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Guilherme Pereira Scagion
Detecção sorológica, molecular e caracterização dos Paramixovírus aviários do tipo 1 (classe I e
classe II) em aves silvestres e sinantrópicas.
Serological and molecular, detection and
characterization of avian Paramyxovirus type 1
(class I and class II) in wild and synanthropic birds.
CAMPINAS– SP
2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Guilherme Pereira Scagion
Detecção sorológica, molecular e caracterização dos Paramixovírus aviários do tipo 1 (classe I e classe II) em aves
silvestres e sinantrópicas.
Serological and molecular detection and characterization of
avian Paramyxovirus type 1 (class I and class II) in wild and
synanthropic birds.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do título de
Mestre em Genética e Biologia Molecular na área de Microbiologia.
Dissertation presented to the Institute of
Biology to obtain the title Master of Genetics and Biology
Molecular in the area Microbiology.
Orientadora: Profa. Dra. Clarice Weis Arns Coorientadora: Profa. Dra. Helena Lage Ferreira
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GUILHERME PEREIRA SCAGION, E ORIENTADA PELO Profa. Dra. CLARICE WEIS ARNS.
CAMPINAS – SP 2015
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Biologia
Gustavo Lebre de Marco - CRB 8/7977
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Serological and molecular, detection and characterization of avian Paramyxovirus type 1 (class I and class II) in wild and synanthropic birds
Palavras-chave em inglês:
Newcastle disease vírus
Wild bird
Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction
Real-Time Polymerase Chain Reaction
Área de concentração: Microbiologia
Titulação: Mestre em Genética e Biologia Molecular
Banca examinadora:
Clarice Weis Arns
Lara Borges Keid
Rodolfo Thomé
Data de defesa: 29-06-2015
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Campinas, 29 de junho de 2015.
Banca Examinadora Profa. Dra. Clarice Weis Arns (Orientadora) _____________________ (Titular) Prof. Dr. Rodolfo Thomé _____________________ (Titular) Profa. Dra. Lara Borges Keid _____________________ (Titular) Prof. Dr. José Luiz Proença Modena _____________________ (Suplente) Profa. Dra. Maria Angela Orsi _____________________ (Suplente)
Agradecimentos
A Deus, por ter me dado forças para persistir no meu ideal e colocar pessoas maravilhosas na minha vida que sempre me ajudaram, Aos meus pais, irmãos, tios e tias, enfim a toda minha família, pelo apoio recebido nesta fase da minha vida. Um agradecimento especial a minha Vó Maria, que apesar de não estar mais entre nós, sempre me apoiou e sei que continua me apoiando de onde estiver. À minha orientadora Profa Dra Clarice e à minha coorientadora Profa Dra Helena Lage Ferreira, pela confiança, incentivo, ensinamentos e pela maneira eficiente como me conduziram na elaboração dos meus estudos. Ao Professor Dr. Paulo Anselmo Nunes Felippe pela sua colaboração no trabalho, À Professora Dra. Maria Silvia Viccari Gatti pelos ensinamentos e pela paciência, Às amigas Larissa, Tamires, Carol e Babi por toda ajuda que me deram na mudança para UNICAMP, as dicas, os almoços, os trabalhos, Aos meus amigos Kamila, Clara, Dayane, Lewris, Mariana, Breno, Eliane, Bianca, Ferzinha, Marmitinha, Bruna e Ariela que mesmo não podendo estar sempre perto, tornam meus dias mais leves, e por nós dividirmos os problemas e somarmos soluções. Agradeço a todos do Laboratório Multiusuário de Saude Animal e Segurança Alimentar pelo convívio diário, em especial a Julia, nossa super tecnica e a Vanessa pela ajuda, conselhos, amizade e risadas. Aos colegas do Laboratório de Virologia Animal, por toda ajuda. A coordenação do Curso de pós-graduação de Genética e Biologia Molecular pelo apoio recebido. Á Universidade Estadual de Campinas agradeço pela formação científica. A CAPES, e principalmente a FAPESP pelo suporte financeiro a este projeto (2013/02059-2) e aos projetos que auxiliaram o desenvolvimento do mesmo (2011/09019-0 e ao projeto BIOTA FAPESP 2011/50919-5). E a você que direta e indiretamente me ajudou e que não foi citado aqui, Um grande abraço Obrigado!
“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos outros dez.”
George Bernard Shaw
Resumo
Os paramixovírus aviários do tipo 1 (APMV-1) pertencem à família Paramyxoviridae, subfamília Paramyxovirinae, gênero Avulavirus. O APMV-1 causador da doença de Newcastle (DN) é considerada uma das maiores causas de perdas econômicas para a avicultura mundial, devido a alta mortalidade e os embargos econômicos envolvidos. A compreensão da epidemiologia de infecções causadas por APMV-1 é dificultada pelo fato de que estes vírus não produzem sinais clínicos e frequentemente não são detectados por métodos de diagnóstico rápidos. As aves silvestres parecem ser um importante reservatório desses vírus. Recentemente, a análise dos tamanhos de genoma e sequências de genes revelou dois clados distintos dentro APMV-1: classe I e II. O presente estudo teve como objetivo investigar a presença de APMV-1 em aves selvagens e sinantrópicas através de testes moleculares e sorológicos. Para este fim, 387 amostras de aves (194 amostras de orofaringe e 193 esfregaços de cloaca) pertencentes a 37 espécies de 12 ordens foram testados. Um ensaio em tempo real de RT-PCR (RRT-PCR), para a detecção simultânea de vírus de classe I e classe II foi utilizado para a detecção molecular de genes L e M, respectivamente. Outros sete testes RT-PCR convencional direcionados ao gene de fusão (F) e ao gene de hemaglutinina-neuraminidase (HN) foram testados em comparação com a sensibilidade analítica do ensaio de RRT-PCR. Estes RT-PCR foram também utilizados para sequenciamentos das amostras positivas. Assim, das 387 amostras testadas 10 foram detectadas como positivas pelos RRT-PCR. Entre as amostras positivas, encontra-se, uma proveniente de Sporophila frontalis ave ameaçada de extinção, na qual ainda não se sabe totalmente o efeito do AMPV-1. Foi possível sequenciar três amostras com o gene HN e onze com gene F, estas sequências foram agrupadas dentro do genótipo II, classe II de APMV-1. Além disso, em um ELISA competitivo testado, obteve-se uma sensibilidade analítica e especificidade perto de 100% e 10% reprodutibilidade. No total, 123 soros foram testados por ELISA e pelo teste de Inibição da hemaglutinação (HI). A frequência de ocorrência, utilizando HI foi de 22,73% e 19,51% no ELISA competitivo. Essas duas técnicas tiveram uma correlação de 0,62. Portanto, nosso estudo reitera a importância de continuar a vigilância em aves selvagens para aumentar o conhecimento sobre a epidemiologia da AMPV -1 no Brasil.
Palavras chave: Paramixovírus, Aves silvestres, RRT-PCR.
Abstract
The avian paramyxovirus type 1 (APMV-1) belongs to family Paramyxoviridae, subfamily Paramyxovirinae, genus Avulavirus. APMV-1 that causes Newcastle disease (ND) is considered a major cause of economic losses to the global poultry industry, because of high mortality and economic embargoes. The Understanding of epidemiology of infections caused by APMV-1 is hampered by the fact that these viruses do not produce clinical signs and often are not detected by rapid diagnostic methods.Wild birds seem to be an important reservoir of these viruses. Recently, analysis of the genome sizes and sequences of genes has revealed two distinct clades within APMV-1: class I and II. The present study aimed to investigate the presence of APMV-1 in wild and feral birds through molecular and serological tests. To this end, 387 samples (194 oropharyngeal swabs and 193 cloacal swabs) of 37 species belonging to 12 orders of birds were tested. A test of real time RT-PCR (RRT-PCR), for the simultaneous detection of viruses of class I and class II was used for molecular detection of genes L and M, respectively. Seven others conventional RT-PCR tests targeting fusion (F) and hemagglutinin-neuraminidase (HN) genes were tested and analytical sensitivity compared with RRT-PCR assay. Those RT-PCR were used for DNA sequencing. Ten out of 387 tested samples were positive by RRT-PCR. Among the positive samples were found, one from Sporophila frontalis an endangered birds species, for which is not yet fully know about AMPV-1 effect. Three samples sequences with the HN gene and eleven with gene F were analyzed phylogenetically and grouped within the genotype II, class II of APMV-1. A competitive ELISA test was tested that performed analytical sensitivity and specificity close to 100% and 10% reproducibility using reference sera. In total, 123 sera were tested by ELISA and also tested by HI test. The occurrence frequency in birds, Anseriforms, especially was 22,73% and 19,51% using HI and ELISA tests, respectively. Those two techniques had a correlation of 0.62. Therefore, our study reiterates the importance of continuing surveillance in wild birds to increase knowledge about epidemiology of AMPV -1 in Brazil.
Keywords: Paramyxovirus, wild birds, RRT-PCR.
Lista de abreviações
APMV- paramixovírus aviário
APMV-1- paramixovírus aviário sorotipo 1
APMV-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12- paramixovírus aviário sorotipo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
CCD- sistema ótico e câmera
CCZ -Centros de Controle de Zoonoses
c-ELISA- ELISA competitivo
CR-Criticamente ameaçada
DD- Deficiente em Dados
DN- Doença de Newcastle
ELISA- Ensaio de imunoabsorção enzimática
ELISA-PCR- PCR ligado ao ensaio imunoenzimático
EM- Em Perigo
EW- Extinta na Natureza
EX -Extinta
HI- Inibição da Hemaglutinação
IBAMA- Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
ICMBio- Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade
ICTV -Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
IFN- Interferon
IPIC- índice de patogenicidade intracerebral
IUCN- União Internacional para Conservação da Natureza
LC- Pouco Preocupante
Mab - anticorpos monoclonais específicos
MDA5- melanoma differentiation associated gene 5
NT- Quase Ameaçada
OIE- Organização Mundial de Saúde Animal
OP- orofaríngeo
PCR- Reação de polimerase em cadeia
PIB- Produto Interno Bruto
PNSA - Plano Nacional de Sanidade Avícola
RRT-PCR- Real Time RT-PCR
SPF - livres de patógenos especifico
STAT1- signal transducers and activators of transcription 1
VDN- Vírus da Doença de Newcastle
VDNv- Vírus da Doença de Newcastle virulento
Sumário
1. Introdução ................................................................................................................................. 19
1.1. A Doença de Newcastle .......................................................................................................... 19
1.1.1 Transmissão .......................................................................................................................... 22
1.1.2 Situação do VDN no Mundo ................................................................................................. 23
1.1.3 Situação do VDN no Brasil .................................................................................................... 24
1.2. O Vírus .................................................................................................................................... 25
1.2.1.Classificação dos APMV-1 .................................................................................................... 34
1.3. Avifauna Brasileira e Rotas de Migração ................................................................................ 39
1.3.1. Aves Ameaçadas de Extinção .............................................................................................. 42
1.3.2. Aves Sinantrópicas .............................................................................................................. 43
1.4. Avicultura Brasileira ............................................................................................................... 44
1.5. Real-Time RT PCR (RRT-PCR) .................................................................................................. 45
1.6. Sorologia ................................................................................................................................. 47
1.7. Considerações Finais .............................................................................................................. 49
2. Objetivos ................................................................................................................................... 50
2.1.Gerais ...................................................................................................................................... 50
2.2. Específicos .............................................................................................................................. 50
3. Material e Métodos ................................................................................................................... 50
3.1 Tecnica Moleculares ................................................................................................................ 50
3.1.1 Amostras Padrão .................................................................................................................. 50
3.1.2 Coleta de Amostras .............................................................................................................. 51
3. 1. 3 Purificação do RNA viral ..................................................................................................... 56
3. 1. 4 Controle Interno ................................................................................................................. 56
3. 1. 5 RRT-PCR para Detecção de APMV-1 ................................................................................... 56
3. 1. 6 RT-PCR para Sequenciamento ............................................................................................ 58
3. 1. 7 Limite de Detecção e Especificidade dos Testes ................................................................ 58
3. 1. 8 Sequenciamento dos Fragmentos Amplificados ................................................................ 58
3. 1. 9 Análise das sequências e desenho da árvore filogenética ................................................. 58
3. 2. Tecnicas Sorologicas .............................................................................................................. 59
3. 2. 1 Amostras ............................................................................................................................. 59
3. 2. 2 Teste de Inibição de Hemaglutinação (HI) ......................................................................... 60
3. 2. 3 ELISA Competitivo .............................................................................................................. 60
3. 3 Comparação entre as Técnicas ............................................................................................... 61
4. Resultados ................................................................................................................................. 61
4. 1 Controle Interno ..................................................................................................................... 61
4. 2 RRT-PCR .................................................................................................................................. 61
4. 3 RT-PCR Convencional ............................................................................................................. 63
4. 4 Detecção do Vírus nas Amostras de Aves Silvestres pelos Testes de RRT-PCR e RT-PCR
Convencionais. .............................................................................................................................. 66
4. 5 Análise Filogenética ................................................................................................................ 67
4. 6 Sorologia ................................................................................................................................. 71
4. 6.1 Teste de inibição de hemaglutinação (HI) ........................................................................... 71
4. 6. 2 ELISA ................................................................................................................................... 72
4. 7 Comparação das Técnicas ...................................................................................................... 72
5. Discussão ................................................................................................................................... 73
6. Conclusões................................................................................................................................. 78
7. Referências ................................................................................................................................ 80
Anexo 1 ............................................................................................................................................ 103
Anexo 2 ............................................................................................................................................ 107
Anexo 3 ............................................................................................................................................ 109
19
1. Introdução
1.1. A Doença de Newcastle
A doença de Newcastle (DN) é considerada uma das maiores causas de perdas
econômicas para a avicultura mundial 1. Esta doença foi descrita inicialmente em 1926 como
uma doença altamente patogênica em dois diferentes pontos geográficos do mundo,
Newcastle-on-Tyne, Inglaterra e na ilha de Java, agora parte da Indonésia2; 3.
Todavia, na literatura, há evidência de que podem ter ocorridos surtos de uma doença
muito semelhante à DN antes de 1926. Porém, como o conhecimento sobre as doenças que
afetavam aves domésticas no início do século 20 era escasso. Parece bem possível que em
um período em que as viagens, a comunicação e a natureza da produção de aves comerciais
eram muito diferentes das atuais, os surtos da DN podem ter ocorrido, mas por diagnóstico
equivocado ou problemas de comunicação não atraíram a atenção dos profissionais da área1.
A DN é uma doença viral listada no Código Zoosanitário Internacional da Organização
Internacional de Epizootias também conhecida como Organização Mundial de Saúde Animal
(OIE), sendo de notificação obrigatória imediata ao serviço veterinário oficial 4. Ela é definida
pela OIE como uma doença infecciosa das aves causada por um paramixovírus aviário
sorotipo 1 (APMV-1), que apresenta pelo menos um dos seguintes critérios de virulência:
primeiro, o vírus tem índice de patogenicidade intracerebral (IPIC) de pelo menos 0,7 em
pintos livres de patógenos específicos (SPF) de um dia de idade; ou, segundo, a presença de
múltiplos aminoácidos (aa) básicos (arginina e lisina) é demonstrada no vírus (diretamente ou
por dedução), entre os resíduos 111 e 117 do sítio de clivagem da proteína de fusão F0. Estes
critérios determinam a caracterização da doença, bem como sua endemicidade, e a
necessidade ou não de barreiras sanitárias para comércio interno e externo 5.
Essa enfermidade é considerada como sendo uma das mais devastadoras doenças
de galinhas e outras aves domésticas. As perdas causadas por surtos desta enfermidade têm
sido significativas resultando na eliminação de milhares de aves em diversos países e
restrições nas importações/exportações. Os prejuízos e danos não se limitam apenas às aves
infectadas com mortalidade do lote, mas também devido ao impacto econômico negativo
devido à restrição do comércio de animais e subprodutos com embargos de áreas e países
com focos da doença 6.
Os sinais clínicos da DN são observados em aves infectadas e podem variar desde
uma infecção assintomática à mortalidade súbita de todo o plantel avícola ou com
20
apresentação de síndrome respiratória e lesões neurológicas. Esta variação clínica depende
de fatores como: o tipo de vírus, a espécie hospedeira, a idade do hospedeiro, a ocorrência
de infecção simultânea, situações de estresse ambiental e o estado imunológico do
hospedeiro6; 7; 8.
Em termos gerais, não existem sinais patognomônicos, mas; sinais clínicos, como
depressão, diarreia, edema de cabeça, crista e barbela; sinais nervosos, como paralisia e
torcicolo; sinais respiratórios; redução do ganho de peso e da postura de ovos, podem também
ser observados 9. Essa doença também pode causar rápida morbidade, mortalidade de 70 a
100% em 2 a 3 dias e um período de incubação de 3 a 6 dias ou, em raras ocasiões, 2 a 15
dias 10.
O vírus da DN (VDN) já foi detectado em mais de 250 espécies de aves, representando
27 das 50 ordens da classe 7. As espécies mais susceptíveis a esse agente são as galinhas,
galinhas d’angola, faisões, codornas e pombos. Já aves como patos e gansos parecem ser
mais resistentes. As aves de rapina são geralmente resistentes à DN; porém há relatos de
doença aguda em abutres barbudos (Gypaetus barbatus), em pigargos (Haliaeetus albicilla),
em águia-pescadora (Pandion haliaetus) e algumas espécies de falcões de vida livre. Sabe-
se, que entre outras aves que foram afetadas por VDN, incluem: gaivotas (ordem
Charadriiformes), corujas (ordem Strigiformes) e pelicanos (ordem Pelecaniformes). E ainda,
esse vírus pode ser carreado por psitacídeos e outras aves silvestres, porém estas, não
necessariamente, apresentam qualquer sinal clínico da doença 11.
Muitos genótipos deste vírus têm sido isolados em aves aquáticas silvestres
assintomáticas, portanto, acredita-se que aves silvestres, principalmente aquáticas, sejam os
reservatórios naturais do vírus e que possuem um importante papel na disseminação da
doença para as aves domésticas12; 13, embora isso ainda não esteja completamente elucidado.
A manifestação clínica e a mortalidade variam segundo, a patogenicidade da estirpe,
ou até mesmo da amostra do vírus. Essa patogenicidade pode variar de muito alta (amostra
velogênica), intermediária (amostra mesogênica) a muito baixa (amostra lentogênica) 14.
Atualmente, essa determinação da patogenicidade pode ser realizada por testes
moleculares, como o da reação da polimerase em cadeia (PCR), sequenciamento de
nucleotídeos e dedução de aminoácidos do sítio de clivagem da proteína de fusão ou por
testes in vivo, como IPIC permite 5; 15; 16; 17.
A base molecular da patogenicidade é baseada principalmente em diferentes sequências
pela proteína precursora da proteína de fusão, a F0, que durante a replicação é clivada em
F1 e F2 para que as partículas virais da progênie se tornem infecciosas (Figura 1)18. Esta
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clivagem pós-traducional ocorre pela ação de proteases celulares dos hospedeiros19.
Diferentes estudos compararam as sequências de aminoácidos deduzidos do precursor F0
dos AMPV-1 com diferentes padrões de patogenicidade em galinhas20; 21; 22. Nestes estudos,
todos os vírus apresentaram uma arginina (R) como aminoácido do resíduo 116 da porção C-
terminal da proteína F2 no sítio de clivagem.
E os vírus lentogênicos apresentaram leucina (L) no resíduo 117 da porção N-terminal da
proteína F1 e outro aminoácido básico no resíduo 113. Assim, estes vírus com até 2 motivos
monobásicos no sítio de clivagem F0, podem ser clivados apenas por enzimas proteolíticas
extracelulares do tipo tripsina, encontrados apenas em epitélios do trato respiratório e
intestinal. Enquanto todos os vírus mesogênicos e velogênicos possuem fenilalanina (F) no
resíduo 117 e aminoácidos básicos nos resíduos 115 e 112, além dos 113 e 116. Deste modo,
estes vírus mesogênicos e velogênicos, isto é, com patogenicidade maior, possuem
aminoácidos adicionais no sítio de clivagem F0. A presença de múltiplos aminoácidos básicos
no sítio de clivagem permite com que as proteases presentes em diversos tipos celulares em
diferentes tecidos e órgãos de hospedeiros clivem as partículas virais das progênies,
resultando em infecções sistêmicas 5.
Figura 1: Bases moleculares da patogenicidade dos APMV-1. A proteína F0 é clivada em F1 e F2 após a ação das proteases celulares para a ativação da proteína de fusão. A sequência de nucleotídeos do sítio de clivagem entre os aminoácidos 111 e 117 é determinante para o reconhecimento das diferentes proteases, o que acaba sendo uma das razões determinantes para virulência.
Essa caracterização da patogenicidade das amostras pode possuir uma maior
acurácia, ao utilizar o teste do IPIC em pintos de 1 dia de idade, SPF, pois permitem
caracterizar e classificar o vírus da doença de Newcastle em 5 patotipos. Por patotipo
entende-se o grau de patogenicidade do vírus e, portanto, severidade da doença causada por
determinada estirpe do vírus 14.
Estirpes altamente patogênicas do VDN, pertencem aos patótipos denominados: 1)
viscerotrópico e velogênico ou também conhecido como “forma de Doyle”, que causa doença
22
severa e fatal, com alta mortalidade em galinhas, e os principais sintomas são apatia, diarreia
esverdeada e lesões hemorrágicas, principalmente nos intestinos; 2) neurotrópico e
velogênico ou “forma de Beach”, que provoca problemas respiratórios como espirros e
corrimento nasal ou ruído dos pulmões, inchaço da cabeça e face, prostração, sintomas
nervosos como torcicolo, paralisia das pernas e tremores musculares e finalmente ocorre
mortalidade, que pode chegar até a 100% das aves; 3) outros patótipos já menos patogênicos
são os vírus classificados como mesogênicos, ou “forma de Beaudette”, que podem causar
apenas leves sintomas respiratórios nas aves, queda de postura em poedeiras e
eventualmente podem ocorrer também sintomas nervosos, mas a mortalidade das aves é
normalmente baixa e mais comum em aves jovens; 4) lentogênicos, ou “forma de Hittchner”
são comumente usadas como estirpes vacinais e podem causar sintomas respiratórios
brandos em aves jovens, dependendo da estirpe vacinal utilizada; 5) há ainda um último tipo,
não patogênico, conhecido como entérico assintomático, que não causa sintomas ou lesões
nas aves e também tem sido utilizado como estirpe vacinal. Portanto, nem todas as estirpes
do vírus de Newcastle causam doença 14.
1.1.1 Transmissão
A transmissão entre animais ocorre de forma horizontal como resultado da inalação de
partículas ou gotículas, ou ingestão de material infeccioso excretado, como fezes. Os vírus
podem não induzir sinais respiratórios significativos, sendo assim, chamados assintomáticos,
acredita-se que esses, vírus assintomáticos, possuem como via de transmissão primária as
fezes contaminadas. A transmissão por via aérea fica evidente a partir da administração de
vacinas vivas por aerossol, sendo a infecção estabelecida pela via respiratória. E ainda
pesquisadores comprovaram experimentalmente a transmissão por meio de via aérea em
curta distância, através aerossóis de galinhas infectadas em galinhas SPF. Entretanto, ainda
há poucas evidências da transmissão aerógena entre aves infectadas e aves susceptíveis
demonstradas em campo, mesmo entre curtas distâncias 7. Pois, como é sabido a transmissão
aerógena do agente é dependente de fatores ambientais como temperatura, umidade e
densidade 23.
A existência de reservatórios e/ou disseminadores é importante para a ocorrência,
introdução e manutenção do VDN em uma população aviária. Os fatores envolvidos na
manutenção da infecção são: a) a presença de indivíduos portadores; b) a introdução de aves
susceptíveis; c) a multiplicidade de espécies aviárias em convívio contíguo, especialmente
quando estão presentes aves silvestres e domésticas, e a heterogeneidade de estirpes do
vírus 24.
23
Em suma, as principais formas de introdução e propagação do vírus em uma área livre
são: a) o movimento de aves selvagens migratórias com papel significativo na propagação do
vírus em áreas onde a enfermidade já esteja estabelecida, já que a maioria das estirpes
circulantes nessas espécies é de baixa virulência, não sendo, entretanto excluído a
possibilidade de infecção primária; b) o comércio mundial de aves de cativeiro e de caça,
pombos correios e aves domésticas mantidas para fins de recreação; c) a comercialização de
aves comerciais vivas e produtos avícolas; d) o movimento de pessoas e equipamentos; e)
alimentos avícolas e água contaminada 7.
1.1.2 Situação do VDN no Mundo
Atualmente, estirpes isoladas de VDN estão continuamente a ser relatadas em todo o
mundo (Figura 2). Recentemente, surtos do VDN foram relatados no Vietnã, Indonésia,
Malásia e Camboja 25. Em 2013, 96 surtos VDN foram relatados em aves domésticas de
Camarões, República Centro-Africano, Costa do Marfim e Nigéria 26. Em 2011, um surto de
VDN velogênico foi relatado em Israel em pequenas corujas e pinguins africanos 27. Além de
surtos de rotina, por vacinação ineficiente, que também tem sido relatado causando
aparecimento de novas estirpes do VDN 28. Só nos EUA, VDN virulentos (também chamado
de VDN exóticos) foram isolados e notificados de cormorões e gaivotas no estado de
Minnesota, Massachusetts, Maine, New Hampshire, e Maryland 29. Surtos de VDN sucessivas
foram também reportados nos continentes europeu e na China 30; 31.
Figura 2: Situação do VDN no mundo no período de Julho a Dezembro de 2013 32.
Curiosamente, um isolamento do VDN foi relatado em um conjunto de mosquitos em
Jacarta 33. E também, embora, a Austrália tenha estado livre dos surtos VDN desde 1932 a
1998, vários focos foram notificados em New South Wales entre 1998 a 2002 34. A presença
24
do VDN também foi relatada a partir de uma população de aves selvagens, incluindo patos-
reais selvagens 35 e Spilopelia chinensis 36. Ocasionalmente, o VDN foi isolado a partir de
espécies não aviárias como suínos e caprinos 37; 38.
1.1.3 Situação do VDN no Brasil
No Brasil, a história da DN iniciou-se com os primeiros surtos na região norte em
Belém-PA e Macapá-AP no ano de 1953 39, sendo que a introdução do vírus ocorreu,
provavelmente, pela importação de carcaças de frango de cortes congeladas provenientes do
Estados Unidos da América para um hotel da capital paraense 40. A partir desta data, a doença
foi observada em todo território nacional, ocasionando várias perdas econômicas para os
avicultores brasileiros 41; 42. Também ocorreram vários surtos e/ou casos da DN em aves
reprodutoras, comerciais, criadas em galinheiros domésticos e/ou aves caipiras, os quais
provocaram vários prejuízos à avicultura nacional, além de comprometimento do comércio
internacional dos produtos avícolas 43.
E essa doença tornou-se endêmica por quase 20 anos, com a ocorrência de surtos
esporádicos e isolados. No entanto, nos anos 1970, a doença ressurgiu sob a forma de um
VDN de alta patogenicidade 44. Ao longo dos próximos 20 anos, esse VDN virulento (VDNv)
foi responsável por vários surtos em diferentes regiões do Brasil, até a implementação de
medidas de controle mais rigorosas, incluindo a extensa vacinação com estirpes de VDN
atenuadas (LaSota e estirpes B1), reduzindo o número e a gravidade dos surtos DN 45.
Assim, devido a importância que a produção avícola brasileira adquiria tanto no
contexto nacional e internacional, e a necessidade de uma normatização e das ações de
acompanhamento sanitário, relacionadas ao setor avícola, principalmente em relação à
ocorrência das principais doenças de notificação obrigatória da OIE como, Newcastle,
salmoneloses, micoplasmoses, além da influenza aviária. Nosso país observando o contexto
da globalização mundial, e quanto o estabelecimento de programas de cooperação entre as
instituições públicas e privadas era necessária. Em setembro de 1994, a Portaria Ministerial
nº 193, consolidou e estruturou o Programa Nacional de Sanidade Avícola (PNSA), do
Ministério da Agricultura Pecuária e do Abastecimento4.
O objetivo desse programa é aumentar a disponibilidade, nos mercados interno e
externo, de produtos avícolas de qualidade, mediante o incentivo às empresas, por meio dos
termos de parceria, destacando-se, nestes, o controle oficial, a produtividade e as exportações
com controle sanitário pelo setor privado. As áreas das atividades avícolas a serem
abrangidas são: Parque criatório (avozeiros e matrizeiros); Incubatórios; Terminadores;
25
Abatedouros e frigoríficos; Trânsito nacional e internacional; Rede laboratorial (pública e
privada/credenciada); e Controle de insumos e imunobiológicos 46.
Assim, com a implementação do PNSA, os surtos de Newcastle caíram de 218 focos
em 1983, para 63 focos em 1994, o primeiro ano do PNSA, dessa forma os surtos foram
decaindo gradativamente com 12 focos em 1995, 6 em 1996, 3 em 2000. Com isso em 2003
a OIE reconheceu o Brasil como livre do VDN patogênica na indústria de aves 45. No entanto,
estudos sorológicos detectaram a atividade de infecção do VDN em aves selvagens em 2003
e 2006 47; 48 e aves de fundo de quintal em 2005 49 e em 2006 nos municípios de Lambari d’
Oeste-MT, Manaus-AM e Vila Real-RS 44; 50; 51; 52.
Atualmente, a estirpe APMV-1 / Frango / Brasil / SJM / 75 (SJM) do VDN é a única
estirpe disponível obtida partir dos surtos 1970 no Brasil do VNDv. Esta estirpe produz várias
lesões e alta mortalidade em galinhas infectadas experimentalmente, enquanto que em outras
espécies de aves não-galiformes a replicação e excreção ocorre sem efeitos patológicos.
Estes resultados sugerem que as aves selvagens podem ainda ser reservatórios e contribuir
para a disseminação do vírus. De fato, as estirpes de VDNv que surgiram na América do Sul
e Central na década de 1970, estavam relacionadas aos surtos na Europa e nos Estados
Unidos no mesmo período, através de aves exóticas 53; 54.
Portanto, embora seja plausível que um surto epidêmico de VDN seja pouco provável
de ocorrer no Brasil a curto prazo, a ameaça de a médio e longo prazo não deve ser
subestimada 55. Por isso, se exige não só vigilância epidemiológica constante, mas também
esforços para aumentar a compreensão atual sobre as relações das estirpes do VDN
relevantes para o Brasil e as outras estirpes circulantes em todo mundo.
1.2. O Vírus
Os vírus que infectam animais selvagens têm se tornado cada vez mais importantes
em todo o mundo. E nas últimas décadas causaram um substancial impacto, na saúde
humana, na produção agrícola e nas economias com base em conservação da vida selvagem 56. As aves selvagens têm um importante papel na difusão de orthomyxovirus e
paramyxovirus, que podem ter causado doenças em humanos e animais durante séculos 9; 57.
Os Paramixovírus aviários (APMV) pertencem ao gênero Avulavirus, subfamília
Paramyxovirinae, família Paramyxoviridae, ordem Mononegavirales. Atualmente há doze
tipos de APMV descritos, apesar de, ainda constar na nomenclatura mais atual do ICTV
(Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus), apenas, os tipos do APMV-1 ao APMV-9, pois
os últimos três, APMV-10 ao APMV-12, foram descritos mais recentemente 58; 59; 60.
26
APMV-1 é o sorotipo mais bem caracterizado, devido à sua importância econômica e
os efeitos causados pelo VDN. Assim, suas sequências genômicas completas foram
determinadas para um grande número de estirpes, e há uma grande quantidade de
informação disponível sobre sua biologia molecular e patogênese. Contudo, em contraste,
pouco se é sabido sobre os outros, demais sorotipos de APMV61.
Como um primeiro passo para a sua caracterização, sequências genômicas completas
de APMV-2 a -9 foram determinados 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69. No entanto, as suas características
biológicas e patogenicidade permanecem mal compreendidas. APMV-2 tem sido associada
com doença respiratória leve e queda na produção de ovos, e infertilidade em perus; o APMV-
3 tem sido associada a encefalite e alta mortalidade em pássaros de estimação, doenças
respiratórias em perus e crescimento atrofiado em frangos jovens 70; 71. Já, os APMV-4, foram
isoladas de frangos, patos e gansos 71. E a infecção experimental de galinhas com APMV-4
resultou em pneumonia intersticial leve e traqueíte catarral 70.
APMV-5 são responsáveis pela doença nos Periquitos-australianos (Melopsittacus
undulatus), causando depressão, dispneia, diarreia, torcicolo, e até enterite aguda fatal em
periquitos imaturos, conduzindo a mortalidade muito elevada 72. Os APMV-6 foram isolados
pela primeira vez a partir de um pato doméstico, e são responsáveis por causar infecção
respiratória leve e queda na produção de ovos em perus, mas é avirulento em frangos 9; 70; 73.
APMV-7 foi isolado pela primeira vez a partir de uma pomba morta em caçadas, e estes vírus
também têm sido isolados em surtos naturais de doenças respiratórias em perus. Infecções
de APMV-7 em perus causam doenças respiratórias, aerossaculite multifocal linfocítica
nodular leve, e diminuição na produção de ovos 74.
Os APMV-8 foram isolados a partir de um ganso e de uma marreca-arrebio selvagem 75. Já, os APMV-9 foram isolados a partir de patos em todo o mundo 76. Os tipos de APMV -
2, -3 e -7 têm sido associados a doenças referentes a produção de ovos e com problemas
respiratórios leves em galinhas domésticas 74. Não há relatos de isolamento de APMV-5, -8 e
-9 em aves domésticas 9. No entanto, um inquérito sorológico de granjas avícolas comerciais,
nos EUA, indicou a possível prevalência de todos os sorotipos de APMV exceto o APMV-5
em frangos 77.
E os subtipos mais recentes, APMV -10, -11, -12 foram detectados em diferentes
estudos. Dessa maneira, um vírus isolado de pinguins rockhopper (Eudyptes chrysocome)
demonstrou ser um paramixovírus que possuía antígenos e genes distinto dos outros nove
grupos representantes e assim APMV/penguin/Falkland Islands/324/2007 e foi considerado
para representar o protótipo de um novo tipo, APMV-10 78. Em um estudo o grupo Briand et
al. 59 ao avaliar um isolado obtido a partir de uma narceja (Gallinago gallinago), concluíram
27
que o vírus era um paramixovírus, geneticamente distinto dos representantes de APMV-1 ao
APMV-10, sendo assim o isolado APMV/common snipe/France/100212/2010 foi sugerido
como protótipo do grupo APMV-11. E como parte de um programa de vigilância para detectar
a presença de vírus da gripe aviária, em amostra de suabe cloacal de uma Marreca piadeira
(Anas penelope) capturada em novembro de 2005, na província de de Rovigo no Norte da
Itália, a partir da qual um vírus AMPV foi isolado, o qual se apresentou sorológico e
geneticamente diferentes dos demais AMPVs, e portanto APMV/ wigeon/It/3920-1/2005 foi
considerado um novo grupo, o AMPV-12 60.
Entre os APMVs, os Paramixovírus aviário do tipo 1 (APMV-1) contêm os vírus
responsáveis por causar a doença de Newcastle, sendo que o nome de vírus da doença de
Newcastle (VDN) é reservado exclusivamente para estirpes de APMV-1 patogênicas que
resultam na infecção e doença para aves domésticas 4; 79.
Os APMV-1 são caracterizados por apresentar um genoma de RNA fita simples de
polaridade negativa com o tamanho aproximado de 15 000 nucleotídeos. O genoma destes
vírus codifica 6 genes na ordem de 3’-NP-P-M-F-HN-L-5’ que produzem 6 proteínas principais:
nucleoproteína, fosfoproteína, matriz, fusão, hemaglutinina-neuraminidase e polimerase,
respectivamente 18. Devido à ocorrência de leituras alternativas no gene da proteína P, esse
gene pode ser codificado em mais duas proteínas, V e W. Assim, ao sofrer edição em seu
RNA mensageiro (RNAm), esse gene pode codificar estas duas outras proteínas que
possuem funções similares à proteína P 80. Estes vírus apresentam também envelopes
derivados das células hospedeiras com projeções de dois tamanhos diferentes: a maior
projeção é formada pela glicoproteína HN e está associada à atividade de hemaglutinação e
neuraminidase; e a espícula menor, formada pela glicoproteína F (Figura 3), associada à fusão
do envelope viral com a membrana celular da célula hospedeira 78; 81; 82.
Figura 3: A ) Representação de vírion da doença de Newcastle. B) Representação do genoma de um VDN 83.
A
B
28
Nucleoproteína é a proteína mais abundante presente na partícula viral. Na
microfotografia electrônica, ele parece possuir uma estrutura semelhante a uma espinha de
peixe. Ela constitui o cerne da estrutura helicoidal da nucleocapsídeo do vírus, juntamente
com o RNA genômico. O RNA genômico em associação com as proteínas N, P e L formam o
complexo ribonucleoproteíco (RNP), que atua como um molde para a síntese de RNA. Esta
proteína possui o tamanho de 489 aminoácidos (aa) e 55 kDa de peso molecular. Ela reveste
todo o comprimento genômico, tanto no sentido negativo (RNA genômico), quanto no positivo
(RNA mensageiro), de modo a protegê-los contra nucleases 84. Sua região amino-terminal é
responsável pela sua interação com o RNA viral, juntamente a necessidade para a formação
da estrutura semelhante a espinha de peixe 85 e tem sido observado que os primeiros
aminoácidos, amino-terminais, da proteína N do VDN formam um complexo proteico solúvel
com a proteína P. A região carboxi-terminal, por outro lado, não é necessária para a
montagem do nucleocapsídeo, mas presumivelmente desempenha um papel regulatório na
sua polimerização 86. Proteínas N recombinantes do VDN expressas em baculovírus,
apresentam o padrão de estruturas semelhantes a espinha de peixe, a qual assemelha-se a
um nucleocapsídeo típico85.
A proteína P do VDN consiste em 395 aa e apresenta múltiplas bandas de peso
molecular variando de 50 a 55 kDa ,em géis SDS-PAGE, devido a diferentes formas
fosforiladas 84. A fosfoproteína de VDN é fosforilada, especificamente, em resíduos de serina
e treonina, e funciona como um homo-oligômero. Essa proteína tem um papel crucial na
replicação e na transcrição viral. Além de auxiliar a estabilizar a proteína L, no complexo P-L,
o qual, funciona como uma RNA-polimerase dependente de RNA viral 87. O complexo P-L
realiza a replicação genômica, assim, sintetizando uma fita de polaridade positiva de RNA que
é usada como um modelo para sintetizar uma fita de RNA polaridade negativa 84. Um
tetrâmero de fosfoproteína medeia a interação entre a proteína L e o complexo N-RNA
modelo, o qual atua como uma chaperona, a fim, de prevenir a encapsidação de RNA
aleatório, não-viral, pela proteína N. Além disso, a proteína P forma um complexo com a
proteína N que regula a mudança da transcrição para a replicação. Ambas as regiões, amino
e carboxi-terminais, da proteína P são necessários para as interações P-N. Diferentes
domínios das proteínas P, realizam diferentes funções do complexo P-N, enquanto interagem
com a proteína N durante a replicação do vírus. Os seus resíduos carboxi-terminais (247-291)
participam em interação P-P e P-N 88. Também tem sido observado que a proteína P tem um
papel importante na virulência, o qual depende do tipo de célula infectada e a estirpe do
VDN84.
Desta maneira, a inserção de um resíduo G na ORF da proteína P, sequência
consenso "394AAAAGGG401", durante a edição da sequência de RNA, transcreve uma
29
proteína V (Figura 4). A proteína V modula a replicação do RNA viral pela interação com a
proteína N 89 e tem um peso molecular de 36 kDa e o tamanho de 239aa 90. Ela é um fator de
virulência das estirpes de VDN 91. O domínio carboxi-terminal desta proteína inibe o IFN alpha
/ beta (IFN -α /β), que é importante para a virulência da estirpe. A replicação do VDN bem
sucedida, requer fuga da cascata pró-apoptótica, a fim de realizar a produção de vírus
eficientes e propagação da progênie viral. Enquanto, a proteína V do VDN foi observada
inibindo a resposta do IFN (Interferon) do hospedeiro de duas maneiras. Ela inibe a sinalização
do IFN por direcionamento para STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) e
sua degradação pelo domínio carboxi-terminal. Alternativamente, o domínio carboxi-terminal
da proteína V do VDN interage com a MDA5 (melanoma differentiation associated gene 5) e
inibe a resposta do IFN β 91. Ocasionalmente, a inserção de dois resíduos G no local da edição
de RNA no gene P codifica um RNAm W. Embora RNAms foram detectadas nas células
infectadas por VDN, a proteína W do VDN numa célula infectada nunca foi reportado. Por
conseguinte, o papel da proteína W no ciclo de replicação do VDN ainda não foi estabelecido.
As proteínas V e W são semelhantes a proteína P para suas extremidades amino-terminais,
enquanto que diferem nas suas carboxi-terminais.
Figura 4: Fenômeno da edição de RNA do vírus da doença de Newcastle. A incorporação de um único ou dois resíduos Guanina no local da edição de RNA pode dar origem as proteínas V ou W, respectivamente.87 modificado por Scagion, G.P. 2014.
Sendo a maior proteína do genoma do VDN, a proteína L, consiste em 2204 aa com
um peso molecular de 250 kDa 90. A proteína L sintetiza o RNAm viral e auxilia na replicação
genômica do RNA. É o último gene a ser transcrito, durante o ciclo de replicação viral. Além
disso, a proteína L também executa formação do cap 5´, metilação e atividade poli A da
polimerase sobre o RNAm recém-formado 84; 90. A proteína L e P em conjunto formam a
polimerase viral ativa. O complexo da nucleoproteína helicoidal vinculado pela proteína N age
30
como um modelo que é reconhecido pelo complexo L-P para formar o complexo polimerase
viral ativo. Seis resíduos de aminoácidos extremamente conservados QGDNQ estão
presentes no domínio III realizando a atividade de transcrição e são responsáveis pela sua
atividade de polimerase 90. Tem sido relatado que a proteína L modula a virulência da estirpe
de VDN sugerindo o seu importante papel na virulência do vírus, presumivelmente pelo
aumento da taxa de síntese de RNA viral durante a replicação 92.
A proteína da Matriz possui cerca de 40 kDa e é constituída por 364 aa. É uma proteína
básica com uma região que interage com ácidos nucleicos virais (17 pb de comprimento), que
inclui nove aminoácidos básicos 93. A carga líquida positiva auxilia a proteína M com sua
associação a proteína N durante a montagem viral. A proteína M é de natureza hidrofóbica,
sem membrana abrangendo os peptídeos e está presente entre a membrana lipídica e o
nucleocápsideo. Há poucas funções propostas para a proteína M; porém é discrito que ela
controla a síntese de RNA viral, principalmente, e que em segundo lugar ela interage com a
actina, e, finalmente, que ajuda na montagem do vírion na membrana da célula hospedeira 94.
A proteína M é altamente conservado entre os paramixovírus, o que é evidente pela
presença de poucas substituições de base não sinônimas seguido por mutações na
população. Estas descobertas podem ser utilizadas como base para classificar diferentes
estirpes do VDN e isoladas a partir de diferentes localizações geográficas 95. Também tem
sido sugerido que a proteína M pode ser responsável pela manutenção da forma do
nucleocapsídeo 96. Além disso, a proteína M ajuda no processo de brotamento do vírus por
interagir com a membrana plasmática da célula hospedeira. A proteína M tem as suas próprias
sequências de localização nuclear e, por conseguinte, não necessita de outras proteínas do
VDN para executar a função de localização. Também, foi notado que a proteína M é
criticamente importante para a montagem viral, quando mutantes sensíveis à temperatura
falharam ao produzir o nível exigido de M sob temperaturas sub-ótimas 94.
A glicoproteína HN é uma proteína de superfície com peso molecular de 74 kDa. É
uma proteína de membrana integral do tipo II, que consiste em uma sequência sinal não
clivada, perto de sua extremidade amino-terminal 97. A HN está presente como um
homotetrâmero com ligação por dímeros de dissulfeto, dentro das células infectadas por vírus.
O domínio exterior da proteína HN consiste de uma haste longa suportando uma cabeça
globular terminal. Estudos anteriores, indicam que HN é uma proteína multifuncional,
envolvida em funções tais como, o reconhecimento do receptor da célula hospedeira, a
remoção de receptores, para evitar automontagem, e a interação com a proteína F para
promover a fusão viral. Tanto o reconhecimento do receptor e a propriedade de neuraminidase
da HN encontram-se na cabeça globular, que é altamente conservada. A estrutura da proteína
31
HN revela a presença de um motivo de hélice beta, com a capacidade de reconhecimento do
receptor e a atividade da neuraminidase situada em um monómero do domínio da cabeça
globular. Um segundo sitio de ligação de ácido siálico, na parte superior da sua cabeça
globular estende-se na extremidade distal da membrana de interface do dímero e é orientada
para a membrana do hospedeiro alvo 98. Além disso, a região da cabeça globular é também
sugerida ser os sítios de ligação dos anticorpos 99. A proteína HN, também, é responsável
pela fusão de membrana específica dos vírus. E a co-expressão e interação entre proteínas
homologas HN e a proteína F são importantes para a fusão dos vírus. Experimentalmente são
propostos dois modelos para a interação HN-F.O modelo antigo previa que a ligação de HN
com o receptor da célula desencadeava sua interação com a proteína F, levando a mudanças
conformacionais na F para a fusão 90; 100. Outro modelo, mais atual, propôs que F e HN formam
um complexo metaestável antes da fixação de HN. Ocorrendo a transição de HN da forma
complexada para forma catalítica que libera a proteína F a qual sofre uma mudança de
conformação para iniciar a fusão. Tem sido sugerido que o domínio da haste da proteína HN
confere especificidade para a fusão 101 e que a interação HN-F é mediada por resíduos na
região do ectodomínio da haste de HN, que se ligam ao domínio F complementar 102; 103.
A proteína HN do VDN contém 14 resíduos de cisteína entre, as quais, 12 resíduos
são conservados e formam ligações intramoleculares de dissulfeto. A cisteína na posição 123
é responsável pela ligação covalente entre as proteínas HN e é importante para a sua
integridade estrutural 104; 105. A cauda citoplasmática possui 26 aminoácidos conservados que
interagem com a proteína M, análises mutacionais de proteínas HN do VDN sugerem, que
apenas, os primeiros dois aminoácidos podem ser removidos enquanto qualquer outra
mutação afetaria sua viabilidade. A proteína HN determina também o tropismo do VDN; no
entanto, o tamanho da proteína HN não parece afetar o seu tropismo para região entérica do
organismo 106. Há proteínas HN do VDN de diferentes tamanhos na natureza, devido à
diferença na posição do códon de parada. A HN mais curta possui 571 aa e está presente em
estirpes velogênicas e as mais longas de 616 aminoácidos são encontradas em estirpes
lentogênicas 107. O tamanho e a sequência carboxi-terminal foram marcados e estudados em
proteínas HN para avaliar a influencia em sua função, mas o seu papel na virulência do VDN
não foi, ainda, claramente entendido 87.
A proteína de fusão (F) também é uma glicoproteína de superfície presente no
envelope do VDN e medeia a fusão da partícula viral com a membrana celular do hospedeiro.
Supõem-se que a proteína F tem um papel importante na virulência das estirpes do VDN 108;
109. Sendo como já visto, a proteína HN conhecida por auxiliar F em sua função 110. A proteína
F é sintetizada como um precursor inativo F0, que é clivada por uma protease celular na forma
de subunidades ativas, que são as proteínas F1 e F2. Sendo processadas na região trans do
32
complexo de Golgi dentro das células de mamíferos que formam uma ligação dissulfeto na
forma ativa de F1-F2. A especificidade de clivagem é determinada pela sequência de
aminoácidos presente no sítio de clivagem e varia com o tipo de estirpe viral 20; 111. A proteína
F não necessita de pH ácido para a sua clivagem e ativação. A proteína F funde-se com a
célula em pH neutro levando a uma condição multinucleada (formação de sincícios), que tem
como consequências, necrose do tecido e propagação viral. Estirpes de baixa virulência de
VDN, lentogênica, apresentaram leucina (L) no resíduo 117 da porção N-terminal da proteína
F1 e outro aminoácido básico no resíduo 113, assim estes vírus que contem resíduos de
aminoácidos mono ou dibásico no seu sítio de clivagem da proteína F e a presença de um ou
dois aminoácidos básicos torna as proteínas F insensíveis às proteases intracelulares e
dependente de proteases extracelulares do tipo tripsina, para serem clivadas, tornando o seu
tropismo limitado a trato respiratório e intestinal onde está enzima se encontra. Para vírus
velogênicos e mesogênicos, ou seja, as estirpes mais virulentas, aminoácidos polibásicos são
os sítios de reconhecimento preferidos para proteases do tipo furina, que estão presentes na
maioria das células 20; 111.
A clivagem da proteína F em uma vasta gama de tecidos é responsável pela
disseminação sistémica do VDN e também por sua alta virulência. Tem-se observado que as
proteínas F de estirpes do VDN virulentas contem lisina (K) e arginina (R) no seu local de
clivagem (112R-RQR / K-R116), e uma fenilalanina na posição 117 da F1. Este local é
reconhecido por proteases intracelulares, furinas que cortam no sítio de clivagem polibásico
formando subunidade F1 que é sugerida como sendo o membro que contribui para os efeitos
neurológicos 19; 111; 112. Também tem sido observado que a presença de arginina na posição
113, 115, e 116 no sitio da clivagem origina variações no corte intracelular da proteína F do
VDN virulento 113. A glutamina está presente na posição 114 que é um aminoácido neutro e
os estudos têm mostrado que a substituição por um resíduo de aminoácido básico ou ácido
nesta posição diminuem a virulência da estirpe do VDN 113. Sugeriu-se então que um
aminoácido neutro, juntamente com aminoácidos básicos no sítio de clivagem é necessário
para a ligação adequada da protease furina e a realização da clivagem por enzima da célula
hospedeira 19. Além disso, as subtilisinas semelhantes a proteases de mamífero também são
candidatas para a clivagem da proteína F, por exemplo, PC6 e PACE4 114.
A replicação dos VDN ocorre quando estes primeiramente infectam o epitélio
respiratório. A adesão da partícula viral à célula hospedeira se dá por intermédio de suas
proteínas de superfície HN, que é uma proteína multifuncional e um dos principais
determinantes antigênicos dos paramixovírus. Além do mais a infecção pode também ocorrer
por endocitose mediada por receptores e, por vezes, através de endocitose dependente de
caveolas 115. A proteína HN é o responsável pela adsorção do vírus junto as moléculas de
33
ácido siálico contidas na superfície celular e por sua clivagem (atividade de neuraminidase),
analogamente ao papel das proteínas (NA) do vírus da influenza, para prevenir a auto-
montagem das partículas virais durante o brotamento da membrana citoplasmática. Além
disso, HN possui atividade promotora na proteína F 90.
A penetração do vírus ocorre devido a fusão do envelope viral e a membrana
plasmática celular, em pH neutro, causada pela proteína F. Como consequência o
nucleocapsídeo é liberado no citoplasma celular, ocorrendo o desnudamento após a entrada.
No citoplasma da célula hospedeira, o genoma de RNA polaridade negativa transcreve RNAm
polaridade positiva que, em seguida é traduzido em proteínas virais. O início da transcrição
se dá na extremidade 3’ da fita líder e sintetiza o RNAm dos genes individualmente do códon
de início até códon de parada de cada gene. Devido ao reinício da transcrição em cada gene,
e variação nas sequências promotoras a produção de RNAm não é uniforme, o que leva a um
gradiente na população destes ácidos nucleicos que diminui de acordo com a distância a partir
da extremidade 3’ do genoma viral (Figura 5). As proteínas N, P e L são essenciais para
formação do nucleocapsídeo 90.
E como em todo vírus de RNA genômico de polaridade negativa, este ácido nucleico
serve a duas funções, sendo a primeiro substrato para produção RNAms, que já foi descrita
no parágrafo a cima, e a segunda é a síntese de fita positiva antigenômica. O RNA de sentido
positivo depois é utilizado como um molde para a síntese de RNA genômico de sentido
negativo. A montagem e brotamento das partículas de VDN maduras dependem das proteínas
M e dos microdomínios lipídicos (lipid rafts) produzidos através da membrana celular (Figura
5)90.
A capacidade de infecção do VDN é dependente do sitio de clivagem do precursor da
proteína F (F0) a subunidades F1-F2. A ativação proteolítica da F0 envolve a ação sequencial
de duas enzimas e uma protease que cliva o lado carboxílico de um resíduo de arginina, e
uma carboxipeptidase que remove os resíduos básicos. Desta forma a sequência de
aminoácido do sitio de clivagem da proteína F é portanto postulado como o determinante
primário da infecção 109; 113; 116. A proteína HN com atividades de reconhecimento de
receptores e neuraminidase do vírus contribui para a virulência da estirpe do VDN 117; 118.
Assim sugere-se que as proteínas F e HN do VDN são determinantes de virulência em galinha
e macrófagos infectados 119; 120.
Outro fato interessante quanto a capacidade de infecção do VDN é que ele também
pode ser patogênico para os seres humanos e pode causar conjuntivite se exposto aos olhos 121. E essa capacidade de infectar células humanas, bem como o fato da replicação viral
ocorrer inteiramente no citoplasma 90. Faz com que o NDV surja como um importante vírus na
área de pesquisa de tratamentos para o câncer no final do século 20, por seu potencial
34
oncolítico 122; 123. Cassel e Garrett observaram pela primeira vez o efeito oncolítico de NDV em
1965, e desde então o NDV tem sido amplamente utilizado como um agente oncolítico tanto
nos estudos pré-clínicos e clínicos 124; 125.
Figura 5: Representação esquemática da replicação do vírus da doença de Newcastle. Entrada do vírus para o sistema das células hospedeiras é mediad pela interação de glicoproteínas (F, HN) de superfície de ligação viral que ligam-se a receptores na superfície celular que contêm ácido siálico, tais como gangliósidios e N-glicoproteínas, resultando na fusão do vírus junto as células hospedeiras. O nucleocapsídeo do vírus é então empurrado para dentro do citoplasma do hospedeiro onde o RNA viral de sentido negativo é transcrito para produzir os RNAms estruturais, com a ajuda da RNA polimerase dependente de RNA viral de um modo gradiente. As respectivas proteínas são traduzidas e conformacionadas usando a maquinaria da célula hospedeira. Uma vez que um limiar de RNAm do gene N é atingido, o RNA genômico de polaridade negativa é convertido em polaridade positiva modelo anti-genômico para a síntese de novos genomas. Estes RNA de polaridade negativas recém-formados (RNA genômico) são então enrolados em proteínas N, P e L para formar o nucleocapsídeo que é montado com a matriz de glicoproteínas de superfície e liberado da célula hospedeira 87, modificado por Scagion, G.P. 2014.
1.2.1.Classificação dos APMV-1
Apesar dos APMV-1 estarem distribuídos em todo o mundo e já terem sido detectados
em mais de 250 espécies de aves 82, sua classificação ainda não possui consenso. Apesar
de todos os VDNs serem classificados dentro de um único sorotipo (AMPV-1) , há uma grande
diversidade antigênica e genética entre as suas estirpes 53. Assim, alguns autores usam a
classificação do grupo de Lomniczi e Ballagi-Pordany 54; 126 com base em “genótipos” enquanto
outros usam o de “linhagem” classificação de Aldous et al 127. Ambos englobam conjuntos de
isolados distintos, mas baseiam-se na mesma informação genômica 128.
O primeiro sistema que classificou os VDN possuía seis linhagens com 13 sub-
linhagens 129, e três sublinhagens foram adicionadas mais tarde 130. No segundo sistema, o
35
APMV-1 é separado em dois subtipos, denominados de classe I e classe II, com base na
relação genética entre vírus. Uma das principais carcterísticas utilizadas na classificação dos
APMV-1 é o tamanho genômico, que pode ser dividido em três grupos atualmente; 15186,
15192 e 15198 nucleotídeos131. AMPV-1 eram separados, em vírus de classe I, os quais
possuem o maior genoma, 15198. Estes, são geralmente avirulentos em Gallus gallus exceto
por uma estirpe virulenta, vG90IE CHK; número de acesso AY972102, a qual foi
historicamente recuperada de aves aquáticas e limícolas, que estão distribuídas por todo o
mundo, em aves de vida livre 129.
Enquanto, os vírus de classe II são divididos em “primitivos”, que emergiram entre
1930 a 1960, possuindo um genoma de 15186 nucleotídeos, os vírus considerados “tardios”
surgiram após 1960, com 15192 nucleotídeos131. Já os vírus de classe II, genótipo II, incluem
os vírus de baixa virulência que são utilizados como vírus de vacinas em todo o mundo, tais
como LaSota, B1 e VG/GA132.
Assim, com base na classificação em genótipo 54; 129, o genótipo I continha estirpes
principalmente não virulentas. Enquanto os genótipos II, III e IV foram considerados
envolvidos na primeira panzootia que começou em 1920 e desapareceu por volta de 1950.
Os genótipos V, VI, e VIII foram responsáveis pela segunda panzootia entre os anos 1960 e
1970. Sub-genótipos VIb,VIc, e VId causou o terceira panzootia que emergiu de pombos
durante os anos 1980, e sub-genótipos VIIa, VIIb, VII c, e VIId apareceu na década de 1980
e 1990 no Extremo Oriente, Europa e África do Sul 132; 133. O genótipo VII tem sido o genótipo
predominante em circulação em todo o mundo, particularmente na Ásia e na África, e foi
relatado recentemente na América do Sul 134; 135; 136. Isolados sul-africanos, europeus,
americanos e asiáticos foram previamente tipificados como genótipos VIb, VIIb, e VIII 54; 134;
135; 137; 138.
Em Uganda, isolados de um genótipo indeterminado, mas próximo ao genótipo VI
também foram isolados 139. Em muitas regiões da África, a DN é considerada endêmica, mas
poucos dados estão disponíveis dos vírus isolados circulantes lá. Na África Ocidental, novos
sub-genótipos VIIf, VIIg, e VIIh foram recentemente descritos 130; 140. E ainda, com base em
análises filogenéticas de um sequenciamento parcial do gene F, de isolados do VDN
recuperados a partir aves domesticas em Mali, aparentemente saudáveis, em 2007 e 2008,
foi previamente proposto um novo sub-genótipo, VIIi141. Recentemente, em estudos realizados
com amostras de surtos advindos da Indonésia, Paquistão e Israel o novo sub-genótipo VIIi
foi detectado 142. Em Madagascar, outras estirpes foram isoladas e sequenciadas, e atribuída
a um novo genótipo, genótipo XI 141; 143.
Porém, ao utilizar distâncias evolutivas, Miller et al 53, mostraram inconsistências entre
as duas nomenclaturas, por exemplo a linhagem 3 não é monofilética e contém genótipos III,
36
IV, V e VIII. As discrepâncias detalhadas entre as duas nomenclaturas podem ser encontradas
na Tabela 1 128.
Dessa maneira, recentemente, um método mais racional de classificação dos
genótipos foi proposto por Diel et al. com base em médias das distâncias evolutivas
interpopulacionais da proteína F completa com valores de corte para atribuir novos genótipos
(> 10% significativo evolutiva interpopulacional distância) e novos sub-genótipos (3 a 10%
média distância evolutiva interpopulacional) 144. Embora ambos sistemas concordem com os
vírus de classe I como uma única linhagem, a classe II sob a classificação de Diel et al.
contem 15 grupos genéticos incluindo 10 previamente estabelecido (I-IX e XI) e cinco novos
genótipos (X, XII, XIII, XIV e XV) 144. Espera-se que este novo sistema de nomenclatura
unificada seja um sistema de classificação mais clara e uniforme dos isolados do VDN e facilite
o entendimento comum da epidemiologia, evolução, controle de doenças e diagnóstico deste
vírus. A desvantagem é que ele requer a obtenção das sequências completas do gene F.
Dessa maneira, as classificações de genótipos com base em outros genes do APMV-
1 ainda concorrem com o agrupamento básico para as classes I e II, como a classe II dos
vírus compreendem a grande maioria do material sequenciado do VDN. Isto inclui a maioria
dos vírus isolados e recuperados de aves domésticas (galináceos), de aves de estimação e
das selvagens 145. Os estudos filogenéticos tanto do gene das proteínas F quanto da
hemaglutinina-neuraminidase (HN) do VDN foram usados para a maioria das análises
epidemiológica moleculares e caracterização da estirpe dos VDNs em estirpes específicas 146.
Mesmo antes da proposta de Diel el al. 144, a classificação pelo mapeamento do sítio de
restrição da enzima do gene da proteína F e análise das sequências foram também utilizados
para qualificar os isolados do VDN em sete genótipos e esta foi a base para a identificação
de um novo genótipo de isolados do VDN em Uganda relatado em 2004 139. Diferentes estirpes
foram descritas em muitas partes da África baseando-se no sitio de clivagem da proteína de
fusão 127 e alguns estão a começar a usar o sistema descrito por Diel et al., 144; 147; 148. Assim
Snoeck et al., terminou recentemente a classificação sob os mesmos critérios utilizados por
Diel et al. 144 e demonstrou e estabeleceu que a classe II dos VDNs possuem 17 genótipos
(nomeados I ao XVIII, mas sem o genótipo XV) que circulam juntamente em todo o mundo147.
Portanto, atualmente, os AMPV-1 são divididos em duas classes I e II, sendo classe I
possuindo 9 genótipos e classe II com XVII. Os VDNs de classe I apresentam um genoma
com o tamanho 15.198-nt e são ocasionalmente isolados de aves aquáticas selvagens e aves
domésticas e todos com exceção de um deles são não virulentos. Enquanto a classe II os
vírus incluem estirpes mais virulenta e algumas não virulentas de VDN: sendo os vírus com
genótipos I-IV são linhagem iniciais ou seja de antes de 1960 com o genoma de tamanho de
37
15.186-nt; porem ao considerar os genótipos V-VIII mais recentes, estirpes depois de 1960,
com o tamanho do genoma de 15192-nt 117; 131; 145; 149; 150.
Desse modo, como pode-se ver novos genótipos são constantemente identificados,
normalmente provenientes de epizootias globais e pelas mudanças observadas nas
sequências genômicas dos vírus, implicando que genótipos de baixa e alta virulência estão
evoluindo simultaneamente em diferentes localizações geográficas 53. Contudo o
conhecimento sobre as relações evolucionárias das linhagens virais de APMV-1 presentes
em diferentes reservatórios e entre os fenótipos, velogênicos e lentogênicos é extremamente
limitado. Sabendo-se que aparentemente há dois grandes sistemas de hospedeiros
existentes na natureza:o primeiro, as espécies de aves selvagens aquáticas principalmente
para as estirpes não virulentas; e o segundo, as galinhas, hospedeiras dos VDNs virulentos 24; 151. Dessa maneira, mostra-se a necessidade de continuar os estudos com os AMPV-1 que
continuam a evoluir pelo mundo.
38
Tabela 1: Correpondencia entre Antiga Nomenclatura proposta por Aldous et al. ou Lomniczi et al. 126 completada por Kwon et al 152 e a nova nomenclatura proposta para todos os genótipos baseadas nos resultados de Almeida et al. 128 Diel et al.144 and Courtney et al. 153.
Antiga Nomenclatura (Lomniczi, Kwon)
Antiga Nomenclatura (Aldous)
Nomenclatura proposta
- Linhagem 6 Class 1 Genótipo I Linhagem 1 Genótipo Ia
Genótipo I Linhagem 1 Genótipo Ib
Genótipo I Linhagem 1 Genótipo Ic
Genótipo I Linhagem 1 Genótipo Id
Genótipo II Linhagem 2 Genótipo II Genótipo II Genótipo III Linhagem 3a Genótipo III Genótipo IV Linhagem 3b Genótipo Iva Genótipo IV Linhagem 3b Genótipo IV Genótipo V Linhagem 3c Genótipo Va Linhagem 3c Genótipo Vb NA Linhagem 4a Genótipo Via Genótipo VIb Linhagem 4b Genótipo VIb Genótipo Vic Linhagem 4c Genótipo Vic Genótipo Vie Linhagem 4b Genótipo Vie Genótipo VIf NA Genótipo Vic NA NA Genótipo VIf Genótipo VII Linhagem 5e Genótipo VII Genótipo VII Linhagem 5c Genótipo VII NA Linhagem 5d Genótipo VIId NA Linhagem 5d Genótipo VIIe NA Linhagem 5e Genótipo VIIf NA Linhagem 3d Genótipo VIII NA Linhagem 3a Genótipo IX NA Linhagem 2 Genótipo X NA NA Genótipo XI NA Linhagem 5b Genótipo XII NA Linhagem 5b Genótipo XIII NA Linhagem 5g*** or 7b* Genótipo XIVa** NA Linhagem 7a* Genótipo XIVb NA Linhagem 5f*** or 7d* Genótipo XIVc
* Proposto por Catolli et al. 140 ** Proposto anteriormente por Almeida e colaboradores subgenótipo VIIi 141 *** Proposto por Snoeck et al. 130 NA: não aplicável Observação: Os genótipo XV e subgenótipo VIIg propostos por Diel et al.144, não foram confirmados por de Almeida et al.128, dessa forma estes táxons que incluem apenas estirpes recombinantes, não constam na tabela.
39
1.3. Avifauna Brasileira e Rotas de Migração
O Brasil possui uma das mais diversas avifauna do mundo, contendo 1901 espécies
que abrangem 33 ordens e 103 famílias 154. Esse número de espécies corresponde a
aproximadamente 18% de toda a riqueza de aves mundial. Um grande número das espécies
que ocorrem em nosso território são compartilhadas com outros países, mas entre 10 e 15%
delas são endêmicas ao país, ou seja, não são encontradas em nenhum outro lugar do mundo 155.
Um dos motivos da grande diversidade das aves no Brasil é a variedade de ambientes
existentes no país. Uma grande parte das duas maiores regiões de floresta tropical da América
do Sul (Amazônia e Mata Atlântica) são encontradas no Brasil, além, da maior região de
savana (Cerrado), uma das maiores planícies alagáveis (Pantanal), uma das maiores área de
florestas secas (Caatinga), os maiores e mais preservados mangues das Américas e um
ambiente marinho muito diversificado, com ilhas oceânicas e recifes de corais 155.
Toda essa variedade de biomas permite ao país abrigar aves de outras regiões do
mundo inclusive do norte do continente americano. As aves chamadas de migratórias são
definidas pela realização do fenômeno de migração. Segundo IBAMA/CEMAVE, migração é
o termo que determina os deslocamentos realizados anualmente, repetidamente, de forma
sazonal, por determinada população animal, que se desloca de um ponto A (área de
reprodução) para um ponto B (áreas de alimentação, descanso, etc), em uma determinada
época do ano, retornando posteriormente ao ponto A, completando o ciclo biológico. Enquanto
deslocamentos não estacionais, que estão associados à resposta rápida a alterações
ambientais não antrópicas, tais como chuvas, secas prolongadas, incêndios, redução ou
aumento na disponibilidade de alimento, dentre outros fenômenos é determinado como
nomadismo 156.
40
A América do Sul é atravessada por três principais rotas migratórias ou flyways,
terminologia mais atual (Figura 6). Entende-se por rotas migratórias ou Flyway, toda a
extensão percorrida pelo qual o conjunto total de espécies de aves migratórias, podendo ser
de diferentes espécies ou populações distintas de uma única. As quais locomovem-se
anualmente de áreas de reprodução para locais de não-reprodução, incluindo as regiões
intermediárias de descanso e as de alimentação, bem como as áreas onde as mesmas
ocorrem 157.
Figura 6.:Principais flyways de aves que se deslocam entre o Hemisférios Norte e Sul 157 adaptado por Scagion 2014.
O Brasil é um país que está na rota de muitas espécies de aves migratórias, tanto de
visitantes setentrionais (aves Neárticas), que possuem seus sítios de reprodução no
hemisfério norte, como as meridionais (aves Neotrópicais), que reproduzem em áreas do
hemisfério sul. No total, já foram registradas 152 espécies de aves migratórias no país destas
61 meridionais e 91 setentrionais 158 apud; 159.
As aves neárticas chegam ao Brasil utilizando as áreas de baixa elevação do leste
americano para alcançarem o Golfo do México e, a partir daí, cruzam as ilhas do Mar das
Antilhas, atingindo o continente Sul Americano pela costa venezuelana e colombiana,
podendo então utilizar uma das quatro rotas conhecidas: a do Pacífico, Cisandina, do Brasil
Central (incluindo as rotas do Rio Negro – Pantanal e dos Rios Xingu - Tocantins) e Atlântica 160; 161; 162; 163. Através da rota Cisandina, estas aves chegam até a região do Acre, e a partir
daí utilizam um trajeto que as levam em direção à Patagônia ou outro trajeto que adentra a
região oeste do território brasileiro, na qual podem conectar-se com outras rotas, como a do
Brasil Central. Estas rotas são vantajosas para estes migrantes uma vez que lhes permitem
desviar da Cordilheira dos Andes e da Serra da Pacaraima, na Venezuela 163; 164. Estes
41
migrantes encontram no Brasil vários sítios de descanso (Figura 7), que lhes oferecem clima
mais quente e abundância de alimento 165.
Figura 7: Rotas migratórias das aves migratórias setentrionais 156
Os locais de concentração de aves migratórias, além da relevância para a conservação
das aves, também são importantes no contexto de vigilância epidemiológica 166. Outro
importante aspecto a ser considerado pelos países em rotas de aves migratórias é sobre a
potencialidade dessas espécies na disseminação de doenças, particularmente aquelas que
possam gerar impactos na economia e trazer riscos à saúde pública. Sabe-se que as aves
42
migratórias são reservatórios naturais de vírus de importantes enfermidades, por exemplo o
vírus da Influenza, da Febre do Nilo Ocidental e da doença Newcastle 158 apud; 159.
Portanto, um dos meios naturais de introdução da DN no Brasil poderia ser pelo
carreamento de estirpes virulentas do VDN agente causador da doença, por intermédio de
aves migratórias existentes. O tamanho considerável da população de aves selvagens, a
ausência de fronteiras e a liberdade de movimentos de aves fazem com que essa população
seja considerada um fator extremamente importante de disseminação viral 167.
Em um estudo realizado por Marks e colaboradores na região da Lagoa do peixe,
estuário o qual recebe uma grande quantidade de aves migratórias do Hemisfério Norte e do
Sul da América, pois possui um sitio adequado para alimentação e descanso 168. Foi realizada
uma investigação quanto a presença do material genético e anticorpos do VDN, com aves de
fundo de quintal. Estas aves “sentinelas” e possíveis reservatórios são um bom indicador para
o levantamento e fiscalização da introdução e disseminação de patógenos dentro de uma
região. Os resultados revelaram uma grande quantidade de aves soropositivas para VDN,
porém sem detecção do material genético viral, o que indica que o vírus circula em aves de
fundo de quintal, e este sistema de criação pode ser uma fonte de VDN de baixa virulência na
região, bem como favorece a propagação do vírus entre a fauna selvagem local e a aves de
fundo de quintal 169.
E ainda, outro trabalho com aves de vida livre e domésticas assintomáticos, da região
litorânea do estado do Amazonas, ou seja áreas geográficas consideradas como possíveis
porta de entrada do VDN no Brasil. Foi mostrado utilizando a técnica de PCR-Real time, tendo
o gene M do VDN como alvo da detecção viral, sete amostras positivas lentogênicas entre
1022 amostras 170.
Estes estudos demostram a importância do monitoramento e vigilância contínua tanto
das aves de vida livre como as de subsistência, para um melhor entendimento da dinâmica
do VDN. Contudo, devido à escassez de informações ainda não é possível realizar uma
análise robusta do real risco da possível chegada de doença através das aves. E ainda não
sabemos a suscetibilidade de cada uma dessas espécies migrantes de se tornar um potencial
reservatório, condutor e transmissor do vírus. Por isso a necessidade de maior conhecimento
sobre epidemiologia do VDN em diferentes grupos de aves, informação sobre ecologia e
comportamento, além dos padrões migratórios 167.
1.3.1. Aves Ameaçadas de Extinção
O Brasil é o país com o maior número de espécies ameaçadas no mundo 171. Uma
espécie ameaçada de extinção é aquela cuja população está decrescendo a ponto de colocá-
43
la em alto risco de desaparecimento na natureza em futuro próximo 172. O principal documento
que possui informações de espécies ameaçadas de extinção em escala global é a Lista
Vermelha de Espécies Ameaçadas, elaborada pela IUCN (sigla em inglês para União
Internacional para Conservação da Natureza) que avalia o estado de conservação das
espécies por mais de quatro décadas, com o objetivo de destacar os táxons ameaçados e
promover a sua conservação. Essas informações tornam a tomada de decisão mais clara e
objetiva, elevando-a de um nível local para global. A Lista Vermelha divide as espécies
em categorias: Extinta (EX), Extinta na Natureza (EW), Criticamente ameaçada (CR), Em
Perigo (EN), Vulnerável (VU), Quase Ameaçada (NT), Pouco Preocupante (LC) e Deficiente
em Dados (DD) 171.
Entre 2010 e 2014, o ICMBio (Instituto Chico Mendes de Conservação de
Biodiversidade) avaliou 12.256 táxons da fauna, incluindo todos os vertebrados descritos para
o país. Foram 732 mamíferos, 1980 aves, 732 répteis, 973 anfíbios e 4.507 peixes, sendo
3.131 de água doce (incluindo 17 raias) e 1.376 marinhos, totalizando 8.924 animais
vertebrados. Foram avaliados também 3.332 invertebrados, entre crustáceos, moluscos,
insetos, poríferos, miriápodes, entre outros 173.
Após a avaliação 1.173 táxons foram oficialmente reconhecidos como ameaçados,
entre estas estão 234 aves. A principal razão da perda de diversidade é devido a degradação
do habitat, principalmente decorrente da expansão agrícola e urbana e da instalação de
grandes empreendimentos, como hidrelétricas, portos e mineração, sendo a mais importante
ameaça para as espécies continentais. Para as espécies marinhas, a pesca excessiva, seja
direcionada ou incidental, é a ameaça que mais se destaca 173.
1.3.2. Aves Sinantrópicas
Fauna sinantrópica são as populações animais de espécies silvestres nativas ou
exóticas, que utilizam recursos de áreas antrópicas, de forma transitória em seu
deslocamento, como via de passagem ou local de descanso; ou permanente, utilizando-as
como área de vida 174. Os animais sinantrópicos adaptaram-se a viver junto ao homem, a
despeito da vontade deste. Diferem dos animais domésticos, os quais o homem cria e cuida
com as finalidades de companhia (cães, gatos, pássaros, entre outros), produção de
alimentos ou transporte (galinha, boi, cavalo, porcos, entre outros)175.
As principais aves sinantrópicas encontradas nas grandes áreas urbanas no Brasil são
da ordem Columbiformes, mais comumente o pombo doméstico (Columba livia) e, em
algumas regiões, os pombos de bando (Zenaida auriculata). Os Columbiformes têm vasta
distribuição no planeta, são granívoros e frugívoros, com grande capacidade de voo e
44
convivem em bandos. O pombo-doméstico, proveniente da Europa, foi introduzido no Brasil
por volta do século XVI como ave doméstica. Contudo, com passar do tempo, exemplares que
saíram do cativeiro se adaptaram a vida livre e atualmente são considerados sinatrópicos.
Esta ave possui o hábito de nidificar em rochedos, razão de sua provável adaptação à vida
em cidade já que encontra edificações de estatura elevada 176.
No Brasil, cada vez mais os pombos estão se tornando alvo de pedidos de controle
populacional pelos municípios aos Centros de Controle de Zoonoses (CCZ). O número de
reclamações sobre pombos urbanos por parte de municípios da grande São Paulo durante o
ano de 2002 alcançou quase de 50% do total de reclamações sobre roedores, considerados
pelo CCZs as de maior ocorrência dentre as pragas urbanas 177. Além disso, ressalta-se a
espantosa população de pombos existentes nos locais de armazenamento de grãos e
sementes, com silos, entrepostos, armazéns, fábricas de rações e áreas portuários. Em
virtude deste aumento populacional, o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos
Naturais Renováveis (IBAMA) através de sua Instituição Normativa n.º 141, de 19 de
dezembro de 2006, regulamento o controle e o manejo ambientais da fauna sinantrópica
nociva 174.
Estas aves de vida livre podem transmitir para as aves comerciais algumas
enfermidades, dentre as quais, temos as salmoneloses (Salmonella pullorum, Salmonella
gallinarum, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis), as micoplasmoses (Mycoplasma
gallisepticum, Mycoplasma synoviae) e o vírus da Doença de Newcastle (VDN), razão pela
qual elas são referidas no PNSA. Pois, a ocorrência destas enfermidades podem causar
prejuízos econômicos ao país, afetando de maneira negativa as exportações, além do impacto
para saúde pública. O Plano Nacional de Sanidade Avícola – PNSA - 178 envolve elevados
investimentos relacionados aos recursos físicos, humanos e de monitoramento laboratorial
representado por uma sistemática coleta, análise e interpretação de resultados de provas
diagnósticas.
1.4. Avicultura Brasileira
No Brasil, a avicultura emprega mais de 5 milhões de pessoas, direta e indiretamente,
e respondendo por 1,5% do Produto Interno Bruto (PIB) nacional. O mercado tem-se utilizado
de sistemas de planejamento e novas tecnologias, resultando em seu crescimento como uma
importante atividade para o agronegócio brasileiro, pela geração de benefícios sociais e
econômicos179.
Em 2013, foi produzido no Brasil 12,3 milhões de toneladas de carne de frango, sendo
68,4% destinado ao consumo interno e 31,6% à exportação. A avicultura de corte brasileira
45
se destaca no agronegócio mundial como uma das mais competitivas. O país ocupa a terceira
posição no ranking mundial dos maiores produtores, sendo superado apenas por Estados
Unidos e China, e é líder em exportações de produtos avícolas, tendo comercializado com
155 países em 2013 179.
Dessa forma, as barreiras sanitárias impostas pelos países importadores, em
substituição às barreiras tarifárias, constituem atualmente o maior entrave para acesso dos
produtos agropecuários aos mercados internacionais. Portanto para o livre comércio mundial
de aves e seus produtos, uma das principais barreiras sanitárias é a presença da DN 5.
Assim, além dos grandes impactos econômicos que a presença desse patógeno pode
acarretar, ainda, é importante ressaltar o impacto social que o mesmo pode causar, que vai
além de perda de empregos. De maneira que muito brasileiros, principalmente das regiões
Norte e Nordeste, assim como em outros países em desenvolvimento, possuem os “frangos
de fundo de quintal” ou frangos caipiras, que representam uma forma de alimento, seja por
meio de ovos ou da carne. E com o surgimento da doença de Newcastle que é altamente
contagiosa e afeta tanto aves domésticas e selvagens com grande potencial epidêmico e letal,
poderia ter um impacto tão grande na produção de aves doméstica quanto na industrial 170.
Desde 2003, o Brasil foi reconhecido como um país livre de estirpes patogênicas do
vírus da doença de Newcastle (VDN) 180. No entanto, estudos sorológicos detectaram
atividades de VDN entre aves silvestres em 2003 e 2006 48; 181 e aves de fundo de quintal em
2005 49 e 2006 44. No entanto, apesar das rigorosas medidas de biossegurança adotadas pela
indústria de aves, o risco de reintrodução do vírus em aves domésticas está sempre presente 45. Portanto exige-se não só uma vigilância epidemiológica constante, mas também esforços
para aumentar a compreensão atual sobre as relações das estirpes do VDN relevantes para
o Brasil bem como estirpes circulantes no mundo inteiro55.
1.5. Real-Time RT PCR (RRT-PCR)
A técnica de PCR em Tempo Real tornou-se um método padrão ouro para a
quantificação precisa e a caracterização de ácidos nucleicos, em rotina de detecção e
aplicações que vão desde a detecção de agentes patogênicos para a descoberta de mutações
e de verificação de perfis de expressão gerados em microarrays.
O desenvolvimento do PCR em tempo real por Higuchi e colaboradores182; 183, foi
possível monitorar em tempo real a quantidade de produto formado durante o curso da reação
de PCR. A primeira PCR em tempo real foi realizada por simples adição de brometo de etídio
na mistura para PCR e acompanhamento da amplificação através das propriedades
fluorescentes 183. Para aumentar a sensibilidade, brometo de etídio foi posteriormente
46
substituído pelo corante SYBR Green 184. A técnica foi implementada com o desenvolvimento
de um equipamento que, num único compartimento, apresenta termociclador, sistema ótico e
câmera CCD (Charged Coupled Device).
Nesta técnica, há vários sistemas para detecção de sequências-alvo, tais como, sistemas
de corante inespecífico (SYBR Green, EVA Green, SYTO 9), tecnologias baseadas em
primers (primer LUX, AmpliFluor, Plexor) e sistemas de sondas FRET (sondas TaqMan ou
sondas de hidrólise, molecular beacons, Scorpions, sondas de hibridização FRET), entre
outros.
O sistema TaqMan® ou ensaio para nuclease 5’ fluorescente utiliza uma sonda
fluorescente para possibilitar a detecção de um produto especifico de PCR conforme esse se
acumula ao longo dos ciclos da reação. A sonda contém um corante repórter na extremidade
5’ e um corante supressor na extremidade 3’. A proximidade do supressor reduz drasticamente
a fluorescência emitida pela repórter, resultando em um substrato não fluorescente 185.
As sondas TaqMan® (sondas de hidrólise) são oligonucleotídeos desenhados para
hibridizar em uma região interna do produto da PCR. Se a sequência-alvo estiver presente, a
sonda se anela logo após um dos primers e é clivada pela atividade exonucleásica 5’-3’ da
Taq DNA polimerase enquanto o primer é estendido. A clivagem separa o repórter do
quencher, removendo a sonda da fita alvo, permitindo que a extensão continue (figura 8). As
sondas clivadas a cada ciclo resultam no acúmulo de repórter livre e refletem a quantidade de
produto formado 186. A fluorescência é captada na fase de extensão e esse sistema tem como
grande vantagem a alta especificidade 187.
A sonda deve ser desenhada de modo a localizar-se de uma a cinco bases do primer
forward. Sua temperatura de anelamento deve ser 10°C maior que a dos primers. Isso garante
que, quando a enzima começar a estender, a sonda já estará anelada. As sondas usadas no
experimento são conhecidas comercialmente como sondas TaqMan MGB. Possuem um
quencher não fluorescente na extremidade 3´ e uma molécula minor groove binder (MGB),
que aumenta em 10°C a temperatura de melting da sonda. As sondas podem ser marcadas
com diferentes corantes, permitindo o desenvolvimento de ensaios multiplex,
TaqMan® Universal PCR Master Mix (PE Applied Biosystems P/N 4304437).
Dessa maneira, com a metodologia para isolamento viral convencional atualmente é
realizada em ovos embrionados de galinhas, está se torna trabalhosa, relativamente
demorada e com isso limita o monitoramento da DN. Atualmente, testes moleculares são
reconhecidos pela OIE por proverem resultados rápidos e eficientes, como RT-PCR
(transcriptase reversa e reação em cadeia da polimerase) e real time RT-PCR (RRT-PCR). A
47
principal vantagem RRT-PCR é a eliminação da etapa de processamento após a amplificação,
que reduz enormemente a possibilidade contaminação de amostras além aumentar a
velocidade do diagnóstico 81.
Com isso a identificação de amostras AMPV-1 tem sido realizada em diversos países
através de uma técnica de RRT-PCR validada 188. A técnica foi desenvolvida e validada
durante um surto de APMV-1 velogênico nos Estados Unidos em 2002-2003 189 e substituiu o
isolamento viral como principal teste de diagnóstico de APMV-1. Assim, esta técnica que
detecta o gene M dos APMV-1 é amplamente utilizada como triagem de amostras para
detectar qualquer APMV-1 em 48 laboratórios nos Estados Unidos e diversos países da União
Europeia.
Porém, um recente estudo demonstrou que esta técnica falhou ao detectar cerca de 73%
de amostras coletadas de aves aquáticas, aves limícolas e LBM 190. Análises das sequências
de nucleotídeos do gene M revelaram que uma grande variabilidade entres os isolados de
classe I e classe II dos APMV-1 na região onde se liga a sonda do teste, o que provocaria
uma diminuição na sensibilidade do teste M. Kim et al (2008) desenvolveram um RRT-PCR
capaz de detectar o gene L um grande número de isolados dos AMPV-1 de classe I. O que
demonstra que apesar do grande poder detecção dessa técnica, ainda é necessário a
continuidade de estudos nessas áreas para um melhor entendimento da epidemiologia viral.
1.6. Sorologia
NDV pode ser utilizado como um antígeno em uma ampla gama de testes sorológicos,
permitindo neutralização, ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) e HI (inibição da
hemaglutinação) a serem utilizados para avaliar os níveis de anticorpos em aves. No
momento, o teste de HI é o mais amplamente utilizado para a detecção de anticorpos para
APMV-1 nas aves, enquanto o uso de kits comerciais de ELISA para avaliação dos níveis de
anticorpos pós-vacinais é comum. Geralmente as neutralizações virais, e os títulos derivados
das técnicas de HI ou ELISA são correlacionados a nível de plantel em vez de a nível de
individual em aves. Testes sorológicos são utilizados em laboratórios de diagnóstico para
avaliar o nível de resposta dos anticorpos após a vacinação, mas possui um valor limitado na
vigilância e diagnóstico da DN devido ao uso quase universal de vacinas em aves
domésticas5.
Atualmente, o teste HI é além de ser um dos mais utilizados para detectar/titular os
anticorpos contra o VDN, ainda é também considerado como uma reação padrão para o
diagnóstico dessa enfermidade 191. Porém, atualmente, vários relatos na literatura indicam que
o método indireto de ELISA é também eficaz nessa mesma tarefa, apresentando, ainda,
48
algumas vantagens relevantes, tais como: ser o teste sorológico mais utilizado em avicultura
para VDN e outros agentes etiológicos, por sua sensibilidade, especificidade e rapidez 192.
Comparativamente, o teste de HI apresenta baixa sensibilidade, especialmente quando soros
de outras espécies de aves são testados, e ainda há a possibilidade de ocorrência de
aglutinação inespecífica de hemácias de galinha 193.
Valores dos níveis de anticorpos quantificados pela técnica de ELISA usualmente são
correlacionados com os valores obtidos no teste de HI, por ser este adotado como padrão no
monitoramento pós-vacinal da DN 194; 195; 196; 197.
É válido ressaltar também que o ensaio ELISA pode ser executado através de vários
protocolos, e fazendo uso de diferentes tipos de conjugados imunoenzimáticos, os quais, por
sua vez, podem restringir a detecção de anticorpos antivirais a uma dada espécie animal como
verificado pelo método indireto do teste, disponível sob a forma de kits comerciais, para os
quais, conjugados específicos para a maioria das espécies de aves não-galiformes não são
encontrados comercialmente. Adicionalmente, algumas variantes de métodos de ELISA,
como exemplifica o próprio ensaio indireto, a despeito de certas vantagens mencionadas,
envolvem o preparo e a padronização frequentes de várias partidas de antígeno viral
purificado por ultracentrifugação, tornando sua exequibilidade na rotina laboratorial, um tanto
mais laboriosa 198.
No entanto, em relação às aves de vida livre, o uso do método indireto de ELISA para
o sorodiagnóstico da DN encontra-se limitado, pois apesar dos conjugados imunoenzimáticos
conseguirem detectar anticorpos presentes nos soros de aves galiformes não há a mesma
disponibilidade desses tipos de conjugados para as outras espécies de aves, sobretudo as de
vida-livre. Em vista dessa dificuldade, tem-se utilizado com maior frequência o teste de HI, ou
na melhor das hipóteses há o esforço para a padronização de métodos alternativos de ELISA,
usando o formato de ELISA competitivos (c-ELISA) 199.
Com respeito aos testes de c-ELISA sabe-se que essa técnica faz uma abordagem
mais refinada e sua execução não requer o uso de anticorpos secundários espécie-
específicos 200; 201. Adicionalmente, alguns métodos variantes do ELISA como exemplifica o
próprio ensaio indireto, a despeito de certas vantagens mencionadas, envolvem o preparo e
a padronização frequentes de várias partes de antígeno viral purificado por ultracentrifugação,
o que representa dificuldades adicionais no preparo desse ensaio imunoenzimático. Entre os
métodos do c-ELISA, constata-se que o método de ELISA de bloqueio de fase líquida
49
utilizando anticorpos monoclonais específicos (Mab) para o VDN, tem sido empregado para
detectar anticorpos específicos em amostras de soro de aves exóticas ou selvagens 193.
No entanto, o crescimento e a manutenção das células de hibridoma para produção
continua de Mabs possuem procedimentos muito trabalhosos e onerosos, ou ainda, a
aquisição deste tipo de anticorpos monoclonais é cara 197; 202; 203; 204. Ademais, em relação ao
uso de Mab, sabe-se que o método de ELISA competitivo utilizando esses anticorpos, não é
capaz de reconhecer todas as estirpes de APMV-1, já que os Mabs são conhecidos pela sua
especificidade para epitopos individuais 5.
1.7. Considerações Finais
A importância econômica e social da avicultura brasileira coloca o setor em evidência no
âmbito nacional e internacional, uma vez que o Brasil é atualmente o maior exportador mundial
de carne de frango e o terceiro maior produtor. Em 2013, a produção de carne de frango
atingiu 12,3 milhões de toneladas, desse total 68,4% foi destinado ao consumo interno, e
31,6% para exportações. Com isto, o consumo per capita de carne de frango atingiu 41,8
quilos por pessoa 179. Neste cenário, a sanidade dos plantéis avícolas brasileiros deve ser
monitorada com o objetivo de manter o status produtivo alcançado nos últimos anos. Em
relação a esta sanidade, as doenças respiratórias estão associadas na avicultura a grandes
perdas econômicas em todo o mundo, sendo as enfermidades virais reconhecidas como o
maior desafio da avicultura moderna.
As aves silvestres, especialmente aves aquáticas migratórias, aves de rapina e
passeriformes são frequentemente consideradas reservatórios, ou até mesmo vetores de
patógenos aviários de importância para as aves comerciais 205; 206; 207; 208. Dessa forma, o
sorotipo APMV-1 tem sido amplamente pesquisado, uma vez que esse sorotipo abrange os
vírus que causam uma grave doença em frangos e com grande prejuízo econômico causado
pelas restrições comerciais 5; 209.
Portanto, como o entendimento da ecologia dos vírus lentogênicos em aves silvestres e
sinantrópicas é ainda limitado bem como as técnicas de diagnóstico empregadas. A técnica
de multiplex real time quantitativo de RT-PCR, RRT-PCR 210; 211 que tem como alvo os genes
L e M para a detecção simultânea os vírus AMPV-1 correspondentes a classe I e classe II,
respectivamente, parece ser promissora para a detecção deste agente. Dessa forma a
validação e emprego desta técnica para detecção viral circulantes em aves silvestres e
sinantropicas. Além disso, o teste HI será utilizado como uma ferramenta complementará a
avaliação dos AMPV-1 circulantes em aves silvestres. Assim, o presente estudo será de
50
grande importância para enriquecer nossos conhecimentos sobre as estirpes dos APMV-1
presentes em aves silvestres e sinantrópicas no Brasil.
2. Objetivos
2.1.Gerais Investigação da presença dos diferentes paramixovírus aviários do sorotipo I através
de testes sorológicos e moleculares e caracterizá-los molecularmente por meio de
materiais obtidos a partir de aves silvestres nos estados de São Paulo e Maranhão do
Brasil.
2.2. Específicos 1) Validação do multiplex RRT-PCR, para detectar a presença do gene M e L dos APMV-
1 através do real time RT-PCR em amostras padrões.
2) Validação de 7 RT-PCR convencionais para futuro sequenciamento do genes F e HN;
3) Detecção da presença dos genes M e L dos APMV-1 através do RRT-PCR em suabes
cloacais e traqueais obtidos a partir de aves silvestres.
4) Sequenciamento do sítio de clivagem do gene F e do gene HN;
5) Realizar a análise genética baseada no gene da proteína F e HN dos APMV através do
sequenciamento afim de caracterizar as variantes circulantes presentes nas aves
silvestres;
5) Detectar anticorpos específicos contra APMV-1 nas aves silvestres através do HI e
ELISA.
3. Material e Métodos 3.1 Tecnica Moleculares
3.1.1 Amostras Padrão
Plasmídeos Topo TA Cloning kits (Invitrogen, Carlsbad, EUA) expressando os genes L e
M dos AMPV-1 190 foram cedidos pelo Dr Claudio Afonso, ARS-USDA em Atenas, EUA. Os
plasmídeos foram utilizados para a padronização do teste na detecção dos vírus de classe I
e II. Além disso, vacinas contendo o vírus vivo da doença de Newcastle estirpe La Sota e B1
51
(New Vaccin e New Vaccin HB1, Laboratório Biovet, Brasil) também foram utilizadas como
amostras referência para os vírus de classe II.
3.1.2 Coleta de Amostras
A coleta das amostras em aves foi realizada em conformidade com as diretrizes de
proteção animal e aprovação legal (SISBIO no 34751-2, data da emissão: 10/06/2013,
anexo1, e Comitê de Ética e Uso de Animais USP no 2012.1.170.74.0, data de emissão:
20/06/2012, anexo 2). Foram selecionadas 387 amostras (194 suabes orofaringeanos-OP e
193 suabes cloacais) de 37 espécies pertencentes a 12 ordens de aves para serem testadas
(Tabela 2). Todas amostras listadas na tabela são provenientes do Centro de Recuperação
de Animais Silvestres (CRAS) "Orlando Villas-Boas" (São Paulo, SP), do Parque Ecológico
do Tietê (http://www.ecotiete.org.br/), Bosque dos Jequitibás (Campinas, SP), Parque
Ecológico Municipal de Americana (Americana, SP).
52
Tabela 2: Amostras testadas durante a vigência do projeto. Foram enviadas 194 suabes orofaringeanos (OP) e 193 suabes cloacais totalizando 387 amostras de 37 espécies de aves pertencentes a 12 Ordens.
Total amostras suabe OP suabe Cloacal
Ordem/Espécie aves Nome popular 387 194 193 Local da coleta
Accipitriformes
Rupornis magnirostris Gavião Carijó 8 4 4 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Anseriformes
Aix galericulata Pato Mandarim 64 32 32 Parque Ecológico Municipal de Americana, Casa de aves
Aix sponsa Pato Carolina 4 2 2 Parque Ecológico Municipal de Americana, Casa de aves
Cereopsis novaehollandiae Ganso Australiano 4 2 2 Parque Ecológico Municipal de Americana
Cygnus melanocoryphus Cisne do Pescoço
Preto 2 1 1
Parque Ecológico Municipal de Americana
Cygnus atratus Cisne Negro 2 1 1 Parque Ecológico Municipal de Americana
Aix sponsa Pato Carolina 14 7 7 Casa de aves
Chenonetta jubata Pato Paraquedistas 8 4 4 Casa de aves
Apodiformes
Eupetomena macroura Beija-flor 1 1 0 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Cariamiformes
Cariama cristata Seriema 3 2 1 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
53
Cathartifomes
Coragyps atratus Urubu de Cabeça
Preta 17 9 8
Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Columbiformes
Columba livia Pomba Comum 63 33 30 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS); CETAS, Bosque dos jequitibás
Falconiformes
Caracara plancus Gavião Carcará 10 5 5 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Falco peregrinus Falcão Peregrino 4 2 2 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Passeriformes
Paroaria dominicana Galo da Campina 1 0 1 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Pyroderus scutatus Pavó 4 2 2 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Pitangus sulphuratus Bem-te-vi 4 3 1 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Sporophila frontalis Pixoxó 3 3 0 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Sicalis flaveola brasiliensis Canário da Terra 7 6 1 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Pelecaniformes
Syrigma sibilatrix Maria Faceira 6 3 3 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
54
Tigrisoma lineatum Socó Boi 3 2 1 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Ardea alba Garça Branca 4 2 2 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Phalacrocorax brasilianus Biguá 2 1 1 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Piciformes
Colaptes campestris Pica-pau-do-campo 5 2 3 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Ramphastos dicolorus Tucano de Bico Verde 6 3 3 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Dryocopus lineatus Pica-pau-banda-
branca 4 2 2
Parque Ecológico Municipal de Americana
Colaptes melanochloros Pica-pau-verde-
barrado 2 1 1
Parque Ecológico Municipal de Americana
Psittaciformes
Amazona vinacea Papagaio-de-peito-
roxo 47 12 35
Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Amazona aestiva Papagaio Verdadeiro 4 2 2 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Anodorhynchus leari Arara Azul de Lear 3 3 0 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Aratinga leucophthalma Periquitão Maracanã 34 17 17 Parque Ecológico Municipal de Americana
Amazona farinosa Papagaio Moleno 2 1 1 Parque Ecológico Municipal de Americana
Alipiopsitta xanthops Papagaio Galego 2 1 1 Parque Ecológico Municipal de Americana
55
Ara chloropterus Arara Vermelha 4 2 2 Parque Ecológico Municipal de Americana
Lorius Iory Loris 6 3 3 CETAS, Bosque dos jequitibás
Strigiformes
Megascops choliba Coruja do Mato 19 11 8 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
Rhinoptynx clamator Mocho Orelhudo 11 7 4 Centro de Recuperação de Animais Silvestres (CRAS)
56
3. 1. 3 Purificação do RNA viral
A purificação de RNA do NDV, estirpes La Sota e B1, foi realizada com o kit QIAamp Viral
RNA Mini Kit (Cat no# 52904, Qiagen, Hilden, Alemanha) conforme instruções do fabricante
(Figura 8). Esse mesmo kit foi utilizado para a extração de RNA das amostras obtidas das
aves silvestres.
Figura 8: A extração do vírus NDV estirpe La Sota foi realizada conforme o gráfico acima. Os suabes orofaringeanos e cloacais coletados das aves silvestres também tiveram seus RNA extraídos a partir dessa metodologia utilizando 200µL de amostra.
3. 1. 4 Controle Interno
A reação de RT-PCR em tempo real (RRT-PCR) para detecção do gene interno, beta actina
(Tabela 3), será utilizada como controle da reação com o kit QuantiFast Probe RT-PCR+ROXVial
Kit (Cat # 204554, Qiagen, Hilden, Alemanha), sob as mesmas condições descritas
previamente212. A amostra e purificação de RNA serão avaliadas através do controle interno
beta-actina com um valor de Ct<45.
3. 1. 5 RRT-PCR para Detecção de APMV-1
A reação de RRT-PCR foi baseada em sondas marcadas com duas fluorescências: FAM
e VIC para a detecção dos vírus APMV de classe II e I (Tabela 3), respectivamente15; 190. Para
57
a reação de RRT-PCR foi utilizado o kit Qiagen onestep RT-PCR (Cat no#210212, Qiagen,
Hilden, Alemanha) em volume de 25µL (17µL de mix mais 5 µL de RNA) contendo 8,105 μl
de água livre de RNAse, 5 μl de buffer (5x), 0,8 μl de DNTP´s (10mM), 1,25μl de MgCl²
(25mM), 0,325 μl RNAse-inhibitor (Qiagen), 1μl de enzima mix, 0.12 μl de cada oligo (500 mM
de cada oligonucleotídeo), 0.025µl de cada sonda (100mM de cada sonda) e 5μl de RNA.
A reação foi realizada em 30 minutos a 50°C para a transcrição reversa, seguidos de 15
minutos a 95°C para a inativação da enzima RT e ativação da enzima Taq polimerase. Após
esta etapa, serão efetuados 40 ciclos: 10 segundos a 95°C (denaturação), 33 segundos a
56°C (detecção e anelamento) e 10 segundos a 72°C (extensão). As reações foram realizadas
no termociclador LightCycler 480 II (Roche Diagnostics, Manheim, Alemanha). Os produtos
da RT-PCR foram analisados com o programa específico do equipamento e a eficiência de
cada reação foi determinada baseada em uma curva padrão. Esta curva padrão foi realizada
através de diluições seriadas na base 10 de concentrações conhecidas de produto da RT-
PCR, em triplicata. Os valores serão expressos em Cycle Threshold (Ct), ou seja, o valor que
a amostra atinge a linha Threshold determinada após o cálculo da eficiência de cada reação.
Os valores para corte foram calculados baseados na última diluição detectada na curva
padrão +2*DP (desvio padrão).
Tabela 3. Oligonucleotídeos e sondas a serem utilizados para amplificação do material genético dos testes moleculares no RRT-PCR.
Gene alvo Nome Posição Sequência
Referência
APMV-1 M
NDVM+4100 4100-4121 5’-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3’
[15] NDVM+4169 4169-4191
5’- FAM-TTCTCTAGCAGTGGGACAGCCRG
C-BHQ-3’
NDVM-4220 4198-4220 5’-
GCCATGTTGTCACTGTCTATTG-3’
APMV-1 L
NDVL+8738 8738-9760
5’-TGTTGAAAAGAAGCTGCTAGGC-
3’
[194] NDVL+9762 9762-9786
5’-VIC-TGCCTGGTCACACAAGATCCGCC
G-BHQ-3’
NDVL-8847 8825-8847 5’-TGGACCATGAAGAGTGGAACC-
3’
Controle Beta -actina
β actin632F 632-653 5’-CCTCATGAAGATCCTGACAGA-
3’
[212] β
actin696 696-719 5’-FAM-
CGTGACATCAAGGAGAAGCTGTG-BHQ-3’
β actin747R 729-747 5’-TCTCCTGCTCYAAYTCCA-3’
58
3. 1. 6 RT-PCR para Sequenciamento
O kit Qiagen onestep RT-PCR (Cat no#210212, Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizado
para a reação da RT-PCR e as sequências dos oligonucleotídeos do gene HN e F foram
baseadas em um estudo anterior 213. As reações foram realizadas no termociclador Veriti®
96-Well Thermal Cycler (Applied Biosystems, California, EUA). Os produtos da PCR foram
visualizados pela luz ultravioleta (UV) após a eletroforese em gel agarose 2,0% contendo o
corante SYBR safe (Life Technologies, Carlsbad, EUA) em tampão Tris-borato (pH 8.0).
3. 1. 7 Limite de Detecção e Especificidade dos Testes
As vacinas comerciais foram extraídas e suas concentrações foram obtidas através da
utilização do espectrofotômetro de microvolumes, Thermo Scientific NanoDrop™ 2000/2000c
Spectrophotometer. Então foram realizadas diluições seriadas na base 10 em água ultra pura
para a avaliação do limite de detecção.
3. 1. 8 Sequenciamento dos Fragmentos Amplificados
Amostras positivas que foram amplicadas com sucesso pela técnica de RT-PCR mais
sensível foram submetidas ao sequenciamento parcial do gene F e do gene HN com
oligonucleotídeos específicos previamente descritos sem necessidade de isolamento viral 213.
Cada reação com um oligonucleotídeo específico (sentido senso ou anti-senso) foi realizada
em triplicada para garantir confiabilidade nas seqüência geradas. O fragmento de DNA foi
purificado através da eletroforese em gel agarose 1,5% (w/v) contendo SYBR safe
(Invitrogen). A banda específica foi extraída do gel com auxílio de uma lâmina de bisturi, assim
o produto de PCR foi purificado utilizando o kit de purificação da QIAquick Gel extraction
(Qiagen) e as amostras quantificadas utilizando um espectrofotômetro. O produto de PCR na
concentração de 20ng/uL e 5µM de cada oligonucleotídeo foram enviados ao LACTAD
(Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida) da
Universidade Estadual de Campinas, conforme recomendações do Setor de Sequenciamento
de DNA.
3. 1. 9 Análise das sequências e desenho da árvore filogenética
A qualidade das sequências obtidas foi avaliada no programa Sequence Scanner Software
2 (Applied Biosystems). As seqüências de nucleotídeos senso e antisenso foram manipuladas
utilizando o programa Bioedit Sequence Alignment Editor versão 7.1.11 214 e alinhadas
59
usando-se o programa Clustal W 215 no programa MEGA versão 6.0 216 e a similaridade das
seqüências comparada com seqüências depositadas no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&
LINK_LOC=blasthome). O alinhamento foi então verificado manualmente e três sequências
de vírus de classe I foram utilizadas como outgroup. Eventos de recombinações foram
avaliados nas sequências obtidas pelo programa RDP 3.44 217. Análises filogenéticas foram
realizadas de acordo com o método Maximum Likelihood como implementado pelo programa
Tree finder 218 e MEGA 6.0. A árvore consenso infere 1000 replicas 219 é utilizada para
representar a evolução das sequências analisadas. As distâncias evolucionárias são
computadas pelo método Hasegawa-Kishino-Yano 220 e estão em unidade do número de
substituição por sítio. A análise envolveu 151 sequências de 603 nucleotídeos para o gene
HN e 57 sequências de 161 nucleotídeos para o gene F. Para a análise da região do sítio de
clivagem, as seqüências de aminoácidos foram deduzidas utilizando o programa MEGA
versão 6.0, conforme o manual da OIE. As árvores foram editadas no programa FigTree
v1.4.2.
3. 2. Técnicas Sorológicas
A sorologia foi realizada utilizando os testes de Inibição da Hemaglutinação (HI) e ELISA
competitivo comercial (IdVet, Montpellier, França).
3. 2. 1 Amostras
A coleta das amostras em aves foi realizada em conformidade com as diretrizes de
proteção animal e aprovação legal (SISBIO no 34751-2, data da emissão: 10/06/2013, anexo
1, e Comitê de Ética e Uso de Animais USP no 2012.1.170.74.0, data de emissão: 20/06/2012,
anexo 2). No total, 132 soros foram testados com 17 espécies de aves pertencentes a 4
Ordens (Tabela 4). Destas amostras, 31 foram provenientes de aves do Parque ecológico de
Americana, 100 amostras de Anseriformes (gentilmente cedidos pelo Prof. Edson Duringon)
e amostra de Galliformes da cidade de Pirassununga.
60
Tabela 4: Amostras de soros testadas durante a vigência do projeto, com 17 espécies de aves pertencentes a 4 Ordens.
Ordem/ Espécie Número de amostras
(132) Local de coleta
Anseriformes
Aix galericulata 1 Parque ecológico de Americana -SP
Aix sponsa 2 Parque ecológico de Americana -SP
Cereopsis novaehollandiae 2 Parque ecológico de Americana -SP
Cygnus melanocoryphus 1 Parque ecológico de Americana -SP
Cygnus atratus 1 Parque ecológico de Americana -SP
Anser cygnoides 81 Parque do Ibirapuera - SP
Dendrocygna viduata 8 São Bento-MA, Bacurituba-MA
Dendrocygna autumnalis 7 São Bento-MA, Cajapió-MA
Amazonetta brasiliensis 3 São Bento -MA
Netta erythrophthalma 2 São Bento -MA
Galliformes
Gallus gallus 1 Pirassununga-SP
Meliagres gallopavo 1 São Bento -MA
Piciformes
Dryocopus lineatus 1 Parque ecológico de Americana -SP
Psittaciformes
Aratinga leucophthalma 17 Parque ecológico de Americana -SP
Amazona farinosa 1 Parque ecológico de Americana -SP
Alipiopsitta xanthops 1 Parque ecológico de Americana -SP
Ara chloropterus 2 Parque ecológico de Americana -SP
3. 2. 2 Teste de Inibição de Hemaglutinação (HI) O teste de HI foi realizado seguindo a metodologia padrão5. Todos os títulos acima de 3
(log2) foram considerados positivos.
3. 2. 3 ELISA Competitivo O teste ELISA competitivo (NDVC-2P, IDvet, França) foi realizado de acordo com as
especificações do fabricante.
61
3. 3 Comparação entre as Técnicas A concordância entre as tecnicas foi determinada pelo teste kappa com p<0,001, a
comparação foi realizada entre as técnicas de RRT-PCR, HI e ELISA utilizando parâmetros
citados acima.
4. Resultados
4. 1 Controle Interno
Todas as amostras foram detectadas pelo RRT-PCR da beta actina. Dessa forma, todas
as amostras foram consideradas para a detecção de APMV-1.
4. 2 RRT-PCR
A eficiência da reação multiplex RRT-PCR utilizando o vírus NDV estirpe La Sota foi de
99.99% (vírus La Sota, respectivamente), e a inclinação da curva (slope) obtida foi de -3.24 e
o ponto de intersecção no eixo Y de 27,16. O limite de detecção em picogramas por microlitro
(pg/µL) foi de 2,52 .10-7 (Figura 9) e a diluição detectada foi de 10-11 (Figura 11 VIII). Obtivemos
resultados similares com a estirpe viral B1. Os resultados obtidos com o plasmídeo contendo
o gene M foram similares. Os valores para corte foram calculados baseados na última diluição
do gene M detectada na curva padrão +2*DP (desvio padrão). O teste é válido unicamente se
a fluorescência do controle negativo (mix + água sem amostra) for negativo (Ct>40) e o
controle positivo apresentar um sinal não contestável (Ct<38,22).
62
A B
Figura 9. Detecção dos plasmídeos contendo os genes L e M dos AMPV-1 cedidos pelo laboratório do Dr Claudio Afonso, ARS-USDA em Atenas, EUA, através do RRT-PCR multiplex A) A sonda específica para a detecção do plasmídeo M e NDV estirpe La Sota, correspondente aos vírus de classe II, foi marcada com o fluoróforo FAM (que utiliza filtro de 465-510). A curva padrão foi obtida através de diluições em série na base 10 do NDV estirpe NDV. B) A sonda específica para a detecção do plasmídeo M e NDV estirpe La Sota, correspondente aos vírus de classe II, foi marcada com o fluoróforo VIC (que utiliza filtro de 533-580). O equipamento LightCycler 480II da Roche foi capaz de detectar com eficiência as duas fluorescências.
Enquanto a eficiência da reação do multiplex RRT-PCR utilizando o plasmídeo
contendo o gene L não foi obtida, uma vez que o plasmídeo apresentou uma baixa
concentração (8,39 .104 pg/μL) e apenas uma diluição foi identificada pelo aparelho, sendo
assim a curva padrão não pode ser calculada. Novos oligos foram desenhados baseados na
sequência do gene L inserido no plasmídeo (GenBank: EU419620.1). Para tanto, foram
selecionados dois oligonucleotídeos para a amplificação de um amplicon 302pb (Figura 10).
Canal VIC/YY Canal FAM
63
A Sequência (5'->3') Fita alvo Tamanho Início Final Tm GC%
L+17 ATCAGACACTCAGCCATTCCTC Positiva 22 17 38 59.83 50.00
L-300
(L-8749)
AAGCCATGCGAATTTGGCG Negativa 19 318 300 60.15 52.63
B >gi|180036694|gb|EU419620.1| Newcastle disease virus isolate Mallard/US(MD)/02-200/2002 polymerase gene, partial cds CTAGGTCGCTCGGTGCATCAGACACTCAGCCATTCCTCAAAACTCACTGGGATCTTACATCCTAGGTGTCTAGAAGACCTAGTAAGGCTAGATATACCCGATTCAACAAACAAGTTCAGAAGGATAGAGAAGAAGATTCAGATTCACAATACAAGGTATGGGGAGCTATTCACCAGACTCTGTTCTTATGTTGAAAAGAAGCTGCTAGGCTCTGCCTGGTCACACAAGATCCGCCGTTCTGAGGAATTTGACAGTCTCCGCACAGACCCAGCATTCTGGTTCCACTCTTCATGGTCCACCGCCAAATTCGCATGGCTTCATGTGAAGCAGATCCAGAGGCACTTGATTGTAGCCGCGCGGACGAGGTCTGCCTCCAGCAAGCTTGTGACACTGTCTCATCATTCAGGCCAAGTCTTTATCACTCCTGAGCTAGTAATAGTAACGCATACGAATGAG Figura 10. Desenho de oligos para amplificação do plasmídeos contendo os genes L dos AMPV-1 cedidos pelo laboratório do Dr Claudio Afonso, ARS-USDA em Atenas, EUA, baseado na sequência GenBank: EU419620.1 A) Os oligos foram desenhados com auxílio do programa Primers 3221. Os dois oligos desenhados pelo programa apresentam uma temperatura de anelamento similar bem como conteúdo de GC (%). B) A sequência dos novos oligos foi marcada em cinza na sequência alvo. As sequências marcadas em azul e vermelho correspondem às sequências dos alvos dos oligos NDVL+8738, NDVL-8847, respectivamente. A sonda específica para a detecção do plasmídeo L marcada com o fluoróforo VIC foi identificada com a marcação amarela (NVL+8762). É importante salientar que os novos oligos amplificarão a sequência de interesse do gene L.
4. 3 RT-PCR Convencional
Os gradientes de temperatura das reações de RT-PCR convencional (denominadas de
RT-PCR I a VIII) foram testados no termociclador. Os limites de detecção bem como as
temperaturas de anelamento determinados de cada reação estão descritos na tabela 5. O RT-
PCR IV (PGA e HN886VV) obteve uma temperatura de 50°C, onde também foi registrado um
limite de detecção de 10-11, correspondente a 2,52 10-7 pg/ µL (Figura 11 IV) na diluição após
a repetição. O RT-PCR V (3HNOV e P7B) obteve uma tmperatura de 60°C, onde foi registrado
um limite de detecção na diluição de 10-10, correspondente a 2,52 10-6 pg/ µL (Figura 11 V).
64
Tabela 5 Limite de detecção determinado pelos diferentes testes com temperaturas de anelamento e tamanhos de amplicon distintos.
Nome par Par de oligonucleotídeos
Temperatura de
anelamento (°C)
Tamanho amplicon
(bp)
Gene alvo
Limite de Detecção (diluição)
Concentração
(pg/ µL)
I MFS1 e F3AS 59 766 M e F 10-10 2,52 . 10-6
II F+4952 e MFS3 52 747 F 10-3 2,52 .10
III F+5429/ F+886 e HN49rev
50 1040 F e HN
10-9 2,52 .10-5
IV P6A EHN886rev
50 1120 F e HN
10-11 2,52 .10-7
V 3HNOV e P7B 60 1271 HN e L
10-10 2,52 . 10-6
VI NDVA e NDVB 50 363 F 10-10 2,52 . 10-6
VII F2-S e F2-AS 50 192 F 10-12 2,52 .10-8
VIII- RRTPCR
NDVM+4100 e NDVM-4220
60 121 M 10-11 2,352 .10-7
O RT-PCR I (MF51 e F3A5) obteve uma temperatura 59°C, onde após constatar o valor
de 10-8 na diluição seriada, repetiu-se o processo a fim de que se obtivesse o limite de
detecção correto para ele que foi registrado como 10-10, correspondente a 2,52 10-6 pg/ µL
(Figura 11 I). O RT-PCR III (F+5429 ou F+886 e HN49) obteve uma temperatura de 50°C,
onde foi determinado um limite de detecção de 10-9 (Figura 11 III) após repetição,
correspondente a 2,52 10-5 pg/ µL. O RT-PCR II (F+4952 e MF52) obteve uma temperatura
de 52°C, onde primeiramente obteve-se o limite de detecção de 10-7, porém ao repeti-lo foi
encontrado um limite de detecção inferior, de 10-3 (Figura 11 II), correspondente a 2,52 10 pg/
µL. O RT-PCR VI obteve uma temperatura de 50°C, onde foi determinado um limite de
detecção de 10-10 (Figura 11 VI) após repetição, correspondente a 2,52 10-6 pg/ µL, contudo
foram aplicadas apenas as diluições de 10-5 a 10-12. Finalmente, o RT-PCR VII obteve uma
temperatura de 50°C que apresentou o limite de detecção de 10-12 (Figura 11 VII)
65
correspondente a 2,52 10-8 pg/ µL. Dessa forma, essa foi a técnica mais sensível entre todos
os testes validados.
VII
66
Figura 11 Determinação do limite de detecção com diluições seriadas de cDNA usando os testes de RT-PCR e RRT-PCR.I) RT-PCR I que consegue detectar até a diluição de 10-10; II) RT-PCR II, que consegue detectar até a diluição de 10-3;III) RT-PCR IIIque consegue detectar até a diluição de 10-9; IV) RT-PCR IV detecta até a diluição de 10-10;V) RT-PCR V detecta até a diluição de 10-11; VI) RT-PCR VI detecta até a diluição de 10-6; VII) RT-PCR IV detecta até a diluição de 10-12; VIII) RRT-PCR VII detecta até a diluição de 10-11. A visualização dos amplicons com os tamanhos esperados (conforme indicado na tabela 2) foi realizada com gel de agarose a 2,0% corado com SYBR Safe (Life Technologies, Carlsbad, EUA).
4. 4 Detecção do Vírus nas Amostras de Aves Silvestres pelos Testes de RRT-PCR e RT-PCR Convencionais.
No total, todas as amostras listadas na tabela 2 foram testadas pelo teste RRT-PCR.
Oito amostras foram detectadas pela fluorescência FAM, específica para o gene M e três pela
fluorescência VIC, específica para o gene L. A amostra de Gavião Carcará foi detectada pelas
duas fluorescências. Todas as amostras foram detectadas também pelo RT-PCR VII e
submetidas ao sequenciamento (tabela 6).
VIII
VIII
67
Tabela 6 Amostras detectadas pelo teste RRT-PCR e RT-PCR. Espécie, nome comum, tipo de suabe e o ciclo em que a amostra foi detectada (CP) para cada gene do RRT-PCR e resultado na RT-PCR convencional estão listados na tabela abaixo. aAmostras detectadas pelo RRT-PCR gene M; bAmostras detectadas pelo RRT-PCR gene L.
Espécie/Ordem Nome Comum Suabe RRT-PCR
(CP) RT-PCR VII
Columbiforme
Columba livia Pomba comum OP 33,17 a Positivo
Columba livia Pomba comum OP 35,05a Positivo
Columba livia Pomba comum OP 36,00a Positivo
Columba livia Pomba comum OP 37,54 a Positivo
Falconiforme
Falco peregrinus* Falcão peregrino OP 35,00 a Positivo
Caracara plancus Gavião carcará OP 26,15 a,b Positivo
Anseriformes
Cygnus atratus Cisne Negro OP 37,4 a Positivo
Passeriformes
Sporophila frontalis Pixoxó Cloacal 33,79b Positivo
Strigiformes
Rhinoptynx
clamator Mocho orelhudo OP 21,49b Positivo
Psittaciformes
Amazona vinacea Papagaio do peito
roxo Cloacal 37,23 a Positivo
4. 5 Análise Filogenética
Na análise filogenética baseada no gene HN com 151 sequências de 603 nucleotídeos,
as três amostras sequenciadas foram agrupadas dentro do genótipo II dos vírus de classe II,
originando um subgenotipo com as amostras brasileiras com um alto valor de bootstrap com
94,93% (Figura 12A). Esses resultados foram confirmados com a análise filogenética do
sequenciamento parcial do gene F, embora o pequeno fragmento analisado (161
nucleotídeos) gerou uma baixa bootstrap (48%) com pouca confiabilidade (Figura 12B). Todas
as amostras sequenciadas foram classificadas como lentogênicas. Essa classificação é
68
baseada na sequência de aminoácido do sítio de clivagem da proteína F que contem apenas
uma arginina (R) no resíduo 113 e um aminoácido básico entre os resíduos 114 e 116 (R no
resíduo 116, mais leucina no resíduo 117 (Figura 12C).
69
Genotipo II
A
70
B
71
Figura 12 Análises filogenéticas realizadas com genes HN e F das amostras brasileiras identificadas em aves silvestres. As amostras brasileiras foram destacadas em vermelho. A) Análise filogenética utilizando 151 sequências com 603 nucleotídeos do gene HN. B) Análise filogenética utilizando 57 sequências com 196 nucleotídeos correspondentes ao sítio de clivagem do gene F. Os fragmentos sequenciados por este estudo foram classificados dentro do genotipo II dos vírus de classe II. As sequências correspondentes aos demais genotipos e a classe I (outgroup) foram agrupadas e identificadas na árvore. Os ramos correspondendo partições reproduzidas em menos de 50 boostrap são agrupados. A porcentagem das árvores replicadas em cada taxa agrupado pelo teste bootstrap (1000 replicatas) está escrita perto de cada ramo 219. C) Dedução da sequência de aminoácido do sítio de clivagem da proteína F das amostras sequenciadas entre resíduos 113 e 117. As sequências de aminoácido deduzidas dos vírus detectados foram comparadas com outras sequências velogênicas e lentogênicas e todas são lentogênicas.
4. 6 Sorologia 4. 6.1 Teste de inibição de hemaglutinação (HI)
Trinta (22,73%) dos 132 soros testados foram considerados positivos e 102 outros foram
negativos pelo teste. Vinte oito desses soros positivos são provenientes de aves da ordem
Anseriformes (Anser cygnoides, Anas platyrhynchos, Cereopsis novahollandiae, Cygnus
atratus, Cygnus melanocoryphus, Cygnus olor, Dendrogygna Viduata), um pertencente a
ordem Psittaciformes (Ara chloropterus) e um pertencente a ordem Galliformes (Gallus gallus).
C
72
4. 6. 2 ELISA
O ELISA testado avaliou o soro de 123 aves e apresentou especificidade e sensibilidade
de quase 100% e reprodutibilidade de 10%. Vinte e quatro (19,51%) dos soros testados
também pelo HI foram detectados pelo ELISA, enquanto que 99 soros foram considerados
negativos ou duvidosos (Porcentagem de inibição inferior a 40%). Os soros testados
provenientes dos cisnes brancos (Cygnus olor) e marrecos mallard (Anas platyrhynchos)
apresentaram uma alta frenquencia de ocorrência de 22% e 33%, respectivamente.
4. 7 Comparação das Técnicas
O teste de concordância entre os dois testes sorológicos foi de 0.617, Quadro 1 A, sendo
considerado como bom.
Também foram realizados testes de concordancia entre as técnicas sorológicas e RRT-
PCR, porém não foi possível realizar uma comparação completa devido a disponibilidade das
amostras, estes resultados estão dispostos no Quadro 1 B, C e D a concordância entre RRT-
PCR e HI utilizando 29 amostras disponiveis foi de 0,365, já a comparação entre RRT-PCR e
o ELISA com 21 amostras foi de 1,0 e com as três técnicas também 21 amostras foi 0, 447,
respectivamente, todos os testes foram aplicados com o valor de P<0,001. A amostra positiva
a todas as técnicas foi a proveniente de um Anseriforme da espécie Cygnus atratus.
73
Quadro 1 Comparação entre as técnicas de HI, ELISA e RRT-PCR determinada pelo teste kappa com p<0,001. A) Comparação entre as técnicas sorológicas HI e ELISA, utilizando 123 aves. B) Comparação entre as técnicas HI e RRT-PCR, utilizando 29 aves.C) Comparação entre as técnicas ELISA e RRT-PCR, utilizando 21 aves D) Comparação entre as três técnicas utilizando 21 aves.
5. Discussão
Atualmente, muitos relatos tendem a generalizar a ideia de que RRT-PCR, tem uma
sensibilidade melhor em comparação com RT-PCR convencional ou PCR ligado ao ensaio
imunoenzimático (ELISA-PCR). É inegável que RRT-PCR tem melhorado em muito as
práticas de diagnóstico molecular e, como tal, representa um considerável progresso no
diagnóstico molecular. De fato, ele tem muitas vantagens objetivas sobre RT-PCR
convencionais, particularmente, a velocidade, uma ampla e dinâmica gama de alvos (RNA e
DNA) pra quantificação, e a redução da contaminação. Contudo, deve-se ressaltar que RRT-
PCR não é necessariamente mais sensível do que RT-PCR convencional 222. Nossos
resultados estão em concordância com a literatura, uma vez que encontramos uma grande
variação de sensibilidade entre as técnicas 223; 224; 225.
Além disso, em nosso trabalho a técnica RT-PCR convencional padronizada do primer VII
(gene alvo F) apresentou uma sensibilidade superior ao RRT-PCR esse fenômeno já foi
observado em diferentes estudos prévios 226; 227; 228; 229. Da mesma forma, um outro RT-PCR
A HI B RRT-PCR
Negativo Positivo Total Negativo Positivo Total
ELISA
Negativo 84 15 99 HI
Negativo 25 0 25
Positivo 9 15 24 Positivo 3 1 4
Total 93 30 123 Total 28 1 29
Kappa geral 0.617
Kappa geral 0.365
C ELISA D Técnicas
Negativo Positivo Total HI ELISA RRT-PCR
RRT-PCR
Negativo 20 0 20 Negativo 17 20 20
Positivo 0 1 1 Positivo 4 1 1
Total 20 1 21 Total 21 21 21
Kappa geral 1.0
Kappa geral 0.447
74
convencional, primer II, apresentou uma sensibilidade muito inferior aos demais. Estudos
prévios relatam que essa diferença de sensibilidade está relacionada aos desenhos dos
oligonucleotídeos principalmente a presença do resíduo pirimidina na porção 3’ do
oligonucleotídeo 224 e também ao número de cópias do material genético do gene alvo no
genoma do organismo, por isso, ainda que dois métodos de PCR usem o mesmo alvo, ou
mesmo os mesmos oligonucleotídeos, não assegura necessariamente a resultados idênticos 222.
Em muitos aspectos, é extremamente difícil avaliar a prevalência da DN no mundo em
qualquer período de tempo. Pois, há falta de dados sobre a enfermidade, em alguns países
ou regiões só há relatos da ocorrência em aves comerciais, enquanto a sua presença em aves
de subsistência ou bandos criados em fundo quintal é ignorado. Mesmo em aves comerciais,
as estimativas da distribuição geográfica do VDN são confusas pelo uso de vacinas vivas em
quase todos os países pelo mundo. Além disso, em alguns países, a distribuição é
especialmente complicada devido a utilização de vacinas vivas, com vírus que são
considerados virulentos em outros países 7.
Em nosso estudo, 2,58% das amostras de aves foram detectadas pelo teste de RRT-PCR
utilizados. Em um estudo prévio realizado por Thomazelli e colaboradores 170, no qual
investigaram a presença de VDN em aves silvestres e domésticas na região litorânea da
Amazônia brasileira a porcentagem de amostras foi menor (de apenas, 0,7%), porém como
no nosso estudo todas foram lentogênicas. Em outro trabalho realizado na região Sul do
Brasil, com aves de fundo de quintal, apesar de ter sido encontrado uma quantidade de aves
não vacinadas soropositivas para o VDN, indicando a possível presença do vírus em aves
silvestres, não foi detectado nenhuma amostra positiva no RRT-PCR 169. Indicando a variação
do VDN no país e a necessidade continua de estudos na área para manutenção da sanidade
dos planteis avícolas.
A detecção em suabes OP foi maior que em suabes cloacais. Concordando com a
literatura prévia já que substâncias inibitórias presentes no material fecal podem reduzir e
bloquear amplificação, além disso, sabe-se que em aves de vida livre o nível de inibidores de
PCR pode variar dependendo da localização (origem geográfica), ecossistema, dieta, e o
habitat das aves 230.
Entre as amostras positivas deste trabalho uma é proveniente Sporophila frontalis, o
pixoxó, esta ave passeriforme da família Thraupidae ocorre no Paraguai, Argentina e no Brasil,
estendendo sua distribuição da Bahia ao Rio Grande do Sul. Estima-se que haja menos de
10.000 indivíduos adultos, no Brasil, sendo que há declínio populacional continuado de ao
75
menos 10% em três gerações (cerca de 15 anos), principalmente, à grande pressão de
captura e engaiolamento, devido ao seu canto. Dessa forma, S. frontalis foi avaliada como
Vulnerável (VU)231.
Essa amostra é especialmente interessante devido a pertencer a uma espécie ameaçada,
e como a ave pertence a ordem Passeriforme a qual apresenta uma susceptibilidade variada
ao VDN, com algumas espécies podendo ser assintomáticas, porém com capacidade para
excretar o vírus, enquanto outras espécies podem apresentar a doença de uma maneira mais
severa 11. Dessa forma, são levantadas duas possíveis problemáticas, uma ecológica, pois se
a doença se manifestar de forma severa em uma espécie, que já se apresenta ameaçada pela
ação humana, e a pressão de extinção pode se intensificar sobre a mesma.
E uma problemática epidemiológica, já que a espécie pode ser assintomática à doença e
mesmo assim excretar o vírus, podendo dessa maneira espalhá-lo. O perigo se intensifica
quando a ocorrência da espécie no Brasil 232 perpassa a mesma região onde duas das
principais flyways do país, Flyway Americana do Atlântico e Flyway Americana do Mississipi 157 se encontram, mostrando um risco inerente. Portanto, é necessário conhecer-se melhor o
efeito do vírus sobre está espécie e entender melhor sua ação sobre os passeriformes de
modo geral.
Outros autores já descreveram as dificuldades de isolar o VDN a partir de espécimes de
aves adultas clinicamente saudáveis, especialmente as estirpes de baixa virulência 170; 233; 234.
Assim, apesar destas dificuldades conseguimos sequenciar parcialmente nossos genes alvos
e realizar análises filogenéticas com estas sequências do gene F e HN. A análise filogenética
dessas amostras baseada no gene HN indicou que os vírus detectados pertencem a um
cluster distinto, porem próximo, das amostras vacinais do genótipo II da classe II. Esse
resultado foi o mesmo obtido com a análise filogenética utilizando um pequeno fragmento do
gene F para onze amostras. Através de um estudo anterior de nosso laboratório sabe-se que
há uma estirpe de campo de VDN circulando entre os lotes de aves comerciais 235.
Além disso, nossos resultados concordam com um estudo prévio realizado na Argentina
em que em aves de vida livre aparentemente saudáveis, localizadas em regiões de relevância
para produção avícola, foram investigadas por técnicas sorológicas e moleculares (RT-PCR
com alvo em gene M e gene F), ao realizar as análises filogenéticas a maioria dos isolados
argentinos estão relacionados com o genótipo II. Sendo que um isolado obtido de um flamingo,
estava fortemente relacionado com a estirpe vacinal La Sota 236.
Porém, nos Estados Unidos, estudo realizado por Seal e colaboradores em 2005 145 com
aves provenientes do mercado de aves vivas, encontraram isolados de VDN de baixa
76
virulência não relacionados com as estirpes comumente utilizadas em vacinas na América do
Norte. Em outro estudo realizado na região do alto meio oeste com Anseriformes de vida livre,
Jindal e colaboradores em 2009 237 descobriram através de análises filogenéticas e de
sequenciamento parcial gene F, que 38 dos 43 isolados de VDN pertenciam a classe II
genótipo II, e que nenhum destes isolados foi filogeneticamente próximo as estirpes vacinais
por comparação. As relações entre estes estudos levantam a possibilidade de possuirmos
uma estirpe circulante entre as aves de vida livre da Argentina e Brasil que diferem do VDN
presente nas aves de vida livre dos Estados Unidos. Pois apesar da grande maioria das
amostras circulantes serem classe II genótipo II, o fenômeno de ocorrência de escape das
estirpes vacinais para os animas silvestres, não parece estar bem elucidado. Levantando a
questão sobre quais diferenças podem estar ocasionando este fenômeno, se há contato entre
as aves silvestres através da migração.
Em nosso trabalho, todas as estirpes foram lentogênicas. Atualmente sabe-se que as aves
domésticas, aves selvagens são consideradas um reservatório natural do VDN e muitas
estirpes com diferentes genótipos foram isoladas de aves selvagens31; 37; 53; 238, estes autores
estão de acordo com nossos resultados.
E através das análises de diversidade genética, a transmissão viral entre aves selvagens
e aves de domesticas foi provada 26; 30; 129; 239. Além disso, os VDN isolados de aves selvagens
podem causar surtos DN em aves domésticas 240. Por exemplo, isolados do VDN de
cormorões migratórios foram a provável fonte de alguns surtos de VDN em aves domésticas 129, possivelmente porque as distâncias genéticas entre os isolados e as estirpes vacinais são
tão grandes, que a vacina atual não pode reduzir a propagação desses vírus em frangos
vacinados 241; 242; 243. Contudo, apesar dos vírus neste estudo serem lentogênicos a presença
dos vírus de classe II em aves selvagens demonstra a necessidade da monitorização continua
para este vírus 1; 54.
Há relatos que sugerem VDNv podem surgir através de estirpes lentogênicas encontradas
na natureza22; 244. Além do mais, estudos também tem sugerido que eventos de mutação
pontual, e não de recombinação, podem ser os responsáveis por gerar estirpes virulentas e
avirulentas. Por exemplo, o surto de VDN na avicultura australiana, durante o período de 1988
a 2000, foi causado por VDNv originado devido a mutação em um virus do genótipo I da classe
II 244. Estes autores acreditam que vírus lentogênicos tem potencial para tornarem-se
virulentos com o passar do tempo. Sempre que há passagem do VDN de um hospedeiro para
outro reporta-se um aumento em sua virulência. Além do mais, as forças seletivas impostas
pelo ambiente de um novo hospedeiro pode também desenvolver um papel na aquisição da
virulência 245; 246. Estes estudos sugerem que estirpes lentogênicas, de aves selvagens,
77
podem adquirir virulência pela transmissão entre aves aquáticas de vida livre e aves
domésticas. Nesse cenário pode-se encontrar um surto de VDN em aves domésticos 247.
Mostrando a importância deste estudo e do continuo monitoramento do VDN no Brasil devido
a sua grande produção avícola.
Quanto a sorologia, a técnica do HI é a metodologia padrão adotada para detecção do
VDN5, mas a algum tempo, vários métodos de ELISA vêm sendo desenvolvidos 248. Diversos
estudos sobre a sensibilidade, especificidade e o teste correlação entre o HI e ELISA indicam
que os resultados podem não concordar 40; 195; 249. Além disso, os kits de ELISA disponíveis
comercialmente para anticorpos de VDN são mais sensíveis do que o teste de HI e, para
laboratórios de diagnóstico, as principais vantagens de kits de ELISA são a padronização do
ensaio, a eficácia melhorada devido a semi-automatização, e a velocidade para a triagem
rápida de agentes múltiplos 202.
Ainda, em relação às aves de vida livre, o uso do método indireto de ELISA para o
sorodiagnóstico da DN encontra-se limitado, pois apesar dos conjugados imunoenzimáticos
conseguirem detectar anticorpos presentes nos soros de aves galiformes não há a mesma
disponibilidade desses tipos de conjugados para as outras espécies de aves, sobretudo as de
vida-livre. Em vista dessa dificuldade, tem-se utilizado com maior frequência o teste de HI, ou
na melhor das hipóteses há o esforço para a padronização de métodos alternativos de ELISA,
usando o formato de ELISA competitivos (c-ELISA) 199.
Em nosso estudo, os soros provenientes de aves da ordem Anseriformes (Anser
cygnoides, Anas platyrhynchos, Cereopsis novahollandiae, Cygnus atratus, Cygnus
melanocoryphus, Cygnus olor, Dendrogygna Viduata), um pertencente a ordem Psittaciformes
(Ara chloropterus) e um pertencente a ordem Galliformes (Gallus gallus) foram detectados
como positivos pelos nossos testes sorológicos. Estes resultados concordam com resultados
prévios presentes na literatura que indicam os Anseriformes 129; 170 e Psitaciformes 142 como
reservatórios do vírus.
Esta variação entre estas técnicas, HI e ELISA, já foi relatada na literatura250, pois como
já foi demonstrado em estudos prévios utilizando a técnica de ELISA a detecção de
imunoglobulinas nos soros de aves selvagens podem apresentar variação devido a diferenças
na patogenicidade de estirpes e na respostas imune do hospedeiro a exposição ao
organismos patogênico251. Além do mais a afinidade antigênica pode ser diferente para cada
espécie, além das reações cruzadas entre anticorpos da espécie de interesse (selvagens) e
dos galináceos produzir alterações no resultado da técnica251; 252. Dessa maneira é
interessante conduzir estudos prévios para padronização do ELISA na espécie de interesse
78
ou utilizar técnicas em conjunto, como o HI e Western Blotting para um melhor entendimento
das condições dos organismos estudados.
Em estudos prévios, realizado com aves de fundo de quintal pelo de teste de ELISA, no
estado do Rio Grande do Sul 169 e em aves silvestres e de fundo de quintal pelo HI, no estado
Rio de Janeiro, 47, a presença de anticorpos para NDV também já foi detectada. Portanto,
nossos resultados corroboram com estes estudos prévios, mostrando a necessidade de
estudos sorológicos contínuos nessas aves, pois estas podem atuar como reservatório viral.
Bem como apresenta uma nova ferramenta para este trabalho, o kit NDVC-2P, IDvet, França,
de ELISA competitivo.
E, ainda, comparamos a concordância através do teste de Kappa entre as técnicas
sorológicas e o RRT-PCR, porem devido a disponibilidade de amostras, não podemos realizar
uma comparação entre todas as amostras testadas. A comparação das técnicas HI, ELISA e
RRT-PCR resultou em concordância moderada, isso é explicado pois o alvo das técnicas é
diferente enquanto as técnicas de RT-PCR buscam a presença do material genético viral
(RNA), as sorológicas como HI e ELISA buscam anticorpos. Estes resultados são
demonstrados também no estudo de Marks e colaboradores em 2014 169, em que 411 aves
de fundo de quintal da região sul foram testadas pelas técnicas ELISA e RRT-PCR, 33,8%
foram positivas para técnica sorológica e nenhuma para o RRT-PCR. Sendo assim, é
interessante a utilização das técnicas sorológicas e moleculares, para um maior entendimento
da dinâmica viral.
6. Conclusões
O presente estudo foi capaz de comparar a sensibilidade da técnica de RRT-PCR e
outras sete técnicas de RT-PCR. A técnica de RRT-PCR foi utilizada como teste de
triagem por conseguirmos testar mais amostras concomitantemente evitando
contaminações. Contudo, uma das técnicas de RT-PCR convencional apresentou uma
sensibilidade analítica superior à técnica RRT-PCR com a amostra de referência. Dez
(2,58%) das 387 amostras testadas provenientes de 8 espécies representantes de 6
ordens de aves foram detectadas pelos testes utilizados. A detecção em suabes OP
(2,07%) foi maior que em suabes cloacais (0,51%).
As técnicas de RT-PCR convencional foram utilizadas para o sequenciamento gênico.
A análise filogenética dessas amostras baseada no gene HN indicou que os vírus
detectados pertencem a um cluster entre as amostras vacinais do genótipo II da classe II.
79
Esse resultado foi o mesmo obtido com a análise filogenética utilizando um pequeno
fragmento do gene F das dez amostras. Contudo, precisamos confrontar os resíduos nos
sítios antigênicos e marcações descritas pelos estudos anteriores 128; 213 para confirmar se
as vacinas utilizadas nas aves comercias brasileiras conseguiriam neutralizar esses vírus
circulantes em aves silvestres.
A soroprevalência em aves, em sua maioria Anseriformes, foi de 22,73% e 19,51%
utilizando os testes HI e ELISA, respectivamente. As duas técnicas apresentaram uma
concordância de 0,62. Dessa forma, o teste de ELISA competitivo parece ser uma boa
ferramenta para avaliar anticorpos específicos contra APMV-1, mas deveria ser avaliado
para cada espécie de ave. O presente estudo apresenta resultados que podem auxiliar
para uma maior compreensão do APMV-1 no Brasil em aves silvestres no Brasil. Além de
levantar questões sobre a ocorrência do VDN e a interação entre o vírus e seus
hospedeiros que deve ser foco dos próximos estudos.
80
7. Referências
1 ALEXANDER, D. J. Newcastle disease. British poultry science, v. 42, n. 1, p. 5-22, 2001. ISSN 0007-1668.
2 DOYLE, T. A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus. J.
Comp. Pathol. Ther, v. 40, p. 144-169, 1927.
3 KRANEVELD, F. A poultry disease in the Dutch East Indies. Ned Indisch Bl
Diergeneeskd, v. 38, p. 448-450, 1926.
4 MAPA. INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 50, DE 24 DE SETEMBRO DE 2013.
MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, P. E. A.: 6 p. 2013.
5 OIE. CHAPTER 10.9. Newcastle Disease. In: OIE (Ed.). Terrestrial Animal Health
Code 2012. 21th, v.II, 2012.
6 ALDOUS, E. W.; ALEXANDER, D. J. Detection and differentiation of Newcastle
disease virus (avian paramyxovirus type 1). Avian Pathol, v. 30, n. 2, p. 117-28, Apr 2001. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=19184885 >.
7 ALEXANDER, D. J.; BELL, J. G.; ALDERS, R. G. A technology review: Newcastle
disease, with special emphasis on its effect on village chickens. Food & Agriculture Org., 2004. ISBN 9251050805.
8 SEAL, B. S.; KING, D. J.; SELLERS, H. S. The avian response to Newcastle disease
virus. Developmental & Comparative Immunology, v. 24, n. 2, p. 257-268, 2000. ISSN 0145-305X.
9 ALEXANDER, D. Newcastle disease and other avian paramyxoviruses. Revue
Scientifique et Technique-Office International des Epizooties, v. 19, n. 2, p. 443-455, 2000. ISSN 0253-1933.
10 BEARD, C.; HANSON, R. Newcastle disease. 1984.
11 CENTER FOR INFECTIOUS DISEASE RESEARCH AND POLICY, C. I. D. R. A. P.
OIE: Newcatle disease:Technical disease card database 2003.
12 ALEXANDER, D. J. The epidemiology and control of avian influenza and Newcastle
disease. J Comp Pathol, v. 112, n. 2, p. 105-26, Feb 1995. Disponível em: <
81
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=7769142 >.
13 DEIBEL, R. et al. Influenza viruses and paramyxoviruses in ducks in the Atlantic
flyway, 1977-1983, including an H5N2 isolate related to the virulent chicken virus. Avian diseases, p. 970-985, 1985. ISSN 0005-2086.
14 MINISTÉRIO DA AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, M. A. P. A.
PLANO DE CONTINGÊNCIA PARA INFLUENZA AVIÁRIA E DOENÇA DE NEWCASTLE 2013. Disponível em: < http://www.agricultura.gov.br/arq_editor/file/PNSA/Plano%20de%20Conting%C3%AAncia%20-%20Vers%C3%A3o%201_4.pdf >. Acesso em: 07 de novembro de 2014.
15 WISE, M. G. et al. Development of a real-time reverse-transcription PCR for
detection of Newcastle disease virus RNA in clinical samples. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, n. 1, p. 329-338, 2004. ISSN 0095-1137.
16 SEAL, B. S.; KING, D. J.; BENNETT, J. D. Characterization of Newcastle disease
virus isolates by reverse transcription PCR coupled to direct nucleotide sequencing and development of sequence database for pathotype prediction and molecular epidemiological analysis. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, n. 10, p. 2624-2630, 1995. ISSN 0095-1137.
17 JESTIN, V.; JESTIN, A. Detection of Newcastle disease virus RNA in infected
allantoic fluids by in vitro enzymatic amplification (PCR). Archives of virology, v. 118, n. 3-4, p. 151-161, 1991. ISSN 0304-8608.
18 LAMB, R. A.; KOLAKOSKY, D. Paramyxoviridae: The viruses and their replication. In:
FIELDS, B. B.;KNIPE, D. M., et al (Ed.). Fundamental virology. New York: Lippincott-Raven Publishers, 2002. p.1305-1340.
19 NAGAI, Y.; KLENK, H. D.; ROTT, R. Proteolytic cleavage of the viral glycoproteins
and its significance for the virulence of Newcastle disease virus. Virology, v. 72, n. 2, p. 494-508, Jul 15 1976. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=948870 >.
20 GLICKMAN, R. L. et al. Quantitative basic residue requirements in the cleavage-
activation site of the fusion glycoprotein as a determinant of virulence for Newcastle disease virus. J Virol, v. 62, n. 1, p. 354-6, Jan 1988. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=3275436 >.
21 MCGINNES, L.; MCQUAIN, C.; MORRISON, T. The P protein and the nonstructural
38K and 29K proteins of Newcastle disease virus are derived from the same open reading frame. Virology, v. 164, n. 1, p. 256-64, May 1988. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=3363866 >.
82
22 COLLINS, M.; BASHIRUDDIN, J.; ALEXANDER, D. Deduced amino acid sequences
at the fusion protein cleavage site of Newcastle disease viruses showing variation in antigenicity and pathogenicity. Archives of virology, v. 128, n. 3-4, p. 363-370, 1993. ISSN 0304-8608.
23 LI, X. et al. Occurrence and transmission of Newcastle disease virus aerosol
originating from infected chickens under experimental conditions. Veterinary microbiology, v. 136, n. 3, p. 226-232, 2009. ISSN 0378-1135.
24 AWAN, M. A.; OTTE, M.; JAMES, A. The epidemiology of Newcastle disease in rural
poultry: a review. Avian Pathology, v. 23, n. 3, p. 405-423, 1994. ISSN 0307-9457.
25 CHOI, K.-S. et al. Molecular epidemiology of Newcastle disease viruses in Vietnam.
Tropical animal health and production, v. 46, n. 1, p. 271-277, 2014. ISSN 0049-4747.
26 SNOECK, C. J. et al. Genetic diversity of Newcastle disease virus in wild birds and
pigeons in West Africa. Applied and environmental microbiology, v. 79, n. 24, p. 7867-7874, 2013. ISSN 0099-2240.
27 HADDAS, R. et al. Newcastle disease virus in little owls (Athene noctua) and African
penguins (Spheniscus demersus) in an Israeli zoo. Transboundary and emerging diseases, 2013. ISSN 1865-1682.
28 CHEN, F. et al. Complete genome sequence of a Newcastle disease virus strain
isolated from broiler breeder flocks in China. Journal of virology, v. 86, n. 22, p. 12461-12462, 2012. ISSN 0022-538X.
29 DIEL, D. G. et al. Characterization of Newcastle disease viruses isolated from
cormorant and gull species in the United States in 2010. Avian diseases, v. 56, n. 1, p. 128-133, 2012. ISSN 0005-2086.
30 LINDH, E. et al. Molecular epidemiology of outbreak-associated and wild waterfowl-
derived Newcastle disease virus strains in Finland, including a novel class I genotype. Journal of Clinical Microbiology, p. JCM. 01427-12, 2012. ISSN 0095-1137.
31 XIE, Z. et al. Complete genome sequence analysis of a Newcastle disease virus
isolated from a wild egret. Journal of virology, v. 86, n. 24, p. 13854-13855, 2012. ISSN 0022-538X.
32 WORLD ANIMAL HEALTH INFORMATION DATABASE, W. A. H. I. D.
Disease distribution maps. 2013. Disponível em: < http://www.oie.int/wahis_2/public/wahid.php/Diseaseinformation/Diseasedistributionmap >.
83
33 FORRESTER, N. L. et al. Identification of a new newcastle disease virus isolate from Indonesia represents an ancestral lineage of class II genotype XIII. Virus genes, v. 47, n. 1, p. 168-172, 2013. ISSN 0920-8569.
34 WESTBURY, H. Newcastle disease virus: an evolving pathogen? Avian Pathol, v.
30, n. 1, p. 5-11, Feb 2001. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=19184867 >.
35 TOLF, C. et al. Prevalence of avian paramyxovirus type 1 in Mallards during autumn
migration in the western Baltic Sea region. Virol J, v. 10, n. 1, p. 1-9, 2013. ISSN 1743-422X.
36 LIU, H. et al. Phylogenetic characterization and virulence of two Newcastle disease
viruses isolated from wild birds in China. Infection, genetics and evolution, v. 20, p. 215-224, 2013. ISSN 1567-1348.
37 CHEN, S. et al. Genomic characterisation of a lentogenic Newcastle disease virus
strain HX01 isolated from sick pigs in China. Virus genes, v. 46, n. 2, p. 264-270, 2013. ISSN 0920-8569.
38 SHARMA, B. et al. Isolation of Newcastle disease virus from a non-avian host
(sheep) and its implications. Archives of virology, v. 157, n. 8, p. 1565-1567, 2012. ISSN 0304-8608.
39 SANTOS, J. et al. A ocorrência da doença de Newcastle no Brasil (nota prévia).
Rev. Prod Animal, v. 1, n. 1, 1954.
40 VAITSMAN, J.; MOUSSATCHÉ, I. Doença de Newcastle. Mo da Agricultura
Serviço Informaçáo agrícola, 1954.
41 ITO, N. M. K.; PRESTES, A. A.; NICIPORCIUKAS, M. C. Virus da doença de
Newcastle: Algumas características biológicas de 12 amostras isoladas no Brasil. Revista da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, v. 23, n. 1, p. 47-53, 1986.
42 HASTENREITER, H. La maladie de Newcastle au Bresil. Bulletin de l'Office
International des Epizooties, 1976. ISSN 0300-9823.
43 FRANZO, V. S. Ocorrência da doença de Newcastle no Brasil e no mundo. Ensaios
e Ciência, v. 5, n. 5, p. 81-85, 2007. ISSN 2178-695X.
44 FLORES, M.; SEGABINAZF, S. Epidemiologia da Doença de Newcastle–Revisão
Bibliográfica. A Hora Veterinária, v. 26, p. 57-61, 2006.
84
45 ORSI, M. et al. A survey for maintenance of virulent newcastle disease virus-free area in poultry production in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 41, n. 2, p. 368-375, 2010. ISSN 1517-8382.
46 PINOTTI, R. N.; PAULILLO, L. D. O. A estruturação da rede de empresas
processadoras de aves no Estado de Santa Catarina: governança contratual e dependência de recursos. Gestão & Produção, v. 13, n. 1, p. 167-177, 2006.
47 DE OLIVEIRA JUNIOR, J. G. et al. Vírus da doença de Newcastle em aves não
vacinadas no Estado do Rio de Janeiro. Cienc. Rural, v. 33, n. 2, 2003. ISSN 0103-8478.
48 SILVA, J. et al. Newcastle disease virus infection in sparrows (Passer domesticus,
Linneaus, 1758) captured in poultry farms of the agreste region of the State of Pernambuco. Revista Brasileira de Ciência Avícola, v. 8, n. 2, p. 125-129, 2006. ISSN 1516-635X.
49 OLIVEIRA JÚNIOR, J. G. D. et al. Isolation and biological characterization of JAP99
Newcastle disease virus isolated from domestic ducks (Neta sp) in Rio de Janeiro State. Ciencia Rural, v. 35, n. 4, p. 948-951, 2005. ISSN 0103-8478.
50 OLIVEIRA, E. Identificada doença de Newcastle em Manaus. 2006. Disponível em:
< http://oglobo.globo.com/economia/identificada-doenca-de-newcastle-em-manaus-4566397 >.
51 S.A., I. C. E. P. Detectado foco da doença de Newcastle no Mato Grosso
2006. Disponível em: < http://oglobo.globo.com/economia/detectado-foco-da-doenca-de-newcastle-no-mato-grosso-4553223#ixzz3RH7gFP77 >.
52 INDUSTRIA, A. Newcastle deixa produtores gaúchos sem serviço em Vale Real.
2006. Disponível em: < http://www.aviculturaindustrial.com.br/noticia/newcastle-deixa-produtores-gauchos-sem-servico-em-vale-real/20060823133606_21956 >.
53 MILLER, P. J.; DECANINI, E. L.; AFONSO, C. L. Newcastle disease: evolution of
genotypes and the related diagnostic challenges. Infection, genetics and evolution, v. 10, n. 1, p. 26-35, 2010. ISSN 1567-1348.
54 BALLAGI-PORDANY, A. et al. Identification and grouping of Newcastle disease virus
strains by restriction site analysis of a region from the F gene. Archives of virology, v. 141, n. 2, p. 243-261, 1996. ISSN 0304-8608.
55 FERNANDES, C. C. et al. Molecular and phylogenetic characterization based on the
complete genome of a virulent pathotype of Newcastle disease virus isolated in the 1970s in Brazil. Infection, genetics and evolution, 2014. ISSN 1567-1348.
85
56 BENGIS, R. et al. The role of wildlife in emerging and re-emerging zoonoses. Revue Scientifique et Technique-Office International des Epizooties, v. 23, n. 2, p. 497-512, 2004. ISSN 0253-1933.
57 STALLKNECHT, D. E. Ecology and epidemiology of avian influenza viruses in wild
bird populations: waterfowl, shorebirds, pelicans, cormorants, etc. Avian diseases, p. 61-69, 2003. ISSN 0005-2086.
58 INTERNATIONAL COMMITTEE ON TAXONOMY OF VIRUSES, I. C. T. V. Virus
Taxonomy: 2013 Release. 2013. Disponível em: < http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp >. Acesso em: 20 de dezembro.
59 BRIAND, F.-X. et al. Complete Genome Sequence of a Novel Avian Paramyxovirus.
Journal of virology, v. 86, n. 14, p. 7710, July 15, 2012 2012. Disponível em: < http://jvi.asm.org/content/86/14/7710.abstract >.
60 TERREGINO, C. et al. Antigenic and genetic analyses of isolate
APMV/wigeon/Italy/3920-1/2005 indicate that it represents a new avian paramyxovirus (APMV-12). Archives of virology, v. 158, n. 11, p. 2233-2243, 2013/11/01 2013. ISSN 0304-8608. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1007/s00705-013-1735-2 >.
61 NAYAK, B. et al. Avian paramyxovirus serotypes 2-9 (APMV-2-9) vary in the ability to
induce protective immunity in chickens against challenge with virulent Newcastle disease virus (APMV-1). Vaccine, v. 30, n. 12, p. 2220-2227, 2012. ISSN 0264-410X.
62 SUBBIAH, M. et al. Complete sequence of the genome of avian paramyxovirus type
2 (strain Yucaipa) and comparison with other paramyxoviruses. Virus research, v. 137, n. 1, p. 40-48, 2008. ISSN 0168-1702.
63 KUMAR, S. et al. Complete genome sequence of avian paramyxovirus type 3
reveals an unusually long trailer region. Virus research, v. 137, n. 2, p. 189-197, 2008. ISSN 0168-1702.
64 NAYAK, B. et al. Molecular characterization and complete genome sequence of
avian paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75. Virol J, v. 5, p. 124, 2008.
65 XIAO, S. et al. Complete genome sequence of avian paramyxovirus type 7 (strain
Tennessee) and comparison with other paramyxoviruses. Virus research, v. 145, n. 1, p. 80-91, 2009. ISSN 0168-1702.
66 SAMUEL, A. S. et al. Complete genome sequence of avian paramyxovirus (APMV)
serotype 5 completes the analysis of nine APMV serotypes and reveals the longest APMV genome. PloS one, v. 5, n. 2, p. e9269, 2010. ISSN 1932-6203.
86
67 SAMUEL, A. S. et al. Complete sequence of the genome of avian paramyxovirus type 9 and comparison with other paramyxoviruses. Virus research, v. 142, n. 1, p. 10-18, 2009. ISSN 0168-1702.
68 XIAO, S. et al. Complete genome sequences of avian paramyxovirus serotype 6
prototype strain Hong Kong and a recent novel strain from Italy: evidence for the existence of subgroups within the serotype. Virus research, v. 150, n. 1, p. 61-72, 2010. ISSN 0168-1702.
69 PALDURAI, A. et al. Complete genome sequences of avian paramyxovirus type 8
strains goose/Delaware/1053/76 and pintail/Wakuya/20/78. Virus research, v. 142, n. 1, p. 144-153, 2009. ISSN 0168-1702.
70 ALEXANDER, D.; PATTISON, M.; MACPHERSON, I. Avian paramyxoviruses of
PMV‐3 serotype in British Turkeys. Avian Pathology, v. 12, n. 4, p. 469-482, 1983. ISSN 0307-9457.
71 TUMOVA, B.; ROBINSON, J.; EASTERDAY, B. A hitherto unreported paramyxovirus
of turkeys. Research in veterinary science, v. 27, n. 2, p. 135-140, 1979. ISSN 0034-5288.
72 NEROME, K. et al. Isolation of a new avian paramyxovirus from budgerigar
(Melopsittacus undulatus). Journal of General Virology, v. 38, n. 2, p. 293-301, 1978. ISSN 0022-1317.
73 CHANG, P.-C. et al. Complete nucleotide sequence of avian paramyxovirus type 6
isolated from ducks. Journal of General Virology, v. 82, n. 9, p. 2157-2168, 2001. ISSN 0022-1317.
74 SAIF, Y. et al. Natural and experimental infection of turkeys with avian
paramyxovirus-7. Avian diseases, p. 326-329, 1997. ISSN 0005-2086.
75 YAMANE, N. et al. Characterization of avian paramyxoviruses isolated from feral
ducks in northern Japan: the presence of three distinct viruses in nature. Microbiology and immunology, v. 26, n. 7, p. 557-568, 1981. ISSN 0385-5600.
76 CAPUA, I. et al. Isolation of an avian paramyxovirus type 9 from migratory waterfowl
in Italy. The Veterinary Record, v. 155, n. 5, p. 156, 2004. ISSN 0042-4900.
77 WARKE, A.; APPLEBY, L.; MUNDT, E. Prevalence of antibodies to different avian
paramyxoviruses in commercial poultry in the United States. Avian diseases, v. 52, n. 4, p. 694-697, 2008. ISSN 0005-2086.
78 MILLER, P. J. et al. Evidence for a new avian paramyxovirus serotype 10 detected in
rockhopper penguins from the Falkland Islands. Journal of virology, v. 84, n. 21, p. 11496-11504, 2010. ISSN 0022-538X.
87
79 LAMB, R. A. et al. Family Paramyxoviridae. In: FAUQUET, C. M.;MAYO, M. A., et al
(Ed.). Virus Taxonomy, Eighth report of the international committe on taxonomy of viruses. San Diego: Elsevier Academic Press, 2005. p.655-688.
80 STEWARD, M. et al. RNA editing in Newcastle disease virus. Journal of General
Virology, v. 74, n. 12, p. 2539-2548, 1993. ISSN 0022-1317.
81 ALEXANDER, D. J.; SENNE, D. A. Newcastle Disease. 12th. Ames: Backwell
Publishing Professional, 2008. 75-100
82 KALETA, E. F.; BALDAUF, C. Newcastle disease in free-living and pet birds. In:
ALEXANDER, D. J. (Ed.). Newcastle disease. Boston: Kluwer Academic Publishers, 1988. p.197-246.
83 VIRAL ZONE, V. Z., 2010. Disponível em: <
http://viralzone.expasy.org/all_by_species/84.html >. Acesso em: 26 de novembro de 2014.
84 DORTMANS, J. et al. The viral replication complex is associated with the virulence of
Newcastle disease virus. Journal of virology, v. 84, n. 19, p. 10113-10120, 2010. ISSN 0022-538X.
85 ERRINGTON, W.; EMMERSON, P. T. Assembly of recombinant Newcastle disease
virus nucleocapsid protein into nucleocapsid-like structures is inhibited by the phosphoprotein. Journal of General Virology, v. 78, n. 9, p. 2335-2339, 1997. ISSN 0022-1317.
86 KHO, C. L. et al. Newcastle disease virus nucleocapsid protein: self-assembly and
length-determination domains. Journal of General Virology, v. 84, n. 8, p. 2163-2168, 2003. ISSN 0022-1317.
87 GANAR, K. et al. Newcastle disease virus: current status and our understanding.
Virus research, v. 184, p. 71-81, 2014. ISSN 0168-1702.
88 JAHANSHIRI, F.; ESHAGHI, M.; YUSOFF, K. Identification of phosphoprotein:
phosphoprotein and phosphoprotein: nucleocapsid protein interaction domains of the Newcastle disease virus. Archives of virology, v. 150, n. 3, p. 611-618, 2005. ISSN 0304-8608.
89 HORIKAMI, S. M.; SMALLWOOD, S.; MOYER, S. A. The Sendai virus V protein
interacts with the NP protein to regulate viral genome RNA replication. Virology, v. 222, n. 2, p. 383-390, 1996. ISSN 0042-6822.
90 LAMB, R., PARKS, G., . Paramyxoviridae: the viruses and their replication. In:
WILKINS, L. W. (Ed.). Fields Virology. Philadelphia, v.5th ed., 2007. p.1449–1496.
88
.
91 PARK, M.-S. et al. Newcastle disease virus V protein is a determinant of host range
restriction. Journal of virology, v. 77, n. 17, p. 9522-9532, 2003. ISSN 0022-538X.
92 ROUT, S. N.; SAMAL, S. K. The large polymerase protein is associated with the
virulence of Newcastle disease virus. Journal of virology, v. 82, n. 16, p. 7828-7836, 2008. ISSN 0022-538X.
93 CHAMBERS, P. et al. Nucleotide sequence of the gene encoding the matrix protein
of Newcastle disease virus. Nucleic Acids Research, v. 14, n. 22, p. 9051-9061, 1986. ISSN 0305-1048.
94 PEEPLES, M.; BRATT, M. Mutation in the matrix protein of Newcastle disease virus
can result in decreased fusion glycoprotein incorporation into particles and decreased infectivity. Journal of virology, v. 51, n. 1, p. 81-90, 1984. ISSN 0022-538X.
95 SEAL, B. S.; KING, D. J.; MEINERSMANN, R. J. Molecular evolution of the
Newcastle disease virus matrix protein gene and phylogenetic relationships among the paramyxoviridae. Virus research, v. 66, n. 1, p. 1-11, 2000. ISSN 0168-1702.
96 MEBATSION, T.; WEILAND, F.; CONZELMANN, K.-K. Matrix protein of rabies virus
is responsible for the assembly and budding of bullet-shaped particles and interacts with the transmembrane spike glycoprotein G. Journal of virology, v. 73, n. 1, p. 242-250, 1999. ISSN 0022-538X.
97 SERGEL, T. et al. The attachment function of the Newcastle disease virus
hemagglutinin-neuraminidase protein can be separated from fusion promotion by mutation. Virology, v. 193, n. 2, p. 717-726, 1993. ISSN 0042-6822.
98 IORIO, R. M.; MAHON, P. J. Paramyxoviruses: different receptors–different
mechanisms of fusion. Trends in microbiology, v. 16, n. 4, p. 135-137, 2008. ISSN 0966-842X.
99 IORIO, R. M. et al. Functional and neutralization profile of seven overlapping
antigenic sites on the HN glycoprotein of Newcastle disease virus: monoclonal antibodies to some sites prevent viral attachment. Virus research, v. 13, n. 3, p. 245-261, 1989. ISSN 0168-1702.
100 SERGEL, T.; MCGINNES, L. W.; MORRISON, T. G. The fusion promotion activity of
the NDV HN protein does not correlate with neuraminidase activity. Virology, v. 196, n. 2, p. 831-834, 1993. ISSN 0042-6822.
101 DENG, R. et al. Localization of a domain on the paramyxovirus attachment protein
required for the promotion of cellular fusion by its homologous fusion protein spike. Virology, v. 209, n. 2, p. 457-469, 1995. ISSN 0042-6822.
89
102 HU, X.; RAY, R.; COMPANS, R. Functional interactions between the fusion protein
and hemagglutinin-neuraminidase of human parainfluenza viruses. Journal of virology, v. 66, n. 3, p. 1528-1534, 1992. ISSN 0022-538X.
103 MELANSON, V. R.; IORIO, R. M. Amino acid substitutions in the F-specific domain in
the stalk of the Newcastle disease virus HN protein modulate fusion and interfere with its interaction with the F protein. Journal of virology, v. 78, n. 23, p. 13053-13061, 2004. ISSN 0022-538X.
104 MCGINNES, L. W.; MORRISON, T. G. The role of the individual cysteine residues in
the formation of the mature, antigenic HN protein of Newcastle disease virus. Virology, v. 200, n. 2, p. 470-483, 1994. ISSN 0042-6822.
105 SHEEHAN, J. P.; IORIO, R. M. A single amino acid substitution in the hemagglutinin-
neuraminidase of Newcastle disease virus results in a protein deficient in both functions. Virology, v. 189, n. 2, p. 778-781, 1992. ISSN 0042-6822.
106 ZHAO, W. et al. HN gene C-terminal extension of Newcastle disease virus is not the
determinant of the enteric tropism. Virus genes, v. 47, n. 1, p. 27-33, 2013. ISSN 0920-8569.
107 GORMAN, J. et al. Characterization of the sites of proteolytic activation of Newcastle
disease virus membrane glycoprotein precursors. Journal of Biological Chemistry, v. 263, n. 25, p. 12522-12531, 1988. ISSN 0021-9258.
108 RÖMER-OBERDÖRFER, A. et al. Generation of recombinant lentogenic Newcastle
disease virus from cDNA. Journal of General Virology, v. 80, n. 11, p. 2987-2995, 1999. ISSN 0022-1317.
109 PANDA, A. et al. Role of fusion protein cleavage site in the virulence of Newcastle
disease virus. Microbial pathogenesis, v. 36, n. 1, p. 1-10, 2004. ISSN 0882-4010.
110 MORRISON, T. G. Structure and function of a paramyxovirus fusion protein.
Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, v. 1614, n. 1, p. 73-84, 2003. ISSN 0005-2736.
111 TOYODA, T. et al. Structural comparison of the cleavage-activation site of the fusion
glycoprotein between virulent and avirulent strains of Newcastle disease virus. Virology, v. 158, n. 1, p. 242-247, 1987. ISSN 0042-6822.
112 KATTENBELT, J. A.; STEVENS, M. P.; GOULD, A. R. Sequence variation in the
Newcastle disease virus genome. Virus research, v. 116, n. 1, p. 168-184, 2006. ISSN 0168-1702.
113 SAMAL, S. et al. A single amino acid change, Q114R, in the cleavage-site sequence
of Newcastle disease virus fusion protein attenuates viral replication and
90
pathogenicity. Journal of General Virology, v. 92, n. 10, p. 2333-2338, 2011. ISSN 0022-1317.
114 SAKAGUCHI, T. et al. Correlation of proteolytic cleavage of F protein precursors in
paramyxoviruses with expression of the fur, PACE4 and PC6 genes in mammalian cells. The Journal of general virology, v. 75, p. 2821-2827, 1994. ISSN 0022-1317.
115 CANTÍN, C. et al. Newcastle disease virus may enter cells by caveolae-mediated
endocytosis. Journal of General Virology, v. 88, n. 2, p. 559-569, 2007. ISSN 0022-1317.
116 PEETERS, B. P. et al. Rescue of Newcastle disease virus from cloned cDNA:
evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant for virulence. Journal of virology, v. 73, n. 6, p. 5001-5009, 1999. ISSN 0022-538X.
117 HUANG, Y. et al. Genomic sequence of an isolate of Newcastle disease virus
isolated from an outbreak in geese: a novel six nucleotide insertion in the non-coding region of the nucleoprotein gene. Archives of virology, v. 149, n. 7, p. 1445-1457, 2004. ISSN 0304-8608.
118 DE LEEUW, O. S. et al. Virulence of Newcastle disease virus is determined by the
cleavage site of the fusion protein and by both the stem region and globular head of the haemagglutinin–neuraminidase protein. Journal of General Virology, v. 86, n. 6, p. 1759-1769, 2005. ISSN 0022-1317.
119 CORNAX, I. et al. Newcastle disease virus fusion and haemagglutinin-
neuraminidase proteins contribute to its macrophage host range. Journal of General Virology, v. 94, n. Pt 6, p. 1189-1194, 2013. ISSN 0022-1317.
120 RÖMER-OBERDÖRFER, A. et al. Contribution of the length of the HN protein and
the sequence of the F protein cleavage site to Newcastle disease virus pathogenicity. Journal of General Virology, v. 84, n. 11, p. 3121-3129, 2003. ISSN 0022-1317.
121 SWAYNE, D. E.; KING, D. J. Avian influenza and Newcastle disease. Journal of the
American Veterinary Medical Association, v. 222, n. 11, p. 1534-1540, 2003. ISSN 0003-1488.
122 ELANKUMARAN, S. Genetically engineered Newcastle disease virus for prostate
cancer: a magic bullet or a misfit. 2013. ISSN 1473-7140.
123 REICHARD, K. W. et al. Newcastle disease virus selectively kills human tumor cells.
Journal of Surgical Research, v. 52, n. 5, p. 448-453, 1992. ISSN 0022-4804.
124 CASSEL, W. A.; GARRETT, R. E. Newcastle disease virus as an antineoplastic
agent. Cancer, v. 18, n. 7, p. 863-868, 1965. ISSN 1097-0142.
91
125 SCHIRRMACHER, V.; GRIESBACH, A.; AHLERT, T. Antitumor effects of Newcastle Disease Virus in vivo: local versus systemic effects. International journal of oncology, v. 18, n. 5, p. 945-952, 2001. ISSN 1019-6439.
126 LOMNICZI, B. et al. Newcastle disease outbreaks in recent years in western Europe
were caused by an old (VI) and a novel genotype (VII). Archives of virology, v. 143, n. 1, p. 49-64, 1998. ISSN 0304-8608.
127 ALDOUS, E. et al. A molecular epidemiological study of avian paramyxovirus type 1
(Newcastle disease virus) isolates by phylogenetic analysis of a partial nucleotide sequence of the fusion protein gene. Avian Pathology, v. 32, n. 3, p. 239-257, 2003. ISSN 0307-9457.
128 DE ALMEIDA, R. S. et al. New Avian Paramyxoviruses Type I Strains Identified in
Africa Provide New Outcomes for Phylogeny Reconstruction and Genotype Classification. PloS one, v. 8, n. 10, p. e76413, 2013. Disponível em: < http://dx.doi.org/10.1371%2Fjournal.pone.0076413 >.
129 KIM, L. M. et al. Phylogenetic diversity among low-virulence Newcastle disease
viruses from waterfowl and shorebirds and comparison of genotype distributions to those of poultry-origin isolates. Journal of virology, v. 81, n. 22, p. 12641-12653, 2007. ISSN 0022-538X.
130 SNOECK, C. J. et al. Newcastle disease virus in West Africa: new virulent strains
identified in non-commercial farms. Archives of virology, v. 154, n. 1, p. 47-54, 2009. ISSN 0304-8608.
131 CZEGLEDI, A. et al. Third genome size category of avian paramyxovirus serotype 1
(Newcastle disease virus) and evolutionary implications. Virus Res, v. 120, n. 1-2, p. 36-48, Sep 2006. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=16766077 >.
132 YU, L. et al. Characterization of newly emerging Newcastle disease virus isolates
from the People's Republic of China and Taiwan. Journal of Clinical Microbiology, v. 39, n. 10, p. 3512-3519, 2001. ISSN 0095-1137.
133 HERCZEG, J. et al. Two novel genetic groups (VIIb and VIII) responsible for recent
Newcastle disease outbreaks in Southern Africa, one (VIIb) of which reached Southern Europe. Archives of virology, v. 144, n. 11, p. 2087-2099, 1999. ISSN 0304-8608.
134 LIU, H. et al. Molecular epidemiological analysis of Newcastle disease virus isolated
in China in 2005. Journal of virological methods, v. 140, n. 1, p. 206-211, 2007. ISSN 0166-0934.
92
135 LIEN, Y.-Y. et al. Phylogenetic characterization of Newcastle disease viruses isolated in Taiwan during 2003–2006. Veterinary microbiology, v. 123, n. 1, p. 194-202, 2007. ISSN 0378-1135.
136 PEROZO, F.; MARCANO, R.; AFONSO, C. L. Biological and phylogenetic
characterization of a genotype VII Newcastle disease virus from Venezuela: efficacy of field vaccination. Journal of Clinical Microbiology, v. 50, n. 4, p. 1204-1208, 2012. ISSN 0095-1137.
137 ABOLNIK, C. et al. Characterization of a pigeon paramyxovirus (PPMV-1) isolated
from chickens in South Africa: research communication. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 71, n. 2, p. p. 157-160, 2004. ISSN 0030-2465.
138 ABOLNIK, C. et al. Characterization of pigeon paramyxoviruses (Newcastle disease
virus) isolated in South Africa from 2001 to 2006. Onderstepoort Journal of Veterinary Research, v. 75, n. 2, p. 147-152, 2008. ISSN 0030-2465.
139 OTIM, M. O. et al. Molecular characterization and phylogenetic study of Newcastle
disease virus isolates from recent outbreaks in eastern Uganda. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, n. 6, p. 2802-2805, 2004. ISSN 0095-1137.
140 CATTOLI, G. et al. Emergence of a new genetic lineage of Newcastle disease virus
in West and Central Africa—implications for diagnosis and control. Veterinary microbiology, v. 142, n. 3, p. 168-176, 2010. ISSN 0378-1135.
141 SERVAN DE ALMEIDA, R. et al. Africa, a reservoir of new virulent strains of
Newcastle disease virus? Vaccine, v. 27, n. 24, p. 3127-3129, 2009. ISSN 0264-410X.
142 MILLER, P. J. et al. Identification of new sub-genotypes of virulent Newcastle
disease virus with potential panzootic features. Infection, genetics and evolution, v. 29, p. 216-229, 2015. ISSN 1567-1348.
143 MAMINIAINA, O. F. et al. Newcastle disease virus in Madagascar: identification of an
original genotype possibly deriving from a died out ancestor of genotype IV. PloS one, v. 5, n. 11, p. e13987, 2010. ISSN 1932-6203.
144 DIEL, D. G. et al. Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1: proposal for a
unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes. Infection, genetics and evolution, v. 12, n. 8, p. 1770-1779, 2012. ISSN 1567-1348.
145 SEAL, B. S. et al. Genomic sequences of low-virulence avian paramyxovirus-1
(Newcastle disease virus) isolates obtained from live-bird markets in North America not related to commonly utilized commercial vaccine strains. Veterinary microbiology, v. 106, n. 1–2, p. 7-16, 2005. ISSN 0378-1135. Disponível em: < http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S037811350400464X >.
93
146 KE, G. M. et al. Molecular characterization of Newcastle disease viruses isolated
from recent outbreaks in Taiwan. Journal of virological methods, v. 97, n. 1, p. 1-11, 2001. ISSN 0166-0934.
147 SNOECK, C. J. et al. High genetic diversity of Newcastle disease virus in poultry in
West and Central Africa: cocirculation of genotype XIV and newly defined genotypes XVII and XVIII. Journal of Clinical Microbiology, v. 51, n. 7, p. 2250-2260, 2013. ISSN 0095-1137.
148 IORIO, R. M. et al. Neutralization map of the hemagglutinin-neuraminidase
glycoprotein of Newcastle disease virus: domains recognized by monoclonal antibodies that prevent receptor recognition. Journal of virology, v. 65, n. 9, p. 4999-5006, 1991. ISSN 0022-538X.
149 DE LEEUW, O.; PEETERS, B. Complete nucleotide sequence of Newcastle disease
virus: evidence for the existence of a new genus within the subfamily Paramyxovirinae. Journal of General Virology, v. 80, n. 1, p. 131-136, 1999. ISSN 0022-1317.
150 UJVÁRI, D. et al. Identification and subgrouping of pigeon type Newcastle disease
virus strains by restriction enzyme cleavage site analysis. Journal of virological methods, v. 131, n. 2, p. 115-121, 2006. ISSN 0166-0934.
151 ALEXANDER, D. The epidemiology and control of avian influenza and Newcastle
disease. Journal of comparative pathology, v. 112, n. 2, p. 105-126, 1995. ISSN 0021-9975.
152 KWON, H.-J. et al. Molecular epidemiology of Newcastle disease in Republic of
Korea. Veterinary microbiology, v. 95, n. 1, p. 39-48, 2003. ISSN 0378-1135.
153 COURTNEY, S. C. et al. Highly divergent virulent isolates of Newcastle disease virus
from the Dominican Republic are members of a new genotype that may have evolved unnoticed for over 2 decades. Journal of Clinical Microbiology, v. 51, n. 2, p. 508-517, 2013. ISSN 0095-1137.
154 COMITÊ BRASILEIRO DE REGISTROS ORNITOLÓGICOS, C. B. R. O. Listas das
aves do Brasil., 2014. Disponível em: < http://www.cbro.org.br >. Acesso em: 05 de novembro de 2014.
155 RENATA DE MELO VALENTE et al. Conservação de Aves Migratórias Neárticas
no Brasil. INTERNACIONAL, B. C.: 400 p. 2011.
156 NUNES, A.; TOMAS, W. Aves migratórias e nômades ocorrentes no Pantanal.
Embrapa Pantanal-Livros científicos (ALICE), 2009.
94
157 BOERE, G. C.; STROUD, D. A. The flyway concept: what it is and what it isn’t. Waterbirds around the world. The Stationery Office, Edinburgh, UK, p. 40-47, 2006.
158 NUNES, M. F. C. et al. Aves migratórias na Amazônia ea gripe aviária. IBAMA.,
Cabedelo, 2006.
159 HURTADO, R. F. Vigilância epidemiológica dos vírus da influenza aviária em
aves migratórias na região costeira da Amazônia. Universidade de São Paulo
160 ANTAS, P. T. de TZ 1983. Migration of nearctic shorebirds (Charadriidae and
Scolopacidae) in Brasil-flyways and their different seasonal use. Wader Study Group Bulletin, v. 39, p. 52-56, 1989.
161 CASTRO, G.; MYERS, J. Ecología y conservación del playero blanco. Boletin de
Lima. Jul 1987, n. 52, p. 47-61, 1987.
162 MYERS, J.; MARON, J. L.; SALLABERRY, M. Going to extremes: Why do
Sanderlings migrate to the Neotropics? Ornithological Monographs, p. 520-535, 1985. ISSN 0078-6594.
163 MORRISON, R.; ROSS, R. K. Atlas of Nearctic shorebirds on the coast of South
America. Canadian Wildlife Service Ottawa (Canada), 1989.
164 LUMA, B. J.; PEREIRA, L. E.; SOUZA, R. P. D. Encefalite do Nilo Ocidental, nossa
próxima epidemia? Epidemiol. serv. saúde, v. 12, n. 1, p. 7-19, 2003. ISSN 1679-4974.
165 TELINO-JÚNIOR, W. R.; AZEVEDO-JÚNIOR, S. M. D.; LYRA-NEVES, R. M. D.
Census of shorebirds and Seabirds (Charadriidae, Scolopacidae and Laridae) in the Coroa do Avião, Igarassu, Pernambuco State, Brazil. Revista Brasileira de Zoologia, v. 20, n. 3, p. 451-456, 2003. ISSN 0101-8175.
166 HUBÁLEK, Z. An annotated checklist of pathogenic microorganisms associated with
migratory birds. Journal of wildlife diseases, v. 40, n. 4, p. 639-659, 2004. ISSN 0090-3558.
167 THOMAZELLI, L. M. Vigilância epidemiológica do vírus da doença de Newcastle
em aves domésticas e selvagens pelo método de Real Time PCR. 2009. Universidade de São Paulo
168 RESENDE, S.; LEEUWENBERG, F. Ecological studies of Lagoa do Peixe. Final
Report to WWF. Não Pub, 1987.
95
169 MARKS, F. S. et al. Targeted survey of Newcastle disease virus in backyard poultry flocks located in wintering site for migratory birds from Southern Brazil. Preventive veterinary medicine, v. 116, n. 1, p. 197-202, 2014. ISSN 0167-5877.
170 THOMAZELLI, L. et al. Molecular surveillance of the Newcastle disease virus in
domestic and wild birds on the North Eastern Coast and Amazon biome of Brazil. Revista Brasileira de Ciência Avícola, v. 14, n. 1, p. 01-07, 2012. ISSN 1516-635X.
171 SAVE. AVES AMEAÇADAS. Disponível em: < http://savebrasil.org.br/wp/aves-
ameacadas/ >. Acesso em: 13 de janeiro.
172 IBAMA, I. B. D. M. A. E. D. R. N. R. O que é espécie ameaçada de extinção? , 2005.
Disponível em: < http://www.ibama.gov.br/documentos/o-que-e-especie-ameacada.pdf >. Acesso em: 13 de janeiro.
173 ICMBIO, I. C. M. D. C. D. B. LISTA DE ESPECIES AMEAÇADAS - SAIBA MAIS.
2014. Disponível em: < http://www.icmbio.gov.br/portal/biodiversidade/fauna-brasileira/2741-lista-de-especies-ameacadas-saiba-mais.html >. Acesso em: 12 de janeiro.
174 IBAMA, I. B. D. M. A. E. D. R. N. R. INSTRUÇÃO NORMATIVA IBAMA Nº 141, DE
19 DE DEZEMBRO DE 2006. 2006. Disponível em: < www.ibama.gov.br/category/1?download=65:141-06 >. Acesso em: 27 de novembro de 2014.
175 PREFEITURA DE SÃO PAULO, P. S. P. Animais Sinantrópicos. 2014. Disponível
em: < http://www.prefeitura.sp.gov.br/cidade/secretarias/saude/vigilancia_em_saude/controle_de_zoonoses/animais_sinantropicos/index.php?p=4378 >. Acesso em: 27 de novembro de 2014.
176 SICK, H. Birds in Brazil. Princeton Univ. Press, Princeton, New Jersey, 1993.
177 SCHULLER, M. Pesquisa de protozoários e helmintos de interesse médico
presentes nos excretas do pombo doméstico Columba livia domestica. 2004. Universidade de São Paulo. Faculdade de Saúde Pública. Departamento de Prática de Saúde Pública
178 BRASIL, P. N. S. A. Portaria 193- Programa Nacional de Sanidade Avícola. Diário
Oficial da República Federativa do Brasil, : Poder Executivo, Brasília - DF 1994.
179 ABPA. União Brasileira de Avicultura Relatório Anual 2014: 106 p. 2014.
180 ORSI, M. et al. Prevalence of Newcastle Disease Virus in broiler chickens (Gallus
gallus) in Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 41, n. 2, p. 349-357, 2010. ISSN 1517-8382.
96
181 OLIVEIRA JR, J. G. et al. Vírus da doença de Newcastle em aves não vacinadas no
estado do Rio de Janeiro. Ciencia Rural, v. 33, n. 2, p. 381-383, 2003.
182 HIGUCHI, R. et al. Simultaneous amplification and detection of specific DNA
sequences. Bio/technology, v. 10, n. 4, p. 413-417, 1992. ISSN 0733-222X.
183 HIGUCHI, R. et al. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification
reactions. Biotechnology, v. 11, p. 1026-1030, 1993.
184 SCHNEEBERGER, C. et al. Quantitative detection of reverse transcriptase-PCR
products by means of a novel and sensitive DNA stain. Genome Research, v. 4, n. 4, p. 234-238, 1995. ISSN 1088-9051.
185 MORRISON, L. E. Basic principles of fluorescence and energy transfer applied to
Real-Time PCR. Molecular biotechnology, v. 44, n. 2, p. 168-176, 2010. ISSN 1073-6085.
186 KUBISTA, M. et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular aspects of
medicine, v. 27, n. 2, p. 95-125, 2006. ISSN 0098-2997.
187 THELWELL, N. et al. Mode of action and application of Scorpion primers to mutation
detection. Nucleic Acids Research, v. 28, n. 19, p. 3752-3761, 2000. ISSN 0305-1048.
188 WISE, M. G. et al. Development of a real-time reverse-transcription PCR for
detection of newcastle disease virus RNA in clinical samples. J Clin Microbiol, v. 42, n. 1, p. 329-38, Jan 2004. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=14715773 >.
189 KINDE, H. et al. The diagnosis of exotic Newcastle disease in southern
California 200-2003. 46th Annual conference of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. San Diego, 2003. p.
190 KIM, L. M.; SUAREZ, D. L.; AFONSO, C. L. Detection of a broad range of class I and
II Newcastle disease viruses using a multiplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay. J Vet Diagn Invest, v. 20, n. 4, p. 414-25, Jul 2008. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=18599845 >.
191 XU, H.; LOHR, J.; GREINER, M. The selection of ELISA cut-off points for testing
antibody to Newcastle disease by two-graph receiver operating characteristic (TG-ROC) analysis. Journal of immunological methods, v. 208, n. 1, p. 61-64, 1997. ISSN 0022-1759.
97
192 SANTOS, C. et al. Métodos de diagnósticos laboratoriais microbiológicos e sorológicos. Doenças das aves. Campinas: FACTA, p. 171-182, 2000.
193 CZIFRA, G. et al. Detection of PMV‐1 specific antibodies with a monoclonal antibody
blocking enzyme‐linked immunosorbent assay. Avian Pathology, v. 25, n. 4, p. 691-703, 1996. ISSN 0307-9457.
194 BROWN, J.; RESURRECCION, R.; DICKSON, T. The relationship between the
hemagglutination-inhibition test and the enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibody to Newcastle disease. Avian diseases, p. 585-587, 1990. ISSN 0005-2086.
195 CVELIĆ‐ČABRILO, V. et al. Correlation of haemagglutination inhibition and enzyme‐
linked immunosorbent assays for antibodies to Newcastle disease virus. Avian Pathology, v. 21, n. 3, p. 509-512, 1992. ISSN 0307-9457.
196 CZIFRA, G. et al. Detection of NDV‐specific antibodies and the level of protection
provided by a single vaccination in young chickens. Avian Pathology, v. 27, n. 6, p. 562-565, 1998. ISSN 0307-9457.
197 SOUSA, R. L. et al. Antibody response to Newcastle disease vaccination in a flock of
young partridges (Rhynchotus rufescens). Journal of Zoo and Wildlife Medicine, p. 459-461, 1999. ISSN 1042-7260.
198 OLIVEIRA, E. S. D. Desenvolvimento e aplicação de métodos sorológicos e
moleculares para o diagnóstico da doença de Newcastle em pombos comuns (Columba livia). 2013.
199 KOTHLOW, S. et al. Evaluation of Newcastle disease virus immunoassays for
waterfowl using a monoclonal antibody specific for the duck immunoglobulin light chain. Avian Pathology, v. 37, n. 3, p. 323-328, 2008. ISSN 0307-9457.
200 SHAFER, A.; KATZ, J.; EERNISSE, K. Development and validation of a competitive
enzyme-linked immunosorbent assay for detection of type A influenza antibodies in avian sera. Avian diseases, p. 28-34, 1998. ISSN 0005-2086.
201 ZHOU, E.-M. et al. Evaluation of a competitive ELISA for detection of antibodies
against avian influenza virus nucleoprotein. Avian diseases, p. 517-522, 1998. ISSN 0005-2086.
202 SNYDER, D. et al. Rapid serological profiling by enzyme-linked immunosorbent
assay. I. Measurement of antibody activity titer against Newcastle disease virus in a single serum dilution. Avian diseases, p. 161-170, 1983. ISSN 0005-2086.
203 CARDOSO, T. et al. A liquid phase blocking ELISA for the detection of antibodies
against infectious bronchitis virus. Brazilian journal of medical and biological research, v. 32, n. 6, p. 747-752, 1999. ISSN 0100-879X.
98
204 GROVES, D.; MORRIS, B. Review: Veterinary Sources of Nonrodent Monoclonal
Antibodies: Interspecific and Intraspecific Hybridomas. Hybridoma, v. 19, n. 3, p. 201-214, 2000. ISSN 0272-457X.
205 ALEXANDER, D. J. An overview of the epidemiology of avian influenza. Vaccine, v.
25, n. 30, p. 5637-44, Jul 26 2007. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17126960 >.
206 CHA, R. M.; YU, Q.; ZSAK, L. The pathogenicity of avian metapneumovirus subtype
C wild bird isolates in domestic turkeys. Virol J, v. 10, p. 38, 2013. ISSN 1743-422X (Electronic)
1743-422X (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23363433 >.
207 HOFLE, U.; BLANCO, J. M.; KALETA, E. F. Seroprevalence of avian paramyxovirus
1, 2, and 3 in captive and free-living birds of prey in Spain (preliminary results): implications for management of wild and captive populations. Ann N Y Acad Sci, v. 969, p. 213-6, Oct 2002. ISSN 0077-8923 (Print)
0077-8923 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12381594 >.
208 CHU, D. K. et al. Avian coronavirus in wild aquatic birds. J Virol, v. 85, n. 23, p.
12815-20, Dec 2011. ISSN 1098-5514 (Electronic)
0022-538X (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21957308 >.
209 HINES, N. L.; MILLER, C. L. Avian paramyxovirus serotype-1: a review of disease
distribution, clinical symptoms, and laboratory diagnostics. Vet Med Int, v. 2012, p. 708216, 2012. ISSN 2042-0048 (Electronic). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22577610 >.
210 TAYLOR, S. et al. A practical approach to RT-qPCR—publishing data that conform
to the MIQE guidelines. Methods, v. 50, n. 4, p. S1-S5, 2010. ISSN 1046-2023.
211 BUSTIN, S. A. et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of
quantitative real-time PCR experiments. Clinical chemistry, v. 55, n. 4, p. 611-622, 2009. ISSN 0009-9147.
212 VAN BORM, S. et al. A universal avian endogenous real-time reverse transcriptase-
polymerase chain reaction control and its application to avian influenza diagnosis and quantification. Avian Diseases, v. 51, n. 1 Suppl, p. 213-20, Mar 2007. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=17494556 >.
99
213 DE ALMEIDA, R. S. et al. New avian paramyxoviruses type I strains identified in Africa provide new outcomes for phylogeny reconstruction and genotype classification. PLoS One, v. 8, n. 10, p. e76413, 2013. ISSN 1932-6203 (Electronic)
1932-6203 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24204623 >.
214 HALL, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis
program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, v. 41, p. 95-8, 1999.
215 THOMPSON, J. D.; HIGGINS, D. G.; GIBSON, T. J. CLUSTAL W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, v. 22, n. 22, p. 4673-80, Nov 11 1994.
216 TAMURA, K. et al. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.
Mol Biol Evol, v. 30, n. 12, p. 2725-9, Dec 2013. ISSN 1537-1719 (Electronic)
0737-4038 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24132122 >.
217 MARTIN, D. P. et al. RDP3: a flexible and fast computer program for analyzing
recombination. Bioinformatics, v. 26, p. 2462-2246, 2010.
218 JOBB, G.; VON HAESELER, A.; STRIMMER, K. TREEFINDER: a powerful graphical
analysis enviromental for molecular phylogenetics. BMC Evol Biol, v. 4, p. 18, 2004.
219 FELSENSTEIN, J. Confidence-Limits on Phylogenies - an Approach Using the
Bootstrap. Evolution, v. 39, n. 4, p. 783-791, 1985. ISSN 0014-3820. Disponível em: < <Go to ISI>://A1985APJ8100007 >.
220 HASEGAWA, M.; KISHINO, H.; YANO, T. Dating of human-ape splitting by a
molecular clock of mitochondrial DNA. Journal of Molecular Evolution, v. 22, n. 2, p. 160-174, 1985.
221 YE, J. et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase
chain reaction. BMC Bioinformatics, v. 13, p. 134, 2012. ISSN 1471-2105 (Electronic)
1471-2105 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22708584 >.
222 BASTIEN, P.; PROCOP, G. W.; REISCHL, U. Quantitative real-time PCR is not more
sensitive than “conventional” PCR. Journal of Clinical Microbiology, v. 46, n. 6, p. 1897-1900, 2008. ISSN 0095-1137.
223 DIEL, D. G. et al. Genetic diversity of avian paramyxovirus type 1: proposal for a
unified nomenclature and classification system of Newcastle disease virus genotypes. Infect Genet Evol, v. 12, n. 8, p. 1770-9, Dec 2012. ISSN 1567-7257 (Electronic)
1567-1348 (Linking). Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22892200 >.
100
224 CECCHINATO, M. et al. Design, validation, and absolute sensitivity of a novel test
for the molecular detection of avian pneumovirus. J Vet Diagn Invest, v. 16, n. 6, p. 582-5, Nov 2004. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=15586577 >.
225 MAERTZDORF, J. et al. Real-time reverse transcriptase PCR assay for detection of
human metapneumoviruses from all known genetic lineages. J Clin Microbiol, v. 42, p. 981-986, 2004.
226 SCOTTER, J. M.; CHAMBERS, S. T. Comparison of galactomannan detection, PCR-
enzyme-linked immunosorbent assay, and real-time PCR for diagnosis of invasive aspergillosis in a neutropenic rat model and effect of caspofungin acetate. Clinical and diagnostic laboratory immunology, v. 12, n. 11, p. 1322-1327, 2005. ISSN 1556-6811.
227 LI, H. et al. Measurement of human cytomegalovirus loads by quantitative real-time
PCR for monitoring clinical intervention in transplant recipients. Journal of Clinical Microbiology, v. 41, n. 1, p. 187-191, 2003. ISSN 0095-1137.
228 HIERL, T. et al. Preliminary evaluation of one conventional nested and two real-time
PCR assays for the detection of Toxoplasma gondii in immunocompromised patients. Journal of medical microbiology, v. 53, n. 7, p. 629-632, 2004. ISSN 0022-2615.
229 HAFEZ, H. et al. Comparison of the specificity and sensitivity of PCR, nested PCR,
and real-time PCR for the diagnosis of histomoniasis. Avian diseases, v. 49, n. 3, p. 366-370, 2005. ISSN 0005-2086.
230 DAS, A. et al. Removal of real-time reverse transcription polymerase chain reaction
(RT-PCR) inhibitors associated with cloacal swab samples and tissues for improved diagnosis of avian influenza virus by RT-PCR. Journal of veterinary diagnostic investigation, v. 21, n. 6, p. 771-778, 2009. ISSN 1040-6387.
231 ICMBIO, I. C. M. D. C. D. B. AVES - SPOROPHILA FRONTALIS (VERREAUX, 1869)
- PIXOXÓ. 2003. Disponível em: < http://www.icmbio.gov.br/portal/biodiversidade/fauna-brasileira/lista-de-especies/5714-especie-5714.html >. Acesso em: 20 de fevereiro de 2015.
232 WIKIAVES. Mapa de registros da espécie pixoxó (Sporophila frontalis). Disponível
em: < http://www.wikiaves.com.br/mapaRegistros_pixoxo >. Acesso em: 20 de fevereiro de 2015.
233 SAKAI, K. et al. Serological and virological studies of Newcastle disease and avian
influenza in slaughter-age ostriches (Struthio camelus) in Japan. Journal of veterinary medical science, v. 68, n. 5, p. 491-494, 2006. ISSN 0916-7250.
101
234 THOMAZELLI, L. M. et al. Newcastle disease virus in penguins from King George Island on the Antarctic region. Veterinary microbiology, v. 146, n. 1, p. 155-160, 2010. ISSN 0378-1135.
235 ORSI, M. A. Caracterização Biológica, molecular, imunológica e estabilidade
térmica das estirpes vacinais e de isolados da doença de Newcastle de aves de produção industrial e migratórias no Brasil. 2010. 146 (PhD). Faculdade de Ciências Médicas, UNICAMP, Campinas.
236 ZANETTI, F. et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of
Newcastle disease virus isolates from healthy wild birds. Avian diseases, v. 49, n. 4, p. 546-550, 2005. ISSN 0005-2086.
237 JINDAL, N. et al. Phylogenetic analysis of Newcastle disease viruses isolated from
waterfowl in the upper midwest region of the United States. Virol J, v. 6, n. 1, p. 191, 2009. ISSN 1743-422X.
238 CAI, S. et al. Genetic characterization and evolutionary analysis of 4 Newcastle
disease virus isolate full genomes from waterbirds in South China during 2003–2007. Veterinary microbiology, v. 152, n. 1, p. 46-54, 2011. ISSN 0378-1135.
239 KIM, B.-Y. et al. Exchange of Newcastle disease viruses in Korea: the relatedness of
isolates between wild birds, live bird markets, poultry farms and neighboring countries. Infection, genetics and evolution, v. 12, n. 2, p. 478-482, 2012. ISSN 1567-1348.
240 KALETA, E.; ALEXANDER, D.; RUSSELL, P. The first isolation of the avian pmv‐1
virus responsible for the current panzootic in pigeons? Avian Pathology, v. 14, n. 4, p. 553-557, 1985. ISSN 0307-9457.
241 MILLER, P. J. et al. Antigenic differences among Newcastle disease virus strains of
different genotypes used in vaccine formulation affect viral shedding after a virulent challenge. Vaccine, v. 25, n. 41, p. 7238-7246, 2007. ISSN 0264-410X.
242 HU, S. et al. A vaccine candidate of attenuated genotype VII Newcastle disease virus
generated by reverse genetics. Vaccine, v. 27, n. 6, p. 904-910, 2009. ISSN 0264-410X.
243 XIAO, S. et al. Generation by reverse genetics of an effective, stable, live-attenuated
Newcastle disease virus vaccine based on a currently circulating, highly virulent Indonesian strain. PloS one, v. 7, n. 12, p. e52751, 2012. ISSN 1932-6203.
244 GOULD, A. R. et al. Virulent Newcastle disease in Australia: molecular
epidemiological analysis of viruses isolated prior to and during the outbreaks of 1998-2000. Virus Res, v. 77, n. 1, p. 51-60, Sep 2001. Disponível em: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Citation&list_uids=11451487 >.
102
245 SHENGQING, Y. et al. Generation of velogenic Newcastle disease viruses from a
nonpathogenic waterfowl isolate by passaging in chickens. Virology, v. 301, n. 2, p. 206-211, 2002. ISSN 0042-6822.
246 ALEXANDER, D.; PARSONS, G. Protection of chickens against challenge with the
variant virus responsible for Newcastle disease in 1984 by conventional vaccination. Veterinary Record, v. 118, n. 7, p. 176-177, 1986. ISSN 2042-7670.
247 ZANETTI, F.; BERINSTEIN, A.; CARRILLO, E. Effect of host selective pressure on
Newcastle disease virus virulence. Microbial pathogenesis, v. 44, n. 2, p. 135-140, 2008. ISSN 0882-4010.
248 WILSON, R. A. et al. An enzyme-linked immunosorbent assay that measures
protective antibody levels to Newcastle disease virus in chickens. Avian diseases, p. 1079-1085, 1984. ISSN 0005-2086.
249 MEULEMANS, G. et al. Diagnostic Serologique de la Maladie de Newcastle par les
Tests d'inhibition de l'Hemagglutination et Elisa Cinétique des différentes classes d'anticorps vaccinaux1. Zentralblatt für Veterinärmedizin Reihe B, v. 31, n. 1‐10, p. 690-700, 1984. ISSN 1439-0450.
250 SCHELLING, E. et al. Epidemiological study of Newcastle disease in backyard
poultry and wild bird populations in Switzerland. Avian Pathology, v. 28, n. 3, p. 263-272, 1999. ISSN 0307-9457.
251 MARTINEZ, J. et al. Detection of serum immunoglobulins in wild birds by direct
ELISA: a methodological study to validate the technique in different species using antichicken antibodies. Functional Ecology, v. 17, n. 5, p. 700-706, 2003. ISSN 1365-2435.
252 GARDNER, I.; HIETALA, S.; BOYCE, W. Validity of using serological tests for
diagnosis of diseases in wild animals. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics), v. 15, n. 1, p. 323-335, 1996. ISSN 0253-1933.
103
Anexo 1
104
105
106
107
Anexo 2
108
109
Anexo 3 Profa. Dra. Rachel Meneguello
Presidente Comissão Central de Pós-Graduação
Declaração
As cópias de artigos de minha autoria ou de minha co-autoria, já publicados ou submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congressos sujeitos a arbitragem, que constam da minha Dissertação de Mestrado, intitulada Soroepidemiologia, detecção
molecular e caracterização dos Paramixovírus aviários do tipo 1 (classe I e classe II) em
aves silvestres e sinantrópicas, não infringem os dispositivos da Lei n.° 9.610/98, nem o direito autoral de qualquer editora. Campinas, 30 /07 /2015 Autor Guilherme Pereira Scagion RG n.° 417576493 __________________________________ Orientadora Profa. Dra. Clarice Weis Arns RG n.° 5003366001