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Imagerie 4D de la circulation sanguine chez la larve dupoisson-zegravebre par holographie numeacuterique en illumination

multipleAlexey Brodoline Nithin Rawat Daniel Alexandre Nicolas Cubedo Michel

Gross

To cite this versionAlexey Brodoline Nithin Rawat Daniel Alexandre Nicolas Cubedo Michel Gross Imagerie 4Dde la circulation sanguine chez la larve du poisson-zegravebre par holographie numeacuterique en illuminationmultiple HOLOPHI5 5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologiedes fluides Nov 2018 Montpellier France hal-01927531

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

Imagerie 4D de la circulation sanguine chez la larve dupoisson-zegravebre par holographie numeacuterique en illumination

multiple

Alexey Brodoline1 Nithin Rawat1 Daniel Alexandre1 Nicolas Cubedo2 Michel Gross1

1 Laboratoire Charles Coulomb (L2C) Univ Montpellier CNRS Montpellier France 2 Meacutecanismes Moleacuteculaires dans les Deacutemences Neurodeacutegeacuteneacuteratives (MMDN) Univ Montpellier INSERM Montpellier France

alexeybrodolineumontpellierfr danielalexandreumontpellierfr michelgrossumontpellierfr

MOTS CLEacuteSDigital holographic Microscopy (DHM) multi illuminations imagerie 3D

RESUME

Une configuration de microscopie holographique qui utilise trois faisceaux dillumination estproposeacutee Elle permet dimager en 3D la positions des globules rouges en mouvement agrave partirdun hologramme ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins perfuseacute agrave partir duneseacutequence dhologrammes

I INTRODUCTION

Les techniques dimagerie du flux sanguin des microvaisseaux sont largement utiliseacuteespour la recherche biomeacutedicale et le diagnostic clinique Cependant la plupart des techniquesexistantes sont invasives car elles requiegraverent des agents de contraste Les deacuteveloppementsreacutecents des techniques dholographie numeacuterique et dholographie laser Doppler permettent dereacuteduire ce problegraveme [1] Il est eacutegalement possible dutiliser lholographie laser Doppler dansune geacuteomeacutetrie de microscopie en transmission [2]

Nous proposons ici daller plus loin en effectuant une holographie laser Doppler entransmission du flux sanguin qui utilise trois faisceaux dillumination orienteacutes dans deuxdirections diffeacuterentes Le dispositif proposeacute permet alors dameacuteliorer la reacutesolution suivant zEn effet en seacutelectionnant numeacuteriquement les signaux correspondant agrave chacun des faisceauxdillumination nous avons pu obtenir trois hologrammes agrave partir desquels nous avons pucalculer pour chaque illumination la carte 3D deacutecrivant lintensiteacute du champ en tout point(xyz) Les points correspondant aux maxima des produits des intensiteacutes des 3 cartes ont eacuteteacuteseacutelectionneacutes en utilisant un algorithme type cleaning Nous ainsi obtenu une carte 3D desmaxima que nous avons identifieacute aux diffuseurs en mouvement cest-agrave-dire aux globulesrouges Cette proceacutedure a eacuteteacute reacutepeacuteteacutee pour chaque pas en temps t et a permis dobtenir unereconstruction 4D (xyz et t) des globules rouges en mouvement

La technique a eacuteteacute valideacutee en imageant la micro circulation sanguine des embryons depoisson zegravebre

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

II MATERIELS ET METHODES

Figure 1 (a partie gauche) Dispositif de microscopie holographique avec une triple illumination de lrsquoobjet Les trois voies sont maintenues agrave des intensiteacutes eacutegales avec un filtre agrave densiteacute neutre ND(b partie droite) Transformeacutee de Fourier drsquoun hologramme obtenu avec le dispositif agrave trois illuminations Les ordres 0 +1 et 1 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterencemutuelle entre les trois faisceaux drsquoillumination (E1E2E3) est agrave lrsquoorigine drsquoun ordre 0 tregraves eacutetenduspatialement Si le hors-axe nrsquoest pas suffisant les ordres croiseacutes peuvent se chevaucher avec lrsquoordre+1 Lrsquoeacutechantillon est de la poudre de lait dilueacutee dans lrsquoeau

Le dispositif expeacuterimental (voir Fig 1 (a) est constitueacute dun microscope droit qui a eacuteteacutemodifieacute pour le transformeacute en dispositif de microscopie holographique Le faisceau laserprincipal est diviseacute par un seacuteparateur de faisceau en deux bras (illumination et reacutefeacuterence) Lebras dillumination (de champ E) est diviseacute agrave nouveau en trois faisceaux de maniegravere agrave eacuteclairerleacutechantillon suivant 3 directions diffeacuterentes Leacutechantillon imageacute est un embryon de poissonzegravebre (48 HPF) placeacute entre lame et lamelle Les trois faisceaux dillumination traversentleacutechantillon et sont collecteacutes par un objectif de microscope MO (douverture numeacuterique NA =050 et de grandissement G = 20) comme le montre la Fig 1 (b) Un second seacuteparateur defaisceau recombine le champ E issu de leacutechantillon avec le champ de reacutefeacuterence ELO Cesecond seacuteparateur de faisceau est inclineacute angulairement de maniegravere agrave reacutealiser une holographiehors axe La cameacutera (2560 x 2160 pixels CAM =50 Hz 12 bits ou 1280 x 1024 CAM =200Hz 10 bits suivant les cas) enregistre le motif dinterfeacuterence I = |E+ELO |2 La cameraenregistre des seacutequences de ~256 images In avec n=0 agrave 255

Les donneacutees enregistreacutees sont placeacutees sur une grille de calcul plus grande (2560x2560ou 1280 x 1280) initialement vide (zeacutero padding) Pour seacutelectionner le signal correspondant agravechaque illumination nous avons reconstruit le champ dans le plan focal arriegravere de lobjectifMO (plan de la pupille) Pour imager lors des reacuteglages la lumiegravere diffuseacutee par toutleacutechantillon la reconstruction est reacutealiseacutee agrave partir dhologrammes impliquant des diffeacuterencesdimages qui donnent H=0 si lorsque les images succesives sont identiques (par exemple H=I0+I1-I2-I3)

A partir des hologrammes H nous avons calculeacute le champ dans le plan de la pupille deMO Limage de la pupille est situeacutee en haut agrave gauche de la grille de calcul de poisson zegravebre(voir Fig 1 b) On observe 3 points lumineux qui correspondent aux pattern dinterfeacuterence des

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

Figure 2 ndash Quelques eacutetapes de reconstruction dans le cas de lrsquoillumination agrave trois faisceaux(a) Transformeacutee de Fourier de lrsquohologramme (b) Seacutelection de lrsquoordre +1 (c) Seacutelection des3 illuminations (b) Image reconstruite dans le plan objet conjugueacute de la cameacutera

3 illuminations Etant donneacute que ces 3 points lumineux sont bien seacutepareacutes dans lespace deFourier il possible de seacuteparer la contribution de chaque illumination en seacutelectionnant 3 zonescentreacutes sur chacun des points lumineux comme cela est illustreacute par la Fig2 Ces zones sontdes hologrammes qui peuvent servir agrave reconstruire le champ de lobjet Ils correspondent auxzones rouge verte et bleue de la fig2 c La reconstruction holographique est alors faite agravepartir des hologrammes correspondant agrave chacune de ces 3 zones (rouge verte et bleue) Lafigure 2d montre par exemple limage reconstruite dans le plan objet conjugueacute de la cameacutera pourles 3 hologrammes

La reconstruction 3D de la position des globules rouges en mouvement est alors faite par unalgorithme de type cleaning A chaque iteacuteration nous effectuons pour chacun des 3 hologrammes(rouge vert et bleu de la Fig 2c) 3 series de reconstructions pour tous les plans z qui entourentleacutechantillon Nous seacutelectionnons ensuite dans les 3 cubes de donneacutees reconstruites les points ougrave leproduit des 3 intensiteacutes est maximum Les points seacutelectionneacutes sont sauvegardeacute dans un cube dedonneacutees de reacutesultats A chaque iteacuteration la contribution des points seacutelectionneacutes est enleveacute des 3hologrammes rouge vert et bleu qui ont servi agrave faire la reconstruction dans tous les plansLhologramme est ainsi nettoyeacute dougrave le nom de cleaning pour lalgorithme de reconstruction Ainsi agravechaque iteacuteration leacutenergie des trois hologrammes diminue alors que le cube de donneacute de reacutesultats serempli Lorsquil ne reste plus que ~20 de leacutenergie de deacutepart dans les 3 hologrammes les calculssont arreacuteteacutes

Figure 3 ndash Image 3D de la position des globules rouges obtenue par lalgorithme de nettoyage agrave partir dun seul hologramme Les vues correspondent agrave une rotation de 0deg (a) et 50deg (b)

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La figure 3 montre une image 3D des globules rouges qui a eacuteteacute obtenue par lalgorithme de nettoyage agravepartir dun seul hologramme En effectuant la reconstruction 3D de cleaning avec une seacuterie dimages etdhologramme et en sommant des images 3D dintensiteacute on peut obtenir limage 3D des vaisseaux sanguins perfuseacutes La figure 4 montre un exemple dimage 3D obtenues ainsi

Figure4 ndash Poisson-zegravebre de 5 jours Images reacutealiseacutees avec la triple illumination et la cameacuteraAndor de 2560x2160 pixels (ab) Deux points de vue diffeacuterents (c) vue transversale La visualisation 3D est faite avec ImageJ (plugin 3D Viewer)

CONCLUSIONS

Nous proposons une technique qui combine holographie numeacuterique microscopie en transmission triple illumination de leacutechantillon et reconstruction par un algorithme de type ldquoCleaningrdquo Cette technique nous a permis dimager en 3D la positions des globules rouges enmouvement agrave partir dun hologramme ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins perfuseacute agrave partir dune seacutequence dhologrammes

REMERCIEMENTS

Nous remercions le Labex Numev (convention ANR-10-LABX-20) n 2014-1-042 et leCNRS (Micro Holo 4D Deacutefi Instrumentation aux limites 2018 CNRS) pour le financementde ce travail

REacuteFEacuteRENCES

[1] O Sakurada C Kennedy J Jehle J Brown G L Carbin and L Sokoloff ldquoMeasurement oflocal cerebral blood flow with iodo [14c] antipyrinerdquo American Journal of Physiology-Heart andCirculatory Physiology 234 H59ndashH66 (1978)[2] M Atlan M Gross B C Forget T Vitalis A Rancillac and A K Dunn ldquoFrequency-domain

wide-field laser doppler in vivo imagingrdquo Optics letters 31 2762ndash2764 (2006)[3] N Verrier D Alexandre and M Gross ldquoLaser doppler holographic microscopy in transmission

application to fish embryo imagingrdquo Optics express 22 9368ndash9379 (2014)[4] F Le Clerc L Collot and M Gross ldquoNumerical heterodyne holography with two-dimensional

photodetector arraysrdquo Optics letters 25 716ndash718 (2000)

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

[5] D Alexandre G Lutfalla and M Gross ldquoHolographic imaging of zebrafish embryo blood flowwith dually oriented illumination beamsrdquo in ldquoDigital Holography and Three-DimensionalImagingrdquo (Optical Society of America 2015) pp DTh2Andash6

[6] M Gross N Verrier and P Picart ldquoFish embryo multimodal imaging by laser doppler digitalholographyrdquo in ldquoSignal Recovery and Synthesisrdquo (Optical Society of America 2014) ppJTu4Andash7

[7] D Donnarumma A Brodoline D Alexandre and M Gross ldquoBlood flow imaging in zebrafish bylaser doppler digital holographyrdquo (2016) Manuscript submitted for publication

[1]Zwick S A amp Plesset M S (1954) On the dynamics of small vapor bubbles in liquid J Math Phys 33 308-330

• I INTRODUCTION
• CONCLUSIONS
• Remerciements
• ReacuteFeacuteRENCES

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II MATERIELS ET METHODES

Figure 1 (a partie gauche) Dispositif de microscopie holographique avec une triple illumination de lrsquoobjet Les trois voies sont maintenues agrave des intensiteacutes eacutegales avec un filtre agrave densiteacute neutre ND(b partie droite) Transformeacutee de Fourier drsquoun hologramme obtenu avec le dispositif agrave trois illuminations Les ordres 0 +1 et 1 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterence 10485761 sont seacutepareacutes gracircce agrave la configuration hors-axe Lrsquointerfeacuterencemutuelle entre les trois faisceaux drsquoillumination (E1E2E3) est agrave lrsquoorigine drsquoun ordre 0 tregraves eacutetenduspatialement Si le hors-axe nrsquoest pas suffisant les ordres croiseacutes peuvent se chevaucher avec lrsquoordre+1 Lrsquoeacutechantillon est de la poudre de lait dilueacutee dans lrsquoeau

Le dispositif expeacuterimental (voir Fig 1 (a) est constitueacute dun microscope droit qui a eacuteteacutemodifieacute pour le transformeacute en dispositif de microscopie holographique Le faisceau laserprincipal est diviseacute par un seacuteparateur de faisceau en deux bras (illumination et reacutefeacuterence) Lebras dillumination (de champ E) est diviseacute agrave nouveau en trois faisceaux de maniegravere agrave eacuteclairerleacutechantillon suivant 3 directions diffeacuterentes Leacutechantillon imageacute est un embryon de poissonzegravebre (48 HPF) placeacute entre lame et lamelle Les trois faisceaux dillumination traversentleacutechantillon et sont collecteacutes par un objectif de microscope MO (douverture numeacuterique NA =050 et de grandissement G = 20) comme le montre la Fig 1 (b) Un second seacuteparateur defaisceau recombine le champ E issu de leacutechantillon avec le champ de reacutefeacuterence ELO Cesecond seacuteparateur de faisceau est inclineacute angulairement de maniegravere agrave reacutealiser une holographiehors axe La cameacutera (2560 x 2160 pixels CAM =50 Hz 12 bits ou 1280 x 1024 CAM =200Hz 10 bits suivant les cas) enregistre le motif dinterfeacuterence I = |E+ELO |2 La cameraenregistre des seacutequences de ~256 images In avec n=0 agrave 255

Les donneacutees enregistreacutees sont placeacutees sur une grille de calcul plus grande (2560x2560ou 1280 x 1280) initialement vide (zeacutero padding) Pour seacutelectionner le signal correspondant agravechaque illumination nous avons reconstruit le champ dans le plan focal arriegravere de lobjectifMO (plan de la pupille) Pour imager lors des reacuteglages la lumiegravere diffuseacutee par toutleacutechantillon la reconstruction est reacutealiseacutee agrave partir dhologrammes impliquant des diffeacuterencesdimages qui donnent H=0 si lorsque les images succesives sont identiques (par exemple H=I0+I1-I2-I3)

A partir des hologrammes H nous avons calculeacute le champ dans le plan de la pupille deMO Limage de la pupille est situeacutee en haut agrave gauche de la grille de calcul de poisson zegravebre(voir Fig 1 b) On observe 3 points lumineux qui correspondent aux pattern dinterfeacuterence des

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Figure 2 ndash Quelques eacutetapes de reconstruction dans le cas de lrsquoillumination agrave trois faisceaux(a) Transformeacutee de Fourier de lrsquohologramme (b) Seacutelection de lrsquoordre +1 (c) Seacutelection des3 illuminations (b) Image reconstruite dans le plan objet conjugueacute de la cameacutera

3 illuminations Etant donneacute que ces 3 points lumineux sont bien seacutepareacutes dans lespace deFourier il possible de seacuteparer la contribution de chaque illumination en seacutelectionnant 3 zonescentreacutes sur chacun des points lumineux comme cela est illustreacute par la Fig2 Ces zones sontdes hologrammes qui peuvent servir agrave reconstruire le champ de lobjet Ils correspondent auxzones rouge verte et bleue de la fig2 c La reconstruction holographique est alors faite agravepartir des hologrammes correspondant agrave chacune de ces 3 zones (rouge verte et bleue) Lafigure 2d montre par exemple limage reconstruite dans le plan objet conjugueacute de la cameacutera pourles 3 hologrammes

La reconstruction 3D de la position des globules rouges en mouvement est alors faite par unalgorithme de type cleaning A chaque iteacuteration nous effectuons pour chacun des 3 hologrammes(rouge vert et bleu de la Fig 2c) 3 series de reconstructions pour tous les plans z qui entourentleacutechantillon Nous seacutelectionnons ensuite dans les 3 cubes de donneacutees reconstruites les points ougrave leproduit des 3 intensiteacutes est maximum Les points seacutelectionneacutes sont sauvegardeacute dans un cube dedonneacutees de reacutesultats A chaque iteacuteration la contribution des points seacutelectionneacutes est enleveacute des 3hologrammes rouge vert et bleu qui ont servi agrave faire la reconstruction dans tous les plansLhologramme est ainsi nettoyeacute dougrave le nom de cleaning pour lalgorithme de reconstruction Ainsi agravechaque iteacuteration leacutenergie des trois hologrammes diminue alors que le cube de donneacute de reacutesultats serempli Lorsquil ne reste plus que ~20 de leacutenergie de deacutepart dans les 3 hologrammes les calculssont arreacuteteacutes

Figure 3 ndash Image 3D de la position des globules rouges obtenue par lalgorithme de nettoyage agrave partir dun seul hologramme Les vues correspondent agrave une rotation de 0deg (a) et 50deg (b)

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La figure 3 montre une image 3D des globules rouges qui a eacuteteacute obtenue par lalgorithme de nettoyage agravepartir dun seul hologramme En effectuant la reconstruction 3D de cleaning avec une seacuterie dimages etdhologramme et en sommant des images 3D dintensiteacute on peut obtenir limage 3D des vaisseaux sanguins perfuseacutes La figure 4 montre un exemple dimage 3D obtenues ainsi

Figure4 ndash Poisson-zegravebre de 5 jours Images reacutealiseacutees avec la triple illumination et la cameacuteraAndor de 2560x2160 pixels (ab) Deux points de vue diffeacuterents (c) vue transversale La visualisation 3D est faite avec ImageJ (plugin 3D Viewer)

CONCLUSIONS

Nous proposons une technique qui combine holographie numeacuterique microscopie en transmission triple illumination de leacutechantillon et reconstruction par un algorithme de type ldquoCleaningrdquo Cette technique nous a permis dimager en 3D la positions des globules rouges enmouvement agrave partir dun hologramme ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins perfuseacute agrave partir dune seacutequence dhologrammes

REMERCIEMENTS

Nous remercions le Labex Numev (convention ANR-10-LABX-20) n 2014-1-042 et leCNRS (Micro Holo 4D Deacutefi Instrumentation aux limites 2018 CNRS) pour le financementde ce travail

REacuteFEacuteRENCES

[1] O Sakurada C Kennedy J Jehle J Brown G L Carbin and L Sokoloff ldquoMeasurement oflocal cerebral blood flow with iodo [14c] antipyrinerdquo American Journal of Physiology-Heart andCirculatory Physiology 234 H59ndashH66 (1978)[2] M Atlan M Gross B C Forget T Vitalis A Rancillac and A K Dunn ldquoFrequency-domain

wide-field laser doppler in vivo imagingrdquo Optics letters 31 2762ndash2764 (2006)[3] N Verrier D Alexandre and M Gross ldquoLaser doppler holographic microscopy in transmission

application to fish embryo imagingrdquo Optics express 22 9368ndash9379 (2014)[4] F Le Clerc L Collot and M Gross ldquoNumerical heterodyne holography with two-dimensional

photodetector arraysrdquo Optics letters 25 716ndash718 (2000)

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[5] D Alexandre G Lutfalla and M Gross ldquoHolographic imaging of zebrafish embryo blood flowwith dually oriented illumination beamsrdquo in ldquoDigital Holography and Three-DimensionalImagingrdquo (Optical Society of America 2015) pp DTh2Andash6

[6] M Gross N Verrier and P Picart ldquoFish embryo multimodal imaging by laser doppler digitalholographyrdquo in ldquoSignal Recovery and Synthesisrdquo (Optical Society of America 2014) ppJTu4Andash7

[7] D Donnarumma A Brodoline D Alexandre and M Gross ldquoBlood flow imaging in zebrafish bylaser doppler digital holographyrdquo (2016) Manuscript submitted for publication

[1]Zwick S A amp Plesset M S (1954) On the dynamics of small vapor bubbles in liquid J Math Phys 33 308-330

• I INTRODUCTION
• CONCLUSIONS
• Remerciements
• ReacuteFeacuteRENCES

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Figure 2 ndash Quelques eacutetapes de reconstruction dans le cas de lrsquoillumination agrave trois faisceaux(a) Transformeacutee de Fourier de lrsquohologramme (b) Seacutelection de lrsquoordre +1 (c) Seacutelection des3 illuminations (b) Image reconstruite dans le plan objet conjugueacute de la cameacutera

3 illuminations Etant donneacute que ces 3 points lumineux sont bien seacutepareacutes dans lespace deFourier il possible de seacuteparer la contribution de chaque illumination en seacutelectionnant 3 zonescentreacutes sur chacun des points lumineux comme cela est illustreacute par la Fig2 Ces zones sontdes hologrammes qui peuvent servir agrave reconstruire le champ de lobjet Ils correspondent auxzones rouge verte et bleue de la fig2 c La reconstruction holographique est alors faite agravepartir des hologrammes correspondant agrave chacune de ces 3 zones (rouge verte et bleue) Lafigure 2d montre par exemple limage reconstruite dans le plan objet conjugueacute de la cameacutera pourles 3 hologrammes

La reconstruction 3D de la position des globules rouges en mouvement est alors faite par unalgorithme de type cleaning A chaque iteacuteration nous effectuons pour chacun des 3 hologrammes(rouge vert et bleu de la Fig 2c) 3 series de reconstructions pour tous les plans z qui entourentleacutechantillon Nous seacutelectionnons ensuite dans les 3 cubes de donneacutees reconstruites les points ougrave leproduit des 3 intensiteacutes est maximum Les points seacutelectionneacutes sont sauvegardeacute dans un cube dedonneacutees de reacutesultats A chaque iteacuteration la contribution des points seacutelectionneacutes est enleveacute des 3hologrammes rouge vert et bleu qui ont servi agrave faire la reconstruction dans tous les plansLhologramme est ainsi nettoyeacute dougrave le nom de cleaning pour lalgorithme de reconstruction Ainsi agravechaque iteacuteration leacutenergie des trois hologrammes diminue alors que le cube de donneacute de reacutesultats serempli Lorsquil ne reste plus que ~20 de leacutenergie de deacutepart dans les 3 hologrammes les calculssont arreacuteteacutes

Figure 3 ndash Image 3D de la position des globules rouges obtenue par lalgorithme de nettoyage agrave partir dun seul hologramme Les vues correspondent agrave une rotation de 0deg (a) et 50deg (b)

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La figure 3 montre une image 3D des globules rouges qui a eacuteteacute obtenue par lalgorithme de nettoyage agravepartir dun seul hologramme En effectuant la reconstruction 3D de cleaning avec une seacuterie dimages etdhologramme et en sommant des images 3D dintensiteacute on peut obtenir limage 3D des vaisseaux sanguins perfuseacutes La figure 4 montre un exemple dimage 3D obtenues ainsi

Figure4 ndash Poisson-zegravebre de 5 jours Images reacutealiseacutees avec la triple illumination et la cameacuteraAndor de 2560x2160 pixels (ab) Deux points de vue diffeacuterents (c) vue transversale La visualisation 3D est faite avec ImageJ (plugin 3D Viewer)

CONCLUSIONS

Nous proposons une technique qui combine holographie numeacuterique microscopie en transmission triple illumination de leacutechantillon et reconstruction par un algorithme de type ldquoCleaningrdquo Cette technique nous a permis dimager en 3D la positions des globules rouges enmouvement agrave partir dun hologramme ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins perfuseacute agrave partir dune seacutequence dhologrammes

REMERCIEMENTS

Nous remercions le Labex Numev (convention ANR-10-LABX-20) n 2014-1-042 et leCNRS (Micro Holo 4D Deacutefi Instrumentation aux limites 2018 CNRS) pour le financementde ce travail

REacuteFEacuteRENCES

[1] O Sakurada C Kennedy J Jehle J Brown G L Carbin and L Sokoloff ldquoMeasurement oflocal cerebral blood flow with iodo [14c] antipyrinerdquo American Journal of Physiology-Heart andCirculatory Physiology 234 H59ndashH66 (1978)[2] M Atlan M Gross B C Forget T Vitalis A Rancillac and A K Dunn ldquoFrequency-domain

wide-field laser doppler in vivo imagingrdquo Optics letters 31 2762ndash2764 (2006)[3] N Verrier D Alexandre and M Gross ldquoLaser doppler holographic microscopy in transmission

application to fish embryo imagingrdquo Optics express 22 9368ndash9379 (2014)[4] F Le Clerc L Collot and M Gross ldquoNumerical heterodyne holography with two-dimensional

photodetector arraysrdquo Optics letters 25 716ndash718 (2000)

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[5] D Alexandre G Lutfalla and M Gross ldquoHolographic imaging of zebrafish embryo blood flowwith dually oriented illumination beamsrdquo in ldquoDigital Holography and Three-DimensionalImagingrdquo (Optical Society of America 2015) pp DTh2Andash6

[6] M Gross N Verrier and P Picart ldquoFish embryo multimodal imaging by laser doppler digitalholographyrdquo in ldquoSignal Recovery and Synthesisrdquo (Optical Society of America 2014) ppJTu4Andash7

[7] D Donnarumma A Brodoline D Alexandre and M Gross ldquoBlood flow imaging in zebrafish bylaser doppler digital holographyrdquo (2016) Manuscript submitted for publication

[1]Zwick S A amp Plesset M S (1954) On the dynamics of small vapor bubbles in liquid J Math Phys 33 308-330

• I INTRODUCTION
• CONCLUSIONS
• Remerciements
• ReacuteFeacuteRENCES

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

La figure 3 montre une image 3D des globules rouges qui a eacuteteacute obtenue par lalgorithme de nettoyage agravepartir dun seul hologramme En effectuant la reconstruction 3D de cleaning avec une seacuterie dimages etdhologramme et en sommant des images 3D dintensiteacute on peut obtenir limage 3D des vaisseaux sanguins perfuseacutes La figure 4 montre un exemple dimage 3D obtenues ainsi

Figure4 ndash Poisson-zegravebre de 5 jours Images reacutealiseacutees avec la triple illumination et la cameacuteraAndor de 2560x2160 pixels (ab) Deux points de vue diffeacuterents (c) vue transversale La visualisation 3D est faite avec ImageJ (plugin 3D Viewer)

CONCLUSIONS

Nous proposons une technique qui combine holographie numeacuterique microscopie en transmission triple illumination de leacutechantillon et reconstruction par un algorithme de type ldquoCleaningrdquo Cette technique nous a permis dimager en 3D la positions des globules rouges enmouvement agrave partir dun hologramme ainsi que la structure 3D des vaisseaux sanguins perfuseacute agrave partir dune seacutequence dhologrammes

REMERCIEMENTS

Nous remercions le Labex Numev (convention ANR-10-LABX-20) n 2014-1-042 et leCNRS (Micro Holo 4D Deacutefi Instrumentation aux limites 2018 CNRS) pour le financementde ce travail

REacuteFEacuteRENCES

[1] O Sakurada C Kennedy J Jehle J Brown G L Carbin and L Sokoloff ldquoMeasurement oflocal cerebral blood flow with iodo [14c] antipyrinerdquo American Journal of Physiology-Heart andCirculatory Physiology 234 H59ndashH66 (1978)[2] M Atlan M Gross B C Forget T Vitalis A Rancillac and A K Dunn ldquoFrequency-domain

wide-field laser doppler in vivo imagingrdquo Optics letters 31 2762ndash2764 (2006)[3] N Verrier D Alexandre and M Gross ldquoLaser doppler holographic microscopy in transmission

application to fish embryo imagingrdquo Optics express 22 9368ndash9379 (2014)[4] F Le Clerc L Collot and M Gross ldquoNumerical heterodyne holography with two-dimensional

photodetector arraysrdquo Optics letters 25 716ndash718 (2000)

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

[5] D Alexandre G Lutfalla and M Gross ldquoHolographic imaging of zebrafish embryo blood flowwith dually oriented illumination beamsrdquo in ldquoDigital Holography and Three-DimensionalImagingrdquo (Optical Society of America 2015) pp DTh2Andash6

[6] M Gross N Verrier and P Picart ldquoFish embryo multimodal imaging by laser doppler digitalholographyrdquo in ldquoSignal Recovery and Synthesisrdquo (Optical Society of America 2014) ppJTu4Andash7

[7] D Donnarumma A Brodoline D Alexandre and M Gross ldquoBlood flow imaging in zebrafish bylaser doppler digital holographyrdquo (2016) Manuscript submitted for publication

[1]Zwick S A amp Plesset M S (1954) On the dynamics of small vapor bubbles in liquid J Math Phys 33 308-330

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• Remerciements
• ReacuteFeacuteRENCES

5egraveme rencontre francophone drsquoholographie numeacuterique appliqueacutee agrave la meacutetrologie des fluides 7-8 novembre 2018- Universiteacute de Montpellier Montpellier France

[5] D Alexandre G Lutfalla and M Gross ldquoHolographic imaging of zebrafish embryo blood flowwith dually oriented illumination beamsrdquo in ldquoDigital Holography and Three-DimensionalImagingrdquo (Optical Society of America 2015) pp DTh2Andash6

[6] M Gross N Verrier and P Picart ldquoFish embryo multimodal imaging by laser doppler digitalholographyrdquo in ldquoSignal Recovery and Synthesisrdquo (Optical Society of America 2014) ppJTu4Andash7

[7] D Donnarumma A Brodoline D Alexandre and M Gross ldquoBlood flow imaging in zebrafish bylaser doppler digital holographyrdquo (2016) Manuscript submitted for publication

[1]Zwick S A amp Plesset M S (1954) On the dynamics of small vapor bubbles in liquid J Math Phys 33 308-330

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