Institut de Recerca

Hospital Universitari Vall d’Hebron

Curs de Microdissecció

19 de juny de 2013

Mª Ángeles Artaza UAT

Institut d’Investigació Sanitària de l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII)

• Introducción a la microdisección por láser

• Instrumentación de la UAT

• Aplicaciones

• Preparación de las muestras

• Otras tecnologías

• Introducción a las pinzas ópticas

Introducción a la Microdisección por láser 1

Microdisección

Proceso que permite el aislamiento y concentración de pequeñas

cantidades de material biológico, grupos de células, células o

cromosomas a partir de muestras más complejas o heterogéneas

como pueden ser tejidos o cultivos.

En general se usa por investigadores que estudian procesos

patológicos in vivo.

El análisis de tejidos enteros homogenizados pueden enmascarar

cambios importantes en poblaciones celulares específicas.

Se estudian los cambios moleculares que tienen lugar en solo 1 o 2

tipos de células en un proceso patológico específico.

Introducción

Los tejidos son complejos

Jaime Rodriguez-Canales © Microdissection Core Facility, Laboratory of Pathology, NCI

Jaime Rodriguez-Canales © Microdissection Core Facility, Laboratory of Pathology, NCI

El tumor contiene diversas subpoblaciones

•Desarrollado en 1996

Pensado y desarrollado por un equipo del NIH dirigido por Lance Liotta,

Robert Bonner y Michael Emmert-Buck

El primer instrumento comercial lo desarrolló Arcturus Engineering, en 1997

formando una cooperativa con el NIH

Emmert-Buck MR et al., Science 274:998, 1996 Simone NL et al., Trends in Genetics 14:272, 1998

•Se componen de

Microscopio recto o invertido

Laser de longitudes de onda que van del IR al UV

Un programa informático que lo controla

Básicamente las células son seleccionadas virtualmente en la pantalla del

ordenador, cortadas por el láser con una precisión de micras y recuperadas

en un tubo eppendorf o un soporte específico

Sistemas de microdisección

2 Instrumentación de la UAT

Instrumentación de la UAT

LMD Leica Microsystems

•Microscopio recto

•Muestra sobre membrana

•Movimiento del láser

•Laser UV (λ= 355 nm)

•Potencia max del laser: 70 µJ

•Frecuencia: 80 Hz

Instrumentación de la UAT

Instrumentación de la UAT

1 microscopio de microdisección: Leica LMD 6000 equipado con pinzas ópticas

adaptado para microdisectar célula viva

Objetivos optimizados para microdisección:

1,25x, 5x,10x,20x, 40x

150x especial para cromosomas

Objetivos de inmersión 63x, 100x

Microscopio de fluorescencia, campo claro, campo oscuro, contraste de fases, DIC,

polarización.

Software de reconocimiento de imagen y deconvolución.

Laser de estado sólido de 355nm

Instrumentación de la UAT

Instrumentación de la UAT

1 criostato Leica CM3050 S.

3 Pasos a seguir

1. Preparación de muestras para Microdisecció

2. Microdisección

3. Análisis Molecular

Funel N et al. Expert Rev. Mol. Diagn. 11(7), 695–701 (2011)

Preparación Tinción Microdisección

Extracción Análisis

Preparación de la muestra

•Los resultados dependerán tanto del tipo tisular como de la calidad de la

preparación de la muestra.

•Célula viva

•Fresco>Congelado>etanol-parafina >formaldehido-parafina

•Idealmente congelación rápida seguida de almacenamiento a -80ºC.

•En el grosor del corte depende de la muestra, habitualmente entre 4–20 µ

Preparación de la muestra

Elección del porta/membrana:

•PET (polietilen tereftalato) recomendado para el análisis de

proteínas por MALDI, SELDI análisis de ionización.

•PEN (polietilen naftaleno) no recomendado para análisis de

ionización.

•Expression Pathology EP Director slides recomendado

para análisis de proteínas, baja autoflorescencia, grandes

áreas.

• Membranas con poca autoflorescencia PPS, FLC, EP.

Tinción

Protocolos de tinción

•Solo para reconocer las estructuras. Hay que llegar a un acuerdo entre

identificación y recuperación. Menos es más

•Hay que ser consciente de que la identificación es diferente (peor) cuando no

usas cubre

•Perdida de biomoleculas

•Interferencia con la extracción

•Interferencia con el análisis molecular

•Tinciones : H&E o H...

Tinción

Protocolos de tinción

•Tinciones : H&E o H...

•Cresil violeta

•Azul de toluidina

•Naranja de Acridina

Microdisección

Total RNA

(μg)

mRNA

(μg)

Cultivo (107 células) NIH/3T3 120 3

Hela 150 3

COS7 350 5

Tejido ratón (100 mg)

Cerebro 100 5

Corazón 120 6

Intestino 150 2

Riñón 350 9

Higado 400 14

Bazo 350 7

Pancreas 181000

Bazo 10600

Pulmón 5300

Higado 64

Timo 16

Riñón 8

Corazón 2

Cerebro 1

Contenido de RNA en distintas células y tejidos Incremento de la actividad de las RNasas en tejidos de ratón (En relación a cerebro=1)

Una vez seleccionadas las células, la cantidad y la calidad que necesitamos os

sugerimos hacer las siguientes pruebas

•Prueba sobre cristal sin cubre

•Prueba de microdisección sobre membrana

•Puesta a punto del método de extracción con raspado sobre cristal: cantidad y

calidad

•Prueba con tejido microdisectado

Preguntas para empezar

Otras tecnologías 4

•Basados en láser infrarrojo (IR-Capture )

Transfiere las células a un polímero termoplástico del que, posteriormente, se

extraen las células

Fue el primero que se diseñó

IR no daña los tejidos

•Basados en láser UV (Catapulting, capture o gravity)

Se utiliza el UV para cortar

El tejido está montado sobre una membrana

UV daña las células sobre las que actúa

Sistemas de microdisección

Sistemas de microdisección

ArcturusXT™ LCM

Veritas

Arcturus Engineering

desarrollado por el National Institute of Health (NIH)

•Microscopio recto

•Muestra sobre cristal

•Laser IR (λ= 980 nm)

Sistemas de microdisección

LMPC (Laser Microdissection and Pressure Catapulting)

Carl Zeiss MicroImaging GmbH-PALM Microlaser Technologies

•Microscopio invertido

•Muestra sobre membrana

•Movimiento de platina

•Laser UV (λ= 337 nm)

Sistemas de microdisección

•Microscopio invertido

•Muestra sobre membrana

•Movimiento de la platina

•Laser UV (λ= 335 nm)

MMI CellCut Plus

5 Pinzas ópticas

Basado en los efectos de la presión de la luz láser al ser enfocada sobre un

punto.

Las pinzas o trampas ópticas tienen la capacidad de atrapar y manipular

partículas microscópicas utilizando la luz y trampas de gradiente.

Mediante presión fotónica se atrapan pequeñas partículas (0.5 – 10 µm) como

células en suspensión que pueden ser manipuladas como si estuviesen

retenidas por unas «pinzas ópticas».

Pinzas ópticas: Introducción

Las trampas más habituales; un

láser enfocado por un objetivo de

microscopio de elevada apertura

numérica y se utiliza el microscopio

para ver las partículas. La partícula

atrapada suele estar en un medio

líquido sobre un porta

Pinzas ópticas: Introducción

Principio físico de las pinzas ópticas

Los rayos de luz inciden sobre una

esfera de diferente índice de

refracción que el medio que la

rodea, por ejemplo una célula y el

medio de cultivo.

Al refractarse, el fotón cambia de

dirección y por la conservación del

momento, se genera una fuerza en

la dirección opuesta al rayo

refractado (algo parecido al efecto

Venturi, pero con fotones).

Pinzas ópticas: Introducción

•Separación y agrupación de células.

•Interacciones celulares. Permite aproximar células distintas, que originalmente

estén muy separadas, para ponerlas en contacto: presentación antigénica,

polarización, quimioquinas, etc.

•Inducción de fusión entre células

•Medición de fuerzas a nivel celular

Pinzas ópticas: Aplicaciones

Pinzas ópticas: Aplicaciones