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INCIDENCIA DE FACTORES GENETICO-AMBIENTALES EN LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO
DE PASTO
CESAR ORLANDO PAZ EGAS
UNIVERSIDAD DE NARIÑO FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
PROGRAMA DE BIOLOGÍA SAN JUAN DE PASTO
2013
2
INCIDENCIA DE FACTORES GENETICO-AMBIENTALES EN LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÀNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO
DE PASTO
CESAR ORLANDO PAZ EGAS
Trabajo de grado presentado como requisito pacial para optar al título de Biólogo
Directora EDITH MARIELA BURBANO ROSERO
MSc. PhD. Ciencias-Área de Microbiología
UNIVERSIDAD DE NARIÑO FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
PROGRAMA DE BIOLOGÍA SAN JUAN DE PASTO
2013
3
“Las ideas y conclusiones aportadas en la tesis de grado son responsabilidad
exclusiva de sus autores”.
Artículo 1 del acuerdo No 324 de octubre 11 de 1966, emanado por el Honorable
Consejo Directivo de la Universidad de Nariño.
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NOTA DE ACEPTACIÓN
____________________________
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____________________________
Presidente del Jurado
____________________________
Jurado
San Juan de Pasto, Noviembre de 2013.
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AGRADECIMIENTOS
A Dios por dotarnos de las herramientas necesarias para crecer y perseguir
nuestros sueños.
A mi familia por ser la fuente de cariño, confianza y persistencia a lo largo de este
camino. A Edilma Egas, por sacrificarlo todo en mi crecimiento y formación, por su
cariño y fortaleza en este proceso. A mis hermanos Daniela, Andrés y David, por
brindarme de su afecto y cariño, por enseñarme el camino de la esperanza y el
futuro.
A la profesora Edith Mariela Burbano, por su extraordinaria asesoría y amistad, por
su fundamental apoyo, guía y motivación en momentos difíciles, y formidables
conocimientos enseñados.
Al profesor Álvaro Pazos, por su apreciable orientación en el contacto con los
pacientes y fase de muestreo.
A la profesora Jaqueline Mena, por la confianza, aportes al trabajo y
conocimientos transmitidos durante este largo proceso y el valioso
acompañamiento de su parte.
Al profesor Rodrigo Prieto, por su valiosa amistad, por la confianza y orientación
como punto de partida de esta investigación, y por introducirme al espectacular
mundo de la Genética y la Evolución.
A la doctora María Clara Yépez, en calidad de jurado, por su amabilidad, por sus
aportes científicos que ayudaron en el estudio, y su determinante gestión para la
ejecución metodológica.
A la profesora Sandra Álvarez, en condición de jurado, por su cordialidad, aportes
científicos realizados al estudio y la enseñanza afectuosa de los mismos.
A la profesora Luz Estela Lagos, por su gestión y sus valiosos aportes científicos
en pro de la investigación.
Al Centro de Estudios en Salud de la Universidad de Nariño (CESUN), por abrirme
las puertas en su grupo, por su determinante apoyo científico y gestión financiera
para la ejecución del proyecto. Entre ellos Luis Carlos, Luisa Goyes, Daniel
6
Jurado, Alicia Rosales y Cristina Campos, por su gestión y compartirme de sus
experiencias en el campo de la salud como un aporte fundamental a esta
investigación.
Al Dr. Pablo Fernández, por la valiosa confianza de su parte y por el apoyo
logístico- científico brindado, a través del grupo de investigación de Biotecnología
Microbiana, y por la acogida en sus instalaciones durante la fase de laboratorio. Y
por su contribución con sus conocimientos impartidos a la formación científica a lo
largo de la carrera.
A la doctora Martha Sofía González y su constante apoyo académico, gestión y
respaldo en la realización de esta investigación.
A la formación académica recibida por los profesores de Biología, entre ellos
gracias a los profesores María Elena Solarte, Belisario Cepeda, Aida Elena Baca,
Aquiles Gutiérrez, Jhon Jairo Calderón y Guillermo Castillo por su respaldo y
colaboración para la realización de este trabajo.
A la Universidad de Nariño y en especial a la Vicerrectora de investigaciones,
Postgrados y Relaciones Internacionales, por la aceptación del proyecto en el
sistema de investigaciones y por la consecución de recursos económicos para la
financiación de este estudio.
Al Comité de Ética en Investigaciones, por su importante apoyo, gestión y respaldo
para la realización de este proyecto.
A las entidades de salud que facilitaron el acceso a sus bases de datos y reportes
para la identificación de casos de Cáncer Gástrico, en especial mención a
Patólogos Asociados y la amable gestión de la Dra. María José Erazo, y al
Hospital Departamental por abrir sus puertas en la fase de campo.
A cada uno los pacientes y sus familiares, que decidieron formar parte de este
estudio y de esta forma ser contribuyentes en la obtención del conocimiento
científico sobre el Cáncer Gástrico en la región.
Al Dr. Álvaro Bedoya por su valiosa guía y acompañamiento en la interpretación
epidemiológica de los reportes de patología.
Al doctor Arsenio Hidalgo Troya por su gentil colaboración y asesoría estadística.
A las profesoras Dolly Revelo y Milena Guerrero, por su valioso apoyo,
7
colaboración y sus grandes enseñanzas. Al profesor Julio Otero, por su constante
y determinante apoyo en el desarrollo de la carrera y sus inolvidables tardes de
clase en el colegio.
A los amigos y colegas Iván Otero Ramírez y Maira Quiroz, por su guía y
compartimiento de saberes en la ejecución de las técnicas de laboratorio y
opiniones constructivas hacia el estudio.
A los amigos y compañeros de carrera Juan Montenegro, Ana Estrada, Marcela
Concha, Mario Suarez, Mónica Martínez, por su constante apoyo anímico. A Oscar
Tovar por su confianza, sus palabras de motivación y aliento en momentos
determinantes, como solo los auténticos amigos lo hacen y por ser un claro reflejo
de superación en la adversidad mediante el esfuerzo.
A los amigos y compañeros de carrera, Isabel Gómez, Jurany Astorquiza, Sandra
Narváez, Karen Suarez, Claudia Sánchez, Eliana Revelo, Gabriela Dorado, Diana
Betancourt, Jenny Chamorro, Jaime Lagos, Vanessa Pérez, Marvin Anganoy,
Diana Mora, Darío Paz, Ernesto Pérez, Natalia Apraez, Julieth Pai, Julio Souza,
Johana Castillo; por cada una de las experiencias y vivencias compartidas que nos
llevaron a fortalecer nuestro carácter, y lograr nuestros objetivos y por ser
ejemplos a seguir de dedicación y constancia.
A cada uno de ellos y a cada persona que hizo desde su posición, la posible
realización de este trabajo… MUCHAS GRACIAS!!
8
DEDICATORIA
A la memoria de aquellos que ya no están entre nosotros, pero su paso por este
mundo dejó un legado importante,
A Julio Cesar Paz, el padre y ejemplo de valentía,
A Sandra Paz, la hermana y amiga leal como una sola,
A Marisol Egas, la hermana y maestra, que dejo un vacio perpetuo, y sembró la
semilla de los sueños y la sabiduría,
Su estadía fue pasajera, pero sus recuerdos serán eternos.
9
RESUMEN
El cáncer gástrico (CG) es una enfermedad de alta frecuencia en el mundo, y a su
vez el de mayor incidencia y mortalidad en Pasto. En la génesis del CG están
implicados factores ambientales, genéticos y la infección por H. pylori, de esta
bacteria se disponen algunos estudios en el departamento, pero el
comportamiento de los demás factores y sus posibles relaciones, aún se
desconocen para la región. Por ello, mediante un estudio retrospectivo se efectuó
la búsqueda de casos sobrevivientes y confirmados de CG, en ellos fueron
evaluados dos marcadores de predisposición genética (FNTα y CYP1A1), después
de la respectiva estandarización de técnicas de extracción de DNA y clonación
acelular por PCR. Con las secuencias de estas regiones, se determinó la
variabilidad genética por corte con enzimas de restricción In silico, identificando
SNPs (normales y anormales) y su asociación con factores ambientales y
familiares. Los casos incluidos (n=10) registraron elevadas frecuencias de los
alelos de riesgo (FNTα=40%, CYP1A1=50%), 60% de susceptibilidad genética,
dependencia significativa con el consumo de habas, ingesta de carne roja y hábito
alcohólico (p<0.10), mientras que los factores genéticos-familiares evaluados no
parecen relacionarse (p>0.10) con la prevalencia de los alelos “raros”. Los datos
también sugieren la asociación del hábito tabáquico con una baja variabilidad en el
FNTα. Los hallazgos de este estudio se constituyen en una base preliminar y
pionera, de cara al conocimiento de los factores de riesgo en la región, la
estandarización de perfiles genéticos y elaboración de medidas puntuales de
prevención.
Palabras clave: Cáncer gástrico, factores familiares, factores ambientales,
polimorfismo.
10
ABSTRACT
Gastric cáncer (GC) is a disease of high incidence in the world, and in turn the
highest incidence and mortality in Pasto. In the genesis of GC are involved
environmental factors, genetic and infection by H. pylori, about this bacteria are
available some studies in the department, but the behavior of the other factors and
their possible relationships, are still unknown to the region. Therefore, using a
retrospective study was carried out finding survivors and confirmed cases of CG,
they were evaluated in two markers of genetic predisposition (TNF alpha and
CYP1A1), after the respective standardization of DNA extraction techniques and
cloning acellular by PCR. With the sequences of these regions, genetic variability
was determined by restriction enzyme cleavage in silico, identifying SNPs (normal
and abnormal) and its association with environmental factors and family. The cases
included (n = 10) showed higher frequencies of risk alleles (TNF alpha = 40%,
CYP1A1 = 50%), 60% of genetic susceptibility, significant dependence with eating
lima beans, red meat intake and alcoholic habit (p <0.10), while family-genetic
factors evaluated did not appear to be related (p> 0.10) with the prevalence of
alleles "rare". The data also suggest the association of smoking with low variability
in the TNF alpha. The findings of this study are based on a preliminary indicative
and knowledge associated with the risk factors in the region, the standardization of
genetic profiles, and specific measures of prevention.
Keywords: Gastric cancer, familiar factors, environmental factor, polimorfism.
11
TABLA DE CONTENIDO
Pág
1 INTRODUCCION ...................................................................................................... 20
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA......................................................................... 23
3 OBJETIVOS ............................................................................................................... 25
3.1 Objetivo General ..................................................................................................... 25
3.2 Objetivos Específicos .............................................................................................. 25
4 MARCO TEORICO ................................................................................................... 26
4.1 GENERALIDADES ................................................................................................. 26
4.2 FACTORES DE RIESGO ....................................................................................... 26
4.2.1 Genéticos ............................................................................................................ 26
4.2.1.1 Polimorfismos genéticos de estudio ................................................................. 27
4.2.1.1.1 Factor de necrosis tumoral (FNTα) ............................................................... 27
4.2.1.1.2 Elemento de desintoxicación CYP1A1 .......................................................... 28
4.2.2 Ambientales......................................................................................................... 28
4.2.3 Infecciosos .......................................................................................................... 29
4.3 ANTECEDENTES .................................................................................................. 30
5 MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................................... 34
5.1 ASPECTOS GENERALES ..................................................................................... 34
5.1.1 Identificación de pacientes diagnosticados con cáncer gástrico susceptibles
de ser incluidos en el proyecto de investigación............................................................ 34
5.1.2 Inclusión de pacientes en el estudio .................................................................... 35
5.1.3 Recolección de datos .......................................................................................... 35
12
5.1.4 Obtención de muestras de sangre ....................................................................... 35
5.2 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN EN LOS GENES FNTΑ, CYP1A1 COMO
MARCADORES DE PREDISPOSICIÓN GENÉTICA .................................................... 36
5.2.1 Extracción de DNA genómico a partir de muestras de sangre ............................. 36
5.2.1.1 Protocolo Salting-Out modificado ..................................................................... 36
5.2.1.2 Kit Bioline: protocolo de cultivo de células ........................................................ 37
5.2.1.3 Kit Bioline: protocolo de tejido animal ............................................................... 37
5.2.1.4 Kit Promega ..................................................................................................... 37
5.2.2 Cuantificación de DNA ........................................................................................ 38
5.2.3 Clonación acelular por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ................. 38
5.2.4 Electroforesis horizontal ...................................................................................... 40
5.2.5 Secuenciación ..................................................................................................... 40
5.2.6 Edición de secuencias ......................................................................................... 41
5.2.7 Análisis de secuencias ........................................................................................ 41
5.2.7.1 Construcción de arboles filogenéticos .............................................................. 41
5.2.7.2 Construcción de dendrogramas........................................................................ 42
5.2.7.3 Cálculo de índices de variabilidad genética ...................................................... 42
5.2.7.4 Determinación de los alelos de riesgo .............................................................. 42
5.3 DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES
AMBIENTALES Y LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN
PACIENTES DEL MUNICIPIO DE PASTO. ................................................................... 43
5.4 EVALUACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES FAMILIARES Y
LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL
MUNICIPIO DE PASTO. ............................................................................................... 43
5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ....................................................................................... 44
13
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 45
6.1 ASPECTOS GENERALES ...................................................................................... 45
6.1.1 Identificación de pacientes diagnosticados con cáncer gástrico ........................... 45
6.1.2 Inclusión de pacientes en el estudio .................................................................... 47
6.2 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN EN LOS GENES FNTΑ, CYP1A1 COMO
MARCADORES DE PREDISPOSICIÓN GENÉTICA .................................................... 49
6.2.1 Aspectos generales ............................................................................................. 49
6.2.2 Extracción de DNA genómico a partir de muestras de sangre ............................. 49
6.2.3 Cuantificación de DNA ........................................................................................ 50
6.2.4 Estandarización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) .................. 51
6.2.4.1 Amplificación genes mediante reacción en cadena de polimerasa PCR ........... 51
6.2.4.2 β-globina .......................................................................................................... 52
6.2.4.3 CYP1A1 ........................................................................................................... 53
6.2.4.4 FNTα ................................................................................................................ 55
6.2.5 Secuenciación ..................................................................................................... 57
6.2.6 Edición de secuencias ......................................................................................... 58
6.2.7 Análisis de la variación genética de FNTα, en la población de estudio ................ 58
6.2.7.1 Construcción de arboles filogenéticos .............................................................. 58
6.2.7.2 Construcción de dendrogramas:....................................................................... 59
6.2.7.3 Índices de variabilidad genética........................................................................ 61
6.2.7.4 Análisis de los SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido) en FNTα,
asociados a riesgo de Cáncer Gástrico ......................................................................... 63
6.2.8 Análisis de la variación genética de CYP1A1, en la población de estudio ........... 64
6.2.8.1 Determinación de la distancia filogenética ........................................................ 64
14
6.2.8.2 Determinación de la similaridad genética ......................................................... 65
6.2.8.3 Índices de variabilidad genética:....................................................................... 67
6.2.8.4 Análisis de los SNPs (Polimorfismos de Nucleótidos Simples) en CYP1A1,
asociados a riesgo de Cáncer Gástrico ......................................................................... 68
6.3 RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES AMBIENTALES Y LA
SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO
DE PASTO .................................................................................................................... 71
6.4 RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES FAMILIARES Y LA SUSCEPTIBILIDAD
AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO DE PASTO. ..................... 77
CONCLUSIONES ......................................................................................................... 84
RECOMENDACIONES ................................................................................................. 85
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 86
15
LISTA DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. Secuencias, dirección y amplicones producidos por los primers utilizados para amplificar los genes de estudio. ........................................................................... 39
Tabla 2. Concentraciones finales de reactivos empleados en la amplificación por PCR. ............................................................................................................................. 39
Tabla 3. Programas de termociclado, para la amplificación de los genes de estudio. .... 40
Tabla 4.Frecuencia y porcentaje de individuos con cáncer gástrico según sexo y grupos etarios ............................................................................................................... 45
Tabla 5. Frecuencia y porcentaje de individuos con cáncer gástrico según la infección por Helicobacter pylori y diagnóstico histopatológico ..................................... 46
Tabla 6. Frecuencia y porcentaje de pacientes participantes en el estudio, según edad y sexo................................................................................................................... 48
Tabla 7. Estandarización de las concentraciones de DNA a 100 ng/ul .......................... 51
Tabla 8. Programas del termociclador para los la amplificación de los genes de β-globina, CYP1A1 y FNTα .............................................................................................. 52
Tabla 9. Condiciones estandarizadas de PCR para la amplificación del gen β-globina. ......................................................................................................................... 52
Tabla 10. Condiciones de variación de la reacción de PCR para la estandarización y optimización de la amplificación del gen CYP1A1 ..................................................... 54
Tabla 11. Condiciones de variación de la reacción de PCR para la estandarización y optimización de la amplificación del gen FNTα .......................................................... 56
Tabla 12. Frecuencias y posiciones genéticas de Polimorfismos presentados en los genes FNTα y CYP1A1 ................................................................................................. 62
Tabla 13. Frecuencia, porcentaje y porcentaje acumulado de los hábitos alimenticios y de exposición en la muestra de estudio. ................................................. 72
Tabla 14. Frecuencia y porcentajes de casos de Cáncer Gástrico, discriminados por factores genéticos y familiares. ............................................................................... 78
Tabla 15. Significancia estadística de las variables dependientes con la predisposición genética y los parámetros ambientales. ................................................. 82
16
LISTA DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1. Serie de cambios en la mucosa gástrica que pueden progresar a cáncer gástrico. Fuente: Modificado de Piñol et al., 1998. ........................................................ 30
Figura 2. Patrones electroforéticos del DNA, procedentes de las muestras de sangre: A) Estandarización a partir del kit Bioline, las bandas corresponden a las muestras procesadas por el método de cultivo celular, B) y C) Muestras procesadas por el método cultivo D) Muestras procesadas con el kit promega............. 50
Figura 3. Patrones electroforéticos de los amplificados de β-globina, A. Estandarización, B y C Amplificados del gen β-globina para la totalidad de las muestras. (Gel de agarosa 1,2%, corrido en buffer TAE 1X a 60V durante dos horas)............................................................................................................................ 53
Figura 4. Patrones electroforéticos de los amplificados de CYP1A1, A. Estandarización, B y C Amplificados del gen CYP1A1 para la totalidad de las muestras. (Gel de agarosa 1,2%, corrido en buffer TAE 1X a 70V durante dos horas)............................................................................................................................ 55
Figura 5. Patrones electroforéticos de los amplificados de FNTα, a) estandarización, b) y c) amplificados del gen FNTα para la totalidad de las muestras. (Gel de agarosa 1,2%, corrido en buffer TAE 1X a 80V durante dos horas)............................................................................................................................ 57
Figura 6. Árbol filogenético construido mediante el algoritmo neighborjoining, usando las secuencias consenso analizadas por cada paciente para FNTα. Control interno: fragmento equivalente al tamaño del gen, control externo: gen PilE, de Neisseria gonorrhoeae. ................................................................................................. 59
Figura 7. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias FNTα, construido usando el método UPGMA, coeficiente DICE, (r= 0.95951) y el software NTSyS 2.11f, se aprecia un conglomerado con el 70% de similitud, formado por ex-fumadores, con un solo fumador pasivo (FE024). .................................................... 60
Figura 8. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias FNTα, construido usando el método UPGMA, coeficiente Jaccard, (r= 0.97075) y el software NTSyS 2.11f, se aprecia un conglomerado con un 55% de similitud, formado por ex-fumadores, con un solo fumador pasivo (FE024). ................................ 61
Figura 9. A. Patrones de electroforesis, in silico para FNTα. Las secuencias fueron sometidas a la enzima de corte NcoI, se aprecia en algunos pacientes el alelo normal (2 fragmentos) y en otros el alelo asociado al riesgo de Cáncer gástrico
17
(108 pb). B. Prevalencia de la mutación estudiada en FNTα. ........................................ 64
Figura 10. Árbol filogenético construido usando el algoritmo NeighborJoining, usando las secuencias consenso analizadas por cada paciente para la región de CYP1A1. Control interno: fragmento equivalente al tamaño del gen, control externo: gen PilE, para Neisseria gonorrhoeae. ............................................................ 65
Figura 11. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias de CYP1A1, construido usando el método UPGMA, coeficiente DICE, (r= 0.98782) y el software NTSyS 2.11f. ................................................................................................................. 66
Figura 12. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias CYP1A1, construido usando el método UPGMA, coeficiente Jaccard, (r= 98199) y el software NTSyS 2.11f. ................................................................................................... 67
Figura 13. A. Perfiles genéticos para CYP1A1in silico generados por corte con enzimas de restricción por el programa pDraw 32 1.1.116 A. Las secuencias fueron sometidas al corte con las enzimas NcoI y BsrDI, se observa en algunos pacientes el alelo normal (2 fragmentos) y en otros el alelo asociado al riesgo de Cáncer gástrico (1 fragmento), las regiones no cortadas por ninguna de las dos enzimas se interpretaron como mutantes. B. Prevalencia del alelo de riesgo. .............. 69
Figura 14. Prevalencia de susceptibilidad genética en la muestra de pacientes de estudio, en porcentaje la probabilidad de mutación para cualquiera de los dos genes evaluados. .......................................................................................................... 70
Figura 15. Dependencia de parámetros ambientales con la prevalencia de la mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en FNTα ............................................ 75
Figura 16. Dependencia de parámetros ambientales con la prevalencia de la mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en CYP1A1. ....................................... 77
Figura 17. Dependencia de parámetros genéticos-familiares con la prevalencia de la mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en FNTα ......................................... 79
Figura 18. Dependencia de parámetros genéticos-familiares con la prevalencia de la mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en CYP1A1. ................................... 80
18
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A : FORMATO DE RECOLECCIÓN DE DATOS PERSONALES Y
PATOLÓGICOS DE CASOS DE CG. ............................................................................ 96
ANEXO B: FORMATO DE PARTICIPACIÓN VOLUNTARIA EN LA
INVESTIGACIÓN: “INCIDENCIA DE FACTORES GENETICO-AMBIENTALES EN
LA SUSCEPTIBILIDAD AL CANCER GASTRICO EN PACIENTES DEL
MUNICIPIO DE PASTO” ............................................................................................... 97
ANEXO C: ENTREVISTA SOCIO-ECONÓMICA, CLÍNICA Y AMBIENTAL DE LA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN EN ASPECTOS GENÉTICOS Y GENÓMICOS DEL
CÁNCER EN COLOMBIA ............................................................................................. 99
ANEXO D: INFORMACION PROVENIENTE DE LA ENCUESTA SOCIO-
AMBIENTAL Y CLÍNICA .............................................................................................. 106
19
GLOSARIO
CYP1A1: Citocromo P-450 1 A 1
DNA [Desoxirribonucleic Acid]: Acido desoxirribonucleico
FNTα: Factor de Necrosis Tumoral alfa
HAP: Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos
INC: Instituto Nacional de Cancerología
OMG: Organización Mundial de Gastroenterología
OPS: Organización Panamericana de la Salud
PCR [Polimerase Chain Reaction]: Reacción en Cadena de la Polimerasa
SNPs [Single Nucleotide Polimorfism]: polimorfismos de un solo nucleótido
20
1 INTRODUCCIÓN
El cáncer gástrico es una enfermedad neoplásica de alta mortalidad en el mundo,
Teniendo en cuenta el crecimiento de la población, la incidencia calculada para el
2010 es de 1,1 millones de casos, de los cuales, se calcula que las dos terceras
partes se producirán en países en vía de desarrollo (Gómez et al., 2009).
En Latinoamérica, estas proporciones reportadas según el sexo son variables; los
índices mayores se registran en Costa Rica (51,5/100.000 hombres y
28,7/100.000 mujeres). En Colombia, de acuerdo al Instituto Nacional de
Cancerología (INC), el CG es la primera causa de muerte en los hombres y la
tercera en las mujeres, precedida por los cánceres de cuello uterino y de mama
(Torres et al., 2004).
Según el Atlas de la mortalidad por cáncer del INC en el 2010, hay un mayor
riesgo de mortalidad por cáncer gástrico en las zonas de alta cordillera tanto en
hombres como en mujeres, sin mayor variación en el patrón entre ambos sexos. El
riesgo disminuye con el descenso en la altitud, hasta alcanzar su nivel más bajo
en las planicies de la Costa Atlántica y la Costa Pacífica, los llanos Orientales, la
Amazonía, y de forma menos evidente, en los valles de los grandes ríos,
principalmente el Magdalena.
De esta forma es importante resaltar la relación entre la región andina y
montañosa y la mortalidad por cáncer gástrico que se aprecia tanto en el estudio
del INC como en los datos proporcionados por Así Vamos en Salud en 2013,
debido a que departamentos como Boyacá, Quindío, Cauca, Risaralda, Huila,
Norte de Santander, Tolima y Caldas han presentado durante los últimos años las
tasas más altas de mortalidad por cáncer gástrico, lo que puede estar relacionado,
tal y como se menciona en el Atlas del INC, con las diferencias en los patrones
culturales y las condiciones medioambientales de las regiones de alta montaña,
que difieren de otras regiones como los valles de los ríos, los Llanos Orientales y
las zonas costeras. Algunos estudios que caracterizan los patrones de dieta en
poblaciones de alto y bajo riesgo para la incidencia de cáncer gástrico en
Colombia, han mostrado diferencias importantes en el consumo de sal y habas
(alto consumo en zonas de alto riesgo), y de vegetales y frutas frescas (mayor
consumo en zonas de bajo riesgo), entre otros factores de riesgo.
21
La existencia de estudios recientes y actualizados a nivel de Colombia y
Latinoamérica, demuestran que esta problemática es de vigente interés, en dichos
trabajos se han evaluado factores ambientales de riesgo como el tabaquismo
(Molina et al., 2007), la calidad de vida (Gómez et al., 2009), o también estudios
como los de Lee y colaboradores (2006), que intentan asociar hábitos como
tabaquismo y alcoholismo con la susceptibilidad genética al CG.
El factor de riesgo más importante dentro de la patogenia de ésta entidad es la
infección por Helicobacter Pylori, un bacilo que afecta aproximadamente a la mitad
de la población mundial y que lleva a gastritis crónica (Correa, 2003). Sin
embargo, esta infección parece ser un factor de riesgo necesario pero no único
para la generación de cáncer (OPS, 2007). Es por esto que factores como una
dieta rica en nitratos (Correa, 2003); tabaquismo, condiciones ambientales (OPS,
2007), el pobre consumo de verduras y frutas y el estrato socioeconómico (8) son
determinantes para el desarrollo de dicho cáncer (Correa, 2003).
A nivel de Nariño se destacan trabajos como el de Correa y colaboradores (2000),
en donde realizan un ensayo con anti-H para H. pylori y suplementación dietética
con micronutrientes antioxidantes, en el estudio en mención se observó una
mejoría en aquellos pacientes con estadios precursores de malignidad portadores
de H. pylori. Pazos y colaboradores (2003), evaluaron el efecto in vitro de
Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus sobre el crecimiento de H.pylori,
encontrando que L. casei inhibe significativamente el crecimiento de la bacteria.
Mena & Yepez (2007) evaluaron in vitro la actividad anti-H. pylori de extractos de
algunas plantas regionales, relacionando resultados promisorios para
determinados extractos. Más recientemente Pazos y colaboradores (2012),
caracterizaron la microbiota láctica residente en pacientes de dos regiones con
diferente riesgo de CG, concluyendo que las Bacterias Acido Lácticas (BAL)
pueden ser una alternativa de inhibición sobre este patógeno.
En Nariño, en donde existe una gran incidencia de CG (10.53/100.000) (Ángel et
al., 2004), y en localidades como Pasto, que ocupa el primer lugar de muertes en
ambos sexos por cáncer (Yepez et al., 2012), se hace notoria la necesidad de
estudios que correlacionen algunos de los factores ambientales y genéticos, con el
riesgo de adquirir esta patología, de igual forma es relevante, disponer de esta
información a fin de elaborar medidas tempranas de prevención para esta
neoplásia, y contar con registros actualizados de la distribución de los factores de
riesgo y su asociación con la susceptibilidad al CG en el ámbito regional.
22
Teniendo en cuenta la elevada mortalidad registrada en Pasto por causa esta
enfermedad y la ausencia local de investigaciones que describan el estado actual
de los factores genéticos y ambientales implicados en el CG, se planteó el
presente estudio, teniendo como propósito la evaluación de los factores genéticos
y ambientales con la susceptibilidad al cáncer gástrico en pacientes del municipio
de Pasto.
23
2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El Cáncer gástrico (CG) después del cáncer de pulmón y de seno, es el tercero
más letal en el mundo, con 700.000 muertes anuales (Globocan, 2008), aunque
sus tasas disminuyen en países desarrollados, es una de las neoplasias más
prevalentes y mortales en los países en vías de desarrollo (Pilco et al., 2009).
El CG en Colombia se ha convertido en un problema de salud pública, debido a
que ocupa el primer lugar entre las causas de muerte por cáncer. En el año 2008,
las tasas de mortalidad fueron de 17,8/100.000 hombres y 9,6/100.000 mujeres
(Globocan, 2008). Se estima que el cáncer ocasiona un 8.5% del total de muertes
que se producen anualmente en el mundo. En Colombia, esta cifra está alrededor
del 14% (Bermúdez et al., 2008).
Existen evidencias clínicas que la etiología del CG es multifactorial, en la cual
intervienen factores genéticos, ambientales e infecciosos (Regino, 2008). Entre los
factores genéticos del CG se incluyen antecedentes familiares, así como
pertenecer al grupo sanguíneo A (Piñol et al., 1998; Bermúdez et al., 2008).
Factores medio ambientales, tales como el alto consumo de sal, alcoholismo
tabaquismo y factores infecciosos, como la presencia de Helicobacter pylori en la
mucosa gástrica, pueden estar asociados a la primera secuencia de cambios
patológicos que pueden desencadenarse en cáncer (Bermúdez et al., 2008).
Entre los departamentos andinos de Colombia, Nariño registra una alta incidencia
de casos de CG, de allí que sea conveniente contar con estudios inherentes a los
factores de riesgo de este problema de salud pública. A pesar de la existencia de
investigaciones sobre H.pylori en nuestra región, aún es incipiente la información
(Goodman & Correa, 1996; Correa et al., 2000; Pazos et al., 2012). Por lo
anteriormente expuesto, es pertinente indagar sobre las relaciones entre los
diferentes factores de riesgo genéticos, infecciosos y ambientales, con la finalidad
de entender su incidencia, su patología y las interacciones presentes en la
población del Departamento de Nariño. Esto permitirá elaborar medidas
tempranas de prevención para esta neoplasia, y también disponer de registros
actualizados sobre los factores de riesgo y su asociación con la susceptibilidad al
CG en el ámbito regional.
En este contexto es posible formular la siguiente pregunta de investigación:
24
¿Cuál es la relación entre algunos factores genéticos y ambientales con la
susceptibilidad al desarrollo de cáncer gástrico en el municipio de Pasto?
25
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo General
Evaluar la relación de los factores genéticos y ambientales con la susceptibilidad
al cáncer gástrico en pacientes del municipio de Pasto.
3.2 Objetivos Específicos
3.2.1 Determinar la frecuencia de los polimorfismos encontrados para los genes
FNTα, CYP1A1 en la población de estudio.
3.2.2 Determinar la relación entre los factores ambientales y la susceptibilidad al
cáncer gástrico en pacientes del municipio de Pasto.
3.2.3 Establecer la relación entre los antecedentes familiares y la susceptibilidad
al cáncer gástrico en pacientes del municipio de Pasto.
26
4 MARCO TEORICO
4.1 GENERALIDADES
El adenocarcinoma gástrico constituyó durante varias décadas la primera causa
de muerte por cáncer, ahora solo liderada por la causa pulmonar, su incidencia ha
disminuido gradualmente en muchas partes del mundo, principalmente por
cambios dietéticos y forma de preparación de los alimentos, entre otros factores
ambientales (Lee et al., 2013). Su frecuencia tiene tendencia a disminuir en países
desarrollados, es más común en hombres que en mujeres, con una relación 2 ó 3:
1, la mortalidad es casi el doble en los hombres, la probabilidad de desarrollo de
CG incrementa con la edad. Existe una evidente asociación entre medio ambiente
y la dieta dentro de los posibles factores etiológicos, lo que se justifica por las
profundas diferencias en cuanto a su incidencia en las distintas partes del mundo
(Piñol et al., 2002).
Se han descrito diversos factores de riesgo del cáncer gástrico, los cuales
desempeñan un papel primordial en su origen, algunos de ellos permanecen en
controversia, y otros, por el contrario, se han ido confirmando de forma cada vez
más clara (Gómez et al., 2009). Los tipos más frecuentes de cáncer gástrico son el
tipo intestinal y el tipo difuso. Ambos difieren en su etiología, epidemiología y
mecanismos biológicos. El tipo intestinal presenta una mayor incidencia, es más
frecuente en hombres que en mujeres, aproximadamente en una proporción 2:1 y
se ha relacionado con factores ambientales, mientras que el difuso, es menos
frecuente, afecta por igual a individuos de ambos sexos y ha sido asociado con
factores genéticos (Dong & Ghosh, 2010).
4.2 FACTORES DE RIESGO
4.2.1 Genéticos
Cada individuo tiene un grado diferente de susceptibilidad de llegar a desarrollar
cáncer gástrico. Estas diferencias pueden ser producto de ciertos polimorfismos
genéticos. La secuencia de eventos genéticos en este caso no es tan clara como
27
lo es en el cáncer colorectal. Factores como presencia de familiares con CG,
pertenecer al grupo sanguíneo A y antecedentes de otro tipo de cáncer, han sido
identificados como factores que aumentan el riesgo de susceptibilidad en la
mucosa gástrica frente a agentes carcinogénicos (American Cáncer Society,
2013).
4.2.1.1 Polimorfismos genéticos de estudio
4.2.1.1.1 Factor de necrosis tumoral (FNTα)
El FNTα es una importante y potente citocina proinflamatoria mediadora de las
reacciones inflamatorias y desempeña un significativo papel en la patogénesis de
varias enfermedades inflamatorias crónicas. Puede ser sintetizado por diversas
células del organismo (macrófagos, Células T, monocitos, células endoteliales, y
miocitos musculares) como mecanismo de defensa ante agentes infecciosos, un
ejemplo de este mecanismo es el desencadenado por H. pylori. Se ha
demostrado que existen diferentes tasas de síntesis de FNTα in vitro e in vivo
entre los individuos, indicando su asociación con la presencia de ciertos
polimorfismos genéticos (Palacio et al. 2002).
Los niveles de FNTα se han visto incrementados en pacientes infectados con H.
pylori. Se han descrito variantes alélicas para este gen, siendo una de las más
reconocidas, la transición de G por A encontrada en la posición -308 del promotor.
La expresión aumentada de este gen se ha visto involucrada en una alta
susceptibilidad ante el desarrollo de enfermedades autoinmunes, infecciosas y de
cáncer gástrico. Durante la infección con H. pylori se produce una estimulación de
citocinas como IL-1, IL-6, IL-8 y FNTα que se encargan de aumentar la inflamación
y producir daño en la mucosa gástrica. Este polimorfismo en algunos casos
genera una expresión aumentada del gen, lo cual hace que exista mayor daño en
el tejido gástrico, o incluso la posible relación entre ciertos polimorfismos y el
choque séptico (Phumeetham et al., 2012).
28
4.2.1.1.2 Elemento de desintoxicación CYP1A1
CYP1A1 es un gen que regula la síntesis de la enzima citocromo P450 que
participa en el metabolismo de algunos fármacos y en la síntesis del colesterol,
esteroides y otros lípidos. Está localizada a nivel del retículo endoplásmico, su
expresión es inducida por hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), presentes
entre otras sustancias en el humo del tabaco. Su sustrato endógeno es
desconocido, sin embargo, se sabe que es capaz de metabolizar algunos HAP a
carcinógenos intermedios, por lo que el gen CYP1A1 ha sido asociado con un
mayor riesgo de cáncer de pulmón (Cardoso Filho et al., 2013; Walsh et al., 2013).
Recientemente, se ha planteado la hipótesis que CYP1A1 sería activada en
etapas tempranas del proceso gastro-carcinogénico a través de procesos
oncogénicos, la expresión de CYP1A1 puede ser un importante factor de riesgo en
individuos expuestos a xenobióticos presentes en humo de tabaco, por lo tanto,
las variantes polimórficas de esta enzima pueden estar asociadas a un alto riesgo
de cáncer gástrico. Los genotipos de CYP1A1 por sí solos no se encuentran
asociados a cáncer gástrico, para la manifestación del riesgo es necesario
considerar el factor ambiental, dado que se requiere la presencia del sustrato para
su manifestación clínica, es decir, la presencia de hidrocarburos aromáticos
policíclicos, los que son componentes importantes del humo del cigarrillo y, en
general, de los procesos de combustión incompleta de materia orgánica (Lee et al.
2006; Anwar-Mohamed et al., 2013; Ding et al., 2013; Han et al., 2013).
4.2.2 Ambientales
Estos factores han sido los más estudiados y relacionados con este tipo de cáncer.
Se han asociado hábitos como la dieta rica en nitratos, sal, alimentos ahumados y
conservados en vinagre, bajo consumo de alimentos ricos en antioxidantes (frutas
y verduras) y lácteos. El uso de la refrigeración de los alimentos ha tenido
estrecha relación con la disminución del cáncer gástrico en países desarrollados,
probablemente afectando los factores dietéticos antes mencionados (Espejo &
Navarrete, 2006).
Otro factor de riesgo es el nivel socioeconómico bajo, que en países desarrollados
tiene relación directa con el tipo de alimentación, sin embargo, siendo un factor
29
conocido, no se ha establecido claramente su relación con la calidad de la
alimentación (Fluxa & Benavides, 2012).
También forman parte:
- la exposición ocupacional o ambiental a xenobióticos, tales como los
hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAPs), aminas aromáticas
heterocíclicas (AAHs) y compuestos nitrogenados (CN), entre otros.
Muchos de estos compuestos mencionados se encuentran en el humo de
cigarrillo (Molina, 2007).
- Alimentación (variable para cada país): pescados secos y salados,
alimentos muy condimentados, carnes rojas, entre otros.
- Ingestión de alcohol, de bebidas calientes, de nitrato de sodio y tabaco.
4.2.3 Infecciosos
En la actualidad, diversos trabajos (Correa 2000, Hunt 2001, Mena, Yepez 2007,
Pazos 2012, entre otros.) tratan de asociar la infección por H. pylori con el cáncer
de estómago; a partir de evidencias epidemiológicas, anatomopatológicas y
fisiopatológicas, que han permitido crear varias hipótesis para explicar los
mecanismos mediante los cuales la infección crónica del epitelio gástrico por esta
bacteria, evoluciona hacia el cáncer gástrico.
La infección por este bacilo Gram negativo, espirilado, flagelado, se adquiere
durante la infancia; la vía habitual de trasmisión es la oral-oral y la fecal-oral. Se
ha calculado que la mitad de la población mundial se encuentra infectada por
H.pylori, de tal manera que es una de las infecciones de mayor prevalencia
(Rodríguez et al., 2009).
Para explicar la asociación entre el H.pylori y el cáncer gástrico se proponen
diversas hipótesis, la más aceptada sugieren que la bacteria, al infectar la mucosa
gástrica, provoca una gastritis crónica atrófica multifocal, asociada a
hiperclorhidria, lo cual facilita el sobrecrecimiento bacteriano, y el aumento de
nitrosaminas y nitrosamidas, que tienen alta capacidad mutagénica, por lo cual son
las responsables de las lesiones premalignas en una compleja serie de cambios
(Figura 1).
30
Figura 1. Serie de cambios en la mucosa gástrica que pueden progresar a cáncer
gástrico.
Fuente: Modificado de Piñol et al., 1998.
4.3 ANTECEDENTES
En el año de 1998, Piñol y sus colaboradores elaboran una revisión teórica de los
factores de riesgo y el papel de H. pylori en la génesis de la neoplasia gástrica,
con el fin de conocer su epidemiología y contribuir a la prevención del cáncer
gástrico.
Se han realizado algunas investigaciones sobre H. pylori en el departamento de
Nariño, una de ellas fue realizada por Correa y colaboradores (2000), donde se
desarrolla un ensayo clínico aleatorizado, tomando una población de 630 personas
sometidas a tratamiento con anti-H para H. pylori y suplementación dietética con
micronutrientes antioxidantes por espacio de 72 meses. El estudio demostró una
significativa tasa de regresión y mejoría en aquellos pacientes con estadios
precursores de malignidad portadores de H. pylori.
Hunt y colaboradores (2001), en un estudio llevado a cabo en las ciudades de
Túquerres y Pasto, analizaron mutaciones del gen Kras, presente en diversas
31
clases de tumores humanos, sin encontrar alguna asociación de estas mutaciones
y la progresión de las lesiones preneoplásicas. En esta investigación los pacientes
fueron previamente sometidos a tratamiento asociado a antibióticos para H. pylori.
Pazos y colaboradores en el año 2003, evaluaron a partir de 257 muestras, el
efecto in vitro de Lactobacillus casei subsp. Rhamnosus sobre H. pylori, realizaron
aislados microbianos de las biopsias con los cuales llevaron a cabo pruebas de
antagonismo, encontrando que L. casei subsp. Rhamnosus inhibe el crecimiento
de H. pylori, por lo que sugieren utilizarlo como probiótico para prevenir o
disminuir la alta incidencia de esta bacteria.
En el campo genético, sobresalen trabajos como los de González (2004) que
determinaron en una población costarricense la asociación entre las lesiones
gástricas leves (tipo I y II) y el cáncer gástrico, con los polimorfismos de
desintoxicación química CYP1A1 MspI y CYP2E1 PstI, y los polimorfismos de los
genes GSTM1 y GSTT1 que carecen de un producto proteínico funcional.
Encontrando, en esta investigación, un tipo de asociación estadísticamente
significativa entre la presencia del polimorfismo CYP2E1 Pst1 y una disminución
del riesgo de padecer cáncer gástrico.
Torres y colaboradores (2004), valoraron la asociación entre las variantes
genéticas de enzimas metabólicas (GSTM1, GSTT1) y el riesgo de cáncer
gástrico, así como también la interacción entre algunos factores de riesgo como: la
infección con H. pylori, el consumo de alcohol, cigarrillo, algunos hábitos
alimenticios y susceptibilidad al CG. Los resultados encontrados comprobaron que
la delección homocigota de GSTM1 en la población del Cauca puede estar
asociada con una mayor susceptibilidad a CG. La asociación entre GSTM1-0 y el
consumo de cigarrillo como mayor riesgo de CG pone de manifiesto la interacción
entre los factores genéticos y los ambientales en el proceso de carcinogénesis
gástrica.
En el 2004, Souza y colaboradores, realizaron un estudio con mujeres de una
población de Nariño catalogada con alto riesgo para evaluar el perfil
epidemiológico de enfermedades gástricas que pueden tener génesis en múltiples
factores, tales como: cultura, dieta, consumo especial de alimentos, estilos de
vida, protección, planes de acción. Se encontró una alta prevalencia de H. pylori
en la población de estudio.
Entre algunos estudios que asocian la variación ambiental y los factores genéticos
32
con la susceptibilidad a desarrollar CG, se pueden mencionar el realizado por Lee
y colaboradores (2006), que analizaron la posible asociación entre la
susceptibilidad al CG y factores genéticos (polimorfismos CYP1A1 y GSTM1) y
ambientales (tabaco y alcohol). Encontrando una fuerte relación entre la variante
alélica m2, variante de CYP1A1 con el tabaquismo y el alcoholismo que
representan altas posibilidades de padecer CG.
Ramos y colaboradores (2006), efectuaron un estudio en México para determinar
la presencia de mutaciones inactivadoras del gen CDH1 codificante de la E-
cadherina que juega un papel fundamental en el establecimiento y mantenimiento
de la adhesión intercelular y de la arquitectura de los epitelios. Fueron observados
polimorfismos de nucleótido único C→A en la región promotora de CDH1 en la
posición –160, el cual teóricamente confiere un aumento en el riesgo de
desarrollar cáncer gástrico difuso. Aunque, no existe actualmente evidencia
suficiente para considerar al polimorfismo –160 C→A como un factor etiológico
determinante de CG difuso debido a que la frecuencia y tipo de alteraciones en el
gen CDH1 se desconoce en poblaciones humanas.
Van Domselaar, y colaboradores (2007), presentan el caso de una familia con
Cáncer gástrico difuso hereditario (CGDH) portadora de una mutación en gen
CDH1 que mostraba un patrón de herencia autosómico dominante, mediante
estudios moleculares confirmaron el diagnóstico, que posibilitará la estimación del
riesgo individual en los familiares consanguíneos.
Mena & Yepez (2007) evaluaron in vitro la actividad anti-H. pylori de extractos de
algunas plantas regionales, encontrando resultados promisorios para extractos
como: aceite esencial de A. sativum (ajo), extracto acuoso A. sativum (ajo), aceite
esencial de follaje de R. officinalis (romero) y aceite esencial de follaje de R.
graveolens (ruda); quedando pendiente la ejecución de realizar pruebas de
citotoxicidad, genotoxicidad e inocuidad en modelos animales y estudios piloto en
humanos, como paso previo a la implementación del tratamiento.
Por su parte Molina y colaboradores (2007) observaron asociación fuerte entre el
hábito de fumar y el riesgo a CG. Además, una asociación significativa fue
encontrada entre el CG y los estratos socioeconómicos medio y bajo. Aunque
también existen otros factores de riesgo endógenos y exógenos que inciden en la
presentación de este tipo de cáncer no explorados en su estudio.
Entre las investigaciones inherentes a las variantes ambientales pueden
33
mencionarse las de Gómez y colaboradores (2009) que mediante un estudio en
pacientes colombianos, determinaron la prevalencia de los diferentes factores
medioambientales (hábitos alimenticios y tabaquismo) y familiares (antecedente de
cáncer gástrico) en pacientes con CG. Se encontró una correlación positiva con los
siguientes cuatro factores: adicionar sal a los alimentos antes de consumirlos,
ingesta de alimentos asados, antecedente de cáncer gástrico en familiares de
primer grado y consumo de alimentos cocidos al horno.
En el 2011, Jiang y colaboradores estudiaron las alteraciones genéticas en
quinasas que se han relacionado a múltiples patologías humanas, de esta forma
evaluaron la variación genética en quinasas vinculadas con el CG. El estudio
abordó la secuenciación de 532 proteínas en 14 líneas celulares de GC; logrando
identificar 10.604 variantes de un único nucleótido en los exones de quinasas, que
incluían más de 300 nuevas variantes no sinónimas.
En el año 2011, Nieves y colaboradores, evaluaron en 396 mujeres mexicanas los
polimorfismos de nucleótidos simples (SNPs) de la región promotora del gen FNTα
(-163, -238, -244, -308, -376, -857, -863, y -1031); destacando de sus resultados el
polimorfismo -376 FNTα con riesgo asociado al genotipo G/A (OR= 2,48) y como
factor de protección el genotipo G/G (OR = 0,37).
Pazos y colaboradores en el año 2012, caracterizaron la microbiota láctica gástrica
en dos regiones de riesgo diferente, con la probabilidad de inhibición de las
Bacterias Acido Lácticas (BAL) sobre H. pylori; reportando diferencias en la
prevalencia de las BAL; 35% en la Florida y 25% en Tumaco, regiones de alto y
bajo riesgo de cáncer de estomago, respectivamente.
34
5 MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 ASPECTOS GENERALES
Estudio retrospectivo realizado en la ciudad de Pasto, en tres etapas: fase de
campo (identificación e inclusión de pacientes); fase de laboratorio (procesamiento
de las muestras) y fase de análisis (caracterización de las regiones genómicas de
interés y correlación con factores medioambientales).
5.1.1 Identificación de pacientes diagnosticados con cáncer gástrico
susceptibles de ser incluidos en el proyecto de investigación
Una vez aprobado el estudio por el comité de ética en investigaciones de la
Universidad de Nariño, mediante acta No. 06 del 2 de diciembre del 2010, se
solicitó el aval de hospitales e institutos de patología, para la búsqueda de casos
de CG, específicamente en el hospital Departamental y Patólogos Asociados.
Fueron examinados los diagnósticos de CG registrados por estas entidades en los
años comprendidos entre el 2005 y 2009.
Principalmente, se recolectó la información correspondiente a: procedencia,
nombre, número de identificación, teléfono, año de diagnostico, ubicación del
tumor, otras enfermedades gástricas y la infección por H. pylori.
Los pacientes incluibles, fueron detectados a través de sus números de
identificación, usando tres bases de datos on-line: Fosyga, Registraduria nacional
y Procuraduría de la nación. En la primera, se confirmó la procedencia de cada
paciente, en la segunda plataforma, se filtró la información para precisar los
individuos sobrevivientes, y en la tercera base de datos, se verificó la identidad
oficial de cada uno.
Con los datos de los pacientes residentes en Pasto, que continuaban con vida y
que su documento de identidad coincidía con su nombre, se efectuó un plan de
contacto vía telefónica, con la finalidad de comentarles sobre el propósito del
presente estudio y gentilmente solicitarles nos permitan realizar una cita
domiciliaria.
35
5.1.2 Inclusión de pacientes en el estudio
Posterior a la conversación telefónica, se acordó con cada paciente una reunión
en sus domicilios. De manera amable y respetuosa, se les dio a conocer los
alcances del proyecto y así mismo, fueron invitados a formar parte de él. Dado el
caso de aceptación voluntaria del consentimiento informado, se llevo a cabo la
recolección de datos familiares-ambientales y la obtención de muestras de sangre.
5.1.3 Recolección de datos
Los datos fueron recolectados mediante el diligenciamiento de una encuesta
integrada por siete secciones:
-Sección 1: Información personal
-Sección 2: Origen geográfico del paciente
-Sección 3: Información sobre el cáncer gástrico
-Sección 4: Otras enfermedades gástricas
-Sección 5: Enfermedades extra gástricas
-Sección 6: Alimentación, alcohol y cigarrillo
-Sección 7: Historia familiar
5.1.4 Obtención de muestras de sangre
Con el apoyo de servicios particulares de enfermería, fueron recolectados por
persona, un máximo de tres tubos Vacutainer ® (con anticoagulante EDTA) con
3,5 ml de sangre cada uno, existiendo casos en los cuales, la viscosidad de la
sangre solo permitía la obtención de menos de tres tubos.
Las muestras de sangre fueron trasportadas en neveras con hielo a 4ºC, hasta las
instalaciones de medicina de la Universidad de Nariño, posteriormente, fueron
trasladadas al Laboratorio de Biotecnología Microbiana de la Universidad de
36
Nariño, donde se almacenaron en freezer a -20°C,hasta su procesamiento
molecular.
5.2 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN EN LOS GENES FNTΑ, CYP1A1 COMO
MARCADORES DE PREDISPOSICIÓN GENÉTICA
5.2.1 Extracción de DNA genómico a partir de muestras de sangre
Con la finalidad de obtener DNA de buena calidad y cantidad suficiente para
realizar las metodologías correspondientes a los marcadores moleculares, se
emplearon tres protocolos de kits comerciales y un protocolo clásico de extracción
de DNA a partir de muestras de sangre.
5.2.1.1 Protocolo Salting-Out modificado
5ml de muestra fueron sometidos a centrifugación (3000 rpm) durante 5 minutos,
se transfirió la fase intermedia a un tubo eppendorf, donde se trato con buffer TE.
Después de incubación en hielo por 10 min se centrifugó a 6000 rpm por 5 min. El
pellet fue resuspendido en buffer TE 1 M, incubado nuevamente en hielo por 10
min y centrifugado a 6000 rpm durante 5 minutos. Posteriormente, el pellet fue
tratado con 200 μl de buffer de lisis, 3 μl de proteinasa K y 100μl de SDS 10%. La
mezcla resultante fue incubada a 65°C durante 1hora y después incubada a -20°C
por 10 minutos. Después, se adicionaron 300 μl de NaCl 5M y se homogenizó con
vortex. La muestra fue sometida a centrifugación a 14000 rpm durante 12 minutos.
400μl del sobrenadante fueron tratados con 800 μl de etanol frio a 96%, se mezcló
por inversión hasta la formación de DNA visible. Se precipitó el DNA mediante
centrifugación a 14000 rpm durante 12 minutos, el pellet fue lavado con etanol al
70% (centrifugación 14000 rpm durante 5 minutos), el DNA fue secado overnight
en desecador, resuspendido en 20 μl de TE y almacenado a -20° C para su
posterior análisis.
37
5.2.1.2 Kit Bioline: protocolo de cultivo de células
300 μl de muestra fueron sometidos a centrifugación a 7500rpm por 10 minutos. Al
precipitado se le adicionaron 400μl de Buffer de Lisis D y 25 μl de proteinasa K, la
mezcla fue tratada con vortex por 5 segundos e Incubada a 50 ºC durante 1 hora.
Posteriormente, se agregaron 200μl de Buffer Binding D. La solución fue sometida
nuevamente a centrifugación a 12.000 rpm durante 2 minutos y en un nuevo tubo
eppendorf de 1,5 mL se pasó el sobrenadante, al que se le adicionó 700μl de
buffer de lavado. La mezcla se centrifugó a 12.000 rpm durante 1 minuto, se
descartó el sobrenadante y se lavó con 700μl de buffer de lavado, se centrifugó a
la misma velocidad anterior por 2 minutos. Finalmente, la columna fue lavada con
buffer a 8000 rpm durante 1 minuto. El DNA resultante fue almacenado a -20° C.
5.2.1.3 Kit Bioline: protocolo de tejido animal
300 μl de muestra de sangre fueron tratados con 400 μl de Buffer de Lisis D y 25
μl de proteinasa K. Después de mezclar lentamente, se incubó a 50 º C por 1 hora.
La mezcla fue sometida a vortex, 4 μl de RNasa fueron adicionados y se
centrifugó a 12.000 rpm por 1 minuto. Al sobrenadante se le adicionaron 200 μl de
Buffer Binding D, se homogenizó con vortex y se centrifugó nuevamente a 12.000
rpm durante 2 minutos. Posteriormente, se lavó el pellet con 700 μl de buffer de
lavado y se centrifugó a 12.000 rpm durante 1 minuto. La columna se lavó con 200
μl de buffer de elución, se centrifugó a 8.000 rpm durante 1 minuto. El DNA
resultante se almacenó a -20 º C hasta su análisis molecular.
5.2.1.4 Kit Promega
A 300 μl de muestra se le agregaron 900 μl de solución de lisis celular, mezclando
por inversión (5-6 veces), se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente y
se centrifugó a 14000 rpm durante 20 segundos. Fue descartado de manera
cuidadosa el sobrenadante, de tal forma que no fuera alterado el pellet blanco
resultante, el que fue resuspendido en 300 μl de la Solución de Lisis, se mezcló
por inversión cuidadosamente, se incubó la solución a 37°C por 1 hora,
posteriormente se adicionaron 100 μl de solución de precipitación de proteína, se
38
agitó durante 20 segundos y se centrifugó a 14000 rpm por 3 minutos. El
sobrenadante fue tratado con 300 μl de isopropanol a temperatura ambiente. La
solución fue mezclada por inversión hasta la formación de una masa visible en
forma de hilo blanco. Se centrifugó a 14000rpm durante 1 minuto para completar
la precipitación de DNA. El ácido nucleico extraído fue lavado con etanol al 70% y
finalmente resuspendido en 100 μl de Solución de Rehidratación, e incubado a
4°C overnight para disolución completa y finalmente almacenado a -20°C hasta su
análisis molecular.
5.2.2 Cuantificación de DNA
La cuantificación del material genético se realizó en un gel de agarosa al 1% en
buffer TAE 1X, teñido con bromuro de etidio (5ug/ml) y corrido en una cámara de
electroforesis Biorad a 70V por 2 horas. Se usó como marcador de tamaño
molecular Lambda HindIII de Promega. Después de la corrida, el gel se registró en
un fotodocumentador (Digi Doc-It, marca UVP). Inicialmente, la concentración (ng/
μl) de DNA de las muestras se estimó por comparación con las bandas del
marcador comprendidas entre 6557 pb (135 ng) hasta 4361 pb (90 ng). El ajuste
de las concentraciones fue realizado por espectrofotometría a 260/280 (Sambrook
et al., 1989).
5.2.3 Clonación acelular por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Los métodos descritos por Torres et al. (2004) fueron tomados como referente
teórico de amplificación de los genes de estudio. Se emplearon los iniciadores
descritos en la tabla 1; el DNA fue amplificado en presencia de los reactivos
descritos en la tabla 2. Como control negativo se sustituyó DNA por agua (Tabla
3).
39
Tabla 1. Secuencias, dirección y amplicones producidos por los primers utilizados
para amplificar los genes de estudio.
Marcador Secuencia (5’-3’) Sentido Producto PCR (pb)
β-globina
(Control +)
GGT TGG CCA ATC TAC TCC CAG G
Forward
262 TGG TCT CCT TAA ACC TGT CTT G
Reverse
CYP1A1
CAG CTG CAT TTG GAA GTG CTC
Forward 312
GAA CTG CCA CTT CAG CTG TCT Reverse
FNTα
AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT
Forward 107
TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG Reverse
Tabla 2. Concentraciones finales de reactivos empleados en la amplificación por
PCR.
Reactivo β-globina (control +) CYP1A1 FNTα
Buffer 0,5x 0,5x 0,5x
MgCl2 0,04mM 2mM 0,06 mM
C. directo 0,4 uM 0,4 uM 0,4 uM
C. reverso 0,4 uM 0,4 uM 0,4 uM
Dntp 0,4 uM 0,4 uM 0,4 uM
Polimerasa Taq 0,5 un/μl 0,25 un/μl
0,25 un/μl
ADN 6 ng/μl 6 ng/μl 6 ng/μl
Volumen ddAgua
(hasta 25 µL) 37 36,75 36,75
40
Tabla 3. Programas de termociclado, para la amplificación de los genes de
estudio.
Etapa β-globina CYP1A1 FNTα
Desnaturalización 95º(7’) 94º(5’) 93º(3’)
Desnaturalización* 94º(1’) 94º(2’) 92º(1’)
Alineamiento* 56º(2’) 59º(1’) 63º(1’)
Extensión* 72º(1’) 72º(1’) 72º(1’)
Extensión final 72º(5’) 72º(10’) 72º(10’)
*Ciclos 40 35 35
*Etapas y números de ciclos.
5.2.4 Electroforesis horizontal
En general, los productos de amplificación fueron corridos en gel de agarosa al
1,2% en buffer TAE 1X a 70V durante dos horas, al finalizar este periodo el gel fue
observado en un fotodocumentador (Digi Doc-It, marca UVP.) y las almacenadas
las imágenes registradas en formato TIFF para posterior análisis.
5.2.5 Secuenciación
Los amplicones para cada uno de los genes fueron enviados a Macrogen para su
secuenciación. El protocolo usado en la empresa está basado en el uso de 20 ng
del producto amplificado, el que se purifica y dispensa en placas de 96 pozos, que
es sometida a secuenciación automatizada en ambos sentidos, con los
respectivos cebadores empleados en la amplificación (Tabla 1). Fue usando
BigDye (AB, versión 3.1) para la síntesis de DNA a partir de las plantillas y dNTPs
marcados con fluorocromos específicos para cada nucleótido. Las secuencias de
nucleótidos marcadas con fluorocromos se detectaron por electroforesis capilar en
un analizador de secuencias de DNA ABI 3730x1, produciendo un
41
electroferograma y secuencia alfabética de los nucleótidos en archivos fasta.abs y
en archivos con extensión ab1. Estos registros fueron enviados directamente de
Macrogen al correo electrónico registrado para su correspondiente análisis.
5.2.6 Edición de secuencias
Con base en los electroferogramas obtenidos por secuenciación, se llevo a cabo la
búsqueda de picos sin su nucleótido respectivo ó con un nucleótido no
coincidente, para corregir la real coincidencia con las herramientas de edición del
programa Chromas Lite 2.1.1.
Las secuencias obtenidas de cada paciente fueron alineadas usando el paquete
informático Bioedit 7.2.0, mediante el algoritmo ClustalW; se removió gaps y se
obtuvo una secuencia consenso por cada individuo, a las cuales se les sustituyó
las bases ambiguas resultantes de acuerdo al código IUPAC.
5.2.7 Análisis de secuencias
Con el fin de caracterizar las regiones de interés por paciente, se analizó el
conjunto de secuencias para determinar su distancia evolutiva (arboles
filogenéticos), similaridad genética (dendrogramas), variabilidad en los marcadores
(índices de variabilidad genética) y perfil de riesgo (alelos asociados al riesgo de
CG).
5.2.7.1 Construcción de arboles filogenéticos
Los alineamientos consenso de cada paciente fueron introducidos en el programa
Mega 5.2, se construyeron arboles de representación de relación filogenética,
mediante el algoritmo Filogenia por el método UPGMA, y fue tomada como raíz
interna una secuencia
42
5.2.7.2 Construcción de dendrogramas
Las secuencias consenso fueron introducidas individualmente en el paquete de
Pdraw32, donde se efectuaron cortes in silico, con 10 enzimas de restricción
previamente seleccionadas, se construyó una matriz binaria con la presencia (1) o
ausencia (0) de cada fragmento de tamaño particular. Esta matriz constituyó el
input para el programa NTSYSpc 2.11f, con el que se efectuó el cálculo de
similaridad para cada uno de los genes y entre pacientes, empleando los índices
DICE y Jaccard con el método UPGMA.
5.2.7.3 Cálculo de índices de variabilidad genética
Usando el software DnaSP5, se calcularon a partir de las secuencias consenso
algunos índices de variabilidad genética, principalmente, sitios variables y cambios
promedio por sitio.
5.2.7.4 Determinación de los alelos de riesgo
De acuerdo a investigaciones previas, existe la posibilidad de diferenciar
secuencias normales de secuencias asociadas al riesgo de CG mediante el uso de
enzimas de restricción, usando el programa Pdraw32, en el caso del FNTα se
realizó el corte in silico con NcoI (Torres et al. 2004), si hay presencia del sitio de
restricción (secuencia normal) genera dos fragmentos (84 pb y 23 pb,
aproximadamente), mientras que la secuencia de riesgo presenta una mutación no
reconocible para la enzima y sólo genera una banda. Para CYP1A1, se evaluó la
restricción con dos enzimas diferentes: BsrD1 y NcoI, en ambos casos el alelo
normal es reconocido por la enzima (BsrD1 genera fragmentos de tamaño
aproximado a 157 pb y 140 pb), (NcoI genera fragmentos de 234 pb y 63 pb),
mientras que el alelo con el polimorfismo, no es reconocido y por tanto genera una
única banda (mutante), (Díaz 2003).
43
5.3 DETERMINACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES
AMBIENTALES Y LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN
PACIENTES DEL MUNICIPIO DE PASTO.
La información ambiental fue analizada a partir de la sección 6 de la encuesta
realizada, de la cual se analizaron los hábitos alimenticios. Relacionando el
consumo (más de 2-3 veces por semana) o no consumo (menos de 2-3 veces por
semana) de los siguientes factores dietéticos asociados al riesgo de CG: Carnes
blancas, carnes Rojas, alimentos asados, frutas, ensaladas, habas, comidas
saladas y comer a deshoras.
En cuanto a la incidencia del alcohol, se consultó al paciente el tipo de bebida
alcohólica y su frecuencia de consumo, considerando como bebedores a aquellas
personas que ingerían regularmente el equivalente a un promedio superior a dos
copas de vino al día (400 ml).
Para la definición del hábito tabáquico, la población se estratificó en cuatro
categorías: no fumadores, fumadores ocasionales (1-20 paquetes/año), fumadores
moderados (21-40 paquetes/año) y fumadores excesivos (> 40 paquetes/año). A
los ex -fumadores (aquellos que habían dejado el hábito un años antes de este
estudio) se considerarán no fumadores (Molina et al. 2007). También se consideró
la exposición al tabaco en la figura de fumadores pasivos.
Una vez definido el comportamiento de los parámetros de exposición-dieta, se
evaluó su posible dependencia con el grado de predisposición genética en
CYP1A1 y FNTα.
5.4 EVALUACIÓN DE LA RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES FAMILIARES Y
LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL
MUNICIPIO DE PASTO.
Recopilando la información de las secciones 2 y 7 de la entrevista otorgada por los
pacientes, se tuvieron en cuenta los antecedentes familiares de cáncer gástrico o
cualquier otro tipo de cáncer, edad, sexo, y grupo sanguíneo de los participantes,
verificando las posibles relaciones existentes con la susceptibilidad de cada gen
evaluado.
44
5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
El comportamiento de cada variable fue evaluado con estadística descriptiva
univariada. Obteniendo promedios y desviaciones estándar en cuanto a la edad de
los pacientes. En el caso de las variables categóricas-binarias como factores
ambientales, familiares y la predisposición genética, la representación se hizo en
tablas de frecuencias con porcentajes.
La relación entre la predisposición genética de cada gen y los factores
ambientales- familiares, fue representada mediante tablas de contingencia,
calculando la dependencia con las variantes genéticas encontradas, mediante el
estadístico chi-cuadrado y evaluando la significancia estadística con el p-valor.
Se evaluó la dependencia de los parámetros significativos del modelo bivariado
con el modelo general de susceptibilidad genética (recuento de la predisposición
en CYP1A1 y FNTα). Las variables familio-ambientales incidentes en la variación
de cada gen, así como la predisposición genética general, fueron sometidas a
regresión logística en el paquete estadístico de Statgraphics 5.1, mediante el
algoritmo de máxima verosimilitud.
45
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 ASPECTOS GENERALES
6.1.1 Identificación de pacientes diagnosticados con cáncer gástrico Entre los años 2005 y 2009 fueron encontrados 168 casos de cáncer gástrico en el
Hospital Departamental y Patólogos Asociados. El sexo masculino representó el
69% y el sexo femenino el 31%, equivalentes a aproximadamente una razón de
2:1. El rango de edades de estos pacientes se encontró entre los 27 y 91 años,
con una edad media de 65,64± 14.22 años, destacando que el 70.83 % de los
casos se encuentra por encima de los 51 años (Tabla 4).
Tabla 4.Frecuencia y porcentaje de individuos con cáncer gástrico según sexo y
grupos etarios
Variable Frecuencia Porcentaje
Sexo
Masculino 116 69.05
Femenino 52 30.95
Edad
Media ± DS
65,65± 14.23
Rango 27-91
≤ 40 11 6.55
41-50 13 7.74
51-60 39 23.21
61-70 30 17.86
71-80 50 29.76
>80 25 14.88
46
A partir de la información disponible en los reportes y las historias clínicas de estos
168 pacientes, tales como exámenes de endoscopia y diagnósticos patológicos,
fue encontrado con mayor frecuencia, el carcinoma de tipo intestinal en el 63.7 %
y la localización de tipo proximal fue la más abundante con el 51.85 % de las
historias informantes, equivalentes al 8,3 del total de historias clínicas analizadas
(Tabla 5).
Tabla 5. Frecuencia y porcentaje de individuos con cáncer gástrico según la
infección por Helicobacter pylori y diagnóstico histopatológico
Variable Frecuencia Porcentaje
Helicobacter pylori
Presente 5 3
Sin dato 163 97
Total 168 100
Tipo histológico
Intestinal 107 63.7
Difuso 34 20.23
Mixto 6 3.57
Sin dato 21 12.5
Total 168 100
Localización
Distal 12 7.1
Proximal 14 8.3
Distal y proximal 1 0.6
Sin dato 141 84
Total 168 100
47
Se contabilizó un bajo diagnostico de H. pylori en apenas el 3% de los casos de
CG examinados (Tabla 5), para las regiones de menor prevalencia se deduce que
si bien H. pylori es el principal agente etiológico para el desarrollo de CG, no es
suficiente ya que solo un bajo porcentaje de los infectados (1-2%) desarrolla CG
(Regino et al., 2009); sin embargo, en ciertas localidades donde la prevalencia de
H. pylori es muy alta, las pruebas diagnósticas para la infección no son costo-
efectivas. De esta manera es factible hacer la suposición de la presencia de este
patógeno entre los casos de CG (OMG, 2010), esto puede explicar el bajo registro
de la infección, entre centros de patología y hospitales.
6.1.2 Inclusión de pacientes en el estudio
A partir de los números de cédula de ciudadanía de cada uno de los 168 casos
encontrados, se inició un procedimiento de identificación y filtro para determinar
los pacientes a integrar el estudio, esto se llevó a cabo en cuatro niveles:
6.1.2.1 Comprobación de los números de identificación: En la base de datos
de la Procuraduría General de la Nación (www.procuraduria.gov.co), el 97% de los
contactos fueron correctos en cuanto a número de identificación, es decir, se
encontraron anomalías en apenas el 3% de los casos, por falta de número de
identificación o por corresponder a una persona diferente, siendo así casos
atípicos en reportes de patología.
6.1.2.2 Identificación de pacientes sobrevivientes a la fecha de contacto: en
la base de datos de la Registraduria Nacional del Estado Civil
(www.registraduria.gov.co) se verificó, si los pacientes aún se encontraban con
vida o habían fallecido, para los cuales la registraduria expedía sendas
resoluciones de defunción. Se encontró que el 49% correspondía a los pacientes
sobrevivientes, mientras que el 51% restante era fallecido.
6.1.2.3 Identificación de la procedencia de los pacientes: en la base de datos
del Fosyga se indagó la procedencia geográfica de los pacientes. El 64.2 %
resultó ser de Nariño, mientras que el 35.8 % restante pertenecía a otras regiones,
por lo cual fueron excluidos del estudio.
48
6.1.2.4 Filtro y depuración de pacientes a formar parte del estudio: para esta
investigación se consideraron aquellos pacientes con identidades correctas,
residentes de San Juan de Pasto y que siguiesen con vida. El 48% de los 168
casos, equivalentes a 34 pacientes reunieron estas tres condiciones.
Con este grupo se efectuaron diálogos telefónicos, y de este conjunto 24
individuos no reunieron los criterios de inclusión, en algunos casos por
defunciones no actualizadas en la registraduria, ó bien por datos incorrectos de
dirección y teléfono, delicado estado de salud, ó la no aceptación del
consentimiento informado. Considerando estos hechos fueron incluidos 10
pacientes para la investigación.
El grupo de pacientes considerados, con una edad media de 59,8± 13,13 años, se
encontraron entre los 40 y 78 años, de los cuales el 50% de los casos se
distribuyeron en el sexo masculino, con una edad media de 60± 15,2 años y el
otro 50% correspondientes al sexo femenino, con una edad media de 59,6± 12,54
años, siendo así dos grupos muy homogéneos (Tabla 6).
Tabla 6. Frecuencia y porcentaje de pacientes participantes en el estudio, según
edad y sexo.
Variable Frecuencia Porcentaje
Sexo
Masculino 5 50
Femenino 5 50
Edad
Media ±
DS 59,8± 13,13
Rango 40-78
Masculino 60± 15,2
Femenino 59,6± 12,54
49
6.2 ANÁLISIS DE LA VARIACIÓN EN LOS GENES FNTΑ, CYP1A1 COMO MARCADORES DE PREDISPOSICIÓN GENÉTICA
6.2.1 Aspectos generales
En esta sección se describen los principales hallazgos de la fase de laboratorio y
de análisis bioinformático. Se partió con la extracción de DNA, para ello fue
seleccionando el protocolo más efectivo, acorde al estado de las muestras
sanguíneas, se continuó con la amplificación de los genes de estudio y análisis de
las mismas, considerando su origen filogenético, similaridad y variabilidad
genética, convergiendo en la determinación de los SNPs de cada gen, como
indicadores teóricos de predisposición genética al CG.
6.2.2 Extracción de DNA genómico a partir de muestras de sangre
Fue fundamental para los análisis moleculares contemplados en el proyecto,
contar con material genético (DNA) de buena calidad y cantidad, por ello fueron
ensayados varios métodos. Inicialmente, se intentó estandarizar el protocolo de
“Salting out” con algunas variaciones, sin obtener un éxito significativo,
posiblemente por el prolongado almacenamiento de las muestras.
Con la intención de encontrar un método de extracción adecuado al estado de las
muestras, se uso el kit de aislamiento Bioline, del cual se probaron los métodos de
cultivo y de tejido, logrando obtener DNA de buena calidad a través del primero de
ellos (Figura 2a), bajo este protocolo se extrajo DNA de las 23 muestras restantes,
con ello se obtuvo la extracción de 18 muestras que cumplían con los
requerimientos de los marcadores moleculares seleccionados para este estudio
(Figura 2b y 2c).
Adicionalmente, se probó también el kit Promega, logrando el aislamiento de DNA
de las 7 muestras restantes (Figura 2d), completando así la extracción de DNA
para todas las muestras de este estudio.
A pesar del prolongado almacenamiento de las muestras se logró la extracción de
DNA, con los kits Bioline y Promega, sin embargo en términos de efectividad en
cuanto a tiempo empleado, cabe decir que usando el kit Bioline fueron requeridas
50
135ng 90ng
135ng 90ng
135ng 90ng
6 horas para procesar 15 muestras, mientras que con Promega se necesitaron
cerca de 13 horas en el protocolo con 7 muestras, detectando así un mayor
rendimiento en términos de tiempo, con el empleo del kit Bioline.
Figura 1. Patrones electroforéticos del DNA, procedentes de las muestras de
sangre: A) Estandarización a partir del kit Bioline, las bandas corresponden a las
muestras procesadas por el método de cultivo celular, B) y C) Muestras
procesadas por el método cultivo D) Muestras procesadas con el kit promega.
Fuente: Esta investigación.
6.2.3 Cuantificación de DNA
En base al método de densitometría, tomando como referencia la intensidad de la
tercera y cuarta banda del marcador Lambda Hind III, se estandarizó para cada
muestra, una concentración de DNA entre los 90 y 135 ng/ul, diluyendo las
muestras más concentradas como se indica en la Tabla 7.
135ng 90ng
51
Tabla 7. Estandarización de las concentraciones de DNA a 100 ng/ul
6.2.4 Estandarización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
6.2.4.1 Amplificación genes mediante reacción en cadena de polimerasa
PCR
Tomando como base la información en la literatura, se consideraron algunas
condiciones de operación del termociclador, y de concentración de la reacción de
PCR. Se emplearon tres muestras de DNA (FE0023, FE0081, FE0243) como
controles positivos y como control negativo fue utilizada el agua. Las
modificaciones relacionadas con temperaturas y tiempo de de termociclado, al
igual que variaciones en la concentración, permitieron estandarizar y optimizar las
reacciones de amplificación de los genes de estudio. Se obtuvieron en total 26
reacciones por gen.
52
Tabla 8. Programas del termociclador para los la amplificación de los genes de β-globina, CYP1A1 y FNTα
Etapa β-globina CYP1A1 FNTα
Desnaturalización inicial 95º(7’) 94º(5’) 93º(3’)
Desnaturalización* 94º(1’) 94º(2’) 92º(1’)
Alineamiento* 56º(2’) 59º(1’) 63º(1’)
Extensión* 72º(1’) 72º(1’) 72º(1’)
Extensión final 72º(5’) 72º(10’) 72º(10’)
*Etapas y números de ciclos. 6.2.4.2 β-globina
La amplificación de este gen como control positivo de reacción, fue indicativo de la calidad del DNA empleado, como de la confirmación de ser la muestra de origen humano. Para estandarizar el protocolo (Tabla 9) se probaron dos buffer diferentes (Colorless y 5Xgreen,) obteniendo resultados similares en ambos tratamientos, sin embargo, debido a que las muestras se secuenciarían, se seleccionó el buffer colorless para evitar interferencias por el colorante que tiene el 5XGreen, que podría repercutir en obtener secuencias con ruido (Figura 3).
Tabla 9. Condiciones estandarizadas de PCR para la amplificación del gen β-globina.
Tratamiento Referencia Buffer
colorless Buffer
5Xgreen Buffer
colorless
Reactivo 1X 4X 4X 26X
Agua 37 148 148 962
Buffer 5 20 20 130
MgCl2 1,5 6 6 39
DNTp Mix 1 4 4 26
Primer A 1 4 4 26
Pimer S 1 4 4 26
Taq polimerasa 0,5 2 2 13
Volumen sin ADN 47 188 188 1222
53
C)
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000
750 500 250
Figura 2. Patrones electroforéticos de los amplificados de β-globina, A.
Estandarización, B y C Amplificados del gen β-globina para la totalidad de las
muestras. (Gel de agarosa 1,2%, corrido en buffer TAE 1X a 60V durante dos
horas).
A)
Fuente: Esta investigación.
6.2.4.3 CYP1A1
Se emplearon las condiciones expuestas en la Tabla 8, la estandarización se
realizó utilizando cuatro tratamientos de ensayo (Tabla 10), cambiando tipo de
buffer (5XGreen ó Colorless), cantidad de enzima (0, 25µl - 0,5µl de GoTaq-pol),
como se ilustra en la figura 4A, se obtuvieron los mejores resultados de
amplificación cuando se trató el mix con buffer Colorless y 0,25 µl de enzima
GoTaq (Figura 4B y 4C).
B)
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000
750 500 250
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 250
54
Tabla 10. Condiciones de variación de la reacción de PCR para la estandarización
y optimización de la amplificación del gen CYP1A1
Tratamiento Referencia
1
Referencia
2
A B C D A
B.
colorless,
0,25
enzima
B.
colorless,
0,5
enzima
B.
Xgreen,
0,25
enzima
B.
Xgreen,
0,5
enzima
B.
colorless,
0,25
enzima
Reactivo 1X 1X 4X 4X 4X 4X 26X
Agua 36,75 36,5 147 146 147 146 955,5
Buffer 5 5 20 20 20 20 130
MgCl2 2 2 8 8 8 8 52
DNTp Mix 1 1 4 4 4 4 26
Primer A 1 1 4 4 4 4 26
Pimer S 1 1 4 4 4 4 26
Taq
polimerasa 0,25 0,5 1 2 1 2 6,5
Volumen
sin muestra 47 47 188 188 188 188 1222
55
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500
250
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000
750 500
250
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000
750 500 250
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500
250
B) C)
A) A)
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000
750 500 250
Figura 3. Patrones electroforéticos de los amplificados de CYP1A1, A.
Estandarización, B y C Amplificados del gen CYP1A1 para la totalidad de las
muestras. (Gel de agarosa 1,2%, corrido en buffer TAE 1X a 70V durante dos
horas)
Fuente: Esta investigación.
6.2.4.4 FNTα
Las condiciones para la estandarización de PCR fueron las mostradas en la tabla
8, y en un principio la estandarización se enfocó en la cantidad de buffer de
reacción, empleando en los ensayos 5 µl y 10 µl, obteniendo una mejor visibilidad
de producto con 5 µl de buffer (Figura 5A), y con base en ello se amplificaron las
muestras, empleando las cantidades de reactivos de la tabla 11, logrando
56
amplicones como los de las figuras 5B y 5C. Para optimizar la calidad de
amplificado se realizaron ensayos posteriores, disminuyendo temperaturas de
alineamiento en el termociclador, cantidades de reactivos, descartando casos de
contaminación, sin obtener mejoras significativas con relación a las iníciales
(Figuras 5B y 5C).
Tabla 11. Condiciones de variación de la reacción de PCR para la estandarización
y optimización de la amplificación del gen FNTα
Tratamiento 5 ul
Buffer
10ul
Buffer
5 ul
Buffer
10 ul
Buffer
5 ul
Buffer
Reactivo 1X 1x 4X 4X 26X
Agua 36,75 31,7 147 126,8 955,5
Buffer 5 10 20 40 130
MgCl2 2 2 8 8 52
DNTp Mix 1 1 4 4 26
Primer A 1 1 4 4 26
Pimer S 1 1 4 4 26
Taq polimerasa 0,25 0,3 1 1,2 6,5
Volumen
preparado sin
muestra
47 47 188 188 1222
57
1000 750 500 300 150
50
10000 8000 6000 5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500
250
1000 750 500 300 150
50
1000 750 500 300 150 50
3000 2000 1500 1200 1031 900 800 700 600 500 400 300 200 100
Figura 4. Patrones electroforéticos de los amplificados de FNTα, a)
estandarización, b) y c) amplificados del gen FNTα para la totalidad de las
muestras. (Gel de agarosa 1,2%, corrido en buffer TAE 1X a 80V durante dos
horas)
Fuente: Esta investigación.
6.2.5 Secuenciación
Un total de 75 productos (25 por cada gen amplificado) fue enviado a Macrogen-
Corea para su secuenciación, obteniendo como resultado un total de 150
secuencias (75 secuencias Forward y 75 secuencias Reverse), por cada muestra
amplificada se recibieron secuencias en los formatos: pdf, fasta, phd1, y ab1, este
último fue el formato utilizado para su edición.
C) A) B)
58
6.2.6 Edición de secuencias
Las secuencias con la extensión ab1, fueron editadas mediante el software
Chromas Lite 2.1.1, en general se inspeccionó la correcta coincidencia de los
picos de los cromatogramas con sus nucleótidos, una vez verificada la buena
calidad de las secuencias, se usó el software Bioedit 7.2.0, en el cual se
efectuaron alineamientos, que ayudaban a determinar las regiones no pareadas
del principio y del final de cada fragmento, estas regiones fueron suprimidas junto
con las pequeñas secciones vacías resultantes (Gaps). Posterior a ello, se obtuvo
una secuencia consenso por cada paciente, las bases ambiguas resultantes
fueron sustituidas por códigos IUPAC, obteniendo un total de 10 secuencias
consenso por cada paciente evaluado.
6.2.7 Análisis de la variación genética de FNTα, en la población de estudio
A continuación se registraron los principales resultados obtenidos como la previa
caracterización del FNTα, evaluando su procedencia filogenética, similaridad y
variabilidad genética, así como la prevalencia de la mutación en la muestra
evaluada.
6.2.7.1 Construcción de arboles filogenéticos
El árbol filogenético construido mediante algoritmo neighborjoining, permitió
dilucidar la presencia de dos clusters mayores: un clúster conformado por todas
las secuencias del gen FNTα, dentro de este, se observa un subcluster solamente
agrupando a las secuencias del gen FNTα de los pacientes de este estudio y otro
clúster conformado solamente con la raíz externa(Neisseria gonorrhoeae).
59
Figura 5. Árbol filogenético construido mediante el algoritmo neighborjoining,
usando las secuencias consenso analizadas por cada paciente para FNTα. Control
interno: fragmento equivalente al tamaño del gen, control externo: gen PilE, de
Neisseria gonorrhoeae.
PacienteFE013
PacienteFE014
PacienteFE033
PacienteFE002
PacienteFE026
PacienteFE008
PacienteFE034
PacienteFE019
PacienteFE025
PacienteFE024
Human gene for tumor necrosis factor (TNF-alpha)
Neisseria gonorrhoeae ( individual isolate: 1-38-BU2) pi l in (pi lE) gene, 3' end
Fuente: Esta investigación
6.2.7.2 Construcción de dendrogramas:
Se determinó la similaridad genética, partiendo de alineamientos de las
secuencias consenso por paciente, incluyendo un fragmento control de la región
de estudio del Genbank, un total de 10 secuencias y un control interno se
sometieron al corte in silico usando las herramientas del software Pdraw32 usando
10 enzimas de restricción: (BmgT120I, BsaJI, BsmFI, CviJI, HaeIII, MnII, NIaIV,
Sau96I, ScrFI, StyD4I). Con base en los resultados generados usando el
coeficiente DICE, se construyó un dendrograma (Figura 7), el cual muestra que
para el gen FNTα, los pacientes comparten un 30% de similaridad genética y que
existen tres subclusters compartiendo un 70%, es decir, las muestras FE013,
FE033, FE014, FE019, FE024, FE034, FE025, FE026, presentan menor
variabilidad genética, respecto a este gen.
60
Figura 6. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias FNTα, construido usando el método UPGMA, coeficiente DICE, (r= 0.95951) y el software NTSyS 2.11f, se aprecia un conglomerado con el 70% de similitud, formado por ex-fumadores, con un solo fumador pasivo (FE024).
Coeficiente DICE
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
ControlMW
FE002
FE008
FE013
FE033
FE014
FE019
FE024
FE034
FE025
FE026
Control
Fuente: Esta investigación
Interpretando el dendrograma usando el coeficiente Jaccard (Figura 8) se encontró que las muestras comparten un 20% de similaridad, con respecto al obtenido por el índice DICE, fue posible deducir que si bien el grado de similitud disminuye, los agrupamientos son similares.
Además de la baja variabilidad observada para FNTα entre los fumadores (Anexo
D: sección 6), se ha demostrado que el cigarrillo tiene el potencial de influir en
estos factores del sistema inflamatorio y la existencia de variantes genéticas más
susceptibles al estimulo ambiental (Hamajima et al. 2006, Ying et al. 2009).
Adicional a la asociación del tabaquismo con la similaridad genética del FNTα, los
metabolitos derivados del cigarrillo, forman aductos con el DNA y causan
mutaciones en genes supresores de tumores, como Rb y p53, y la conversión de
proto-oncogenes en oncogenes (Martínez, 2012).
61
Figura 7. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias FNTα,
construido usando el método UPGMA, coeficiente Jaccard, (r= 0.97075) y el
software NTSyS 2.11f, se aprecia un conglomerado con un 55% de similitud,
formado por ex-fumadores, con un solo fumador pasivo (FE024).
Fuente: Esta investigación
6.2.7.3 Variabilidad genética según las posiciones de los polimorfismos.
En la tabla 12, se describen algunos datos referentes a SNPs, no comunes en la
literatura. En la mayoría de trabajos se han descrito SNPs con una o dos variantes
(normal y rara), fue relevante el hecho de encontrar en este estudio, sitios hasta
con tres y cuatro variables, acontecimiento no muy usual en estudios previos
sobre estas regiones genéticas.
Los conceptos actuales en torno a los estudios recientes sugieren que la
constitución genética del individuo es relevante en la evolución de las
enfermedades (Chávez & Vallejo, 2013). El FNTα es una citocina proinflamatoria
que participa en diversos patologías como la psoriasis vulgar y la artritis psoriasica
(Gallo et al. 2012). Esta citocina induce varias respuestas celulares asociadas a la
inflamación de los tejidos y la producción de citocinas proinflamatorias. Además de
los polimorfismos en la región promotora, la exposición ambiental puede llegar a
modificar la expresión de esta variante (Muñoz y Medina, 2011).
62
Tabla 12. Frecuencias y posiciones genéticas de Polimorfismos presentados en
los genes FNTα y CYP1A1
Parámetro FNTα CYP1A1
Sitos Variables (dos variantes)
7 17
Posiciones 3 4 9 41 42 78 90
4 5 8 16 22 23 27 30 32 59 112 114 115193 194 197 198
Sitios Informativos de Parsimonia (dos variantes)
12 7
Posiciones 5 7 10 12 17 33 36 38 58 64 91 94
9 20 28 57 104 108 192
Sitos Variables (tres variantes)
1 1
Posiciones 6 3
Sitios Informativos de Parsimonia (tres variantes)
2 5
Posiciones 14 93 1 2 11 14 165
Sitos Variables (tres variantes)
0 0
Posiciones
4 3
Sitios Informativos de Parsimonia (tres variantes)
8 15 19 20 10 15 43
Posiciones 26 33
63
Los casos con genotipos mutantes en comparación con los normales, tienen un
aumento en la producción de FNTα y un riesgo mayor de CG (De Luis et al.,
2011), en estudios previos se han evaluado cambios en cuanto a la regulación
transcripcional y polimorfismos en la zona promotora que afectan los niveles de
producción de RNAm, en especial en las posiciones -238 y -308 -857 y -1031
(Soria, 2009, Gallo et al., 2012).
En sujetos con Hepatitis C se ha estimado La prevalencia de estos polimorfismos
en las posiciones -308 -238 mutantes, en menos de un 12% (Trujillo et al., 2010).
En Valladolid se encontró la frecuencia del cambio G308A (grupo mutante) en un
22.7%, (Aller et al., 2012)
El alelo mutante “A” del polimorfismo -308 Guanina/Adenina (-308 G/A) del gen
FNTα, está implicado a una mayor producción de la proteína y frecuentemente
asociado a la predisposición a enfermedades inmunológicas, infecciosas e
inflamatorias.
En una población de mestizos en Lima se encontró este alelo presente en un
12,5% de pacientes (Acosta et al., 2010), mientras que en diferentes localidades
de Colombia Martínez y colaboradores en el 2011, estimaron una prevalencia del
14%.
6.2.7.4 Análisis de los SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido) en FNTα,
asociados a riesgo de Cáncer Gástrico
Cambios en un solo nucleótido, pueden alterar los productos proteicos de un gen,
para FNTα se ha reportado una mutación de riesgo de CG, la cual se puede
detectar mediante el uso de enzimas de restricción. En este caso, se evaluó el
corte enzimático in silico sobre el gen (Figura 9A), el alelo normal presenta un
sitio de restricción reconocible por la enzima, mientras que el alelo mutante no fue
cortado por tener un sitio de restricción irreconocible para la respectiva
endonucleasa.
Fue calculada la frecuencia de los fragmentos individuales o dobles obtenidos a
partir de cada secuencia consenso, al igual que la prevalencia del alelo normal y la
variante de riesgo (Figura 9b), se destaca por aparecer en el 40% de los casos.
64
Figura 8. A. Patrones de electroforesis, in silico para FNTα. Las secuencias fueron
sometidas a la enzima de corte NcoI, se aprecia en algunos pacientes el alelo
normal (2 fragmentos) y en otros el alelo asociado al riesgo de Cáncer gástrico
(108 pb). B. Prevalencia de la mutación estudiada en FNTα.
Fuente: Esta investigación
6.2.8 Análisis de la variación genética de CYP1A1, en la población de
estudio
A continuación se registran los principales resultados obtenidos que describen el
comportamiento de los pacientes en cuanto a la variación de la secuencia del gen
amplificado de CYP1A1, su procedencia filogenética, similitud y variabilidad
genética, así como la prevalencia de la mutación en la muestra de estudio.
6.2.8.1 Determinación de la distancia filogenética
Fue evaluada filogenéticamente la procedencia de las muestras, se incluyeron
outgroups de dos regiones genéticas con tamaño similar a las de estudio, las
cuales fueron útiles para la obtención del árbol filogenético (Figura 10). Los
resultados obtenidos permitieron la verificación de formación de dos grandes
clusters, el primero representa un taxa diferente a Homo sapiens (Neisseria
gonorrhoeae) y el segundo, la secuencia diferencial del genbank de la región
evaluada para CYP1A1 y los amplicones de los pacientes de estudio. Era
esperado estos datos, dado el filtro de procedencia realizado en la fase de
reclusión de pacientes.
A)
B)
65
Figura 9. Árbol filogenético construido usando el algoritmo NeighborJoining,
usando las secuencias consenso analizadas por cada paciente para la región de
CYP1A1. Control interno: fragmento equivalente al tamaño del gen, control
externo: gen PilE, para Neisseria gonorrhoeae.
Paciente013
Paciente034
Paciente002
Paciente019
Paciente026
Paciente014
Paciente008
Paciente033
Paciente024
Paciente025
Homo sapiens cytochrome P450, family 1, subfamily A, polypeptide 1 (CYP1A1)
Neisseria gonorrhoeae ( individual isolate: 1-38-BU2) pi l in (pi lE) gene, 3' end
Fuente: Esta investigación
6.2.8.2 Determinación de la similaridad genética
Se evaluó la similaridad genética partiendo de alineamientos de las secuencias
consenso por paciente, más un fragmento control de la región de estudio del
Genbank, la matriz binaria construida interpretando la ausencia o presencia de
fragmentos diferentes según su tamaño y la base de datos resultante fue
procesada en NTSYSpc 2.11f computando la distancia genética por los índices
DICE y Jaccard, graficando así los respectivos dendrogramas por coeficiente.
Aplicando el coeficiente DICE fue obtenido un dendrograma (Figura 11) en el cual
se encontró que las muestras comparten aproximadamente un 60% de similaridad
y se notan dos grandes agrupamientos el primero correspondiendo al outgroup, el
66
segundo integrado por la raíz interna para el gen y las secuencias genéticas de los
amplicones de los pacientes estudiados. Se observan que todas las secuencias
para este gen de los pacientes estudiados comparten un 76% de similaridad
genética.
Figura 10. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias de CYP1A1,
construido usando el método UPGMA, coeficiente DICE, (r= 0.98782) y el software
NTSyS 2.11f.
Coefficient
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
ControlMW
FE002
FE008
FE014
FE024
FE034
FE013
FE025
FE033
FE019
FE026
Control
Fuente: Esta investigación
Comparando el dendrograma construido usando el índice DICE con respecto al
obtenido por el coeficiente Jaccard (Figura 12), se observa que las muestras
comparten aproximadamente el 40% de similaridad, y las muestras FE008 y
FE024 comparten un estado clonal del 97%, deduciendo características similares
para la población de estudio.
67
Figura 11. Dendrograma de similaridad genética de las secuencias CYP1A1,
construido usando el método UPGMA, coeficiente Jaccard, (r= 98199) y el
software NTSyS 2.11f.
Coefficient
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
ControlMW
FE002
FE008
FE014
FE024
FE034
FE013
FE025
FE033
FE019
FE026
Control
Fuente: Esta investigación
6.2.8.3 Variabilidad genética según las posiciones de los polimorfismos.
Las posiciones polimórficas para CYP1A1, fueron reportadas en la Tabla 12, este
gen codifica la estructura del Citocromo P-450 y se ha considerado como un
posible indicador de predisposición genética frente a la exposición ante
contaminantes ambientales como los hidrocarburos aromáticos policíclicos
(HAPs), presentes en el tabaco (Dres et al. 2004). Este elemento participa en la
primera fase del metabolismo de ciertos compuestos tóxicos, completando el
proceso con una denominada fase II donde intervienen genes como el GSTM1
(Moraes et al., 2012).
Se han reportado cuatro variantes polimórficas del gen CYP1A1, el CYP1A1*1 es
el tipo salvaje, CYP1A1*2 ó m1 es una sustitución 6235 TxC, detectable con la
enzima MspI, el polimorfismo CYP1A1*3 (m2) ó Ile x Val, detectable con las
enzimas NcoI, o BsrDI, y el CYP1A1*4, exclusivo de poblaciones africanas (Díaz,
2003).
68
Se han estudiado algunos de estos en poblaciones humanas, en Valencia,
España, Collado en el 2012, detectó la prevalencia de las variantes raras
CYP1A1*2A, CYP1A1*2B, y CYP1A1*4 en un 12-16%, 8-9% y 9.5%,
respectivamente. En afrobrasileros Kvtko y colaboradores en el 2006 detectaron
que la forma CYP1A1*2A aparecía en un 30% de la población, más alta que en
sitios europeos, según ese estudio. Los polimorfismos m1 y m2, se han asociado a
incrementada actividad enzimática, y han sido catalogados como raros (11%) en
una población portuguesa (Mota et al., 2010).
El polimorfismo ILE-VAL, se asocia, a menudo, con incrementada actividad
enzimática y ha sido ligado a una elevada producción de metabólitos reactivos,
que forman aductos en el DNA (Castaño et al., 2009, Cavbaco et al., 2012), este
polimorfismo de CYP1A1 Ile462Val, se ha relacionado fuertemente con el riesgo a
enfermedades, mucho más cuando las enzimas de la fase I (CYP1A1) y II
(GSTM1) de la detoxificación, se encuentran alteradas (Santos et al. 2011).
6.2.8.4 Análisis de los SNPs (Polimorfismos de Nucleótidos Simples) en
CYP1A1, asociados a riesgo de Cáncer Gástrico
Cambios en un solo nucleótido, pueden alterar los productos proteicos de un gen.
Para CYP1A1 fueron evaluados mediante corte enzimático in silico con las
endonucleasas BsrDI y NcoI (Figura 13a), algunos SNPs descritos para este gen
fueron evaluados el alelo normal presenta un sitio de restricción reconocible por
cada enzima, mientras que el alelo mutante no fue cortado, el sitio de restricción
fue irreconocible para cada enzima.
Fue calculada la frecuencia de los fragmentos individuales o dobles obtenidos a
partir de cada secuencia consenso, la prevalencia del alelo normal y la variante de
riesgo (Figura 13B) fue estimada, se interpretó como predisposición en el gen,
aquellas muestras cortadas por las dos enzimas (Figura 13A). La frecuencia del
alelo de riesgo fue estimada en el 50% de los casos.
69
Figura 12. A. Perfiles genéticos para CYP1A1in silico generados por corte con
enzimas de restricción por el programa pDraw 32 1.1.116 A. Las secuencias
fueron sometidas al corte con las enzimas NcoI y BsrDI, se observa en algunos
pacientes el alelo normal (2 fragmentos) y en otros el alelo asociado al riesgo de
Cáncer gástrico (1 fragmento), las regiones no cortadas por ninguna de las dos
enzimas se interpretaron como mutantes. B. Prevalencia del alelo de riesgo.
Fuente: Esta investigación
Los datos de estimación de prevalencia del alelo de riesgo para cada fragmento
evaluado, coincidieron en la medida del grado de predisposición genética entre los
pacientes vía recuento, es decir, definiendo como sujetos predispuestos a aquellos
que presenten las mutaciones de riesgo en cualquiera de los dos genes, de esta
forma se encontró que el 60% de los casos tiene riesgo, el modelo general de
prevalencia de predisposición genética fue graficada en la figura 14.
A)
B)
70
Figura 13. Prevalencia de susceptibilidad genética en la muestra de pacientes de
estudio, en porcentaje la probabilidad de mutación para cualquiera de los dos
genes evaluados.
Fuente: Esta investigación
En los resultados obtenidos del análisis genético, se encontraron orígenes
filogenéticos similares entre pacientes, dado el relativo acercamiento entre las
secuencias. En este estudio se observó más del 50% de similitud genética en
ambos factores y además de describir otras variantes (no muy reportadas) en los
fragmentos, fueron detectados los alelos de riesgo en la población con
prevalencias del alelo “raro” FNTα del 40% y para CYP1A1 del 50%.
Fue fundamental evaluar el comportamiento de CYP1A1 dado que constituye la
mayor porción del citocromo CYP450 (Meyer et al., 2002), complejo enzimático
encargado de la biotransformación y la activación de precarcinógenos, (Bozina et
al., 2009). El metabolismo llevado a cabo por estas enzimas puede determinar la
susceptibilidad individual a enfermedades, dado que polimorfismos SNPs en la
secuencia de CYP1A1 están relacionados con el incremento de la actividad
catalítica de la enzima, (Elcoroaristizabal et al., 2011), lo que ocasiona un aumento
en la activación de precarcinógenos que pueden alterar el DNA si no son
detoxificados por otras enzimas (Ghisari et al., 2013).
González y colaboradores en el 2004, reportaron la frecuencia de variantes de
riesgo para el gen CYP1A1en un 34% para una población costarricense, mientras
Lee y colaboradores en el 2006 describen una prevalencia del alelo raro (mutante)
en un 28%. De modificarse la actividad esta enzima, que tiene la función de
71
metabolizar hidrocarburos aromáticos como el benzopireno, se podrían acumular
metabolitos mutagénicos y aumentar riesgo de CG (Lee et al., 2006).
Se han reportado varios SNPs para FNTα, en la región promotora, los cuales
pueden determinar una expresión aumentada del gen, además de la respuesta a
factores infecciosos del CG, ya se ha relacionado previamente con diversas
enfermedades como artritis reumatoidea, alzheimer, malaria, choque séptico, que
pueden conducir a la muerte. (Aguillon et al, 2002, Ramírez et al., 2013).
Dada las diversas facetas de acción del FNTα, es necesario desarrollar nuevas
vacunas y alternativas farmacológicas de tratamiento, para lograrlo, una
herramienta poderosa sería identificar los mecanismos moleculares que rigen la
producción de este factor y conocer su prevalencia en las poblaciones. En Rio de
Janeiro, se reportó la presencia del alelo “raro” en el 14% de pacientes estudiados
con tuberculosis, (De Olivera et al., 2004), en una población del departamento del
Cauca, Torres y colaboradores en el 2004, reportan una prevalencia de la
mutación estudiada de FNTΑ en un 18%, frente al 40% registrado en el presente
estudio.
Considerando que las frecuencias encontradas para los alelos raros, tienden a
superar a las reportadas en otras latitudes, se puede inferir que estas diferencias
en cuanto a la prevalencia de estos genotipos anormales y otras variantes
genéticas pueden aportar explicaciones de interés a la diferencia que existe entre
las regiones en cuanto a sus tasas de Incidencia.
6.3 RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES AMBIENTALES Y LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO DE PASTO
En el cumplimiento del segundo objetivo especifico, fueron analizados dos niveles, el primero relacionado con la descripción individual de los principales factores dietarios-ambientales estudiados, y el segundo relacionado con determinar la dependencia de cada uno, en la mutación de cada gen evaluado.
De los factores descritos en la tabla 13, fue especialmente notoria la tendencia hacia la alimentación a deshoras (80%), mientras la mayoría de los demás parámetros tienden a distribuirse de manera más “equitativa” entre la muestra de estudio, y también se destacó la baja frecuencia de consumo de alcohol entre los participantes (30%)
72
Tabla 13. Frecuencia, porcentaje y porcentaje acumulado de los hábitos
alimenticios y de exposición en la muestra de estudio.
Hábito/factor
dietario Frecuencia Porcentaje
Porcentaje
acumulado
Sal
adicional
Si 4 40,0 40,0
No 6 60,0 100,0
Total 10 100,0
Comer a
deshoras
Si 8 80,0 80,0
No 2 20,0 100,0
Total 10 100,0
Habas
Si 6 60,0 60,0
No 4 40,0 100,0
Total 10 100,0
Frutas
Si 6 60,0 60,0
No 4 40,0 100,0
Total 10 100,0
Carne Blanca
Si 4 40,0 40,0
73
Hábito/factor
dietario Frecuencia Porcentaje
Porcentaje
acumulado
No 6 60,0 100,0
Total 10 100,0
Carne Roja
Si 5 50,0 50,0
No 5 50,0 100,0
Total 10 100,0
Ex fumador
Si 5 50,0 50,0
No 5 50,0 100,0
Total 10 100,0
F. Pasivo
Si 6 60,0 60,0
No 4 40,0 100,0
Total 10 100,0
Alcoholismo
Si 3 30,0 30,0
No 7 70,0 100,0
Total 10 100,0
Posterior a la determinación del comportamiento de cada factor, se efectuó el
modelo bivariado por tablas de contingencia, con el propósito de examinar la
asociación existente entre los parámetros de exposición evaluados con la
74
prevalencia de la susceptibilidad a FNTα y de CYP1A1.
Para determinar la existencia de estas asociaciones se consideraron los
estadísticos obtenidos del análisis bivariado, el primero chi2, que mide el grado de
diferenciación del tratamiento y el segundo el p-valor, el cual determina si estas
diferencias son estadísticamente significativas para inferir la dependencia de los
factores. De esta forma se graficó por cada gen la diferenciación del estadístico
chi2, y el p-valor.
En la figura 15, es posible apreciar la relación estadística de cada factor con la
región de FNTα, se hizo notoria la asociación entre el consumo de habas y la
mutación del gen (p<0.10), mientras los demás parámetros parecen ser
independientes de la prevalencia de la mutación, (p>0.10).
En Pasto se registró un estudio que ya había encontrado en un modelo
experimental con ratones (Mus musculus), los cambios que el consumo de habas
(Vicia fava) puede llegar a inducir en la mucosa gástrica (Bolaños, 2007). En este
estudio se detectó la asociación de este alimento con la prevalencia del alelo
mutante, lo cual se puede comprender según estudios que han reportado al 4-
cloro-metoxiindol como compuesto natural presente en Vicia faba que al
reaccionar con nitratos puede producir N-nitroso compuestos, que tienen cierto
potencial mutagénico (Tiedink et al., 1991).
Se ha estimado que un gramo de haba fresca contiene 0.35 nmol del mutageno
clave en la activación de N-nitroso compuestos, (Llanes y Tannembaun, 1982) el
cual es precursor de genotóxicos como el 1-Nitrosoindol-3-acetonitrilo (NIAN),
participantes en la producción endógena de los N-nitroso-compuestos sustituidos
formados bajo condiciones ácidas, y se ha confirmado que pueden formar aductos
de DNA, e incluso inducir la separación de las hebras de material genético de
células estomacales de ratones (Furihata et al., 1996) (Matsubara et al., 2012).
75
Figura 14. Dependencia de parámetros ambientales con la prevalencia de la
mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en FNTα
Fuente: Esta investigación
Por su parte en la figura 16 se observa la relación estadística de los factores de
exposición, con la prevalencia de variantes en la región de CYP1A1, a diferencia
del comportamiento de las variables con FNTα, en este caso se destacó
claramente la dependencia del consumo de carnes rojas y alcoholismo (p<0.05),
en la prevalencia de la mutación de riego de esta región genética.
Analizando la ingesta de carnes rojas sobre el riesgo de CG, se ha detectado que
tiene relación con el desarrollo de la neoplasia, observando que la carne roja
puede ser conjuntamente sustrato para la formación endógena de nitrosaminas,
así como fuente de otras sustancias cancerígenas como las aminas heterocíclicas,
a partir de los nitratos adicionados a la carne para su conservación. Compuestos
que sumados a las inadecuadas reparaciones de DNA pueden convertirse en
mutagénicos (Jakszyn, 2006).
76
Es importante revisar los hábitos alimenticios, pues se ha evidenciado que las
fuentes exógenas de los nitratos y nitrosaminas constituyen un gran riesgo de CG,
(Larsson et al., 2006), estos son los productos derivados de la carne que pueden
ser catalizados por la microbiota bacteriana del tracto digestivo (Hua et al., 2011),
para producir Nitroso-compuestos con potencial mutagénico y cancerígeno (Ghosh
et al., 2010), estos metabolitos pueden ser más efectivos como cancerígenos en
animales cuando se aplican en dosis pequeñas y repetidas en comparación con
una dosis alta aislada (Agudo y González, 2002), sugiriendo la relevancia de la
cultura alimenticia en la salud. Ya se ha demostrado la formación de aductos
(Ramírez 2004) por Nitroso-compuestos en colonocitos humanos (Knekt et al.,
1990).
Se ha demostrado que los efectos de la acción de alcohol, combinados con el
habito tabáquico, pueden incrementar hasta 5 veces el riesgo de CG (Sjödahl et al,
2007), análisis previos de la composición y metabolismo del alcohol, han
encontrado que primer producto metabólico del etanol es el acetaldehído,
compuesto que tiene el potencial para formar aductos en el material genético
(Barnes et al., 2000, Granado, 2012).
Sin embargo, se destacó la ausencia de relación de la susceptibilidad genética
con factores protectores con capacidad antioxidativa como las frutas (Serafini et
al., 2012) ó factores de riesgo con compuestos potencialmente genotóxicos, como
el consumo de cigarrillo. Por tal razón se hizo alusión a la organización del
material genético en la célula, de forma que la molécula de DNA parece asociado
con histonas; estos factores pueden modificase por causa de las variaciones del
ambiente, lo que puede determinar la expresión génica sin implicar cambios
directos en el material genético (Ondarza, 2012).
Se ha hecho manifiesto en la literatura, que estas alteraciones de orden
epigenético, pueden llegar a ser tan relevantes, como las mutaciones en el
material hereditario, constituyendo un papel fundamental en la génesis de las
neoplasias (Menéndez et al., 2012), de hecho entre los recientes estudios
realizados en el mundo ya sugieren procesos epigenéticos específicos, que
pueden determinar la expresión de RNA en la aparición de cáncer colorrectal
(Suzuki et al., 2011)
77
Figura 15. Dependencia de parámetros ambientales con la prevalencia de la
mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en CYP1A1.
Fuente: Esta investigación
6.4 RELACIÓN ENTRE LOS FACTORES FAMILIARES Y LA
SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER GÁSTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO
DE PASTO.
En el cumplimiento del tercer objetivo especifico, se desarrollaron dos enfoques, el
primero centrado en la evaluación el comportamiento individual de los principales
factores genético-familiares estudiados, y el segundo, determinar la dependencia
de cada uno de ellos con la predisposición en los genes evaluados.
De los factores descritos en la tabla 14 fue posible destacar la distribución de los
casos de CG en su 90% por encima de los 41 años de edad, la predominancia del
grupo sanguíneo 0 y el hecho de que el 70% de pacientes manifestó haber
presentado al menos un antecedente de cáncer en su círculo familiar.
78
Tabla 14. Frecuencia y porcentajes de casos de Cáncer Gástrico, discriminados
por factores genéticos y familiares.
Factor Frecuencia Porcentaje Porcentaje
acumulado
EDAD
Menos de 40 años 1 10,0 10,0
41-50 años 2 20,0 30,0
51-60 años 2 20,0 50,0
61-70 años 2 20,0 70,0
Más de 71 años 3 30,0 100,0
Total 10 100,0
SEXO
Masculino 5 50,0 50,0
Femenino 5 50,0 100,0
Total 10 100,0
GRUPO SANGUINEO
0 6 60,0 60,0
A 3 30,0 90,0
B 1 10,0 100,0
Total 10 100,0
ANTECEDENTES
FAMILIARES DE
CÁNCER
No 3 30,0 30,0
Si 7 70,0 100,0
Total 10 100,0
Posteriormente, para determinar la situación de cada factor, se efectuó el modelo
bivariado por tablas de contingencia, con el propósito de examinar la asociación
existente entre los parámetros genéticos evaluados con la prevalencia de la
susceptibilidad de cada gen, evaluando su dependencia con diferenciación
estadístico chi2, y significancia estadística mediante el p-valor.
79
En la figura 17 es posible apreciar la relación estadística de cada factor con la
región de FNTα, en general ninguno de ellos evidencia una dependencia
estadísticamente significativa (p >0.05), a pesar de observar una notable, pero no
significativa diferenciación (chi2), en grupo sanguíneo y en edad (p>0.10).
Figura 16. Dependencia de parámetros genéticos-familiares con la prevalencia de
la mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en FNTα
Fuente: Esta investigación
Mientras en la figura 18 se observa la relación estadística de los factores con la
región de CYP1A1, similar a lo acontecido con el FNTα, ninguno de ellos evidencia
una dependencia estadísticamente significativa (p >0.05), a pesar de observar una
alta diferenciación (chi2), en la edad, (p>0.10).
80
Figura 17. Dependencia de parámetros genéticos-familiares con la prevalencia de
la mutación asociada al riesgo de Cáncer gástrico en CYP1A1.
Fuente: Esta investigación
No existió evidencia de la relación entre los factores genéticos que pueden incidir
en el desarrollo de CG, con la susceptibilidad genética del humano. Sin embargo,
la asociación puede ser significante al considerar los hábitos de vida, etnias y
razas de las poblaciones humanas (Pasha et al., 2009).
De manera general, el sexo masculino tiende a ser el más afectado por cáncer
gástrico, con una incidencia 2:1 (Pérez, 2008), en Pasto los hombres tienden a ser
más afectados por esta neoplasia (Yepez et al., 2012), sin embargo esta
investigación no evidencia la dependencia del género con el desarrollo de
mutación. Los papeles fisiológicos en particular el desarrollo de CG no son claros,
pero se ha pensado que la hormona femenina estrógeno de origen ovárico ó
exógeno, pueda producir un efecto protector (Camargo et al., 2012, Michiels,
2012).
En cuanto al tipo sanguíneo, sorprendió en el presente estudio la baja frecuencia
del grupo A, aunque no es muy bien conocido su papel, se ha explicado que un
factor de adherencia bacteriana “BabA” con blanco en el antígeno sanguíneo
81
Lewis b se encuentran en el grupo sanguíneo A, pudiendo así influir sobre la
entrega de los factores bacterianos VacA o CagA, que producen daño directo en el
epitelio gástrico (Bermúdez, 2008), pero no se ha reportado evidencia de relación
con alteraciones genéticas.
Aunque el CG puede aparecer en cualquier época de la vida, la avanzada edad
encontrada de los pacientes, concuerda con la mayoría de reportes que incluso
han sugerido se está haciendo el diagnóstico por encima de la sexta y séptima
década de vida (Reina et al., 2011, American Cáncer Society, 2013, Ayala &
Lotero, 2013), la ausencia de relación de la prevalencia de las mutaciones con la
edad sugiere que este puede ser un factor importante en el tiempo de exposición y
acción de los factores ambientales en el organismo, hubo ligera pero no
significativa dependencia.
De los antecedentes familiares, se destacó el gran porcentaje de pacientes que los
presentan, se ha estimado la posibilidad de que individuos con antecedente
familiar de CG, compartan predisposición genética (Nadauld y Ford, 2012). En esta
investigación no hubo dependencia de la historia familiar de cánceres con los
factores moleculares, aunque se ha demostrado que existen genes con líneas de
mutación germinal como el caso de CDH1 (Vam Domselaar et al., 2007), en otros
tipos de CG, no han sido encontradas estas líneas de mutaciones familiares, por lo
que se asocian comúnmente a factores ambientales (Ayala & Lotero, 2013).
Finalmente, para entender la dependencia múltiple de los factores con el modelo
de prevalencia de la predisposición (Figura 14), fueron incluidos aquellos
parámetros significativos (p<0.10) del modelo bivariado. Por la parte ambiental,
fueron incluidas en este análisis, variables significantes del bivariado como el
consumo de habas, consumo de carne roja y habito de alcoholismo, mientras que
los factores genético-familiares, se omitieron en este análisis por tener una
significancia no evidente (p>0.10).
82
Tabla 15. Significancia estadística de las variables dependientes con la
predisposición genética y los parámetros ambientales.
Factor Chi-
cuadrado DF P-valor
Carne Roja 2.91103 1 0,0880
Alcoholismo 4.49868 1 0,00339
Habas 9.55672 1 0,0020
Las variables independientes (factores ambientales) que formaron parte del
modelo de regresión logística (Tabla 15), inciden en la constitución genética del
individuo (p<0.10), en orden creciente de asociación, consumo de habas,
alcoholismo y consumo de carne roja.
Como parte de los parámetros significativos, el alcohol puede producir como
metabolito endógeno acetaldehído, el cual a su vez induciría a la formación de
aductos de material genético. Se contempló el hecho de importar al cuerpo 4-cloro
metoxiindol mediante el consumo de habas, a su vez la carne contiene nitritos que
pueden endógenamente reaccionar con el 4-cloro metoxiindol proveniente de la
ingesta de haba para formar nitroso compuestos con potencial genotóxico
(Jakszyn 2006, Lewin et al., 2006,).las nitrosaminas generadas con estos
metabolitos ejercen sus efectos carcinógenos mediante la potencial la unión de los
grupos alquilo que pueden interferir en el apareamiento de las bases en la doble
hélice de DNA. Este daño conlleva mutaciones y por consiguiente a un mayor
riesgo de la génesis del cáncer. Por lo que se ha recomendado mantener el nivel
más bajo posible de los precursores de compuestos con potencial genotóxico
(Anton & Lizaso, 2001).
Esta investigación abordó la selección de técnicas para el procesamiento de
muestras sanguíneas, es pionera en cuanto al análisis genético para la región,
refiriendo particularmente, la estandarización de protocolos de extracción de DNA,
clonación acelular por PCR de los genes de riesgo, determinación de variabilidad
genética por corte in silico de alelos de riesgo de CG (o de otras enfermedades
relacionadas), constituyéndose los resultados encontrados en una base indicativa
de la caracterización de perfiles genéticos humanos de susceptibilidad al
83
desarrollo de cánceres en Nariño, se explora y se reporta otras alternativas de
análisis de variabilidad genética en dos enfoques, el primero desde el punto de
vista de las posiciones polimórficas no consideradas en la mayoría de trabajos, el
segundo punto de vista estriba en constituirse en uno de los primeros trabajos
donde analiza la similaridad genética y los factores ambientales que puede incidir
ó no en la mutación puntual de riesgo, pero que pueden estar asociados a la
homogenización genética y por ende, afectar la respuesta humana a la fluctuación
de condiciones de vida.
La mayoría de trabajos se encaminaron a estudiar los factores de riesgo de
manera individual, de esta forma, en la región sólo se disponía de un número
limitado de estudios sobre H.pylori, y mediante esta investigación, se ingresa al
campo de los factores ambientales y genéticos, y se explora sus posibles
interrelaciones, considerando las condiciones a las que la población está expuesta
y contribuir a la modelación de la respuesta individual, ante agentes de riesgo
ambientales o infecciosos.
En diferentes trabajos de orden nacional o mundial, se ha subrayado la
importancia de conocer las relaciones de factores de riesgo, pero no se había
cristalizado estudio alguno de este tipo, disponer de hallazgos previos como los
reportados, puede contribuir a entender mejor el comportamiento y génesis de la
enfermedad en la región y estandarizar estrategias para aumentar los saberes
científicos que converjan en medidas preventivas más eficaces, para la población
enmarcada en alto riesgo de CG.
84
CONCLUSIONES
1. El tabaquismo parece estar asociado a la reducción de la variabilidad de
FNTα, esto conlleva a afectar la respuesta del hospedero a la infección por
H. pylori.
2. Se encontraron los alelos de riesgo en la población de estudio, lo que
puede sugerir una inadecuada respuesta de los individuos ante H. pylori
(FNTα) o compuestos potencialmente tóxicos (CYP1A1).
3. No se evidenció una fuerte asociación entre la predisposición genética y
antecedentes familiares de cáncer. Sugiriendo así, la importancia del
componente ambiental en procesos genotóxicos y cancerígenos.
4. Se encontró una asociación estadísticamente significativa, entre las
variables ambientales como el alcoholismo, consumo de habas y carne
roja, con los indicadores evaluados de predisposición genética.
5. Una posible explicación a los contrastes en la frecuencia de cáncer gástrico
en diversas regiones, puede estar asociada, a diferentes prevalencias de
los alelos mutantes entre cada localidad.
6. La detección de prevalencias importantes en las mutaciones, sugiere
falencias en los mecanismos de reparación genética y anomalías en el
trabajo de los genes supresores de tumores.
85
RECOMENDACIONES
Para establecer el riesgo potencial de un determinado alimento o hábito tóxico,
son indispensables estudios toxicológicos; en especial, los de toxicidad crónica
para descartar o evidenciar mutágenos y carcinógenos.
Es necesario efectuar revisiones y meta análisis del tema y sus factores de riesgo,
a fin de integrar los hallazgos encontrados y disponer de puntos de partida más
claros en futuras investigaciones.
Efectuar investigaciones de tipo experimental, para determinar con mayor
especificidad, la influencia de la dieta ó los hábitos en la salud.
Formular y promover investigaciones en torno a los factores de riesgo de CG en la
región.
86
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RUAULT MC, CLAVEL-CHAPELON F, MOROIS S, GRIONI S, PANICO S,
TUMINO R, SACERDOTE C, RAMON QUIRÓS J, MOLINA-MONTES E, HUERTA
CASTAÑO JM, BARRICARTE A, AMIANO P, KHAW KT, WAREHAM N, ALLEN NE,
KEY TJ, JEURNINK SM, PEETERS PH, BAMIA C, VALANOU E,
TRICHOPOULOU A, KAAKS R, LUKANOVA A, BERGMANN MM, LINDKVIST B,
STENLING R, JOHANSSON I, DAHM CC, OVERVAD K, JENSEN M, OLSEN A,
TJONNELAND A, LUND E, RINALDI S, MICHAUD D, MOUW T, RIBOLI E,
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96
LISTA DE ANEXOS
ANEXO A : FORMATO DE RECOLECCIÓN DE DATOS PERSONALES Y PATOLÓGICOS DE CASOS DE CG.
Nombre ____________________________________________No. Historia Clinica _________________ 1. Edad_____________ 2. Sexo____________________ 3. Tipo de sangre __________________ 4. Dirección del paciente____________________________ Tel _______________________________ 5. Dirección de un contacto___________________________ Tel _______________________________ 6. Antecedentes de cáncer: Si _____No _____ Tipo de cáncer: ________________________________ __________________________________________________________________________________________________ 7. Antecedentes Familiares: ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 8. Localización del tumor (patología) proximal ___________ Distal _____________ 9. Tipo de detección del carcinoma: Temprano____________ Avanzado___________ 10. Tipo Histológico ________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 11. Helicobacter pylori: Presente ____________ Ausente ______________ 12. Presencia de enfermedades precursoras de malignidad: Si _____ No _________ Cuales:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
97
ANEXO B: FORMATO DE PARTICIPACIÓN VOLUNTARIA EN LA
INVESTIGACIÓN: “INCIDENCIA DE FACTORES GENETICO-AMBIENTALES EN
LA SUSCEPTIBILIDAD AL CANCER GASTRICO EN PACIENTES DEL
MUNICIPIO DE PASTO”
Universidad de Nariño
Formato de Participación Voluntaria En La Investigación: “INCIDENCIA DE FACTORES GENETICO-AMBIENTALES EN LA SUSCEPTIBILIDAD AL
CANCER GASTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO DE PASTO”
Por favor lea con detenimiento este documento. Si después de ello, usted está interesado en
participar en la investigación, señale con una X el cuadro del Si (si acepta) o del No (si no acepta)
cada uno de los enunciados que aparecen a continuación. Si no entiende completamente o, si
desea más información, por favor pregúntenos antes de firmar.
Línea de Investigación Salud y medio ambiente
Nombre del paciente:
Fecha y lugar de nacimiento:
Yo confirmo que he entendido en que consiste esta investigación y que tuve la
oportunidad de hacer preguntas y solucionar todas las dudas al respecto.
Si No
Yo entiendo que mi participación es voluntaria y que puedo retirarme de la
investigación si lo deseo sin necesidad de argumentar ninguna razón ante el
investigador principal.
Si No
Yo autorizo al investigador principal y a las personas designadas por él para que
revisen mi historia clínica con el propósito de llevar a cabo la presente investigación.
También autorizo a dicho investigador y a las personas designadas por él, para que
fotocopien y archiven dicha información, la cual sólo podrá ser usada en análisis
Si No
98
confidenciales.
Yo autorizo al investigador principal, y a las personas designadas por él, a que me
tomen tres muestras de sangre para que las almacenen y utilicen en la presente
investigación u otras a las que diese lugar con fines exclusivamente científicos. Yo
entiendo que las muestras proporcionadas serán anónimas. Sólo el investigador
principal, y las personas autorizadas por él, tendrán acceso a dicha información y a los
resultados obtenidos con ellas.
Si No
Yo autorizo al investigador principal, y a las personas designadas por él, para que usen
mis muestras de sangre con el fin de investigar y entender los factores genéticos
involucrados en el cáncer Gástrico
Si No
Yo autorizo a que las muestras de sangre que he proporcionado sean almacenadas y
estudiadas por el investigador principal, y por las personas designadas por él, en
futuras investigaciones relacionadas con cáncer gástrico y otras a las que diese lugar
con fines de investigación únicamente.
Si No
Yo estoy de acuerdo en participar en la presente investigación. Si No
------------------------------------------------------------------- ----------------------------------- ------------------------
Nombre del participante y número de cédula Fecha Firma
------------------------------------------------------------------ ---------------------------------- --------------------------
Persona que obtiene el consentimiento (testigo) Fecha Firma
99
ANEXO C: ENTREVISTA SOCIO-ECONÓMICA, CLÍNICA Y AMBIENTAL DE LA
LÍNEA DE INVESTIGACIÓN EN ASPECTOS GENÉTICOS Y GENÓMICOS DEL
CÁNCER EN COLOMBIA
Proyecto: “INCIDENCIA DE FACTORES GENETICO-AMBIENTALES EN LA SUSCEPTIBILIDAD AL CANCER GASTRICO EN PACIENTES DEL MUNICIPIO DE PASTO”
Fecha de diligenciamiento: _______________________________________
Diligenciado por: _______________________________________________
Sección 1. Información Personal
Código del paciente: ___________________
Número de historia clínica: __________________________Hospital:___________________
Tipo de afiliación al sistema de salud: __________EPS: __________________ Número de afiliación a la EPS: ________________________________
Apellidos: _____________________Nombres: ____________________________
Lugar y fecha de nacimiento: _____________________Edad: _____________ Número de cédula: ______________________ Profesión:_____________________ Sexo: _____ Grupo sanguíneo:___________
Dirección:________________________________________________
Teléfono: _______________________Barrio:__________________________________ Estrato socio-económico:______ Escolaridad:_________________
Grupo étnico: __________________Estado civil: ________________
100
Sección 2. Origen geográfico del paciente
Pariente Nombre Edad1 Ha tenido o tuvo cáncer?
Lugar de nacimiento
Padre
Madre
Abuelo Paterno
Abuela Paterna
Abuelo Materno
Abuela Materna
Detalles:
1 Edad actual (si están aún vivos) o al momento de la muerte. Si está muerto escribir (M) después de la edad
101
Sección 3. Información sobre el Cáncer Gástrico
3.1 El cáncer
Sintomatología Inicial: (Síntoma, duración)
__________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
¿A qué edad le dio el cáncer?:___________________
Localización del tumor: ________________________
Tipo de tumor: _____________________________________________
¿Cómo le diagnosticaron el cáncer?: __________________________________________________________
¿Qué tipo de tratamiento le hicieron?: __________________________________________________________
¿Cuáles cree usted que fueron las causas de su cáncer? ________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Sección 4. Otras enfermedades Gastricas
¿Ha padecido usted de alguna de las siguientes enfermedades gástricas? (Responder si o no):
Gastritis _______________________________ Metaplasia Intestinal: ____________________Hernia hiatal: __________________Otra (¿cuál?): ___________________________________
Detalles:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________
102
Sección 5. Enfermedades extra-gastricas
Enfermedad Edad de
aparición
Medicamento usado o
tratamiento
Frecuencia de uso de la droga o duración del
tratamiento
Duración de la
enfermedad
Cáncer
Diabetes tipo I
Diabetes tipo II
Hipertensión
Problemas cardíacos
Triglicéridos
Alergias
Infecciones
Otras (¿cuál?)
Describir:
103
Sección 6. Alimentación, Alcohol y Cigarrillo
6.1 Alimentación
Describir la frecuencia con que come cada uno de los siguientes alimentos y su método de cocción
Alimento Frecuencia Periodo (d-s-m-a) Método de preparación
Pollo
Pescado
Carne de Res
Carne de Cerdo
Ensaladas
Frutas
Carnes rojas
Habas
¿Qué tipo de grasa usa para cocinar?:___________________________
¿Cóme con frecuencia a deshoras?:_____________________________
Tiende a consumir alimentos salados o simples?______________________________
6.2 Alcohol
aguardiente ron cerveza Otro________________
Unidad de consumo
frecuencia
Años de consumo
104
6.3 Tabaquismo
¿Fuma?:________________ ¿Es usted un ex-fumador?:______________________
¿Por cuánto tiempo fumó antes del cáncer :___________________________________
¿Con qué frecuencia fumó? (cigarrillos/día): _________________________________________
¿Fumaba antes o cuando le dio el cáncer?____________________________________________
¿Fumaban en su casa u oficina antes o cuando de dio el cáncer?:_________________________
¿Está expuesto o ha estado expuesto al cigarrillo (fumador pasivo)?: ___________ ¿En dónde?:___________
Sección 7. Historia familiar
hombres mujeres total
Padres
Abuelos
Hermanos completos
Hermanos medios
Tios paternos
Tios maternos
Primos paternos
Primos maternos
¿Cuáles son las enfermedades más comunes en su familia?:_____________________________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
105
____________________________________________________________________________________
Información sobre abuelos y parientes de primer grado
Nombre Parentesco Edad1 ¿Ha tenido o tuvo cáncer?2
Otras enfermedades3
¿Está vivo?
1. Edad actual o al momento de la muerte, 2. Responder si o no y especificar el órgano de ser necesario, 3 Especificar el nombre de la otra enfermedad y la edad aproximada a la aparición
106
Sección 8. Información adicional
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
ANEXO D: INFORMACION PROVENIENTE DE LA ENCUESTA SOCIO-AMBIENTAL Y CLÍNICA
SECCION 1: Información Personal
CODIGO P.
EPS EDAD LUGAR DE
PROCEDENCIA LUGAR DE
RESIDENCIA PROFESION SEXO
GRUPO SANGUÍNEO
ESTRATO SOCIO-
ECONIMICO ESCOLARIDAD
ESTADO CIVIL
FE026 emmsanar 40 Pasto Pasto Mesero profesional M 0+ 2 3 B soltero
FE002 prosalud 78 Ipiales Pasto Ama de casa F A+ 2 3 B Casada
FE024 caprecom 53 Pasto Pasto Ama de casa F B+ 3 3p separada
FE034 saludcoop 46 Ipiales Pasto Topografa F 0+ 3 Tecnologo Casada
FE025 66 Yacuanquer Pasto Ama de casa F A+ 2 p separada
FE014 emmsanar 49 Tambo Pasto Vendedor estacionario M 0+ 2 3p
Union libre
FE033 saludcoop 75 Pasto Pasto Conductor M 0+ 1 3p Casado
FE013 saludcoop 63 Pasto Pasto Comerciante M 0+ 3 Curso Casado
FE019 73 Tuquerres Pasto Agricultor M A+ 2 4p Casado
FE008 55 Providencia Pasto Ama de casa F 0+ 3- p Casada
SECCION 2: Origen Geográfico del Paciente
PADRE MADRE ABUELO PATERNO ABUELA PATERNA ABUELO MATERNO ABUELA MATERNA
COD. P.
ha tenido cáncer
procedencia ha
tenido cáncer
procedencia ha
tenido cáncer
procedencia ha
tenido cáncer
procedencia ha
tenido cáncer
procedencia ha
tenido cáncer
procedencia
FE026 no Florida seno Robles no Robles no Robles leucemia Sandona Diabetes Robles
FE002 artritis Tuquerres no Ipiales Estomago Ipiales no Ipiales Ipiales Ipiales
FE024 huesos Colon (P) Piel Pasto Colon (P) no Pasto artritis Pasto
FE034 no Ipiales no Ipiales no Ipiales no Ipiales trombosis Ipiales colerin Ipiales
FE025 no Yacuanquer no Yacuanquer
FE014 no Tambo no Tambo no Tambo no Tambo no Tambo no Tambo
FE033 no Guachucal matriz Ipiales Guachucal Ipiales Ipiales
FE013 no Pasto no Tuquerres no Tuquerres
FE019 no Tuquerres no Tuquerres no Tuquerres no Tuquerres no Tuquerres no Tuquerres
FE008 si Providencia no Providencia
SECCION 3: Información sobre el cáncer gástrico
CODIGO P.
SÍNTOMAS INÍCIALES EDAD DE
DIAGNOSTICO LOCALIZACIÓN
TUMOR TIPO DE TUMOR
COMO LO DIAGNOSTICARON
TRATAMIENTO POSIBLES CAUSAS
FE026 Vomito con sangre 35 maligno gastroscopia
radioterapia, quimioterapia, gastrectomia desmando
FE002 Palidez 72 maligno gastroscopia gastrectomia, parte de higado, quimioterapia hereditario
FE024 Anemia, perdidad de apetito 50 cardias maligno
endoscopia, patologia gastrectomia subtotal
estrés, falta de alimentacion, deshoras
FE034 dolor de estomago 43 proximal maligno endoscopia
gastrectomia total, quimioterapia, radioterapia
estrés, mala alimentacion
FE025 palidez,vomito 62 maligno biopsia
operación total, quimioterapia, radioterapia esporadico
FE014 dolor de estomago 29 proximal maligno gastroscopia
cirugia parcial radioterapia quimioterapia descuido
FE033 Inflamacion del estomago, picaduras 64 izquierdo maligno gastroscopia extraccion del tumor
deshoras, mala alimentacion
FE013 dolor intenso en pecho 59 cuerpo maligno gastroscopia gastrectomia total, quimioterapia mala alimentacion
FE019 sudor, pérdida de peso, vomito, dolor de pecho 68 todo maligno endoscopia, biopsia gastrectomia total
cigarrillo, alcohol, exposicion a fungicida
FE008 pérdida de peso, nauseas, dolor espalda 52 cuerpo benigno gastroendoscopia cirugía
hereditario, mala alimentacion
SECCION 4: Otras Enfermedades gástricas
CODIGO P. GASTRITIS HERNIA HIATAL
METAPLASIA INTESTINAL
ULCERA GÁSTRICA
FE026 si si
FE002 si
FE024 si si
FE034 si
FE025 si
FE014 si
FE033
FE013 si si
FE019 no claro
FE008 si
SECCION 5: Enfermedades Extra gástricas
CODIGO P. CÁNCER DIABETES HIPERTENSIÓN PROBLEMAS CARDIACOS
TRIGLICERIDOS ALERGIAS INFECCIONES OTRA
FE026 35a ampicilina
FE002 15a
FE024 accidente rodilla
FE034
FE025
FE014
FE033 accidente amnesia
FE013 si II
FE019 dolor de pecho, flema
FE008
SECCION 6: ALIMENTACIÓN, ALCOHOLISMO Y CIGARRILLO
ALIMENTACION
CODIGO P. CARNE BLANCA CARNE ROJA ENSALADAS
FRUTAS FRUTAS HABAS GRASA DESHORAS SAL
FE026 asado, 3xs 3xs 4xs jugo si aceite si normal
FE002 frito, sudado2xm 1xd 1xd jugo 1xd 2xa cocinado aceite si normal
FE024 sudado, asado, frito 3xs sudado frito5 xm poco poco aceite, tocino si bajo
FE034 frito, asado 3xs asado, sudado 2xs 1xd poco poco aceite si simple y normal
FE025 cocinado 2xs todas, 1xd 1xd 1xd cocinado 1xd aceite no salado
FE014 cocinado, frito ,asado 3xs frita sudada 3xs 3 xs 3xs cocinada 2xs aceite si simple
FE033 Frito, asado, cocinado 2xs hueso 1xm
Sopa, frita, seca,molo5xs
manteca vegetal si salado
FE013 frito 2xm vario 2xd no poco vario, 2xd aceite si salado
FE019 cocinado, asado 1xs coccion y fritar, sopa 2xm 2xd 1xd 1xd aceite no salado
FE008 frito, asado cocido, 2xs frito, cocida 3xm 1xs* 1xs* sopa 2xd aceite si simple
ALCOHOL
CODIGO P. AGUARDIENTE RON CERVEZA OTRO DURACION
FE026 botellaxs mediaxs botellaxs 22a
FE002 no
FE024 no
FE034 no
FE025 no
FE014 botellaxm mes botellaxm 10a
FE033 guarapo 7a
FE013 botellaxs poco poco 33a
FE019 copa 2xs botella 2xs 10a
FE008 no
TABAQUISMO
CODIGO P. FUMA EXFUMADOR ANTES FRECUENCIA LUGAR FUMADOR PASIVO
FE026 no no no no no no
FE002 no no no no no si
FE024 no no no no no si
FE034 no si 2a 1xm amistades si
FE025 no trabajo si
FE014 si si 3a 1xd casa si
FE033 si si continuo 6xd no
FE013 no si 25a 15xd trabajo si
FE019 no si 10a caja xd no
FE008 no no no no no no
SECCION 7: Historia Familiar
HERMANOS TIOS PRIMOS
FAMILIAR DE 1ER GRADO
CODIGO P. COMPLETOS MEDIOS PATERNOS MATERNOS PATERNOS MATERNOS ENFERMEDAD MÁS FRECUENTE HNOS. HIJOS
FE026 4 1 6 5 20 25 cáncer, diabetes 4 5
FE002 6 2 de estomago 5 8
FE024 6 1 6 30 cáncer diabetes leucemia 6 4
FE034 4 1 4 30- 30- diabetes, hipertension 4 3
FE025 7 16 30- cáncer cabeza (primo) 4 0
FE014 10 1 4 6 huesos 8 4
FE033 4 4 2 30- 30- no 4 7
FE013 10 4 1 4 no 9 3
FE019 5 5 6 prostata 4 6
FE008 8 5 4 10 12 11 gastritis, infeccion matriz, cáncer matriz 1 2