IDENTIFIKASI DNA DAN GEN RESISTEN TERHADAP VIRUS AI (AvianInfluenza) PADA ITIK PITALAH SEBAGAI SUMBER DAYA GENETIK

SUMATERA BARAT DENGAN PCR (Polymerase Chain Reaction)

ARTIKEL

Oleh :HENDRI PURWANTO

0921207022

PROGRAM PASCASARJANAUNIVERSITAS ANDALAS

PADANG2012

IDENTIFICATION DNA AND GENE RESISTANT THE VIRUS AI (AvianInfluenza) TO DUCK PITALAH ON GENETIC RESOURCES ASTHE WEST SUMATRA WITH PCR (Polymerase Chain Reaction)

by:Hendri Purwanto (0921207022)

Supervised by: Prof. Drh. Hj. Endang Purwati, MS., Ph.D. andProf. DR. Sumaryati Syukur, MSc

ABSTRACTPreservation of genetic resources is one way to maintain local property

owned by the Indonesian nation. Local wealth of Indonesia one of themoriginating from West Sumatra is a duck Pitalah contained in Jorong SulayanKenagarian Pitalah, Kenagarian Batipuah Atas and Kenagarian Batipuah Baruahin Tanah Datar District. Variables in this study is the identification of DNA andgenes of resistance to AI virus (Avian Influenza) in ducks Pitalah to know theprofile of DNA and the Mx gene in the duck Pitalah.

Materials used are DNA blood samples from 20 head Ducks Pitalahcomprising 10 females and 10 ducks male, as male comparators used shadow 2duck duck tail and a tail Kamang male. The study was conducted at theLaboratory of Biotechnology BPPV (Veterinary Investigation Center) BukittinggiRegional II Baso and Biotechnology Laboratory UNISEL (Universiti Selangor)Shah Alam, Selangor Malaysia. This research method that is the extraction ofDNA from blood samples, electrophoresis and PCR (Polymerase Chain Reaction)using the primer SMO7 F 5 'and '3 TTTTCACCCAGTTCACTTCAGCCSMO7 R 5' GATTCAAATTTGCCGCAGGATTA'3 for identification of DNAfollowed by DNA sequencing and BLAST analysis. Research for theidentification of resistance genes against the AI virus (Avian Influenza) or the Mxgene DQ788615: forward (F) 5'-GCACTGTCACCTCTTAATAGA-3'reverse (R) 5'-GTATTGGTAGGCTTTGTTGA -3'.

The results obtained that the DNA identification of ducks Pitalah with amolecular weight of 200 bp sekuen duck Pitalah femaleCAAACTAACCCTTTCTGACTGCATTGCTCTCTTCTGTTTTCTGCTTTCTAAATAAAGAGATGCACTTCTCACAAGTTAGTAGCCTGCCGCACGGAACCAAATCTGTGTGGGTGAAGTGAACTGGGTGAAAAAAAAAAand sekuen duck Pitalah maleGCCTGCCGCAGGGAACCTAATCTGTGTGG for the results of BLASTanalysis showed that the ducks Pitalah West Sumatra is still classified in the classof bird, but is not yet known name in the Gen bank BLAST data. Then for theresistance gene of AI virus (Avian Influenza) with a molecular weight of 50 bpwhich indicates that the ducks there Pitalah Mx gene as resevoar AI.Key words: duck Pitalah, identification DNA, gene resistance, AI (Avian

Influenza), PCR (Polymerase Chain Reaction)

PENDAHULUANTernak itik merupakan salah satu jenis ternak unggas penghasil telur dan

daging yang potensial. Populasi ternak itik tersebar diseluruh pelosok Nusantaramulai dari daerah perkotaan sampai pedesaan. Daging dan telur itik cukupdigemari oleh masyarakat Indonesia. Menurut Bharoto (2001) jenis-jenis itik diIndonesia adalah itik Tegal, itik Mojosari, itik Alabio, itik Manila (entok), dan itikBali. Penamaan dan pengelompokan jenis-jenis itik tersebut berdasarkan namadaerah tempat itik berkembang. Di Sumatera Barat itik lokal yang berkembangsebagai sumber daya genetik atau sumber daya genetik adalah itik Pitalah, itikKamang, dan itik Bayang. Harahap, Arbi, Tami, Azhari dan Bandaro (1980)menyatakan bahwa dilihat dari fenotip itik yang dipelihara di Sumatera Baratseperti itik di pulau Jawa yang berdarah Indian Runner.

Salah satu itik lokal di Sumatera Barat adalah itik Pitalah yang terletak diJorong Sulayan Kenagarian Pitalah Kecamatan Batipuah Kabupaten Tanah Datar.Pada umumnya masyarakat disini memelihara itik dengan cara tradisional yaitudengan dilepaskan begitu saja (ekstensif). Selain itu ada pula pemeliharaan semiintesif yaitu dengan dilepaskan dalam pekarangan yang dipagar, dan adapemeliharaan itik secara intensif. Ternak itik memiliki banyak kelebihandibandingkan dengan ternak unggas yang lainnya, diantaranya adalah ternak itiklebih tahan terhadap penyakit, sehingga pemeliharannya mudah dan kurangberisiko. Selain itu, itik memiliki efisiensi yang baik dalam mengubah pakanmenjadi daging yang baik (Akhadiarto, 2002).

Selain memiliki kelebihan-kelebihan di atas, itik Pitalah juga mempunyaibeberapa kelemahan. Kelemahan yang paling banyak dijumpai sulitnya

memperoleh bibit yang baik dan produksinya yang masih rendah. Adanyabeberapa kelemahan diatas maka dikhawatirkan populasi itik Pitalah yangmempunyai sifat-sifat dan penampilan genetik yang khas sebagai sumber dayagenetik itik lokal Sumatera Barat akan musnah. Oleh karena itu perlupengembangan selanjutnya untuk pelestarian sumber daya genetik itik Pitalah.

Sampai saat ini informasi karakteristik genetik itik Pitalah belumterdokumentasi secara lengkap, sehingga upaya penelaahan karakteristik genetikitik Pitalah yang ada di Sumatera Barat menjadi sangat penting dan mendasardalam rangka menunjang program konservasi sumber daya genetik. Salah satupendekatan yang dapat dilakukan untuk mengetahui informasi genetik itik Pitalahdi Sumatera Barat adalah dengan cara melihat karakteristik genetik kualitatif itiklokal tersebut serta mengidentifikasi kemurnian dari DNA itik Pitalah tersebutkemudian juga dilihat dari gen resistensi dari itik yang tahan terhadap Virus AI.

Karakteristik genetik itik Pitalah dapat diamati berdasarkan fenotip tubuhseperti: warna bulu, warna kulit badan, warna kaki/shank, bentuk paruh dan warnakerabang telur. Sifat-sifat genetik kualitatif dapat dijadikan patokan untukmenentukan suatu bangsa itik karena sifat tersebut banyak diatur genotip individu,sedangkan pengaruh faktor lingkungan sedikit sekali peranannya (Minkema,1987).

Unggas air seperti itik ini merupakan induk semang (hospes) alami virusAI, pada inang ini virus berada dalam keadaan seimbang dan tidak menimbulkanpenyakit, hanya pada keadaan tertentu saja dapat menimbulkan kematian padahewan ini. Adanya sifat resevoar dari ternak itik ini perlu dilakukan uji untukmendeteksi sifat resevoar dari itik pada itik Pitalah yang merupakan sumber daya

genetik dengan teknik molekuler. Hal ini berguna untuk memcari tindak lanjutdari sifat resevoar itik tersebut.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui profil DNA pada itik Pitalahdari identifikasi DNA dengan PCR dan untuk mengetahui gen resistensi (gen Mx)dari itik Pitalah terhadap virus AI (Avian Influenza). Kegunaan dari penelitian iniadalah : dapat diketahuinya kemurnian DNA pada itik Pitalah sesuai denganfenotip tubuhnya maka hal ini berguna untuk pengembangan dan pelestarian itikPitalah yang merupakan ternak lokal dan dapat diketahuinya gen resistensi padaitik Pitalah terhadap virus AI (Avian Influenza) hal ini berguna untukpengendalian penyakit AI.

MATERI DAN METODAMaterial DNA yang digunakan adalah sampel darah dari 20 ekor Itik

Pitalah yang terdiri dari 10 ekor itik betina dan 10 ekor itik jantan. Itik ini diambildari 3 (Tiga) Kenagarian yakni Jorong Sulayan Kenagarian Pitalah, KenagarianBatipuah Atas, Kenagarian Batipuah Baruah pada Kecamatan BatipuahKabupaten Tanah Datar, sebagai pembanding dipakai itik Bayang jantan 2 ekordan itik Kamang jantan 1 ekor. Penelitian dilakukan bulan Agustus 2011 sampaiDesember 2011 yang dilakukan di Laboratorium BPPV Baso Bukittinggi danLaboratorium Bioteknologi Universiti Selangor, Syah Alam Malaysia.

Alat dan Bahan PenelitianDalam penelitian ini menggunakan alat dan bahan yakni : jarum suntik

(Disposable Syringe, OneMed Health Care, PT. Jayamas Medica IndustriIndonesia 3 ml); EDTA (BD Vacutainer K2 EDTA (K2E) 5.4 mg plus BloodCollection Tubes, USA); Kit (Qiagen DNA blood extraction kit, USA); Agarose

(1st BASE); 10x TBE Buffer (1st BASE); Taq Polymerase (HelxAmp Taq DNAPolymerase with dNTP mix, Korea); Laminar Air Flow Captair bio by erlab(Biocap) France; PCR (Bio-Rad my cycler thermal cycler, USA); Gel Doc(red cell Bioscrences, USA); Elektroforesis ( Power Pac Basic, USA); Vortex(Fine Vortex, Fine PCR, Korea).MetodaEkstraksi Genom DNA (Romain, Ann, Loo, Hafiz, Iswadi and Mazni, 2011)Langkah-langkahnya :

1. Dimasukkan 20 l proteinase (Qiagen DNA blood extraction kit, USA)kedalam tube eppendorf yang ukuran 2 ml.

2. Ditambahkan 10 l sampel darah itik yang cair kedalam tube tersebutkemudian ditambahkan PBS (Phosphat Buffered Saline) sebanyak 150 l.

3. Ditambahkan 200 l Buffer AL (Lysis Buffer) dalam tube tersebut lalu divortex selama 10-15 detik.

4. Setelah itu dimasukkan dalam water bath dengan memakai pengapungagar tidak masuk air, dilakukan pada suhu 56C selama 10 menit.

5. Setelah dari water bath lalu ditambahkan 200 l ethanol (96 %) kemudiandi vortex selama 10 detik.

6. Di pipet semua cairan tersebut dan dimasukkan kedalam Dneasy Min SpinCoulum lalu di sentrifuse dengan kecepatan 1200 rpm selama 2 menit,setelah itu dibuang larutan bagian bawahnya bersama tube dan diganti tubedengan yang baru.

7. Ditambahkan buffer AW 1 (Wash Buffer 1) sebanyak 500 l dansentrifuse lagi dengan kecepatan 1200 rpm dalam waktu 2 menit, setelah

itu dibuang larutan bagian bawahnya dan ganti tube eppendorf. denganyang baru.

8. Ditambahkan buffer AW 2 (Wash Buffer 2) sebanyak 500 l dansentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 3 menit, lalu buang bagianbawah dan tinggal ekstrak DNA pada bagian saringan/ tube bagian ataslalu masukkan bagian bawah tube eppendorf.

9. Selanjutnya ditambahkan 200 l buffer AE (Elution Buffer) dan sentrifusedengan kecepatan 1500 rpm selama 3 menit.

10. Dalam hal ini telah didapatkan ekstraksi DNA pada bagian bawah yangditampung dengan tube eppendorf.

11. Setelah ekstraksi DNA dapat kemudian disimpan pada freezer suhu 5 Cuntuk mempertahankan kualitas dari DNA tersebut.

Elektroforesis (Romain, Ann, Loo, Hafiz, Iswadi and Mazni, 2011)Langkah-langkahnya :

1. Pembuatan agarose gel (SIGMA, USA):a. 0,8 % agarose gelb. Ditambahkan 1xTBE sebanyak 100 mlc. Dimasukkan dalam erlemeyer agarose gel dan 1x TBE tersebut

kemudian dihomogenkan hingga larut.d. Selanjutnya dipanaskan dalam microwave dengan temperature 59 C

selama 2 menite. Setelah itu dimasukkan Ethium Bromide 4 l/100ml.f. Setelah itu dimasukkan kedalam cetakan gel elektroforesis hingga

mengeras.

g. Setelah mengeras kom kemudian dimasukkan kedalam larutanelektroforesis.

2. Elektroforesisa. Dicampurkan ekstraksi DNA 5 l dan DNA loading 3 l (Fermentas).b. Diambil campuran tersebut hingga habis kemudian masukkan kedalam

well gel elektroforesis dengan arah well terletak pada aliran negatif(Anoda) dilakukan dengan hati-hati jangan sampai wellnya rusak

c. Setelah well elektroforesis dipasang dari aliran negatif (Anoda) kepositif (Katoda) kemudian disambungkan kepower supply.

d. Diatur power supply dengan 80 volt selama 1 jam dan diamati tiap10 menitnya.

e. Setelah itu dilihat dibawah UV untuk mengetahui band dari DNAtersebut.

Amplifikasi DNA dengan PCR (Polymerase Chain Reaction)

Identifikasi DNAAmplifikasi PCR yang dilakukan di Laboratorium BIO-IT Selangor

Universiti Selangor (UNISEL) Malaysia. Dalam amplifikasi PCR untukidentifikasi DNA itik yakni dengan menggunakan primer sesuai dari Ahmadi,Rahimi, Vafaei and Sayyazadeh (2007) SMO7 F 5TTTTCACCCAGTTCACTTCAGCC 3 dan SMO7 R 5GATTCAAATTTGCCGCAGGATTA 3 . Taq PCR yang digunakan adalahadari merk HelixAmp Taq DNA Polymerase.

Tabel 1. Komposisi Reaksi PCR untuk Identifikasi DNA itikNo. Komponen Volume per reaksi (l)1. Taq Polymerase 0.252. dNTP 1.03. Primer (F) 1.04. Primer (R) 1.05. 10 x buffer 5.06. TuneUp 5.07. Template DNA 0.58. sdH2O 36.25

Total 50

Tabel 2. Protokol PCR untuk suhu dan waktu sesuai primerTahapan Suhu (C) Waktu (detik) Jumlah siklus

Pemanasan Awal 95 120 1Denaturasi 95 20 40Annealing 59.1 40Extension 72 10Pemanasan Akhir 72 300 1Penyimpanan 4 Tak hingga 1

Analisis Data SekuensingAnalisis data sekuensing dilakukan dengan menggunakan program

software DNA star. Untuk analisa sequence alignment, dilakukan denganmembandingkan sekuens yang diperoleh (query) dengan yang telah ada padaGene Bank dengan database searches NCBI internet site(http//www.ncbi.nlm.nih.gov) menggunakan BLAST (Basic Local AlignmentSearch Tool) (Mustopa, 2009 dalam Sumarni, 2011).

Identifikasi Gen Resistensi Terhadap Virus AI (Avian Influenza)

Dalam amplifikasi PCR untuk identifikasi Gen Resistensi Avian Influenzayakni dengan menggunakan primer sesuai dari Sironi, Ramelli, Williams andMariani (2010) berdasarkan urutan genom Mx Nomor aksesi No. DQ788615 :

forward (F) 5-GCACTGTCACCTCTTAATAGA-3 reverse (R) 5-GTATTGGTAGGCTTTGTTGA-3. Taq PCR yang digunakan adalah darimerk HelixAmp Taq DNA Polymerase.Tabel 3. Komposisi Reaksi PCR untuk Identifikasi Gen Resistensi Avian

InfluenzaNo. Komponen Volume per reaksi (l)1. Taq Polymerase 0.252. dNTP 1.03. Primer (F) 1.04. Primer (R) 1.05. 10 x buffer 5.06. TuneUp 5.07. Template DNA 1.08. sdH2O 35.75

Total 50

Tabel 4. Protokol PCR untuk suhu dan waktu sesuai primerTahapan Suhu (C) Waktu (detik) Jumlah siklus

Pemanasan Awal 95 120 1Denaturasi 95 20 40Annealing 53.5 40Extension 72 10Pemanasan Akhir 72 300 1Penyimpanan 4 Tak hingga 1

HASIL DAN PEMBAHASANLokasi Pengambilan Sampel Darah Itik

Lokasi pengambilan sampel darah untuk diteliti bertempat di KabupatenTanah Datar tepatnya pada Jorong Sulayan Kenagarian Pitalah, KenagarianBatipuah Atas dan Kenagarian Batipuah Baruah pada Kecamatan Batipuah.Pengambilan sampel ini didasarkan bahwa itik Pitalah lebih banyak dipelihara diDaerah Pitalah Kabupaten Tanah Datar. Hal ini sesuai dengan pendapat Sabrina,Husmaini dan Ciptaan (2009) yang menyatakan Pitalah dahulunya merupakansatu kenagarian, yang sekarang sudah terpecah menjadi beberapa desa. Di

kenagarian Pitalah terdapat sumber daya genetik itik lokal yaitu itik Pitalah yangmempunyai ciri spesifik, produktivitas tinggi dan adaptif terhadap lingkunganyang kurang baik.

Gambar 1. Lokasi Pengambilan Sampel Jorong Sulayan Di Kenagarian PitalahKecamatan Batipuah Kabupaten Tanah Datar (Sumber: Peta TanahDatar, 2010)

Karakterisasi dari Itik Pitalah, Itik Bayang dan Itik KamangDalam penelitian morfologi dari itik Pitalah dan sebagai pembanding itik

Bayang dan Kamang juga diamati yaitu dapat terlihat pada tampilan Gambar 8berikut ini :

Gambar 2. Salah satu Itik Pitalah Betina yang dipakai untuk penelitian

Lokasi Pengambilansampel

Dari Gambar 2 tersebut dapat dilihat bahwa iti Pitalah betina berwarnacoklat bintik-bintik hitam, dengan kaki hitam serta paruh berwarna hitam.Karakterisasi itik ini sesuai dengan cirri-ciri itik Pitalah kebanyakan yang telahdipelihara oleh peternak.

Gambar 3. Salah satu Itik Pitalah jantan yang dipakai untuk penelitian

Dari Gambar 3 dapat dilihat bahwa untuk itik Pitalah jantan berbedadengan itik Pitalah betina. Karakterisasi dari itik Pitalah jantan adalah sebagaiberikut yakni bulunya nkuning kehitam-hitaman dengan paruh berwarna hitam.Bulu kepala hitam campur kehijau-hijauan. Suhaemi (2007) mengemukakan ciri ciri beberapa itik lokal Sumatera Barat seperti Itik Pitalah ciri cirinya adalah :(a) Itik betina dewasa (periode bertelur) warna bulu sangat dominan hitam denganlurik coklat tua, dan warna paruh hitam; (b) Itik jantan dewasa warna kepala hijaukeemasan dengan warna bulu sangat dominan abu abu, mulai dari leher sampaiekor, dan pada bagian bulu di ujung sayap dan ekor berwarna hitam, denganwarna paruh coklat. Ditambahkan dari peraturan menteri pertanian (2011) bahwasifat kualitatif dari itik Pitalah adalah : a) postur tubuh ramping agak tegak, waktuberjalan posisi tubuh mendatar; b) warna bulu itik dewasa : jantan: abu-abudengan kemilau kecokelatan dan betina: dominan warna belang jerami yaitu lurik

cokelat tua/kehitaman dengan cokelat muda atau lurik cokelat muda dengancokelat tua/kehitaman; c) warna ceker dan paruh : jantan: abu-abu kehitaman danbetina: cokelat kehitaman.

Sebagai pembanding dalam penelitian digunakan itik Bayang dan itikKamang yang dapat dilihat seperti pada gambar berikut ini :

Gambar 4 . Itik Kamang jantan yang dipakai penelitian sebagai pembanding

Gambar 5. Itik Bayang jantan yang dipakai dalam penelitian sebagai pembandingItik yang digunakan dalam penelitian tersebut yang mana itik Pitalah dibeli

dari Pitalah Nagari Batipuah kabupaten Tanah Datar, itik Bayang dari BayangPesisir Selatan serta itik Kamang dari Kamang Bukittinggi. Setelah itu itiktersebut dipelihara di Dharmasraya tepatnya di Desa Piruko Utara Kecamatan

Sitiung Kenagarian Sitiung dengan pemeliharaan intensif secara terpisah. MenurutIsmoyowati (2008) itik lokal merupakan salah satu sumber daya genetik ternakIndonesia. Upaya pelestarian dan pengembangan itik lokal harus diupayakan gunamempertahankan keberadaan sumber daya genetik ternak Indonesia yang telahberadaptasi dengan lingkungan setempat. Itik merupakan penghasil daging, telurdan juga bulu, itik dapat hidup dan berkembang biak dengan pakan yangsederhana sesuai dengan potensi wilayah.Ekstraksi DNA dari Darah Itik

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dalam mengektraksi DNA darisampel darah itik Pitalah jantan dan betina serta sebagai pembanding itik Bayangdan Kamang dapat dilihat pada gambar hasil elektroforesis berikut ini :

Gambar 6. Ekstraksi DNA darah Itik Pitalah betina 5 sampel dan jantan 2 sampelserta itik jantan Bayang 1 sampel dengan menggunakan Agarose 8 %

Keterangan : M : Marker 1 Kbp1 : Sampel darah Itik Pitalah Betina Pada Kandang I c2 : Sampel darah Itik Pitalah Betina Pada Kandang I e3 : Sampel darah Itik Pitalah Betina Pada Kandang II b4 : Sampel darah Itik Pitalah Betina Pada Kandang II c5 : Sampel darah Itik Pitalah Betina Pada Kandang III c6 : Sampel darah Itik Pitalah Jantan Pada Kandang IV a7 : Sampel darah Itik Pitalah Jantan Pada Kandang IV b8 : Sampel darah Itik Bayang Jantan Pada Kandang C

100 bp200 bp300 bp

1500 bp1000 bp500 bp

1 2 3 4 5 6 7 8

Dari hasil ekstraksi DNA daripada darah itik tersebut maka didapatkan 23sampel yang terdeteksi oleh gel elektroforesis yakni 20 sampel dari itik Pitalahbetina dan jantan serta sebagai pembanding diambil 2 sampel itik Bayang jantandan 1 sampel itik Kamang. Dalam ekstraksi DNA ini dilakukan di LaboratoriumBioteknologi BPPV Baso Bukittinggi. Ekstraksi DNA dari sampel darah itik yangtelah dilakukan rata-rata 1000 1500 bp ini merupakan DNA stok yang akandipakai untuk amplifikasi PCR dan dilanjutkan ke sekuensing. Hal ini sesuaidengan pendapat Martn, Garca, Fajardo, Calleja, Rojas, Pavn, Hernndez,Gonzlez and Martn (2007)yang menyatakan bahwa ekstraksi DNA adalahlangkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisis DNAsequencing. Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutanbasa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sampel itu sendiri,dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengankualitas tinggi dari berbagai jenis sampel memiliki tantangan tersendiri, danmetode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan/tissue (termasukdarah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sampel ditanganiatau disimpan sebelum diekstrak.Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuranmekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Menurutpendapat Martn, Garca, Fajardo, Calleja, Rojas, Pavn, Hernndez, Gonzlezand Martn (2007) menyatakan bahwa baik metode ekstraksi manual maupunotomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasiDNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya, freeze-thaw yang

berulang-ulang dan di vortex. Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikianrupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sampel.Amplifikasi PCR untuk Identifikasi DNA Itik

Dari hasil ekstraksi DNA tersebut kemudian dilanjutkan denganamplifikasi PCR yang dilakukan di Laboratorium BIO-IT Selangor UniversitiSelangor (UNISEL) Malaysia. Hasil running elektroforesis dari PCR untukidentifikasi DNA adalah sebagai berikut :

Gambar 7. Running elektroforesis PCR produk DNA itik 10 sampel denganmenggunakan Agarose 8 %

Keterangan : M 1 : marker 50 bp1 : itik jantan Pitalah pada kandang I A2 : itik betina Pitalah pada kandang I A3 : itik betina Pitalah pada kandang I B4 : itik betina Pitalah pada kandang I D5 : itik betina Pitalah pada kandang I E6 : itik jantan Pitalah pada kandang II A7 : itik betina Pitalah pada kandang II B8 : itik betina Pitalah pada kandang II C9 : itik betina Pitalah pada kandang II D10 : itik jantan Pitalah pada kandang III AM 2 : marker 100bp

M 1 M 21 2 3 4 5 6 7 8 9 10

200 bp

50 bp

500 bp

200 bp100 bp

500 bp

Hasil amplifikasi PCR dari identifikasi DNA itik Pitalah didapatkan besarmolekul DNA 200 bp dan juga sama pada itik Bayang dan itik Kamang. Darihasil tersebut dapat digunakan untuk kegiatan sekuensing pada tahap berikutnya.Hal ini sesuai dengan pendapat Ahmadi, Rahimi, Vafaei and Sayyazadeh (2007)yang menyatakan bahwa populasi itik memiliki marker dengan berat molekul 182bp dan 205 bp.

Pada proses elektroforesis kapiler, produk-produk reaksi cycle sequencingdiinjeksikan secara elektrokinetik ke dalam kapiler yang diisi dengan polimer.Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatannegatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif.Dengan diberikannya tegangan listrik tinggi maka fragmen DNA yang bermuatannegatif akan bergerak melalui polimer di dalam kapiler menuju elektroda positif.Hal ini sesuai dari hasil kutipan Sciencebiotek (2009) yang menyatakan bahwaElektroforesis kapiler dapat memisahkan molekul DNA yang memiliki perbedaanbobot molekul hanya satu nukleotida.Sekuensing DNA Itik

Proses sekuensing DNA itik Pitalah, itik Bayang dan itik Kamang yangdiperoleh dari kegiatan amplifikasi dilakukan oleh Perusahaan LaboratoriumVivantis Malaysia. Hasil sekuensing berupa grafik elektrophoregram denganpeak-peak yang berwarna-warni untuk membedakan jenis basa nitrogen(nukleotida) yang dicirikannya. Nukleotida A (Adenin) berwarna hijau, nukleotidaG (Guanin) berwarna hitam, C (Citosin) nukleotida berwarna biru dan nukleotidaT (Timin) berwarna merah. Hal ini sesuai dengan pendapat Ratnayani, Wirajana

dan Laksmiwati (2007) yang menyatakan bahwa Pola warna sekuen yang samajuga sesuai dengan hasil penelitian sekuensing nukleotida pada DNA.

Hasil data sekuensing yang diperoleh dari kedua sampel dieditmenggunakan software DNASTAR (Madison Wisconsin-USA) dan dikontrolsecara manual. Berdasarkan Gambar 20 - 23, dapat dilihat bahwa kedua peak yangdihasilkan cukup baik sehingga lambang N yang merupakan lambang untuksimbol A, G, C, dan T yang muncul tidak banyak. Kontrol lambang nukleotiddilakukan dengan memperhatikan pola puncak-puncak tertinggi dari puncaklainnya. Jika terjadi keraguan maka penentuan jenis nukleotidnya difokuskandengan memperkecil terjadinya variasi dari runutan nukleotid dengan sampelyang lain. Sesuai dengan pendapat Jamsari (2007) yang menyatakan bahwaproporsi jumlah basa G,C dan A akan selalu sama dengan jumlah basa T.

Gambar 8. Hasil Sekuensing DNA dari Itik Pitalah Betina

Gambar 9. Hasil Sekuensing DNA dari Itik Pitalah Jantan

Gambar 10. Hasil elektrophoregram sekuen DNA Itik Pitalah Betina setelahdilakukan pengeditan

Gambar 11. Hasil elektrophoregram sekuen DNA Itik Pitalah Jantan setelahdilakukan pengeditan

Dari hasil elektrophoregram sekuen DNA diatas setelah dilakukanpengeditan dapat diurutkan sekuennya sesuai yang terdapat pada tabel 6 dibawah

ini. Urutan sekuen yang telah dilakukan pengeditan antara masing-masing itikberbeda ini akan dilihat dalam proses selanjutnya yakni analisis BLAST untukmengetahui perbedaan atau kesamaan antara itik tersebut.Table 5. Urutan Sekuen DNA ItikNo Jenis Itik Urutan Sekuen1. Itik Pitalah

BetinaCAAACTAACCCTTTCTGACTGCATTGCTCTCTTCTGTTTTCTGCTTTCTAAATAAAGAGATGCACTTCTCACAAGTTAGTAGCCTGCCGCACGGAACCAAATCTGTGTGGGTGAAGTGAACTGGGTGAAAAAAAAAA

2. Itik PitalahJantan

GCCTGCCGCAGGGAACCTAATCTGTGTGG3. Itik Bayang

JantanACACACACACAAGACAACTAACCCTTTCTGAGTGCATTGCTCTTCTGTTTTCTGCTTTCAAAATAAAGAGATGCACTTTCAGAAGTTAGTAGCCGCCGCAGGGAACCGAATCTGTGTGCTGAA GTGAACTGGGTGAAAAAG

4. ItikKamangJantan

CTAACCCTCTCTGACTGCATGGCTCTCTCCTGTTTTCTGCTTGCTAAAAAAATAGATGCACTTCTCTCAAATAAGTAGCCTGCCGGACGGAAGCAACTCTGTGTGTGTGAAGGGAACTGGGTGAAAAAAAAAT

Dari Tabel 5 tersebut dapat dinyatakan bahwa urutan sekuaen masing-masing itik tidak terlalu berbeda tetapi masih dalam satu spesies.yang mana antaraitik Pitalah dengan itik Bayang dan itik Kamang urutan sekuennya berbeda tapimasih ada kemiripan. Hal ini sesuai dengan pendapat Mirza dan Kurniasih (2002)yang menyatakan bahwa urutan nukleotida dari spesies yang sama tidakmenunjukkan perbedaan, tetapi spesies yang berbeda memiliki urutan yangberbeda pula.Analisis BLAST Sekuen DNA Itik

Analisis BLAST dilakukuan dengan tujuan untuk membandingkan datasekuen yang dimiliki dari hasil penelitian dengan sekuen-sekuen DNA dariberbagi penjuru dunia dari unggas yang didepositkan pada database atau gen bank

sekuen publik. Analisis BLAST dilakukan secara on line pada website NCBIhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.Tabel 6. Hasil Analisis BLAST

Gambar 12. Pohon filogenetik dari itik penelitian yang ada di databank BLAST.

Dari Gambar 12 dapat dilihat bahwa filogenetik yang didapatkan dariBLAST pada sampel yang diteliti merupakan hasil baru yang mana itik Pitalah,Bayang dan Kamang merupakan kelas dari bird (aves). Hal ini sesuai denganpendapat Mirza dan Kurniasih (2002) yang menyatakan bahwa urutan nukleotidadari spesies yang sama tidak menunjukkan perbedaan, tetapi spesies yang berbedamemiliki urutan yang berbeda pula.

Identifikasi Gen Resistensi AI (Avian Influenza)Hasil running elektroforesis dari PCR untuk identifikasi gen resistensi

terhadap virus AI (Avian Influenza) pada itik terlihat bahwa terdapat gen Mx rata-rata dengan besar molekul 50 bp.adalah sebagai berikut :

Gambar 13. PCR untuk identifikasi Gen Resistensi Avian Influenza 14 sampelKeterangan : M 1 : marker 50 bp

1 : itik jantan Pitalah pada kandang I A2 : itik betina Pitalah pada kandang I A3 : itik betina Pitalah pada kandang I B4 : itik betina Pitalah pada kandang I C5 : itik betina Pitalah pada kandang I E6 : itik jantan Pitalah pada kandang II A7 : itik betina Pitalah pada kandang II A8 : itik betina Pitalah pada kandang II B9 : itik betina Pitalah pada kandang II C10 : itik jantan Pitalah pada kandang III B11 : itik jantan Pitalah pada kandang III C

M 1 M 21 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

200 bp

50 bp

500 bp200 bp100 bp

500 bp

12 : itik betina Pitalah pada kandang III C13 : itik jantan Pitalah pada kandang IV B14 : itik betina Pitalah pada kandang IV BM 2 : marker 100 bp

Hasil penelitian dengan rata-rata besar molekul 50 bp ini merupakanidentifikasi bahwa pada itik penelitian bisa terdeteksi gen Mx yang masih adasebagai resevoar pada virus AI. Hal ini sesuai dengan pendapat Li, Qu, Hou, Yao,Xu, and Yang (2007) yang menyatakan bahwa Mx protein, yang memberikanresistensi untuk orthomyxovirus, telah terdeteksi di beberapa organisme, dan satunonsynonymous substitusi (S631N) dari protein Mx ayam telah ditunjukkanmempengaruhi resisten kegiatan untuk virus AI secara in vitro. Panjang penuhpada ayam gen Mx mencakup sekitar 21 kb, dengan 13 ekson pada kromosom 1dari genome.

KESIMPULAN DAN SARANKesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :1. Identifikasi DNA dari itik Pitalah didapatkan berat molekul DNA 200 bp

dengan hasil sekuensing dan analisis BLAST itik Pitalah masih dalamtergolong dalam kelas aves tapi belum diketahui namanya di Genbank dataBLAST.

2. Identifikasi gen resistensi terhadap virus AI (Avian Influenza) denganmenggunakan primer spesifik gen Mx dapat mendeteksi adanya gen resistensiAI sehingga itik tersebut masih merupakan resevoar terhadap virus AI danjuga itik Bayang dan itik Kamang terdeteksi gen resistensinya sebagairesevoar AI.

SaranDisarankan kepada peneliti selanjutnya bahwa dengan adanya profile

DNA ini nantinya bisa dilakukan penelitian lanjutan untuk mengidentifikasi jenisspesies itik Pitalah tersebut dengan desain primer dari sekuen yang telahdidapatkan guna untuk pengembangan lebih lanjut sumber daya genetik itik diSumatera Barat. Selanjutnya agar dilakukan penelitian tentang penangananpenyakit AI pada itik tersebut baik dengan probiotik atau Biosecurity yanglainnya.

DAFTAR PUSTAKAAhmadi, A. K., G. Rahimi, A. Vafaei and H. Sayyazadeh. 2007. Microsatellite

Analysis of Genetic Diversity in Pekin (Anas platyrhynchos) andMuscovy (Cairina moschata) Duck Populations. International Journalof Poultry Science 6 (5); 376-382.ISSN 1682-8356.

Balai Penelitian Ternak LIPI. 2005. Gen Mx+ sebagai penyeleksi resistensi fluburung. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian Vol.27, No.5,2005. Ciawi, Bogor.

Batty, J. 1985. Domesticated Ducks and Geese. 2 nd ED. Francier Suppliers. Ltd,England.

Bennet, P. 2000. Microsatellites. J.Clin.Pathol:Mol.Pathol ;53:177-183Bharoto, K.D. 2001. Cara Berternak Itik. Aneka Ilmu, Semarang.Chen H, Deng G, Li Z, Tian G, Li Y, Jiao P, Zhang L, Liu Z, Webster RG and Yu

K. 2004. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southernChina. Proc Natl Acad Sci USA 101: 10452-10457.

Dillon, D. and Jonathan R. 2010. Mx gene diversity and influenza associationamong five wild dabbling duck species (Anas spp.) in Alaska. InfectGenet Evol. 2010 October ; 10(7): 10851093.doi:10.1016/j.meegid.2010.07.004. 1 Institute of Arctic Biology,University of Alaska Fairbanks, Fairbanks, Alaska, USA.

Fanani, M. Z. 2011. Teknologi Analisis Molekular Menggunakan MetodeRestriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): AplikasinyaDalam Diagnosis Molekular Spesies Candida. Program MagisterKimia, Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga. Mulyorejo,Surabaya.

Gilbert, M., Chaitaweesub P, Parakamawongsa T, Premashthira S, Tiensin T,Kalpavidh W, Wagner H and Slingenbergh J. 2006. Free-grazing duckand highly pathogenic avian influenza, Thailand. Emerg Infect Dis12:56-62

Gunawan, B. 1988. Teknologi pemuliaan itik petelur Indonesia. ProsidingSeminar Peternakan Nasional dan Forum Peternakan Unggas danAneka Ternak II. BPT -Ciawi - Bogor.

Harahap., D, A. Arbi, D. Tami, W. Azhari dan Dj. Dt. T. Bandaro. 1980.Pengaruh manajemen terhadap produksi telur itik di Sumatra Barat.P3T Universitas Andalas, Padang.

Hardjosworo, P. S. 1985. Konservasi ternak asli. Fakultas Peternakan., InstitutPertanian Bogor, Bogor.

Hulse-Post DJ, Sturm-Ramirez KM. and Humberd J. 2005. Role of domesticducks in the propagation and biological evolution of highly pathogenicH5N1 influenza viruses in Asia. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:10682-7. Abstract: http://amedeo.com/lit.php?id=16030144.

Hutt, F.B. 1949. Genetic of Fowl, Mc-Grow-Hill Book Company Inc, New York,Taronto, London.

Ismoyowati. 2008. Kajian deteksi produksi telur itik Tegal melalui polimorfismeprotein darah. Animal Production, Mei 2008, hlm. 122 128, ISSN1411 2027, Vol. 10, No. 2. Fakultas Peternakan, Universitas JendralSoedirman, Purwokerto.

Jamsari, 2007. Bioteknologi Pemula. Prinsip Dasar dan Aplikasi AnalisisMolekuler. UNRI Press. Pekanbaru. Hal: 74-76.

Minkema, D. 1987. Dasar Genetika dan Pembudidayaan Ternak. Bhatara KaryaAksara, Jakarta.

Mirza, I. Dan Kurniasih. 2002. Identifikasi Molekuler Eurytrema sp. Pada Sapi DiIndonesia. Jurnal Bioteknologi Pertanian Vol. 7 No. 1. 2002 pp 25-31.

Miswati, Y. 2010. Kerakterisasi molekuler virus avian influenza subtipe H5N1pada itik (Anseriformes) dan ayam (Gallus domesticus) di provinsiSumatera Barat dan Riau. Tesis. Program Pascasarjana, UniversitasAndalas. Padang.

Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda, Bogor.Murphy, B. R. and R. G. Webster. 1996. Orthomyxovirus. in : Fields Virology. B.

N. Fields, D. M. Knipe and P. M. Howley (Eds). 3rd Ed, Ippincott-Raven. Philadelphia. Pp. 1397-1445.

Mustopa, A. 2009. Koleksi Protokol Laboratorium Virologi Molekuler. PusatPenelitian Bioteknologi. Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia, Bogor.

Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics.: Columbia University Press.New York.

Peta Tanah Datar. 2010. padang-today.com. Diakses pada 20 Februari 2011. Jam17.00 WIB.

Pratiwi, R. 2001. Mengenal metode elektroforesis. Oscana, Vol. XXVI, No. 1,2001, hlm. 25 31, ISSN 0216-1877. Balitbang Biologi Laut,Puslitbang Oseanologi-LIPI, Jakarta.

Purwati, E. 2003. Molecular characterization of Listeria spp. isolated from beef,chiken and fermented fish in Malaysia. Disertation, Doctor ofPhilosophy, Universiti Putra Malaysia, Malaysia.