Introducción

La sección de Inmunohematología y Banco de Sangre tienen bajo suResponsabilidad, preparar los hemocomponentes y seleccionar el más indicadopara el paciente, a quien el médico se lo prescribe.

Para cumplir con esta labor, se debe interaccionar con los donantes de sangre,realizar pruebas inmunohematológicas como la determinación de grupossanguíneos, fenotipos y pruebas de compatibilidad entre otras.

El buen desenvolvimiento dentro del laboratorio y la utilización de medidaspreventivas es un aspecto básico y fundamental para los cursos de laboratoriode Inmunohematología y Banco de Sangre.

A continuación le brindamos algunas de las recomendaciones importantes para laseguridad en el Banco de Sangre.

En 1987, el CDC introduce el concepto que la sangre de todo paciente debe sertratada como potencialmente infecciosa para el Virus de la Hepatitis B (HBV),Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y otros patógenos transmitidospor vía parenteral.

Toda persona que labore en un Banco de Sangre debe saber que el SIDA y la hepatitis se trasmiten por medio de fluidos corporales y que, por lotanto, se deben guardar todas las normas de seguridad necesarias para evitar elcontagio.

La exposición ocupacional al HIV es menos frecuente que la del HBV, debido aque las concentraciones en que se puede encontrar el HBV, son mucho másaltas, además de que este virus puede permanecer estable a 25ºC por más desiete días, lo que explica su mayor frecuencia e infección.La transmisión ocupacional de HBV y del HIV se relaciona con:• inoculación percutánea de sangre, plasma, suero u otros fluidoscorporales, debido a accidentes con agujas.• Contaminación de la piel o mucosas, con sangre o fluidos corporales sin que medien punciones, debido al contacto directo de una lesión y el fluidocontaminante, como resultado de pipetear con la boca, salpicaduras almomento de quitar un tapón de un tubo y/o centrifugación inadecuadaque genere aerosoles con material infeccioso y que entren en contacto conlesiones en piel.Los estudiantes deberán cumplir con los siguientes puntos dentro dellaboratorio:1- No correr.2- Siempre que va a manipular o trasladar muestras dentro del laboratorioestas deberán de estar en una gradilla, no las transporte en las manos, ademásutilice guantes durante la manipulación de las muestras.

3- Utilice zapatos cerrados, no utilice zapatillas abiertas o sandalias. Con elobjetivo de proteger los pies.4- Si se tiene el pelo largo, se debe amarar con una cola.5- Es importante utilizar anteojos de seguridad.6- Si se ve afectado por alguna salpicadura, lave con abundante agua y encasos de alguna lesión con algún vidrio debe acudir donde un médico quelo asista.7- Siempre utilice gabacha dentro del laboratorio.8- Antes de empezar la práctica y hasta el final de la misma utilice guantes.Los guantes pueden estar hechos de látex o vinil. En ambos casosdemuestran una buena barrera protectora; sin embargo, los de látexpermiten conservar mayor sensibilidad táctil.9- Queda prohibido el uso de teléfonos celulares durante el laboratorio.10- El frecuente lavado de manos es una de las medidas de precaución másútiles e importantes, éste se debe realizar posterior al contacto conpacientes y muestras de laboratorio.Las manos se deben lavar con agua y jabón:• después de completar el trabajo y antes de irse del laboratorio• después de quitarse los guantes• antes de cualquier otra actividad donde intervenga contacto entremanos y mucosas• inmediatamente después de un contacto accidental con sangre ofluidos corporales• antes de ir al servicio sanitario.11- Limpieza de superficies de trabajo.Todas las superficies de trabajo deben limpiarse antes y después deltrabajo con hipoclorito de sodio al 3.5% o con alcohol yodado. Otrosinstrumentos a desinfectar son las tijeras y las centrífugas.La dilución de cloro recomendado inactiva al HBV en 10 minutos y alHIV en 2 minutos.Cuando ocurra un derrame de sangre o fluidos corporales se debeproceder de la siguiente manera:• absorber el líquido con una toalla o papel absorbente. El objetivo deeste paso es eliminar la mayor cantidad de proteína, ya que lassoluciones de cloro son menos efectivas en presencia de altasconcentraciones proteícas• limpiar la superficie con cloro diluido.• Colocar un papel absorbente empapado con cloro sobre la superficiesuciaLimpiar de nuevo y descartar todo lo usado en un recipiente debioseguridad12- Precaución con agujas.Los accidentes con agujas se pueden prevenir de la siguiente manera:• No tapar las agujas después de haber sido utilizadas.• No separar las agujas de las jeringas.• No manipular las agujas con las manos.

• Poner las agujas una vez utilizadas en un recipiente rígido de color rojo o naranja con el símbolo de bioseguridad.• Estos recipientes deben de estar colocados cerca del área utilizada paralas flebotomías.13- Descarte de material.• Todo material que resulta luego de realizar las pruebas en ellaboratorio debe ser descartado en recipientes de plástico quecontengan solución de hipoclorito de sodio al 0.5%, aquí se incluyentubos, pipetas, portaobjetos y frascos.• Mientras tanto, el material seco como gasas, aplicadores, papel, debeser depositado en bolsas de basura de material resistente, estas bolsasdeben de ser de color naranja o rojo y portar el símbolo debioseguridad.• Todos los residuos del laboratorio que contengan fluidos corporalesdeben ser autoclavados previo descarte definitivo.14- Otras medidas de seguridad.• No consumir comidas ni bebidas en el laboratorio.• No guardar alimentos en las refrigeradoras o congeladores quecontengan muestras o bolsas de sangre.• Estos equipos deben de ser rotulados también como biopeligrosos.• Es totalmente prohibido fumar dentro del laboratorio.

Procedimiento 1La flebotomía o recolección de sangre.Principio:La recolección de sangre debe ser practicada mediante métodos asépticos, conun sistema cerrado, guantes y una punción venosa a primera intención.En caso de que la primera punción no fuera óptima, para la segunda punción sedebe utilizar un equipo nuevo.Método:Antes de la flebotomía:- Revisar la identificación de los tubos que se van a utilizar.- Rotular el tubo con el nombre y apellidos de la persona a la cual pertenece lamuestra y con el número de identificación que puede ser el número de cédula.- Indicar la persona responsable de realizar el procedimiento, ya sea con lasiniciales o un número designado por el Laboratorio.- Otra información importante de indicar es la ubicación, fecha y hora de laextracción.Preparación para la punción venosa:- Inspeccionar ambos brazos y seleccionar la mejor vena.- Limpiar con un algodón impregnado con alcohol al 70% un área de ochocentímetros alrededor del sitio seleccionado para la punción.- Realizar la limpieza de adentro hacia afuera en forma circular.- Limpiar en dos ocasiones cuando se amerite.- La zona debe de estar seca antes de la punción venosa.

Flebotomía:- Colocar el torniquete.- Introducir la aguja en la vena seleccionada en un ángulo de 45º y con el biselhacia arriba.- Dejar que la sangre fluya libremente dentro del tubo.- Si se está recolectando sangre anticoagulada inmediatamente después deretirar el tubo del adaptador proceda a mezclar la sangre con suavidad.- Aflojar el torniquete cuando la extracción haya concluido.- Colocar un algodón sobre la vena.- Retirar la aguja y hacer presión con el algodón sobre la vena.- Indicar al paciente que doble el brazo y que lo mantenga en esa posición por10 minutos.- Descartar el material con la aguja en el contenedor de desecho.- Colocar las muestras obtenidas en el espacio correspondiente dentro de lagradilla.Cuidados:La recolección de sangre es un procedimiento sencillo y seguro para laspersonas. No representa riesgo alguno, sin embargo, en muy pocas ocasiones sepueden presentar ciertos inconvenientes como:desvanecimiento, lipotimia, síncope.Estas reacciones pueden explicarse por una descarga vasovagal. Si esto sepresenta, se debe indicar a la persona que coloque la cabeza entre las piernas ocoloque al paciente en posición de Trendelemburg.(los pies más arriba de la posición de la cabeza)Si se presentan nauseas, indicar al paciente que respire profundamente.Si hay hiperventilación, el paciente debe respirar en una bolsa de papel.Si se observa una tendencia a perder el conocimiento, proteja la persona de ungolpe colocandolo en una posición que evite las caídas.Tomar la presión y el pulso.

Hematoma durante o después de la flebotomíaSi este se presenta se debe de:Retirar inmediatamente el torniquete y la aguja del brazo.Colocar tres o cuatro gasas estériles sobre el sitio de venipunción y aplicarfirmemente presión digital durante 7 a 10 minutos. Una alternativaconsiste en aplicar un apósito ajustado, que se puede retirar 7 a 10minutos después, para permitir la inspección.Si se desea, aplicar hielo, cubierto con una gasa, en el área durante 5minutos.Si se sospecha una punción arterial, retirar la aguja de inmediato y aplicarpresión firmemente durante 10 minutos. Aplicar un vendaje compresivoenseguida.

Procedimiento 2Lavado de muestras en Inmunohematología.Principio

- Los lavados de muestras sanguíneas para obtener sólo el paquete globular es un procedimiento de rutina, dentro de cualquier sección de Inmunohematología.

- El propósito es eliminar cualquier interferente proteico que pueda alterar la reacción de aglutinación. Este aspecto es tan importante que se pueden obtener reacciones falsas positivas o negativas a partir de muestras mal lavadas.

Materiales y muestras:1. Tubos 12x75 mm limpios y secos2. Pipetas Pasteur o de transferencia3. Solución salina 0.9%4. Centrífuga serológica (3000 rpm )5. Guantes6. Gabacha7. Recipientes de descarte de material8. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA

Método:1. Rotular adecuadamente un tubo de ensayo.2. Transferir con una pipeta Pasteur y técnica apropiada de uso de materialbiopeligroso una muestra de sangre de 0.2 ml a un tubo deensayo.3. Añadir solución salina hasta alcanzar 1 centímetro antes de la boca deltubo.4. Equilibrar y centrifugar por 1 minuto a 3000 rpm en una centrífugaserológica.5. Una vez centrifugado debe de quedar un paquete globular.6. Descartar el sobrenadante.7. Resuspender los glóbulos rojos, con el líquido remanente.8. Añadir solución salina hasta 1 centímetro antes de la boca del tubo.9. Repetir el mismo procedimiento dos veces más10. En el último lavado debe de quedar un sobrenadante claro.11. Descartar el sobrenadante, incluyendo la última gota, la cual se debe secar con papel toalla. Realizar una suspensión de trabajo al 3-5%, con el paquete globular lavado.12. Descartar el material en los recipientes adecuados de la práctica.

Práctica:Realizar al menos cinco lavados de glóbulos rojos.Repetir el procedimiento tantas veces sea necesario hasta que domine la técnica

Procedimiento 3Suspensión de glóbulos rojos al 3-5%, suspensión de trabajo

Principio La suspensión de trabajo al 3-5%, es un procedimiento de rutina en el laboratorio de Inmunohematología.La suspensión no requiere ser exacta, puede estar en un rango de concentración entre el 3 a 5%.Esta concentración permite una proporción adecuada de reacción entre los glóbulos rojos y los anticuerpos presentes en los reactivos o muestras a analizar através de la reacción de aglutinación.Este procedimiento tiene como característica principal ser un método cualitativo, por lo que es importante desarrollar las destrezas necesarias para realizarlo correctamente. Materiales y muestras

1. Tubos de 12x76 mm limpios y secos.2. Pipetas Pasteur.3. Solución salina fisiológica.4. Muestras de sangre anticoaguladas con EDTA.5. Centrífuga serológica (3000 rpm).6. Guantes.7. Gabacha.8. Recipientes de descarte de material.

Método Cuantitativo

1. Con una pipeta automática transfiera 0.3 ml de glóbulos rojos lavados a un tubo de ensayo que contenga 9.7 ml de suero salino fisiológico.

2. Tapar el tubo y mezclar con suavidad hasta homogenizar la solución.Cualitativo

1. Rotular adecuadamente el tubo de ensayo.2. Con una técnica apropiada de uso de material biopeligroso tomar una

pipeta Pasteur y transferir una pequeña muestra de sangre al tubo.3. Añadir solución salina fisiológica hasta alcanzar una coloración rojo

¨tomate¨.4. Realice comparaciones visuales con soluciones ya preparadas al 3-5%.5. Descarte el material en los recipientes destinados para dicho fin.

Práctica Realizar al menos 5 suspensiones de forma cualitativa hasta determinar que cantidad de sangre y de solución salina deben ser añadidos para hacer una suspensión de trabajo. Tenga presente que todas las personas poseen diferentes valores de hematocrito (proporción de glóbulos rojos en la sangre) por lo que la cantidad de muestra necesaria para realizar una buena suspensión de trabajo puede variar, de ahí que es muy importante desarrollar la destreza para realizar estas suspensiones.

Realice el procedimiento tantas veces como sea necesario, hasta que domine la técnica y las proporciones.

Procedimiento 4

Lectura, interpretación y grado de las reacciones de aglutinación.

Principio

Cuando se presentan reacciones de aglutinación se pueden observar diferentes grados y fuerzas de reacción entre los antígenos y los anticuerpos.Esta observación es muy importante en Inmunohematología, pues se puede utilizar estas características distintivas para identificar situaciones donde se presentan casos de mezclas de anticuerpos, mezclas de sangre e incluso haciendo uso de un grado de aglutinación, determinar si los glóbulos rojos en estudio son homocigotas o heterocigotos para un determinado sistema de grupo sanguíneo.

Materiales y Muestras:1- Reactivo anti-A.2- Glóbulos A al 3-5%3- Tubos de ensayo4- Pipetas volumétricas de 1 ml, 5ml y 10 ml5- Pipetas automáticas6- Centrífuga serológica (3000 rpm)7- Solución salina 0.9%8- Recipientes de descarte de material9- Un marcador permanente10- Guantes11- Gabacha

Método:Realizar a un volumen final de 100 ul diluciones dobles del antisuero (reactivo de anti-A) con solución salina hasta una dilución final de 1:512 de la siguiente manera.

1- Rotular los tubos correspondientes.2- Colocar 100 ul. de solución salina del tubo rotulado 1:2 hasta el tubo1:512.3- Dispensar 100 ul. del reactivo anti A al tubo rotulado 1:1 y al tuborotulado 1:2.4- Mezclar el tubo 1:25- Transferir 100 ul del tubo 1:2 al siguiente tubo 1:4.6- Mezclar, continuar el procedimiento de forma repetitiva hasta llegar altubo 1: 512.7- Descartar los últimos 100 ul.8- Añadir 50 ul de las células “A” a cada uno de los tubos.9- Mezclar y centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos.10- Desprender el botón con suavidad frente a la luz para observar elgrumo.11- Anotar las características observadas en cada reacción deaglutinación y asignar el puntaje.

Característica del grumo, intensidad de reacción y puntaje (score)obtenido.

Observación macroscópica

Designación en cruces Puntuación

Un solo grumoFondo transparente

Hemólisis total

4+ 12

Un grumo grande con varios pequeños

Fondo transparente

3+ 10

Muchos grumos medianos y pequeñosFondo transparente

2+ 8

Muchos grumos pequeños

Fondo turbio

1+ 5

Reacción visible solo al microscopio

M 2

Las aglutinaciones microscópicas se observan colocando la suspensión en estudio en un portaobjeto y devolviendo el líquido al tubo, de manera que el cubre objeto solo quede lo necesario para poder observar, lo cual se hace con el objetivo de 10x y se considera aglutinación a los grupos de eritrocitos que recuerdan las rosetas y que adquieren una coloración café por el efecto tridimensional de los eritrocitos agrumados.La utilidad de determinar el puntaje de aglutinación o score es que nos permite

diferenciar entre las células homocigotos y heterocigotos para un antígeno.

Procedimiento 5

Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en adultos.Principio:El sistema de grupo sanguíneo ABO fue el primer sistema descubierto por el Dr.Karl Landsteiner en 1900 y que le valió el premio Nobel en Fisiología yMedicina del año 1930. (1)

Este sistema involucra dos antígenos: A y B. Interactúa con el sistema H, que produce por la acción de una fucosiltransferasa, el antígeno H, capaz de añadir una fucosa a la sustancia precursora.La sustancia H puede ser convertida en el antígeno de grupo sanguíneo A poracción de la N acetil galactosaminil transferasa, que añade una N-acetil galactosamina, a la cadena precursora o una galactosa en el caso de actuar la galactosil transferasa produciendo el antígeno B; el fenotipo O es el resultado de una mutación en la transferasa que genera un producto inactivo, la cual es incapaz de añadir carbohidratos, dejando expuesto solo al antígeno H.Los seres humanos mayores de 3 a 6 meses de edad desarrollan a través de unarespuesta T independiente anticuerpos antitéticos naturales del tipo IgM capacesde activar al complemento contra los antígenos ABO que no se posean.Se desarrollan a partir de la estimulación de sustancias tipo azúcares presentesen los alimentos y bacterias en el tracto intestinal.Este sistema es de gran importancia en el campo de la medicina transfusional yen la investigación clínica. Ha sido de gran ayuda en el ámbito antropológicodonde lo han utilizado como marcador serológico en genética de poblaciones,desarrollo embrionario, diferenciación celular y en las neoplasias.(2,3)El siguiente procedimiento es el método de referencia, sin embargo, recuerde queexisten diferentes casas comerciales y que cada una utiliza distintoscomponentes para fabricar reactivos, así como los tiempos de incubación y dereacción, por lo que nunca se debe de pasar por alto leer la especificacióntécnica que recomienda la casa comercial para el uso de reactivos.

Materiales y muestras:Tubos de ensayo 12x75 mmPipetas PasteurSolución salina fisiológica.Centrífuga serológicaRecipientes de descarte de materialGuantesGabachaMarcador permanente.

Para realizar las determinaciones, generalmente se utilizan muestras de sangretotal anticoagulada con EDTA (tubo tapón lila), sin embargo, también sepueden utilizar sangre sin anticoagulante (tubo tapón rojo).Los glóbulos rojos pueden ser suspendidos en el suero autólogo, plasma osolución salina o pueden ser lavados y resuspendidos en solución salina antes dela prueba.Reactivos1- Anti-A (azul)2- Anti-B (amarillo)3- Células A1 y B. Estas células pueden ser obtenidas comercialmente opreparadas diariamente en el laboratorio en una suspensión entre el 3-5%Método:Grupo eritrocitario (Prueba directa):1- Rotular 2 tubos como A y B.2- Homogenizar la muestra de sangre.3- Realizar una suspensión de trabajo entre el 3-5%.4- Agregar una gota de la suspensión de trabajo a los tubos rotulados comoA y B.5- Añadir al tubo rotulado como A una gota del anti A.6- Añadir al tubo rotulado como B una gota del anti B.7- Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm.8- Resuspender suavemente el botón.9- Leer, anotar e interpretar las reacciones.

Prueba sérica (grupo inverso)1- Centrifugar la muestra a analizar de 3 a 5 minutos.2- Rotular dos tubos como células A y células B.3- Añadir al tubo rotulado como células A una gota de células A al 3%.4- Añadir al tubo rotulado como células B una gota de células B al 3%.5- Añadir a cada tubo dos gotas de plasma de la muestra centrifugada.6- Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm.7- Leer, anotar e interpretar las reacciones.8- Comparar los resultados obtenidos con el grupo eritrocítico.

Práctica:Determinar el grupo ABO eritrocítico y sérico de al menos 10 muestrassanguíneas y que en ellas vayan todas las posibles combinaciones de gruposABO.Los antisueros anti A y anti B fueron designados internacionalmente con un color para evitar los errores de grupo, los cuales pueden incidir en la vida de un paciente

Interpretación de grupo ABO

Anti A Anti B Células A Células B Interpretación+ 0 0 + A0 + + 0 B+ + 0 0 AB0 0 + + O

Procedimiento 6

Determinación en tubo del grupo sanguíneo ABO en recién nacidos

Principio

La determinación del grupo sanguíneo ABO en el recién nacido es de sumaimportancia en la detección y diagnóstico de la enfermedad hemolítica delrecién nacido, así como en la terapia transfusional.En este tipo de paciente, debido a la inmadurez del sistema inmune alnacimiento, no tiene la capacidad de producir anticuerpos hasta los primerostres a seis meses de vida, razón por la cual la prueba sérica o inversa no debeser aplicada.Las reacciones de aglutinación con el grupo eritrocítico en recién nacidos, pueden dar grados de aglutinación, más débil que en los pacientes adultos, debido a que los determinantes antigénicos ABO en los glóbulos rojos se encuentran en poca cantidad, pobremente ramificados y expresados en comparación con los antígenos de glóbulos rojos de personas adultas.Es por lo anterior que en la determinación de grupo sanguíneo ABO del reciénnacido se añade a la batería de reacción, un tubo adicional para el reactivo anti-AB que permita generar reacciones de mayor avidez, que permitan confirmar la reacción.Una de las ventajas de utilizar este reactivo adicional, es que va dirigido contraotros determinantes antigénicos que los reactivos anti-A o anti-B individuales,por lo que al utilizar los tres reactivos en conjunto aumenta las posibilidad dedetección antigénica, en contraposición que si se utilizara sólo un medio dereacción, disminuyendo así las reacciones falsas negativas. Toda reacción negativa en un grupo de recién nacido debe ser observada al microscopio, acción que conlleva a aumentar la sensibilidad. (1,2)

Materiales y muestrasTubos de 12 x75 mmPipetas PasteurSolución salina fisiólogicaCentrífuga serológicaRecipientes de descarte de materialGuantes

GabachaMarcador permanente Muestras de Sangre de cordón umbilicalReactivos1- Anti-A2- Anti-B3- Anti-AB

Método:

Por lo general se utilizan muestras de sangre de cordón umbilical (tubo tapónrojo).A una alícuota de la muestra realizar tres lavados con solución salinafisiológica.Del paquete globular lavado hacer una suspensión de trabajo entre el 3-5%.Lo anterior debido a que este tipo de muestra posee muchos elementosadiciones interferentes como es la gelatina de Wharton que interfiere con las reacciones de aglutinación, produciendo falsos positivos1- Rotular 3 tubos de prueba como A, B y AB.2- Transferir una gota de la suspensión de eritrocitos del paciente, a los tubos rotulados como A, B y AB.3- Añadir al tubo rotulado como A una gota del anti A.4- Añadir al tubo rotulado como B una gota del anti B.5- Añadir al tubo rotulado como AB una gota del anti AB.6- Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm.7- Leer, anotar e interpretar las reacciones.

Interpretación grupo ABO recién nacido

Anti A Anti B Anti AB Interpretación+ 0 + A0 + + B+ + + AB0 0 0 O

Práctica:Realizar la determinación de al menos 5 muestras de recién nacido, tratar que nosean del mismo grupo ABO.

Procedimiento 7

Determinación en tubo de subgrupos sanguíneos ABO.

Principio

El sistema de grupo sanguíneo ABO presenta dentro de sus característicasalgunos fenotipos poco frecuentes clasificados como subgrupos, los cuales sehacen evidentes a nivel de laboratorio como reacciones de aglutinación másdébil de lo esperado.Razones que justifican la presencia de estos subgrupos son:- Mutaciones en los genes A y B que provocan la expresión aberrante de estos, codificando la producción de glicosiltransferasas con menor actividadenzimática para la conversión del antígeno H.- Expresión débil de un alelo alterno que se ubica en el locus ABO.- Efecto de genes modificadores o inhibidores que regulen la expresión de losgenes ABO.La mayor frecuencia de subgrupos ABO es para el antígeno A. Los eritrocitosde los diferentes subgrupos de A varían ampliamente en la densidad antigénica.Se ha calculado que los eritrocitos que son A1 pueden expresar entre 1-1.5millones de sitios antigénicos en contraposición con eritrocitos Am o Ael dondese ha podido determinar apenas expresan unos 2000 sitios antigénicos.Los subgrupos de A se clasifican en:A1, A2, A3, Ax, Aend, Am, Ay, Ael.Los subgrupos de B se clasifican en:B3, Bx, Bm, Bel.Los subgrupos de ABO pueden ser detectados a través de patrones de reacción incongruentes entre los resultados de la prueba directa con la pruebainversa.La observación minuciosa de los siguientes aspectos es fundamental paradeterminar las características de los diferentes subgrupos:

- Grado de aglutinación con anti-A y anti-A1.

- Grado de aglutinación con anti-AB.- Grado de aglutinación con anti-H.- Presencia de anticuerpos anti-A1 en el suero.- Presencia de sustancias A, B y H en secreciones de saliva.- Estudios de Absorción/Elución para antígenos ABH en eritrocitos.

Método:

Técnica en tubo para la detección del antígeno A1 utilizando la lectinaDolichos biflorus.

A cada tubo adecuadamente rotulado añadir 1 gota suspensión entre el 3-5% deglóbulos rojos A o AB a analizar.A los tubos anteriores añadir 1 gota de la lectina anti-A1.Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm.Leer, anotar e interpretar los resultados obtenidos.

Interpretación:- Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+.- Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación.

Técnica en tubo para la detección del antígeno H utilizando la lectina Ulexeuropaeus:

Añadir 1 gota de la suspensión de glóbulos rojos A o AB, del 3-5% a analizar a los tubos debidamente rotulados.Añadir 1 gota de la lectina anti-H a cada tubo.Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm.Leer por aglutinación y anotar los resultados.Interpretación:- Positivo: presencia de reacción de aglutinación de 1+ a 4+.- Negativo: Ausencia de reacción de aglutinación.

De las muestras clasificadas, escoger las de grupo A y O para determinarla cantidad de sustancia A o H con las lectinas anti-A1 y anti-H.Hacer las lecturas e interpretar los comentarios que considere necesarios. Anotar en orden de fuerza de aglutinación las reacciones utilizandoLectina anti - A1 y Lectina anti H para células.Realizar determinaciones en recién nacido.

Procedimiento 8

Determinación en tubo del antígeno Rh/ D.

Principio

La definición de Rh positivo o Rh negativo se refiere a la presencia o ausenciadel antígeno Rh (D) en los eritrocitos humanos.El primer anticuerpo contra el antígeno D fue descrito en 1939 por Levine yStetson, encontrado en el suero de una mujer cuyo hijo se obitó y además había presentado una reacción hemolítica después de haber sido transfundida con sangre de su esposo.En 1940, Landsteiner y Wiener describieron el anticuerpo obtenido porinmunización de cerdos y conejos con glóbulos rojos del mono Macacus rhesus.Estos aglutinaron aproximadamente el 85% de las pruebas con eritrocitoshumanos y fueron denominados con el correspondiente factor Rh positivo y losque no reaccionaron como Rh negativo. El término Rh se nombra en honor a laespecie en que se descubrió el antígenoLos antígenos del sistema Rh se encuentran en los seres humanos y en algunasespecies de primates. El antígeno D está completamente desarrollado al nacer.Los reactivos anti-D pueden tener tres tipos de presentación, los de altocontenido proteico, los salinos a base de IgM y los químicamente modificados,que son IgG´s, tratadas químicamente para generar mayor capacidad aglutinante

que los IgG nativos.Los de alto contenido proteico poseen una concentración entre el 20-24% másotros aditivos macromoleculares, dando un resultado más pronto y una lecturamás fiable.El diluyente de elevado peso molecular puede producir aglutinaciónespontánea de los eritrocitos, si estos se encuentran recubiertos deinmunoglobulinas como son los casos de autoinmunidad y de la enfermedad hemolítica del recién nacido.

Un aspecto a tomar en consideración es que estos anti sueros, debido a los aditivosque se le añaden para ayudar a la aglutinación pueden producir reaccionesfalsas positivas.Para detectar estos falsos positivos, es importante correr paralelamente con laprueba de Rh una prueba control, utilizando un reactivo inmunológicamenteinerte, preparado por la misma casa comercial del reactivo anti-Rh.Este control posee los mismos aditivos que están en el reactivo anti-D, pero sinlos anticuerpos. Si las células que están en estudio son aglutinadas por estecontrol, el resultado de la prueba debe ser invalidado, siendo necesarioanalizarlo por otro método.En caso de ausencia del reactivo control se puede utilizar albúmina bovina al22%, produciendo incluso menos falsos positivos que elanterior, ya que la albúmina no contiene los potenciadores de alto pesomolecular pero sí su alto contenido proteico.

Reactivos1- Anti-D, IgG de alta concentración proteica.2- Reactivo para el control de Rh, manufacturado según la casa comercial oalbúmina al 22%.Materiales y muestras1. Tubos de pruebas limpios y secos.2. Pipetas Pasteur.3. Solución salina 0.9%.4. Centrífuga serológica (3000 rpm ).5. Guantes.6. Gabacha.7. Recipientes de descarte de material.8. Tubos de ensayo.9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.Método:1- Marcar dos tubos uno como D ó Rh y otro como control ó Ctrl.2- Agregar al tubo rotulado como D, 1 gota del reactivo anti-D.3- Agregar al tubo rotulado como control, 1 gota del reactivo control y encaso de no disponer de albúmina.4- Añadir 1 gota de la suspensión entre el 3-5% de los glóbulos del pacienteen estudio.

5- Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm en una centrífugaserológica.6- Resuspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.Interpretación:

Interpretación de los resultados de RhAnti D Control Interpretación1-4+ 0 Rh positivo

0 0 Rh negativo1-4+ 1-4+ No se puede interpretar

Si el control está positivo el resultado se considera inválido. Si prevalece el resultado positivo en el control, el resultado del Rh (D) seconsidera inválido y se requiere investigación adicional con la utilización dereactivos con anti-D salino o químicamente modificado

Procedimiento 9

Detección del antígeno D débil

Principio

Algunos glóbulos rojos expresan más débilmente el antígeno D en la membrana,esta condición puede provocar que en la primera fase del análisis, cuando setrabaja con reactivos de alto contenido proteico se presenten resultadospositivos y con otros una reacción negativa.Estas discrepancias se resuelven cuando las pruebas con resultados negativos sellevan a la fase de antiglobulina, detectando el antígeno con expresión débil queen la primera fase no se logró detectar.Debido a la trascendencia desde el punto de vista transfusional o en laprevención de la enfermedad hemolítica del recién nacido, todo estudioserológico con anti-D proveniente de un donante de sangre o un recién nacidocon una lectura negativa en la primera fase, se debe continuar hasta la fase deantiglobulina para confirmar el resultado.

Método:1- Si la prueba de Rh da resultado negativo incubar el tubo estudio y el tubocontrol por 30 minutos a 37ºC.2- Lavar 3 veces las muestras con solución salina 0.9%3- Secar bien la última gota.4- Añadir dos gotas del reactivo de antiglobulina humana.5- Mezclar y centrifugar por 30 segundos a 3000 rpm.6- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados7- Confirmar reactividad de reactivo agregando una gota de “Células

Control de Antiglobulina Humana”8- Mezclar y volver a centrifugar los tubos por 30 segundos a 3000 rpm.9- Re suspender cuidadosamente, leer, anotar e interpretar los resultados.Interpretación de resultados:La aglutinación en el tubo de anti-D y la ausencia de aglutinación en el tubocontrol indican un resultado positivo. La sangre debe de clasificarse como Rhpositivo.La ausencia de aglutinación en ambos tubos, el estudio y control indican unresultado negativo y la sangre debe de clasificarse como Rh negativo.Presencia de aglutinación en el tubo control invalida la prueba y debe derepetirse. Si esta vuelve a dar positivo, se debe considerar un estudio paraAnemia Hemolítica Autoinmune iniciando con una prueba de antiglobulina directa.

Interpretación de Rh débilAnti D Control Interpretación1-4+ 0 Rh positivo

0 0 Rh negativo1-4+ 1-4+ Anemia hemolítica

autoinmune

Procedimiento 10

Células Control de Antiglobulina Humana.

Principio

Las Células Control de Antiglobulina Humana, son glóbulos rojos sensibilizadoscon inmunoglobulina tipo IgG, son utilizadas para validar metodologías entubo con resultados negativos en la fase de antiglobulina humana.La presencia de aglutinación después de ser añadidas al medio de reacciónindica que los lavados fueron realizados adecuadamente y todos los restosproteicos fueron eliminados, no neutralizaron el reactivo de antiglobulinahumana y el resultado de la prueba puede ser validado.

Cuando una prueba de antiglobulina humana da un resultado negativo, quieredecir que no hubo reacción antígeno-anticuerpo, los glóbulos rojos en pruebano contienen el antígeno especifico para el antisuero que se está probando o elsuero en estudio no tiene anticuerpos contra ninguno de los antígenosexpresados en los eritrocitos utilizados, por tanto, en el tubo de reacción debede quedar reactivo anti-IgG activo y funcional presente en el medio.Al adicionar las Células Control de Antiglobulina Humana las IgG activaslibres reaccionan con las células provocando la aglutinación.

Si se presenta un resultado negativo después de ser añadidas, indica que los lavados fueron realizados incorrectamente, quedaron restos de inmunogloblinas que neutralizaron el reactivo de antiglobulina humana y la prueba debe ser invalidada y repetida.

Materiales y Reactivos:Células Control de Antiglobulina Humana entre el 3 – 5 % obtenidas de casacomercial o preparadas en el laboratorio.Tubos de pruebasGradillasPipetasCentrífuga serológica

Procedimiento:1- Mezcle y resuspenda con suavidad las células del reactivo de Control deAntiglobulina Humana2- Añada 1 gota de las Células Control de Antiglobulina Humana a cadatubo con resultado negativo en la prueba de inmunoglobulina humanaincluyendo al control.3- Mezcle y centrifugue 30 segundos a 3000 rpm4- Resuspenda cuidadosamente, lea, anote e interprete los resultados.

Procedimiento 11

Conservación de Glóbulos Rojos.Preservación de la sangre:Los glóbulos rojos pueden ser preservados con diversos propósitos como porejemplo:- Preservación de hemocomponentes para ser utilizados con finesterapéuticos.- Investigación.- Fuente de reactivos como las células rastreadoras, células control deAntiglobulina Humana, células A1, B.- Control de calidad de los antisueros utilizados de manera rutinaria enlos Bancos de Sangre y servicios de Inmunohematología y demás.Existen diversas soluciones que ayudan a anticoagular y conservar los glóbulosrojos como son el:- ACD (adenina, citrato, dextrosa),- CPD (citrato, fosfato, dextrosa),- CPDA-1 (citrato, fosfato, dextrosa, adenina).Otros pueden ser soluciones aditivas que lo que permiten es sólo suconservación brindando fuente de energía y sustancias precursoras para subiosíntesis normal, entre los que se encuentra el Alsever, Adsol, y el Alsevermodificado.

La parte más importante de las soluciones para la conservación de células rojasen estado líquido, es que deben proporcionar el mantenimiento intacto delfenotipo eritrocitario y reducir los riesgos de contaminación microbianadurante largo tiempo, lo cual posibilita su uso para pruebas diagnósticas in vitroy su comercialización.Soluciones sólo anticoagulantes como el EDTA, alteran a cabo de un tiempo lamorfología normal del glóbulo rojo, por lo que no pueden ser utilizadas para este propósito.

MétodoObtener una muestra de su propia sangre siguiendo instrucciones delprocedimiento 1 de este manual.Recolectar 10 ml y dividirla entre un tubo con EDTA (tapón lila) y un tubo consolución de Alsever.Rotular con sus datos personales el tubo con Alsever y colocarlo en la gradillapara ser guardado en refrigeración a 4ºC.Es muy importante guardar la muestra pues con ella se trabajará en prácticas posteriores.

Procedimiento 12

Determinación del fenotipo Rh

Principio

Aparte del antígeno D se han descrito otros antígenos pertenecientes al sistemaRh, específicamente más de 50 diferentes, sin embargo, de estos los principalespor su capacidad de inducir una respuesta inmune y por ende implicados enreacciones transfusionales o en la enfermedad hemolítica del recién nacido sonlos antígenos C, E, c y e.Algunas asociaciones de antígenos incluyen al D y otras no. La composición deestas combinaciones antigénicas está determinada genéticamente.Dos genes homólogos y estrechamente ligados son los responsables de laproducción de los cinco antígenos principales del sistema Rh. Uno llamadoRHD determinará la producción o la no producción del antígeno D, mientrasque el otro gen RHCE será el encargado de la producción de los antígenos C, c,E y e.De igual manera que para el antígeno D, se encuentran disponibles en elmercado reactivos pobres en proteínas (químicamente modificados omonoclonales) o ricos en proteínas con anticuerpos específicos para determinarla presencia de los antígenos C, E, c y e.Pueden producir reactividad variable con diferentes haplotipos en los eritrocitos(fenómeno de dosis), por lo que esta debe ser considerada dependiendo de losantígenos expresados en membrana a la hora de hacer un fenotipo de Rh, porejemplo CDE o CE son los responsables de la mayoría de la expresión de C enlos eritrocitos humanos.

Se ha reportado antígenos variables E y c, pero son considerablemente menoscomunes.Cualesquiera que sean los reactivos utilizados, las indicaciones del fabricantedeben ser seguidas cuidadosamente. Los concentrados de sueros humanosusados para preparar reactivos, de los demás antígenos Rh; tienen riesgosignificativo de contener especificidades contaminantes reactivas con laantiglobulina, anticuerpos irregulares e inducir poliaglutinación.Para evitar estas y otras situaciones, es recomendable correr en paralelo con laPrueba, controles positivo y negativo para los antígenos en estudio.Los eritrocitos seleccionados para el control positivo deben tenerpreferiblemente una sola dosis del antígeno implicado. La frecuencia de estosantígenos en población caucásica es de:C: 70%, c: 80%, E: 30% y e: 98% respectivamente.Materiales y Reactivos:Anti-C, Anti- c, Anti-E, Anti-e, Anti-D, anti-A, anti-B, anti-ABCélulas A1, células B, células control de antiglobulina humanaReactivo de antiglobulina humanaAlbúmina 22%Solución salina 0.9%Solución de AlseverTubos de ensayo para análisisPizetasPipetas pasteurCentrífuga serológicaGuantesGabachaJeringasAgujasTubos con EDTATubos con solución de AlseverAlgodónAlcohol al 70%Recipientes de descarte de muestras y material

Muestras:Se puede utilizar muestras de sangre con EDTA o sin anticoagular.

Método:Preparar una suspensión de células al 3 – 5% en solución salina fisiológica.Rotular tubos como D, C, E, c, e y control.Añadir una gota del reactivo a cada tubo rotulado.Añadir una gota de la suspensión a analizar a todos los tubos.Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm.Resuspender, leer, anotar las reaccionesIncubar los tubos que dieron reacción negativa a 37ºC por 15 minutos.Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3000 rpm.

Resuspender, leer, anotar e interpretar las reacciones.Interpretación de resultados:Una aglutinación de 1+ a 4+ indica que hubo reacción antígeno - anticuerpo,por lo que la prueba debe ser considerada positiva.La no presencia de aglutinación en el medio indica la ausencia del antígeno ypor lo tanto la prueba es negativa.Muchos de estos antisueros son del tipo IgM, o IgG químicamente modificadospor lo que no se debe de llevar hasta la fase de antiglobulina humana.

Procedimiento 13

Determinación de la sustancia H en saliva

Principio

El gen Se es el responsable de la expresión del antígeno H en las secreciones.En las personas secretoras se puede encontrar sustancia H en saliva, orina,lágrimas, líquido amniótico, leche y fluidos digestivos. La cantidad encontradaen estas secreciones puede variar dependiendo del grupo ABO.Si las personas son del grupo A, B o AB y heredaron el gen Secretor, se puedendetectar sustancias A y B en las secreciones.El gen Se es de carácter dominante sobre se. El 85% de la población esSecretora.El gen “se” no se ha asociado con la codificación de algún productodemostrable, por lo que se dice que es un gen amorfo y representa al 15% de lapoblación.La técnica utilizada es la inhibición de la aglutinación.

Reactivos y materiales

Sets de reactivos anti A, anti B, anti AB, anti D, anti H, albúmina 22% yreactivo de antiglobulina humanaSolución salina fisiológicaCélulas al 3% de los grupos A1, B y OMuestras con sangre para analizar.Beacker de 10 ó 25 mlTubos tipo PirexPipeteadoresPipetas de 10 mlTrípodesMecheros de bunsenChispas para mecheroCedazosCentrífugas serológicaCentrífugas de tubosPipetas Pasteur

Goteros para pipetas pasteurTubos de 12 x 75 mmMicropipetas de 100-200 ml (en este caso poner puntas de micropipetas)Pipetas de 1 mlPapel parafilmMaterial de descarteGradillas metálicasGradillas maderaPuestos de descarte por mesa y material necesario para la limpieza de lasmesas.

Preparación de la muestra:

Colectar aproximadamente 5 ml de saliva fresca en un beaker o en un frasco de vidrio de boca ancha.Transferir la saliva a un tubo 12x75 mm y centrifugue 5-10 minutos a 3000 rpm.Transferir el sobrenadante claro a un tubo de vidrio tipo pirex 13x100.Colocar el tubo en un baño de agua hirviendo por 10 minutosTransferir nuevamente la saliva a un tubo 12 x 75 mmCentrifugar la muestra por 5 minutos a 3000 rpmUtilizar el sobrenadante claro y opalescente inmediatamente para su estudio. Sino lo va a procesar al momento se puede congelar a -20ºC para su posterioranálisis.Preparar una suspensión al 3-5% de glóbulos O, A1 y B.Preparación de reactivos:El siguiente procedimiento se va a realizar por mesa de trabajo y de este van arealizar sus respectivas pruebas.Realizar diluciones dobles del reactivo anti-A, anti-B y anti-H hasta obtener unaaglutinación de 2+.

Método:

Determinación de la sustancia A, B o H en saliva:

Pipetear 100 ul. del sobrenadante de la saliva en cuatro tubos de ensayo limpios.Rotular como A, B, H.Añadir 50 ul de la lectina anti-H diluida al tubo rotulado como H.Añadir 50 ul de anti A diluido al tubo rotulado como A.Añadir 50 ul de anti B diluido al tubo rotulado como B.Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

Posterior a la incubaciónAgregue 50 ul de eritrocitos A al tubo AAgregue 50 ul de eritrocitos B al tubo BAgregue 50 ul de eritrocitos O al tubo H

A los tubos rotulados como control positivo añadir 50 ul de la lectina anti-H diluida. Rotular H+50 ul de anti A diluido. Rotular A +50 ul de anti B diluido. Rotular B +y agregar 50 ul de eritrocitos O al tubo H+, 50 ul de eritrocitos A al tubo A+ 50 ul de eritrocitos B al tubo B+Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

A los tubos rotulados como control negativo añadir 50 ul de saliva. Rotular H+50 ul de saliva . Rotular A +50 ul de saliva. Rotular B +y agregar 50 ul de eritrocitos O al tubo H+, 50 ul de eritrocitos A al tubo A+ 50 ul de eritrocitos B al tubo B+Mezclar e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.

Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm.Resuspender, leer e interpretar lo resultados

Resultados de grupo secretor

Células O Células A Células B Interpretación0 + + Secretor H+ 0 + Secretor A+ + 0 Secretor B

Control positivoCélulas O Células A Células B Interpretación

+ + + Válido0 0 0 Inválido

Control negativoCélulas O Células A Células B Interpretación

+ + + Inválido0 0 0 Válido

Práctica:Determinar estado secretor en saliva.Seguir realizando determinaciones de grupos sanguíneos

Procedimiento 14

Determinación fenotípica del sistema MNSs

Principio

Los antígenos M y N fueron descubiertos en 1927, cuando Landsteiner y Levineobtuvieron los anticuerpos que los definían mediante la inmunización deconejos con glóbulos rojos humanos.Son dos genes estrechamente ligados uno que codifica para los antígenos MN yel otro para los antígenos Ss.En este sistema se agrupan 3 antígenos de alta frecuencia y al menos 30 de bajafrecuencia.Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo MNSs se encuentran ubicados enproteínas integrales de membrana del glóbulo rojo de 43 KDa.Los antígenos MN se localizan en la glicoforina A (GPA) y los Ss en laglicoforina (GPB), también se han ubicado los antígenos del sistema Gerbich enlas glicoforinas C y D.Las glicoforinas además de interaccionar con el citoesqueleto del glóbulo rojoposeen gran cantidad de ácido siálico, en su estructura lo que ayuda a brindar lacarga negativa a la membrana.La diversidad antigénica está basada predominantemente en lasrecombinaciones genéticas, recombinaciones homólogas o conversionesgénicas.Los eritrocitos que carecen de los antígenos S y s son también negativos para elantígeno del alta frecuencia U.Los antígenos M y N así como los S y s se comportan como productos de paresde genes alélicos, manteniendo una clara relación alélica.Los anticuerpos contra antígenos del sistema MNSs se han involucrado comocausa de reacciones hemolíticas transfusionales, agudas o tardías, especialmenteen pacientes politransfundidos.Los anticuerpos anti-M y anti-N pueden mostrar efecto de dosis dandoreacciones significativas más intensas y con altos títulos en presencia deglóbulos rojos homocigotos para los antígenos que frente a glóbulos rojosheterocigotos.El anti-M se detecta en el suero humano como una aglutinina en solución salinaa temperatura ambiente sin antecedentes de transfusión; condición que lepermite su denominación de anticuerpo natural.El anti-M rara vez produce problemas clínicos, aunque cuando reacciona a 37ºCo en fase de antiglobulina se puede considerar como significativo,especialmente si este es del tipo IgG.El hallazgo de un anti-N es menos frecuente que el anti-M, es una IgM ytípicamente se comporta como crioaglutinina, eventualmente puede presentarsecomo una IgG con expresión clínica significativa, como ocurre en los pacientesbajo hemodiálisis.

En estos pacientes posteriormente se logró asociar la producción del anticuerpoanti-N con el uso de membranas de diálisis esterilizadas con formaldehido.Dado que las enzimas destruyen los antígenos, la reactividad anti-M y el anti-Npuede ser eliminada por técnicas enzimáticas habituales.Los antisueros comerciales anti-M o anti-N debido a que han sido seleccionadosy estandarizados para reaccionar adecuadamente con todos los glóbulos enestudio, en muy raras ocasiones presentan efecto de dosis a diferencia de losanticuerpos producidos por los pacientes.Frecuentemente se encuentran casos de anti-M que reaccionan sólo conglóbulos rojos homocigotos. Por el contrario, los sueros de anti-N rara vezproducen este efecto.Los anticuerpos anti-S, anti-s y anti-U pueden aparecer posterior a unaestimulación eritrocitaria, se detectan en la fase de antiglobulina e in vivomuestran una significativa actividad hemolítica.La frecuencia de fenotipos del sistema MN en poblaciones caucásicas es de:MM: 28%, MN: 50% y NN: 22%

Reactivos

Se dispone de reactivos comerciales para determinar los antígenos MNSs.Estos se obtienen a partir de inmunización de animales, de origen humano,anticuerpos monoclonales y de lectinas.La lectina más ampliamente utilizada como reactivo análogo del anti-N es elextraído de las semillas de Vicia gramínea.Se debe conocer muy bien el tipo de reactivo que se esta utilizando, para obtener buenos resultados.

Materiales y muestras:1. Tubos de 12x75mm limpios y secos2. Pipetas pasteur3. Solución salina 0.9%4. Centrífuga serológica (3000 rpm )5. Guantes6. Gabacha7. Recipientes de descarte de material8. Tubos de ensayo9. Muestras de sangre total anticoagulada con EDTAProcedimiento para la detección de los antígenos MN:1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.2- Identificar los tubos a analizar como M y N.3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.5- Mezclar y centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos.6- Resuspender las células e interpretar las reacciones

Interpretación de resultados sistema MNAnti M Anti N Interpretación

+ 0 MM0 + NN+ + MN

Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos homocigotas para losantígenos a investigar tanto positivos como negativos.

Procedimiento para la detección de los antígenos Ss:1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.2- Identificar los tubos a analizar como S y s.3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC6- Lavar tres veces con solución salina.7- Añadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana.8- Mezclar y centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos.9- Resuspender las células e interpretar las reacciones.10- Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con célulascontrol.Procedimiento para la detección de los antígenos Ss:1- Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.2- Identificar los tubos a analizar como S y s.3- Añadir 50ul del antisuero correspondiente.4- Añadir 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.5- Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC6- Lavar tres veces con solución salina.7- Añadir 100 ul gotas de reactivo de antiglobulina humana.8- Mezclar y centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos.9- Resuspender las células e interpretar las reacciones.10- Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células control.

Interpretación de los resultados sistema SsAnti S Anti s Interpretación

+ 0 SS0 + ss+ + Ss

Práctica:Con técnica aséptica transfiera una alícuota de la sangre preservada enALSEVER a un tubo adecuadamente rotulado.Guardar el resto de la muestra con solución de Alsever para próximas prácticas.De la muestra transferida, realizar tres lavados con solución salina fisiológica y

preparar una suspensión al 3-5%.Determinar el fenotipo para los antígenos M N S y s.

Procedimiento 15

Determinación fenotípica de los sistemas de grupo sanguíneo Kell, Duffy yKidd.

Principio:

Los antígenos del sistema de grupo sanguíneo Kell se ubican en una proteína deun solo paso transmembrana de 93 KD; en ella se han podido identificar almenos 25 antígenos distintos.Este sistema se caracteriza por estar constituido por antígenos de alta y de bajaincidencia dentro de la población.Se ha observado que 13 de estos antígenos son de alta frecuencia y al menos 5de baja incidencia, algunos se encuentran organizados en cinco grupos alélicos,mientras que otros, principalmente los antígenos de alta frecuencia, pueden serexpresados independientemente.El antígeno Kell (K) sólo se expresa en la membrana del glóbulo rojo. Elpromedio de sitios antigénicos varía de 2300 a 6100 en eritrocitos homocigotospara K y de 200 a 3500 en células heterocigotas Kk.El grupo sanguíneo Kell, es altamente inmunogénico y está completamentedesarrollado al nacer.Al igual que con otros sistemas de grupo sanguíneo, el anti-K puede seradquirido al exponerse a eritrocitos con presencia del antígeno, ya sea por unatransfusión de sangre o por un embarazo donde el niña/o hereda el antígenopaterno.Con muy poca frecuencia se han descrito casos de anti-K y anti-k (Cellano) depresentación natural. Estos son del tipo IgM, reaccionan a temperatura ambientey se presentan secundarios a infecciones agudas bacterianas, principalmentecuando el agente causal es una E. coli O125.b15.Desde el punto de vista inmune, los anti-K y anti-k son muy importantes,usualmente son anticuerpos del tipo IgG1 con fuerte actividad hemolítica in vivoEl sistema Duffy está constituido por una glicoproteína de 35-43 kDa que seexpresa en la membrana del glóbulo rojo.El número de sitios antigénicos en células Fy (a+b-) se ha estimado en 6900 yde 17000.Los antígenos del sistema Duffy están relacionados cuando menos con sietereceptores diferentes de membrana, entre los que se incluyen al receptor dequimosinas y al receptor de los parásitos de la malaria.Un hecho importante y que se ha asociado mucho con procesos de evolución yadaptación de las especies, es que los glóbulos rojos con fenotipo Fy (a-b-),muy comunes en individuos de raza negra, son resistentes a la invasión de losparásitos de las especies de Plasmodium vivax y Plasmodium knowlesi.Los anticuerpos Duffy pueden causar reacción hemolítica severa, asimismo, su

presencia en mujeres embarazadas debe de ser evaluada cuidadosamentemonitoreando cambios constantes en el título de anti- Fy maternos.Se ha establecido que títulos de anticuerpos maternos de 1:64 o mayores debende ser considerados de alto riesgo fetal y neonatal.En el sistema Kidd (Jk) se ha observado que sujetos Jk(a-b-) tienen resistenciaa la lisis por la urea 2M, aunque conservan normal su función de permeabilidadal agua.Una característica del anticuerpo producido contra antígenos del sistema Kiddes que muestra destrucción mediada por complemento, dichos anticuerpos se han observado en pacientes que son Jk(a-b-) en donde el 90% de las célulasJk(a+b+) transfundidas son eliminadas en 30 minutos, mientras que se prolongaal triple cuando son células Jk(a+b-).Este anticuerpo también se encuentra asociado con la producción de cuadros deenfermedad hemolítica severa.

Materiales1. Tubos de pruebas limpios y secos2. Pipetas pasteur3. Solución salina 0.9%4. Centrífuga serológica (3000 rpm )5. Gradillas6. Guantes7. Gabacha8. Recipientes de descarte de material9. Tubos de ensayoMuestras:Muestras de sangre total anticoagulada con EDTA.Muestras preservadas con solución de Alsever.Reactivos:Anti-K, anti-k, anti-Fya, anti-Fyb, anti-Jka, anti-Jkb, albúmina al 22%,antiglobulina humana, Células Control de Antiglobulina Humana.Método:

1. Preparar suspensiones de glóbulos rojos al 3-5% en solución salina.2. Identificar los tubos a analizar como K, k, Fya, Fyb, JKa, Jkb, control.3. Añadir 50ul del antisuero correspondiente a cada tubo rotulado4. Al tubo control añadir 50 ul de de albúmina al 22%5. Añadir a todos los tubos 50ul de la suspensión de glóbulo a analizar.6. Mezclar e incubar por 30 minutos a 37ºC7. Lavar tres veces con solución salina.8. Secar la ultima gota de salina con papel absorbente.8. Añadir dos gotas de reactivo de antiglobulina humana9. Mezclar y centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos.10. Resuspender las células, leer e interpretar las reacciones.11. Si el resultado es negativo, realizar la corroboración con células control.

Interpretación de los resultados sistemas Kell, Duffy y Kidd.Anti K Anti k Anti Fya Anti Fyb Anti Jka Anti Jkb Interpretación

+ 0 - - - - KK0 + - - - - kk+ + - - - - Kk- - + 0 _ - Fya Fya- - 0 + - - Fyb Fyb- - + + - - FyaFyb- - 0 0 - - fyfy- - - - + 0 JkaJka- - - - 0 + JkbJkb- - - - + + JkaJkb- - - - 0 0 jkjk

Siempre incluya como control muestras de glóbulos rojos conocidos, tantopositivos como negativos, para los antígenos a investigar.

Práctica:Tomar una alícuota de la sangre preservada en ALSEVER y transferir unamuestra a un tubo adecuadamente rotulado.Realizar tres lavados con solución salina fisiológica y preparar una suspensiónal 3-5%.Determinar el fenotipo para los antígenos K, k, Fya, Fyb, Jka y Jkb.Procedimiento 16

Células rastreadoras o células pantalla

Principio

Parte de la rutina de un Banco de Sangre es la búsqueda constante deanticuerpos irregulares presentes en el suero de donadores o pacientes quepuedan causar alguna reacción transfusional cuando se administra unhemocomponente.Se ha vuelto requisito obligatorio contar con células rastreadoras o pantalla quepermitan establecer la presencia de alguno de estos anticuerpos.Estas células pueden ser obtenidas tanto comercialmente como realizadas ennuestro lugar de trabajo, deben ser del grupo O para evitar que los anticuerposnaturales interfieran en la detección de otros anticuerpos.Se obtienen a partir de donadores que son fenotipeados y que poseen losantígenos más comunes dentro de la población y que son reconocidos como deimportancia clínica, es decir, capaces de causar una reacción transfusional o unaenfermedad hemolítica del recién nacido.Las células seleccionadas deben contar con al menos en una de ellas uno de lossiguientes antígenos: D, C, E, c, e, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, K, k, Fya, Fyb, Jka yJkb.

Como el objetivo es detectar anticuerpos, la célula rastreadora ideal debe tenerla mayor cantidad de expresión homocigota posible, ya que estas células poseendoble dosis de antígeno en contraposición con las células de individuosheterocigotas.Esto es importante pues hay mayor probabilidad de detectar anticuerpos quereaccionan débilmente o que presentan bajo título con células que expresan máscantidad de antígeno.Las células rastreadoras provenientes de tres donadores deberán serhomocigotas para antígenos del sistema Rh de la siguiente manera R1R1, R2R2y rr.También en combinación deberán tener los antígenos homocigotas Kidd, Duffyy MNSs, los cuales se ha observado que muestran efecto de dosis.Otro punto importante que deben de cumplir las células rastreadoras es contarcon al menos una célula Kell positivo ya que el antígeno Kell es altamenteinmunogénico y de baja incidencia, con el objetivo de evitar severasreacciones transfusionales.Si un juego de reactivos no contiene un antígeno en particular, elcorrespondiente anticuerpo no podrá ser detectado cuando se realice lainvestigaciónAl interpretar un rastreo de anticuerpos se debe de contar con una tablafenotípica en donde se indica cuáles antígenos están presentes en las células yque deben acompañar al juego de células según el lote del reactivo.

Las células rastreadoras pueden estar disponibles en diferentes presentaciones amodo de:- Un único vial, constituido por no menos de dos células de donantes que hansido mezcladas, a este se le conoce como pool, son menos sensibles y sonutilizadas en el rastreo de anticuerpos en donantes de sangre.- Tres viales, proveniente de tres donantes diferentes, poseen una buenasensibilidad para la detección de anticuerpos y es la más utilizada en el país.- Seis viales, proveniente de 6 donantes diferentes son las que poseen la mayorcapacidad de detección de anticuerpos.Para las pruebas pretransfusionales son requeridas la presencia de célulasRastreadoras, de al menos tres viales para la detección de anticuerpos.La selección adecuada de las células permite la detección de niveles de anticuerpos muy bajos en el suero del receptor, lo cual es importante porque la ausencia de un antígeno, puede resultar en una respuesta inmune secundaria con una rápida producción de anticuerpo y destrucción del hemocomponente transfundido.Una vez confirmada la presencia de anticuerpo en un suero se tiene queinvestigar cual es el antígeno causante de la producción de este, por lo que sehace uso de paneles de identificación de anticuerpos que son un grupo de 11 acélulas con fenotipo completo y que en conjunto permiten establecer cuál es elantígeno causante.Método:

Preparación de células pantalla• Preparar suspensiones de eritrocitos de donadores O al 3% en soluciónsalina.• Las células escogidas de referencia son R1R1, R2R2, rr.• Hacer fenotipo para los grupos sanguíneos Duffy, MNSs, Kk, Kidd, Lewis yP.• Escoger las células del fenotipo adecuado.• Separar una cantidad de 150 cc de sangre, con el número de donador, fechade extracción y de separación.• Agregar 150 cc de solución salina a la sangre separada.• Añadir 2 cc de gentamicina.• Añadir 1 cc de penicilina y agitar.• Guardar a 4 ºC en el espacio de sangre en cuarentena.• Las células se deben de cambiar cada mes.• Si se considera necesario se puede añadir soluciones preservantes como CPDo Alsever para mantener la calidad y viabilidad de las células

Práctica:Proceder a anotar en la pizarra su fenotipo completo.Una vez anotados todos los integrantes, seleccionar los mejores perfiles parauna célula rastreadora.