genetic - india.oup.com

45
GENETIC Engineering SMITA RASTOGI Department of Biotechnology Delhi Technological University Delhi NEELAM PATHAK Department of Biotechnology Integral University Lucknow © Oxford University Press

Upload: others

Post on 01-May-2022

0 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: GENETIC - india.oup.com

GENETICEngineering

SMITA RASTOGIDepartment of BiotechnologyDelhi Technological University

Delhi

NEELAM PATHAKDepartment of Biotechnology

Integral UniversityLucknow

© Oxford University Press

Page 2: GENETIC - india.oup.com

�� �������� ����������������� �

��� ���������� ��� ��������������� �

��� ����������������������������� ����� ��������� ����� ���������������������� !���������� ��

�� ���������������������� ����������� ��

�� ���������� �� � "�����������#��������� �� �� !��$��%&������' !�

!������%�(�����������)�#�� �*�*�*+ ��

�� "�������,�������������'"!�(������� !�$��%&�����-�#�� �*�*��.+ ��

�� "!��$��%&������'"!��!������%�,����������)�#�� �*�*�/+ �

�/ ��0������$1���1������'2��1��1���1����(&��������$1���1�1%������)�#���������+ �

�* $��%���������3������'$!3+'�,$4� ��( ��1���1����%����������($1���1������������)�#�� �*���*5+ �

�5 !��6�����'$��%��7%��������������%��1�����+�

�. ��7%������������ ' !���+

��8 "�����������'"!���+ � ��� $1���1�������������'#����������+ � �� �(��������'#���� ���5�+� ��� 9�����: !����%���%�����'#���� � � ��+ ��� $����������3�'#������ ��/�+ ��� 6%��;%&��'#���� ����*+

��/ ,������&������

�� ����� ��������� ������ �

��� ���������� ��� <��������������"�������������

=�����������'"(=+��%���& ���� !�&������������"�����������#���������� ����� ,%�������"�����������#���������� ����� "���������������� ��

��/ ����������%�"�����������#���������� ����* ������������"�����������#���������� ��

Contents

��5 ����������������"����������

#���������� ��

�� �!��� ���"���!�����#�$����� ������� �%�

��� ���������� ����� �������(�1������������(�1�����%��1���� ���

��� <����������$�������������

�1�&������%��1�������� !� ������ �����������������(�1���

�%��1����4�$1���1���&�����=��1� ����� !���%��1���;���

'���&��������($1�����%��1����+ ����/ �%���&�����#�����������6�����

�%�#7����������#����1&����'�#6#>+ ���

��* !���1��� ���

&� "���!�����#���'���������()� ���

��� ���������� ���

�� #����1&�������$��������������&"!�� ���

��� � !���%��1���� ���

�� *� !��+����#�)� ��� �� ����������������"���

,� ������� ���

/�� ���������� ��

/� ����#�������1������ ��/�� #��������� !��?���&��������&���� ��

/�� ����?�����������1��&�������1% ���/�� �����%���������������������� ���

-� .���������!������� ��� �%-

*�� ���������� ���

*� ����������$�"��������� ���*�� ,1��&�������� !��$��%&������ ���

*�� $��&��� �������� ���

*�� �%����!&��� ���*�/ $�"�$�����@��� ���

*�* ����������������$�"�$���� ���*�5 ?�����������������$�"��&����������� ���

*�. ������������$�" ���*��8 ����1��&���,��1��A������ !�

�&����������� ���

*��� ����������������$�" ��

� ����� �

����������� ��������� �

.��*��/�,�)(�0�)*�1"�$,���)�*����)��)����)�

GE Prelims (6th Proof).p65 7/3/10, 7:11 PM7

© Oxford University Press

Page 3: GENETIC - india.oup.com

viii Contents

� .������� ���

5�� ���������� ��

5� ��������������$���&� ���

5�� B1%����$���&��!����������������&�C ���

5�� $���&���������� ���

5�� $���&����;��"���� ���

5�/ �1��������$���&��4����������%

�����������������6����������&�� ���

5�* "��������������$���&�� ���

5�5 $���&��<����"���� ���

5�. �������=��������������$���&�� ���

5��8 �����������$���&�����%�!&��� ���

5��� $���&������&���������% ���

5�� $���&���������������� ���

5��� $���&��$���������� ��

5��� $���&�������������������������#���������� ��

2� ��3� ���'!��� �-�

.�� ���������� ���

.� D�����%������D��������1��� ���

.�� ��D��������1�������E�1����$��������������� !� ��

.�� =��1���������������������� !������D�������������� ���

.�� ��D��������1�����������������1���� ���

�%� 0���3� ���'!��� ���

�8�� ���������� ���

�8� D�����%����?���&������D��������1���� ���

�8�� =���D��������1��������������������� ���

�8�� �����������=���������� ���

��� 4������������5� �� ��-

���� ���������� ���

��� B1%����@������%���&�"�A���C ���

���� !�����������7�����1�����&���&��������

����"���&���������������� ���

���� ,�������&���������@���������� ���

���� @����� (�&�$���&� ���

���/ @�������������������� ���

��� 5� ���$�!��*!�����������.�������6

��3� ���'!���6�����0�� ���

� �� ���������� ��

� � �1�&������������ ��

� �� ���&�!��������D��������2�1���,1��

�������������������������� ���

� �� ���&�$��������D������������������

������� ���

� �� $�����������&���������������� ���

� �/ $��$1������������� ��

� �* ?������%���&��2�1���,1���@���� ��

� �5 ������������1��&���&�� ���

� �. �1������������ ���

� ��8 #7���������������� ���

� ��� ������������,��������������� ���

.��*����/�5��*$�"��"�(��)���)���1$)�)�

.��*�����/���)���*�$)��)(�"����)�)��$,����$03�)�)*"

�&� ����� ����#������ ����� ()��1�7���� ��2

���� ���������� ��

��� ����&���6�����%� ��

���� � !��6�����% ��

���� $�"����������������������6�����%

����������� ���

��� *� !��+����#�"��� ���6�" ������6����

�!�� ���������#�*���#����� � -

�/�� ���������� ���

�/� �����������=��0�������� ���

�/�� "������������� ���

�/�� ������������������'�+������������ ���

�/�� !����������D�����������<%����;����� ��

�/�/ $��������������F?������(����

,��1��A�� ��

��� 8������#�()��,������� ���

���� ���������� ���

��� 6����������� !��?���&���������� !�

6����� ���

���� 6��������9�����<�&����%&���,������ ���

���� ���������������������%����#��������%���

6���������%�=���������������1��#�����

"�����������?���&���� ���

��� ����� ����#�()������9�������� ��%

���� ���������� ���

��� �������������� !�������D��������

����� ��

���� �������������� !�������@���������� ���

���� ��������,�������&���������$����� ���

���� �������������� !�������������� ��

GE Prelims (6th Proof).p65 7/3/10, 7:11 PM8

© Oxford University Press

Page 4: GENETIC - india.oup.com

Contents ix

.��*��5/��..1��(���)�*����)��)����)�

�-� $�!��*� !��+����#������� �0���'������ &�

�*�� ����������� ��

�*� ����� ��=���������� ��

�*�� �����=������������%�"���&��������� ��

�*�� ,��1��A���D���������������������� �

� � 0�� ����0�:�� &&�

�5�� ���������� �

�5� D���1�&�����=��0��� �

�5�� =��������=��0���

�5�� "�����������?���&����6����1

$��%&���1��&

�5�� "���&��&�������$��%&���1��� !� �

�5�/ �&�������?���&����6����1

$��%&���1��& �

�5�* =������������������1����,���&

"������ �

�5�5 �������������������&�����

$��%&���1��& �

�5�. �������!��������$��%&���1��& �

�5��8 =��(������������ ��

�5��� =��0��(����������������� ��

�2� *� !��+����������������� ������.���� � &-�

�.�� ���������� ��

�.� ,��1��A���9����������&��� ��

�.�� ,��1��A���9������$�����&��� ��

�%� �''�� ������#�����������������*���#�

*� !���� ���

8�� ���������� ��

8� ����������������"���&������

=�����������&� ��

8�� ����������������,����������$����

,��1�����% ��

8�� �������������������&�������������

,����������,��1�����% �

��� "�#�������������������������������

���������� �-2

��� ���������� ��

�� !��������"�������%�=��1����&

�����&���&������������D�������%

�������������<��������=2� ��

��� ��������?����������"���&������� !�

D�������%���������-�"��������������

����"������1����,����������$���������"��0

������&��� ��

��� "���������������=�$�����4�!��������

�������G���������% ��

��� "����������"������������&������"������1

���<&���������� ��

���� ���

����� ���

GE Prelims (6th Proof).p65 7/3/10, 7:11 PM9

© Oxford University Press

Page 5: GENETIC - india.oup.com

1.1 INTRODUCTION

�������������� ������� �� ����������������������� ����

���������������������������������������������� �!��������

�"�������������������#����$����%�������$����������&������

'��������������������������� �����������������������������

���������������()*������ ������� +, �-����������������

������������������ ���������������������������"�������

�����������������������������������������������������

�������������.�������( � ���� ����.���������������/���

�������������012������ ���������������312,��� �������

��� �����"���� ���� �������� ���� ������ ���� /���� �����

������������������������������������������ �!���������

An Introduction toGene Cloning

���� ���� ����������� ������� ����� ���� ���� ���� ���� ��

��������������������������������� ���������� ������������

����������� ���� ������ ���� �� ��������� ��� �����"���� ���

������ ������������������������ �2��������������� ��������

����� ���� ���� ���������� ��� ���� ������ ���� �����������

���������������������������� ����������������������������

���� ��� ���� �������������� ��"������� ( � �� �����.����,�

��������������������������012����312��������������

����������������������������������"������

!��������"����������������(���������������������������

�,� ����������� � �� ��� ���� �������� ��� ������ 012� (����

�������������0124���������0124�*�������0124�����

0124012��������4������� �������,� ����������� ��������

Key Concepts5��������������������������������������6

� '����� ������

� &������ �� ��������������

� &�������

� 2� ������������������012������

Exhibit 1.1 Deoxyribonucleic acid (DNA)

DNA is a high molecular weight biopolymer comprising ofmononucleotides as their repeating units, which are joined by3’ � 5’ phosphodiester bonds. Each mononucleotide unit of DNAconsists of purine and pyrimidine nitrogenous bases, phosphorus,and a pentose sugar 2’-deoxy-D-ribose (Figure A). Examples ofpurine bases are adenine (A) and guanine (G), and examples ofpyrimidine bases are cytosine (C) and thymine (T) (Figure A).

The nitrogenous bases are planar due to their �-electron clouds,hydrophobic, and relatively insoluble in water at the near neutralpH of the cell. Purines exist in both syn or anti forms, whilepyrimidines due to steric interference between the sugar and

carbonyl oxygen at C2 position (carbon atom at position 2) ofpyrimidine exist in anti form. Besides, the major nitrogenous bases,some minor bases called modified nitrogenous bases also occur inpolynucleotide structures, for example, 5,6-dihydrouracil,pseudouracil, 4-thiouracil, 5-methylcytosine (5-MeC), and 5-hydroxymethylcytosine, etc. Phosphorus is present in the sugar–phosphate backbone of DNA as a constituent of phosphodiesterbond linking the two sugar moieties. Sugars are always in closedring �-furanose (ketose) form and hence are called furanose sugars.The base is linked to the sugar by �-N-glycosidic linkage. Fiveatoms in the sugar ring are denoted as 1’ to 5’, while six atoms in

2 - eoxy- -ribose¢ D D

N

N

H

O

Thymine

H CH3N

N

H

N

HH

O

Cytosine

N

N

N

HH

Adenine

N

N

H

N

N

Guanine

N

N

H

N

H

H

HO O

CHHC

CHHC

OOH

OH H

OH CH2

16

5

432

7

89

16

5

432

7

89

34

5

612

34

5

612

Figure A Structures of 2-deoxy-D-ribose sugar and four nitrogenous bases (A, G, C, and T)

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM2

© Oxford University Press

Page 6: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 3

to T, and the amount of G is always equal to C (molar equivalenceof bases); (v) Base ratio A+T/G+C may vary from one species toother, but is constant for a given species, and this ratio is used toidentify the source of DNA; and (vi) The deoxyribose sugar andphosphate components occur in equal proportions in the sugar–phosphate backbone. Based on the X-ray data of Franklin andWilkins and the base equivalence observed by Chargaff, Watsonand Crick (1953) proposed a model for the 3-D structure of DNA.This model accounted for many of the observations on the chemicaland physical properties of DNA and also suggested a mechanismfor the accurate replication of genetic information.

DNA contains two polynucleotide chains that are coiled in helicalfashion around the same axis in right-handed or counterclockwisedirection, thus forming a double helix. The two chains or strandsare antiparallel, i.e., the 3’,5’-internucleotide phosphodiesterlinkages run in opposite directions on two strands. The antiparallelorientation is a stereochemical consequence of the way that Apairs with T and G pairs with C. All the phosphodiester linkageshave the same orientation along the chain, giving each linearDNA strand a specific polarity, and distinct 5’ and 3’ ends. Thebackbone of helix consists of sugar and phosphate groups, whilepurine and pyrimidine bases are stacked inside the helix with theirplanes parallel to each other and perpendicular to the helix axis.Hydroxyl groups of sugar forms H-bonds with water. DNA isnegatively charged due to its phosphate groups and negativecharges are generally neutralized by ionic interactions with positivecharges of protein, metals, and polyamines. Bases beinghydrophobic, project inwards to the center, and hence shieldedfrom water. Backbone is found on the periphery of the helix and ishydrophilic. It means that single stranded structure, in which thebases are exposed to aqueous environment, is unstable. Thus DNAis double helix, in which two strands are held together by H-bonding interactions between complementary base pairs andhydrophobic [(�–�) stacking interactions between adjacent bases]interactions. A perfect Watson–Crick base pair consists of a perfectmatch between hydrogen donor and acceptor sites on the twobases. Thus, a purine on one strand base pairs with a specificpyrimidine on the other strand; the resulting base pair exhibitsproper spatial arrangement. Thus the base A is base paired to T bydouble H-bonds and G is bonded to C by triple H-bonds (Figure C).This forms the concept of specific base pairing.

The individual H-bond is weak in nature, but a large number ofsuch bonds involved in the DNA molecule confer stability to it.However, the stability of DNA is primarily a consequence of vander Waals forces and hydrophobic (base stacking) interactionsbetween the planes of stacked bases. On one hand, H-bonding isspecific, which is responsible for complementarity of two strands,on the other hand, hydrophobic interactions are nonspecific andare responsible for the stability of the macromolecule. Note thatthe two DNA strands tend to stick together even in the absence ofspecific H-bonding interactions, although these specificinteractions make the association stronger. The two helices arewound in such a way so as to produce two interchain spacings orgrooves, a major or wide groove (width 12 Å, depth 8.5 Å), and aminor or narrow groove (width 6.0 Å, depth 7.5 Å). The majorgroove is slightly deeper than the minor one. The two groovesarise because the glycosidic bonds of a base pair are notdiametrically opposite each other. The minor grove contains theO2 position of pyrimidine and the N3 positions of the purine of

pyrimidine ring (or nine in purine ring) are denoted as 1 to 6 (or1 to 9) as shown in Figure A. The compounds in which thenitrogenous bases are conjugated to the pentose sugars by �-N-glycosidic linkages are called deoxyribonucleosides ordeoxyribosides. These linkages are formed between the N1 atomof pyrimidine (or the N9 atom of purine) with the C1’ carbon atomof sugar. Thus, the purine deoxyribonucleosides are N-9 glycosidesand the pyrimidine deoxyribonucleosides are N-1 glycosides. Theseare stable in alkali. The purine deoxyribonucleosides are readilyhydrolyzed by acid, whereas pyrimidine deoxyribonucleosides arehydrolyzed only after prolonged treatment with concentrated acid.These deoxyribonucleosides are generally named for the particularpurine and pyrimidine present. The nomenclature ofdeoxyribonucleosides differs from that of the bases. The trivialnames of purine deoxyribonucleosides end with the suffix –sineand those of pyrimidine deoxyribonucleosides end with suffix –dine, for example, deoxyribonucleosides containing A, G, C, and Tare called deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxycytidine, anddeoxythymidine, respectively. The phosphate esters ofdeoxyribonucleosides are called deoxyribonucleotides ordeoxyribonucleoside triphosphates. The phosphate is alwaysesterified to the sugar moiety. Esterification can occur at any freehydroxyl group, but is most common at the 5� and 3� positions insugars. The phosphate residue at � position is joined to the sugarring at C5 by a phosphomonoester bond, while �- and �-phosphategroups are joined in series by phosphoanhydride bonds. Thesedeoxyribonucleotides occur either in the free form or as subunitsin DNA linked by phosphodiester bond as shown in Figure B.

Chargaff (1950) formulated important generalizations aboutthe structure of DNA, which form the Chargaff’s equivalence rule.According to the rule, (i) The base composition of DNA varies fromone species to another; (ii) DNA specimens isolated from differenttissues of the same species have the same base composition; (iii)The base composition of DNA in a given species does not changewith age, nutritional state, or changes in environment; (iv) Purinesand pyrimidines are always equal such that amount of A is equal

CHHC

CHHC

O

P

O

OO

Phosphodiester bond

Base

Base

Mononucleotide

b- -glycosidic bondN

CHHC

OCH2

O

3¢ 2¢HC CH

CH25¢

4¢ 1¢3¢ 2¢

O

Figure B Structure of deoxyribonucleotide

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM3

© Oxford University Press

Page 7: GENETIC - india.oup.com

4 Genetic Engineering

N9

8 N7

5 6

4

N3 2

O H N

N1

H N

4

H

3 6

N12

OHN

HG

Sugar

Sugar

C

N9

8 N7

5 6

4

N3 2

OHN

N1

H N

4 5

H

3 6

N12

O

Sugar

Sugar

T

CH3

A

Major groove Major groove

Minor groove Minor groove

AA D

5H

A

D A

A H

A D A

M

A

Figure C Watson–Crick base pairs: G:C and A:T

toward the minor grove in G:C and C:G base pairs is ADA, and AHAin A:T and T:A base pairs (Figure C). Thus the major groove displaysmore information as compared to the minor groove. The doublehelices of DNA are plectonemic coils, i.e., coils that are interlockedabout the same axis. These strands cannot be pulled apart, butcan be separated by the unwinding process. The Watson and Crickstructure of DNA is referred to as B-DNA (normal form). It is thebiologically important one and exists under physiological conditionsdescribed below. The structural details of ds DNA as suggested byWatson and Crick (i.e., B-DNA) are shown in Figure D and Table A.

the base pair, while the major groove is on the opposite side ofthe pair. At each groove, potential H-bond donor and acceptoratoms are exposed to external environment, which serve as theinteraction sites for the DNA-binding proteins. Thus the sequenceof H-bonding donors and H-bonding acceptors exposed towardthe major groove in a G:C base pair is AADH, while in an A:T basepair is ADAM (A is H-bond acceptor, D is H-bond donor, H is nonpolarhydrogen, and M is methyl group). Similarly, the sequence is MADAin T:A base pair, and HDAA in C:G base pair toward the majorgroove. The sequence of H-bonding donors and acceptors exposed

O–

O–

O P

O

CH25¢

C

O

H H C1¢

HCCH

3¢ 2¢

O H

O–

O P

O

CH25¢

C

O

H H C1¢

HCCH

3¢ 2¢

O H

O–

O P

O

CH25¢

C

O

H H C1¢

HCCH

3¢ 2¢

OH H

–O OP

O

CH2

C

O

HC1¢

H C C

H

3¢2¢

OHH

H

GC

CH2

C

O

HC1¢

H C C

H

3¢2¢

OH

H

C

OA CH2

CHC1¢

H C C

H

3¢2¢

OH

H

T

O

–O OP

O

–O OP

O–

G

5 end¢

3 end¢

3 end¢

5 end¢

GC

Minorgroove

Majorgroove

TA

AT

GC

AT

GC

CG

AT

AT

CG

TA

AT

TA

GC

2 nm

Pitch = 3.4 nm

Figure D Watson–Crick double helical structure of DNA

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM4

© Oxford University Press

Page 8: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 5

Table A General Characteristics of Three Helical Conformers of DNA

Characteristics Helical conformations of DNAA B Z

Relative humidity 75% 92% –Ions required/salt concentration Na+, K+, Cs+ ions Low ion strength Very high salt concentrationShape Broadest Intermediate NarrowestHelical state Right Right LeftPitch (base pairs per turn) 11 10.5 12 (=6 dimers)Major groove Deep, narrow Wide FlatMinor groove Broad, shallow Narrow Narrow and very deepHelix diameter ~26 Å ~20 Å ~18 ÅSugar pucker conformation C2’ endo C3’ endo AlternatingGlycosidic bond angle anti anti Alternating anti/synDisplacement –4.4 0.6 3.2Twist 33 36 –49/–10Helix rise per base pair 2.6 Å 3.4 Å 3.7 ÅHelix pitch 25.30 Å 35.36 Å 45.60 ÅBase tilt normal to helix axis 20° 6° 7°Inclination 22 –2 –7Rotation per base pair +32.72° +34.61° –60° (per dimer)

DNA is strongly acidic molecule owing to the presence ofphosphate groups. Double helical DNA is maximally stablebetween pH 4.0 and 11.0 (physiological range). Outside thesephysiological limits, DNA becomes unstable and unwinds. DNAis very flexible in nature, and due to thermal fluctuation, bending,stretching, and unpairing (melting) of strands can occur.However, when melted DNA is incubated at a temperature ~25°Cbelow the denaturation temperature, the two separated strandsreassociate (or reanneal or renature) to form a ds DNA moleculedue to complementary sequences present in the two strands.DNA exhibits a strong positive rotation. Upon denaturation,optical rotation is highly decreased and becomes more negative.The solution of ds DNA possesses an absorption maximum at260 nm. This characteristic absorption maximum is the propertyof its individual bases, and their corresponding deoxyribonucle-otides. Upon denaturation of DNA, an increase in absorption oflight (up to 40%) occurs even though the amount of DNA remainsthe same. This phenomenon is called hyperchromic effect. Thetemperature at the midpoint of melting curve is called meltingtemperature (Tm). Because of the rigidity of the double helixand the immense length of DNA in relation to its small diameter,the solution of DNA is highly viscous at pH 7.0 and roomtemperature (25°C). Mammalian DNA forms a band at positioncorresponding to 1.7 g/cm3 buoyant density in a CsCl densitygradient upon centrifugation.

Some structural variants of DNA may also arise due to differencein possible conformation of deoxyribose, rotation aboutphosphodiester bonds in the sugar–phosphate backbone, and freerotation about C1’-�-N-glycosidic bonds (syn or anti). Major helicalconformers that are formed at different humidities are A and Zforms. These differ in the gross morphological features, bond angles,base inclination, displacement of the base pairs from the helicalaxis resulting from dehydration, helix parameters as base pairsper helical turn, helical twist, size, and shape of grooves. Thevariations in minor and major grooves potentially influence thenature of protein–DNA interactions and consequently affect theregulatory property of DNA. However, the key properties of DNA indifferent forms are not changed. A-DNA is observed when therelative humidity is reduced below 75% and is also favored inmany solutions relatively devoid of water. Moreover, the doublestranded regions of RNA (as in hairpins) and RNA:DNA hybridsalso adopt a conformation similar to A-DNA. The structure of Z-DNA is characterized by alternating helical parameters and torsionangles with a two-base pair periodicity, causing the backbone ofthe helix to zig-zag and hence the name. The general characteristicsof A-, B-, and Z-DNAs are tabulated in Table A.

Sources: Watson JD, Crick FHC (1953) Nature 171: 737–738;Dickerson RE (1983) Sci. Am. 249: 94–111; Watson JD, Baker TA,Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R (2004) Molecular Biology of theGene, Pearson Education (Singapore), pp. 97–128.

���������� � ���������� ���� �����������������

����������������������� �� ������������������

�� �������������������������������� ���������� �

������������������ ������������� ��������� ��� ���

����������������������������� ����������

������� ��������������� ���������� � �

���� ����� �� ���� ���������������������� ��

���� ������������� � �� ���������� ���� ���

������� ����������� ���� ���������������

�������� ��������!������������������� � ������

����� ���� ��� �� ��� ���������� �������� �

����� ������������������������������ ������ �

����� ������������������ ������������ ������� ��

�������� ����������� �������������� ������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM5

© Oxford University Press

Page 9: GENETIC - india.oup.com

6 Genetic Engineering

Exhibit 1.2 Ribonucleic acid (RNA)

RNA is a long, unbranched macromolecule consisting of nucleotidesjoined by 3’ � 5’ phosphodiester bonds. Chemically, RNA is verysimilar to DNA. It contains nitrogenous bases such as A, G, C, anduracil (U), phosphorus, and a D-ribose sugar (Figure A). Thestructural differences between the components of RNA and DNAinclude presence of U instead of T (its nucleoside is called uridine),and D-ribose sugar instead of 2’-deoxy-D-ribose sugar.

The linkages between sugar and phosphate in the sugar–phosphate backbone, and sugar and base (perpendicular tobackbone) are the same as described in the structure of DNA inExhibit 1.1. The structural difference in the sugars of RNA andDNA confers very different chemical and physical properties onRNA. RNA is much stiffer due to steric hindrance and moresusceptible to hydrolysis in alkaline conditions (high pH). UnlikeDNA, under physiological conditions, RNA is single stranded.However, the single strand can fold back on itself havingpotentially much greater structural diversity than DNA. Thesesecondary structures arise due to intramolecular base pairing.If the two stretches of complementary sequences are near toeach other, RNA may adopt stem loop structures in which theintervening RNA is looped out from the end of the double helicalsegment (e.g., secondary structures include hairpin, bulge, orsimple loop). Similar to DNA, weak interactions, especially basestacking interactions, play a major role in stabilizing RNAstructures. Where complementary sequences are present, thepredominant double stranded structure is an A-form right handeddouble helix. The presence of 2’-OH on the sugar residue in theRNA backbone prevents RNA from adopting a B-form helix.A feature of RNA that adds to its propensity to form secondarystructures is an additional non Watson–Crick G:U base pair. Notethat G:U base pair contains two H-bonds, one between N3position of U and carbonyl on C6 of G, and the other betweenthe carbonyl on C2 of U and N1 of G, and due to these additionalG:U base pairs, RNA chains have an enhanced capacity of self-complementarity.

On basis of size, function, and stability, there are three typesof RNAs, viz., ribosomal RNA (rRNA), messenger RNA (mRNA),and transfer RNA (tRNA). The rRNAs are the components ofribosomes (16S, 23S, and 5S rRNAs in prokaryotic 70S ribosomes;18S, 28S, 5.8S, and 5S rRNAs in eukaryotic nuclear 80S ribosomes),which are the sites for protein synthesis. The mRNA carries geneticinformation from one or a few genes to a ribosome. The proteincoding region(s) of each mRNA is composed of a contiguous,nonoverlapping string of codons called open reading frame (ORF),which is a sequence of DNA consisting of triplets that is translatedinto amino acids starting from initiation or start codon at 5’-end

(e.g., AUG in most bacteria and eukaryotes or GUG or UUG insome bacteria), and ending with a termination or stop codon[e.g., UAG (amber) or UGA (opal) or UAA (ochre)] at 3’-end. EachORF specifies a single polypeptide, and starts and ends at internalsites within the mRNA, i.e., the ends of an ORF are distinct fromthe ends of mRNA. Prokaryotic mRNA is polycistronic, i.e., a singlemRNA molecule codes for two or more polypeptide chains or simplyit contains multiple ORFs. The prokaryotic mRNA contains aribosome-binding site (RBS; also referred to as Shine Dalgarnosequence). It is complementary to a sequence located near the3’-end of 16S rRNA. RBS base pairs with 16S rRNA, thereby aligningthe ribosome with the beginning of mRNA during the process oftranslation. Note that some mRNAs lack RBS and have translationalcoupling of termination with initiation due to the presence ofsequence 5�-AUGA-3� (in this overlapping sequence, UGA markstermination for previous transcript and AUG marks initiation forthe next). In contrast, eukaryotic mRNA is monocistronic, i.e., asingle mRNA codes for single polypeptide chain or simply itcontains single ORF. There is no RBS, rather the eukaryotic mRNAis recognized by translation machinery by 5’ cap and the startcodon (AUG) is reached by scanning. Note that most of theeukaryotic mRNAs contains a 5’ cap and a 3’ poly (A) tail. ThetRNA serves as adapter molecule in translating the language ofnucleic acids in mRNA into the language of proteins by serving ascarriers of specific amino acids to specific sites on the ribosome.Thus anticodons of charged tRNAs (i.e., tRNAs covalently linkedto an amino acid at 3’-end in a reaction catalyzed by amino acyltRNA synthetase) pair with the codons of mRNA in such a waythat amino acids are joined to form a polypeptide chain in acorrect sequence.

Sources: Uhlenbeck OC, Pardi A, Feigon J (1997) Cell 90: 833–840; Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M, Losick R(2004) Molecular Biology of the Gene, Pearson Education(Singapore), pp. 97–128.

CH2

HC

O

CH

CHHC

OH OH

OH

3¢ 2¢

4¢ 1¢

OH

D-ribose

HN

O N

H

Uracil

O

12

34

5

6

Figure A Structure of D-ribose and uracil

����� ������������������������� ����������

� ���� ��� ������� ������ � �������� �� �������

������ � ����������������� ����������� ������

������� �� �����������������������������������

������������ ����� ���� ������������������� ����

���� �������� ������������� ������ � ��� �

������� ��������� �������� ������� ����� �����

��������"��������������������������� �

�������� ���� ����������������� ����� �����#�

����� ��� �������������������������� � ���

���������� ��������� �� �������������� �� � ��� �

���#���$%�� �&����������������� ����������

'��� ����� � ���� ������� ������������ � �������

����� �������� ���������������� �����������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM6

© Oxford University Press

Page 10: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 7

��� ������������������������� � ������ ������� ��

� ��� � ���� ��� �� ���� � ��� � � �� ������� �������

���� � ���������� ������������������������� �

� �������� ������ �(� ��������������� ����������

���� ��� ����� � � � �������� ����� ������ �

��������������������� ����������� � �� �� ��

�������� ����� � ������� �� ���������� ������

�������� ����������� ������ ���������� ���� �����

������������� �����������#�������������� ����� �

���� ������ ������������)� ������������ �

���������������� ��������������� �� ��� ���

������ ��������������������*������������

���� ����� ����� ������� ������� �������� ��

����� ������������� ���� �������������� ��

1.2 CLONING VECTORS

������������� ������ ����&��������������

�� � ����������� ������� �+ ��� ���������,������

���� ��������������������� ����������� ����

���������������������� ����������� �������� �

� ��������������������������������� ��� �������

����������������� �����

���������� ������������� ��&��������� �����

������� ����� ������� ������� ���� ������� ��

������ �������� � ���������������������������

�� �� � ������ � �� �� ������� ���� � � ��������������

������������������� � ���������+� ��������-��

�� �.�/�/,��������������� �������+-��� �.�/�.,�

� �� � �� ��������� �������� � ������������ � ��������

�� ������� ������� ������ ������������� �� �����

���� ������ ���������������� ���������� ���������

����������������������������� ��������01����

+2&�����.�3,�

1.2.1 Examples of Cloning Vectors

�&����� ���������� �������� �������������� ��������

�� ������� �� ��������� �� ���� �������� ���������

������ ����� +�����4.3� 5.,� ������ 6������ ������

Exhibit 1.3 Escherichia coli (E. coli)

Theodor Escherich, a Germanpediatrician and bacteriologist,cultured ‘Bacterium coli’ in 1885 fromthe feces of healthy individuals andconcluded that this bacterium can befound almost universally in the largeintestine or colon, and named it ‘coli’.

It was renamed Escherichia coli (E. coli) in 1919 in a revision ofbacteriological nomenclature to lend more specificity to thisparticular form of bacterium.

E. coli (Domain: Bacteria; Phylum: Proteobacteria; Class:Gammaproteobacteria; Order: Enterobacteriales; Family:Enterobacteriaceae; Genus: Escherichia; Species: coli) is a gramnegative, unicellular, facultatively anaerobic chemoorganotrophcapable of both respiratory and fermentative metabolism,mesophilic, nonphotosynthetic, and nonsporulating eubacteria.It is small (length ~2 m, diameter 0.5 m, and cell volume of0.6–0.7 m3) and straight rod-shaped bacterium. The motilebacterium contains peritrichous flagella. It is one of thecharacteristic members of the normal intestinal (lower intestine)flora of warm-blooded animals, i.e., it is a coliform or entericbacterium. However, it can also survive when released into thenatural environment, allowing widespread dissemination to newhosts. The strains that are part of the normal flora of the gut areharmless and can benefit their hosts by producing Vitamin K2 orby preventing the establishment of pathogenic bacteria withinthe intestine. Most E. coli strains are harmless, but somepathogenic E. coli strains are responsible for infection of theenteric, urinary, pulmonary, and nervous systems, for example,serotype O157:H7 can cause serious food poisoning in humans.

The genome of E. coli is well studied. Sequence analysis ofE. coli K-12 has revealed that the bacterium has a single circularchromosome of 46,39,221 bp and molecular weight of 2.7 � 109 Da.Its 4,288 protein-coding genes have been annotated, out of which38% have no attributed function. The genome of E. coli K-12, likeother E. coli genomes, has a 50.8% G+C content. Genes that codefor proteins account for 87.8% of the genome, stable RNA-encodinggenes make up 0.8%, noncoding repeats contribute to 0.7%, andabout 11% is for regulatory and other functions. Comparison withfive other sequenced microbes reveals ubiquitous as well asnarrowly distributed gene families. Many families of similar geneswithin E. coli are also evident. The largest family of paralogousproteins contains 80 ABC transporters. The genome as a whole isstrikingly organized with respect to the local direction ofreplication. The genome also contains insertion sequence (IS)elements, phage remnants, and many other patches of unusualcomposition indicating genome plasticity through horizontaltransfer. E. coli and related bacteria possess the ability to transferDNA via bacterial conjugation, transduction, or transformation,which allow genetic material to spread horizontally through anexisting population.

E. coli is easy to cultivate and it can live on a wide variety ofsubstrates. It can be easily cultivated on synthetic medium,with a minimal medium comprising of ingredients (g/l): 5glucose, 6 Na2HPO4, 3 KH2PO4, 1 NH4Cl, 0.5 NaCl, 0.12 MgSO4,and 0.01 CaCl2. It can also thrive well in complex medium, forexample, Luria Bertani (LB) medium. The pH of the media is 7.0and sterilized by autoclaving [15 psi (1.05 kg/cm2), 121°C, 20min]. On rich media, bacteria grow with a doubling time of 20min, hence readily visible colonies can be seen overnight whenplated on agar (Figure A). Specialized medium, like MacConkey’s

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM7

© Oxford University Press

Page 11: GENETIC - india.oup.com

8 Genetic Engineering

agar, was developed for the selective isolation and identificationof E. coli, as this was used as a global indicator for the pollutionof water supplies. Optimal growth of E. coli occurs at 37°C, butsome laboratory strains can multiply at temperatures of up to49°C.

From the beginning, although pathogenic strains were alsofound, E. coli was used as a representative, harmless bacteriumthat could be safely and easily cultivated, and it became one ofthe most studied bacterium in various fields of science. E. coliwas an integral part of the first experiments to understandbacterial and phage genetics, process of replication, conjugation,gene regulation, the concept of operon, etc. Thus, it has servedas prokaryotic model organism in various studies includingmolecular genetics, microbiology, and genetic engineering. Firstcloning experiments were also undertaken in E. coli and thisorganism became the primary cloning host. However, under somecircumstances, it may be desirable to use a different host for agene cloning experiment. This is especially true in biotechnology,where the aim may not be to study a gene, but to use cloning tocontrol or improve synthesis of an important metabolic product(e.g., a hormone such as insulin) or to change the properties ofthe organism (e.g., to introduce herbicide resistance into a cropplant). Hence subsequently, cloning techniques were extendedto a range of other microorganisms, such as B. subtilis,Pseudomonas spp., A. tumefaciens, yeasts, filamentous fungi, andhigher eukaryotes. Despite these advances, E. coli remains themost widely used cloning host even today because genemanipulation in this bacterium is technically easier than in anyother organism, and the widest variety of cloning vectors areavailable for this organism. As a result, it is unusual for researchersto clone DNA directly in other organisms. Rather DNA from theorganism of choice is first manipulated in E. coli and subsequentlytransferred to the original host or another organism. Without theability to clone and manipulate DNA in E. coli, the application ofrecombinant DNA technology to other organisms is greatlyhindered. The dominant role that E. coli plays in recombinantDNA technology is due to construction of many well-characterizedmutants, good understanding of gene regulation, establishmentof growth medium, isolation of many plasmids, and establishmentof genetic transformation procedure. E. coli is considered a veryversatile host for the production of heterologous proteins andhence by introducing genes into these microbes, mass productionof recombinant proteins in industrial fermentation processes ispossible. One of the first useful applications of recombinant DNAtechnology is the manipulation of E. coli to produce human insulin.Other applications of modified E. coli include vaccine development,bioremediation, production of immobilized enzymes, etc.

Several E. coli strains find application in genetic engineeringexperiments. Few such examples include cultivated strain K-12(isolated at Stanford University in 1922 from human feces), DH5�,C600, and XL-1 Red. The K-12 strain has universally been adoptedfor fundamental work in biochemistry, genetics, and physiology.E. coli K-12 serves as the precursor for almost all strains used bymolecular biologists for propagating cloned DNA. This is becausethis strain is well-adapted to the laboratory environment, andunlike wild-type strains, it is nonpathogenic and has lost theability to thrive in the intestine. Note that the K-12 strain harbors

a lysogenic bacteriophage and a number of plasmids. Manylaboratory strains lose their ability to form biofilms. These featuresprotect wild-type strains from antibodies and other chemicalattacks, but require a large expenditure of energy and materialresources. Improvements in E. coli K-12 for recombinant DNAexperiments include: (i) Removal of Eco K restriction system(hsd R–); (ii) Removal of mcr A/mcr B genes (mcr A–/mcr B–) thatare responsible for degrading methylated foreign DNA, but not atthe sites that E. coli K-12 recognize as its own (e.g., human andmouse DNA is CpG methylated); (iii) rec A– mutation thatsuppresses homologous recombination, which makes it moresensitive to UV light; and (iv) end A– mutation in the endonucleaseA gene that greatly improves the quality of DNA isolated withbiochemical techniques. Some derivatives of K-12 are XL1-Bluestrain [rec A1 end A1 gyr A96 thi-1 hsd R17 sup E44 rel A1 lac{F’ pro AB lac Iq Z�M15 Tn 10 (tetr)}], and XL1-Blue MR strain{�(mcr A) 183 �(mcr CB – hsd SMR – mrr) 173 end A1 sup E44thi-1 rec A1 gyr A96 rel A1 lac}. Like many cloning strains, E. coliDH5� strain with a genotype [fhu A2 �(arg F - lac Z) U 169 phoA gln V44 �80 (lac Z) �M15 gyr A96 rec A1 rel A1 end A1 thi -1 hsdR17] has several important features, which make it useful forrecombinant DNA methods. These are as follows: (i) The straintransforms with high efficiency; (ii) The end A1 mutationinactivates an intracellular endonuclease that degrades plasmidDNA in many miniprep methods; (iii) The hsd R17 mutationeliminates the restriction endonuclease of the Eco KI restriction–modification system, so DNA lacking the Eco KI methylation willnot be degraded. DNA prepared from hsd R strains that are wild-type for hsd M will be methylated and can be used to transformwild-type E. coli K-12 strains; (iv) lac Z�M15 is the �-acceptorallele needed for blue-white screening with many lac Z-basedvectors; (v) rec A eliminates homologous recombination. Thisreduces deletion formation and plasmid multimerization; and(vi) sup E44, with a systematic name gln V44, is an ambersuppressor mutation. The chromosomal genotype of strain C600is sup E44 hsd R thi-1 leu B6 lac Y1 ton A21 hfl 150 chr :: Tn 10(tetr). The genotype of XL-1 Red is end A1 gyr A96 thi-1 hsd R17sup E44 rel A1 lac mut D5 mut S mut T. This strain is used forintroducing random mutations into a gene of interest. Thoughthis strain has the Tn 10 insertion with tetracycline, it should notbe used for selection, as it is frequently lost.

Sources: Blattner FR, Plunkett IIIG, Bloch CA, Perna NT, Burland V,Riley M, Collado-Vides J, Glasner JD, Rode CK, Mayhew GF (1997)Science 277: 1453–1474; http://ecoliwiki.net/colipedia/index;Stanier RY, Lingraham JL, Wheelis ML, Painter PR (1986) TheMicrobial World, Prentice-Hall India, pp. 145–182.

Figure A E. coli colonies on solid medium

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM8

© Oxford University Press

Page 12: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 9

+������� ��������� ��������� ���� �����������*���

�����&������-������������-������ ���������7���������

������� ����� � -891� ���, � ����� ������ +��� �

����� �����,� �������������� +���� ������� ��� ����

������������������ ���� � ����������� ��� �����:�

���,;� ��������������� ������������������������� ���

����������� ������������������������� �����������

��������+����� ���������������������� ����,��������

������� � � ��+��������������������� � � �������

����������������� � � ��5.������������������� � � ��

���������������������� � � ����������������������� �

� � �,� ��� � ����� ���� ��� �� +���� ��������� ���

������������� ������,+� ��������!������<� ./,�

1.2.2 Properties and Construction of a VectorDNA Molecule

���� ��������� ��� ����� ������ ��� ���

���������������� �� �����&����� ���� �� �����

&����� � � �� �� �� ��� ���� � �� ���� ��=��

� ��� � �� ��� � ���� ����� � �� �� �� ��� �

��������� ������� ������� ���&����������������

����� �����)� ���������� ���� ������ � ����

��������������������� ��� ��������� ������������ ��

�������������������������� �������������+��������

������>� ��� �������������������������������� ��

������� ���� ���� ��������� ����� ����������

� � ������� ����� ���>� �� �� � ����������� ��

����,� ��� ����� �������� ��� ����������� �

������������ � ���� �� �&����� � ����� ����

����� �� ��?

Capability of Autonomous Replication #�����������

��������� �� ���������������� ��������� �������

��� ������ �������� ��� ��� ��� ����������

� ����� �� �� ���� ��� ����� � �� ������� �����

4 � ����� ���� � ���� ������ ����� ���������

������� ���� ��(��� �� ��������� ��� ��������

�� ����� � �������� �� ������� ������ � �����������

�� �������������� ������� ���� ����������������

������� ��� ����� ��� � ����� ��������� ������

����� ��� ������������ ������+������� � � �������

��������������+ ��,�

@� �� � ������� � � ��� �� �� ������ � ���� ��

���������� ���� � � ���������� �+�������� ����� ����

������ �,� � ���� � �� � ��� � � ������ &����� � �

�� ������ �������� ��� ������ �&����� �

� � ������ ��&����� � � ����� � &�� � ��� ��

������������ ������ ����� ��������� ���� ������

� ����������������� ������������� ���� ��� ���� ��

-���������������� ������ �� ����������� � �

������� ����� ��� ����� ��������� ������ �

���������� ��� ���������� � � ������� ��� �� ����

� ������� ����������������� ��� �������������

����� ���� � � � ���� ������� ��

Small Size ��� ������������� ���� ����������

�� ��A +� ��� �����������, ������������ -����

� ����������� �������� ����������������������

��������������� ����������������������������

�������� ��@��� ������������� ��������� ����

� �� �������� � ������������� ���������� �

����� �������������4 � ��� �� ������ ������ ��

����� � ������� ����������� ��������� ��A��+�,

��������#������� ������������ ���������������

���������������� �� ������B������ ������������

������������������ ������������������������

����� ���� � �� ���� +=�� � �� ����, &����� �� �

���� ����� � �������������� ������ �������

�������������� ��������-����������������������

�������� �� �C������������������ � �������� ��

������ ��� � � �� ����� � ������������� ��� ���� �

��� ������� � � �� ���� � � ���� ��� ����� ����

�������C���� ��A+ ���,�������� ������������ �

����A����������������� � �����������������������

������ �����������������

Presence of Selectable Marker Gene(s) 8�� �� �����

�� ���� ����� ��������������+�, +���������� ���

���������������D� ���������� � &������,����� ��

���������� ������� ����������� �� ���������� ����

�� ����������� ����� ����� ��� ���� ��� ����

�� � ����� ��������+� ��������!�����.E,�#�� �

�����������������������������������������������

���� ���� ��� �� ��� �� ���� �� ������� ��������

��������� �������� ������� � � � ������� �� ����

������ � ��������� ����������������������+�,���

��� �� ������� ��������� ������� ���� ��� �����

� � ������ ��� �������� ��� ���� �� � ���� �

������ � ����� ���� � ������������� �� �����

������ ���� �6�����.��0��F�����.1� ����������

�������� �����������+���� ����,����������+ � �

��,���� �������� �+���,��������������+����,������

�����;��- �&����� ���� ����� � ������ �����+�,

� ��������&����� � ����� �������������

�&����� �+� ��������!�����.E,�

Presence of Unique Restriction Enzyme Site(s) or Mul-tiple Cloning Sites for Inserting the Target DNA B ��� ��

��� �� �� � ������� ����� �������� � �A�� ���+�,

�� ��������� ������ ����� �������������

�������� � �� ������ �� �� � �� �������� �� ���� ���

+4!-) � �������,� � � ���� � � ��� �������� � ����

�� �������������������� � ������� ���������

���������������� ������ �������������������

���������� � ��� ����� ����� � � &����� � �� �

��������� ������ ��� �� �� �&����� � ������ �

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM9

© Oxford University Press

Page 13: GENETIC - india.oup.com

10 Genetic Engineering

�� ���� �� �� �A�� ���� � ������ ������ �� � ����� ��

������� ��������� ���A��������+������������ � �,�

� �����4!-������������������A������� ��������

�� ��A�� �� ����� ��������������� ����������

��������� ��A����������� �� �4!-��� ������

������������� ����������� ��� ��������������

������� �+���������� ����� ������� ������� ������

�������� ��A�� ���� ��4!-�� ���������,���� ��

�� ������ ������ ������������� �������������>����� �

���������� ������ ������� �� ��&������� �� ���� �

�������� ��A����

Ease of Purification G������������������������� ����

���� ������ ���� ������� �������������������

� ������ ��� ��� ������������A � ����� ����

� ������������ ��������� ����������� �������

���������������������� ��� ������������

No Effect on the Replicative Ability of Vector due toInsertion of Target DNA � ���� ����� � � ��������

��� ��� ����� ����� � ���� ����������� ��

���� �� ������� ���� ����� ���� � ������� ���� �

����������������������� ���� ����� �����

Ease of Reintroduction into Host Cell with High Efficiency � ������ ����� �>��������� � �� � � �� �� ��� �����

���������������� ��� ���4 � ������������� �

����� ������� ���������

Biological Containment �����������A�������� ��� ��

����������� � �� ��� �� ������ ��������#������

� ������� ���� ������ � �������� ����������� � ��

�������� � �� ����� ����� ����� ���� �� � ��

� �� �C���������� �� ����A������������� ��� �� ��

C������ �� ����A������������������� �� �C������

�� �� ����A������������� ���������� ������ ���

� �&���������������� ����� ������� ���� �����

&����������� ������������A+� ��������!�����<,�

B ��� � ������ �������� ������� ��������������

� ��� � ������ �������� ������ ����������� �� ��

������������ �&���������������������������

���� �������� ���������H� �� �� � ���� ������� ��

�����+� ��������!�����F,�

Presence of Promoters and Ribosome Binding Site �� ���

���� ������� ������ ������ �����������������

�� ����������������� �������&���� ������ ����������

B �&�����&����� ���� �� ���������� � ���������

�������� ����+����������� ������� ���� �,��� ���

��������������� � ����� �������������������� ��

���������������� � �������� � �����������+="-,

+��������� ������� ���� �,��� ����������������� � ���

�� ������������+� ��������!�����./,��* ����

�� ����������� � ���> � ��������� � � �� �� �� �� ���

��� ������������� � ��������� � �����="-��

��������� ��� �� ��������� �� �� �� �� �������� �

������������������������������������ ��� �

���� ��������&����� ���� ����� ������

Presence of Two Different Origins of Replication or BroadHost-range Origin of Replication 4 �� � �� � ����

���������� �� ��� ��� �� �� �� ���� &������� ��

������������ �� �������)� ���������� ���� �������

� ����� ����� ��������� �� ������������� �����������

�������������������������������� ����� ����&����

������ ������������������������ ��* �������

�������� �� ��������������� ��� ����� ����� ����

�������� ������ ��������� ����� ����+������ �� �

�������������, ������������� ����� ��� �������

+����� ���� ��������������������� ��� ������,�����

������� � ����������� �� � ������ ����&����

������������������� ����������������� ���� �����

���� ������������ ���� ������������ ��������������

��� �������������� ������������������� �� �������

��� ���������������� �� �� � � �� �� �� �� � ���

����� ����� �� ��� ����� ��� �� ���� � ��������

������� �������������� �� �� ������������ ���� ����

� ���� �� ���������������� ����������� �� ��������

�� ������� ������ ��������� � ���� ��� ������� ���

��� ��������� �������� �������������� ����� �������

� ����� �&��������������� ������������+� ��������

!�����./,�

Specialist Vectors 2&����� � ��� ������ ������

� �� ����������� ��+� ��������!�����./,�B �

&�������&����� ���� �������������� �

��� �� ����?+�,8�� ����� ���������������&�����

�� ���� ���� ������ ���� �������� &����������

������ �������������� ���������� ��������� �����

�������&������� ������ ��������� � ������������

�������������������� ����� ���� ����)+��,8�� �

���� ����� ��� ���� ������ ������� � �� &�����

��� � � ���� ���� ������ ����������������� ��

��A���� �������� � ������� ������B �������������

��� �� �� �������� �� �� �� ���� ���������

�� ���+���������, ��������� ������������� ���

+������,)���+���, ������� ����� ������������ �

��� ���������� � � �� &����� ��� � � �� �� ���

��� ��� �������� ���������� � � ������I����� �� ����� ��

������ ����������� ��*����� �������������

���� ��������

1.3 STEPS INVOLVED IN GENE CLONING

��������� ������� ������ ��������������� ��

���� ����&������ �� ���� �� �� ���������� ��

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM10

© Oxford University Press

Page 14: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 11

@����������� ���� ������� ����&���������

���� ������ �������� ������ �������������

�� ���� � � ������ �� � � ���������� � ���� ��� ��

� �� ������ ���� � ������������������������������

���������������������-��� �.�3�3�� ���������

������������ ������ ������� ������������

����������������� ������������� ��� ��+����

���������� ������,����������� �� ������� ��

� �� ���� �� ���� �������������� ����������

� ������� �������������������� ��������

��� ����������� �� ���� � �� ���� ������ � ��

� ����������� ������ ��� ������������������

����� ����� �����������&��� ��� ����������

� ���������������������������� ������ �

�� �������� �+ �� �, ���������������� ����

�����#����&������� ����������� ����������

�� ������� � ���������������������� ���� ���������

����� ���� ������������������������ ���������

����� � ������ �� ������ � � ��� � ������

��������� ������ ����� ����������������� � �

��� ������������������������������������� ��

'�� ��( ��� �� � ����� � � ��� �� �� �� �� ����� �

'�� ��� �������(�� � ����������� ��� � �� �������

���� ���� �� ������ ��� ��� ��� ����� � �� ���� �

���� �� ����� �� � �� ����� � ������������ � ��� �

C��� �� ����� ������������������� �� �����

�� �+�, ������������������� �+�,���� ���

B ������������� �������� ��� ���=������ ������ �

��� ����� �� �����=������������ ��� �� ���=��

��� ���� �������� ��� ��� ���� ����������� � +� �

�������!�����0,� �������������������� ��

����) � �� � ����=���2��� ���� �� ��� �� ��

��� ��� ����� ����� ��� �� �������� �� �������

���� ����������� ������� � ������� �������

������������� ������� �� ���� � ������ � �� &�

����� ������������ � ���� ��� � ����� ��� �� �

������������� ��

@���� ������� �� ������������������������

�� ���� ���� ��������� ���������������������

����A������������������� ��� �� � �����+� �������

� !����� 9, � �������� ����� ���������� ������

��� ��� � ������ ����� ����� � +5!=, +� � ������ �

!�����J,�#�������������������������� ��������

���� ��������� ������������������������� ��

��� ���� ����� ����������������� ����� � ��

����� �� ������� ���� ����� ���� � ������� �� � �

�������

���������������������� � ���������� ������

���� ����&������ �������� ��B����.�.���� ��

��� �� �������� ����������������������������

1.3.1 Isolation and Purification of TotalCellular DNA

� ����� ��� �� � �� �� ���� &������ �� �� ���� � �

����� ������������� ���� ����������� �����

� ����� ���� �������������� � �����* ����������

�������� ��������� ������������������������

���������� ��B ����������������������������� �

������������� � �� ���� �� � ������� �� �������� ��

������ ���� ��� ������� ��������� ������ �� � �

�� �� ���� � ��� ���������� � ���� �� � ��� � �����

��� ������ ��� ���� �������������� � ���� �����

� �&��������������������+l���4.3,�������� ���� � �� ��� �������� �� ������� �� �) � ����

��&����� �����������������!������<� .1�

Isolation and Purification of Total DNA from BacterialCells

B �������� �������� �������� ����&����������

�������������� ���� � �������� ������������ �

�� ����� �� �������������� ��� �����������������

����������� � �������?+�,G� ���������������������

�����������)+��,7���� �������������� ��������� ��

��������� ��� ���������+����� �����&�����,)+���,

������ ����&������ �� ����� ������������ ��

� ����+�������������� � ����,)���+��,5��������� ����

� �������� � ����+������ ��� �����������,� ��

����������������������� ������� �������A���

B����.�/�

Growing and Harvesting a Bacterial Culture ���������

������ ���� � ������ ����������������� �������

�������������������������

��������� 4 ������������� ����������������

�����+�� ��������,�������� ��������������&���

������������������������ �������� ��������� �����

������ ������������ � ��������� � ���������������

�� ���������7"���4F)� ���������������� �

���������������7"������ ������ ������ �+.1

�>�,�����&�����+0�>�,���!�+.1�>�,�����*��C�����

J�1�� ����������� ���& ��������������������

����������������������� ����� �� ������� ��� ���

��� �� ����� �� � �� ���������� ����� � ��� ����

&��������� ����������&���� ����� ���������� ��

� ����� ���� ������������ ��������������������

��������&�����+������������� � ����������������

��������,�� �������� ���� ����������������� ��

�������� ��������������� ������������ ������

����������� �������� ��� ���� ��� ���������

� �������� ������@� �� ��� �����4F �� � �����

����� ������� ��� �� � �� ���� ��� ���� ���������

�� �� ��� ��������� ������ ���&��� � �� ������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM11

© Oxford University Press

Page 15: GENETIC - india.oup.com

12 Genetic Engineering

�������������� ������������������������������������

������� �� �������� ������ �� ������ � ������ �����

�� ���������� ����� ����� ���� �������������������

��� ��� !�� ����� �"## ��$ ��������� %&�# �'�

(�")*+&,-)"+� . �# �'� /)"*+&� "� �'� (�0�� �# �'�

()&0��� .���1+& �"���� "#2 ������ � ����������

���������� ������"#2������$"#����.�0�0�" �#�.

������ ���������$�)� 3���� �-�#�(����������������

�������4� ��1+&�� 0�0�"�����������������������

������������������������4����������#�""���������

���� � ��������� �� ����� ������� !��������

5���������� � ����������� ������ ������������� ��

�������� �� ����� �������� ��� � � � ������������

�� ������������������������������������������

���� � � ��� ������� ������� �6����� �� �� �� ���

����������������������������������� �����������

������� �� ����������������7�� ���������������

����������������������������������������6(8�

������������� 8��������������������� �����������

������������������9:�� �����;-<0�� ������ ��

���=�����. #>" #������������������?� �� �����

�� ������������������� ��� �����������"#�������7��

�������

����� ���� ��� ������������ ������ ���� ����� ��

������������������ ��� ��� ������������������������

��������� ������������������� �������+6���%##

Cloning site

Vector

Recombinant DNAmolecule

DNA fragment(also called insert DNA/foreignDNA/exogenous DNA/passengerDNA/target DNA/gene of interest)

Step 2: Construction of recombinant DNA molecule by joining of DNA fragment to vector

Step 3: Introduction into host cell, multiplication of recombinant DNA molecule along with host cell

Recombinant DNA molecule

+

Bacterial cellBacterium carryingrecombinant DNA molecule

Bacterium carrying several copiesof recombinant DNA molecule

Several bacterial cell divisionslead to formation of clones

Genomic DNA

Step 1: Generation of DNA fragment

Partial digestion with restriction enzyme/mechanical shearing/sonication/cleavagewith nonspecific endonucleases

DNA fragments (these DNA fragments mayalso be chemically synthesized/PCR products/cDNA synthesized from mRNA)

+

Linearized vector

Linearized vector

DNA ligase(this ligation stepmay includelinkers or adaptors orhomopolymer tailing)

Restriction digestion

Bacterial colonies growing on solid medium

Figure 1.1 Basic steps in gene cloning [In this figure, the genomic DNA and vector are cut with blunt end cutter, however, a sticky endcutter can also be used depending upon the requirement.]

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/7/10, 6:49 PM12

© Oxford University Press

Page 16: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 13

Bacterial culture

Harvest bacteriaby centrifugation

Pellet of bacterial cells

Pure and concentrated DNA

Mix with phenolCentrifuge toseparate layers

Step 1: Harvesting of bacterial cells by centrifugation

Step 2: Preparation of cell extract by lysis of bacterial cells

Cell lysis(disrupt cell walland cell membrane)

Pellet of bacterial cells Cell extract

Removal ofinsoluble cell debrisby centrifugation

DNA, RNA, proteinCell debris

Step 3: Phenol extraction to remove protein contaminants

DNA, RNA, proteinCell debris

Aqueous layer containingDNA and RNA

Interface containingcoagulated proteins

Phenol layer

Step 4: Purification and concentration of DNA

Transfer aqueouslayer to fresh tubethrough pipette

Add 2.5 vol ethanol;Mix well;Incubate at 20°C

Precipitate DNAby centrifugation

DNA

Ethanol

Decant ethanol;Wash pellet with 70% ethanol;Air dry;Dissolve DNApellet in small volume of buffer

Aqueouslayer

Figure 1.2 The basic steps in preparation of total cell DNA from a culture of bacteria

������������������ �@�� ���� ���� �� ��1�<K

.1F����>���@������ ������� ����� ��������������

����������������������������������������������

�� ������ � ������������ � ���� � � ����� ��� ��������

+3�111I<�111�� �£0���,� �������� ����� � �� ��������������������������� ����������������������

��� �� � ������������������ ��������������

���� � � ������ ��� � ������� �������� ���� ��

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM13

© Oxford University Press

Page 17: GENETIC - india.oup.com

14 Genetic Engineering

���������������������� ������ ������� �����

����������� �.�111������������&�������������

������������� �� ��� �.1�� �����

Bacterial Cell Lysis and Removal of Cell Debris (Prepara-tion of Cell Extract) *������������������������� ��

�&� ��� �� � ����� � ��� &����������� ���� ���� ��

��� �������� ���������+��� �������������� �����

������������� ������������ �������������,

�������������� ����� �� ������������������

���� ���������� ������������������ ��� �

������� ��������������������� �� ���� ���?������

���������������� ���

�������������� ����� ����� ����������������

��������������� ����� �&������ ��&������� �����

�� �� ������������ ������������� � ���� ����

���� ��������������� ���

������������ !��������� ����� ���������� � �

������&� ���� �������������������������������

�������������� ����������������� ���� ����

��� ��� �� ��������� ��� ������������ �)� ��

����� ������� � �� ����������������������� ��

������ ���� ���G��������� ��������������

��� ��� � ����������� ��������� ��� �� ��� ����

����������������������������� ������� ���

����� � ���������L������ ���� ��� ����� ���������

��� A���2� �+��� ��������,� ��� ������� � �� ��

������ ��������������� �������� A��+����

A���������������� ������ �������������������,

������A������� ����������� ���!�������������I

!������ ���� ����� +��4I��G, ������ �� �� ������

������� +���� ���� ����� ������ ������4�����G,�

����� ���� �� �� �������� � �� ����� ������� � ���

�������������������������� ��������� �������������

���� � ������� ������������ ������� ����� ��

� ���������@��� ����������/2� ����������������

�������������������������� ��������4�/H���!�/H

���������������� ������������� ������� ��=�

� ��� �4�/H����� ���������� � ����������������

����������������� � ������ �����4�/H� ����

�������� ����������� ������������� ������� ��

�������� ������� � ������������������� ��������

� 2� � +��/2� �, �� ��� ������ � ����� ���� ����

+��92� �,����������� �������� � ���A�����

�������������� ����� �������� ��"���������������

��92� ������������� �������������� ��������

��/2� ���� �� �������������� � �*!� � ��������

�*J�1I<�1�����������������!�� �������� �����

������������������������������������ ��� ���

� � ���&�������$���� �� ����� ����������

����������������� A�� ���/2� �������������

����������������� �����������������������������

� ����� ����������+-�-,����� ����� ���������

���� ������������������������������ � �������

������� ������������������������� �� �����

�������������������������������� � �����&�

����� �� �� ��� � ��� ���� ��� ������ 5�������� ������

������������� ������������������������������ ��

�����������&����������� ��������������������

Removal of Contaminating Biomolecules from the CellExtract ������������&������ ������������������������

��� � �� ���� ���=�� �� ������ � � ���� �� � ��

������������ � �������� ��� ������������

�������� ��� ���������� ����&�����������

���� �������� ���������� ���� ��������� ���

��� �� ��?

������������ ��� ��� ��� ����������������

�� ������������ ������� �?��� � � ��&������ �

���������������� �����

�����"����������� �#������� � �� ��� � �� ���� ��

��������� ����&�������������&��������� ������

� �����+������� ����� � � ����� ������� � �,������

�������������������� �������������������������

�����������+������=��,����� ��� ���� �� ����

&����� �� ����� &������ ���� �� ���� � ��� �

��� �?��� � � �� +.?.,� B � ���� ���� ��� ������ �� ��

��������� ��������������*<�1+��.4 ����*!��

�*<�1,�� �������� ����������������������������

���� ������� ���� �� ��������������� ����� ���

�������� ���������� � � �* � J�<I<�1�4 � ���

��� ��� �������������� ���� �� �����������

������������� ���������������� &���A��������

��� ���� ��+��� � &����� ��� �����,������� ����

������������������ ��� ��������������� �������������

���������������������������� ��� ��@��� ������1�.M

�>� <����� &����� ������ � ���� � ��� � ������

���������� ���������� &������ <����� &����� ��� ������

��A���� ������������� &����� � ���� ����� ���

����� ����� � ����� ���#���� ����������������� �

� � � � �� ��� � � ����� �� �� ����� ������ � ��

����������)��������������� ������� ��� ���������

��� ������� �����������������A��� � ������������

���!�� � � �� ���������� ������� ���� � �� ��� �� ���

��������������� � &������ ����� ��� �?��� � � ��

��� ����� ����&��� ���� ����� �������������

� ����� � �������� �� �� ��������������� �������

���+./�111� � �.1���,���������������� ����� ��

����� ������������������ ����������+��� ���

<����� &����� ���������,� ������ �������#����

����� ������� ������N1�04���� �N.1M���� ����

�� ���������� �������������� ������ �������

������������� ���� ������ �������� �������

������������������������ ����� ������������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM14

© Oxford University Press

Page 18: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 15

�������� ����� +������=��, � ����� ������ ������

�� ���������� �������� ���������� ������+����

� ����,���������������������� ��������� ��

������ ������������ �����&��������� �����������

������������� ������ ������6� �������������� � �

���� �������������������������������� &���

�� ����������������� ����� ������������� �����

��������������� ���� ���#������������������ ��

�����+<1�.��/1O!,������������������������ ������

��� �� ������ ����� ��� ���� �� �����������������

� ������������ ���������� ����������� �������

��������������� �� �������� ��������������� ����

��� ����� � ����� ������� � ����� +� ����� � �����,

�� �������#�������������� �� ����� �������

� �� ����+����������� ������,;� ���� ������+� ��

��������������������������,�������� ��������������

� ������������� ��������������������+� ��������

��������� ����,�����������- ����&������� �����

����������� ���� ����������������� �&������ ���

� ����������� � ������������������������ ����� ��

�� ���� � ���� � ���������� �� ��� ����� �����

��� �?��� � � �� &������ �� � ���� �� ��� ����� �

�� ������������� ����������4 � ������ ������ �

��� ������������� �� �������� ������� �����

����� ������ � ��*��� �� ��������� � ��� ��

&������ � ���� �� ���� � ��� � ��� �?��� � � ��?

�� ������� � �+/0?/9?.,������� �?��� � � ��&������ ��

#� ���� ��� � � �� ����&��� ����� � �����������

������������ ���&������ ��� ��������� ������

&������ �+�,� ����� ������ ��&����������������

� ��� ���� � � �������� � ��&�������� ���� ��

��� � � �������������� ����� ���� ����� ����

&������������������� ��� ���� � � ��� ��� ���

������� ���� ���� ��� ��������������������� �

���������� �������� ��� � �� ��� �������������

�������������������� �������� ����� � � ������

����� ������� �������������������� ��������������

���������������&�������5�� ���������� �� �

����#��������A� ����������������� ����������

�������� ��������#������� ��������� � ��������

� ������������ ����� ��������� ���� ��������

#������� �� ����� � �������������������������

�� ����������������������� �� ���� ���� ����

���� ��������� �+2�@*,�� ���� ������ ��������

���� ���� ������ ��� � ��� ���� � ��� ������� ��

������ ������

���������$�����������%������%��� ��� ��� ��� ���

� ���������� �� ����� ��� �?��� � � �� &������ �� ��

����������������&����������������� ������������

��������� ��� ������� ������� ������������

��������������������������������������������

�� �� �� � �� �� ���� �� � ��� � &������ � ��

������ ������� � ������A���+�� ����,�������� �

��� ��� �����%� ���A�������������������� ��

������� �������� ������������ ����� ��������

��� ������������������������ ������� ��5� ����

��%���� � ������A��+������� ���,�����������

����� ���� ���������������������#�� ���� �����������

���*����9I./�0������ ������ ��*<�1�������

����������/0IE0O!����� ������A������� �����

�������� �!�/H���������� ���������������� ��� �

����������������� ��������� � ���������� � ��� ����

� �� ���� ����������������������� ���@����� ������

�� �����% ������ � �� ������ �� �� �� ����� �

��/2� ���01O!� �������������4�/H���������������

5� �����% �� � �� ��� ������ �� � /1��>�� �� ��

� ���� ������������+������ �.�����I/1O!, ����

� ���� � �01�4 ����*!�+�*<�1,���.�4!�!�/+�����

� �� ������9O!,�#����������������� ������ ����

����� � ���� 01m�>������� ������� ������� �������� ��� � &���� ������ �� .1�4 ����*!� +�*

<�1,�.�4��/2� �����1�0M-�-�4�&������ ����

��%���������� ������������������ � �.�4!�/H��

������� �������#����� ��� �����%��� ����� ����

�� ���������%��������������������#�� �����������

��������� ��� ����� ������������� �� �������

� ��������������� ��������� #� �������� ���� �� �����

��� ����������������� � ����� ����� ��6/1��>��

��.1�4 ����*!�+�*J�0,���.1�4��!�;��3JO!� �

.� ��� ���&������������������ ������������������

�������� ����#��������������������� �� ��� ���

���� ����I/1O!�=���� �� ����� ��� ��� ���������

������ �� �� ��� �����%&����������� �����

� ������ �������� �� ��� ������� ��.��>���

������������������������� �� �����������=��

� ������������ ��� ���� ������ ����C���

������ �� ����&��������- �=��� ���������

�������=�������� ������� �&������ ����������

������* ����������� ��������������� �� ��=��

� ������������������������������ ��������

���� ��� � &������ �� ������ ����� ��� �� ������ ������

����������� � +� � ������ �!����� E, � � ������� ����

�� ����� �������������������� � ������ � ��� ��

� � �� ��� �=��� ��� �� ����� ����� � �� ����

� ��������������&���������������������A������

�������� �������������� ��������� ����

���=������������ ���� ���������� ������ �

��������� ��������� ��� ����� ��� �� ���������

���=��� �������������� �� ����?

�������������������� ������� ������ �������&�

������ ������ �������������! �����������=��� ��

������� ��� ���� ����������������������� �

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM15

© Oxford University Press

Page 19: GENETIC - india.oup.com

16 Genetic Engineering

���� ��� ��� ���������������� ����� �� ������

������� �� �=���� � ������� ���������� ��

�A��� ��� ������ +=���,� � � �� � �� ��� ���

=����������� ���� ��� ������=�������=���

.6�� ��� ���� � �.1��>�������� � 2�����+.1�4

����*!����.�4��/2� ���*<�1,;� ���A�������

���� �����=�� ��� ��� ���� ��� �������������� ��

���������� ������� �&������ ���������������

�� �� �=�������� ���������������������� ���������

���� ���� ����� �������� ������ =��� �������� ��

�� ��������� �������������������������+�������

�������,������� ��� ���� ������ ������� �������

���=����� ��� ���� ��� ���� �����+F1O!,� �.1����

� �� ����� ���� ���� ������������F1O!�����

�������� �� ������� ������������ �� � ��� ������ ��

=����������� � �������� ��������=��� ����

���������� ���� A�������� ����������=�������

���� �� � ������������� �������� �� ��� � ���������

���������� � ����=��� ��� ��������� ������� ��

����� �� �����*���=��� ������� � ������ ����

�������� � � �� � =�� � ��������� � �� � � ����

� �������� �����

���������� ������������� ������ � ��������� � �

� � ������������ ������������������� �������������

���� ���� ��� ������� ������� � � ������A� �� �����

�������� ������������������� ���� ���� � �����=���

��� �� ����� ������ � ��� ��� ����� � ���� ���� �

� � ������ � ���� � � �������� � ��� ����

�� ��� ������������ ��� � ����������������������

��� �� ������������������������������ ������� ����

��3���������� ��� �������� ����� ���� ����� �

���� ���� ���������� �������������������������

�� � ���� � � ����������� ��+ ������,���� ���

������������� ������&�������������=������

��� ��������������������������� ��� ����������

������������ �����2�@*������ ����� ��� ������

������P/1�������A�������������������� �5!=�

��� ������ ���� ���������������� ������

� ���� &� ��� � �������� ��� �� ��� ������ � �

����� �� ��������=����������� ������� ����������

� ��������� �������������� ������������������ �

����������� ���������� ����� ���� � ����=���

���=���������������� ���� ������������ �� �

��� � ��� �� � �������������� ��� �� ���� �� �����

���� �� �� ������ ���� +� � ������ � -��� � .�3�/,�

! ������������� � ����������� ��� �����������

�������������� ���� ������� ������������������� ���

����� ����� ����� � ��������� �� �� ����

�������������������������� ���� ������

Precipitation and Concentration of DNA ��&������

���� �� ���� � ��� ���������� � �� ���� �� �� ��� �

������ ���������������� ��������������������

�� ��

���������������������� ! �� ��(����������������

�� ������ �������� �� ���� �� � ������� ������ � �� ��

� ���� ���������������������� ������ ����������

�������� ������ ������������������� ������ � ��

� ���� ������������������������� ����������� ��

������ ��������� � � �� � ��������� ����� � �� � � �

� �����! ��������� �� �� �� ����� � � �������

������� ������� ��� ���� �������������������� ��

������ ��� ���������������� �� ��������������

������� ������������������� ������������� �� �

� ���� �� ����������������������� ������� �������

� ��������� ������� ���������������� ��������� �

� ���� ������������ ��������������������� ��

�� ���������������������� ���� ���� �� ������� �

�2�@*������������������ �� ����������� ������

� �������������� ������������������� ���������

��� ���������������� ���������� ��������������

���������� �� ��������������2�@*���������� �������

2�@*�������� ��������������������� �������

����� ������+/9�3��/0O!,����������������� �������

������+����&� ������������������ ������� ���

������������������������������ ������� ����,�

��������������� �� �������������� ��� �������

������ ��������������������������������� �������

���������� �� � �� �� ���� ��#� ���� �����������

���� ���������� ������ �����������������

��&��������������������� ��� ���������������2�@*

+PE9M ���� ���� �,������������������������� ���

��� �� ����� �� ��� ��� ��� � ������� ������ � ��

�������� ���� ��� ����� ��� ���� � �������� ���

�������� ���

"��� � �� �������� �������� �� �� ��� � �� ��

������������� ���� ��� ���� ���������������������

�� ����� /I3 � ���� � ��� ���2�@* +��������� ����

������ � �����,��������� �� � ��������� ��� �

� ��� �� ���������� ��� ��������� ���1�34� �

���� ����� +�* 0�/,� 1�/I1�04 � ���� ��� ���� ���

/I/�04 ��� ���� ����� + ��� .�.,� �� � �������

������� ���������A������������� ������������

������������������ ������������� ��������� ����

�������� � ���� ��� � ���� ������ ����� ����

���� �� ������ ���������� �� � ���������������

�� �� ��� ��������

����2�@*���������� �� ���&������ � �� �� ��

���������������������� ������ ��������� ���� �

����������� ������������@��������������������� �

������������������������������ ���� ������ �� �

��� �� ������������������L���������� ���� � �

�����������2�@*������� �� � ����������������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM16

© Oxford University Press

Page 20: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 17

Table 1.1 Salt Solutions Used in Ethanol Precipitation of Nucleic Acids

Salt Stock Final Important remarkssolution concentration(M) (M)

Sodium acetate 3.0 (pH 5.2) 0.3 Stock solution (3.0 M) is added one-tenth the volume of aqueousphase to get a final concentration of 0.3 M;0.3 M sodium acetate (pH 5.2) is used for most routine precipita-tions of DNA and RNA.

Ammonium acetate 5.0 2.0–2.5 Stock solution (5.0 M) is added in a volume equal to that of aque-(NH4OAc) ous phase to get a final concentration of 2.5 M;

It is frequently used to reduce the coprecipitation of unwantedcontaminants (e.g., dNTPs or oligosaccharides) with nucleic acids.For example, two sequential precipitations of DNA in the presenceof 2.0 M ammonium acetate result in the removal of >99% of thedNTPs from preparations of DNA;It is also the best choice when nucleic acids are precipitated afterdigestion of agarose gels with agarase (for details see Chapter 6).This is because the use of ammonium ions reduces the possibilityof coprecipitation of oligosaccharide digestion products;It is used frequently for the removal of unincorporated nucleotidesfollowing a DNA labeling reaction;It is not used when the precipitated nucleic acid is to be phospho-rylated, as bacteriophage T4 polynucleotide kinase is inhibited byammonium ions.

Sodium chloride 5.0 0.2 0.2 M should be used if the DNA sample contains SDS. The deter-(NaCl) gent remains soluble in 70% ethanol;

It is not as soluble as NH4OAc, NaOAc, or LiCl in EtOH-water, orisopropanol water.

Lithium chloride 8.0 0.8 Stock solution (8.0 M) is added one-tenth the volume of aqueous(LiCl) phase to get a final concentration of 0.8 M;

It is frequently used when high concentrations of EtOH are re-quired for precipitation (e.g., when precipitating RNA). LiCl is verysoluble in ethanolic solutions and is not coprecipitated with thenucleic acids;Small RNAs (tRNAs and 5S rRNAs) are soluble in solutions of highionic strength (without ethanol), whereas large RNAs are not.Because of this difference in solubility, precipitation in highconcentrations of LiCl (0.8 M) can be used to purify large RNAs.

� ������ �������������������������������������

��� ����������� ���� �����2�@*��� ������������

� ���� ��L����� � �� �� �������������� �����

����� ������������ ��+�� �� ��, ���� ���� ���

��� �� ��� �������#��������� ��������������

� ���� ��������������������� ������������� ��

��� ������ � �������� ��� ������������� �������

�� � ������������� ����� ����������� � ������������

�� ������� ���� ����� ������+2�@*,������ �������

����&���� ��&�������� ��������������� �����

+Q.1���, � �� ���� ���������� �� ���������� ��

���� �� ������A +.1I31���,�L�� �� ������ ����

���� �����+N31���,�������� ������������ �� ��

��������� �&��������������� ������������ �������

�� �� � � ��� � �� ���� #� -�- �� ������ �� ��� �

�������� ��������������������������!�� ������

� �������� � � ���1�/4 ��������7�!�+1�04,�� �

����������� � ��

��������������� �����������������������������

����+����������,�����������J1M2�@*+���� ���

�� ������������� � �� ����� ���������������

���� ������,�����������+������������� �� �

����� ��� ������� ���������� ���������,�� �

��������� �������2�@*���������� �� ������� ��

����������������������������������� ������������

� ������������� ��������������������� ������ ���

����������� � �������������J1M2�@*����� ������L����

�������J1M2�@*�� ������ ����������������

��� ������������ �� ���� ���������� ���� ��

���������������� ������� �������� ��������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM17

© Oxford University Press

Page 21: GENETIC - india.oup.com

18 Genetic Engineering

� � ����������� ��� �� � ����� ��������������

�� ���� ����� �� � ��� ��� ��������� �� ���� �

��������� � ������������������ ��������4 ��

��� �� ����� ����� ���� ��������������������

����2�@*���� ��� ������������ ���������� ���

L������������������� ����+�� ���, ���������

������� ��������� ��������������� �������+����

���������� ����� ��� ��� 2�@* �������������� J1M

2�@*,��������������������� ���� ���������

����+�����������,������� ��� ����������������

�� ������ ��� �.: 2�����+�*<�1, �����������

���� ��� ���� � ���������������� �������������

����=����&������������� �������������������

��������2�@*��������� ������"�������� ���

�������������2�@*���������� ������� ������������

��� �������������� � �������� ������������ � �

��������������� �� ������� ���� ��*����� �����

���� �� ���� ��=��� ������� �� � �� �� ���� �����

� �� ������� �����������J1M2�@*����������

�������� ����� 2�����+�*<�1,� ���������� ���� �

� ������ ������������ �� �� �� �� 9O!�� � ���� � �

� ������ �� ������� �� �� �� �� ������� � �� 2�@*

��I/1O!�

�� �������� � �2�@*���������������������

������ ��������� �����2�@*�����������������

������������ ������������������ ������� ���� �

� �������� � ����������� �������� ��������� ����

� ���� ������ �� ���� �� ��� � ���� � ����������������

�������������� ���������������� ������ ��� �

�����������2�@*���������� ����� �� ������ ���

��IJ1O!�I/1O!�1O!� � � � �������� � ���� �� �

0������� �������� � �������������� ���������

� �� ����� ��� � �������� � ����� B � � ����

� �������� �������������� �������� �� �2�@*�� ���

���������� ��+� �.� ��� �������,�� �����������

+I/1O!� IJ1O!,����� �������������� �����+��� 31

���,����������� ���������� ���� ����������

��� ������������������ ���� ���� � ������������

������������������� �� �� �����������������

� ���������������������������� ��������� �

���������� � � � ����� � �������� �� ������� � ���

������� �������� ���IJ1O!���� �������� ���� ���

��� ����� 1O!�� ������������ ����� ��������

������ ���� � � ���� �� � � ���������� � �����

������� ��������������������� ������������ ���

��������������������� �������������������� �

���������* ������� � ����� �������� � �� � �

�������� �� � ������� �� �� �� ����� ��� � �������

������ ������������ � ��� �� � � �� ����������

���� ����������� ���������������������� ��

������� ����� ���/1��>����������������1I9O!��

�������� �� �.0I31��� ���������������- ��������

�������� �� �������������������� ���� ���������

��������� �������������������� ��������������

�������� � ���� � ������������������� �������������

������������������� � ���� ���2�@*� ���� ��

��� �� � ������������������ ������������ �

������������������� ����� ������� ����������

���� -����� �������� �������� ������ �� +� ��������

����� �������� ��,������ ���������������������� �

��� ����������������������������������� ��� ����

� � ��� ����� ������ ��� � � � �������� �� �������

�������� ����� ������#�������������� ��� �

�������������� ������������������ �������������

�� � �������� �� ������������� �&����������=��

+.1I/1m�>��,� ���� �� +01m�>��,� � ������ ������������+.1I/1m�>��,�� ��������������������������������� �� ��� ���� �� ���� ��� � ���� �� ��� � �� �������

������������������������������������������������ ��

����������������������� ���� ������������������ �

�� ����� ������ ������R��� �=�� �� ��&������ ��� ��

���� ������ ������������������������������� �

�������������� ������� ��������A���� ������ ���

����� ������������������ ������������������ �

���� �=����&�������������� � � ����A������

� ������� �� ������ � ���������� �� ����� ������

�����G��� �� ������������������������������

��������������1�04��� �������������� �� ��� ��

G��� ��� �� �� ���������������������������

���������A����������� ���* �����������������

�� �������� �� ������� ��� �� �����7���� � ���

��������� �� �� ������� ������ ������ � � ������������

��� ������ ���� ����������������2�@*�� �������

������� ������������� �������� ���� � ���

/1��>��� ����������������������������������� ��

��������������� �������� ����� �������� ��

� �������� �� ���� �����������������+Q.11�����

�����������,���� ������ �&���������������

�� ������������� ���������� ������������

���� ������� � �� �������� ���� !���������� � ��

.�11�111�� �/1I31������ ������ ��� ���� ����

��������� ����������� �� ������� �������� #����

����������� ���� ������������ ���� ���� �����

� ������������������������������� ���� ���I/1O!

�IJ1O!��A��

����������������������������� 2�@*������ �������

���� �� �� ��� �� ��� �� �������� �� ����� ��� ���

�������� ����������������������1�EI.�1�>�+C�������

�� � ��� � 2�@*, � ��� � � ���������� �� ���� ���

������ �������� ������������������������

� �� �������� ��4 � ������������� ���� ���� �

������������ ��� ���������� � ���������������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM18

© Oxford University Press

Page 22: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 19

�������������������� ������#� �� ��� ����������

�� ���� �����������2�@*������������������� �

5!=�� ������* ������������������� �������� �

�� ��� �������2�@*������� ��J1M��� � ����� �

���������� ������ � ��������������������

���� �������� ������� �� �������� �� ��� ���

�������4 � ������� �� ��� ������� ���������2�@*�

� ������������� ������������������������-������

� 2�@*���������� ��� ��������������������� ���

���������� ������������J1M��� � �������������� ��

���������������������� ������� ���������� ������

� ��������������! ��������������!�������������������

��������������� �� ����������&������ �����

� ����� ������ �� ���������� ��� � � +�� ����� �, �

��������� � �+������ �,� ������������������ �����

� ��� ������������ �� ��� ��������������

��� �������������������� �����2�@*� �������

����� � � ������� �������������� �� ��� ��

����������������������� ������������ �&�����

�� ����� ��� ������ ���� ������������������

������� ������������ ����� �� ��� ��� ����� �+ �

������ �,������������ ���� ���� ��&���� � ������

���������� ���������� ������ ���������� �����

�������������&������ �������������������������

���� �� ���������� ����� �+ ������� �,� �������

������������������������2�@*���������������

"�������������� �� ������������� ��� � ����������� �

� � �� � �������� � ��� �������� ���� � ���� �� ��

������������� ��#�������� ������������� ���� ���� ���

���������� �������������� ����� �����������

��������� ���������� ���������� ����� � ���

� ������������ �������������������������

����� �������������������� �� ��������������

���� � ���� � �� ��� ������ � ������������� ��������

�� ������������ ������� � � ��A� ��� ��� �� ����

������������ ���������������A�������������

"��������������������� �����+����4��� � ���������

�� �4����� �,������������������� �� +����A � ��

���������������������� ���������������,����

� �������������� ��������A ������������� �

�������������������������� �������� � �����������

����������������� ������ �� �� ���������

�������������������������������� ��������������

� �� �������� �� ������������� �4��� � ���������

���������������� ��������� � �������+���� ��������

�������� �������� �,�011m������ ����+ �=��,�������� ��� ���� �� ��� ����������� � �� ��� ��� � �

�� �� ����� ���� � � &����� �� � � ���

&������������ ���� ��� ����� �����������������

� �������� �������������� 011m�� ����� ������ ���� ����������������� �����������������

��011I.�111� � �/���������������������� ����

� ������������������ �� �� �������������� �� �

���� �� ������ �������� ���������� ����������

�������� �� �4��� � � �� �� ��� �� ���� �� �� �������

������B ������������� �������������������������

���� ������� ��� �������� ���������������� �����

��������� ����� ������������� ���������� �� �����

����� �������� ����� � ���������������� ��B �&�����

���011m������� ��������.11�4������� ��������� /0m�+/1M� �������� ����� �,�F0M ���� �������������������� ���=���������������� 011m������������� �� ���� � �������� � � 0�4�! ���������� �

/0m� ��������� ��FFM ��� �������� �������� �� �������� ������ �� ������ ���1�/0�4�����B �

� �� ������ ��� �������������� ���������� ����

�������������� ��FF�FM ��������������� �����

�������� �� ��� ��������� � 2�@* ���������� � ��

������������ ��������������� �������� ������ ��A

��� ������� ����������������+��������������

� ���, � �������� � �� � ��� ���� ���� � ������

������ ���-����� �����+� ���������� ������,�����

��������������� ������������������������� �������

����+��� ���� ��,���������� �������� �����������

������� ���� �� �������� ��������������

������ ������� ��������� ��������������� ��������

������� �������� � ������������ �� ����������

��� ��� � � �� �� ��� �!�!� ���� �� ������ ��������

��������� �������������� � �������������� ����� �

��+� ��������!�����E,� �� ��� �� ���������

������������������ ����+����� ������,����� ������

��� ����������������������� ����� �� �� ��������

�������� ��� ������������������������ �� �

��������������� ����������������� �1�0� 011����

"��������A ���� �������&������������� ��

� �������� ������ ������� ���� ����������

�� �������� �������������� ������������������

����������������� � ��� ����� ����*������� � ���

��������"� � ��� �� �������� ������ �� ������� �� ��

���� ���?���������� ���� ���������A�����+.1I/1��,�

�������� ��.1����������� ��� �/M�>�� ����������

� ������.�4��/2� �+�*<�1,��� � ��������������

�������������� ������ �.1�����.�4��/2� �+�*<�1,

6 ������ ���������/1���+����.�91��>��/,� �.1��� �

�������������� ��������C���������������;�� �����

����� �����9O! �� �������� ����� ������ ���� �����

���� �� ������ �� ������ ���������� �� ��� ����� �

�������������������� ���������������������������

B �� ������������������������� �������� ���� �

�������������� �������������� ���������������������

����� ������� ������� �������� ��������������

�������� ���� �� ������� ���������� ������� ���

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM19

© Oxford University Press

Page 23: GENETIC - india.oup.com

20 Genetic Engineering

����� �� � ������+����������������� ���9O! �

���� ����������� ������� ����������� ��� �,�

������������� ��� �� ���������� ��� ����������

��������������������������� � �0I.1� � �����

����������������� 2�����+�*<�1,� �� ���� �

�� ������ ���� �� � � ���� � ���� �� ���������

����� ��� ����������������������������

C����� ������ �������������������������� ������

�������A������������� ���+9�, � 2�����+�*<�1,

� � .EI/9 � ������� �� ���� �� ������ � ������ ���

��� �� ���� ������������� ������ � �������� �

��������������� ������� ���� �� �� �����������������

������� ��� �����

�� ��� ������� ����� �� ��������� �� ��� � �� �

� �� ������������ ������������ ������� ���� �

�������� ����������������� ����������

���������������������� �� ����������� ��A���

����� ����������� � ����� �� ���� ���� ���

�� ����� ���� �+P01m�,�������� ��4����� �-���8������+1�1/0m�,�� ��������������� �.1�� ��������������������������.1��������������

��������A�� �.1������� ��� �������� ��� �

�������� �������������� �� ������A���������

� � �������� � �A�� ������ � ���> ���� ��������

&��������

Isolation and Purification of Genomic DNA from HigherEukaryotes

����������� ����������������� ����� ��������

����� ����������������&��������� �� ����

�� ����� ������������������������� ��������

��������� ���������� ����� �� �������� �����

����� ����� ������ ����������������� �������

���� ���� #� ���� ���� �� ��� ������ ��������� ��

���������

Cell Lysis ���C �� �������� ���� ������������ ���

���������� ������������ ����������������

����������������������� �����������������������

+������� A��,� � ��������� ��������������������

�����7������������ ������� � �������������������

�������� �������������� �����������������������

@��� �������� ��������� ���� �� �������� �� A� � ���

������������� ����������� �� � ���A����� �

�������� B � ������� �������� �� ������� ����� ����

����������A����������� � �� ��������� ������

����@��� ��������� ���������������� �������

�������������������������������������������

Removal of Contaminating Biomolecules and Recovery ofDNA �� ������ ������ �������� ������� �������� ��

��� ��������� ���������������&�������L���� ��

�������� �������� ������������� ������ &����� ��

�� ��������� ���=��� � ��� � &������ � ���> � �� �

����������� �� ������ ��� �=������=��� �

�� ��������� � �� � ������ ������ ���� � ������

������ �� �������� ���� ���� � � ��������� � ��

����������������� � ������������������������� � ���

�� ���������� �&������ ������������ �� ����� �����

5�������������������� � �� ��� ���������������� ���

�� ������� �� ����������������������� ������5� ��

����� ����������� ���� �������������� � ������ �

���������������� ������������������������� � �

����� � �� �������� � �� ���� � � ������ ���� ��

� ����������������������� �� �� �������� ����� �����

��� �� ��������� ���� ����������� ��� �������� ��

������������ �����������������������A��������

���� ������� ������������ ���5 ��������������� �

�� ������� �&������ ��������� ��� ���&�����

����������������������&������ ����� ���������������

����������� � ����������� ������������� ������

���������������� ����� ������������������������ �

� ��������������������� ��������������� ���� ��� ����

������������� ��� ������ �������������� ���������

����� ����� ��� ����� �������� ���� ����� �

�� ��� �� ��������������� ������������� ������

������������������ ������ ���+! �",������� ���

����� ����� ���&����������������L��! �"������

� ���������&������ ������������I! �"� ���&���

������������������� ��������� ������� ���� ����������

�� �� ����������� ���������� �� ���� ������� ���

��������� ���� �������� ��.4��!������������ ��

� ���& � ����� ��� �������������� ���� ����

�������2�@*���������� ������=���� ����=���

�������� �! �"��� �� ����������� � ������ �

������ �������������B����.�3�

��������� ��������� �� ����� ������� ���

������� ���� ����� �� �� � ����� ������� � �������

���� ��� �+585,���� ������� �� ��&������ �������

585 �������� � ����� � &���� ��� ����� � �� ��� ���

� �� �������������������������2�@*���������� ��

Other DNA Recovery Methods

� ������� ������ � ��� �� �� �� ���� � � �� ���

��� ����� �� � �� ����� ��� ��� +!�!�, � �����

������ � ����� +!� B�, �� ������ ������� ���� ��������

��������� � +� ������� �!�����E,�� #� ��!�!�������

���������� ������=��� ������������������� ���

����� ������������� ������������+� ��������!����

��E,��B ���������� �������������������������

������������������ � ������������=����������

����&�����!�!����2�"�������������� ������� ����

����������� ������� ���������������&������

������ �� ��� �� �� �2�"����������������������

2�@*� �� �������� ������ ���� ������ ���� �

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM20

© Oxford University Press

Page 24: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 21

Cell extract

CTAB

Precipitated nucleicacid CTAB complex

Centrifuge

Nucleic acid CTABcomplex

Carbohydrates,proteins, etc.

Resuspend pelletin 1 M NaCl

Precipitate DNA with ethanol;Centrifuge; Wash pellet with70% ethanol; Air dry;Dissolve pellet insmall volume of buffer

Pure andconcentratedDNA

Treat with RNase; Reprecipitate withethanol; Centrifuge; Wash pellet with70% ethanol; Air dry; Dissolve pellet insmall volume of buffer

DNA + RNA

Figure 1.3 CTAB method for purification of plant DNA

��������������������������� ����������� ����������

���&�����+�����������������������,������������

���� ������ �� �������4 � ���������� ����� &��

�������� +����!�!�, ��� �� ��� ��� ����� � ��� ����

��� ������� ������ ������ ��������� ����� ���

���������� ���� ���� �����2�@* ��� �� ��� �����

�������� �� �2�@*���������� ���� �������������

������� ��� ���������������������� ���� ����

����������������������������B ���������������

����� ��� ������������������� �����������������

������������� �����������A��� ��

Silica-based Spin Column Chromatography ������ ��

������ ���� ������������ ���� � �������������

������ �� �� ����� � ���� � �������� �� � ��� �� ���

������2������������������������������������� ���

����������������������� ����� ����������� �

��� �� ��������������� ����� ��� �� ��������� �

����� � �������������������������� ���������

������� ������� ����� ��� �� ���� ��� ��

���� ������� ������ ��� ��������� � �� � �� ���� �������

4 � ���������������������������� ����������

��������A�������� ��� ���������� ���� ���� ����

����� ����������� ����� +���� ����������� ��� ������ �

��������������� ��� ���,����� �� �������� ��� �

������������������ ����� ������ �������������

������������ �����&����� �� �� �������������

�� � ��� ��� ������ � ����� #� ����������� ���� � ����

��� ��� ����������������������� ������������������

����� ��������������� ��������� ������������

�����������+B����.�9�,� ��������������������

�������������� �� ���������� � ���������������

��������� �������� ��� ��������������� ����� ���

����������� � �� � � ���������������� ������

��������������������������������������������

� � ���������� � �������� � +B����.�9�,�$� � ����

��A������������������ ������������� ������

����� ���� ����������� ������������� ������������

����������� ����������� ������������ ���� �����

������� ������ ������ �������������������������

���2�@*��������������������� ���������������

� ����������� �������������������A����������� ��

�������� ����� ��� ������� ��� ����� ��� �

���� �� ������ � �� �������� �� � ���������

��& ��� ���������#���������������� � ����������� �

����������� � ����+������� �������������������

����� �������,��� �������� ����� � ��������

������� ����������� ������ ��������������

�� � � &������ � �� ������� ���� � �� ������� �����

��&����������� ������������ �������� ���� � ������

�����������G� �������� ������������������������

� �������� � ������� 01�������A������������

����� �/1I31����4 � ������� ����������������

� �� ���������������� ��������- ������� ������5!=�

�������5!=����� ���������� ��� ��������+=�5�,�

�������� � ������� ����� � ��� ������ +=B75,� ���

�������� ������� ������ ��� ������ +�B75, �������

+� � ������ �!����� .<,�!�������� ��������������

���� � ����������� � ����� � � ���������� � ���� ��

S���� ��� ��� ��� � ����� �� ��� ����� � ��

S����� ������B �&�������������������+S����,

��������� �������� ������������� �������������� �

���������������� �� ����� �� ���� � ���� � ������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM21

© Oxford University Press

Page 25: GENETIC - india.oup.com

22 Genetic Engineering

Cell extract (DNA containing solution)Lysis

Tissue sample

Add wash buffer;centrifuge

Add DNA containing sampleon silica column;Centrifuge

Wash

Unbound contaminants ordena biochemicalstured

Bind DNA

Add elution buffer;centrifuge

Elute

DNA for downstream applications

Add lysis buffer

Column containingsilica particles

Sampleoutlet

Discard

(b)

Silica particles

DNA molecules

(a)

H H HI I IO O O

O

Na Na Na NaI I I IO O O O

or

O

HIO

+

I I I ISi Si Si Si

+ + +

Si Si Si SiI I I I

Figure 1.4 Silica-based spin column chromatography for purification of DNA; (a) Procedure for purification on silica-based spincolumn, (b) Magnified view showing binding of DNA to silica particles in the presence of guanidinium thiocyanate

+�� ���>�����>��� �� ������,�� ����������� ������

� ����������������������� A���������������������

����������� �� ������ ������ ���������� ���

������������� �������������������������������

������� ����� ������ �����������������������

���� ��� ���������� ���������������� ���� ���

������� ���� ��������� ����� � ������� � �

�������� ��� �������� ������N01�������A�

Magnetic Bead Capture Technology ������� � �������

������� ����� ����������������� ������������

������ � � �� �� ���� � � ������ ������$���� ���� ����

������������ ��������� ��������������������4 ��

����������������� ���� �������������� �

������������������� � ����������������� ��� ���

�� �� ��� ���� � ������ ����������������� ������

������������� ���������������� ����� ���� �

�� ������� ����B����.�0�

Anion Exchange Chromatography - ��� ���� ��� �

&�������� ��� ������������ ����������� �����

�� �������� ������ �� ������ � �� ������ ���� ���

� ������������� ������� ����� � �� �������� +����

� ������� ��,�#�������� ���������� ��� ����� ��

� ��� ���� �� ���� � � ���� � ����� �� ��� �� ���������

������=������������ ������������ �����������

�������������������������*�������������������

��������������������������������� �������� �

� ����������� �� ��������� ���� �&�������� ���

� ������ �� ���� �� � ������ �� ��� �� �� � � &�� ����

����������������� ����������� ���������������

����� �� � � ������� ����� � ���������� �� � �� ����

��� �� ��A� �� � .01 �������� �� ����� ����� �

01I.11����4 � ���������������� ����������� �

���� ���������������� ���

DNA Isolation Kits #� ���� �������������� � ������ �

�������� �������������������������� �� ������

� ���������������������� ������������ � � �

�� ������ ������������������������ ��� �

����� ���� �������������� ���������������

Analysis of DNA Preparations

������ ��������� ����� ������ ����������

�� ��� ������� � � ������� +������ ��� ��������, ���

��������� � �������� ��� � � �� ���� � ������ ��

� �� ����?

Agarose Gel Electrophoresis and Visual Inspection UnderUV Illumination ������������������ �����������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM22

© Oxford University Press

Page 26: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 23

��������� �������������������� ���������6(8>

@�:������7����������������������������� ��?A

�������������� ���������0������%��0��������������

�� ��� ������������� �� ��� � �������� ��� ������� �

6(8��������������������4���� #���B"#=��������

��������� �����������������*CD@������ ��6(8���

������E"#=������4��*���������� �������������������

�������4����� ��������������������6(8�����������4�

������� �� ##���C�����.�%�������������������

�������������������������������������� ����6(8

�����������F��� ���� ������G��� ��� �������������������

�6(8���������������6(8��4����� �� ��������

�������� �

Agarose Gel Electrophoresis and Fluorescence ImageAnalysis C�������������7���������������������=��

����7��� ������������6(8�������8��������� ����

�������������������������������� ��������� 6(8�

�������������������������������������������������

���� ��������������G�������������������� ������

�������� �����4����������������������������������

������������1H:ID�����D��1���� �1H:ID� � ����

������������������� ������������=�������

���� �� �������!.-&��6(8��5�������������������

����� �����7��� ������=��� ��� ������ ��� ��� ���

������ ��� ������ ����������� �����������������

=������������������������� �� �����������������

��� � �������� ��� G������� � ��������4� �6(8����

���� ������ �� �������G�������������

Visual Inspection of DNA Spots on Agarose Plate UnderUV Illumination 8��������������������������

�� ������������6(8��������������������=�����

���������� ������������ ����������������� �������

DNA containing sampleLysis

Lysis buffer

Magnetic beads/binding buffer

Binding

Wash buffer

Discard supernatant

Washing

Elution

Elution buffer

Pure DNA for downstrean applications

Figure 1.5 Magnetic bead capture technology for the purificationof DNA

Cathode

Anode

Samplewells

M

1 2

23.130

Mig

ratio

nof

DN

A

9.416

6.557

2.3222.027

Marker size(in kbp)

EtBr stainedagarose gel

4.361

0.5640.125

M

Figure 1.6 A pattern of EtBr-stained DNA bands under UV light [Lane M : DNA size marker; Lane 1 : Purified DNA; Lane 2 : DNAfragments.]

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/7/10, 6:49 PM23

© Oxford University Press

Page 27: GENETIC - india.oup.com

24 Genetic Engineering

�� ����������� �� ��� ���� ���� ���������������

������ ����� ��� �������� �� ������� ������ ��

����������� ��������@�$8��������� �� ������� �

�������� � ��� �� ���� ��� ������������� ��

������ ��� ����� �������� ���� �� �� �� ��� ���

�� �������������� ��������� ����� ��� ����

�������� ���5�� ���������� �����������������

���������������� � ����� ������� ��������1�0m�>�� 2�"� � -R"= ����� � ���� �� ������ �� ��� �

��� ������ ������ ��� �������������� �����

�������� ������B ��� ������������� �������� �� �

��������������������������������������0m�+ ����,����� ���������� ��������������� �� �������

���� ������������ ��������� ��$8������������

��� � ������������ ��� �������������$8� ��� ��

���� ���������� ��� ������������������������

���� ������������������

UV Absorption Spectrophotometry B �������������

������ ���� �������� � ���������� ���� ��+����

���� ��������������� ���� �� ������������������ �����

��� ������ �� �=��,������ � ��� ����$8��� ��

��������� �� � ����� �����������������������

�� ���� ��������������������� ���������������� ��

$8����������&������ �� �������� ��������������

����� � ��&������ �� �������� ���� � ����� ��

������� ���� ����� B � ����� ������ ��� �� �� � ��

������������������������ �������� �������� ����

������ ������������&������ �� �������������B �

������ ����������� ��� ���� ������������� ������

������������&������ �� ��������� ������� �� �

���� ��"���� �� � �������� �� � ��� ���� ���� ��

� �� ��� �� ��� ���� �>�� ������� ��� &������ �

� ������� +e, �� � ����� �������� �� ��"�I7���������� �6eT�+.0�3,HG+..�F,H!+J�9,H +F�3,;������G�!���� �� ������� � ����������� �����

���������������� ��� ��� ���� ���� �����

������������������ ���&������ �� ��������� �

������� &����� ������*J�1�� �������&������ �

� ������� ����������������������� �������������

�* ���� ���� ������������������ �� �������� �

������� ������ ���* ����������� ��� ������

��� ���������� ���� ���� ���� ��� ���� ���������

������������������ �����������"��������� ���� �

������ ����������������&������/E1������ �����

����� ����+ �=��,����� ��������&��������/E1

������ �@���/E1����� ����������� � ���� ����

����� � ����+ �=��,�����������/E1 �.� ���� ���

� P01m�>��� �������91m�>��� ������ �=������P33m�>��� ��� ��� ���� ����� ��� ��� �$8������� ���� ������� ���� � ����+ �=��,���������

�� � ��� ���� ���� ��� ����+ �=��,����������

����"�I7���������������������� ���/E1T/���

� �������� � � � � ���� � ���� + �=��, �� ���� �

����� ��������� �� ����� ����� ���� � ����� � �� ����

����� ��?

! �������� � ������+m�>��,T�/E1K������ ����� �K01

! �������� � ������+ �=��,+m�>��,T�/E1K������ ����� �K91

! �������� � ��� ��� ���� ����+m�>��,T�/E1K������ ����� �K33

� ���� ���� �� ������� �� /E1 ��� /<1 �� +�/E1>

�/<1,�� ������������ ��������� ������+ �=��,

�������� ��5���������� �� ��������/E1>�/<1����

�.�<� #� ��� �������������� ��������� ������� ��� �

��� �� ���/E1>�/<1���� � ��� ���� .�< ��� �������

���������� � ����� ��� ��������� ��� �������� �

����� �� ����� ���� ����� � �� ���� ��� �� ��� ���� ��

/<1���

UV-induced Fluorescence Emitted by DNA–EtBrComplex ���� �������� ������ ��������� �������

�� � �� ���� �� ������� ��� ���� ��������������

������� ���� �����������������+/E1��,�������� ��

� � �������� ��� �� �����$8 ��� ���� � ����� �� �

� ���� ������ �� � ������ ���������� � � &����� �� ��

� ���������� ����������� �� ��� ��� �� ����� �� � ��

��������������.m�>������ �������� ��� ����������� ������� ��/E1� �� ���� � ������ �����������

����������=������ ������ �������������

�������� �� ����� ���� �� ��� ��� � ������������

+Q/01��>��, ����������������� �������������

������������������� ��$8��������� �������������

�� �� � ������������������������4 � ����/E1>�/<1

�������� ������� � �� ������������ � ��� �

�� ��� ���������������� ��� ��� ������/E1��

���� ������������������ ��� ���� ��������� ���������

������������������������� ���� ����������� ����

������� ��� ������ ������������������� �

� � ������������ ����� �� ����� �� � ����� �������� �

���I2�"� � ���&� ���� � ��� ��� ������� � �

���� ��� ������� ����������� �$8���������� ���

����������2�"�� ������������������ ������

�� ����� � �� ���&�����������2�"�����

��������������������� ������������� �

����������������� ���� �������� ������������ ��

������������� � ���������&������9<1��+��� ��

����,���������� ��������� 0/1��+����,����������

����������� ������� �����0.1���"�������� ��� �

��� ����� ���� � ��� ��� � �� � ������� ����� ��

�������� ���� �� �� ����� �� ���������� �������

�����������������������0F1��+��� ���������,

�������� ����� ����������� ����� �����������������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM24

© Oxford University Press

Page 28: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 25

�� ��� ������������ � �������� ��� ����������� � �

�������6(8��� �� ��������.> ���6(8�� ��� ���

������ ���������� �

5� ���������� ������������������������������

��������� ��������������������������������������

�������"%#�����������������������������������

� �� ������������������������������(����������

�������� �������� �� "%# �� �� ������ ����������� ��

�������� ��� �������������� ��������������� ��

������� �������� �� ������ ����������� �;;# �� ��

��������������������� ������������������� �� ���������

���������������������������

Fluorometric Quantitation of DNA using Hoechst 33258)����� ;;" J �� � ����� ������4��� �4�� ����������

�� ���� ��� � ����������������� �� ���� ���� �����������

��������������� �6(8�?���=�@�:��)����� ���

��� �������������� 9�=����� ���� ��������������� ����

)����� ;;" J��� � �������������� �8�� ���� ������ �

���6(8����7�)�����;;" J������������������7�����

�����7���� �� B; % �� �� �� ���������7���� ��

&�" ���)���������� ��� �6(8�)����� ;;" J

������ ��7������ �� ; % �� �� ����� ��7������ ��

& J ���8���� ��� ��� � �6(8� ��� ���������� ����

������������#�#.�#�%����������.#��������������

����������������������������������8K��������

6(8���� ���������� ���� �)����� ;;" J �� ����7��

������ �������� ����������6(8�+����� ��������

�����)�����;;" J�������� ������������ �������

�� G������������� �6(8������������)�����;;" J

���������� �@�:� �� ������������������ ����������

�������� ������������ �6(8���I(8�� ��6(8�

��������� ���������������6(8��������������

���������� �������������������������������� ���

������ ���������������G����������6(8�������

����������6(8�������=������������������� ���

����� �� �������������� �������������������6(8�

�.#>" #��'���������������������������������

��=����������5�����������6(8������������=���

�� ��=��� ������������ ��� �������� ����)�����

;;" J ����������8������� ������ �� ��� ��=���

��������������� �������������� �����=������

���� �� ��� ����������� � ��� ��=��� ������ �� �����

���� ��������������������������������� �����

�������������������6(8�������4���7��� B.=���

��)�����;;" J��� �������������6(8����������

������������ ���� �� ������ �� ���� �� �������4�

������������ �� ������ �� ����������� ������� �� �

���������������������@��������7� ����������������

���� ������)����� ���/+.##� � � �������� �������

����������������������)������*��=��>@����� ���*C�

"8� ����� �:�� ����)�����;;" J �� � ������� ������

���� ���)�7���������������� ������������������

����������������������������������� ����������������

���� ;�#��(�� ���� ��������� ����������)�����

;;" J ����=�� �7��������)�� ��� ������� ��

��� ����������� ������8���������������������������

��� �� �� �� ���� �� �� ����� L#�"�(�0�� .#��

(�"@6�8��)-�&M�)�������� ���������������������

���������G���� � ���������� �6(8�����6(8��

I(8����������������)�����;;" J���N ;;�����

�������������� ��=������ O.#>-��"� O.#>%���

�����G������������������������������������� ��

�6(8 �� �����)������ �� ������������ � �� ���

����������� ��7��� ��� ������ ������ ���������

8�� 6(8� �� ������� ���� �� ���� � @�:�� �����

G������� ��� ������������)�����;;" J�)������ ��

)�����;;" J���������������������������I(8�����

�������������������� ������������������������ ������

�������6(8�

Membrane Immobilization and Chromogenic Assay 8�����

���� �� ����������6(8����������������������

����4��������������G����6(8�������������

����� ����� �� � ��������� ������������ ������

:������� ��������6(8��������������� ���������

����������� ������������������ ���������������

����������������6(8������������� �������� �����

������ ��������������� ��������� ����� �� ������ �����

��G������������������G��������������������G������

�������6(8� �6(8�I(8��� ���������� ��� ��

�����������.�����G�����������:��� �����������G���

6(86������=�=���5��������� �������������� ��� ���

������� ���� �������G������� ���G����������� �����

�����������������*0I�������������� ����������

����������������������

Colorimetric Analysis using Diphenylamine (DPA) 6*8

�� ������������������������6(8����������������

��� ������� ��������������6(8������������� ���

�� <0�����������������������������6*8�� �����

�� ���������������� ������ ����������������

�����7���� �� � ���(�� ����6*8 ������ �� ����

���� �� ���7���� � ������� ������ ��� �� ����������

����������� �5���� �� ��������������������������

"� �7������� ����� �6(8 �� ������� � ��� ������

������������ �7������������ ��� �����������������6*8

� �� ��� � ��������� �����7�6(8����������� ��

�������� �������������������������������������

��������� �������� � ����������������������

�� ������������������� �� ������=���6(8���

�����������5�6(8������� �7����������������������

�� �������������������������� ������������������

���� �7��������������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/7/10, 6:50 PM25

© Oxford University Press

Page 29: GENETIC - india.oup.com

26 Genetic Engineering

1.3.2 Isolation and Purification of Total RNA

=���� ���� ���������� ����������� � ��=���� �� ��

��������������� ����� ����������� � �����

��������"������ ����� ������������ �� �=�� ��=��

������ �������� � �� &����� �� � �� +�,=�� ����

�� ����������������� �������������������5!=+= �5!=,�

� ����� �������A��� �� � �>�� � �� ������=��� �� ���� �

������ -. ������ �� ���� � ������=����������� ���

�����&���� �&���������2���������� � � ������

������������������ ��� �� �����&������� �

���� � �=���#������������� ��������� �������

=���������=��� ���&���� �� ���� �� ����� ��

�� �������=��� � � ����� �� ������ � � � ���������

�� ���� � �=����� ������������������� ���������

��� ��� � � �� ��� �������� �� ������ �������

���� ������ � ����� ���-������ � ��� �� ���� � ������

����=���� ���� ���� ��������������������������

�������� ��� �� ������������� � ����������� ���

�=���� ��������������������� �������������

������ �� ��������������=��&������ ���������

&����� #� �� � �� ���� ���� ��� ������ � ����� ���� ���

� �����=���� ���� ������������������ ��������

������������������ �������� ��� ����=���� ���

�� �������������� ��� ��������=� �� �������� � ��

�� �������������� ����?�������������������

�� �������=�����������������

Cell Lysis and Preparation of Cell Extract � ����� ��� ��=�� �� ��� �� ��� �� ��� �������� ��

������������������������������������ �� ���

��� ��������� ���� 6���� ����������� ����� ���� ��

������������� ��� ������+G# ,����������������� ���;�

��������� 6����b������� ���� � +b�42,� ����� ����� �+� ,�������;���� ������ ����� 6������ �����%�

��� �������� � � ��;�������6����-�-�!�����������

� ��� +���� ���,� ��� �:�.11�� ��� � ���� ����� �� ���

������������� ���;�������������6����� ����9�����

��������� �����/2� �;� ���=��� ������� � 6���� ���

������ � �������&������������ ������������������� ���

���������� ���� ���+8�=,�������� �������������;�

Roles of Various Ingredients of Cell Lysis Buffer ����

����� � �����������������������������������

���������������� ������A��� ����� ������������ �

�=���������������������� � ���������������

� ��=��� ������ � ������ � � �� ����� ���� =��

� ������ ��� �������������� ��������+�, ��������

#!������� !���$����� ���� � � ��� ����� ����

������&��� ������������������� � ���������B �

&����������������������������������������������

��������������������������� ������ ��� ������

������� ���� ��������������� ������A��� ���

��� ������������������������� ���������������

� �� ������ ���=���������� ���������� ��

����������A�������=�������� �������=�������

��������������������� � ��� ����� ���������

������������� ���� ������� ��������������� �����

���� � �=���� ����������������� ����� ��=��

�� � ��� �� ���������� � ��������� ��� ��

� �������������������������� �����������������

������� ����������������������� � � �� ���������

�� ����� ���������

����������!���������������������� -������� �� ��

���� ��� ���� ��� � �=���������������������� ������

��� ������� ���� &������ � ��� ���������� �� �������

=����� ����������������������� ��� �����=���

��������������������- �������������������������

������������� ������������������������� ���������

������� ��� ����������� � �=������������������ ��

����������������������� ���� ������ ������

�� � � ���������� � � �� �� �� ��� & �� ��=���

�������������������������������A���2&�����.�9�

Exhibit 1.4 Ribonuclease (RNase) in RNA isolation and purification

Ribonucleases (RNases) are a family of enzymes that are small,very stable, and omnipresent (present in virtually all the livingcells). These enzymes are present both in endogenous (intrinsicor internal) and exogenous (extrinsic or external) sources. Theseenzymes, if present, easily and quickly degrade RNA duringextraction, purification, as well as storage. RNA exhibits shorthalf-life due to its intrinsically labile nature and its degradationis further compounded by the ubiquity of these RNases. Furtherthe resilient nature of RNases aggravates the problem, as theserenature quickly following treatment with most denaturants evenafter boiling. This property is attributable to reformation andmaintenance of their tertiary configurations by virtue of fourdisulfide bridges. RNases have minimal cofactor requirements andare active over a wide pH range.

To maintain the stability of the RNA before, during, and afterits isolation from the cell (i.e., to isolate full-length RNA andstore it for longer time periods), following precautions andpreventive measures to overcome the problem of both endogenousand exogenous RNases should be taken into account. Extrinsicsources of potential RNase contamination must be identified andneutralized from the onset of the experiment. These include, butare not limited to, bottles and containers in which chemicals arepackaged, RNase containing water, gel-boxes and combs, bacteriaand molds present on airborne dust particles causing con-tamination of buffers, the hair or beards of investigator, and oilfrom user’s fingertips, etc. These extrinsic sources of RNase leadto accidental contamination of an RNA preparation. Beyond thepotential for accidental contamination of an RNA preparation with

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM26

© Oxford University Press

Page 30: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 27

RNases from the laboratory environment, one must be acutelyaware of the fact that intracellular RNases, normally sequesteredwithin the cell, are liberated on cellular lysis. The problems withexogenous RNase can be entirely avoided by vigilant use ofprophylactic measures and the prudent application of commonsense. Following precautions and preventive measures should betaken to eliminate the risk of contamination with both exogenousand endogenous RNases.

Wear Gloves Finger greases are notoriously rich in RNases andare generally accepted as the single greatest source of RNasecontamination. Hence, rule number one for controlling extrinsicRNase activity is to wear rubber gloves throughout the isolationand purification process, i.e., during the preparation of reagents,handling of reagents and apparatus, and especially during theactual RNA extraction procedure. Furthermore, changing of glovesseveral times during the course of RNA related experiment isrecommended because door-knobs, micropipettors, handles ofrefrigerator’s door, and telephone receivers are also potentialsources of RNase contamination.

Proper Handling and Maintenance of Cleanliness and AsepticConditions Proper microbiological sterile techniques should beobserved for handling and preparation of reagents. Tubes shouldbe kept closed when handling RNA samples. As reagents are usedrepeatedly, contamination must be prevented during opening andclosing the reagent tubes. If the barrel or the metal ejector of theautomatic pipettor comes in contact with the sides of tubes, itbecomes a very efficient vector for the dissemination of RNaseand hence one should be very careful in pipetting solutions.

Reserve Separate Glassware, Plasticware, Equipments, andReagents for RNA Work Materials or stock solutions that havebeen used for purposes other than RNA isolation and purificationin the laboratory should not be used for RNA work. Rather itemsof glassware, batches of plasticware, electrophoresis devices, andbuffers that are to be reused should be reserved exclusively forRNA work and not be in general circulation in the laboratory. Aspecial set of automatic pipettors for use when handling RNAshould also be kept aside. Chemicals should be set aside for RNAwork and should be handled with disposable spatulas or RNase-free spatula or more safely dispensed by tapping the bottle ratherthan using a spatula. Solutions/buffers should be stored in smallaliquots of suitable volumes, rather than drawing repeatedly fromthe stock bottles, and each aliquot used once should be discarded.Although such actions may at first seem excessive, these maywell preclude the accidental introduction of RNases and facilitaterecovery of the highest possible quality RNA.

Use RNase-free and Disposable Plasticware Conical tubes, bothpolypropylene and polystyrene, are considered sterile if alreadycapped and racked by the manufacturer. Individually wrappedserological pipettes are always preferred for RNA work because nospecial pretreatment is required. Sterile (marked as tissue culturesterile) disposable tips and microfuge tubes certified by a reputablemanufacturer to be free of RNase should be used preferably. Thesematerials are generally RNase-free and thus do not requirepretreatment to inactivate RNase. Bulk packed polypropyleneproducts are potential sources of RNase contamination, mainlydue to handling and distribution from a single bag. This pertains

to microfuge tubes and polypropylene micropipette tips becausethese can become contaminated and, in turn, contaminate stocksolutions. Thus, any plastic product that comes into contact withan RNA sample at any time, either directly or indirectly, and thatcan withstand autoclaving should be autoclaved [sterilization usingmoist heat done under high temperature (121°C) and high pressure(15 psi)]. These microfuge tubes are then handled only with glovesand set aside exclusively for RNA work. To reduce the chances ofcontamination, it is best to use sterile forceps or gloved hands(use fresh gloves) for the distribution of small items of plasticwarefrom original packages to laboratory racks or beakers. Afterdistribution, these can be covered with aluminium foil andautoclaved. For the manipulation of organic extraction buffers,which typically contain mixtures of the organic solvents phenoland chloroform, individually wrapped borosilicate glass pipettesare strongly preferred.Make Glassware, Plasticware, Equipments, and Reagents RNase-free Clearly, it is incumbent on the investigator to ensure thatequipment, glassware, and plasticware are purged of RNases fromthe outset of the experiment. The temperature and pressuregenerated during the autoclaving cycle for the sterilization ofsolutions, laboratory plastics, and other apparatuses do not ensurecomplete elimination of RNase activity. Hence, some otherstrategies as mentioned below should be adopted.∑ All reagents should also be maintained RNase-free at all times.Pre-made solutions that are certified as being RNase-free are widelyavailable and it is worthwhile to invest in such solutions.Alternatively, stock solutions and buffers prepared in the laboratorycan be treated directly or indirectly with diethyl pyrocarbonate(DEPC) (Figure A);Moreover, all reagents should be prepared in high-puritybiochemical quality water and in RNase-free glassware andplasticware. For indirect treatment with DEPC, solutions are madein DEPC–water (DEPC–water is prepared by treating water with0.1% DEPC for at least 1 hour at 37°C and removed by autoclavingfor 15 min at 15 psi on liquid cycle), followed by autoclaving ofthe prepared solution. Alternatively, DEPC is removed from largevolumes of DEPC–water by boiling for 1 hour in a fume hood. Onthe other hand, for direct DEPC treatment, 0.1% DEPC is addedto solutions and treatment is allowed for the required length oftime, and later DEPC is removed by autoclaving. Thus whereverpossible, solutions are treated with 0.1% DEPC for at least 1hour at 37°C, or overnight at room temperature, and thenautoclaved for 15 min at 15 psi on liquid cycle. For the preparationof solutions and buffers, DEPC is added to a final concentrationof 0.1%, shaken for several hours on an orbital platform, or stirredvigorously with a magnetic stirrer for 20–30 min, and following

C CH2 CH3

O

O

O CH2 CH3

O

Figure A Structure of diethyl pyrocarbonate (DEPC)

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM27

© Oxford University Press

Page 31: GENETIC - india.oup.com

28 Genetic Engineering

acrylic gel-box components. After 10–20 min at room temperature,electrophoresis tank is washed thoroughly with sterile water. Notethat the unit should never be exposed to DEPC, because acrylic isnot resistant to DEPC.Discard Old Chemicals By careless use of aseptic technique,buffers may become contaminated with bacteria or othermicroorganisms. As the growth of these microorganisms is notusually visible to the naked eye, solutions that are even suspectedof being contaminated should be discarded. All stocks and workingsolutions in the laboratory should be labeled with a predeterminedexpiration date in addition to the date of preparation. A sadconsequence of the use of out-of-date solutions in the laboratoryis the unintentional introduction of RNase from microorganismsthat may have taken up residence in the solution bottles.Immediately Freeze Harvested Tissue The use of fresh tissue ispreferred for RNA isolation. However, as it is easier to collecttissues in advance, the interest lies in preservation of the samplesfor days, weeks, or even months after tissue collection withoutsacrificing the integrity of the RNA. One way is to store tissuesamples in RNAlater® tissue storage:RNA stabilization solution(Ambion). Dissected tissue or collected cells are simply droppedinto the RNAlater® solution at room temperature. The solutionpermeates the cells, stabilizing the RNA. The samples are thenstored at 4°C. Samples can be shipped on wet ice or even at roomtemperature if shipped overnight. Note that the use of RNAlater®for tissue storage is compatible with most RNA isolation procedures.Alternative to storage in RNAlater®, harvested tissues or cell pelletsmay be frozen immediately in liquid nitrogen and stored at –70°Cto –80°C. When stored in this way, RNA can be purified up to ayear later. Tissues stored in RNAlater® or in liquid nitrogen aresimply removed and processed by homogenization or othermechanical apparatus in the lysis buffer specified in the RNAisolation procedure. Some investigators homogenize fresh tissuein guanidinium buffer on receipt and then freeze the homogenateat –80°C, continuing the RNA isolation procedure at a later date.Purified RNA is most stable when stored as an ethanol precipitateat –80°C. Under these conditions, the investigator can confidentlystore RNA for several months or even longer because the half-lifeof RNA is a direct function of the biological source.Speedy Extraction Cellular RNases (endogenous RNases) are freeto initiate degradation of the RNA that the investigator isattempting to isolate, unless these are inhibited without delay.Hence intrinsic RNases should be inactivated as quickly as possibleat the very first stage in the RNA purification process (i.e.,extraction). This demands speed as well as precautions whilehandling. Once the endogenous RNases have been destroyed, theimmediate threat to the integrity of the RNA is greatly reducedand purification can proceed at a more graceful pace.Inclusion of Chaotropic Agent and Reducing Agents in RNALysis Buffer RNA lysis buffer may combine the disruptive andprotective properties of guanidine thiocyanate (GTC) and �-ME toinactivate RNases present in cell extracts. GTC is a chaotropicagent that disrupts nucleoprotein complexes, allowing RNA to bereleased into solution and isolated free of protein. �-ME is areducing agent that breaks disulfide bonds in proteins, therebyinactivating RNases. The combination of GTC and �-ME makes theRNA lysis buffer a potent inhibitor of RNase activity.

this treatment, DEPC is destroyed completely by autoclaving.Complete removal of DEPC is further promoted by rapidly stirringthe hot solutions with a nuclease-free magnetic stir bar. Frequently,if the autoclaving time is not adequate, the distinctive odour ofthe residual DEPC can be noticed. Alternatively, some solutionsare maintained at 60°C overnight. Certain solutions such as thosecontaining SDS, NP-40, or NaOH are not autoclaved and thesenonautoclavable components are added to complete the solutionformulation after the other components have been autoclaved asneeded, or otherwise made RNase-free. DEPC is not added to anybuffer containing mercaptans or primary amine groups, with whichDEPC is reactive. Perhaps the most common buffers to which DEPCexposure is to be avoided are the Tris buffers [tris (hydroxymethyl)aminomethane]. This is because the hydrolysis of DEPC to CO2 andethanol is greatly accelerated by Tris and other amines, whichthemselves become consumed in the process. Note that in aqueoussolution, DEPC is hydrolyzed rapidly to CO2 and ethanol; half-life inphosphate buffer is ~20 min at pH 6.0 and 10 min at pH 7.0. Thusfor RNase decontamination of Tris buffers, DEPC–water is used andthe solution is autoclaved again. Those buffers consisting ofchemicals that demonstrate or are known to have DEPCincompatibility are filtered twice through a nitrocellulose membraneto remove RNase activity, and other trace proteins. As DEPC is toodifficult to remove from reagents and interferes with PCR and otherreactions, a suitable alternative to DEPC treatment of water to renderit RNase-free is to simply purchase RNase-free water;� Nondisposable plasticware should also be treated before use tomake them RNase-free. Plasticware is therefore filled with DEPC–water and allowed to stand for 1 hour at 37°C, or overnight atroom temperature. The items are rinsed several times with DEPC-treated water and then autoclaved for 15 min at 15 psi on liquidcycle. Besides DEPC–water, commercially available products thatinactivate RNase upon contact (e.g., RNaseZap from Ambion Inc.)can also be used to remove RNase contamination from pipettes ortable-tops;� Baking the glassware in a dry heat oven is a very effectivemethod for purging glassware of RNase activity. Hence glasswareshould be cleaned scrupulously, rinsed with RNases-free water,and then baked for 3–4 hours or overnight at 300°C. It is importantto note here that not all laboratory implements can withstand theheat generated in a dry heat oven. Such glassware (e.g., COREX®tubes) should be filled with DEPC–water and allowed to stand for1 hour at 37°C or overnight at room temperature. The items arerinsed several times with DEPC-treated water and then autoclavedfor 15 min. at 15 psi on liquid cycle; and� The electrophoresis unit, including the comb, casting tray, andelectrophoresis chambers, are treated to remove RNasecontamination by rinsing and soaking in DEPC–water. For RNasedecontamination, after cleaning of electrophoresis devices withdetergent solution, these are rinsed in water, dried with ethanol,and then filled with a 3% solution of H2O2. H2O2 is an inexpensiveand powerful oxidizing agent that can be used to render a surfacenuclease-free by soaking in it for 20–30 min, then rinsing withcopious amounts of sterile water. More concentrated form of H2O2(e.g., 30%) commonly available from standard chemical supplycompanies should not be used, as concentrated solutions of H2O2are extremely dangerous and may cause irreparable damage to

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/8/10, 4:46 PM28

© Oxford University Press

Page 32: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 29

8-Hydroxyquinoline, a partial RNase inhibitor, when includedin lysis buffer, may optimize RNA purification efficiency. It chelatesheavy metals that can cause RNA degradation when present withRNA for extended periods.Application of RNase Inhibitors Creating an RNase-free environ-ment or elimination of RNase activity is essential during the entireprocess. Because endogenous RNase activity varies tremendouslyfrom one biological source to the next, the degree to which actionmust be taken to inhibit RNase activity is a direct function of cellor tissue type. Knowledge of the extent of intrinsic RNase activityis derived from the literature and personal experience. Moreover,the method selected for controlling RNase activity must becompatible with the cell lysis procedure. It is also important tonote that the method of nuclease inhibition must support theintegrity of the RNA throughout the subsequent fractionation orpurification steps, some of which can be quite time-consuming.In addition, the reagents used to inhibit RNase activity must beeasily removed from purified RNA preparations so as not to interferewith subsequent manipulations. One such strategy is addition ofRNase inhibitors in the lysis buffer, reaction buffers, and in thestandard preparation of reagents intended for RNA work and storage.At the time of extraction, RNase inhibitors are most often addedto relatively gentle lysis buffers when subcellular organelles(especially nuclei) have to be purified intact. Unfortunately, theinhibitors do not offer perfect protection because all of theavailable inhibitors inhibit only some part of the existing RNases.Consequently, these substances cannot be handled without workingcleanly. RNase inhibitors are also used to protect mRNA in cDNAsynthesis, and in vitro transcription/translation system. Note thatRNase inhibitors are heat-sensitive and are stored at –20°C. TheRNase inhibitors may be composed of mixtures of proteins thatinhibit a more or less broad spectrum of RNases. There are twotypes of RNase inhibitors, viz., specific and nonspecific inhibitors.The examples of these two types are discussed below:∑ Vanadyl ribonucleoside complexes Amongst the category ofspecific RNase inhibitors are vanadyl ribonucleoside (VDR)complexes, protein inhibitors, and macaloid. VDR complexes weredeveloped in the mid-1970s as a means of controlling RNase activitywhen using relatively gentle methods to support cellular lysis.VDR consists of complexes formed between the oxovanadium ionand any or all of the four ribonucleosides in which vanadium takesthe place of phosphate. These complexes then function as transitionstate analogs that bind to many RNases and inhibit their activityalmost completely. The four vanadyl ribonucleoside complexes areadded to intact cells and used at a concentration of 10 mM duringall stages of RNA extraction and purification. The resulting mRNAis isolated in a form that can be directly translated in frog oocytesand can be used as a template in some in vitro enzymatic reactions(e.g., reverse transcription of mRNA). However, vanadylribonucleoside complexes strongly inhibit translation of mRNA incell-free systems and must be removed from the mRNA by multipleextractions with phenol (equilibrated with 0.01 M Tris–HCl, pH7.8) containing 0.1% 8-hydroxyquinoline. Vanadyl ribonucleosidecomplexes are available from several commercial suppliers. In theabsence of VDR, RNase-mediated cleavage of the phosphodiesterbackbone of RNA results in the transient formation of a dicyclictransition state intermediate, which is subsequently opened up

by reaction with a water molecule. VDR is not widely used anylonger due to associated drawbacks, viz., (i) RNA isolationcompounds that are more efficient inhibitors of RNase have beendeveloped; (ii) VDR in trace quantities can inhibit in vitrotranslation of purified mRNA; and (iii) VDR inhibits reversetranscriptase and hence contraindicated for RT-PCR and thenumerous permutations thereof. Thus, if purified RNA is to besubjected to either of these applications, the use of VDR is notrecommended. 8-Hydroxyquinoline chelates heavy metals, makingit very useful for removing VDR complexes from cell lysates. Thecolor imparted by the 8-hydroxyquinoline changes from yellow todark green upon binding VDR. When the phenol phase of theextraction buffer remains yellow, it indicates that all VDR hasbeen removed .∑ Human placental inhibitor Many RNases bind tightly (Ki ª 3 ×1010) to a protein isolated from human placenta forming equimolar,noncovalent complexes that are enzymatically inactive. In vivo, theprotein is probably an inhibitor of angiogenin, an angiogenic factorwhose amino acid sequence and predicted tertiary structure aresimilar to that of pancreatic RNase. The inhibitor, which is sold byseveral manufacturers, is stored at –20°C in a solution containing50% glycerol and 5 mM DTT. Preparations of the human placentalinhibitor that have been frozen and thawed several times or storedunder oxidizing conditions should not be used, as these treatmentsmay denature the protein and release bound RNases. The inhibitoris therefore not used when denaturing agents are used to lysemammalian cells in the initial stages of extraction of RNA. However,it should be included when more gentle methods of lysis are usedand should be present at all stages during the subsequentpurification of RNA. Fresh inhibitor should be added several timesduring the purification process, as it is removed by extractionwith phenol. The inhibitor requires sulfydryl reagents for maximalactivity and does not interfere with reverse transcription or cell-free translation.∑ Macaloid Macaloid is clay that has been known for many yearsto adsorb RNase. The clay is prepared as slurry that is used at afinal concentration of 0.015% w/v in buffers used to lyse cells.The clay, together with its adsorbed RNase, is removed bycentrifugation at some stage during the purification of RNA (e.g.,after extraction with phenol).∑ Diethyl pyrocarbonate The most common example ofnonspecific RNase inhibitor is DEPC. It is a highly reactive alkylatingagent, which acts as a potent and efficient RNase inhibitor. Itdestroys the enzymatic activity of RNase chiefly byethoxyformylation of histidyl groups. DEPC is commonly used tochemically inactivate trace amounts of RNases that maycontaminate solutions, glassware, and plasticware to be used forthe preparation of nuclear RNA. Note that endogenous RNases incell suspensions or lysates are not inhibited by addition of DEPC.After treatment of glassware, plasticware, and solutions, DEPC hasto be removed before use in RNA isolation procedure. This is becausein addition to reacting with histidine residues in proteins, DEPCalso carbethoxylates single stranded nucleic acids, and has strongaffinity for adenosine nucleotides. It forms alkali-labile adduct withthe imidazole ring N7 of unpaired purine, resulting in cleavage ofthe glycosidic bond and generation of an alkali-labile abasic site.Even trace amounts of residual DEPC result in chemical modification

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM29

© Oxford University Press

Page 33: GENETIC - india.oup.com

30 Genetic Engineering

of adenine, thereby changing the physical properties of RNA andcompromising its utility for in vitro translation and other applications,including standard blot analysis and PCR. However, the ability ofDEPC-treated RNA to form DNA:RNA hybrids is not seriously affectedunless a large fraction of the purine residues have been modified.Note that due to ability of DEPC to modify unpaired adenine, DEPCis also carcinogenic and should be handled with extreme care. Aftertreatment of glassware, plasticware, and solutions with DEPC forappropriate time period, it is removed readily by thermal degradation(autoclaving), leading to its decomposition into CO2 and ethanol,both of which are quite volatile under the conditions of autoclaving.This is, however, problematic, because small amounts of theseproducts lead to an increase in ionic strength, and lower the pH ofunbuffered solutions. Samples of DEPC that are free of nucleophiles(e.g., water and ethanol) are perfectly stable, but even small amountsof these solvents can cause complete conversion of DEPC todiethylcarbonate. For this reason, DEPC should be protected against

moisture. It should be stored under small aliquots in dry conditionsand bottle should be allowed to reach temperature before beingopened.� Other examples Other examples of RNase inhibitors are heparin,iodoacetate, dextran sulfate, polyvinyl sulfate, and cationicsurfactant, etc. Many RNase inhibitors are available commercially,for example, RNAsin from Promega, RNase Block from Stratagene,RNaseZap from Ambion Inc., Ribonuclease inhibitor from Clonetech,etc.

Sources: Farrell Jr RE (2005) RNA Methodologies–A LaboratoryGuide for Isolation and Characterization, Elsevier Academic, NewYork, Appendix F; Tait RC (1997) An Introduction to MolecularBiology, Horizon Scientific Press; Sambrook J and Russel DW (2001)Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 7.2–7.12.

Classification of Cell Lysis Buffers �������������� ��

��������������������������������������������

���������������� ����������������� ���������

Lysis buffers containing plasma membrane and subcellu-lar organelle membrane solubilizing agents ���� �������

���������������� ������������ ������� ���������������

��������������� �������� �������������������������������

������������������� ��������������������������������� �����

��������� ����� ��������� ��� ������������� � �����

������ !�!������������"���������������������������

��#����$!� %"������� ������ � ���� �������� ���� &'��

������� ��������()(�����*���������������������������

���������� ���������!�����������"��� ������������������ �

��������������� ��������������������������������� ��

������������+� � ���� ����� ��� �� ������ ������+�����

���������� �������� ��������!�'���������*������������

��������+!

&�������������� �������������������,�)����� �

������������������ ������������������������������� ����

�����!����� �������������������������������������

�������������� �� ���������������������������������� ��

�����������"��� �������� ����+�������������� ��������!

-� ���������������&'�� ���� �������� ������� ��������

����������� ��� ������ �����������������������

.�����!�'������������������� ����������� ������� �!�!�

��/%$� �������*� ������� ��������������������������

� ��������� ���������������� �� ����� ���*����� ���������

��������� ����� ���!������������������ � ����������

���������� ���������������������$������ �����

���� ����������/%�����������������!�+������ ����

���� �� �������� )���� �� ��� ����� � ����������

��������������� ������������� ��� ������ ����!�+����

���� ������ �������� �����+��)�+�� ��� ������ � ���

�������������������#����!�������� ������������������

$� '���� � ����� ���������� ����0�0�� ���0��1+2

$�+ �3��������������2���� $�+��� ��������������

� �������� ������ �������������������������

�������� ���������������������������� 1�����4!5$!

'� ���� ����� ��� �������������� ������� ������� �

���6� ���� ��� ���� ������ ���� � ����� ���������

��������0�0�70��1+!����� ������������� ���� ������ ���

���������������������� ���������������������"������

��� ��������80���������� �������������������� ������

���������� �������������������������� ������������������

�����������+����������$!������� ���������� ������

������������������� ���� ����� ��������� ��� � �3����

����"��� ��!������������������� ������������� �� ����

���� �������������������+�������������� ���� �����

������� ������ ��� �������� ��� �� ����� ���� ��� ���+

������������� ���������+�������������������������!�+��

������� �� �� �"��� ��� �������� ���� ������ ��������� � ���

���� ���������������������������"����������������������

������� �� � � � ������� ��� ������ � ������� ����"��

������� � ����������� ��� ������ ���������� ����

������ �!�!����'���������'�������$��������������������

����� ����!�-�������������������+��������������

�#������ ������� �����)�+� ��� ������� ������� ��� ���

����� ��������� ������!�������+����� ��������������

����������������������� ���� ������� ���������!

'���������� ����������+������ ��������������������������

���4����������������49:� �����������������������4�����!����

����������������������������������� ����������+�����

� ������ ����������� ;3<($���+�!���������������+����

����������������������������������������!���� ������4993

<99������� ��������+� ��������� �����499���������� ��

���������=99���������+������499�����������������!����

����������������+������ �������� ��������������������<93

=9���� ������������������ ����$�����49934>9���� ��������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/8/10, 9:20 AM30

© Oxford University Press

Page 34: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 31

����,��.1J����� ��������� ���� ������������ � �

� � ������������ �����A��������&��� �=���

���������� �+� ��������-��� �.�3�.,�-����� ����

����=���� ���� ����������� ����� � �����������

�������������� ���������������������������� �

���� ����� � � &����� =#A � ����� +7�� ��� � �

���,� =# ����� +4 ������ =����� !���,� #� ��

+���� �G�� �����U����,�=��A ����=���-����E1

+ �� ��#���,������� �������� ���� �=��������� ��

������ ������������������������ �� ��� ������

������������������ ��� ������ � ��� +� ,������ �

� ���������> ����� �� ������� ��������A��� ������

����������� �� �= �5!=� ����� � � ���=�������

� �� ����� � ��� � ���� ��� �� �� ������� 9IJm�>��������������� �0I.1m�>.1E�����%�����! ��������������&������������!������� !�'

��$��&��&��� ��������� ������������������=��

������������������������������������� � �� �

������������� ������������� �� ��������������

� ����� ������� �����������������=��� �����

������������ ��� ���������������+ ���������,��������

���������C ������������ ����������������������

=���� ��#������������������������������ ��������

��� ���� ���� ������������ � ������ �������� �

� �� ��� � ����������� ������� ��� ��� ���� ������

�������� ������� �=��� ���������� ����� ��� �

������������� �������������� �=��������� ���������

����������������� ��������������#�� ������� ���� �

� � ��� ����������� ���������������������������������

�� ������������������� ���� � ������������������

��� � ���� ��� ����� � ����� ���� ��� �� ���� � ��� �

=��� ������� ������������ �������������������

�������������� ��������� ������������� ��� ����

������������������ ��������*����� ������� �� �

��������������� �������� ������A��� � ����������

������������������������������������������������

����� � ���� ����5�91+�5�91, �#����!��E31+-����,

������������#����������� ��� ��������������������

���� �� ��� �� �� �� � �� ����� �� ���������� ���

��������� �� � ���������� � �������� ��� �� �������

��� ���������� � �������������� ����������������

��������������� �� ��������������� ��� �=���

��������� ������5�91�������� ���� ����� �����

� �=����� � ������ � ��������� �� ���������� � �

��=����������������

Removal of Contaminating Biomolecules�����������������������������&������� ����������� ��

������� � ������������ ������������� ������

��� ��* ����� ����� ��� �������� � ������������� �

����� ��� ��� ����� � �� ��� ������������� ������������

��������� �������=���*����&�����������������

�� � �=�������� �� ���������������� ���� ���

� ��� �� ������������� ���������������� ��������

Deproteination B �� ������ ��� ��� ������ ����

�����������=���� ���� ��� ������� ������������ �

��� ������ ��=� ��� � �� ������� � ��� �������

�� ��� � � �� � ������� � � � �� ���� �� �����?

+�,������ � � ����������� ���A���� �����%)

+��,=���� &������ �������&���� � ������ � �����

��������� ������� � � ��)+���,-������ �� ��� ����)

���+��,- ������A��� ��������������������+� ��������

-��� �.�3�.,�� ��������� ������ ���������� ����

������������� �� �� �������������=��������������

������ ����� �=��� ���������� ������ �������� �

� ��+�,�

Tissue sample Cell culture

Guanidinium lysate

Isopycniccentrifugation(CsClgradient)

Acid phenolextraction

Isopycniccentrifugation(CsTFAgradient)

DNA

RNA

Protein

DNA

RNA

Protein

Protein

RNA

DNA

Aqueous phase

Organic phase

Interface

Figure 1.7 Methods for fractionation of total cellular RNA following cellular disruption with guanidinium buffer

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM31

© Oxford University Press

Page 35: GENETIC - india.oup.com

32 Genetic Engineering

Prevention of Genomic DNA Contamination �� ����

������� � ������ �=���������� ������������������

������������ �����������������������������������

����������������������&��������� ��� ��� ������� ���

=��� �������� ������������������������������

����� ���� ��� ��������� � ������ �����������

�������� ��������������� ��������������� ���� �

������ ������ �������� � �� � ���� ��� � �������

���� ��������� ���� ������������������������ �����

=���������� # +� ��� �������,������ �� � � ���

���������������� ��������������������� ��=����

���������������2�@*���������� ����������� � ����

��-��� �.�3�.��� ������ �� ��� ��� �=���� ��

����� ������� � ������������ ��� ������&������ ���

�*�� �E�1� ������������ ����� ��I �����������

���� ����=�� ���� �� ��� �� ������ �� �� ���

��� � �� ���� � �� ��������� � � ����������������

� � ������ ������"�����7�!� ���������� � ���������

����������=������� ������� ���� ����� �������

Elimination of Polysaccharides and Polyphenols ���� ���

�� �������������������� ��� � �������������

��� ������������ ����� �� �� ������������ ���

��������������������������� �� ���������������

�������� ������ ��� ����� ����� �� � ������������ �

� ����� ���� � ��� ���������� � ���&�����=������

��������&������ ����� ��������������������������

� � ����������� ������������� ����������������

���� ����� ������������������������ � �����������

�������� �� ������� ��������������� ���� ���4 ��

��� ��=�� � ���� � � ������������� � ������������

���> � � ����� �� ��� ��� ��� ���� �� /31 �� ��� ���

������������������������� � �=���������� ��B���

���� �� =�� � ��������� ���� � ������������ �

� ����� �� �� � � ������� � � ���� ��������� = �5!=

����������� ����������������� �� �� ��������������* ��

��� �� �� ���� ��� ��������� � ������������ ���

� ����� �������������������������������� �������

�� �� &������ � ��� ���������� � �� ����� � � &�����

������������ ���� �>-�- �� �� ����

Recovery of RNA

=� ��� � =�� �� �� ����� ��� �� =�� ���������� �

������ ������ ������ ���� �� ������ �����?

Alcohol–Salt Precipitation Followed by Centrifugation �� ������������ �� �� ����������=�����������

���� ���������� ��� ������� �� ����������� � �� �����

�����������������������������������������������

�� �� ��� ���&����������������� ����������2�@*

+ ��� �� ��� �,� ����=���������������������������

/�0I3�1� ���� �2�@*�� �� ���� ��� ����������H�%H�

7�H� ��*9H � �� + ��� .�.,� -������ � � �������� � �

�� ����������������������� ������������A��

�� ��5���������=������ ���������������� �������

��������������������������������J1M2�@*���

���������

���� ����������� �������������������$����

�������������������� � ��� ������������������� �

�=�� ������ �� ��� ��� �������� � ��� �������� �

��� ����I/1O!� ����� ������ ���������������

����� ���5�91��� �� ��� ���� ������� ������

���� �������� �� ���������������� � ��� ����=��

��������� ���A ���� ���&��� � ��������-���

��� ����������� �� ������������&�������� �����

� ���������������� �����������������=����� �

���� ������������ ��������-�-�� �&���������������

������ ���� ��� ������ � ��� +� ,������ ��B ���

��� ��� �� � ������� ����� �� �� ��� �� ��=�� ��

���������� ������������ ��������-�-�7�!�����������

����������� �������� �� �2�@*��������� ����

�������� �+����� �������������=��,�7�!������� ����

�� ���� ��� � ���� �� ��� �� � � � �������������� ��

�����������-����=���+�=������0-�=���,��� ����

��� ���� �� ������ ����������+���� ��2�@*,������

����=������ ��"���� ��������������� ���������

���������� �������� �������� �� �7�!���������

������ ����=���� 7�!� ���������� � ������C � ������

���� �� ���=������������ ���� ���#� �� ��� ��

���� �������� �� ����� ��� ������ �����������

=��� ������������������ �������� ��� ���������

=���+�����=�������=���,����� ������� ���� ��

������ ������������������� ��������������� ��

���������+Q/11���� ����,=����� �&������=�� �

0-�=������ ���� ���� ��������������������#�

���� ����7�!� ���������� � �� ���� �� ��� �� �����

=����������� #�� �� � ����������������������

�� ����� � ���� �������� #� �� ����� � � �� �� � �

�� ����������� �� ���������� � ��������������� �

=���������� ���#���� �� ��������������������� �

� ��� �����=���� ������������������ ������ ���5��

�������� � �=������7�!������ ���������� ��������

� �� ���� ��� � ��� � �� ���� �� � �� �������� ���

4 � ��� =��� ���������� �� ������� � ���� �

���������������������������$8����� �� � ����

����7�!���������������� ���������� �����* ��

���7�!����� ��������=����� ����� �����

����������� � ���������������� �� ����������7�H

� �� ������� �������� � ��� ����������� ��� ��������

���������������� ���������� �=������������

� �������

Single-step Resin Binding Method �� ��������� � ��

��� � ����������� ���������������������������� ��

����� ��� �� =���������� ����� 6���� =�� ���� 4

����� +"� ��&,� ��� =��4� =#: 4 +"#@ .1.,;� �

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM32

© Oxford University Press

Page 36: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 33

��� ������ �������� ������������� � �� ���=���

����� ���� ����� ������������������� ���� �� �

2�@* ��� �� ��� ��=������������������ �����

�� ��������������������� ��������������������� ��

���� ���������� ���������� ��������=�� ��������

�� ��� ������ �������� ������ ����������� ��� ��

�� ��� � � ������=�� ������ ���� �� ����� ���

��� ���� ������������������� ��������������

����������� ������������������������������� �����

���� � �� ����=���� ������ ���� �� .1I/1M � ��

������� ����� ������ � ����������� ���� ��������

���� �=�������� ���

Silica-based Column Purification �� ���� �����������

������� ���� ��������� ��������������������� ����

� ���=������������������� �� ����������������

������������ �������������� �� ���� �����������������

�� ���� � ���� � �� ���� ���� �� ������ ����� ����

+��� ��,� ��� �������+������,������� ����*���

������� ���� ���������-������� =����������������

����������� � ������������������������������� �

������������������������ ��4 � ���������������� ���

=������ ����������������� ���� ����������� �

�������@�����&��������5��R���V=���������

�����+5� ���! ���,���������5��R�������������

�������� � ��� �� ���������� ���=�������������A

�� ��������.11����� ���������/1���$�� 311��

������ �������������0K.1J����������������.K.1.1

�������������0K.1<��������� �/1�� ��� �����

�� ������� ����������������� ��������� � ����

������=��� ������������������������� ����������� �

��� ��+Q.11���� ����,=�����������������������

=��+��=��,������� =��+��=��,�

Glass Fiber-based RNA Purification G�������������=��

���������� ������� ����������� ���=���� ���� �

������� ����������� �����������������=���� ���

�� �� ������������� ����������������������� �=��

��������������������� ����� ���� ��� �0- �=��

����=�����������4 � ���=������������������

�� � ��������������� ������&������ ���� ��� ���

������������������=�� 5��V�����������+���� �,� ���

���� �������������������������=��L#DV�����

��� �������� � ��� � �� �� �� � ����� ����������=��

���������� � � � ���� ����� � &���� ����� ��� ��������

=��� ������� �������������V������� ������

��� ��������� ������� � ���������� �� ������

&������ ����� � ����������� �� �� �������������� ��

Isopycnic Ultracentrifugation � ��������� � � �������������������������������� ����� �������� ���� �

=������������ ��������������������� ������ �

������ ����� ��� � ��������� ���C�������������

������ � �� ���������������������� ������!�!�>!� B��

#� !�!� ������ ������� ����������� �� ��� ��������

����������������� ������������!�!���� ����

�������������� �������=������������#���������������

� ���!�!�����������/11O!� �EI<� ���� �� �

�������=�������������� �� &� ���� =���!� B���

�������� ������������� ������A�������� ������� ����

�� ���������������� ������ ���������!� B���

��&������������ � �=�������������������� ���

��� ������ ���������� �������� ������ ��+����

��� �?��� � � ��� �� �����%,��� � ����� � !�!��

!� B���� ���� �� ���� ��������=��� � ������&�

��������� �������� ����������2�@*������&�����

����� ���� �� ������ ���������������������� � �=���

=�� ��� � ����� � ����� ��!� B� �� ������ ��

����� ���� ����������� /�E�>��+ �/�E�>��3,��� ��

�������������������"�������� ���������� �=��

��!�!�+.�<�>��,������������������� � ����������

� �� ����� �=�������=��������� � ��� �� � �

��������������������������� ����� ���������������

������ � ��� ������ ������������������������

��������������� ��� ���!�!������ �� ������ �

������������������=���������������=��&�

�������� ���������������� �������������������

��� �� ������ &����������� �� ��� ������ ��������

������� �����������������=������������� �

01 � J0m�>.1E ����� ���� � �� �������� ����� � �������������������������� ����������������

�������� ���������������������������� ����

���������������� � ������������ ����������������

�� ��@��� ��������������� ��������� �������

� ���&�������� ����&����������������� �+������

������������ � � � �,� ������� �������� �� ����� �

��������������������� ������������ �����B������

� �������=���+����0-�=������=���,������� � �

������ ��������� ������ ����������� � ��� ��� !�!��

�� ���� ���������� ������� ��4 � ��� �������

����������������������� ��������� ����+�� ����

� �=������������ �,�������������� �������� ������

������ ������ �� � �� ��������� ��� !�������� �����

��� ���������� ��������������������� ����

����!�!� ��� �� ����� �� �./I.< � ��� � 3 � ���

�����A����"����� 7�.11���������������� 7-�00� � ��

RNA Isolation Kits ���������� �������� �� ��

�������� �������� �� � ���� �������������� ���� ��� �

������������� ���� � �������������=���� ��������

� ������� ������� ������� ����� ������� � �

�� ��� ������ �� ������������ ��� �� ��� �� �����

���������-��� �.�3�/�

Other Methods ����������� ��� � ����������� �� �� ��

������� ������������ �=��� ���� ����������������� �

�����������+� ��������-��� �.�3�.,�-������� ����

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:46 PM33

© Oxford University Press

Page 37: GENETIC - india.oup.com

34 Genetic Engineering

���������� ���� � �������� �&�������� ��� ��

����� ��� ��� � ��� �� � � �� �� ��� �=�� +� �

�������-��� �.�3�.,�

Storage of RNA

�������������=���� ���� ��� � � �������� �

� ���=�� ��=���������� ����� ����������������

=����������������������������������=��������

�� �� ������� ���� =��� ������� ��� �� �� �� � ����

=������� ���� ��*���� ����������=������ ��

����� ���� �� ��������?+�,=����������������� ���

�� �� ��A� � ������ ��� �� �� �� I/1O!� � � ����

� ������ �� ���� � ��������� ����� ���� ���� ����

�� ����=����������������� ���=�����5������������

��=������ ������������� ��������� �� �������

�� � �9��>���������� �������� ���=����������

�����A���������������� �� ����������� �= �5!=

�=����� ���� ���������������� ������ ���������

������ ��L���������=������ ��������������� �

���� � �� � ���� � 2�@* � �� �������� �� � ������

� ���� ������1�/4��!���������������� ����� ���

�� � ���� �2�@*�� �� �� �������� ����=����

���� ������������������.11M� ������ ��� ����

������ �������� �������A� � �� � � ������ �� �� ��

B@=4�A �+4 ������=�����!���,��������=����

������ ���� /������I/1O!�B �� ������� �����=��

���� ������ ������������������������ ���������

���� ��������������������� ��� ���� �2�@*� ��

������������ ����� �) +��,=����������� ������ ���

����� �������������������A����� ����� �=��+� �

����������� ���� �� ������A ��������� ����� �=��,

������ �������������� ���� �� �� �������������

���� �� �=���@�����&���������� ���� �������

� ��������1�.I1�0M-�- �� 2����� +�*J�E,� � �� ��

���� �����I<1O!�B �� ���������������� ���-�- ��

�� ������� � � ��&������ ����2�@*���������� ��

��������� �� ��� � ���� �� �� 2 ����� +�* J�1,>=��

�� ���� ���� � 6���� �).�4� ���������� +�*E�9W

1�/,)����� �� ��*���� �����������������������

�������� ���� ������A� ��� ���� ����� � =��;>

=������V �������� � � ���� � 6���� �)=������

��������������=������V�������� �� ���� ����

����� E1O!� �.1������� ���������=�����������

����� �=������V�������������������������������

��������������=�������� ��������� ����������

�� � ����������;>�25!I���� � �������� 1�. �4

��/2� �+�*J�0,)���+���,=����������������� ��

���������� ���I/1O!��2�@*�

@��� ���=������ ������ �������� �����=��

�� ������� �� � �� �������� �� ����� �� ��� ��� � �

���� ������� � �������� � +� � ������ �!����� 0, �

������������ ���

Analysis of RNA Preparation

"� � �� ����� � � � ������� ��������� ��� ��=��

�������� ��������A�� ������������������������ ����

����� �� �� �� ������� ��������������� � ����������

�=���������� ��

Denaturing Agarose Gel Electrophoresis � ������� �

� ���=���������� �+�����=�����=��������=���,��

������ �� ���� �� ���� � ��������� +� �������� �

��� &�� � ��������, ���� � �� +� � ������ �!����� E,�

=������ � �� �� ��� �� ��� ����� ���� � � � ����� ��

�������� �=���������� ��������� ����������� �=��

�������� ���������������� ���"�����=������� ��

�������=��+<1I<0M ��������=��,�������� � �� ���

������� �� ������ �������=���� ������� �� ��������

�� �� ��� �� ������������ ����� ������������ +/<-

���.<-�=���������� ���=���������� ��/3-���.E-

�=��� �� �� ���� ���=���������� �, ����������� ��

���� ��=���� ��������� ������������������

� ������������� ����������� ���������� ���������

-����� ������� �������������� ��������� �

������������ ����������������������� ����� � ��=��

����� ��� ����� ������� � ���=���� � ���� �� �����

����������������=��������� �/<-?.<-����� ����=�

���+C���������������� ��������� ���2�"���������,

�� ����P/?.�� ������������ ���� ����.�� �� ��

� ����� ���� ���������� ������� ������� ����� ��� ��

���������� ��������� ��������� �/?.�������������

�� ���������� � �=����� �������#�=������������

�������������������� ������������/<-�=����

������������������������ .<-����������#������� ��

��/<-���.<-�=������������=������������������

�=��� �� ���������������������������������������

�������� �� �� ����� ��� �� � �� �=���� ��� �� ��

� ������������ ���������=������� ����&�����

��� �� ������������������=��������������

����3M ���� ������� �=���������� �������&��

��� �� ���� � � ������ �����������=���� ���� �

�� ������ ������ ��� � ������ ��&��������������

0-���0�<-�=������=���������� ������������ �

���������� ��������������� ������������������

��0-���0�<-�=��������� � ����� � ��������

� ������������������ ��������=�������������

�������������� ��������� ���������=����������

����� ������� �� ����������� �����311I911���

����������� ����� ��������������� � �� ������

=������=���� ������ ������������B����.�<�

����� �� ������ ��� ������=���� �����������

������������ ����� ����� ����� �� ���� �����

��������#������� �� ���������������=�����������

��������� � �����������������A� ���������� ��

����� � ������������������������ ��������������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM34

© Oxford University Press

Page 38: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 35

��������� � ����������� ����������� ������ ����

� ����� � ��������� ������&�������������� � �

=��� ���� ����������� ��������� �������

�������� ����B�� ������ ������ ������������

������� ������ ������������� �� ��������2� ��

� ���������� ���� � � ����������������������

� ������ ������������������� �=���� ���� �������

���� ���������������� ��� ������� �� �����

UV Spectrophotometry -������ � ���� �� � �������� �

��������� �=���������� ������������������$8

��� ���� ������ �� � ����+� ��������-��� �.�3�.,�

���/E1 �.� ���� ���� 91m�>��� �=������ ��������� � � �=��� ���� � �� ����� �������������� � �� ����

����� �?

! �������� � �=��+m�>��,T�/E1K������ ����� �K91

B � ��������� � � �� � �������� � �=��� ���@�

���������1�.���.�����������������������

����1�1/���1�.������� �����������������

���� �� ������$8����� �� � ����� �� ������������

���� ��� ������ �=�� ������������� �������

� �����A��� ����� ��/E1����� ��� ���������

���� �������� �� ��� ������� �������������

�� ������� 5�� �������� �� �=�� ����/E1>�/<1

���� �/�1�#������������������ ��������� ������� �

��� ���� �����/E1>�/<1������������/�1� �� ��

�������� � ���� ������ ������������������

��� � � ��&������ ��@� �� ��������� � � ���� ���

���������� ����� ������A��� � ���=�������

Colorimetric Analysis by Orcinol Method @���� ������ �

� ������������� �=������������ ���������

��������� ���������������=��� ���� �������

��������� �� ��������*!������������� ���������

������������ ���� ���������� �B!�3��������

����� ��������� � ��� ���&������������� ���� �

��&������EE0���� ����� �������������� ����

��� ��� ����������� ����� ��=�� � �������� � �� ����

������������������������ ���� ����� �������

� � �� � ���� � �� EE0 ������ � ����� �� � ��� ���

� ����������� � �������� ���� � �� ��=�� � ����

����� ���

1.3.3 Construction of Recombinant DNA Molecule

������ ���� �������������� � ������������ ��������

����� ��� ���������� ��������&�������

���������� ����&��������� �������� � �����

� ����������� ����� ������ ��������� �����

� ����������� � ��� �� � �� ���� ���� C �����

� �������� ��� ���������

Cleavage of Vector DNA and Isolation of DNAFragment from Genomic DNA

2������ �� ������������������ ���� �+���������

����������l ������ ������ ��� ���, � �� �� �������� ���� ��+��������� �l����������� �� �������������� � � ������,������������ ��A��+�,�����&�����

������ ���� �+�,��� ������ ��������� ����

+�� ������,������� ��� ��������������� �

(a) (b)

M 1

9.0

6.05.04.03.02.52.01.5

1.0

0.5

kb Cathode

Anode

28S rRNA (~4.2 kb)

18S rRNA (~2.3 kb)

Smear of mRNA

(~500 bp to 8 kb)

M 1

9.0

6.05.04.03.0

2.52.01.5

1.0

0.5

kb Cathode

Anode

Smear of mRNA

(~500 bp to 8 kb)

Degraded RNA

Figure 1.8 Electrophoresis of RNA on denaturing agarose gel; (a) Total RNA preparation [Lane M : RNA size marker; Lane 1 : Total cell RNAin eukaryotes; 18S and 28S rRNAs form clearly visible discrete bands at positions around 2.3 and 4.2 kb, respectively; Different mRNAsappear as smear between ~500 base and 8 kb, with the bulk mRNA lying between 1.5 kb and 2 kb. In prokaryotic total RNA preparation(not shown in figure) 16S and 23S rRNAs form two discrete bands at positions around 1.5 kb and 2.9 kb, respectively within the mRNAsmear]. (b) Pure mRNA preparation [Lane M : RNA size marker; Lane 1 : Different mRNAs form smear between ~500 base and 8 kb;Degraded RNA appears as a lower molecular weight smear; Note that a pure mRNA preparation lacks two discrete bands of rRNAs.]

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM35

© Oxford University Press

Page 39: GENETIC - india.oup.com

36 Genetic Engineering

������������ ����� �������� �� ����������������

�� �� ����� �������������� �������������

� ���� �������������� �������&������������

��� ������������ ��������������A�����B������

���� ���������������������A������ ��������������

�������&��� ��������� �������������A �

���������� ����� �� ��� �� ��������� ��� �

���������� � ��� ���������������A��� ����

��� ������� ���.�/�

Digestion with Restriction Enzymes =������� ������� �

������������������������ ��� ���������� ���������

� � ��������������������������������� ������

�����+� ��������!�����3,� ��� ������������

�������������������������A����������

Cleavage by Nonspecific Endonucleases �� ����A������

��� � � � ���������� � ���� �� � �������� �� ���

�����������A�������� ������ ������ ����� �����

���� ����������

Mechanical Shearing �� �����������&���� �����

������������������� ����������� ��������� ���

�� � ���� ��"��������� �������� �� ������� � ��� ���

������������������ �������������� �����������

����������� ������������������A �P<�����

�������� �� .�011 ��>��� � � 31���� -��������� ������

��� ����� ����� ��/<�������� �������������

���������������� ������ ��������������+ ���

.�/,� ���� � �� ����� ���� ��� ������ ��� �����

�� ���� �����" �� ��� �� ����� ����� ���� �

��������� ����� � ��� ����� � ���� ��� ��� �

�������������������������� ���������������

����4 � ��� ������� ���� � �������� � ���� �

������� ����� ��� ������������������ �����������

��� � � ���� ��� ��� ��� ���������� C ������� ��

����� ����� �������������� ������������� ��

����������������� ��� ������� �������� � �

� ��������&�������+� ��������!�����.F,�

Automated Shearing Using High-Performance Liquid Chro-matography (HPLC) ������ �� ���� �� ����� ���� �

� ����� ���������������������������� ����� �*57!

����������'� ��������(�� ������������ ��������

����������������������� �����#���'� ��������(�� �

��������*57!���������� ������������ �����

������������ ���������� ��������� ������������

����� #� �� ��� ���� �� ��� �� �� ��*��� -���

+� ������������������� �G�4������,������� �

��� �� ������� ����� ��� ��� � ����� � � ����� ��

Table 1.2 Hydrodynamic Shearing Methods Used for DNA Fragmentation

Method Advantages and disadvantages

Sonication Easy and quick method of fragmentation;Requires sophisticated instrument;Requires relatively large amounts of DNA (10–100 mg);Fragments of DNA distributed over a broad range of sizes;Only a small fraction of the fragments are of a length suitable for cloning and sequencing;Requires ligation of DNA before sonication and end-repair afterward;Hydroxyl radicals generated during cavitation may damage DNA.

Nebulization Easy and quick method of fragmentation;Requires sophisticated instrument;Requires only small amounts of DNA (0.5–5 mg), and large volumes of DNA solution;No preference for AT-rich region;Size of fragments easily controlled by altering the pressure of the gas blowing through thenebulizer;Fragments of DNA distributed over a narrow range of sizes 900–1,330 bp);Requires ligation of DNA before nebulization and end repair afterward.

Passage through the orifice of Cheap method of fragmentation that does not require any sophisticated instrumentation;a 28-gauge hypodermic needle The method is easy and quick to perform;

Requires only small amounts of DNA;Fragments are a little larger (1.5–2.0 kbp) than required for shotgun sequencing;Requires ligation of DNA before cleavage and end repair afterward.

Circulation through an HPLC Requires expensive apparatus;pump Requires 1–100 mg of DNA;

Fragments of DNA distributed over a narrow range of sizes that can be adjusted by changingthe flow rate;Ligation of DNA required;End repair of fragments before cloning not necessary.

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM36

© Oxford University Press

Page 40: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 37

���������������� �� ����� ����������A+ ���.�/,�

��������A���������� ������������� ������ ����

���������������A ��� ������ ����������

�� � ��� ��� ���� ��� ���� �� ��� ���� ��������

����������������������������������������������

���� ���������� ���������������������������

��� ��� ��� �� ������ � �������� ����� �� �����

���� ��������� ���A���������� �� ��������F1M �

�� �������� ����������� � �� �� �� ��A ���� � ��

����� ������ 7������� � �������� �� � ������ �����

������������ � ������������������� �������

��� � ��� ��������������������� ��� �����

������� ������� �� �� ����� ����A���� ���������

�� �� ��������������� ���� ����� ��

Sonication #� ������� �� �� ������� �� ���C��� �

���� ����������������&� ���� ��������� �� ���

����+ ���.�/,����������� ���������� ���� �� ���

��� �����������B����.�F�4 ��� ����� ���������

� ���A �311I011������ ������ ���� �������������

����� ������ � ����������������������� ����

��A�* ���� �� ���� � ����� �� �� ������� ����� ��

� ������ ����� ���������������� ��������������

�������A �PJ11���2&������ ������ �� �� ����� ��� ������ �� &�������������� � �� � �� � ������

������������� ��������������������������

������������� ��

Nebulization �����A��� ���� �� ����� ������������

�������� ������� ��������������� ���������

� ������ + ��� .�/,� #� �� ��� ��� �� � ������� ��

��������������� ����������� ���� ���� ���������

� ����������A�����+����!��/1F�� �!#-�$-#���,

+B����.�.1,� ���� ������� ����� ���� ���� ���

��� �� ������ ���� � ��� ���� ����� �� ��������

����������A ������������

Other Methods of Obtaining DNA Fragment to be Cloned#����� � ������ ����������������������� ��� ��

�����������A����������� ��� ������&����� ����

� �+� ��������!�����9,�-���������������������

�� ������ ������� �������� �������������

���� ������ ��5!=����������� � ����� ����������

�������������������5!=�� ���������� ���������

��� �� &����� ���� � +� � ������ �!����� J,� #� ��

������ ��� �� ������� ��� ����� � �� �� �� &����� ��

����� ���������� ���� ����������������������

���������� ��������=��� ����� ������� �� � ��

� ������=��������������������� ����� ������

�������� �� �� ��� ��� �� ����� � �� � ����

�������+� ��������!������0���.0,�

���� ���������� �������� ��������������� ����

����������� ����������� ������� ����� �������

�������������������������������� ����������������

�� ��� � � ���������� �� �������� � �����

Attached tocontrol unit

Horn probe

Central hole

DNA sample

Ice-water level

Probe cup

Burette clamp

Figure 1.9 Cup Horn sonicator for random fragmentation of DNA[The cup horn attachment for the Heat Systems sonicator isdepicted with a sample tube in place. The cup horn unit, whichcontains a large horn probe, is attached to the sonicator controlunit and filled with ice water before the sample is sonicated.The sample tube is held in place from above by using a buretteclamp and a ring stand. Alternatively, a tube holder can befabricated from 1/4 inch plastic and used to hold up to eighttubes for simultaneous processing.]

Opening sealedwith plastic cap

Removable lid

Baffle

Pressure from Nentering chamberforces DNA solution upinto the siphon

2

DNA solution exits fromsiphon and flows overthe N as it enters andimpacts on plastic cone

2

N from tank2

Figure 1.10 Functioning of nebulizer [A viscous DNA solutioncontaining glycerol is placed in the nebulizer, which is attachedto a nitrogen tank. Pressure from the nitrogen entering thechamber siphons the DNA solution from the bottom of thechamber to the top. The solution exits the siphon and impactson a small plastic cone suspended near the top of the chamber,thus shearing the DNA.]

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM37

© Oxford University Press

Page 41: GENETIC - india.oup.com

38 Genetic Engineering

� �� ���� �������� ������������������� ����� ��

������� ��������� � ����������������A����������

���#��������������� ����� ��������� ��������������

�� � �������� ����� ��������� ������ � ������A��� �

�� ���� ����� �� ����� ����������� ���������� �

������ �� ������ � ����������� ������ �����������

��������� �������������������������A����� �����

���� ������� ���������� ���������� ��� ���� �

���������* ������������� ���������� �� ������ �

���� ������������������������ ����������������

������� ������ � ������� ������������������

����������� ���������������� ��A����

Joining of DNA Fragments to Vector DNA Molecule

@�� ���������������������� �� ����� ������

���������� �� ����� ��� � � ������ ��� � �� ����

��� �+� ��������!�����.3,� ������������������

������� ������ �������������� ��������� ��

����������� �� � ����� ������� #� �� ����� ��

������������� ����� �������� ����� ��������

�� �� ���������� � ������ � ��� � ����� ������ #� �����

���� ������� ������������ ��� ��� ���� ����

���������� ������������� ��-�������� ������ ��

����� ��+� ��������-��� �.�/,� ����� �������

����������C �������������A� ��������� ����

� ����� ������ ������������A� ����� �� �������� ��

��� ����� � ��� ����������� ������ ��� ����

������� ���� �� � ��� � �� �������� � ���� �����

�������� ����� ���������� ������������� ��

�� ������ � +� � ������ �!����� /, ��� ����� �����

���� ����� �������A�� ����������A������ ���� �

��������+� ��������!�����E,�-� ���������� ��� �

���� ���������������������� ����������� ������

������������ ������� ������ �+� ��������!�����.3,�

@������������ �C ����� ������������������� �

���� ����������� � � ������������������ � �

����������� � �� ����+� ��������!�����.3,�

1.3.4 Introduction of Recombinant DNA Moleculeinto Host Cell

��&���� ������� ����&������ �� � ���� ���

�� �� ����������� ���� ��� ������ ����� �������

��������� ���� �������������@������ ������� � ��

�������� �������������� � � ��� ���� ��������� �

�� ����������� ����������� ������ ������

����� ��� �����������������L����� ������������

� ��� ����� ����������� ������������� ��

�� ������� ��������� � �������� � ��������������

����� � ��� ������ ��� � ���� ����� � ���������

��������� ������+�� ��,���� �����������������

�� � �� ��������������� ������ �� ������2���

��������� �� ������ � �� �� ��� ���� �������

���� ����� ��������������'�� ����( ������

������� �������� ��� � � ���� ����� � � �� �������

���� ����� ��� � �� ��� ������ ������ ����� ��

��������� �� � �� ���� ��������� � �� �� �� �������

������ ������������������ ������+� ��������

!������F���.9,�

1.3.5 Selection of Recombinants and Screeningof Desired Clone

�� ������� � ������� �� ����������� �� ������

��� �� �� � ������� �� �&� ��� �� � �� �� ����

&��������������� ����������� ��� ��������

� ������ ������� -������ � ����� �� � �� ��� ��

����������� ������������ �������� ������������� �

����� ������+���� ����� ���� �������������

��,��� ���������������������������� �� ��� ��

������� �� � � � ����� � � �� �� ��� � ��� ������ �

�� ��� ����������+� ��������!�����.E,�@����

����������������� � ���>���������� �����������

�&������ � ������ � ��������� ������ ������

��������������� ��������������������� ���

������������������� �� ��� ��������������+�,�����

����� �� � ���������)���+��,#���������� � � ��

������� ��� ������������

Direct Selection for the Desired Gene ���������������������� ����&��������������

�������������� �������� ����������������� ����

�������� ���������������� � ������������ �

��������� ������ ���� �� �� �� ������ �� �� �� ��

� �������������������#����������������������

������� ������������������������������� ���

Identification of the Desired Clone from a Gene Library���������� ���� ����������� ����������������

������ ��� ������������ ��������� ������4 � ���

�������������� ������ ���������������� ����������

� ��������� ��������� ������������������� ����

��� ��� ��� ����� �� ��� ���������� ��������! ���

�������������� ��� ��������� ���� ����������������

� ����� ����������� ��+B����.�..,�- �� ���� ����

���������������B ��������� ���������� ��������

������������ �� �� ��������������������� ��

������� +� � ������ �!����� .0,������ �� � �� �� ��

�������� ��������������� ��� �������������� �

�� ����&��� � � �� � ������� �� ��� ��� ������� ��

�����&������������������� ��������� �����

����� ���� ���������� � ����� ����� �� �������� ��� �

�������� ������ �� ����������� ����� � ����������

��������������������������� ���� �����������

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM38

© Oxford University Press

Page 42: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 39

�������� �������4 � ��������� �������������

������������� ��������� �� ���� ����������

������� ��������� ������ ��� ������������� �

���������������� � ���� ������ ����������� ����

������ � ���������� ��� ���� ����� ��������

�� �� � ������� ��������� � +� ������� �!�����

.E,� ��������� �������� �� ������� ���� ��� ���

� �� �������A��� � �� ����� ���� �������A��� � �������� ��

�������������� ������� ���� ����������������� �

� ��������� ����������� ���������� ���� � ���

��������@��� �������� ������ ����� ���

&����� � �� ���������� ����� ����������������

+

DNA fragments

Ligate

Linearized vector DNA

12

34

1: The desired recombinantDNA molecule (containsdesired DNA fragment)

Recombinant DNA molecules each carrying different DNA fragments (correct or wrong)

1 32 4

5: Self-ligated vectorwithout any DNAfragment

3: The 'wrong' recombinantDNA molecule (containswrong DNA fragment)

+

Nonrecombinants containingself-ligated vector

Recombinants containingthe desired DNA molecule

2: The 'wrong' recombinantDNA molecule (contains wrongDNA fragment)

4: The 'wrong' recombinantDNA molecule (containswrong DNA fragment)

Nonrecombinant DNA moleculewith no DNA fragment

Recombinants containing the'wrong' recombinant DNA molecules

Introduce into host bacteria [all circular molecules(recombinant or nonrecombinant) will be cloned]

1: Cell containingdesiredrecombinantDNA molecule

+

3: Cell containinga wrongrecombinantDNA molecule

4: Cell containinga wrongrecombinantDNA molecule

5: Cell containingligated

vectorself-

2: Cell containinga wrongrecombinantDNA molecule

5

Each bacterial colony represents a clone, and contains multiple copies of just one DNA molecule

Plate on solid medium

Figure 1.11 Cloning allows purification of individual fragments of DNA generated in the first step of cloning experiment [The DNAfragment to be cloned is one member of a mixture of many different fragments, each carrying a different gene or part of a gene. Thismixture could indeed be the entire genetic complement of an organism, a human, for instance. Each of these fragments becomesinserted into a different vector molecule to produce a family of recombinant DNA molecules, one of which carries the gene of interest.Usually only one recombinant DNA molecule is transported into any single host cell so that the final set of clones contain multiplecopies of just one DNA molecule. The gene is now separated away from all the other genes in the original mixture, and its specificfeatures can be studied in detail. Cloning is analogous to purification. From a mixture of different molecules, clones containingcopies of just one molecule can be obtained.]

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM39

© Oxford University Press

Page 43: GENETIC - india.oup.com

40 Genetic Engineering

����������� � ����� ����� ����������������� ��������

������� ������� ��@�������������� ����������

��A����������� �������������������������������

���� ������������ ������A���� ������ �����

��� �� �� ������ �� � �������� ��� �� � ����

����� ����� ����� ������������ ��������

������������ ����������� ������ ����������������

�� �� ������ ����+� ��������!�����/1,�

1.3.6 Storage of Desired Bacterial Clones

@������ � ���������������������� ������ ��� �

� ����� ������������� � �������� ����������

�������������������� ������ �� ����� ���@�������

�������������������������� 9����������� ���

������������������������������� ������������

B �� �������� ����� ����������� � �������-� ��

����� ��������������������������� ������� ���

�������� ���� ����� +.�0I0�1��,������ �� ������ ��

��������� ������ �������� ��������������������������

����+7"���������1�E�>�����).1��>� ����������

������ ������������������� ��������,� �������

�������� ��������������������������� ��������

������������������� ������ ���� �� ���������

�� ���� �� �������� � ��� ��<� �����3JO!����� ��

��������� ���������������������� ����������

����������� �������������������� ��������� ���

3IE� ������� ���������� ��������������������

�� ��������� ����������� ������������������ ��

��7"������������������������� ��� �� � ���

�������3JO!� ������������� ������ �����������

��� ������������ &��+�4-@,�� �������������

������.�� ���������������.�� ��������� ���� �

+E0M�>��������)1�.44�-@9)/0�4 ����!���*<�1, �

.�� ��4-@� ���� �+JM�>��4-@,� ���� �����

�� ����I/1O! �IJ1O!�� � ���� �� ����� ��������

��������������������� ��������� ��4-@������

�������� �������� ������ �������� ����������

������� ������ �����������������������������

������ ������ ��� ������ �� ���� ����������7"����

��� �� ���� ������� �� 3JO!��� ������ � � � � ���

����� ��� ������������A������� ����� ��� �����

�� ���������������#������� ������������������ �

A�� � �� ���� �� ��� ����������� ���������

���� ����� � ���������������������������������� �

��������������� ���� � ��� ���������������

���� ����������������������������� 31�����B �

������ �������������� ������ ���������������

� ����������������� � �� ������ ���� �����7"

������"���� �� ���� �������� ��� �� � �� � ���

��������� � �� � �� �������������� �����I/1O!�

�� � ���� ������� �� �� ������� �� ��������� �

������ �� �������� ��� ����� �����1�.m�>���=����� �� � ����� ��� �� �� �������� �������� �� ���

�������������� ������� ������ ��������

1.4 SUBCLONING

������������� ���� ��������� ������ � �

��� �� �� ���������������� �����#������ ���������

���� ���� ��������������� ��������� ������ �

&������ ����������� � ���� ����� � �������� ��

������� ��� � ����� � � ������� � �� � � ��� �

������� &������������������������ �� �������

������ ��4.3 ��� �� �������������� � � �� �����

���������� +�����, � � ������ ��������� � �����

������������������������������&��������� �

������������� ��������������� �� �������������

������� �� � ������� +����4.3, ��� ��� �� ���� ��

��������� �� �������������� ����� ��������

1.5 ADVANTAGES OF GENE OR cDNA CLONING

�� ����������������������� ����� ���� �����

�� ����� ��� ���� � ���� ���� �� ��� ����� ����

����������� �� ����?

To Get Homogeneous Preparations of any Desired DNAC� �������������������������� ������ �������� � �������������� ������ ������ � �� ���������

�� �� ������������� �������� ������������ �

��� ��� �������&��������

To Get High Yields of Recombinant DNA ���� �� �

����� ���� �� ����� � ������ ����� ����� ������ ��

��������������� � ���� ���������������� �

� ��������+B����.�./,�-�������� ����� ��� ��

���������� ����� �� ������� ������ �� � � �����

��������� � �������������.�111�� �������� ����

���������� ����#���� � ����������� ��� ��� ���

���� ���������������������������������� �������

������� ����������� ��� ���������������

To Obtain Pure Sample of a Gene �� ������ �����������

���� � ��� ���������������� � ��������������������

������ ������ �������������� ���������&�

������ ��� ��������� ������������ ������ ��

�����������&�������� �B����.�.�����������������

����������+B����.�./,� ����������� �������������

��� ����������� �������������� ��� ���� ��

&�������� ������� ������������������ �

���� �����#������� �� ��������� ����������

� ������������� ���&������� ���������������� �

� ������������������������������������������

����������A� �������������� �� ����������� ����

�������� ����������������� ����������� � ���

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM40

© Oxford University Press

Page 44: GENETIC - india.oup.com

An Introduction to Gene Cloning 41

����������������������������� ����� ���������

������������������������ �������������

���� � �������� ������C���� �������� �����

� ���A���+����������� �������&���� ����������

������,�@��� ��������������������� �� ��������

��� ������ ���������� ������������C��������������

���������� �����* �������������� � ��������

� ���������������������� ����� �������������

&������������� ���� ����� ������ ����� �

���� �����2��� ��� ���� ��� � � ����� � � ��� �

��� ������������� ��� ������ ���������� �������

���� ����� ���� ������� � � ��� � ����� �������

� ������� �� �������������� ����������� ��

���� � � ����� �� �� ����������� ����� ���

� �� ������������������ �� #�� � �� �� ��� � ���

� ����������� ������ ����������� ����������

��������������� ����� ����������� �������

Isolation and Manipulation of Fragments of an Organism’sGenome ����� ������������������ ���� �����������

���� � ��������� ��� �������(��� �������������

������������������� ������ � � ����� ��

Isolation of Long Genes and Unknown Genes G��� ��

������� ������ ��� ������� �������������������

�� � �'��� � � �����(+� ��������!�����.F,�G�

�� ���� ����� �� ����� ���� � �� ��� ����� ����

���������������� �)�������� ��������� �

��� ������� ���5!=�

Elucidation of Gene Function, Promoter Analysis, andIdentification of Mutations ����� ������� �������� �

�������� ����������������������������������� �

���� �������!������������������ �������������� ��� �

���� � ���� ��������� �� �� ����������������

��������� ���� ������������������������� ������

���������� ��������������� �����������������@����� ���

��� �� �����&�������+�,�-�������������� ��� �

���������� ������ ������ �� �������������� �

����� �� ����������������������������������

���� �� ��������� �������� � ��� �� ����� ��� ��

����� ��� �������(��� � �� ���� ���� ���&�

����������� �������������� ����� ��� �� �����

������G��� ����������������� ������ ������

������ � ��������� ��� �&������������� � �&����

�� ��� ���� ��� ������������� �� ����� ����� ��

������ ����� �������������� ����������� �

��� ���>�A��>=�������� ��� ����������� ����� �

�� ������������� ����$���������������������

���������������� �&�������� ��������� � ���

&����� �������������� ���������� ���� ����

Single cell containing multiple copiesof a recombinant DNA molecule in nanogram amounts

Plate on solid medium andgrow to a colony

Colony provides several microgramof recombinant DNA

Inoculate into 500 ml of liquid broth;Incubate for 18 hours

Broth supplies several milligramof recombinant DNA

Figure 1.12 Cloning supplies large amounts of recombinant DNA

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM41

© Oxford University Press

Page 45: GENETIC - india.oup.com

42 Genetic Engineering

���� �� ��� ����������� ���������G��� ��������� ���� ��� ���� ������������ ����� � ������ ���� ��� ��������������� �������������� � �������� ��������������������� ������

Information About Cell Type and Developmental Stage-Specific Genes, Locations of Splice Sites, and Alterna-tively Spliced Genes ��� ����������� ������� � �� ��� ����� � �������� � � � ���� ��� #� � ����������������������������������������� ��=������� ��� ����&����� ��� ������������������������ �������������������� ��� ������� �&�������������������&������������������� ������� ������ ��������������������� ����������� ����� ��� ������������������� � ���������������������������������������� ������������

DNA or Genome Sequencing �������� �������� ������ �������� ���&�� ������������� � ���

�� ��������������������� ��������������� � ��� ��������+� ��������!�����.F,�

Site-directed Mutagenesis G��� ��������� ���������������������������&����������� �������� ������ ��� ������ �&������ ������������ ���������*��������� ��A������������������ ��� ����� �� ���� �� ������������������������������������ ��A�������+� ��������!�����.J,�

Applications Other Than Research ���������� �� ����� �������������������� ��������� ����� � ��� ������� ���� ����� ��� � ����� ��� ����� +����������������� �� ��� � �� �� �������� � �A���� ������ ������� � �������� ��������������,����������������������� �� ��������� �� ������� �� ��� ������ �� ������������������������� ��������+���� ��������������������������,�������������������������+� ��������!�����/1,�

Review Questions

.� ���������L��� �I!����� ����������������� �����

* �� ����������� �=��X

/� ���������� ���� �������� ��� � ���&�����G��

&����� �����

3� ����������� ����� ��������� ������� ��L���� ���

�� ���� �� ���� ��� � � ����� �� ��AX��� ��� � �

&����� ��� ������� ���

9� L������� � ������ �������������������������������X

* �����������X

0� L���� � �����������������'���� ����(XG�����

&�������� ������� * � �� �� �� ��� ��� � � ��

�� ���� �X

E� ����������������� ����� ����������� � �� ���

�������� ��������������* �� ����� ��������

�� ����� ��� ���� � �� �����������X

J� ������ �� �������� ��� �� ���� �������������� �

������������������� ������������������ ��

<� 2&��������� ������������ ���� ������ ��������� �

������������ ����� ������ ����������������=���

F� ���������� ������������ ���� ������� � �=���

� ��������� �������=���� ���� ��� �����L�������

����������� ��������� �������� ���X

.1� L������������������������������� �������������

������ ����5�91 � �������� ����� ������ ��� � � =��

�� ���� �X

..� ���������� �� �� �� ������������������ ���� ����

���������� � �� �����? ��� A��� b�42� �����������

��� �������-�-���/2� ��� � ��������������� �����

%� ��� �� ��� � � ��� �� ���� ��� � �� ! �"����� #�

=�����25!� � ���� ������ 7�!�� .11M2�@*� ������

� �������� ���������������������� ����������������J1M

2�@*�

./� * ��������� �������=���������� ���������$8

��� �������������X#���� ������������� �����

�������� �������/E1>�/<1����� �.�0���������� ����

������ ������������ ��

.3� * �������������������� �� ���=���������� �������

������ ������� �� ����X

.9� 2&�������� �� ����?

+�, =����� ���������������

+�, ��� ���� ��� �� ����� ������� � � ��� �� �� ����

&��������

+�, 5�������� ��������������� �����������

+�, 5!=��������������������� �� �����

+, G��� �������� ������� ��� ������� ����� �

�� ��������������������� ��

+�, ������ ����� �� �������������������2�@* �� ��

����� �� � ����� � ����������H��*9H�%H�

�7�H�

+�, @��� �������� �������� ������=���

+�, '" ������������������������ �=����( �'=����

��������� �����(�

+�, ����������� ������������������������� ���� ��

�����25! � � ���� ����� ��� ��� �� �� �� �� ��

����������� ��������

.0� L�������������� � ��� ������������� ��� ����X

����������������� ��� � �������������������� �

�� ���� &����������� ������� �� ��������� ���

������������ ������ �����

.E� L���� � �����������������'����� ����(X2&�����

���������������

.J� ������� �� ��������� � ������ �������� ������

���� ����������� �� ����� �����

.<� ���� ���������������/E1������/m� ��.1�������������������������@� �1�<�!�������

��� �������� � ����+��m�,���.11m������������ ��

GE Chap_01 (6th Proof).p65 7/2/10, 4:47 PM42

© Oxford University Press