immucor transplant diagnostics, inc. documents/lc1618cero.2 - mia... · 2016-12-15 · 20. sferele...

Pagina1 din 15 LC1618CERO.2 (11/16) Drepturi de autor © 2016, Immucor Transplant Diagnostics, Inc. Toate drepturile rezervate.

Immucor Transplant Diagnostics, Inc. 550 West Avenue, Stamford, CT 06902 SUA

Tel: +1(203) 328-9500 sau (888) 329-0255, Fax: +1(203) 328-9599 WWW.IMMUCOR.COM

Documentaţie despre produs şi traduceri disponibile la: www.Immucor.com

Kit de tipizare MIA FORA™ NGS HLA A se utiliza pentru diagnosticarea in vitro

CUPRINS

Definirea simbolurilor………………..…………………. 1 Recoltarea şi prepararea probelor………………….… 4

Reactivii în funcţie de număr de catalog……………... 2 Procedură…………………………………………..…… 5

Domeniul de utilizare…………………………………… 3 A. Materialele furnizate………………………...….… 5

Sumar şi explicaţie………………….………………….. 3 B. Materialele necesare, dar care nu sunt furnizate…………………………………..

5

Principiile procedurii……………………………………. 3 Instrucţiuni de utilizare…………………………………. 5

Reactivi………………………………………………….. 3 Controlul calităţii…………………………………….….. 12

A. Identificare…………………….………………. 3 Restricţiile procedurii………………..……………….… 12

B. Avertizări şi precauţii…………………………. 3 Caracteristici specifice de performanţă………………. 12

C. Instrucţiuni de depozitare……………………. 4 Probleme tehnice………………………………………. 14

D. Purificarea sau tratamentul necesar pentru utilizare………………………

4

Licenţe limitate……………….………….……………… 15

E. Indicaţii privind instabilitatea………………… 4 Informaţii despre producător………………………...... 15

Necesarul de instrumente…………………………….. 4 Mărci comerciale utilizate……………………………… 15

Definirea simbolurilor

Cod lot

Număr de catalog

Limite de temperatură

Data expirării

Număr de serie SN Suficient pentru<n> teste

Atenţie

A se vedea instrucţiunile de utilizare

Producător

Reprezentant autorizat în Comunitatea

Europeană

Dispozitiv medical pentru diagnosticare In vitro

Conţine CONT

Conformitate Europeană

08 Fall

P R O S P E C T U L P R O D U S U L U I

http://www.gen-probe.com/

http://www.immucor.com/


REACTIVII ÎN FUNCŢIE DE NUMĂR DE CATALOG Kit principal MIA FORA NGS HLA număr piesă SR-800-10377 constând din kit de reactivi de tipizare MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365) şi kit de sfere magnetice (SR-800-10379). Kit de reactivi de tipizare MIA FORA NGS HLA (SR-800-10365): a) Reactivi PCR (reacţie de polimerizare în lanţ): Constând din nouă (9) eprubete individuale

Reactiv Număr produs Volum de umplere

Depozitare

24

1 HLA-A PCR Mix SR‐800‐00326

450 µL -20 până la -80°C

2 HLA-B PCR Mix SR‐800‐00327

3 HLA-C PCR Mix SR‐800‐00328

4 HLA-DPA1 PCR Mix SR‐800‐00329

5 HLA-DPB1 PCR Mix SR‐800‐00330

6 HLA-DQA1 PCR Mix SR‐800‐00331

7 HLA-DQB1 PCR Mix SR‐800‐00332

8 HLA-DRB1-S PCR Mix SR-800-00333

9 HLA-DRB1-L PCR Mix SR-800-00334

b) Reactivi pentru pregătirea bibliotecii de gene: Constând din douăsprezece (12) eprubete individuale

Reactiv Număr produs Volum de umplere

Depozitare

24

10 Enzimă de fragmentare SR-800-00335 67 µL

-20 până la -80°C

11 Soluţie tampon de fragmentare

SR-800-00336 168 µL

12 Soluţie tampon STOP SR-800-00337 225 µL

13 Mix de enzime de reparaţie la capăt

SR-800-00338 34 µL

14 Soluţie tampon de reparaţie la capăt

SR-800-00339 168 µL

15 Enzimă A-tail SR-800-00340 17µL

16 Soluţie tampon A-tail SR-800-00341 118 µL

17 Enzimă ligază SR-800-00342 34 µL

18 Soluţie tampon ligază 2X

SR-800-00343 917 µL

19 Amestec Enzimă/Soluţie

tampon PCR SR-800-00344 84 µL

20 Amorse de amplificare SR-800-00345 12 µL

21 Apă fără nucleaze SR-800-00362 85 µL

c) Placă Adaptor (SR-800-00349):

Descriere Număr piesă Volum de

umplere Depozitare

Placă adaptor indice

Trei coloane umplute ale unei plăci cu 96 godeuri

SR-800-00349 5 µL/godeu -20 până la -80°C

Kit de sfere magnetice (SR-800-10379):

a) Sfere magnetice: Constând din o (1) eprubetă

Descriere Număr piesă Volum de umplere

Depozitare

Eprubetă umplută, Agencourt®AMPure® XP sferă

SR-800-00378 5 ml 2 până la 8°C


DOMENIUL DE UTILIZARE Kitul de tipizare MIA FORA

TM NGS HLA este destinat amplificării şi secvenţializării genelor HLA, HLA -A, -B, -C, -DRB-1/3/4/5,

-DQA1, -DQB1, -DPA1 şi -DPB1 pe platforma de secvenţializare Illumina NGS. Software-ul MIA FORA se doreşte a fi un ghid pentru determinarea tipului de HLA din datele generate cu kitul de bibliotecă de gene MIA FORA NGS HLA. Testul este destinat utilizării într-un laborator competent în manipularea ADN-ului în vederea amplificării şi secvenţializării.

SUMAR ŞI EXPLICAŢIE Tipizarea pe bază de secvenţă a exonilor amplificaţi prin PCR (reacţie de polimerizare în lanţ) ai genelor HLA este o procedură de laborator obişnuită. Amplificarea prin PCR este utilizată pentru a îmbogăţi secvenţele vizate, iar tipizarea ulterioară a HLA este determinată pentru regiunile selectate. Alte metode cum ar fi sonda oligonucleotidică cu secvenţă specifică (SSOP), amorsă de teste de extensie specific secvenţei (SSP) au fost, de asemenea, folosite pentru a determina tipizarea HLA. Sistemul de tipizare MIA FORA NGS HLA reprezintă o metodologie nouă de tipizare HLA care foloseşte capacitatea de a capta toate regiunile relevante ale locusurilor HLA prin PCR cu rază mare de acţiune. Kitul conţine nouă master mix PCR care conţin toate componentele necesare pentru amplificarea fiecărei gene, inclusiv enzime, soluţii tampon, dNTP (dezoxiribonucleotid trifosfați) şi amorse de amplificare prin PCR cu rază mare de acţiune. AND-ul amplificat poate fi ulterior prelucrat cu ajutorul kit-ului de bibliotecă de gene MIA FORA NGS HLA pentru a genera biblioteca de gene ADN pentru secvenţializare pe platforma de secvenţializare Illumina. Kitul permite secvenţializarea a până la 24 de probe în manieră multiplex cu ajutorul platformei de secvenţializare Illumina.

PRINCIPIILE PROCEDURII Kitul de tipizare MIA FORA NGS HLA este destinat determinării tipizării locusurilor HLA Clasa I şi Clasa II HLA prin secvenţializarea întregii gene sau a celor mai informativi exoni şi introni. Kitul de tipizare MIA FORA NGS HLA utilizează PCR cu rază mare de acţiune pentru a capta şi îmbogăţi genele HLA majore, HLA -A, -B, -C, -DQA1, -DQB1, -DPA1 –DPB1 şi –DRB1/3/4/5. Kitul de reactivi pentru pregătirea bibliotecii de gene MIA FORA NGS generează o bibliotecă din AND-ul amplificat pentru secvenţializare pe platforma de secvenţializare Illumina. Software-ul de tipizare MIA FORA NGS HLA oferă secvenţa genelor relevante HLA şi informaţii privind faza în vederea realizării unei tipizări de înaltă rezoluţie a HLA.

REACTIVI A. Identificare

A se vedea tabelele din secţiunea Reactivi în funcţie de numărul de catalog pentru lista completă a produselor şi numerelor de catalog.

B. Avertizări şi precauţii 1. A se utiliza pentru diagnostic in vitro numai în Uniunea Europeană. 2. Rezultatele acestor kit-uri nu trebuie să fie folosite ca bază unică pentru luarea unei decizii clinice cu privire la un pacient. 3. Trebuie să fie desemnate laboratoare separate sau spaţii închise din laborator pentru manipulări Pre-PCR precum şi pentru

manipulări post-PCR. 4. Trebuie desemnate pipete separate pentru manipulările Pre-PCR precum şi pentru manipulările Post-PCR. 5. Avertizare cu privire la pericolul biologic:Toate probele biologice şi de sânge trebuie tratate ca potenţial infecţioase. Aplicaţi

Măsurile de Precauţie Universale când le manipulaţi. 6. Nu pipetaţi niciodată pe cale orală. Evitaţi contactul reactivilor şi probelor cu pielea şi mucoasele. 7. Aruncaţi materialele utilizate în conformitate cu reglementările Instituţiei şi/sau cele locale cu privire la eliminarea

materialelor cu posibil pericol biologic. 8. Tehnologia PCR este predispusă la contaminare, în special de la produsul propriu. Aerosolii ampliconilor PCR care sunt

generaţi în timpul etapelor post-PCR reprezintă o sursă frecventă de contaminare. De aceea, trebuie acordată atenţie pentru a împiedica împrăştierea şi producerea excesivă de aerosoli. Măsurile de laborator standard PCR care includ ştergerea suprafeţelor de lucru cu clorură de var 10% proaspătă înainte de prelucrarea sau pregătirea probelor PCR, utilizarea luminii ultraviolete (UV) în hote sau dulapuri sigure din punct de vedere biologic între utilizări, separarea în spaţiu şi timp a activităţilor pre- şi post-PCR, folosirea reactivilor PCR alicotaţi, folosirea măsurilor de control pozitiv şi negativ, etc. trebuie să fie, de asemenea, urmate în timpul utilizării kit-ului. Folosirea unei metode consecvente şi atente împreună cu încorporarea liberală şi monitorizarea măsurilor de control vor asigura o abordare vigilentă, proactivă pentru a controla şi monitoriza contaminarea PCR.

9. Laboratoarele trebuie să valideze propriile proceduri de curăţare. 10. Contaminarea reactivilor sau probelor poate provoca rezultate eronate; ca urmare, trebuie acordată atenţie pentru a evita

contaminarea acestui produs în timpul utilizării. Nu folosiţi reactivi contaminaţi. 11. Folosiţi lichidele din kit aşa cum sunt furnizate. Diluarea sau alterarea poate genera rezultate eronate. Nu amestecaţi reactivi

din loturi diferite. 12. Nu folosiţi eprubete care curg sau nu sunt etichetate. 13. Probele sau reactivii care au fost congelaţi în prealabil trebuie să fie amestecaţi bine şi apoi centrifugaţi după dezgheţare,

înainte de testare. Evitaţi formarea spumei sau bulelor de aer în probe. 14. Păstraţi toate enzimele şi master mix pe gheaţă sau bloc criogenic (2 - 8°C) în timpul dezghețării. 15. Asiguraţi-vă că eprubeta cu proba este închisă etanş corect înainte de amplificare pentru a împiedica evaporarea. 16. Datorită diferenţelor inerente dintre mecanismele performanţei termociclorilor, poate exista o anumită variaţie a rezultatelor

când profilele termice stabilite sunt transferate între diverse modele şi mărci de termociclori. În unele cazuri, specificitatea şi


sensibilitatea reacţiei pot fi compromise, ceea ce duce la falsa interpretare şi raportare a datelor. Termociclorii şi profilele adiţionale trebuie să fie validate de utilizator.

17. Duratele sau temperaturile de incubare diferite de cele specificate pot duce la rezultate eronate. 18. Abaterea de la instrucţiunile de folosire recomandate poate conduce la o performanţă mai puţin decât optimă a produsului.

În funcţie de natura şi gravitatea abaterii, aceasta poate conduce la un test nereuşit (nereuşite ale probei individuale precum şi ale lotului) şi/sau la rezultate eronate. De exemplu, am determinat că folosirea unei curăţiri insuficiente/inactive a sferelor din cadrul testului poate conduce la un volum înalt de apeluri de avariere a adaptorului indicelui.

19. Se recomandă efectuarea unei electroforeze a gelului pentru analiza produşilor de amplificare a genelor HLA în funcţie de mărime. Produsele PCR trebuie să fie vizualizate cu bromură de etidium sau GelRed; alte vopseluri pot arăta benzi slabe.

20. Sferele magnetice sunt folosite în câteva etape din protocol. Este important să se îndepărteze etanolul înainte de a începe etapa de eluare fără a permite sferelor să se usuce prea mult. Suprafaţa sferelor magnetice trebuie să aibă un aspect lucios fără acumulări de lichid vizibile. Durata de uscare potrivită poate fi determinată empiric în fiecare mediu de laborator (5-10 minute).

21. Folosiţi etanol 80% diluat proaspăt pentru fiecare curăţire a sferei. 22. După fiecare curăţire a sferei, există un punct de oprire sigur în timpul căruia probele sau biblioteca pot fi păstrate la -20°C

timp de cel mult 4 zile. 23. Protejaţi plăcile PicoGreen® de lumină pentru a evita înălbirea. 24. Este esenţial ca reacţia de fragmentare să nu depăşească 20 de minute şi ca curăţirea sferei să fie realizată imediat pentru

a asigura un interval corect de mărime a fragmentelor. 25. Placa A-tail trebuie să treacă direct la etapa de ligare cu adaptor. 26. Când se prepară placa de ligare cu adaptor index, folosiţi mănuşi curate când manipulaţi placa adaptorului. Scoateţi cu

atenţie sigiliul plăcii. Verificaţi dacă toate godeurile din coloanele1, 2 şi 3 conţin aproape 5 µL de soluţie. 27. Biblioteca amplificată trebuie să fie purificată în interval de 1 oră de la amplificare. 28. Etapele de post-amplificare a bibliotecii trebuie să fie efectuate într-o sală de secvenţializare sau într-o cutie AirClean PCR

pentru a evita contaminarea AND-ului ligat cu adaptorul index cu produsele finale care conţin secvenţele grupate Illumina. 29. Pregătirea pentru cuantificarea bibliotecii prin qPCR sau Qubit trebuie făcută într-o hotă PCR şi cu soluţie tampon de diluare

proaspătă pentru qPCR pentru a evita contaminarea. 30. Efectuaţi denaturarea probelor cu hidroxid de sodiu 0,2N proaspăt. 31. Efectuaţi toate spălările de întreţinere şi post-run ale ordonatorului şi curăţirea obişnuită.

C. Instrucţiuni de depozitare 1. Păstraţi kitul de tipizare MIA FORA NGS HLA la temperaturi sub -20ºC într-un congelator cu dezgheţare manuală. 2. Nu folosiţi componente după expirarea termenului de valabilitate. 3. Păstraţi sferele magnetice la temperaturi între 2 şi 8°C.

D. Purificarea sau tratamentul necesar pentru utilizare A se vedea “Recoltarea şi prepararea probelor.”

E. Indicaţii privind instabilitate 1. Dacă sărurile au precipitat din soluţie în timpul transportului sau depozitării, dizolvaţi-le din nou complet înainte de utilizare

prin agitare în vortex la temperatura camerei (18 până la 30°C).

NECESARUL DE INSTRUMENTE 1. Termociclor prevăzut cu capac încălzit, timp de încărcare ajustabil şi domeniu minim de temperatură între 2°C şi 100°C şi o precizie

de cel puţin +/- 0,5°C. Condiţiile pentru termociclori ar putea necesita modificări pentru optimizarea profilurilor. A fost validat termociclorul Veriti de la Applied Biosystems când funcţionează în modul prestabilit cu rata de încărcare de (3,9ºC/sec).

2. Cititorul de placă fluorescent adecvat cu filtru de excitare ~ 485 nm şi filtru de emisie ~535 nm pentru măsurarea concentraţiei ADN cum ar fi Victor X2, X3 a fost validat.

3. Metoda/dispozitivul adecvat pentru izolarea şi purificarea fragmentelor de ADN a aproximativ 400-500 perechi de bază în mărime. Un astfel de instrument Pippin Prep

TM pentru selectarea mărimii a fost validat.

4. Sistem opţional de manipulare a lichidului pentru construcţia semiautomată a bibliotecii. Un astfel de sistem Biomek 4000 a fost validat.

5. Metoda/aparatul adecvat pentru cuantificarea bibliotecii cum ar fi qPCR sau Qubit. 6. Platforma de secvenţializare Illumina a fost validată. 7. Server şi Software MIA FORA NGS: Nr. piesă Immucor SR-790-00017.

RECOLTAREA ŞI PREPARAREA PROBELOR ADN-ul genomic uman poate fi purificat din sânge integral şi straturi leuco-trombocitare prin metode validate care întrunesc criteriile

de mai jos. ADN-ul extras din sânge conservat în EDTA a fost testat, iar performanţa testului a fost cea aşteptată. ADN-ul extras din sângele conservat în heparină nu poate fi utilizat în acest test.

ADN-ul izolat trebuie să se găsească în 10 mM Tris-HCl, la pH 8,0-9,0 sau în apă fără nucleaze. Dacă apare un agent de chelare, cum ar fi EDTA,concentraţia finală a agentului de chelare nu trebuie să depăşească 0,5 mM.

Concentraţia finală a ADN-ului trebuie să fie cuprinsă între 5 şi 15 ng/µL.

Determinările de absorbanţă ale probei de ADN la 260 şi 280 nm trebuie să dea un coeficient de 1,65 până la 2,0.

ADN-ul poate fi folosit imediat după izolare sau păstrat la –20ºC timp de 1 an. Trebuie evitată congelarea/decongelarea repetată, deoarece aceasta poate conduce la degradarea ADN-ului.

Cel puţin 50% din probele genomice de ADN trebuie să conţină fragmente mai mari de 10 kb pentru ca amplificarea PCR cu rază mare acţiune să fie reuşită.


PROCEDURĂ

A. Materialele furnizate (A se vedea tabelul din secţiunea Reactivi în funcţie de numărul de catalog pentru informaţii specifice)

Reactivi PCR

Reactivi pentru pregătirea bibliotecii, placă pentru adaptorul index, sfere magnetice Ampure®

B. Material, reactivi şi echipament necesar, dar care nu sunt furnizate Termociclori: termociclorul ABI Veriti ® a fost validat

Suport magnetic pentru eluare cu volum redus în plăci cu 96 godeuri: Alpaqua Magnum FLX a fost validat

Suport magnetic pentru separarea magnetică a eprubetelor din microcentrifugă: DynaMag-2 Magnet a fost validat

Centrifugă pentru plăci pe masa de lucru şi microcentrifugă pentru eprubete

Pipete, pipete multicanal şi vârfuri (1-20 µL, 20-200 µL, 1000 µL)

Sigilare adezivă pentru plăcile PCR. Film adeziv Accuseal pentru PCR (E & K Scientific nr. categorie T796150, 4titude nr. categorie 4ti-0500) a fost validat

Eprubete de 1,5 ml pentru centrifugă şi eprubete cu bandă PCR

Agitator de tip Vortex

Plăci dure cu semi-bordură şi înălţime maximă, cu 96 godeuri (E & K Scientific nr. categorie EK-75012, 4titude nr. categorie 4ti-0770/C)

Placă cu 96 godeuri PP neagră, cu fund în v de tip horn(E & K Scientific nr. categorie 21209, Greiner Bio-One nr. categorie 651209)

Placă de reacţie cu 96 de godeuri MicroAmp® Optical (ThermoFisher nr. categorie N8010560)

Bandă de sigilare optică MicroAmp®, extrem de adezivă (E & K Scientific nr. categorie T796400, ThermoFisher nr. categorie 4311971)

Rezervoare pentru reactivi

Tampoane cu bandă de sigilare transparentă

Bandă de sigilare din aluminiu

Hârtie pentru lentile

Vârfuri de pipete de unică folosinţă filtrate (rezistente la aerosoli) de la 0,1 μL până la 1000 μL

Etanol 200 pentru Biologie Moleculară

10mM Tris-HCl pH 8,0

100% Tween 20

Hidroxid de sodiu,1N

Apă fără nucleaze

1,5% Agaroză, fără vopseluri, norme interne, Pippin PrepTM

, 250bp-1,5kb, (Sage Science,CDF1510)

PhiX Control, v3 (Illumina nr. categorie FC-110-3001)

Reactivi pentru determinarea concentraţiei de ADN fluorescent: kitul de testare Quant-iT™ Picogreen®

dsDNA a fost validat

Kit ciclu MiSeq® V2 300 (Illumina nr. categorie MS102-2002)

Kit reactiv cu debit mediu MiniSeq® 300 ciclu (Illumina nr. categorie FC-420-1004)

Metodă/kit/aparat corect de cuantificare a bibliotecii: atât kitul de cuantificare a bibliotecii KAPA, cât și fluorometrul Qubit au fost validate

INSTRUCŢIUNI DE UTILIZARE Testul pentru un set de 24 de probe poate fi efectuat prin protocolul manual descris mai jos. Protocoale detaliate manuale ale testului pentru 8, 16 sau 24 de probe și protocolul de automatizare pentru 24 de probe cu Biomek 4000 sunt disponibile la Specialistul dvs. în vânzări de produse tehnice. NOTĂ:

• Acordaţi o atenţie deosebită procesului de alicotare. Folosiţi pipete calibrate. Nerespectarea acestui criteriu poate duce la pierderi de reactivi şi eşecul testului.

• Toate temperaturile trebuie să fie respectate cu precizie. • Aduceţi sferele magnetice la temperatura camerei înainte de utilizare.

• Produsul amplificat poate fi păstrat până la 4 zile la 20ºC înainte de utilizare. Produsul amplificat poate fi congelat şi decongelat o singură dată. Congelarea şi decongelarea repetată poate conduce la degradarea produsului amplificat şi va determina rezultate slabe dacă este folosit pentru generarea unei biblioteci.

A. Purificarea ADN-ului genomic Purificaţi ADN-ul genomic folosind o metodă la alegere. Cerinţele probei de ADN sunt următoarele:

Probele de ADN genomic trebuie extrase din sânge integral sau strat leuco-trombocitar prin metoda de extracţie a ADN-ului care poate genera ADN cu greutate moleculară mare.

AND-ul trebuie diluat în apă fără nucleaze şi păstrat la temperatura de -20oC sau mai mică.

Concentraţia finală de ADN trebuie să fie cuprinsă între 5 şi 15 ng/µL, păstrând toate probele la concentraţii similare. Ajustaţi, dacă este necesar, cu apă fără nucleaze.

Cel puţin 50% din fragmentele de ADN genomic extrase trebuie să aibă o mărime de cel puţin 10 kb pentru o PCR cu rază mare de acţiune reuşită.


B. Amplificarea ADN(PCR)

Pregătirea PCR 1. Completaţi în Fişierul cu codurile de bare ale probelor (un fişier CVS separate prin virgulă Windows) numele probelor şi

atribuirile codurilor de bare aşa cum este ilustrat în Figura 1.

Figura1. Exemplu de Fişier cu codurile de bare ale probelor

2. Generaţi un proiect în software-ul MIA FORA după ce aţi creat un fișier model cu numele probelor şi codurile de bare. Acest

nume de proiect este necesar pentru numele seriei ordonatorului. 3. Etichetaţi trei plăci PCR dure cu 96 de godeuri şi semi-bordură. 4. Pregătiţi o placă cu probe cu 100 µL de ADN genomic pe godeu pentru fiecare probă la o concentraţie de 5-15 ng/µL diluat în

apă fără nucleaze. Placa cu probe trebuie să fie aranjată în coloanele 1, 2 şi 3 ale unei plăci cu 96 de godeuri, aşa cum este ilustrat în placa cu

probe din Figura 2. Godeul A1 trebuie să fie controlul negativ (NTC) 10mM Tris+HCl pH 8,0 care nu conţine ADN, urmat de proba 1 în B1, proba 2 în C1 şi în continuare până la proba 23 în H3 (Figura 2, PLACĂ CU PROBE).

5. Dezgheţaţi master mix PCR (P1-P9), amestecaţi prin inversare sau agitaţi rapid în vortex şi centrifugaţi. 6. Centrifugaţi placa cu probe de la punctul 4 într-o centrifugă cu un suport pentru placă timp de 2 minute pentru a vă asigura că

ADN-ul genomic se află pe fundul godeului. 7. Distribuiţi 15 µL de amestecuri PCR P1-P9 în coloanele 1-9 ale fiecărei plăci PCR dure cu 96 de godeuri şi semi-bordură astfel

încât fiecare godeu al unei coloane să aibă acelaşi amestec PCR (Figura 2). 8. Distribuiți cu atenţie pentru a evita bulele de aer în master mix PCR. 9. Distribuiţi probele din placa cu probe cu o pipetă multicanal după cum urmează (Figura 2):

Coloana 1 din placa cu probe: 10µL din NTC şi probele1-7 în coloana 1 (A1-H1) în fiecare din cele nouă coloane ale plăcii PCR1. Coloana 1 din placa cu probe: 10µL din probele 8-15 în coloana 2 (A2-H2) în fiecare din cele nouă coloane ale plăcii PCR 2. Coloana 1 din placa cu probe: 10µL din probele 16-23 în coloana 3 (A3-H3) în fiecare din cele nouă coloane ale plăcii PCR 3. NOTE: probele trebuie să fie amestecate uşor pentru a evita bulele de aer în PCR master mix aşa cum este ilustrat în Figura 2.

10. Etanşaţi plăcile PCR cu film adeziv PCR. Centrifugaţi rapid plăcile PCR, puneţi-le în 3 termociclori separaţi şi rulaţi programul MIA FORA HLA_PCR folosind setarea capacului încălzit, a se vedea Tabelul 1.

PUNCT DE OPRIRE SIGUR

Produsele PCR pot fi păstrate la -20ºC până la 4 zile până când sunt pregătite pentru etapa de echilibrare a genelor.


Figura 2. Aranjarea probelor şi pregătirea PCR

Tabelul 1. Condiţiile termociclorului pentru amplificare

Cicluri (15) Cicluri (20)

Aşteptare iniţială

Denaturare Anneal (ataşare amorse)

Extensie Denaturare Anneal (atașare amorse)

Extensie Extensie finală

Aşteptare

940C /30s 94

0C /1:15m 60

0C /30s 66

0C /7:30m 94

0C /30s 60

0C /30s 66

0C/7:30m 66

0C/10m 4

0C/∞

11. Opţional: Amplificarea poate fi verificată trecând câteva probe reprezentative pe un gel de agaroză 0,8% care conţine bromură

de etidium sau GelRed. Electroforeza trebuie realizată la 90 volţi timp de 40 de minute. Fragmentele PCR pot varia între probe

datorită diferenţelor dintre introni. Mărimile aproximative pentru produşii PCR sunt indicate în Tabelul 2.

Tabelul 2: Mărimile produşilor de amplificare

Locus HLA Mărime (kb)

HLA-A 3,2

HLA-B 4,1

HLA-C 4,4

HLA-DPA 5,0

HLA-DPB 5,2

HLA-DQA 5,8

HLA-DQB 6,3

HLA-DRB1 0,9

HLA-DRB2 5,6

C. Echilibrarea şi gruparea produşilor PCR

Concentraţia fiecărui produs PCR poate fi determinată folosind un reactiv fluorescent de cuantificare a ADN-ului adecvat, cum ar fi PicoGreen®.

Pe baza determinărilor fluorescenţei, produşii PCR din toate cele nouă reacţii PCR pentru fiecare probă sunt echilibraţi şi grupaţi în conformitate cu rezultatele din SironaQuant

TM, disponibile în sistemul MIA FORA NGS HLA. Probele grupate sunt apoi curăţate în

vederea pregătirii pentru fragmentare.


Echilibrare şi grupare

Figura 3. Pregătirea testului PicoGreen®

1. Cuantificaţi produşii PCR cu reactiv PicoGreen®: Aduceţi reactivul PicoGreen® la temperatura camerei şi diluaţi-l cu soluţie tampon 1X TE (50 µL PicoGreen®+ 7450µL1xTE). Agitaţi în vortex pentru a-l amesteca şi a-l proteja de lumină până la utilizare. Notă: Urmaţi indicaţiile din prospectul reactivilor dacă sunt utilizaţi alţi reactivi pentru cuantificarea PCR.

2. Pregătiţi standardele diluate în serie în eprubetele microcentrifugei folosind 100 ng/µL control furnizat cu kitul PicoGreen®. Distribuiţi 20 µL din fiecare standard în Placa 1 PicoGreen® (plăci de măsurare negre cu bordură completă) godeurile A10 –E12 aşa cum este ilustrat în Figura 3. Transferaţi 20 µL de soluţie tampon 1xTE în Placa 1 PicoGreen®, godeurile F10, F11, F12 aşa cum este ilustrat în Figura 3.

3. Adăugaţi 20 µL de PicoGreen® diluat în fiecare godeu al celor trei plăci PicoGreen®, inclusiv godeurile standard de pe placa 1 aşa cum este ilustrat în Figura 3.

4. Adăugaţi 19 µL de soluţie tampon 1xTE la cele trei plăci PicoGreen® în acelaşi format ca cele trei plăci PCR. Adăugaţi 1 µL produşi PCR la cele trei plăci PicoGreen® astfel încât aranjamentul să se potrivească cu plăcile originale PCR pentru a realiza diluarea 1:20 a produşilor PCR. Volumul final este 40 µL în toate godeurile măsurate.

5. Centrifugaţi placa şi incubaţi-o la temperatura camerei cel puţin 5 minute. Feriţi plăcile de lumină în timpul incubaţiei. 6. Măsuraţi fluorescenţa cu filtru fără excitare ~ 485 nm /emisie ~535 nm, 0,1s (Victor X3) 7. Salvaţi fişierul cu rezultate folosind următoarea convenţie de numire: (Notă: Windows foloseşte text delimitat cu file;

MacOS foloseşte Text formatat in Windows). Proiect_COLOANA1_Data.txt (de ex. ProiectX_COLOANA1_123115.txt) Proiect_COLOANA2_Data.txt (de ex. ProiectX_COLOANA2_123115.txt)) Proiect_COLOANA3_Data.txt (de ex. ProiectX_COLOANA3_123115 txt) Rulaţi programul de echilibrare SironaQuant în software-ul MIA FORA. Valoarea recomandată pmol este cuprinsă între 0,0035 şi 0,0009 pmol.

8. Centrifugaţi plăcile PCR şi etichetaţi o placă nouă pentru următoarea etapă drept “Proiect_PCR combinat_data” 9. Diluaţi produşii PCR din fiecare locus cu 10mMTris HCl soluţie tampon pH8,0 conform rezultatelor SironaQuant înainte

de grupare. 10. Consolidaţi produşii PCR din toate cele 9 reacţii PCR pentru fiecare probă transferând volumul specificat în rezultatele

SironaQuant. 11. Sigilaţi plăcile şi păstraţi-le la temperatura de -20ºC dacă nu începeţi curăţirea cu sfere imediat. 12. Aduceţi sferele magnetice la temperatura camerei şi amestecaţi sferele magnetice prin agitarea lor în vortex pentru a

resuspenda uniform sferele. 13. Adăugaţi 55 µL sfere în fiecare godeu de probe consolidate. Amestecaţi ADN-ul şi sferele bine prin pipetare în sus şi în

jos de cel puţin 10 ori. 14. Incubaţi amestecul de ADN şi sfere la temperatura camerei timp de 10 minute. Transferaţi placa pe magnet timp de 5

minute. 15. Îndepărtaţi cu atenţie supernatantul fără a deranja sferele în timp ce placa este pe magnet. 16. Lăsaţi placa pe magnet pentru etapele de spălare cu etanol. Adăugaţi 200 µL de etanol 80% proaspăt diluat în fiecare

godeu şi incubaţi timp de 30 de secunde, apoi îndepărtaţi cu atenţie şi aruncaţi etanolul. 17. Repetaţi spălarea cu etanol de încă două ori (în total 3 spălări). Îndepărtaţi toate urmele de etanol după a treia spălare. 18. Scoateţi placa din magnet şi permiteţi sferelor să se usuce la aer. Suprafaţa sferelor magnetice trebuie să pară sticloasă

fără nicio acumulare de lichid vizibilă. Durata de uscare adecvată poate fi determinată empiric în fiecare mediu de laborator (5 - 10 minute).

19. Adăugaţi 35 µL la temperatura camerei de 10mMTris-HCl pH8,0 la fiecare godeu. Amestecaţi bine prin pipetare şi incubaţi timp de 5 minute.

20. Puneţi placa pe magnet şi incubaţi timp de 5 minute sau până când soluţia este limpede. 21. Cu placa pe magnet, transferaţi 30 µL de eluat în noua placă PCR cu 96 de godeuri etichetată:

Proiect_Echilibrat_curat_data.


PUNCT DE OPRIRE SIGUR Probele grupate şi curăţate pot fi păstrate la temperatura de -20ºC până la 4 zile până când sunt pregătite pentru etapa de Fragmentare.

D. Construcţia bibliotecii de secvenţializare

a. Fragmentarea

1. Stabiliţi un cronometru de laborator pentru 20 de minute înainte de etapa 8. 2. Alicotaţi 20 uL de soluţie tampon de stopare din eprubeta 12 în fiecare godeu din coloana 11 a noii plăci cu 96 de

godeuri etichetată ca placă de fragmentare. 3. Preparaţi Master Mix de fragmentare transferând 134 µL din eprubeta11 (soluţie tampon de fragmentare) în eprubeta 10

(enzima de fragmentare). Amestecaţi bine în vortex şi centrifugaţi rapid. 4. Pipetaţi 23 µL din Master Mix de fragmentare preparat în etapa 3 în fiecare godeu din coloana 12 a plăcii de

fragmentare pentru a crea coloana “rezervor” de master mix. 5. Din coloana 12, transferaţi 6 µL de master mix de fragmentare în fiecare godeu din coloanele 1, 2 şi 3 ale plăcii de

fragmentare. 6. Transferaţi 14 µL din probă din coloana 1 a plăcii combinate, curăţate cu sfere din secţiunea anterioară

(Proiect_Echilibrat_curat_data) în coloana 1 a plăcii de fragmentare. Amestecaţi prin pipetare în sus şi în jos de 5 ori. 7. Transferaţi 14 µL din probă din coloana 2 a plăcii combinate, curăţate cu sfere din secţiunea anterioară

(Proiect_Echilibrat_curat_data) în coloana 2 a plăcii de fragmentare. Amestecaţi prin pipetare în sus şi în jos de 5 ori. 8. Transferaţi 14 µL din probă din coloana 3 a plăcii combinate, curăţate cu sfere din secţiunea anterioară

(Proiect_Echilibrat_curat_data) în coloana 3 a plăcii de fragmentare. Amestecaţi prin pipetare în sus şi în jos de 5 ori. 9. PORNIŢI CRONOMETRUL şi incubaţi la temperatura camerei timp de 20 de minute. Este esenţial ca reacţia să nu

depăşească 20 de minute. 10. După 20 de minute de incubaţie, transferaţi imediat 5 µL de soluţie tampon de STOPARE din coloana 11 în coloanele 1,

2 şi 3 şi amestecaţi bine prin pipetare în sus şi în jos de 5 ori după fiecare adăugare. 11. Pipetaţi 200 µL de sfere magnetice la temperatura camerei în fiecare godeu din coloana 10 a plăcii cu probe

fragmentate sau într-o eprubetă cu strip într-o eprubetă PCR cu strip curată. 12. Din coloana 10, adăugaţi 40 µL de sfere magnetice la fiecare godeu de ADN fragmentat şi amestecaţi încet prin

pipetare în sus şi în jos de10 ori. Incubaţi amestecul de sfere ADN la temperatura camerei timp de 10 minute. 13. Transferaţi placa pe magnet timp de 5 minute pentru a lega sferele de pereţii godeurilor şi eliminaţi cu atenţie

supernatantul folosind pipeta. 14. Lăsaţi placa pe magnet pentru etapele de spălare cu etanol. Spălaţi fiecare godeu cu 200 µL de etanol 80%, incubaţi

pentru 30 de secunde şi îndepărtați cu atenţie lichidul cu o pipetă multicanal fără a deranja sferele 15. Repetaţi spălarea cu etanol încă o dată, în total 2 spălări. 16. Scoateţi placa din magnet şi uscaţi-o la aer pentru a evapora excesul de etanol până când concentratul de sfere

magnetice are un aspect sticlos. 17. Scoateţi placa din magnet. Adăugaţi 20 µL de soluţie tampon 10mM Tris-HCl pH 8,0 la temperatura camerei la sfere,

amestecaţi prin pipetare şi incubaţi timp de 5 minute în afara magnetului. 18. Puneţi placa pe magnet şi incubaţi timp de 5 minute. 19. Transferaţi 15 µL din eluat în plăcile PCR noi dure cu 96 de godeuri etichetate Proiect_Fragmentat_Curăţat_Data şi

sigilaţi placa. Probele sunt pregătite acum pentru etapa de Reparaţie la capăt

PUNCT DE OPRIRE SIGUR Probele fragmentate şi curăţate pot fi depozitate la temperatura de -20°C până când sunt pregătite pentru etapa de Reparaţie la capăt. Placa cu godeuri fragmentate şi curăţate sigilate poate fi păstrată în siguranţă timp de 4 zile la temperatura de -20°C.

b. Reparaţia la capăt

1. Re-etichetaţi placa fragmentată şi curăţită anterior: Proiect_Reparaţielacapăt_Data 2. Preparaţi master mix pentru Reparaţie la capăt adăugând 136 µL din eprubeta 14 (soluţie tampon pentru reparaţie la

capăt) la eprubeta 13 (enzima de reparaţie la capăt), amestecaţi în vortex şi centrifugaţi rapid. 3. Pipetaţi 18,5 µL de master mix pentru Reparaţie la capăt preparat în etapa 1 în coloana 12 a plăcii pentru Reparaţie la

capăt etichetată Proiect_Reparaţielacapăt_Data, pentru a crea o coloană “rezervor” 4. Din coloana 12, transferaţi 5 µL de master mix pentru Reparaţie la capăt în coloanele 1, 2 şi 3 ale ADN-ului echilibrat,

fragmentat şi curăţat, etichetat Proiect_Fragmentat_Curat_Data preparat în secţiunea anterioară şi amestecaţi prin pipetare de 5 ori

5. Sigilaţi placa cu film PCR adeziv şi centrifugaţi rapid pentru a vă asigura că tot lichidul se află pe fundul godeului. 6. Transferaţi placa pentru Reparaţie la capăt, etichetată Proiect_Reparaţielacapăt_Data într-un termociclor şi executaţi

programul MIA FORA Reparaţie la capăt, aşa cum este ilustrat în tabelul 3. 7. Păstraţi placa la temperatura de -20°C până când este pregătită pentru A-tailing.


Tabelul 3: Programul termociclorului pentru reparaţie la capăt

MIA FORA Reparaţie la Capăt

20°C timp de 30 minute


4°C ∞ aşteptare

c. A-tailing

1. Preparaţi un master mix de A-tail adăugând 85 µL din eprubeta 16 (soluţie tampon de A-tail) în eprubeta 15 (enzima de A-tail), agitaţi în vortex şi centrifugaţi rapid.

2. Pipetaţi 12 µL de master mix de A-tail, preparat în etapa 1, în coloana 11 a plăcii reparate la capăt pentru a crea o coloană “rezervor”.

3. Din coloana 11, transferaţi 3 µL de master mix de A-tail în fiecare godeu al coloanelor 1, 2 şi 3 ale plăcii reparate la capăt, etichetate Proiect_Reparaţielacapăt_Data din secţiunea precedentă şi amestecaţi prin pipetare în sus şi în jos de 5 ori. Etichetaţi din nou placa cu Proiect_A-tail_Data.

4. Puneţi placa în termociclor şi executaţi programul pentru A-tail aşa cum este ilustrat în tabelul 4. 5. CONTINUAŢI DIRECT CU ETAPA DE LIGARE CU ADAPTOR INDEX în termen de 30 de minute.

Tabelul 4: Programul termociclorului pentru A-tailing MIA FORA A-tail



4°C ∞ aşteptare

d. Ligare cu adaptor index

1. Folosiţi mănuşi noi când manipulaţi placa adaptorului. Învârtiţi placa adaptorului rapid înainte de a îndepărta sigiliul plăcii.

Îndepărtaţi cu atenţie sigiliul plăcii de pe placa adaptorului. Verificaţi dacă toate godeurile din coloanele1, 2 şi 3 conţin aproximativ 5 µL de soluţie.

2. Preparaţi master mix de Ligare adăugând 850 µL din eprubeta 18 (soluţie tampon de ligază) în eprubeta 17 (enzima de ligază), agitaţi în vortex şi centrifugaţi rapid.

3. Pipetaţi 95 µL de master mix de Ligare preparat în etapa 2 în coloana 10 a plăcii A-tail etichetată Proiect_ Atail_Data din secţiunea precedentă pentru a crea o coloană “rezervor”. Etichetaţi din nou placa cu Proiect_Ligare_Data

4. Din coloana 10, transferaţi 26 µL de master mix de Ligare în fiecare godeu al coloanelor 1, 2 şi 3 ale plăcii A-tail şi amestecaţi prin pipetare în sus şi în jos de 5 ori.

5. Transferaţi 2,5 µL de adaptor în godeurile corespunzătoare ale plăcii de ligare. 6. Amestecaţi bine şi sigilaţi placa cu film adeziv PCR. Centrifugaţi rapid. 7. Transferaţi placa de ligare într-un termociclor şi executaţi programul de ligare MIA FORA aşa cum este ilustrat în tabelul

5.

Tabelul 5: Programul termociclorului pentru ligarea adaptorului

MIA FORA Ligare



4°C ∞ aşteptare

e. Consolidarea produşilor ligaţi cu adaptor

1. Combinaţi 20 µL din fiecare godeu de pe placa Proiect_Ligare_Data din secţiunea precedentă într-o singură eprubetă Eppendorf de 1,5 ml. Etichetaţi eprubeta cu “Proiect-Data-Consolidat.”

2. Adăugaţi 865 µL de sfere magnetice la eprubeta microcentrifugei etichetate Proiect-Data-Consolidat. Amestecaţi bine prin agitare în vortex. Incubaţi timp de 10 minute.

3. Transferaţi eprubeta în stativul magnetic până când soluţia este limpede timp. Îndepărtaţi şi eliminaţi supernatantul. 4. În timp ce se află încă pe magnet, adăugaţi 1 ml de etanol 80% şi incubaţi timp de 30 de secunde. Îndepărtaţi etanolul

80% fără a deranja sferele legate. 5. Repetaţi spălarea cu etanol (etapa 4) pentru un total de 2 spălări. Îndepărtaţi cât mai mult etanol posibil din eprubetă. 6. Îndepărtaţi eprubeta din stativul magnetic şi permiteţi sferelor să se usuce la aer timp de 5-10 minute până când

depozitul de sfere magnetice are un aspect sticlos. 7. Resuspendaţi sferele în 63 µL de 10mMTris-HCl pH 8,0 la temperatura camerei. Agitaţi în vortex şi incubaţi timp de 5

minute. 8. Puneţi eprubeta pe magnet până când soluţia este limpede şi transferaţi 60 µL de eluat care conţine probe ligate cu

adaptor curăţite într-o eprubetă de microcentrifugă curată.


PUNCT DE OPRIRE SIGUR Probele ligate cu adaptor combinate şi curăţite (Biblioteca) pot fi păstrate la o temperatură de -20°C până când sunt pregătite pentru Selecţia mărimii cel mult 4 zile.

f. .Selecţia mărimii şi amplificarea bibliotecii selectate în funcţie de mărime (Pippin Prep)

NOTĂ: Biblioteca amplificată trebuie să fie purificată în decurs de o oră de la amplificare.

1. Alegeţi o metodă adecvată de selecţie a mărimii pentru pregătirea bibliotecii pentru a izola fragmentele de aproximativ 400-500 perechi de bază. Urmaţi manualul de instrucţiuni al produsului dacă nu folosiţi Pippin Prep.

2. Amestecaţi 30 µL din Bibliotecă cu 10µLde marker adecvat şi încărcaţi într-o bandă a casetei Pippin. 3. Creaţi şi executaţi un program pentru a selecta Biblioteca cu mărimea fragmentelor cuprinsă între 400 şi 500bp. 4. Dezgheţaţi modulele de Amplificare din kitul de pregătire a Bibliotecii, eprubetele 19, 20, 21 şi asamblaţi reacţia într-o

eprubetă cu benzi PCR de 0,2 ml, după cum urmează: Amestecaţi 25 µL de amestec de amplificare din eprubeta 19, 2 µL amorse din eprubeta 20, 18 µL apă fără nucleaze din eprubeta 21 şi 5 µL de eluare selectată în funcţie de mărime.

5. Amestecaţi uşor şi centrifugaţi. Transferaţi în termociclor şi amplificaţi cu Biblioteca PCR MIA FORA aşa cum este ilustrat în tabelul 6.

Tabelul 6: Biblioteca PCR MIA FORA

Ciclul (1) Ciclurile (12) Ciclul (1)

Aşteptare iniţială Denaturare Anneal (ataşare amorse)

Extensie Extensie finală Aşteptare

980C /30s 98

0C /15s 65

0C /30s 72

0C /30 s 72

0C/5m 4

0C /00

E. Pregătirea secvenţializării NOTĂ: Deschideţi şi urmaţi toate etapele de post-amplificare într-o secţie desemnată a laboratorului şi preferabil într-o hotă PCR de siguranţă pentru a preveni contaminarea suprafeţelor de lucru şi a reactivilor de secvenţializare.

1. Transferaţi 50 µL din biblioteca amplificată într-o eprubetă de microcentrifugă. Adăugaţi 50 µL de sfere magnetice la temperatura camerei la Bibliotecă. Amestecaţi bine şi incubaţi timp de 10 minute.

2. După 10 minute, puneţi eprubeta în suportul de eprubete magnetic până când soluţia este limpede, aproximativ 5-8 minute. Scoateţi şi eliminaţi supernatantul.

3. În timp ce se află pe magnet, adăugaţi 200 µL de 80% etanol şi incubaţi timp de 30 de secunde. Îndepărtaţi etanolul 80% fără a deranja sferele legate.

4. Repetaţi spălarea cu etanol (etapa 3) pentru un total de 2 spălări. Îndepărtaţi cât mai mult etanol posibil din eprubetă. 5. Îndepărtaţi eprubeta din suportul magnetic şi lăsaţi sferele să se usuce la aer timp de 5 - 10 minute până când aglomerarea

de sfere magnetice are un aspect sticlos. 6. Resuspendaţi sferele în 17 µL la temperatura camerei 10mMTris-HCl pH8,0. Agitaţi în vortex şi incubaţi timp de 5 minute. 7. Puneţi eprubeta pe magnet până când soluţia este limpede, şi transferaţi 15 µL de eluat care conţine biblioteca de

secvenţializare curată, amplificată într-o eprubetă curată de microcentrifugă.

PUNCT DE OPRIRE SIGUR Probele eluate pot fi păstrate la -20°C până la 4 zile.

8. Determinaţi concentraţia Bibliotecii prin metode care măsoară cu precizie concentraţia ADN-ului. Immucor recomandă fie

metodele qPCR, fie pe cele Qubit pentru estimarea concentraţiei Bibliotecii. 9. Datorită naturii ordonatorului, biblioteca amplificată trebuie să aibă o concentraţie de cel puţin 10 nM. Distribuţia mărimii

librăriei poate fi determinată prin electroforeză în gel de agaroză sau orice sistem de electroforeză capilară pentru a verifica mărimea bibliotecilor obţinute.

10. Diluaţi biblioteca până la 4nM şi apoi pregătiţi o bibliotecă denaturată finală de 8pM (Qubit) sau 12pM (qPCR) pentru MiSeq®, și o bibliotecă denaturată finală de 1,3pM (Qubit) pentru MiniSeq®. Biblioteca poate fi activată cu control 5% PhiX, dacă este cazul.

11. Încărcaţi biblioteca denaturată pe casetă şi desfășuraţi ordonatorul. 12. Urmaţi instrucţiunile Illumina pentru secvenţializarea bibliotecii. Asiguraţi-vă că numele fişierului din fişa de probe

corespunde numelui proiectului generat în timpul pregătirii PCR cu rază mare de acțiune.

F. Analiza datelor

Fişierele fastq generate de instrumentul de secvențializare trebuie să fie analizate cu software-ul MIA FORA pentru a genera tipizarea HLA. Fişa de probe cu numele de probe şi codurile de bare şi fişierele corespunzătoare fastq trebuie să fie încărcate în fişierul de proiect al software-ului MIA FORA. Pentru modul de utilizare a software-ului MIA FORA, urmaţi Ghidul utilizatorului software-ului.


REZULTATE

1. Amplificarea PCR: Analiza gelului de agaroză trebuie să demonstreze că nu există niciun produs în controlul negativ (NTC) pentru ca seria să fie valabilă. Gelul de agaroză al produşilor amplificaţi poate suferi variaţii în ce priveşte mărimea în funcţie de diferenţele dintre secvenţele intronice. Consultaţi Tabelul 2 pentru mărimea aproximativă a benzilor.

2. Pregătirea bibliotecii: Kitul bibliotecii trebuie să genereze o bibliotecă când nivelul de intrare ADN în SironaQuant este cuprins între 0,0009 şi 0,0035 pmol. Concentraţia finală a bibliotecii trebuie să fie de cel puţin10nM şi trebuie să fie cuantificată cu precizie înainte de secvenţializare. Bibliotecile trebuie să fie diluate până la 4nM înainte de denaturare. Aglomerarea de pe kiturile MiSeq® și MiniSeq® poate varia în funcţie de precizia cuantificării. De obicei, densităţile aglomerării bibliotecilor de 8-12pM trebuie să fie cuprinse între 600 şi 800 K/mm

2 pe MiSeq® și 160-220 K/mm

2 pe

MiniSeq®. Trebuie acordată o atenţie deosebită cuantificării bibliotecii cu precizie. Toţi produşii ligaţi post adaptor trebuie să fie păstraţi într-o hotă PCR sau o zonă desemnată şi trebuie preparaţi reactivi de diluare proaspeţi pentru a împiedica contaminarea.

3. Tipizarea HLA este generată de Software-ul MIA FORA NGS şi este prezentată într-un raport. Urmaţi Ghidul Utilizatorului Software-ului MIA FORA pentru analiza datelor de tipizare HLA.

CONTROLUL CALITĂŢII Este necesară realizarea unui control negativ şi a unui control opţional cunoscut la fiecare testare, cum ar fi o probă de control a apei şi respectiv o probă tipizată anterior. Trebuie acordată o atenţie deosebită la îndepărtarea sigiliilor plăcilor şi plăcile trebuie să fie centrifugate înainte de deschidere. Trebuie folosite sigilii noi pentru plăci în fiecare etapă în care plăcile trebuie să fie sigilate. Vârfurile de pipetă folosite trebuie să fie puse în recipiente adecvate şi aruncate. Pregătirea PCR trebuie făcută într-o sală separată Pre-PCR de unde sunt manipulaţi produşii amplificaţi. Întregul ADN genomic trebuie să fie diluat în apă fără nucleaze. După selecţia mărimii şi amplificarea ADN-ului, biblioteca amplificată trebuie să fie manipulată într-o zonă separată, de preferat într-o hotă PCR, şi manipulată cu un set separat de pipete. Trebuie să se aibă grijă ca suprafeţele de lucru să nu fie contaminate cu biblioteci amplificate. Testul trebuie să se desfăşoare conform recomandărilor din prospectul produsului şi trebuie realizat împreună cu celelalte proceduri de control al calităţii conform normativelor locale, statale, federale şi/sau cerinţelor agenţiilor de acreditare.

LIMITĂRILE PROCEDURII 1. PCR şi testul descris în prospectul produsului necesită condiţii controlate cu precizie. Abaterile de la parametrii validați pot conduce la

eşecul produsului. 2. Dacă cel puțin 50% din fragmentele inițiale de ADN sunt mai mici de 10 kb, nu poate fi generată o cantitate suficientă de produs PCR

cu rază mare de acțiune. 3. Dacă concentrația finală a bibliotecii este sub 10 nM, nu pot fi generate rezultate de secvențiere corecte. 4. Ambiguitățile din al patrulea câmp vor fi observate datorită lipsei de acoperire din regiunea intron. 5. Aditivii din amestecul PCR pot interacţiona cu alternativele de bromură de etidium non-toxice folosite în mod obişnuit în electroforeza

în gel de agaroză şi pot conduce la o intensitate mai redusă a benzilor. 6. Gelurile de agaroză colorate în verde SYBR® nu sunt potrivite pentru produşii PCR. Bromura de etidium sau GelRed™ trebuie să fie

utilizate pentru vizualizarea produşilor PCR. 7. Amorsa DPB1 nu amplifică exon 1 și exon 5. Ca urmare,orice polimorfisme cunoscute în aceşti exoni nu vor fi secvenţializate şi vor fi

enumerate ca ambiguităţi în raport. 8. Lipsa unor secvenţe genomice de referinţă pentru DPB1 şi nivelele reduse de polimorfism în intron 2 (între exon 2 şi 3) face dificilă

efectuarea analizei de sincronizare pentru probele de heterozigoţi. Ca urmare, ar putea exista o ambiguitate a genotipului care nu poate fi soluţionată.

9. Amorsele avansate pentru DPB1 se suprapun cu primele câteva baze de pe exon 2. Ca urmare, polimorfismele din acele secvenţe nu vor fi identificate prin secvenţializare.

10. Locusurile DRB sunt amplificate ca două fragmente – unul care amplifică exon 1 şi altul care amplifică exonii 2 până la 6. Intron 1 nu este amplificat în întregime. Ca urmare, sincronizarea întregului locus nu este posibilă pentru DRB1/3/4/5 și orice polimorfism prezent în Intron 1 va conduce la ambiguități în al patrulea câmp.

11. Amorsa întârziată pentru DRB exonii 2 până la 6 se suprapun terminalului 3’ al exonului 6, ca urmare, polimorfismele din acele secvenţe nu vor fi determinate prin secvenţializare.

12. În majoritatea cazurilor, amplificarea produselor de exon 1 din DRB1/3/4/5 este mapată slab la exonul 1 al secvențelor de referință cunoscute ale DRB5; ca urmare este, puțin probabil să fie generat contigul pentru exon 1 pentru DRB5. Deoarece nu există polimorfisme cunoscute de exon 1 pentru DRB5, aceasta nu conduce la nicio ambiguitate în tipizarea HLA pentru DRB5.

13. Datorită naturii complexe a tipizării HLA, interpretarea datelor şi alocarea tipizării trebuie examinate de către personal calificat.

CARACTERISTICI SPECIFICE DE PERFORMANŢĂ S-au desfăşurat studii clinice la trei centre pentru a evalua performanța kitului pentru tipizare MIA FORA NGS HLA. Performanţa testului a fost comparată cu tipizarea anterioară care a inclus Tipizarea pe bază de secvenţă [Sequence Based Typing (SBT)] cu înaltă rezoluţie, acolo unde este disponibilă şi tipizarea cu rezoluţie inferioară în care SBT nu a fost disponibilă. Probele au fost selectate de centrele de testare pentru a reprezenta un set divers de tipuri de HLA care ar fi întâlnite în timpul operaţiilor normale. Un total de 206 probe au fost testate de centre în 3 serii, fiecare folosind două loturi de reactivi. Tipizarea HLA a fost determinată pentru locusurile HLA-A, -B, -C, DPA1, -DPB1, -DQA1, -DQB1şi -DRB 1/3/4/5. Un total de 3.692 alele au fost evaluate cu aceste 206 de probe. Rezultatele au demonstrat că tipurile HLA obţinute prin testul MIA FORA, fără retestarea eşecurilor şi locusurilor nepotrivite, a fost 99,34%. După retestarea locusurilor eşuate şi a celor nepotrivite, concordanţa generală a fost 99,74%.

Tabelul 8: Sumarul concordanţei generale


Centru Număr de probe

Număr de locusuri testate

Număr de alele Pentru analiza concordanţei

Concordanţa după retestare

Centru1 68 748 1223 1220 (99,75%)

Centru2 69 759 1064 1063 (99,91%)*

Centru3 69 759 1241 1236 (99,59%)

* Nu s-a repetat testarea la acest centru. Un locus DQB1 a avut date insuficiente.

Tabelul 9: Sumarul testării clinice per locus

Locusuri HLA Concordanţa iniţială Concordanţa după retestare**

HLA-A 100,00% 100,00%

HLA-B 99,76% 99,76%

HLA-C 99,51% 100,00%

DPA1 99,72% 100,00%

DPB1 99,44% 99,72%

DQA1 99,26% 100,00%

DQB1 98,48% 99,27%

DRB1 98,54% 99,03%

DRB3/4/5 99,43% 100,00%

Total 99,34% 99,74%

** Retestările au inclus apeluri care au fost marcate pentru revizie şi nu au putut fi soluționate prin inspecţia manuală a datelor. Apelurile care nu au putut fi făcute datorită datelor insuficiente (11/1854 amplificări) au fost, de asemenea, retestate.

Notă: Pentru caracteristici specifice de performanţă detaliate, vă rugăm să telefonaţi la Immucor Transplant Diagnostics, Inc. la 1- 888-329-0255.


PROBLEME TEHNICE

PROBLEMĂ CAUZA POSIBILĂ SOLUŢIE

Nicio bandă pe gel după amplificarea PCR

Calitatea sau cantitatea ADN-ului

Raport OD 260/280 mai mic de 1,65 Repurificaţi ADN-ul pentru a îndepărta impurităţile

ADN fragmentat

Cel puţin 50% din ADN trebuie să fie mai mare de10Kb

Re-extrageţi ADN din probă

ADN diluat în Tris-HCl sau TE Diluaţi probele în apă

Concentraţie de ADN redusă Asiguraţi-vă că concentraţia ADN-ului este 50- 150 ng/reacţie

Alternative pentru etidium folosite în gel de agaroză

Folosiţi bromură de etidium dacă benzile sunt slabe pe gelul de agaroză, deoarece unele vopseluri fluorescente pot fi

estompate datorită compoziţiei amestecului PCR

Abandonarea amplificării Repetaţi PCR pentru abandonarea amplificării folosind reactivi rămaşi suficienţi pentru patru probe. Reactivii rămaşi păstraţi

la temperaturi de 2-8oC sunt stabili timp de o săptămână.

Multiple benzi sau frotiu de benzi după amplificarea PCR

Condiţiile termociclorului

Rate de încărcare Asiguraţi-vă că ratele de încărcare sunt cele specificate în protocol

Temperatura Calibraţi aparatul PCR pentru a verifica performanţa aparatelor PCR

Calitatea ADN-ului Asiguraţi-vă că ADN-ul este diluat în apă şi că nu conţine contaminanţi

Valori fluorescente joase pentru toate locusurile

Reactiv PicoGreen®

Decolorarea fotografică a reactivului

PicoGreen®

Urmaţi îndeaproape instrucţiunile producătorilor. Reactivii

trebuie să fie feriţi de lumină.

Diluare incorectă a reactivului Diluaţi reactivul PicoGreen® conform instrucţiunilor

Standarde diluate incorect Diluaţi standardele conform instrucţiunilor

Selecţia incorectă a mărimii ADN-ului

Instrument Pippin

Verificaţi profilul de eluare pentru a vă

asigura că eluarea s-a produs fără erori

Urmaţi ghidul de depanare Sage Science pentru a determina dacă performanţa instrumentului este conform specificațiilor.

Instrument necalibrat

Testaţi 2 µL de 1kb plus scară (ThermoFisher) cu protocolul de exciză de 400-600 perechi de bază. Treceţi 15 µL de produs eluat pe gel de agaroză pentru a vizualiza eluarea

fragmentului de 500 bp

Reutilizarea cartuşului Pippin Cartuşul Pippin trebuie folosit o singură dată

qPCR R2 < 0,95

KAPA PCR Provocat de o valoare aberantă clară Repetaţi analiza cu valoarea aberantă omisă.

Contaminare în reactivi Repetaţi KAPA PCR cu standard proaspete

Concentraţie redusă a bibliotecii amplificate

Curăţirea sferelor magnetice

Etanolul nu a fost îndepărtat complet Îndepărtaţi etanolul în timp ce plăcile sunt pe suportul magnetic. Îndepărtaţi toate urmele de etanol, în special după

spălarea finală.

Sfere depozitate incorect Păstraţi sferele la 2 până la 8°C – NU CONGELAŢI

Etanolul nu a fost preparat proaspăt Etanolul 80% trebuie preparat proaspăt înainte de fiecare utilizare

Sfere uscate prea mult

Durata de uscare poate depinde de temperatura ambiantă şi umiditate. Monitorizaţi îndeaproape sferele pentru a vă asigura că acestea nu se usucă prea mult şi ajustaţi protocolul după

caz

Este folosită o concentraţie greşită de Tris-HCl Asiguraţi-vă că soluţia tampon Tris-HCl este 10mM şi pH este 8,0

Lipsa de eluare a ADN cu Pippin prep

Verificaţi pre şi post eluarea pentru

produşii ligaţi la adaptor

Amplificaţi 1 µL bibliotecă curată combinată pre-pippin cu jumătate din cantitatea de reactivi pentru amplificarea bibliotecii. Treceţi produşii amplificaţi (nu este necesară

purificarea) pe un gel de agaroză 2% pentru a determina prezenţa unui frotiu de fragmente.

Produs amplificat pierdut în timpul curăţirii cu sfere

Reamplificaţi 5µL de eluare. Dacă biblioteca este >25nM, produsele pot fi vizualizate trecând 5 µL pe un gel de agaroză

Eroare la fragmentare

prin etapele de ligare

Probleme de fragmentare Purificaţi 20 µL 2-3 probe ligate şi NTC folosind protocolul de

curăţire cu sfere cu 36 µL sfere. Eluaţi produşii în 10 µL şi verificaţi fragmentarea pe un gel de agaroză 2%. Dacă nu s-a produs fragmentarea, telefonaţi la serviciul tehnic pentru

instrucţiuni suplimentare de depanare

Aglomerare MiSeq® mai mică decât cea

aşteptată

Cuantificarea incorectă a bibliotecii

Kapa qPCR Urmaţi instrucţiunile producătorilor acordând o atenţie deosebită diluărilor şi verificând dacă curba standard este

corectă şi valorile Ct sunt cuprinse în intervalul linear al curbei standard

Fluorometru Qubit

Urmați instrucțiunile producătorului acordând o atenție deosebită soluțiilor de diluare și folosind soluții de diluare standard proaspete.

Dacă proba se îndepărtează de curba standard a reactivilor cu gamă largă de acțiune, repetați cu testul de sensibilitate înaltă.

Reactivi Illumina Probleme cu celula de măsură,

instrumentul sau reactivul

Contactaţi serviciul tehnic Illumina pentru a soluţiona

problemele legate de reactiv şi instrument


LICENŢĂ LIMITATĂ IMPORTANT — CITIŢI CU ATENŢIE: Acest Contract de licenţă ("Contract") este contractul legal dintre dumneavoastră (în continuare numit "Deţinător de licenţă") şi Immucor Transplant Diagnostics, Inc. ("Immucor") (individual, o "Parte" sau împreună, "Părţile"), pentru utilizarea reactivilor furnizaţi prin acesta

(“Reactivi”). Prin utilizarea Reactivilor, Deţinătorul de licenţă acceptă să respecte clauzele stabilite prin prezenta. 1. Utilizarea reactivilor de către deţinătorul de licenţă. Immucor acordă Deţinătorului de licenţă un drept neexclusiv, netransferabil de a utiliza numai cantitatea transferată de Reactivi numai în conformitate cu procedurile stabilite în marca anexată şi supusă restricţiilor stabilite în prezenta. Titlul pentru Reactivi nu trebuie

să fie transferat Deţinătorului de licenţă. Immucor reţine toate drepturile care nu sunt acordate în mod expres prin prezenta şi nu se acordă licenţe implicite prin prezenta. 2. Utilizări excluse. Nu se acordă nicio permisiune prin prezenta ca Deţinătorul de licenţă să folosească alţi Reactivi decât cei desemnaţi în Secţiunea 1 a

acestui Contract. În mod specific, nu se acordă nicio permisiune prin prezenta pentru ca Deţinătorul de licenţă să folosească Reactivi în scopul transferului, vânzării, dezvăluirii sau acordării accesului la Reactivi sau la produsul Mia Fora în alt mod unei terţe părţi. Deţinătorul de licenţă nu va avea dreptul să producă produse derivate ale niciunui Reactiv sau să autorizeze o terţă parte să folosească sau să vândă Reactivi sau produse derivate ale Reactivilor. Deţinătorul de licenţă confirmă că anumiţi Reactivi şi utilizarea acestora sunt supuse brevetelor unor terţe părţi şi sunt oferite cu licenţă către Immucor. Deţinătorul de licenţă

nu va folosi Reactivii decât în scopul permis în mod explicit prin prezenta. 3. Utilizarea neautorizată a Reactivilor şi termeni de despăgubire. În măsura permisă de lege, Deţinătorul de licenţă va apăra, despăgubi şi exonera de răspundere Immucor, asociaţii Immucor, managerii, directorii, funcţionarii superiori, angajaţii, sponsorii şi agenţii lor (în mod colectiv numiţi "Părţi despăgubite")

împotriva oricărei obligaţii, pierderi, daune, revendicări sau cheltuieli, inclusiv onorariile avocaţilor, (în mod colectiv numite "Pierderi indemnizate") care sunt determinate sau legate de acest Contract, inclusiv, dar fără a se limita la Pierderile indemnizate care provin din utilizarea de către sau în numele Deţinătorului de licenţă. Deţinătorul de licenţă va despăgubi şi va exonera de răspundere Părţile despăgubite împotriva oricărei pierderi provenite din, generate de sau legate de

încălcarea de către Deţinătorul de licenţă a acestui Contract; şi revendicările făcute de un terţ că Deţinătorul de licenţă sau utilizarea de către Deţinătorul de licenţă a Reactivilor încalcă sau deturnează orice brevet, drept de autor, marcă comercială, secret comercial sau alte drepturi intelectuale private ale unui terţ. 4. Acest Contract se aplică numai Reactivilor. Orice utilizare a software-ului Mia Fora este supusă Contractului de Licenţă al utilizatorului final. Acest contract

va fi interpretat şi executat în conformitate cu legislaţia Statului New York din Statele Unite. Dacă cumpărătorul nu acceptă termenii acestui Contract, Immucor este dispus să accepte returnarea produsului.

Producător: Immucor, 35 Technology Drive, Suite 100, Warren, NJ 07059 SUA. Telefon:+1 (908) 226-8200, Fax: +1 (908) 226-0800

Reprezentant autorizat: lmmucor Medizinische Diagnostik GmbH, Robert-Bosch-Straβe 32 63303 Dreieich, GERMANIA Telefon: +49-607 4-84200, Fax: +49-607 4-842099

Serviciul Tehnic European:Telefon: +32 (0)3 385 47 91

Ultima revizuire şi emitere a acestui document: Rev 2, 03 noiembrie 2016

MĂRCI COMERCIALE UTILIZATE MIA FORA şi SIRONAQUANT sunt mărci comerciale ale Sirona Genomics, Inc.

Agencourt şi Ampure sunt mărci comerciale înregistrate ale Beckman Coulter, Inc. Toate celelalte mărci comerciale sunt proprietatea respectivilor proprietari.

immucor transplant diagnostics, inc. documents/lc1618cero.2 - mia... · 2016-12-15 · 20. sferele...

Documents