GLYCOPROTEOMIC STUDIES IN RHEUMATOID ARTHRITIS

Synopsis submitted to

WEST BENGAL UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

in partial fulfillment of the Degree of

DOCTORATE OF PHILOSOPHY

2011

ASHISH SAROHA

SCHOOL OF MANAGEMENT AND SCIENCES DEPARTMENT OF NATURAL SCIENCES

WEST BENGAL UNIVERSITY OF TECHNOLOGY SALT LAKE, KOLKATA-700 064

WEST BENGAL INDIA

 

Rheumatoid arthritis: An overview 

Rheumatoid arthritis  (RA)  is associated with physical disability affecting 1‐2%  of  the  population worldwide.  It  is  a  chronic,  systemic  and  autoimmune disease which has great socio and economic consequences as  it affects patient’s efficiency and cost huge amount of money  to manage  the disease  (Aggarwal et al., 2006). RA is characterized by inflammation of the synovial membrane (SM) of diarthrodial joints. Early indications of RA are swelling and pain of the proximal inter‐phalangeal and  later,  the  larger  joints become affected, especially  those of the knee, elbow and ankle. Hyperplasia or thickening of the SM is promoted by cytokines  and  growth  factors  released  from migrating  cells.  The  SM  becomes revascularised  making  it  redder  than  normal  (Fig  1).  The  cytokine  enriched environment produced by pro‐inflammatory cytokines (IL‐1α, IL‐6 and TNF‐ α) results  in  the  aberrant  growth  of  complex  vessels  known  as  pannus  which invades  the  cartilage  resulting  in  the  irrepairable  degradation  of  the  articular surfaces. 

 

 

Fig 1. Picture showing deformities in small joints of rheumatoid arthritis patient (Top). Schematic diagram showing  the comparison among normal and  the  joints affected with osteoarthritis and rheumatoid arthritis (below).  

 

The  precise  etiology  of  the  disease  is  unknown  however;  genetic  and environmental factors seem to be involved in its pathogenesis. Certain infections or  factors  in  the environment  (Edwards and Cooper, 2006) as well as  smoking tobacco have been reported to increase the risk of developing RA (Criswell et al., 2006). The description of  the human  leukocyte antigen  (HLA) associations with RA, has been a major source of support for the hypothesis that genetic factors are important  for  susceptibility  to RA due  to  a  closely  related  set  of polymorphic sequences  (the  ‘shared  epitope’)  on  several  different  DRB1  alleles  such  as DRB1*0401  and  DRB1*0101  (Weyand  and  Goronzy,  2000).  In  addition, homozygosity  for  particular  combinations  of  haplotypes,  such  as DRB1*0401/0404,  appear  to  confer  especially  high  risk  or  influence  disease severity as well as risk (Suzuki et al., 2003). 

There  is no single  test which clearly diagnoses early RA. Disease activity score‐28 (DAS) score, erythrocyte sedimentation rate (ESR) and visual analogue score  (VAS)  are  calculated,  besides  examining  the  joint  inflammation  and deformity.  In  RA,  the  small  joints  of  the  hands,  wrists,  feet,  and  knees  are typically  inflamed  in  a  symmetrical  distribution  (affecting  both  sides  of  the body). Blood test for IgM and IgG RF, anti‐CCP (ACPA) antibodies may suggest the presence of RA. ACPA against various citrullinated autoantigens like keratin (antiperinuclear  antibodies,  APA),  filaggrin  (antifilaggarin  antibodies,  AFA), vimentin  (antivimentin  antibodies,  anti  SA)  can  be  detected  very  early  even before the onset of clinical symptoms (Van Boekel et al., 2002). Presence of anti‐nuclear  antibody  (ANA)  and  anti‐MBL‐antibodies  have  also  been  reported  in patients of RA (Gupta et al., 2006).  

Protein glycosylation is the most common post translational modification of  proteins.  Besides  stability,  some  other  important  functions  performed  by glycans in the proteins are protection from proteolytic enzymes and viruses, host pathogen  interaction,  immune  system,  protein  folding  etc.  During  disease conditions, the intracellular environment of the cell is under stress, affecting the glycosylation machinery of  the  cell which  consists of various glycosidases and glycosyltransfersaes  present  in  endoplasmic  reticulum  (ER)  and  golgi  bodies. This results in the altered glycosylation pattern of the protein which often leads to malfunction of the protein e.g. agalactosylation of human IgG (IgG0) has been found  to be  increased and  correlated with  the disease  severity  in RA patients. Rheumatoid factor (RF), the characteristic auto‐antibody against the Fc region of IgG0,  is also  increased  in  the sera of patients with RA  (Carson et al., 1987). The altered  glycosylation  of  IgG  activates  the  complement  system  via  mannose binding  lectin  (MBL)  through  the  interaction with penultimate GlcNAc  residue exposed after degalactosylation (Malhotra et al., 1995). Besides IgG, other serum proteins also undergo glycosylation changes in RA patients (Raghav et al., 2006).

 

Aims and objectives 

The present work aimed  to  study  the disease  specific glycosylation  changes  in plasma proteins for diagnosis and understanding disease mechanism  in RA. To fulfill the above aim, the study was divided into following objectives.  

1. Glycosylation  alteration  studies  in  acute  phase  plasma  alpha  1  acid glycoprotein (AGP) and haptoglobin (Hp) in plasma of rheumatoid arthritis (RA) patients.  

2. Jacalin bound O‐linked plasma glycoprotein profiling in RA patients. 3. Glycoproteomic  studies  in  collagen  induced  arthritis  (CIA)  in  rats,  the  rat 

model of rheumatoid arthritis.  

Results 

Glycosylation alteration studies in acute phase plasma alpha 1 acid glycoprotein (AGP) and haptoglobin (Hp) in plasma of rheumatoid arthritis (RA) patients.  

 Fig. 2. 2DE profiling of WGA bound plasma of control and RA patients using pH 3‐10 NL IPG strips.  The  marked  proteins  spots/regions  were  analyzed  by  alpha  digidoc  software  for differential expression and were  identified as AGP (region 1), Hp‐β (region 2), Hp‐α2 (region3) and hemoglobin alpha (region 4) and beta (region 5) chains by MALDI‐TOF. 

Comparative  analysis  of  albumin  and  IgG deleted plasma  of RA patients  and healthy controls showed the differential expression of many acute phase proteins like  alpha  1  acid  glycoprotein  (AGP),  haptoglobin  (Hp),  alpha  1  antitrypsin 

 

(AAT)    in  RA  patients.  The  expression  level  of  two  important  acute  phase proteins  i.e. AGP  and Hp was  validated  in more  number  of  control  and  RA patients  using  Western  blotting  which  showed  the  statistically  significant (p<0.05)  increase  in plasma  level  of AGP  (~2.5  fold)  and Hp  (~1.6  fold)  in RA patients.  Plasma  glycoproteins  from  RA  patients  and  controls  were  enriched using wheat germ agglutinin  (WGA)‐agarose affinity  column  followed by 2DE (Fig. 2). N‐linked glycans were separated by  in gel digestion of WGA enriched AGP  and  Hp  using  peptide  N‐glycosidase  F  (PNGase  F).  Monosaccharide analysis  of  glycans  by  high  pH  anion  exchange  chromatography  using  pulse amperometric  detection  (HPAEC‐PAD)  showed  the  presence  of many  neutral sugars  like  fucose,  galactose,  glucose  and  mannose  and  basic  sugar  like glucosamine  in AGP  and Hp. HPAEC‐PAD  analysis  revealed  the  statistically significant  increase  and  decrease  in  the  level  of  mannose  in  AGP  and  Hp respectively  in  RA  patients  compared  to  controls  (Fig.  3).  The  differential glycosylation was further validated using concanavalin A (ConA) lectin binding to these proteins by enzyme linked lectinosorbent assay (ELLA). Con‐A showed higher and lower 

 

Fig.  3. Histograms  showing  the  relative percentages of monosaccharides  from AGP  and Hp‐β chain from plasma of healthy controls and RA patients (n=30) as analyzed by HPAEC‐PAD. The relative  percentage  level  of  GlcN,  Gal  and Man  was  found  to  be  higher  in  AGP  while  the percentage of Man was found to be less in Hp‐β chain in plasma of RA patients. p value less than 0.05 is considered as statistically significant. 

binding  to AGP  and Hp  respectively  in RA  patients,  confirming  the HPAEC‐PAD  results.  Serum AGP  has  high  heterogeneity  in  glycan  structures, mainly composed of bi‐,  tri‐ and  tetra‐antennary  structures. Most of  the  tri‐ and  tetra‐

 

antennary  forms  are  sialylated  of which  few have  lewisx  (Lex)  or  sialyl  lewis  x (SLex) structures. Serum AGP fucosylation and sialylation have been shown to be significantly  increased  in RA  resulting  in  the  increased  expression  of  the  SLex (Ryden et al., 2002). It has been shown that the bi‐antennary glycan structures of AGP are responsible  for ConA binding which are rich  in Man contents  (Shiyan SD and Bovin NV, 1997). ELLA studies using ConA lectin also showed the higher binding  of  ConA  with  AGP  in  RA  plasma  indicating  a  possible  increased expression of bi‐antennary glycans. Higher content of Gal on AGP may facilitate more binding of sialic acid residues which might help in binding of AGP to sialic acid receptors (E‐selectin) present on neutrophils (Jorgensen et al., 1998). 

Jacalin  bound  O‐linked  plasma  glycoprotein  profiling  in  RA patients 

  

Fig.  4. 2D DIGE  images of  jacalin bound Cy3  labeled  control plasma  (A) Cy5  labeled patients plasma (B) and overlay of A and B (C).   

Here,  comparative analysis of O‐linked glycoprotein profiling of plasma proteins was done using  jacalin affinity agarose column chromatography  in RA patients. Glycoprotein  profiling  using  difference  in  gel  electrophoresis  (DIGE) and  2DE  showed  the  differential  expression  of many  jacalin  bound O‐linked plasma proteins in RA patients. The PD‐Quest analysis of these gels revealed the differential  expression  of  18  protein  spots  with  statistical  significance.  The 

 

expression  level  of  two  O‐linked  glycan  containing  proteins  i.e.  alpha  2  HS‐glycoprotein  (A2HSG)  and  inter  alpha  trypsin  inhibitor  4  (ITIH4) which were found to be differentially expressed  in plasma of RA patients were validated  in more number of controls and patients by Western blotting. The later showed the statistically significant increase (~2 fold) in the expression of ITIH4 and decrease (~2 fold) in the expression of A2HSG in RA patients. The increased level of ITIH4 was  found  to be  in good  agreement with previous  studies where  its  level has been  found  to be  increased  in various  inflammatory  conditions  (Choi‐Miura  et al., 2000; Pineiro et al., 2004). ITIH4 is a 120 kDa protein which is cleaved into N‐terminal 85 kDa and C‐terminal 35 kDa fragment by plasma kallikarein system. The 85 kDa fragment is further cleaved into 57 kDa and 28 kDa. In our study, the level of 85 kDa fragment was found to be increased by ~2 fold in plasma of RA patients.  ITIH4  contains potential actin and  calcium binding  sites  suggesting a role in inhibition of actin polymerization and calcium metabolism.  

Protein sialylation plays a very important role in structural and functional establishment  of  synaptic  pathways,  nutrition,  leukocytes  rolling  and extravastation during inflammation. The reduced sialylation of A2HSG may 

 

  Fig 5. 2D Western blot analysis shows the more acidic pI of A2HSG in control as compared to RA which was  shifted more  in control compared  to RA  towards basic pI after sialidase  treatment. PNGase F treatment resulted in equal shift in pI of A2HSG in both control and RA patients.  

 have  a  major  effect  on  the  protein  structure  and  its  functions  i.e.  bone calcification,  ossification  and  cell  adhesion  because  the  interaction  of  A2HSG with other molecules may be mediated via sialylation (Kundranda et al., 2004). 

 

 

Generation  and  glycoproteomic  studies  in  collagen‐induced arthritis (CIA)  

  

Fig 6. (A) Representative photographs of hind paws of control and CIA rats. (B) Percent change in body weight of control and CIA rats with reference to day 12 (appearance of inflammation) till the day of euthanization  (day 42th).  (C) Representative radiographs of  the hind  limbs  (showing the tibiotarsal and tibiofemoral joints) of control and CIA rats. Arrows indicate the bone damage in  both  tibiotarsal  as  well  as  tibiofemoral  joints.  (D)  Representative  histological  figures (hematoxylin and eosin stained slides) of knee  joints showing smooth and monolayer synovial linings  and  uniform  synovial  space  of  ‘control’  rats. Hyperplastic  synovial  cells  indicated  by circle,  erosion and disruption of  synovial  linings as  indicated by arrows was observed  in CIA rats. m=meniscus, f=fibula, js=joint space, t=tibila.  

 Collagen‐induced  arthritis  (CIA)  is  an  experimental model  of  arthritis induced in susceptible strains of mice or rats by immunization with heterologous collagen  type  II,  a  joint‐specific  protein,  in  complete  Freund’s  adjuvant (Trentham  et  al.,  1977).  CIA  has  been  extensively  studied  to  elucidate  the pathological  mechanisms  relevant  to  human  RA  and  to  identify  potential therapeutic targets. In this study, CIA rat model of RA was developed in Wistar rats  using  porcine  type  II  collagen.  Visual  analysis  like  inflammation  and swelling in hind paws, loss of body weight, increased arthritic score and arthritis 

 

index  in  starts  appearing  within  12‐16  days  of  period.  Histochemical  and radiological analysis also showed the  joints deformities and narrowing of space between joints in CIA rats as compared to control rats, confirming the successful development of rat model of RA (Fig. 6).  

 

 

Fig 7. A representative 2DE image of WGA bound plasma of pooled control and CIA rats from each group. Three hundred microgram of protein was focused in pH 3‐10 IPG strips followed by second dimensional separation in 12 % polyacrylamide gel.  

Proteomic  analysis  of  plasma  proteins  using  both  WGA  bound  and unbound  plasma  fractions  showed  the  differential  expression  of  many  acute phase proteins  like AGP, hemopexin, kininogen,  clusterin, alpha‐1 major acute phase protein (T‐kininogen 1) etc in CIA rats (Fig 7). The level of T‐Kininogen 1 was  found  to  be  highly  increased  (~6  fold)  in  CIA  rats  which  was  further validated using Western blotting. Kininogens are important precursor molecules for  vasodilator  peptide  called  bradykinin  via  plasma  kallikrein‐kinin  system (KKS) which participates  in the pathogenesis of various  inflammatory reactions like  involved  in  cellular  injury,  coagulation,  complement  activation,  cytokine secretion,  release  of  proteases  etc.  The RT‐PCR  analysis  of  two  genes  namely clusterin  and  kininogen  from  liver  tissues  also  showed  the  change  in  the expression of these two genes in CIA rats as compared to control rats. However, the  expression  level  of  these  two  genes  did  not  corroborate  with  the corresponding protein level in the plasma. 

 

Significant achievements

• The  comparative  plasma  glycoprotein  profiling  of  patients  and  healthy controls,  using  different  lectins  affinity  columns  based  glycoprotein enrichment, has  identified the number of glycoproteins underwent changes in the expression level. 

•  Glycan  analysis  of  plasma AGP, Hp  and A2HSG  has  shown  the  disease specific glycosylation  changes  in RA patients. These aberrant glycosylation patterns,  along  with  other  clinical  parameters,  can  be  used  for  precise diagnosis of RA. 

• The glycoproteomic studies in collagen induced arthritis (CIA), the rat model of  RA,  have  identified  the  differential  expression  of  many  plasma glycoproteins  similar  to  RA,  suggesting  the  similarity  of  CIA  to  RA  at proteomic level. 

Publications:

1. Suramin  ameliorates  collagen  induced  arthritis.  Debasis  Sahu,  Ashish Saroha,  Saugata  Roy,  Sandip  Das,  Prem  S.  Srivastava,  Hasi  R.  Das. International Immunopharmacology, 2011 (in press). 

2. Altered  glycosylation  and  expression  of  plasma  alpha‐1‐acid  glycoprotein and  haptoglobin  in  rheumatoid  arthritis. Ashish  Saroha,  Sagarika  Biswas, Bishnu P Chatterjee and Hasi R. Das. Journal of Chromatography B, Vol 879, No. 20 (2011) 1839‐1843. 

3. Altered glycosylation  in autoimmune diseases. Ashish Saroha, and Hasi R. Das. Trends in Carbohydrate Research, Vol.3, No.2 (2011) 1‐12. 

4. Glycoproteomic  analysis  of  collagen  induced  arthritis  in  rats.  Sagarika Biswas, Debasis Sahu, Ashish Saroha, Hasi R. Das. Trends  in Carbohydrate Research, Vol.1, No.4 (2009) 12‐20. 

5. Altered expression and glycosylation of plasma proteins in rheumatoid arthritis. Sunil K. Raghav,   Bhawna Gupta, Charu Agrawal, Ashish Saroha, Rakha H. Das, Ved P. Chaturvedi and  Hasi R.Das. Glycoconjugate journal (2006) 23:169‐175.

 

6. Jacalin  bound  O‐linked  glycoprotein  profiling  and  reduced  sialylation  of plasma  alpha  2‐HS  glycoprotein  (A2HSG)  in  rheumatoid  arthritis  patients. Ashish Saroha, Saravanan K, Bishnu P Chatterjee, Hasi R Das.  (Manuscript under revision in Journal of chromatography B) 

References Aggarwal,  A.,  Chandran,  S.,  and Misra,  R.  (2006)  Physical,  psychosocial  and 

economic impact of rheumatoid arthritis: a pilot study of patients seen at a tertiary care referral centre. Natl Med J India 19, 187‐191. 

Carson,  D.  A.,  Chen,  P.  P.,  Fox,  R.  I.,  Kipps,  T.  J.,  Jirik,  F.,  Goldfien,  R.  D., Silverman,  G.,  Radoux,  V.,  and  Fong,  S.  (1987)  Rheumatoid  factor  and immune networks. Annu Rev Immunol 5, 109‐126. 

Criswell, L. A., Saag, K. G., Mikuls, T. R., Cerhan, J. R., Merlino, L. A., Lum, R. F., Pfeiffer, K. A., Woehl, B., and Seldin, M. F.  (2006) Smoking  interacts with genetic  risk  factors  in  the  development  of  rheumatoid  arthritis  among older Caucasian women. Ann Rheum Dis 65, 1163‐1167. 

Edwards,  C.  J.  and  Cooper,  C.  (2006)  Early  environmental  factors  and rheumatoid arthritis. Clin Exp Immunol 143, 1‐5. 

Gupta, B., Raghav, S. K., Agrawal, C., Chaturvedi, V. P., Das, R. H., and Das, H. R.  (2006) Anti‐MBL  autoantibodies  in patients with  rheumatoid  arthritis: prevalence and clinical significance. J Autoimmun 27, 125‐133. 

Jorgensen, H. G., Elliott, M. A., Priest, R., and Smith, K. D. (1998) Modulation of sialyl Lewis X dependent binding  to E‐selectin by glycoforms of alpha‐1‐acid glycoprotein  expressed  in  rheumatoid arthritis. Biomed Chromatogr 12, 343‐349. 

Kundranda, M. N., Ray, S., Saria, M., Friedman, D., Matrisian, L. M., Lukyanov, P., and Ochieng,  J.  (2004) Annexins expressed on  the cell surface serve as receptors  for  adhesion  to  immobilized  fetuin‐A.  Biochim  Biophys  Acta 1693, 111‐123. 

Malhotra, R., Wormald, M. R., Rudd, P. M., Fischer, P. B., Dwek, R. A., and Sim, R.  B.  (1995)  Glycosylation  changes  of  IgG  associated  with  rheumatoid arthritis  can  activate  complement  via  the mannose‐binding  protein. Nat Med 1, 237‐243. 

 

Raghav, S. K., Gupta, B., Agrawal, C., Saroha, A., Das, R. H., Chaturvedi, V. P., and  Das,  H.  R.  (2006)  Altered  expression  and  glycosylation  of  plasma proteins in rheumatoid arthritis. Glycoconj J 23, 167‐173. 

Ryden,  I.,  Pahlsson,  P.,  Lundblad,  A.,  and  Skogh,  T.  (2002)  Fucosylation  of alpha1‐acid  glycoprotein  (orosomucoid)  compared  with  traditional biochemical markers of inflammation in recent onset rheumatoid arthritis. Clin Chim Acta 317, 221‐229. 

Schafer, C., Heiss, A., Schwarz, A., Westenfeld, R., Ketteler, M., Floege, J., Muller‐Esterl, W., Schinke, T., and  Jahnen‐Dechent, W.  (2003) The serum protein alpha  2‐Heremans‐Schmid  glycoprotein/fetuin‐A  is  a  systemically  acting inhibitor of ectopic calcification. J Clin Invest 112, 357‐366. 

Shiyan  SD  and  Bovin  NV  (1997)  Carbohydrate  composition  and immunomodulatory  activity  of  different  glycoforms  of  alpha1‐acid glycoprotein. Glycoconj J 14, 631‐638. 

Suzuki,  A.,  Yamada,  R.,  Chang,  X.,  Tokuhiro,  S.,  Sawada,  T.,  Suzuki,  M., Nagasaki, M., Nakayama‐Hamada, M., Kawaida, R., Ono, M., Ohtsuki, M., Furukawa,  H.,  Yoshino,  S.,  Yukioka,  M.,  Tohma,  S.,  Matsubara,  T., Wakitani, S., Teshima, R., Nishioka, Y., Sekine, A., Iida, A., Takahashi, A., Tsunoda,  T.,  Nakamura,  Y.,  and  Yamamoto,  K.  (2003)  Functional haplotypes  of  PADI4,  encoding  citrullinating  enzyme  peptidylarginine deiminase 4, are associated with  rheumatoid arthritis. Nat Genet 34, 395‐402. 

Trentham, D. E., Townes, A. S., and Kang, A. H. (1977) Autoimmunity to type II collagen an experimental model of arthritis. J Exp Med 146, 857‐868. 

Van Boekel, M. A., Vossenaar, E. R., van den Hoogen, F. H., and van Venrooij, W. J.  (2002)  Autoantibody  systems  in  rheumatoid  arthritis:  specificity, sensitivity and diagnostic value. Arthritis Res 4, 87‐93. 

Weyand, C. M. and Goronzy,  J.  J.  (2000) Association of MHC and  rheumatoid arthritis.  HLA  polymorphisms  in  phenotypic  variants  of  rheumatoid arthritis. Arthritis Res 2, 212‐216.