FUNGITEST TM 6078010 PRUEBASDETERMINACION DE LA SENSIBILIDAD DE LOSHONGOS A LOS AGENTES ANTIFUNGICOS

1- INTERES CLINICOEn los últimos años se ha observado un nuevo brote de infecciones porhongos, y ello debido al aumento del número de individuos inmuno-deficientes (9).Esto se debe principalmente al uso de quimioterapias anticancerosas máspotentes, a tratamientos inmunosupresores más intensivos en receptoresde trasplantes y al uso de antibióticos de amplio espectro (2, 3).Este brote se acompaña de un aumento del número de especiespatógenas identificadas (10) y de la aparición de resistencia en lasespecias previamente conocidas.En este nuevo contexto puede ser de utilidad una prueba in vitro de lasensibilidad de los hongos a los agentes antimicóticos (1, 4, 7, 8).FUNGITESTTM logra este objetivo, ya que permite la determinación de lasensibilidad de los hongos a los agentes antimicóticos según un métodoestandarizado derivado de un método de referencia (5, 6), fácil de llevar acabo y de interpretar.

2- PRINCIPIOFUNGITESTTM se usa para estudiar el crecimiento de hongos en presenciade 6 agentes antimicóticos a 2 diferentes concentraciones, en un mediotamponado RPMI 1640 modificado, en presencia de un indicador deoxidorreducción.La verificación del crecimiento se basa en la reducción del indicador decolor, que hace pasar el medio desde el color azul al rosa. Cuando elagente antimicótico inhibe el crecimiento, el medio permanece de colorazul.Esta prueba, que se lleva a cabo en una microplaca de 16 pocillos,consiste en:• 2 pocillos para el control del crecimiento• 12 pocillos que contienen los agentes antimicóticos deshidratados

(6 agentes antimicóticos a 2 concentraciones diferentes)• 2 pocillos para el control negativoUn inóculo calibrado de la cepa que se va a someter a prueba se diluye enel “medio de suspensión” y luego se distribuye en cada uno de lospocillos de la microplaca.El “medio de suspensión” inoculado vuelve a hidratar los agentes antimi-cóticos presentes en cada pocillo.

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Las concentraciones antimicóticas obtenidas corresponden a concentracionesdiscriminadoras, que permiten la clasificación de las cepas en:• cepas sensibles (S)• cepas intermedias (I)• cepas resistentes (R)Los umbrales de discriminación han sido escogidos de acuerdo con el estudiode la distribución de los agentes antimicóticos M.I.C. obtenidos conmicroplacas prototipos utilizadas con el mismo procedimiento que elFUNGITESTTM.Este estudio preliminar (11) fue llevado a cabo en dos laboratorios dereferencia, la Unidad de Micología del Instituto Pasteur de París y elLaboratorio de Inmunología de la Facultad de Farmacia de Montpellier; seseleccionaron 193 cepas para que fuesen representativas de cepas aisladasen la práctica médica corriente, con la inclusión de cepas resistentes. En dichoestudio, 8 diluciones de 6 fármacos antimicóticos fueron sometidas a prueba yse obtuvo la distribución de los M.I.C. resultantes obtenidos. Sobre la base delas gráficas de distribución y de los datos de la literatura médica reciente seseleccionaron 2 concentraciones para cada fármaco antimicótico para lapresentación final de la galería.Ante la ausencia de recomendaciones internacionales actuales que den unainterpretación de los M.I.C., los umbrales de discriminación constituyen uncompromiso y podrían ser modificados en el futuro: se necesitan otrosestudios que definan la correspondencia entre los resultados obtenidos in vitroy su importancia clínica.

3- COMPOSICION DEL ESTUCHEFUNGITESTTM incluye:• Microplate : 10 microplacas individualmente envasadas de 16 pocillos

(el diagrama de la microplaca está indicado en la etiqueta).• 10 películas adhesivas• Suspension medium : 10 frascos que contienen 3 ml de medio de

suspensión listo para su usoCada microplaca está individualmente envasada en una bolsa de aluminioprecintada con una película adhesiva y un deshumidificador.

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Diagrama de la microplacaT + ➩ Control positivo

5 FC ➩ 5- fluorocitosina (2-32 µg/ml)

AB ➩ amfotericina B (2-8 µg/ml)

MCZ ➩ miconazol (0,5-8 µg/ml)

KET ➩ ketoconazol (0,5-4 µg/ml)

ITR ➩ itraconazol (0,5-4 µg/ml)

FLU ➩ fluconazol (8-64 µg/ml)

T- ➩ Control negativo

4- CONSERVACIONLos reactivos, conservados a +2 – 8°C, son estables hasta la fecha decaducidad indicada en el estuche.

5- MATERIAL REQUERIDO, PERO NO INCLUIDO• Micropipetas de 20 µl y 100 µl • Micropipetas de 20 µl y 100 µl • Conos estériles• Opacity control 1 Mac Farland: código 56499• Incubadora a 37°C y 32°C.

6- PROCEDIMIENTO

A) PREPARACION DE LA SUSPENSION DE HONGOS• Se utiliza una pipeta para tomar 2 colonias similares de un cultivo puro y

fresco obtenido en un medio de Sabouraud con o sin antibióticos y seintroducen en 3 ml de agua destilada estéril con vistas a obtener unprimer inóculo calibrado con un equivalente de opacidad con el estándarMac Farland nº 1 (Opacity control 1 Mac Farland), por ejemplo, ≈ 3 x 106

hongos/ml.

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• Con una pipeta calibrada se diluyen 100 ìl de este inóculo en 1,9 ml deagua destilada esterilizada.

• Se inoculan 20 ml de la dilución obtenida en el medio de suspensiónincluido en el estuche. La concentración del inóculo es ahoraequivalente a ≈ 1 x 103 hongos/ml.

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B) INOCULACION DE LA MICROPLACA• Con una pipeta calibrada se distribuyen 100 µl de esta suspensión en

cada pocillo de la microplaca.• Se cubre con la película adhesiva.

C) INCUBACION DE LA MICROPLACASe incuba : - a 32 °C durante 72 h para Cryptococcus neoformans

- a 37 °C durante 48 h para los demás hongos.

D) LECTURA E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS• Sólo se examinará la placa cuando los pocillos del control positivo (T+)

sean de color rosa.• Se observará cualquier cambio de color en los pocillos que contienen el

agente antimicótico, en comparación con los pocillos negativos decontrol (de color azul).

• Se interpretará de acuerdo con el color de los 2 pocillos de cada agenteantimicótico:- Azul-Azul = ausencia de crecimiento: cepa inhibida por el agente

antimicótico in vitro- Rosa-Azul = crecimiento lento: cepa intermedia- Rosa-Rosa = crecimiento: cepa no inhibida por el agente antimicótico

in vitro.

7- PRECAUCIONES DE USONo se deben usar los reactivos después de la fecha de caducidad.

RECOMENDACIONES DE HIGIENE Y SEGURIDADLas cepas y los reactivos inoculados son potencialmente infecciosos; sedeben manipular con las precauciones habituales y se deben desechar deacuerdo con los reglamentos actuales de higiene y seguridad para estetipo de productos.

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8- CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBALos resultados de FUNGITESTTM se controlan utilizando las siguientescepas:

* Incubación durante 72 horas a 32 °C

9- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los reactivos han sido fabricados de acuerdo con nuestro Sistemade Calidad, desde la recepción de las materias primas hasta lacomercialización final del producto. Cada lote se somete a verificacionesde control de calidad y únicamente se comercializa en el mercado cuandoestá conforme con criterios predefinidos de aceptación. Los informesrelativos a la producción y el control de cada lote individual se conservanen Bio-Rad.

10-REFERENCIAS BIBLIOGRAFICASVer la versión Francesa.

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CEPAS RESULTADO DEL CULTIVO A LAS 48 HORAS A 37°C

T+ 5FC AB MCZ KET ITRA FLU T-

C. tropicalis ATCC 750 Rosa S S/I S/I S S/I S Azul

C. krusei ATCC 6258 Rosa I S/I I S/I S/I I Azul

C. albicans CIP 884.65 Rosa S S/I S/I S S S Azul

C. glabrata SDP A35 Rosa S S S/I I I/R I/R Azul

C. parapsilosis ATCC 22019 Rosa S S S/I S S/I S Azul

C. neoformans SDP B53* Rosa S/I S S/I S/I S/I I/R Azul

10-REFERENCES1. ANAISSIE ELIAS J, KARYOTAKIS NICHOLAS C, HACHEM RAY, DIGNANI MARIA

C., REX JOHN H., AND PAETZNICK VICTOR. Correlation between In Vitro and InVivo Activity of Antifungal Agents against Candida Species. The Journal ofInfection Diseases 1994 ; 170 : 384-389.

2. BERENGUER J, FERNANDEZ-BACA V , SANCHEZ R, BOUZA E. In Vitro Activityof Amphotericin B, Flucytosine and Fluconazole against Yeasts CausingBloodstream Infections. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995 ; 14 : 362-365.

3. DROMER F, DUPONT B. The increasing problem of fungal infections in theimmunocompromised host. J. Mycol. Méd. 1996 ; 6, Suppl. I : 1-6.

4. ESPINEL-INGROFF A, PFALLER MA. Antifungal agents and susceptibility testing.In MURRAY PR, BARON EJ, PFALLER MA, TENOVER FC, YOLKEN RH, eds.Manual of Clinical Microbiology, 6th ed. Washington, DC : American Society forMicrobiology, 1995.

5. ESPINEL-INGROFF A, RODRIGUEZ-TUDELA JL, and MARTINEZ-SUAREZ JV.Comparison of Two Alternative Microdilution Procedures with the NationalCommittee for Clinical Laboratory Standards Reference Macrodilution MethodM27-P for In Vitro Testing of Fluconazole-Resistant and -Susceptible Isolates ofCandida albicans. J. Clin. Microbiol. 1995 ; 33 : 3154-3158.

6. NCCLS. Antifungal Susceptibility Testing; Committee Report. NCCLS documentM27-T. NCCLS, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, Pennsylvania. October1995.

7. PAUGAM A. Intérêt de l'étude in vitro de la sensibilité des levures auxantifongiques. Revue française des laboratoires. 1996 ; 282 : 157-159.

8. PFALLER MA, BUSCHELMAN B, BALE MJ, et al. Multicenter comparison of acolorimetric microdilution broth method with the reference macrodilution methodfor in vitro susceptibility testing of yeast isolates. Diagn Microbiol Infect Dis. 1994 ;19 : 9-13. 4

9. WALSH TJ, GONZALEZ C, ROILIDES E, MUELLER BU, ALI NASR, LEWIS LL,WHITCOMB TO, MARSHALL DJ, and PIZZO PA. Fungemia in Children Infectedwith the Human Immunodeficiency Virus : New Epidemiologic Patterns, EmergingPathogens, and Improved Outcome with Antifungal Therapy. Clin. Infect. Dis.1995 ; 20 : 900-906.

10. WINGARD JR. Importance of Candida Species Other than C. albicans asPathogens in Oncology Patients. Clin. Infect. Dis. 1995 ; 20 : 115-125.

11. GARRIGUES ML, MALLIE M, DUPONT B, BASTIDE JM, CARLS B, DROMERF. Evaluation d’une galerie pour tester la sensibilité des levures auxantifongiques. Colloque de la Société Française de Mycologie Médicale,Institut Pasteur, 22-23 Novembre 1996.

(GB) • This product contains human or animal components. Handle with care.(FR) • Ce produit contient des composants d'origine biologique humaine ou animale. Manipuler avec précaution.(ES) • Este producto contiene componentes humanos o animales. Manejar con cuidado.(IT) • Questo prodotto contiene componenti umane o animali. Maneggiare con cura.(DE) • Dieses Produkt enthält Bestandteile menschlichen oder tierischen Ursprungs. Vorsichtig handhaben.(PT) • Este medicamento contém componentes de origem humana ou animal. Manuseie com cuidado.(SE) • Denna produkt innehåller beståndsdelar från människa eller djur. Hantera produkten varsamt.(DK) • Dette produkt indeholder humane og animalske komponenter. Skal behandles med forsigtighed.(GR) • Αυτό το προϊόν περιέχει ανθρώπινα ή ζωικά στοιχεία. Χειριστείτε το µε προσοχή.(PL) • Niniejszy produkt zawiera składniki pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego. Nale y obchodzić się z nim ostro nie.(LT) • Šiame produkte yra žmogiškosios arba gyvūninės kilmės sudėtinių dalių. Elgtis atsargiai.(HU) • A készítmény emberi vagy állati eredetű összetevőket tartalmaz. Óvatosan kezelendő.(EE) • Käesolev toode sisaldab inim-või loomseid komponente. Käsitseda ettevaatlikult.(SK) • Tento výrobok obsahuje ľudské alebo zvieracie zložky. Narábajte s ním opatrne.(CZ) • Tento výrobek obsahuje lidské nebo zvířecí komponenty. Zacházejte s ním opatrně.(RO) • Acest produs conţine materiale de origine umană sau animală. Manevraţi-l cu grijă.(BG) • Този продукт съдържа човешки или животински компоненти. Бъдете внимателни при работа с него.(LV) • Šis produkts satur cilvēkiem vai dzīvniekiem paredzētas sastāvda as. Apieties uzmanīgi.(MT) • Dan il-prodott fih komponenti umani jew tal-annimali. U a b’attenzjoni.(NL) • Dit product bevat menselijke of dierlijke bestanddelen. Breekbaar.(SI) • Izdelek vsebuje človeške ali živalske sestavine. Rokujte previdno.(FI) • Tässä tuotteessa on ihmisestä tai eläimistä peräisin olevia osia. Käsittele varovasti.

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