un diseño de bloques completos al azar con el tipo de microorganismo y el caldo como factores (Tabla 1). En cada nivel, los experimentos se llevaron a cabo dos veces.

El análisis estadístico

Los datos fueron analizados con el software SAS versión 9.2 (SAS Inst. Inc., Cary, NC, EE.UU.) y los parámetros cinéticos μmax, xmax, y xo determinados. Análisis de covarianza (ANCOVA) se utilizó para ajustar los datos al modelo logístico usando el método de regresión no lineal de Gauss-Newton y comparaciones de cada coeficiente de regresión a través de los tratamientos. Para el mínimo concentraciones de inhibidor y los parámetros cinéticos, los datos se analizaron con JMPR versión 9.0.0 (SAS Inst. Inc.). Para analizar los parámetros cinéticos (Yp / s, Yx / s, ms, y QP), un análisis de la varianza (ANOVA) fue utilizado y las diferencias en la media de los parámetros cinéticos se analizaron mediante la prueba de Tukey-Kramer (α = 0,05 ).

Resultados y discusión

La fermentación del etanol con S. cerevisiae y Z. mobilis S. cerevisiae exhibió respuestas óptimas para la producción de etanol, el consumo de azúcares, y el crecimiento celular en todos los caldos de preformas utilizadas en este estudio (Figura 1). Sin embargo, en la mayoría de caldos de fermentación, Z. mobilis no era tan eficiente (Figura 2). Esta bacteria no exhibió crecimiento con la SBMB3 hidrolizado (135 ° C, 2% de H2SO4, 45 min), pero con la SBMB1 (135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min) muestra su máxima producción de etanol. S. cerevisiae, por otra parte, demostró consumo rápido de azúcar, probablemente porque es un microorganismo robusto que no fue afectada críticamente por los inhibidores presentes en la mayor parte de la SBMB hidrolizado (Luj'an-Rhenals y otros 2014). Zymomonas mobilis se vio afectada por los compuestos inhibidores de la SBMB ((Luj'an-Rhenals y otros 2014) y también por la presencia de sales procedentes del hidrolizado, tales como acetato de sodio (CH3COONa) que es la sal de sodio del ácido acético formado durante el sulfato de reacción y de sodio (Na2SO4) formado durante la neutralización del ácido sulfúrico con hidróxido de sodio. (Yang y otros 2010) demostró que la combinación de iones Na + y elevadas de acetato condujo a un efecto inhibidor sinérgico sobre la cepa ZM4.

Cinética de consumo de sustrato durante la fermentación

S. cerevisiae exhibió su más rápido consumo de azúcar de 15,6 g / L durante las primeras 12 h de fermentación con la SBMB4 (120 ° C, 1,25% de H2SO4, 30 min) y 15,1 g / L durante la primera 12 h de fermentación con el SBMB1 (135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min) (Figura 1e). Por otro lado, los caldos de preformas de los tratamientos de hidrólisis más graves parecían dar lugar a una baja tasa de uso de azúcar a partir del caldo de fermentación por S. cerevisiae (Figura 1e). Esta baja tasa de consumo de azúcar se produjo debido a compuestos tóxicos formados durante el proceso de hidrólisis que reduce el crecimiento de la levadura (Luj'an-Rhenals y otros 2014). Z. mobilis también expresó su más rápida absorción de azúcar de 15,0 g / L por 16 h de fermentación con la SBMB1 (135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min) (Figura 2b). Similar a S. cerevisiae, Z. mobilis tenía bajas tasas de consumo de azúcar aparente durante el crecimiento en los caldos (Figura 2C y 2D) como resultado de los pretratamientos más severas, en particular SBMB2 (135 ° C, 1,25% de H2SO4, 45 min), que es probablemente debido al efecto inhibidor del ácido acético y sales como se discutió previamente.

En general, el coeficiente de mantenimiento ms (g de azúcar consumidos / g de células h) para ambos microorganismos no dió diferencias estadísticamente significativas a excepción de S. cerevisiae con SBMB2 y SBMB3, que dio valores más altos (2,7 y 2,8 g de azúcar / g de células h, respectivamente ) que los otros coeficientes (Tabla 2). Sin embargo, numéricamente, todos los coeficientes para ms de Z. mobilis eran más bajos que los coeficientes EM calculado para S. cerevisiae que significa que las bacterias aparentemente requiere menos sustrato de carbono por célula de la levadura. Este resultado también se ha informado anteriormente por (Dien y otros, 2003). Por lo tanto, Z. mobilis utiliza menos de sustrato por gramo de células producidas de S. cerevisiae y tiene más de carbono disponible para la producción de etanol (Dien y otros, 2003).

Cinética de la producción de etanol

S. cerevisiae exhibió su producción máxima de etanol de 8 g / L durante la primera 8 h de fermentación de la SBMB1 (135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min) y SBMB4 (120 ° C, 1,25% de H2SO4, 30 min). En contraste, la producción de etanol más baja (5,67 g / L de etanol) se produjo con la SBMB3 (135 ° C, 2% de H2SO4, 45 min) después de 28 h de fermentación, donde, posiblemente, algunos compuestos inhibidores de (sales de acetato, a partir de ácido acético, y otras sustancias tóxicas no identificados) podrían haber reducido la productividad de etanol. La producción de etanol por Z. mobilis alcanzó un máximo de 9,2 g / l de etanol después de 20 h de fermentación con la SBMB1 (135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min). El SBMB0 (135 ° C, 0% de H2SO4, 45 min) permite una tasa máxima de etanol de 3,9 g / L de etanol después de 20 h de fermentación. Sin embargo, los niveles más bajos de producción de etanol-1 g / L a 20 h-se han cumplido con la SBMB2 (135 ° C, 1,25% de H2SO4, 45 min) y SBMB4 (120 ° C, 1,25% de H2SO4, 30 min), que es probablemente causado por los inhibidores (acetato a partir de ácido acético, otras sales, y compuestos desconocidos). Ha habido informes anteriores de que la producción de etanol con Z. mobilis y su crecimiento se puede reducir sustancialmente incluso con bajas concentraciones (2-8 g / L) de ácido acético (Wang 2008).

El rendimiento de etanol (Yp / s, g etanol / g de azúcares) en la Tabla 2 no mostró diferencias estadísticas significativas entre los 2 y los microorganismos respectivos caldos de preformas utilizadas. Sin embargo, numéricamente ambos microorganismos mostraron rendimientos de etanol similares a los valores teóricos, que es 100% para 0,51 g de etanol / g de azúcares (Doran 1997). Las fermentaciones en el SBM0 y SBMB1 dieron a los más altos rendimientos de etanol, 96% del rendimiento teórico para ambos microorganismos, que son comparables o incluso superiores a los valores reportados en la investigación anterior (Siqueira y otros 2008; Zhang y Feng 2010; Da Cunha-Pereira y otros 2011; Letti y otros 2012; Romao y otros 2012). Además, la productividad volumétrica más alta etanol (rp) para S. cerevisiae se logró con la SBM1 (1,01 g de etanol / L h) y SBMB4 (1,00 g de etanol / L h), sin diferencia significativa entre el 2, pero difieren con respecto a los otros caldos utilizados en esta investigación (Tabla 2). Estos valores de S. cerevisiae son comparables a, y algunos más altos que los reportados por otros investigadores (Da Cunha-Pereira y otros 2011). Sin embargo, Z. mobilis alcanzó una productividad volumétrica máxima etanol (rp) de 0,61 g de etanol / Lh sólo con el SBM1, que es inferior a los valores, 1.4 a 1.8 g de etanol / Lhwith Z. mobilis durante la producción de etanol a partir de melaza de preformas (Letti y otros 2012). Además, es menor que 2,8 g de etanol / Lh obtuvo para la producción de etanol con Z. mobilis de patata dulce (Zhang y Feng 2010); sin embargo, es mayor que 0,59 g / Lh usando material lignocelulósico como sustrato (Mohagheghi y otros 2002). Estos resultados demuestran que la aplicación de Z. mobilis para la fermentación de etanol no es factible cuando el sustrato es caldo de SBM obtenida bajo las condiciones aplicadas en estos experimentos. Esto es probablemente debido a la alta concentración de ácido acético, sales y otros compuestos desconocidos tóxicos formados durante la hidrólisis ácida en los caldos obtenidos bajo tratamientos severos.

Cinética de crecimiento de la biomasa y el desarrollo de modelos para la fermentación

Los datos reportados en la Figura 1a indican que S. cerevisiae cedió su concentración máxima de biomasa (2,3 g / L) después de 12 h de fermentación anaeróbica cuando se expone a la SBM0 (135 ° C, 0% de H2SO4, 45 min), seguido por tratamiento enzimático con celulasa . Del mismo modo, también se llegó a esta concentración máxima de biomasa (2,3 g / L) con SBMB4 (120 ° C, 1,25% de H2SO4, 30 min) a 24 h.

Sin embargo, SBMB3 (135 ° C, 2% de H2SO4, 45 min) mostró una importante inhibición de crecimiento de la levadura ya que la biomasa dio no más de 0,5 g / L después de 32 h de fermentación. En general, la producción de biomasa de S. cerevisiae parece estar asociado directamente con la producción de etanol.

Z. mobilis exhibió su más alta concentración de biomasa, 3,9 g / L, después de 20 h de fermentación (Figura 7.2a) con el SBMB0 (135 ° C, 0%, H2SO4, 45 min), seguido por tratamiento enzimático con celulasa.

Del mismo modo, la biomasa producida (3,3 g / L), cuando la fermentación del SBMB1 (135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min) estaba muy cerca de la primera, pero requiere 24 horas para llegar a este

nivel. En contraste, SBM2 (135 ° C, 2% de H2SO4, 45 min) mostró los efectos inhibitorios sobre el crecimiento primario de Z. mobilis debido a mayores concentraciones de sales, ácido acético y otros inhibidores en el caldo que restringe su crecimiento (Doran 1997; Yang y otros 2010). En general, Z. mobilis también mostró la producción de etanol de crecimiento asociado con la excepción de los caldos donde las bacterias se inhibieron considerablemente.

Los datos de las respuestas de crecimiento de células ajustaron a un modelo logístico durante la primera 24 h de fermentación se muestran en la Tabla 3. Las tasas de crecimiento específicas máximas (μmax) muestra que en el SBM0 y SBMB4, μmax para S. cerevisiae (0,63 y 0,60 h- 1, respectivamente) fueron mayores pero no significativamente diferente de μmax para Z. mobilis, 0,55 h-1, en el T3C0t3 sustrato. Wang y otros (2004), también utilizando el modelo logístico, reportaron una μmax de 0,1 h-1 para la fermentación etanólica de jugo de manzana con S. cerevisiae (Huang andWang 2010) obtuvo una μmax de 5,2 h-1 utilizando Saccharomyces diastaticus con mixta azúcares como sustrato. Mohagheghi y otros (2002) informaron de Z. mobilis un μmax de 0,34 h-1 para la fermentación etanólica de biomasa lignocelulósica hidrolizada. En general, μmax para S. cerevisiae fue mayor para los sustratos obtenidos con tratamientos previos de menor gravedad; Z. mobilis μmax no mostraron el mismo patrón, debido al efecto de los inhibidores presentes en algunos de los caldos de preformas.

La concentración inicial de biomasa (x0) no fue significativamente diferente entre todos los caldos para ambos microorganismos, lo cual es una indicación de que el inóculo se preparó de forma homogénea y se introduce en cada caldo de SBM. El otro parámetro cinética derivada ajustando el modelo logístico a las primera 24 h de fermentación era la concentración máxima de biomasa (xmax). Para S. cerevisiae, xmax fue de 2,28 y 2,23 g / L para SBMB0 y SBMB4, respectivamente, mientras que el xmax máximo para Z. mobilis era 3,79 g / L y 5,1 g / L para la SBMB0 y SBMB1, respectivamente. El rendimiento de biomasa a partir de sustrato (Yx / s) enumerados en la Tabla 2 fue significativamente mayor (P = 0,05) para S. cerevisiae (0,1 g de células / g de azúcar consumido) de Z. mobilis (0,08 g de células / g de azúcar consumida) cuando se fermenta el SBMB1. Los valores más altos con S. cerevisiae que mobilis Z. También se han reportado por otros investigadores (Dien y otros 2003, Aitabdelkader y Baratti 1993). Esta es una función de la mejor resistencia de la levadura a los inhibidores presentes en estos sustratos (Weber y otros 2010). Sin embargo, con SBM2 el efecto era el contrario, el valor de Z. mobilis fue de 0,15 g de células / g de azúcar y para S. cerevisiae fue de 0,04 g de células / g de azúcar. No obstante, la mayoría de los valores de S. cerevisiae fueron más altos que los informes anteriores (Siqueira y otros 2008) para la producción de bioetanol a partir de melazas de soja y similares a los valores (0,14 g / g) informó en otro trabajo (Ahmad y otros 2011) .

Conclusiones

S. cerevisiae mostraba buenas cualidades en la producción de etanol, el consumo de azúcares, y el crecimiento celular para todos los caldos de la harina de soja acidhydrolyzed probados sin ningún tipo de nutrientes adicionales, mientras Z. mobilis tenía un rendimiento inferior para la mayoría de caldos. Se alcanzó la mayor producción de etanol de S. cerevisiae, 8 g de etanol / L, (4 g de etanol /

100 g SBM fresco) durante la primera 8 h de fermentación con el caldo obtenido a 135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min y el de 120 ° C, 1,25% de H2SO4, y 30 min. Sin embargo, Z. mobilis produjo la máxima producción de etanol, 9,2 g / L de etanol, (4,6 g de etanol / 100 g SBM fresco) sólo después de la primera 20 h con el hidrolizado obtenido a 135 ° C, 0,5% de H2SO4, 45 min.