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Histologia dos órgãos e tecidos linfóides de galinhas poedeiras White Leghorn

Histology of organs and lymphoid tissues of white leghorn laying hens

Silas F. Eto1, Dayanne C. Fernandes1, Adriano M. Gonçalves2, Luiz F.J. dos Santos2, Julieta R.E. de Moraes1, João M.P. Junior2, Flávio R. de Moraes*1

1Departamento de Patologia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista Júlio Mesquita Filho, Unesp, Via Prof. Paulo Donato Castellane, Km 05, Jaboticabal, SP, CEP 14870-000 - São Paulo, Brasil

2Departamento de Tecnologia - Unesp - Jaboticabal, SP

Resumo: O sistema imune de aves é composto de células, molé-culas, órgãos e tecidos linfoides primários e secundários. O pre-sente trabalho teve como objetivo descrever as estruturas histo-morfológicas dos órgãos e tecidos linfoides de galinhas poedeiras da linhagem White Leghorn. Duas amostragens de aves foram analisadas, a primeira com 10 dias de vida para a coleta da bursa de Fabrícius e a segunda com 45 semanas de vida, para a reti-rada dos órgãos e tecidos linfoides reprodutores secundários. O material coletado foi processado para o preparo de lâminas his-tológicas, coradas pelo método de hematoxilina e eosina (HE) e as imagens capturadas em microscopia de luz e analisadas no software Motic®.

Palavras-chave: Aves, celular, humoral, órgãos linfoides, sistema imune.

Summary: The immune system of birds is composed of cells, molecules, organs and primary and secondary lymphoid tissues. Therefore the present work was to describe the structures histo-morphological lymphoid organs and tissues of laying hens of Whi-te Leghorn strain. Two samples of birds were analyzed, the first 10 days of life for the collection of primary lymphoid organs and tissues, the second with 45 weeks of life, for the removal of organs and tissues and secondary lymphoid breeding. The collected ma-terial was processed for histology and stained with hematoxylin and eosin (HE) and the images captured and analyzed by light microscopy.

Keywords: Birds, cellular, immune system, humoral, lymphoid

organs.

Introdução

O sistema imune das aves e seu funcionamento nor-mal dependem da presença de células derivadas da medula óssea que se desenvolvem nos órgãos linfóides primários. Os linfócitos B se diferenciam na bursa de Fabrícius, enquanto os linfócitos T, no timo. Na bursa de Fabrícius ocorre o desenvolvimento e a maturação dos linfócitos B e é semelhante à medula óssea dos ma-míferos com relação ao desenvolvimento de linfócitos

B (Sayegh e Ratcliffe, 2000; Otsubo et al., 2001; Scott, 2004).

O timo apresenta o microambiente ideal para o desen-volvimento de linfócitos T, gerando três sub-populações destas células, quais sejam, linfócitos T auxiliares, linfó-citos T citotóxicos e linfócitos T supressores, cada com sua função nas respostas imunes humoral e celular (Erf, 2004; Scott, 2004).

Além dos órgãos linfóides primários, existem os ór-gãos e tecidos linfóides secundários, estrategicamente distribuídos pelo corpo, para o melhor monitoramento do organismo pelo sistema imune. O baço é o único órgão linfóide secundário encapsulado encontrado em aves, gerando resposta imune a antígenos presentes na corrente circulatória (Ciriaco et al., 2003).

A presença de linfonodos na região poplítea, ao longo da veia femoral em galinhas poedeiras (Gallus gallus) foi descrita por Glick (1986).

Tecidos linfóides associados à mucosa (MALT) não são encapsulados, têm distribuição difusa na mucosa de vários órgãos, tais como intestino na região de íleo quando são denominados placas de Peyer, nas tonsilas cecais e glândula de Harderian (Ratcliffe, 2002).

No trato reprodutivo das aves são observados na re-gião de infundíbulo, útero e vagina (Leite e Viveiros, 2009). A presença de células B e a produção marcante de anticorpos IgY, IgM e IgA, nos tecidos linfóides as-sociados a mucosa, aparentemente está correlacionada com a concentração de estrógeno (Zheng et al., 2000).

Na imunidade inata de aves como na peritonite indu-zida pela carragenina em aves os resultados demonstra-ram o aumento de permeabilidade vascular de caráter monofásico. Os leucócitos polimorfonucleares predo-minam no exsudato apos 2 e 4 horas. e equilibraram-se com as mononucleares apos 24 horas, predominando o último tipo celular após 48 h. O maior acúmulo de cé-lulas polimorfo e mononucleares ocorreu após 4 e 24 horas, respectivamente (Hara et al., 1994).

A imunidade adaptativa em aves envolve os mecanis-mos humoral e o mediada por células. Enquanto a imu-nidade humoral responde particularmente a antígenos

*Correspondência: fruasmoraes@gmail.comTel: (0xx16) 32092662 ramal 204 / (0xx16) 997852072; Fax: (0xx16) 3202-5500

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extracelulares, a imunidade mediada por células respon-de a antígenos intracelulares, vírus e bactérias intracelu-lares (Erf, 2004).

O conhecimento da morfologia normal dos órgãos e tecidos linfoides primários e secundários é uma ferra-menta analítica morfométrica importante para a deter-minação da intensidade da resposta imune nesses locais.

Material e métodos

Aves

Foram utilizadas seis galinhas da linhagem White Leghorn, três com 10 dias de vida e três com 60 sema-nas de vida, adquiridas da Granja da Fazenda Escola da Faculdade de Medicina Veterinária, da Universidade Estadual de Londrina - PR - Brasil, que foram alimen-tadas com ração para aves e água a vontade. As aves apresentavam-se em idade reprodutiva, com 60 semanas de vida.

Coleta de amostra de sangue

A coleta de sangue foi realizada, pela punção da veia braquial como recomendado por Zander e Mallinson (1991). Após a coleta o sangue foi colocado em tu-bos de vidro com solução anticoagulante (EDTA 5%) e processado no Laboratório de Patologia Clínica do Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Londrina - PR.

Necropsia (Coleta de órgão linfóides )

Os animais foram sedados com éter etílico e sacrifica-dos pelo método de deslocamento cervical recomenda-do pela, American Veterinary Association.

A necropsia foi realizada pelo método recomendado por Zander; Mallinson, (1991). O animal foi colocado em decúbito dorsal, realizando uma incisão desde a clo-aca até a comissura do bico, dissecando a pele e muscu-latura expondo o abdômen e a região torácica.

Após a retirada os órgãos foram fixados em solução de Bouin aquoso e formol a 10% tamponado.

Exame histológico

Os órgãos foram fixados por 24 horas, e submetidos a desidratação, diafanização e inclusão em Paraplast, cor-tados em secções de 7 mm, corados com hematoxilina e eosina e analisados por microscopia de luz.

Resultados

Células Sanguíneas

As células mais abundantes nas aves são as hemácias. Estas células apresentam aproximadamente 12 mm de diâmetro, presença de núcleo central elíptico de croma-tina condensada levemente basofílico e citoplasma le-

vemente eosinofílico. O hematócrito realizado em um animal apresentou 31% e a dosagem de hemoglobina apresentou 8,5 g/dL.

Os heterófilos apresentaram núcleo multilobulado, cromatina condensada e citoplasma contendo grânulos esféricos e elípticos e representaram 80% dos leucócitos presentes no sangue.

Os eosinófilos têm seu núcleo multilobulado hete-rocromatina granulada e citoplasma com grânulos que corados em azul. A porcentagem de eosinófilos foi de 26%. Não se observou a presença de basófilos.

Os monócitos apresentaram núcleo periférico, elípti-co, ou reniforme, cromatina frouxa e citoplasma azu-lado. Sua porcentagem no sangue foi de aproximada-mente 1%.

Os linfócitos apresentaram núcleo central, cromatina densa, citoplasma escasso e pouco corado. A porcenta-gem de linfócitos no sangue foi de 40%.

Os trombócitos contem núcleo que toma todo o ci-toplasma, e são encontrados em agregados no sangue. A morfologia das células sanguíneas está apresentada na (Figura 1).

Timo

Macroscopicamente o timo apresenta coloração es-branquiçada, consistência friável e aproximadamente 0,5 cm de diâmetro.

Fig. 1 - Esfregaço sanguíneo de aves corado com H&E anali-sado em maior aumento. a) Monócito apresenta núcleo perifé-rico de forma elíptica, cromatina frouxa e citoplasma azulado. b) Agregados de trombócitos com núcleos que tomam todo o citoplasma. c) Linfócito com núcleo central, cromatina conden-sada, citoplasma escasso e pouco corado (seta fina), a seta gros-sa aponta uma hemácia com presença de núcleo central elíptico com cromatina condensada levemente basofílico e citoplasma levemente basofílico. d) A direita a flecha aponta um eosinófilo com núcleo multilobulado, heterocromatina granulada, citoplas-ma com grânulos que se tigem em azul rosado, a esquerda a seta grossa aponta um heterófilo com núcleo multilobulado, cromati-na condensada e citoplasma com grânulos esféricos e elípticos.

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Ao exame microscópico foi observada presença de uma cápsula de tecido conjuntivo denso envolvendo o órgão e septos do mesmo tecido que invadem o timo dividindo-o em lóbulos. A região mais externa cha-mada cortical é rica em linfócitos e apresenta extensa rede vasos sanguíneos, quando comparada com a re-gião medular (Figura 1). Em um dos animais o timo apresentava redução progressiva de células da região cortical e medular (Figura 2).

Fig. 2 - Corte histológico do timo corado com H&E visuali-zado em pequeno aumento. a) A seta mostra degeneração pro-gressiva da região cortical (C) para a medular (M). b) A seta fina mostra a cápsula de tecido conjuntivo denso, que invade o timo dividindo em lóbulos mostrados pela seta grossa, presen-ça de região cortical (C) rica em linfócitos quando comparada com a medular (M).

Bursa de Fabrícius

Macroscopicamente a bursa é um órgão em forma de bolsa localizada na região dorsal, na porção final da cloaca. Em um doa animais examinados a bursa apre-sentava aspecto de bolha, medindo aproximadamente 1,0 cm de diâmetro. Microscopicamente a bursa de Fabrícius é revestida internamente por um tecido epi-telial de revestimento simples e colunar, apoiado sobre tecido conjuntivo frouxo, com pouco colágeno e celu-laridade abundante, infiltrado por linfócitos e alguns plasmócitos (Figura 3).

Baço

O baço macroscopicamente apresenta coloração marrom avermelhada com aproximadamente 1,5 cm de comprimento e 0,5 cm de diâmetro.

Ao exame microscópico o baço apresentava uma cápsula de tecido conjuntivo denso, da qual partem septos. Observou-se regiões ricas em sinusóides, ma-crófagos e hemácias, correspondente a polpa vermelha e regiões onde há acúmulo de linfócitos, especialmente ao redor de pequenas arteríolas. Em alguns locais ob-servaram-se regiões mais claras, correspondentes aos centros germinativos, circundados por linfócitos com núcleo fortemente corado. Estes acúmulos de linfóci-tos próximos a arteríola correspondem à polpa branca. (Figura 4).

Fig. 3 - Corte histológico da Bursa de Fabrícius corado por H&E. a) Bursa de Fabrícius mostrada em pequeno aumento, a Bursa é revestida internamente por tecido epitelial simples colu-nar (seta fina), apoiado por tecido conjuntivo frouxo, mostrado pelo asterisco, a seta grossa aponta a dobra de tecido epitelial, local onde se localiza os folículos linfoides sub-epitelias. b) A seta mostra o tecido epitelial simples colunar em médio aumen-to. c) Infiltrado de linfócitos, no estroma em evidencia as seta aponta dois plasmócitos.

Fig. 4 - Corte histológico do Baço corado com H&E. a) Cápsula de tecido conjuntivo denso, a qual adentra o órgão formando septos (seta), região de polpa branca (PB) e polpa vermelha (PV) (menor aumento). b) A seta mostra a formação de septos, pela invasão do tecido conjuntivo denso (*) e região de polpa vermelha com pre-sença e hemácias coradas em vermelho intenso (médio aumento). c) Região de polpa branca (PB) e polpa vermelha (PV), arteríola central (seta grossa), com acúmulo de linfócitos formando a bai-nha linfoide periarteríolar (setas finas). Na região clara mostrada pelo asterisco, corresponde ao centro germinativo, circundado por linfócitos fortemente corados (maior aumento).

Órgãos linfóides associados às mucosas

Os órgãos linfóides associados à mucosa (MALT) fo-ram observados na região de tonsilas cecais, íleo e sis-tema reprodutor.

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Em alguns locais das tonsilas cecais e placa de Peyer havia saliências de coloração rosa pálido na superfí-cie dos órgãos nos locais correspondentes aos MALT. Microscopicamente o MALT é um aglomerado de te-cido linfóide não encapsulado, localizados no tecido conjuntivo abaixo do epitélio. Em alguns havia centros germinativos (Figura 5).

No sistema reprodutivo, na região de infundíbulo, observou-se tecido linfóide não encapsulado, com pre-sença de linfócitos e plasmócitos no interstício (Figura 6). Na vagina foi detectada a presença de linfócitos e plasmócitos no estroma (Figura 6).

Fig. 5 - Cortes histológico tonsilas cecais (a,b) e íleo (c,d) corados por H&E. a) O asterisco (*) mostra a região de mucosa e submu-cosa, a seta aponta aglomerados de tecido linfóide não encapsulado (pequeno aumento). b) O tecido linfóide não encapsulado, esta di-fusamente distribuído (asterisco) com presença de centros germina-tivos mostrado pela seta (médio aumento). c) Presença de Placas de Peyer no íleo, mostrado pelas setas. d) em maior aumento, a pre-sença de linfócitos e plasmócitos (seta), infiltrados no conjuntivo.

Fig. 6 - Corte histológico da região de infundíbulo (a,b) e va-gina (c,d) corados por H&E. a) A seta aponta para um tecido linfóide não encapsulado no infundíbulo (pequeno aumento). b) Presença de plasmócitos (seta) e vários linfócitos distribuídos no conjuntivo, tecido linfóide não encapsulados (asterisco) (grande aumento). c) corte histológico da vagina em pequeno aumento, epitélio ciliado pseudo estratificado colunar (asterisco), mus-cular do órgão e submucosa (seta). d) Presença de plasmócitos (seta) no tecido conjuntivo (grande aumento).

Discussão

Nos estudos hematológicos, os valores do hemogra-ma, leucograma e análise morfológica foram compatí-veis com a literatura consultada (Campbell, 2004).

Os estudos histológicos do timo mostraram a pre-sença de região de córtex e medula, com presença de cápsula de tecido conjuntivo, como mostrado na figura 1.1, como descrito por Glick (1986) e Ciriaco et al. (2003).

Segundo Ciriaco (2003) informações a respeito de mudanças estruturais e funcionais na involução do timo de aves são escassas e fragmentadas, mas nas galinhas estas alterações começam a aparecer com três meses de idade, com progressiva perda na área cortical. No entanto em um dos animais necropsiados observamos ainda a presença de região cortical bem organizada, enquanto em outro o timo havia sofrido completa involução. Em outro parte do órgão havia sido substituído por tecido adiposo. Isto sugere que mesmo entre galinhas de mesma idade e mesma raça a involução do timo ocorre de forma heterogênea entre os animais. Mas são necessários maior número de aves para confirmar esta hipótese.

A bursa de Fabrícius apresentava epitélio simples prismático, tecido conjuntivo frouxo e infiltrados de linfócitos e plasmócitos, mas não foi detectada a pre-sença de tecido linfóide associado ao epitélio. Este resultado é devido a involução deste órgão, já que os animais em estudo tinham 60 semanas de idade . Estes resultados corroboram os de Ciriaco et al. (2003).

O timo e a bursa de Fabrícius são os órgãos respon-sáveis pela maturação dos linfócitos B e T, mas apesar da involução com a idade, as galinhas apresentaram va-lores leucocitários normais para animais não infecta-dos que foram de 4.850 leucócitos totais/mm³ obtidos.

A histologia do baço revelou a presença de cápsula conjuntiva que penetrava no parênquima do órgão for-mando pequenas trabéculas. Observou-se a presença de polpa branca composta de artéria trabecular que se ramificava em arteríolas centro foliculares, envolvidas por bainha linfóide periarteriolar, formando centro germinativo adjacente à bainha linfóide periarteriolar eram semelhantes ao descrito por Yasuda et al. (2003).

A polpa vermelha é formada por sinusóides, cordões celulares, macrófagos, granulócitos, plasmócitos e cé-lulas interdigitais (Figura 1.3) (Yasuda et al., 2003).

Nas tonsilas cecais foram encontradas na mucosa e submucosa, regiões de criptas, muscular do órgão, célu-las epiteliais e presença de nódulos linfáticos não encap-sulados distribuídos difusamente, com presença de plas-mócitos migrando para o conjuntivo como descritos por (Glick, 1986; Hiroshi et al., 2000). Os nódulos linfáticos não encapsulados são importantes na defesa local contra a proliferação de microrganismos residentes. O baixo peristaltismo com acúmulo destes microrganismos seria a razão para este estrutura conter quantidade significati-va de tecido linfóide (Hiroi et al., 2000).

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A presença de nódulos linfáticos não encapsulados, e plasmócitos foram detectadas na região de íleo das aves como relatado por Payne (1971); Befus et al. (1980).

Nas observações do sistema reprodutivo das galinhas havia nódulos linfáticos não encapsulados na região de infundíbulo com presença de plasmócitos no estroma da mucosa, concordando com estudos realizados por (Zheng et al., 2000).

Na região de vagina foi detectada a presença de plas-mócitos no estroma da mucosa vaginal, comprovan-do a produção de imunoglobulinas nesta região e seu papel na defesa local como descrito por (Khan, et al., 1997; Zheng, et al., 2000).

No útero, no istmo e magno não foram encontrados presença de plasmócitos, sendo estas regiões respon-sáveis pela deposição de elementos ao ovo (Zheng, et al., 2000).

Os órgãos linfoides secundários provavelmente assu-mem o papel de manter os de linfócitos no sangue, já que os animais estudados mostraram valores normais no leucograma.

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