induction de la tolerance aux famphibien urodele ...le tableau 1 resume les resultats des greffes...
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/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 32, 3, pp. 805-818, 1974 gO5
Printed in Great Britain
Induction de la tolerance auxallogreffes de peau dans les chimeres de
Famphibien urodele, Pleurodeles waltlii Michah,
Par P. GOUJON1
Laboratoire de Biologie Animate 2, Universite Paris VI
SUMMARY
Induction of skin allograft tolerance in chimaeras of urodeleamphibian, Pleurodeles waltlii Michah.
Allogenic chimaeras were produced in Pleurodeles waltlii (Amphibian, Urodele) by asso-ciating the anterior and the posterior parts of two different embryos. A reciprocal exchangebetween two homologue embryos gave rise to reciprocal allogenic chimaeras.
Skin grafts performed in the adult stage between two reciprocal chimaeras are alwaystolerated. On the other hand, when two skin grafts coming from the anterior and the pos-terior part of one chimaera are grafted on a common host, one of them may be tolerated andthe other rejected: each part of a chimaera keeps its own antigenicity.
In allogenic chimaeras, the average natural tolerance for skin allografts is 30 % higher thanin sibling controls.
INTRODUCTION
Depuis l'experience fondamentale de Billingham, Brent & Medawar (1953),de nombreux travaux ont confirme la possibility d'induire une tolerance auxallogreffes, aussi bien chez les Mammiferes que chez les Oiseaux (Hasek, 1954),en mettant le futur receveur au contact de cellules allogenes au debut de sondeveloppement. De meme chez les Amphibiens une tolerance est obtenue parClark & Newth (1972) chez le Xenope apres echange de greffons embryonnaires.
Un contact encore plus intime entre cellules d'animaux differents se trouveetabli dans les chimeres realisees experimentalement au tout debut du developpe-ment. C'est ainsi que les Souris allopheniques obtenues par la fusion de deuxblastocystes (Tarkowski, 1961; Mintz, 1962) sont tolerantes aux deux ligneesparentales (Mintz & Silvers, 1967).
Chez les Amphibiens Urodeles, les chimeres sont realisees en associant lapartie anterieure d'un embryon avec la partie posterieure complementaire d'unautre embryon. L'echange reciproque de parties homologues entre deuxembryons permet d'obtenir un couple de chimeres allogeniques reciproques.
Le present travail a pour objet l'etude de la tolerance acquise chez un Triton,1 Adresse d1 auteur: Laboratoire de Biologie Animate 2, Universite Paris VI, 12, Rue Cuvier,
75230, Paris CEDEX 05, France.
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A
B A
Fig. 1. Realisation d'un couple de chimeres reciproques.
Pleurodeles wait Hi Michah. II convenait, en premier, de mettre en evidence queles deux partenaires d'un couple reciproque etaient mutuellement tolerants. Puisde demontrer qu'une chimere parfaitement viable est bien constitute de deuxparties antigeniquement differentes. Enfin de rechercher si la tolerance auxallogreffes est plus elevee chez les chimeres que chez les animaux temoins.
MATERIEL ET METHODES
Le principe de la greffe en chimere consiste a sectionner transversalement deuxembryons puis a souder la partie anterieure de l'un avec la partie posterieure del'autre. Ainsi, disposant de deux embryons A et B de la meme espece, il estpossible de proceder a un echange reciproque de facon a obtenir deux nouveauxembryons composites. Comme l'indique la Fig. 1, le premier embryon sera issude la partie anterieure de A et de la partie posterieure de B; inversement, lesecond embryon sera issu de la partie anterieure de B et de la partie posterieuredeA.
Cet ensemble constitue un couple de chimeres allogeniques reciproques.L'avantage de ces couples est de presenter deux animaux etant entre eux simul-tanement donneur et receveur de greffes embryonnaires, chaque chimere priseindividuellement etant en outre formee de deux parties provenant d'embryonsdifferents.
L'intervention elle-meme est realisee selon les techniques classiques dePembryologie experimental appliquees aux germes d'Amphibiens. Les stadesoperatoires couvrent la periode qui s'etend depuis la fin de la neurula jusqu'austade du jeune bourgeon caudal (stades 21 a 23 de la table du developpementetablie pour le Pleurodele par Gallien et Durocher (1957)). La cicatrisationparfaite des deux hemi-embryons places exactement dans le prolongement l'unde l'autre necessite un sejour de trois a quatre heures dans le liquide physiologiqueoperatoire de Holtfreter. Le niveau de la soudure, encore discernable quelques
La tolerance aux allogreffes de Pleurodeles 807
Fig. 2 Fig. 3
Fig. 2. Couple de chimeres reciproques d'aspect normal. Toutes les greffes entre lesdeux animaux effectuees selon le schema de la Fig. 4 sont tolerees 18 mois apres lagreffe. Un greffon en provenance d'un temoin demeure egalement visible sur le dos desanimaux.Fig. 3. Couples de chimeres reciproques presentant une malformation consecutive al'intervention embryonnaire. Les animaux ont recu quatre greffons en provenancede quatre animaux temoins (T1} T2, T3 et T4); ils rejettent tous les deux les memesgreffons T2 et T3 dont l'emplacement est indique par une fleche blanche. Ils tolerenten outre les quatre greffons indiques (1, 2, 3, 4) sur la Fig. 2.
jours plus tard, se situe entre la 3eme et la 11 erne paire de somites et correspondraa la region troncale moyenne chez l'animal adulte.
En pratique, il est assez delicat de pouvoir elever simultanement les deuxembryons reassocies; la mortalite post-operatoire et les incidents d'elevageentrainent frequemment la mort d'un individu du couple. Dans la suite del'expose, le terme de 'chimere isolee' se rapportera au survivant d'un couple.
Les chimeres reciproques ont un aspect morphologique et un developpementcomparables a ceux des animaux temoins. Cependant on observe frequemmentdes individus ayant un aspect plus trapu ou presentant une deformation dorsaleau niveau de la soudure (Figs. 2 et 3). II s'agit de malformations consecutives al'intervention initiale et qui affectent la colonne vertebrale, de ce fait ces animauxseront plus fragiles.
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Chi mere AB Chi mere BA
Fig. 4. Realisation des greffes entre chimeres d'un meme couple.
Au total, quatre series de chimeres ont ete realisees: pour les series I, II et III,les embryons proviennent d'une meme ponte, pour la serie IV les embryonssont issus de deux pontes differentes.
Les allogreffes de peau sont pratiquees selon la technique de Squadroni etWolsky (1962), adaptee au Pleurodele par Tournefier, Charlemagne & Houillon(1969), alors que les chimeres sont agees de 6 a 7 mois. Les greffons sont prelevessur le cote de la queue, debarrasses d'une grande partie de l'assise musculairesous-jacente, puis mis en place sur le dos de l'animal receveur dans des incisionsa la taille du greffon. La reprise du greffon est rapide et celui-ci restant plusclair que la peau de l'hote, demeure plus aisement discernable.
RESULTATS
(1) Demonstration de la tolerance acquise
La parfaite viabilite des chimeres allogeniques s'interprete dans le cadre de latolerance acquise a Petat embryonnaire. La consequence doit etre que deuxindividus d'un meme couple se tolerent mutuellement. Arm de verifier cettehypothese, des greffes cutanees sont pratiquees entre animaux d'un meme coupleapres l'age de 6 mois, lorsqu'ils ont largement atteint la maturite immuno-logique (Orfila & Deparis, 1970).
La Fig. 4 rend compte du protocole operatoire. Chaque animal recoit quatregreffes placees de la facon suivante:
- une autogreffe sur la region de meme origine (greffon n° 1),- une autogreffe sur la region d'origine differente (greffon n° 2),- une 'allogreffe' ou 'greffe croisee' sur le partenaire dans la region de meme
origine (greffon n° 3),
La tolerance aux allogreffes de Pleurodeles 809
Tableau 1. Resultats des greffes entre chimeres reciproques
Duree d'ob-servation
de la greffe(mois)
6
12
18
Nombre decouples
27(108 greffons)
. 22(88 greffons)
11(44 greffons)
Nombre dechimeresisolees
10(20 greffons)
12(24 greffons)
13(26 greffons)
Nombre degreffonsobserves
128
112
70
Nombre derejets
0
0
0
Pourcentagede tolerance
100
100
100
- une 'allogreife' ou 'grefFe croisee' sur le partenaire dans la region d'originedifferente (greffon n° 4).
Au depart 40 couples ont ete testes mais en cours d'elevage un certain nombred'animaux ayant peri, le nombre de greffons observes 6 mois plus tard, et a plusforte raison apres un delai de 18 mois, est moins important que le nombre totalde greffes realisees.
Le Tableau 1 resume les resultats des greffes croisees 3 et 4, obtenus 6, 12 et18 mois apres la mise en place du greffon cutane.
D'une maniere generate, aucune greffe n'a ete rejetee, qu'il s'agisse d'auto-greffes (1 et 2) ou de greffes croisees (3 et 4). Ce resultat conduit aux deux con-clusions suivantes:
- les deux animaux d'un couple sont devenus mutuellement tolerants alorsqu'il n'y a jamais 100 % de tolerance dans les series de greffes effectuees sur lestemoins;
- la position du greffon sur un animal donne n'a pas d'influence sur son evolu-tion, aussi bien dans le cas d'autogreffes que de greffes croisees. Chaque chimerese comporte ainsi comme une unite immunologique.
(2) Persistance de V antigenicite de chaque hemi-partie d'une chimere
La survie des cellules greffees, qui se traduit chez les chimeres par la persistancede l'antigenicite de chaque hemi-partie, est une condition d'acquisition d'unetolerance definitive. Cette persistance d'antigenicite peut etre mise en evidencepar des greffes de peau de chimeres sur des animaux temoins.
A partir d'un couple de chimeres reciproques, des greffons sont preleves auxniveaux anterieur et posterieur de chaque animal puis plages sur un Pleurodeletemoin issu de la meme ponte selon le schema de la Fig. 5. L'hote temoinrec.oit done quatre greffons quand il s'agit de tester un couple et seulement deuxgreffons pour tester une chimere isolee. Dans la pratique pour les trois premieresseries deux couples de chimeres sont testes sur quatre temoins qui recoiventdone huit greffons (Fig. 6). Pour la serie IV deux couples de chimeres sont testessur six temoins.
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TemoinChimere BA
Fig. 5. Principe des greffes de chimeres sur temoins.
(a) Evolution generate des greffes
II n'est tenu compte que des greffons dont revolution a ete suivie au moins12 mois sur des temoins, soit au total 674 greffons. Ces greffons proviennent de38 couples de chimeres et de 38 chimeres isolees.
Dans un couple de chimeres reciproques, les deux parties complementairesderivant d'un des deux embryons initiaux ont toujours la meme antigenicite.Les greffons issus de ces parties subissent en effet toujours la meme evolutionsur des temoins, soit toleres un an apres la greffe, ou soit rejetes a la memevitesse. Ceci est verifie pour 280 greffons a partir de 38 couples testes. Pour unechimere prise isolement, revolution de greffons en provenance de la partieanterieure ou de la partie posterieure peut etre differente sur un meme temoin,ce qui traduit une difference d'histocompatibilite des deux greffons selon qu'ilsderivent de l'un ou l'autre des deux embryons constituants la chimere (Fig. 7).
II convient de remarquer que dans le cas d'une difference devolution il estcertain que les deux tissus sont antigeniquement differents. Dans le cas inverse,il n'est pas possible d'affirmer qu'ils ont les memes antigenes d'histocompati-bilite.
Sur 114 animaux pris en compte, couples reciproques et chimeres isolees, unedifference d'antigenicite entre les greffons anterieurs et posterieurs testes sur desanimaux temoins a ete observee dans 60 cas. Le fait que pres de la moitie deschimeres n'aient pas presente de difference antigenique entre la partie anterieureet la partie posterieure s'explique par la forte consanguinite du Pleurodele eleveau Laboratoire depuis de nombreuses generations.
La tolerance aux allogreffes de Pleurodeles 811
Fig. 6. Disposition des greffons issus de deux couples de chimeres (AB-BA etCD-DC) sur un temoin.Fig. 7. Exemple devolution des greffes de chimeres sur temoins: tolerance desgreffons issus des territoires A, rejet des greffbns issus des territoires B (dont l'emplace-ment est indique par une fleche blanche). De meme, tolerance de C et rejet de D.
En utilisant comme test la vitesse de rejet d'un greffon de peau sur un temoin,ou l'absence de rejet si le greffon est tolere, on peut conclure que dans unechimere allogenique les tissus en provenance d'embryons differents conserventleur antigenicite d'origine.
(b) Cas particulier: utilisation de greffons longs
Une demonstration encore plus evidente de la persistance de l'antigenicite dechaque hemi-partie d'une chimere allogenique peut etre apportee de la manieresuivante: un greffon ventral, preleve assez long pour etre sur qu'il contienne lesdeux tissus de la chimere, est implante en position orthotopique sur un animaltemoin. II est meme possible de s'adresser a un couple de chimeres et, dans cecas, l'animal hote regoit deux longs greffons implantes cote a cote en respectantleur orientation selon l'axe antero-posterieur des donneurs et du receveur (Fig. 8).
II convient de choisir une chimere isolee ou un couple dont l'heterogeneiteantigenique est deja connue grace aux tests precedents. L'animal temoin doitn'avoir jamais recu de greffe au prealable pour eviter un rejet accelere quipourrait perturber la cicatrisation de la partie toleree. Malgre le nombre limitede chimeres testees (un animal isole et deux couples), le resultat fut particuliere-ment evident. Une moitie de long greffon a ete toleree, elle correspondait aI'hemi-partie de la chimere ayant la meme antigenicite que l'hote, l'autre moitie
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Chimere AB Temoin Chimere BA
Fig. 8. Realisation d'un greffon ventral double sur un temoin a partir d'un couple dechimeres reciproques.
du greffon a ete rejetee, elle correspondait a 1'hemi-partie de la chimere ayantune antigenicite differente de l'hote. Dans le cas des couples, les reactions desdeux greffons ont ete exactement complementaires (Fig. 9).
(3) Augmentation de la tolerance aux allogreffes chez les chimeres
Les resultats precedents ont demontre qu'une chimere allogenique pouvaitetre constituee de deux parties antigeniquement differentes, ce qui entraine pourson systeme immunologique la reconnaissance de deux groupes differentsd'histocompatibilite. Cette double reconnaissance permet de supposer que lesgreffes cutanees d'animaux temoins sur les chimeres, seront plus frequemmenttolerees que les greffes cutanees entre animaux temoins.
II a ete signale que par suite de Felevage consanguin du Pleurodele, les allo-greffes de peau pouvaient etre naturellement tolerees chez cet animal (Tournefieret ah 1969). II convenait de rechercher ce taux de tolerance naturelle dans nosdiverses series experimentales afin d'etablir une comparaison avec le pour-centage de tolerance rencontre dans les allogreffes de temoins sur les chimeres.
(a) Pourcentage de tolerance naturelle des animaux temoins
Dans les experiences precedentes les allogreffes cutanees de chimeres sur desanimaux temoins ont ete regulierement suivies pendant une annee. Un greffon
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e
Fig. 9. Greffon ventral double trois mois apres la greffe. Les parties reciproques,issues de Panimal A, sont en cours de rejet et apparaissent en plus clair, alors queles greffons B ont une pigmentation normale.
est considere comme definitivement tolere s'il persiste encore apres ce delai.Le Tableau 2 rend compte du pourcentage de tolerance naturelle observee dansles diverses series experimentales. Ce pourcentage particulierement eleve estvraisemblablement du au fait que les greffons cutanes provenant des chimeressont testes sur des animaux temoins issus de la meme ponte.
(b) Pourcentage de tolerance des chimeres
Les chimeres recoivent quatre a six greffons provenant d'animaux temoins issusde la meme ponte.
Les greffes de temoins sur chimeres ont ete pratiquees en meme temps queles greffes de chimeres sur temoins analysees precedemment. Par exemple, deuxcouples de chimeres servent de donneurs pour quatre temoins mais recoiventen meme temps des greffons en provenance de ces quatre temoins. Cette metho-dologie est indispensable afin d'eviter de trop frequentes anesthesies des animauxlors du prelevement du greffon et de son implantation.
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Tableau 2. Pourcentage de tolerance naturelle des animaux temoins
Nombre d'animaux temoinsayant vecu plus d'un anapres la greffe
Nombre de greffons observesNombre de greffons toleresapres 12 mois
Pourcentage de tolerance
Tableau 3. Pourcentage de
Nombre de chimeres ayantvecu plus d'un an apres lagreffe
Nombre de greffons observesNombre de greffons toleresapres 12 mois
Pourcentage de tolerance
Serie I
16
88
29
32
tolerance
Serie I
13
54
34
62
Serie II
23
148
53
35
Serie III
21
140
84
60
des greffes de temoins sur
Serie 11
19
104
70
67
Serie III
18
79
71
89
Serie IV
43
298
176
55
chimeres
Serie IV
20
128
109
84
Les resultats indiques dans le Tableau 3 mettent en evidence une netteaugmentation du taux de tolerance des chimeres allogeniques. Cependant il esttoujours possible de trouver un donneur dont les greffons seront rejetes par unechimere, surtout si Ton s'adresse a des donneurs issus d'une ponte differentede la serie a laquelle appartient la chimere testee.
Dans le cas des couples reciproques, les deux chimeres manifestent toujoursdes reactions de rejet ou de tolerance identiques vis-a-vis d'un meme temoinutilise pour tester leur competence (Fig. 3). Ceci constitue une preuve supple-mentaire de la tolerance acquise par ces chimeres; en effet, un animal normaletant naturellement tolerant a ses propres antigenes, les chimeres d'un couplesont tolerantes aux deux groupes d'antigenes qu'elles renferment et presententla meme reaction a un troisieme groupe d'antigenes.
II est interessant de comparer les taux de tolerance naturelle rencontree apropos des greffes de chimeres sur temoins avec ceux des greffes de temoins surchimeres (Fig. 10).
Pour garder toute sa signification, la comparaison doit se faire a l'interieurde chaque serie experimentale. Ainsi, l'augmentation du taux de tolerance deschimeres aux allogreffes est d'environ 30 %; de plus il est pratiquement le memepour chacune des quatre series experimentales.
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Serie 1
32
: C :
62
mer
es
U
35
6760
55
84
Serie II Serie IH Serie IV
Fig. 10. Comparaison graphique des pourcentages de tolerance chezles temoins et les chimeres.
DISCUSSION
L'etude des allogreffes chez les animaux chimeres s'inscrit dans le cadre desphenomenes de la tolerance acquise. Ainsi, Mintz & Silvers (1967) obtiennentchez les Souris allopheniques une tolerance aux allogreffes en provenance desdeux lignees parentales et montrent que chaque animal est effectivement con-stitue de deux types de cellules distinctes derivant des blastocystes parentaux(Mintz, 1971). Des resultats tout a fait comparables se rencontrent pour leschimeres obtenues chez le Pleurodele.
Ainsi la tolerance entre les deux types cellulaires est complete dans leschimeres, ce qui se traduit par leur viabilite. On retrouve chez les Amphibiensl'absence de 'runt disease' deja signalee par Mintz a propos de la Souris. II ya done une difference avec les experiences d'induction de la tolerance chez lesMammiferes decrites par Billingham (1957) ou l'inoculation de cellules spleni-ques a un souriceau entraine frequemment une reaction du greffon contrel'hote. Ceci provient du fait qu'il inocule des cellules immunocompetentes a unsouriceau qui n'a pas encore atteint sa maturite immunologique tandis que dansles chimeres, le contact entre les cellules de lignees differentes s'etablit au toutdebut de la vie embryonnaire alors qu'il n'existe encore aucune cellule immuno-competente.
Les Souris allopheniques presentent un degre d'intrication des cellules d'originedifferente tel que la plupart des organes sont des mosaiques constitutes decellules issues des deux lignees parentales (Mintz, 1971). Par contre chez lePleurodele, le chimerisme est biparti, les parties anterieure et posterieure gardentleur antigenicite d'origine comme le prouvent les greffes cutanees de chimeressur des animaux temoins. Les organes situes au niveau de la soudure peuventetre constitues de parties antigeniquement differentes comme le revelent lesgreffons cutanes preleves assez longs et meme de parties morphologiquement
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differentes comme l'indique l'observation du tractus urogenital (Houillon,Charlemagne & Goujon, 1973).
II est d'autres exemples ou la persistance de l'antigenicite est encore plusevidente sans meme tester les animaux, c'est le cas des chimeres realisees entreespeces differentes (Houillon, 1964).
Des resultats differents sont obtenus par Volpe (1971) chez les Anoures unisen parabiose. Dans ce cas, deux embryons sont soudes cote a cote puis separesau moment de la metamorphose. Si Ton greffe alors un des deux ex-parabiontessur un temoin qui le rejette, ce temoin rejettera ensuite l'autre animal du coupleen second set, ce qui traduit une grande parente antigenique entre eux. IIpourrait ainsi se produire dans une parabiose un melange d'antigenes, alors quedans les chimeres d'Urodeles les tissus d'antigenicite differente demeurentnettement delimiters. Toutefois l'auteur envisage egalement l'hypothese selonlaquelle la sensibilisation du temoin au deuxieme ex-parabionte serait due nonpas au tissu greffe lui-meme, mais aux cellules sanguines qu'il contient et quisont effectivement d'origine mixte. Dans le cas des chimeres d'Urodeles, un telmelange de cellules sanguines n'aurait par contre pas d'effet sur revolution desgreffes de peau en premier set.
Les deux chimeres d'un couple se tolerent mutuellement. Cette tolerance estinduite par la greffe a l'etat embryonnaire; elle est reciproque puisque chaqueanimal dans un couple se comporte simultanement comme donneur et receveurpour son partenaire.
Une tolerance du meme ordre s'obtient egalement chez les Amphibiens apresl'echange de territoires cutanes entre embryons (Clark & Newth, 1972) ou par lagreffe en parabiose (Volpe & Gebhardt, 1966).
Les chimeres allogeniques ont un systeme immunitaire fonctionnel puisquetoutes les chimeres etudiees se sont revelees capables de rejeter les allogreffesde peau. Charlemagne (1972) indique meme chez les Pleurodeles chimeres unestimulation permanente du systeme lymphoide sans qu'apparaisse le moindresigne de rejet, tant au niveau de la partie anterieure que de la partie posterieure.Par contre le meme auteur montre que des chimeres heterospecifiques Pleurodele-Triton alpestre sont incapables de rejeter aussi bien les greffes de peau dePleurodele que les greffes de Triton alpestre, ce qui traduit un blocage de leursysteme immunitaire.
La tolerance des chimeres aux allogreffes de peau est accrue par rapport a latolerance naturelle rencontree chez les animaux temoins. Elle resulte d'unereconnaissance par chaque hemi-partie d'un groupe d'histocompatibilite diffe-rent du sien. De meme les Anoures unis en parabiose durant la vie embryonnairerejettent les greffes de peau plus lentement que les animaux normaux (Volpe,1971). Chez les chimeres de Pleurodele, 1'augmentation de la tolerance, evidentedu point de vue statistique, s'est revelee encore plus nette dans une des seriesexperimentales ou vraisemblablement seulement deux groupes d'histocom-patibilite etaient en cause. Dans cette serie particuliere, les chimeres constitutes
La tolerance aux allogreffes de Pleurodeles 817de deux parties antigeniquement differentes toleraient tous les animaux dela meme ponte alors que les chimeres constitutes de deux parties antigenique-ment semblables ne toleraient que les animaux appartenant au meme groupequ'elles.
Seule la realisation de chimeres entre deux souches histocompatibles diffe-rentes permettra d'obtenir des animaux susceptibles de tolerer a 100% lesallogreffes en provenance de ces deux souches.
RESUME
Des chimeres sont realisees chez le Pleurodele (Amphibien Urodele) en associant la partieanterieure d'un embryon avec la partie posterieure complementaire d'un autre embryon.L'echange reciproque de parties homologues entre deux embryons permet d'obtenir uncouple de chimeres allogeniques reciproques. Les greffes de peau realisees a l'etat adulteentre les deux partenaires d'un couple sont tolerees a 100%. Chaque hemi-partie d'unechimere conserve son antigenicite d'origine. La tolerance des chimeres aux allogreffes depeau est en moyenne de 30 % superieure a la tolerance naturelle rencontree chez le Pleurodele.
Ce travail a puetrepoursuivi grace a l'aide financiere de la DGRST (Contrat n° 72-7-0306).
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