introduction à la transillumination en biophotonique · 2008-05-28 · introduction à la...

Introduction à la Transillumination en Biophotonique

Stéphane Mottin1 et Jean-Michel Tualle2

1 LTSI , CNRS & Université Saint-Etienne

Saint-Etienne

2 LPL, CNRS & Université Paris XIII Villetaneuse

Définition du problème A partir d’une surface d’un tissu vivant perfusé comment pouvons-nous

mesurer des propriétés ou des variations des propriétés physico-chimiques situées à l’intérieur de ce tissu par des voies optiques ? Notamment au travers du scalp, de la boîte crânienne, des méninges, comment atteindre le cortex et les tissus nerveux ? Quels sont les précisions anatomiques et les temps de mesure que nous espérons atteindre suite à la propagation dans ces milieux compartimentés sur plusieurs échelles et très diffusants ?

Nous proposons une introduction à ce domaine de la biophotonique en particulier en neurophotonique. En suivant les différentes étapes aussi bien sur le plan théorique qu’expérimental, nous pourrons apprécier les choix et les compromis qui font partie intégrante du design des systèmes optiques de transillumination.

Nous aborderons tout d’abord les aspects fondamentaux concernant les théories de la propagation en milieux aléatoires. Nous verrons ensuite les enjeux de l'optique biomédicale, en nous focalisant sur les grandeurs ou les variations des grandeurs d’intérêt. Au travers de l’intérêt biologique et/ou médical de la mesure des coefficients optiques, la nécessité de la résolution temporelle sera abordée. Enfin, les techniques résolues dans le temps seront traitées en soulignant les contraintes des systèmes opto-électroniques qui essaient de répondre à la question. Deux brevets CNRS seront détaillés. Le premier repose sur la détection par camera à balayage de fente en mode comptage et transillumination par continuum femtoseconde et le deuxième apporte une nouvelle méthode interférométrique alternative à la résolution temporelle par modulation de la longueur d’onde.

Le public visé va du licencié en physique aux ingénieurs et aux

chercheurs. L’objectif est de présenter les principes de la transillumination des tissus vivants afin de mieux identifier les besoins et de comprendre certaines contraintes liées à la réalisation de diverses approches. Ces

S. Mottin – J.-M. Tualle 444

domaines sont regroupés sous le sigle DOT (diffuse optical tomography). Les principes de transillumination DOT peuvent être, bien sûr, être étendus à d’autres matériaux diffusants en dehors des sciences du vivant.

Les théories de la propagation des tissus

Divers aspects de la propagation dans des milieux diffusants en biologie (par exemple le scalp/crâne/tissus nerveux) et des systèmes picoseconde/femtoseconde associés ont déjà été détaillés notamment par les trois équipes françaises qui travaillent sur la DOT [Avrillier, 2001], [Laporte, 2004], [Montcel, 2004]. Brièvement on peut réduire la complexité des tissus vivants au dessus de quelques millimètres à un milieu diffusif ou à un ensemble de milieux diffusifs souvent disposés de manière stratifiée. Avec cette approximation on réduit le problème à la détermination de deux coefficients : le coefficient d’absorption et le coefficient de diffusion réduit.

L'approximation de la diffusion consiste à considérer la migration des photons suivant l'équation suivante avec l'opérateur diffusion-réaction :

(1)

ϕ est une densité volumique d’énergie (ou une « concentration de photon »). En milieu infini (R3), pour S0 = Dirac spatial et temporel et avec U fonction d’Heaviside, la solution est la suivante:

2/32/3 )4())4/(exp()(),(

DctctDctrtUtr a

πµ−−

=ϕ2

Cette fonction de Green comporte la variable t, temps en ps, et la variable r en mm qui représente la distance entre le point d’impact laser (r=0) et le point de détection différent de ce point d’impact. Les conditions limites pour la géométrie semi-infinie sont souvent du type mixte, c’est-à-dire une combinaison linéaire des conditions de Dirichlet et de Neumann [Kienle, 1997]. Cette approximation P1 de l'équation du transf adiatif [Avrillier, 2001] fait intervenir la diffusivité photonique (Dc). Cette dc/(3(µa + µs‘)) avec µa coefficient d’absorption en mm-1 diffusion réduit en mm-1. La diffusivité photonique 0.02mm2/ps pour les tissus diffusants comme la substandes migrations sur L=10 mm, l'échelle du centième dL2/(4Dc) est de l'ordre de quelques picosecondes, et l’ola réponse temporelle est de quelques centaines de divers tissus des valeurs des coefficients d’absorption détaillées dans la littérature [Cheong, 1990], [Yaroslavskgrandeur est respectivement pour le µs‘, 4mm-1 et po

ert r
iffusivité est égale à et µs‘ coefficient de est de l'ordre de ce grise. Ainsi pour
u temps de Fourier rdre de grandeur de picosecondes. Pour et de diffusion sont y, 2002] : l’ordre de ur µa, 0.01mm-1 (à


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800 nm), relativement proches des valeurs typiques du lait UHT demi-écrémé [Ramstein, 2004].

Le passage des informations mesurées à la surface à une information recherchée dans le volume

Récupérer des informations dans un volume par des voies optiques est réalisable suivant trois voies :

1) Méthode 1 : « ouvrir » le volume par exemple en insérant une fibre optique (voir figure ci-dessous) [Mottin, 2001b], [Laporte, 2004] ou par micro-endoscopie à confocalité fixe [Digital light confocal MicroEndoscopy, 2002], [Sung, 2003], [Viellerobe, 2004].

2) Méthode 2 : Effectuer des coupes optiques par microscopie avec différents modes de confocalité ou de confinement et avec différents contrastes [Mertz, 2001], [Mertz, 2004] (voir les articles de Lenne et de Cognet dans ce présent ouvrage).

3) Méthode 3 : Les techniques DOT qui forment le cœur de cette présentation.

~ 2 cm

Cortex 1 mmSkull 0.7 mm

Skin 1 mm

Représentation anatomique grossière chez le rat adulte soulignant

la difficulté géométrique de la transillumination crânienne.


nRD

Fibre optique (0.2mm)

Prothèse: Canal Assemblage Contact tissu- impulsion

nRD

Illumination intra-crânienne en profondeur (méthode1)

La mesure de fluorescence est réalisée chez le rat vigile permettant

de relier l’étude des comportements à des variations moléculaires

d’une petite structure cérébrale (ici le noyau du Raphé Dorsal nRD).

Les deux premières méthodes sont en fait « hyper-locales » et sont

limitées à ne sonder que sur des épaisseurs inférieures à 1millimètre pour des coefficients de diffusion typiques des tissus [Yoder, 2002], [Theer, 2003].

La première approche présente le défaut d’être souvent invasive. De plus si on veut éviter la phase aigüe du traumatisme, elle nécessite le maintien d’une prothèse mécanique sur plusieurs semaines [Mottin, 2003]. En outre la première et la deuxième voie peuvent aussi être couplées [Helmchen, 2001].

Le deuxième axe regroupe un domaine très ancien [Webb, 1999] et qui demeure très actif en optique notamment depuis l’arrivée des technologies femtoseconde dans ce domaine [Denk, 1990], [Hell, 2003b], [Chaigneau, 2003]. Pendant plus d'un siècle et dans les milieux limpides, la résolution en microscopie en champs lointain a été limitée typiquement à 180 nm dans le plan focal et à 400 nm suivant l'axe optique et actuellement les meilleures


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résolutions latérales peuvent atteindre λ/25 (28 nm) [Hell, 2003] et suivant l’axe optique, λ/23 en montage 4-Pi-STED [Dyba, 2002] ou λ/18 en simple STED [Dyba, 2003]. Par rapport à la profondeur de pénétration et du MID (maximum imaging depth), qui sont une des questions des axes de transillumination dans des tissus ou des milieux diffusants, il faut savoir que cette limite du « MID 1mm » est l’objet d’intenses recherches actuelles [Oheim, 2001], [Yoder, 2002], [Theer, 2003]. Le MID est typiquement équivalent au double du libre parcours moyen pour des facteurs de collection de fluorescence classiques et des rendements quantiques classiques des fluorophores organiques. On retrouve les ordres de grandeur du passage du mode de propagation balistique au mode diffusif. Pour des milieux considérés comme aléatoires (comme des microbilles de verres dans de l'eau), la transition entre les deux modes est assez abrupte et se situe vers 3-4 fois le libre parcours moyen [Zhang, 1999]. Récemment l’utilisation des techniques femtoseconde combinée avec des micro-lentilles GRIN (Gradient Index) a permis de dépasser cette limite du « MID 1mm » [Levene, 2004]. La faisabilité de cette approche innovante a été montrée chez la souris anesthésiée (Thy1-YFP line H mouse) avec des images de la couche corticale V et de l’hippocampe et des micro-angiographies des capillaires (avec du fluorescein-dextran ou des quantum dot).

Transillumination sur la dure-mère (nécessitant un acte chirurgical)

et microscopie par fluorescence et absorption à 2 photons Ref. P. Theer, M T. Hasan, W. Denk, Opt. Letters 28, 2003;

950nm, 200fs, 200kHz; Nikon x 40/0.8, 45mW surface; 2image(256*256)/s. Souris de six semaines.

Compartiment vasculaire avec Fluorescein Isothio-Cyanate-Dextran.


Dans ce deuxième type de méthode d’exploration des « faibles

profondeurs », il faut y ajouter une autre approche, les techniques OCT (Optical Coherence Tomography) [Tearney, 2001]. Contrairement aux autres techniques qui reposent sur la mesure de l’absorption et de la fluorescence, les techniques OCT permettent d’avoir une cartographie de la partie réelle de l’indice de réfraction. Les techniques classiques OCT offrent des résolutions axiales de 4-20 µm. Avec les lasers blancs femtoseconde à très faible longueur de cohérence, l’OCT connait une nouvelle étape avec des résolutions en dessous de 2 µm, UHR OCT (ultrahigh resolution OCT) [Bizheva, 2004]. En outre le choix de la longueur d’onde centrale est l’objet de travaux récents qui indiquent un optimum autour de 1-1.1 µm [Wang, 2003], [Bizheva, 2004]. La visualisation de microbilles de diamètre 15 µm à la profondeur de 500µm dans les tissus nerveux corticaux [Bizheva, 2004] montrent le fort potentiel de ces approches.

Pour les méthodes de surface, on peut citer le TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) dont la profondeur de pénétration se situe entre 50-150 nm [Axelrod, 2001]. Lakowitz et al ont démontré la possibilité d’exciter en multiphotonique avec les ondes évanescentes en TIRF [Gryczynski, 1997]. On peut mentionner le SNOM (Scanning Near-Field Optical Microscopy) qui permet des résolutions dans la gamme 10-100 nm [Dürig, 1986]. Les techniques SNOM classiques ou en excitation multiphotonique [Jenei, 1999] restent encore loin du domaine de la transillumination car les cellules doivent être fixées.

Méthode de tomographie optique diffuse Pour la troisième voie, DOT, et par exemple pour les applications en

neurobiologie, les premières études optiques transcrâniennes chez les enfants hydrocéphales avaient été initiées dès les années soixante [Shurtleff, 1966]. Plus récemment des industriels (Hamamatsu, Siemens, General Electric, Hitachi Central Research Lab, Advanced Research and Technology...) développent des appareils fonctionnant en mode continu ou en réponse harmonique ou impulsionnelle et à quelques longueurs d'onde. Mais aucun n'a encore réussi la validation clinique. La difficulté majeure est d’obtenir une réponse fiable d’une variation des concentrations de chromophore (hémoglobines) localisée dans une partie du volume [Okada, 2003]. Sur le plan mathématique diverses approches (analytique, éléments finis, monte carlo...) ont été utilisées [Avrillier, 2001]. L’une des plus courante est l’utilisation des fonctions de Green de l’équation de diffusion avec diverses géométries [Arridge, 1992], [Kienle, 1997], [Aydin, 2002].


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Actuellement l’imagerie DOT du petit animal utilise de plus des connaissances anatomiques a priori (IRM, scannerX) dans les processus de reconstruction des cartographies 3D des variations des hémoglobines [Bluestone, 2004].

Mesu

illumination par

Transillumination crânienne en profondeur par DOT

(méthode 3) Vue schématique de l’expérience

avec l’utilisation d’imagerie multimodale pour les calculs des zones sondées

par analyse des temps de vol de 10ps à 700ps.


Transillumination crânienne

en profondeur par DOT chez un modèle mammifère (rat hair less, photo A) et un modèle oiseau (diamant mandarin, photo B)

sans acte chirurgical en mode anesthésié sous isoflurane. La photographie C est une illustration des conditions expérimentales

avec le caisson d’insonorisation (la stimulation acoustique est réalisée par play-back [Vignal,2004]).


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L’information de volume est souvent la variation d’absorption issue des variations des chromophores d’intérêt comme les hémoglobines dans une structure activée. Ces chromophores sont situés dans le compartiment sanguin et dans les globules rouges. Si on considère que le compartiment sanguin représente de l’ordre de 6 % du volume pour le cortex cérébral et que le taux d’hématocrite est de l’ordre de 33 % à ce niveau. On obtient un pourcentage volumique de globule rouge de 2 %. La longueur d’onde de 793 nm est un point isobestique (même facteur d’extinction de deux chromophores) des formes oxygénée et déoxygénée des hémoglobines. A cette longueur d’onde on a un µa globule=1 mm-1 comme indiqué sur la figure ci-dessous, soit en homogénéisation volumique < µa >=0.02 mm-1. On parle de structure compartimentée en absorption. La différence entre les deux spectres des hémoglobines dans le proche-infrarouge est la base de la mesure en oxymétrie par les méthodes DOT [Ramstein, 2004].

Spectre d’absorption d’un globule rouge moyen chez le rat.

L’information d’intérêt consiste en la variation d’absorption liée aux hémoglobines dans une structure activée. En plus des problèmes de compartimentation, l’oxymétrie est confrontée à l’accès à une valeur précise du coefficient d’absorption du tissu étudié, sachant que celui-ci est généralement situé en profondeur, et que les couches de tissu qui le recouvre vont perturber les résultats. L’objet du problème inverse est justement de retrouver l’ensemble des paramètres optiques et géométriques.

Concernant le problème de la géométrie multicouche en réflectance figurée ci-dessous, l’équation 1 est utilisée dans chacune des couches. Pour


un milieu bi-couche avec le même indice de réfraction, l’approche par la transformée de Fourier est bien connue [Kienle, 1998], [Tualle, 2002], mais l’opération réalisée numériquement exige des longs temps de calcul. Pour obtenir une estimation plus rapide de la fonction de réflectance, d’autres méthodes ont été développées [Tualle, 2000]. On peut notamment étudier le régime asymptotique de l’intensité rétro-diffusée, résolue dans le temps, qui est généralement relié aux coefficients optiques de la couche la plus profonde. La mesure aux temps longs permet ainsi d’espérer sonder le milieux profondément, sans connaissance a priori des propriétés des couches supérieures. L’analyse du comportement asymptotique montre cependant l’existence d’une épaisseur critique de la première couche [Tualle, 2002]. Dans le cas d’un milieu bicouche, avec ∆µ=µa2-µa1 >0 la distance critique s’écrit:

bzDd −∆

=µ

π 1

2

Pour des valeurs typiques (µa1=0.0026 mm-1, µs1’=1.5 mm-1, µa2=0.015 cm-1, µs2’=1 mm-1), cette épaisseur critique est de 5.6 mm : au-delà de cette épaisseur, le comportement asymptotique dépend de manière non triviale de l’ensemble des données du milieu.

Il est donc possible par cette méthode, sans connaissance a priori d’un milieu, d’obtenir une estimation correcte des coefficients optiques de la couche profonde, à condition que l’épaisseur des couches qui la recouvre ne soit pas trop importante et que la différence entre les coefficients d’absorption ne soit pas trop forte. Dans le cas contraire, des termes correctifs peuvent être appliqués, mais nécessitent une connaissance a priori du milieu.


453

-zb Zone 0 0

source z0 Milieu 1 Zone 1 L1

Milieu 2 Zone 2

L 2

Milieu N Z Zone N

Géométrie multicouche semi-infini.

Méthode d’imagerie par porte optique temporelle Contrairement à l’exploitation des photons très diffusifs dans le cas

du régime asymptotique, de nombreux auteurs [Dunsby, 2003] ont développé des méthodes de sélection des temps de vol les plus courts par l’utilisation d’une porte temporelle femtoseconde, par exemple par amplification paramétrique optique d’images [Le Tolguenec, 1997] ou par sommation de fréquence [Yan, 1992], [Bordenave, 2002]. La sélection des photons dits « balistiques » par abus de langage permet d’échantillonner la lumière qui en fait interagit le moins avec le milieu sondé. Cet échantillonnage permet d’augmenter le contraste d’une imagerie en transillumination dans ces milieux très diffusants. Le problème principal est le très faible nombre de photons « balistiques » qui arrivent à être collectés. Une grande partie des applications biologiques et médicales se situe dans une géométrie en réflectance et non en transmission à travers une épaisseur. Cette contrainte géométrique augmente les difficultés de la mesure par sélection temporelle.

Au final le régime diffusif des tissus [Beauvoit, 1995] s’avère très efficace

pour brouiller l’information spatiale. Même le fait de vouloir accéder aux propriétés optiques du muscle ou du cerveau sans imager correspond à un problème inverse absolument non trivial. Mais un des intérêts du régime diffusif des tissus est que l’approximation de diffusion (équation 1) est de manière surprenante assez pertinente. Cette approximation est assez peu mise en défaut sauf dans les cas où une forte organisation des tissus


apparaît comme la substance blanche cérébrale. Ainsi dès une échelle de quelques millimètres, les propriétés d’homogénéisation de ce régime diffusif facilitent la définition de coefficients effectifs associés à un tissu donné. Cependant la question de l’homogéneisation du coefficient d’absorption pour un milieu compartimenté comme un organe peu absorbant perfusé par du sang très absorbant reste une question ouverte [Ramstein, 2004], [Ramstein, 2005]. Les enjeux de l'optique des milieux non limpides et la résolution temporelle « picoseconde »

Pour l’optique des tissus perfusés, la lumière peut pénétrer assez profondément dans les tissus biologiques pour des longueurs d’onde situées dans l’infra-rouge proche. Cette propriété permet l’évaluation quantitative de l’oxygénation des tissus qui est « liée » au coefficient d’absorption à ces longueurs d’onde. Les tissus sont essentiellement composés d’eau. La cellule vivante qui contient le moins d’eau est le globule rouge (de l’ordre de 50 % d’eau). Le spectre d’absorption de l’eau montre que l’absorption étant assez faible en dessous de 1300 nm, l’exploration centimétrique est possible. Du côté du visible la fenêtre de cette exploration des tissus est limitée par l’absorption des chromophores naturels notamment les hémoglobines. Plus la longueur d’onde se situe vers le bleu plus la diffusion augmente et plus l’absorption augmente aussi. La fenêtre d’exploration est donc finalement réduite à une dynamique de deux : de 650 à 1300 nm.

Nous n’avons abordé que les propriétés d’absorption et de diffusion. Si on considère l’émergence du NIRF (near-infrared fluorescence) dans l’imagerie du petit animal [Weissleder, 1999] alors on peut espérer que la fenêtre 1000-1400 nm connaisse un fort développement. Les nouveaux fluorophores stables, biocompatibles et à haut rendement quantique dans le NIR forment le point crucial de cette approche. Ils pourront être excités par les lasers impulsionnels pico/femtoseconde dont la tendance générale est l’émission dans cette fenêtre comme certaines parties de ce livre le soulignent. De plus l’imagerie FLI (fluorescence lifetime imaging) permettra des techniques quantitatives robustes. En plus de la détection des tumeurs sub-millimétriques sur des profondeurs centimétriques, des mesures quantitatives fiables devraient ouvrir de nouveaux champs.


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0.0001

0.001

0.01

0.1

1

10

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Dens

ité op

tique

pour

1 cm

de tr

ajet

Longueur d'onde (nm)

>90% de photon absorbé sur un cm de trajet

>99% de photon absorbé sur un cm de trajet

moins de 2% de photon absorbé sur 10 centimètres de trajet

Spectre d’absorption de l’eau dans la fenêtre 200-2000 nm.

L’utilisation de mesures résolues en temps de la lumière diffusée par les

tissus est un atout supplémentaire pour l’extraction des informations pertinentes, a priori brouillées par les processus de diffusion. Les deux brevets que nous allons détailler proposent deux méthodes originales basées sur le suivi dans le temps de l'évolution de cette lumière diffuse. Le premier exploite la réponse impulsionnelle de la fonction de transfert de la transillumination, mesurée à l'aide d'une chaîne laser CPA et d'une caméra à balayage de fente, le second repose sur une méthode interférométrique pour la mesure résolue dans le temps de la réflectance.

La connaissance de la dynamique de propagation de la lumière dans les tissus, par l’utilisation de mesures résolues dans le temps, peut permettre d’améliorer la faisabilité des problèmes inverses. Ainsi, le comportement asymptotique de l’énergie diffuse aux temps longs est cette fois-ci directement reliée au coefficient d’absorption que l’on recherche. Si les couches supérieures peuvent modifier la valeur mesurée, le terme correctif est généralement plus petit et peut être plus facilement corrigé par une connaissance a priori du problème.

Concernant certaines applications spécifiques de localisation d’une hétérogénéïté (par exemple des tumeurs hyper-vascularisées), la résolution temporelle peut se révéler particulièrement précieuse. Le régime diffusif ne permet pas de repérer un objet en transillumination car la lumière diffuse a la possibilité de « contourner » l’objet. La sélection temporelle des trajectoires élimine certaines trajectoires de contournement. On peut ainsi augmenter à la fois la résolution spatiale, mais aussi et surtout le contraste.


Réflectométrie des milieux non limpides par résolution simultanée en temps et en longueur d’onde avec transillumination par un continuum à large spectre et détection par camera à balayage de fente

Ce brevet (PROCEDE ET DISPOSITIF DE SPECTROPHOTOMETRIE DIFFERENTIELLE DE MILIEUX NON LIMPIDES PAR IMAGERIE SPECTRO-TEMPORELLE EN MODE COMPTAGE, FR0209755 et WO2004013617, CNRS&UJM, S. Mottin) concerne un procédé de réflectance résolue en temps et en longueur d’onde pour analyser un milieu non limpide pouvant mettre en œuvre un seul tir laser. On éclaire le milieu non limpide par au moins une impulsion lumineuse à large spectre puis on acquiert à travers au moins un collecteur de lumière (ici avec une caméra à balayage de fente), à partir du milieu ainsi éclairé, au moins une image spectro-temporelle de transmission, sans balayage spectral, puis on traite cette image en tenant compte de sa nature statistique pour acquérir des informations sur le milieu non limpide.

Exemple d’un dispositif d’imagerie spectro-temporelle de transmittance.

L’ensemble spectrographe-camera à balayage de fente donne des images en fonction du temps de vol sur une fenêtre spectrale.

On connaît déjà diverses techniques de spectrophotométrie de milieux

limpides notamment les techniques développées dans les années quatre-vingts qui permettent de mesurer l'absorption sur l'ensemble d'un spectre, sans balayage, en particulier à l'aide de détecteurs comportant des barrettes de photodiodes. Ces techniques autorisent la spectrophotométrie différentielle et les analyses de mélanges de colorants en temps réel dans le cas des milieux limpides. Si le milieu est plus complexe et ne permet plus l’utilisation de l’équation des ondes, ces approches ne sont plus valides. Pour sonder ces milieux hétérogènes non limpides, il faut développer une instrumentation optique plus complexe où la résolution temporelle intervient.


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Les trois idées centrales de ce brevet sont : (i) d’ajouter la résolution du temps de vol à ces approches de mesure

spectrale sans balayage. L’image obtenue est une intensité (notée z) en fonction du temps et de la longueur d’onde : z=f(t,λ),

(ii) d’utiliser les dérivées partielles premières, secondes et n-ième des flux photoniques mesurés par rapport à la longueur d'onde et au temps (∂z/∂t, ∂z/∂λ, ∂2z/∂λ/∂t ...),

(iii) de quantifier l’intensité en nombre de photo-électron unique. Diverses techniques d’imagerie spectro-temporelle résolue en temps et

résolue en longueur d’onde notamment pour la fluorescence ont déjà été développées. L'imagerie spectro-temporelle de fluorescence avec des caméras à balayage de fente est bien connue [Watanabe, 1994]. Une telle imagerie donne accès à des distributions spectrales et temporelles qui sont spécifiques de l'analyse des temps de déclin de fluorescence à une ou plusieurs composantes. Cependant ces travaux du « two-dimensional single-photon counting » sont orientés vers la mesure de l’émission de lumière par fluorescence, ou en tout autre émission à une autre longueur d’onde que la source initiale mais jamais en transmittance. Il convient de noter que, dans le cadre de l'imagerie spectro-temporelle de transmittance des milieux non limpides, le mode de comptage de photo-électrons uniques ("single photo-electrons" ou SPE), est aussi puissant que pour l'imagerie spectro-temporelle de fluorescence car il permet de mesurer les flux photoniques non en unité arbitraire mais en unité de comptage d’évènement SPE. Ceci permet aussi une plus grande dynamique de mesure. Le mode de comptage est réalisé par binarisation de l’image par seuillage. Cette binarisation provoque la mise à zéro du bruit de la chaîne de détection. Cette opération non linéaire de seuillage autorise l’utilisation d’une fenêtre d’intégration sur un temps très long (pouvant dépasser plusieurs heures) et aussi d’éviter les problèmes de shading des caméras. Ce mode permet de compter des évènements rares liés aux photons non absorbés ayant séjourné un long moment dans le milieu d’étude. Ces photons « rescapés » portent une très forte valeur informative sur le volume sondé.

Outre le couplage entre un laser blanc impulsionnel et une caméra à balayage de fente à 1 kHz, la chimiométrie (identification des molécules et détermination des concentrations de celles-ci, ici dans des milieux optiquement complexes) repose sur les aspects mathématiques, probabilistes et statistiques de ce type d’imagerie (liés au comptage de SPE et l’utilisation des diverses dérivées partielles).

En final l'imagerie spectro-temporelle de transmittance, avec une source lumineuse impulsionnelle à large spectre et en mode comptage peut être définie comme la détermination optique de la fonction de Green généralisée


c’est-à-dire la fonction de transfert du milieu entre deux points d’un volume pour un temps donné et sur une large fenêtre de longueur d’onde.

Les images spectro-temporelles ci-dessous représentent un résultat

d’imagerie spectro-temporelle de transillumination crânienne chez le rat hairless Sprague-Dawley anesthésié avec l’isoflurane sous des conditions stéreotaxiques (Stoelting Co., USA). La distance entre la fibre “source” et la fibre “détection” est de 5 mm pour sonder le cortex moteur M2. Le traitement de ces données spectro-temporelles permet de mesurer les spectres des coefficients moyens de diffusion et d’absorption [Ramstein, 2004]. La littérature propose de nombreuses méthodes de détermination de ces coefficients optiques [Arridge,1992]. Nous avons opté pour un ajustement non-linéaire avec la fonction de Green qui prend en compte les conditions limites réfractives des milieux sondés avec une géométrie plane semi-infinie publiée par Kienle et Patterson [Kienle, 1997]. La fonction instrumentale (figure I-C) est convoluée avec cette fonction de Green dont on cherche à identifier les paramètres µa et µs‘. L’ajustement non-linéaire est alors réalisé avec la distribution des temps de vol (figure II-C).

Count II

Count I

Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)

Représentation d’une fonction instrumentale typique sans le milieu diffusant (figure I) et d’une image spectro-temporelle provenant de la transillumination crânienne

chez le rat anesthésié (figure II). Le niveau de gris sur l’axe Z correspond au nombre de photo-électrons comptés

pour chaque pixel. Les spectres sont indiqués sur les parties B. Les réponses temporelles (partie C) proviennent de la fenêtre spectrale 670-695 nm.


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Réflectométrie des milieux non limpides par résolution en temps avec modulation de la longueur d’onde d’une diode laser en cavité étendue

L’idée de base pour effectuer des mesures résolues dans le temps de la lumière diffuse consiste à envoyer une impulsion lumineuse très brève sur le milieu étudié, et mesurer la lumière diffuse à l’aide d’un détecteur très rapide comme dans le premier brevet exposé. Les lasers femtoseconde Ti-Sa ont été très utilisés car leur longueur d’onde d’émission réside au centre de la fenêtre thérapeutique. Il existe également maintenant des diodes laser impulsionnelles capables d’émettre des impulsions d’une cinquantaine de picosecondes pour une puissance moyenne de l’ordre de 1 mW. La détection, avec une résolution temporelle requise de l’ordre de quelques dizaines de picosecondes, est en elle-même un challenge. On pourra citer, de façon non exhaustive, les caméras à balayage de fentes ou les caméras intensifiées ultra-rapides, les photodiodes ultra-rapides, les portes optiques à effet non-linéaire ou les convertisseurs temps-amplitude. Sans entrer dans une étude comparative, ces différentes technologies sont d’une mise en œuvre délicate et d’un coût élevé.

Une méthode mathématiquement équivalente à la résolution temporelle consiste à se placer dans l’espace de Fourier, en utilisant une source lumineuse dont l’intensité est modulée. La connaissance de l’amplitude et de la phase de la composante modulée de la lumière diffuse est théoriquement équivalente à celle de son évolution temporelle. Cependant la modulation et la détection d’un signal à des fréquences de l’ordre de 1 GHz pose des problèmes technologiques qui ne sont pas très différents des problèmes soulevés précédemment. Par ailleurs, la composante modulée du signal devient vite très faible devant sa composante continue, ce qui pose des problèmes de dynamique.

Par rapport à ces technologies, ce brevet (METHOD FOR ANALYSING A DIFFUSING SAMPLE BY TIME RESOLUTION MEASUREMENT international patent WO0188507, november 22nd 2001 Université Paris 13, J.-M. Tualle) repose sur une méthode interférométrique alternative beaucoup moins onéreuse avec une détection par une simple photodiode et une électronique classique. Les méthodes interférométriques sont généralement utilisées en optique biomédicale pour éliminer la lumière diffuse (tomographie optique cohérente) et réaliser de l’imagerie sur des profondeurs de tissu pouvant atteindre le demi-millimètre. Ce brevet propose au contraire une méthode interférométrique pour résoudre dans le temps la lumière diffuse. Il s’agit pour cela d’utiliser une source de grande longueur de cohérence, mais dont la longueur d’onde est modulée de façon à simuler une source de cohérence plus faible [Tualle, 2001].

Si l’on considère par exemple un interféromètre à deux voies et que la longueur d’onde de la source varie linéairement sur un petit intervalle de


temps, le signal d’interférence observé va osciller, en fonction du temps, à une fréquence proportionnelle à la différence de marche entre les deux voies. Le spectre de ce signal donnera donc une porte temporelle, centrée sur cette différence de marche, et dont la largeur est directement reliée à l’intervalle spectral balayé. Pour exploiter au mieux la bande passante du système de balayage, un balayage sinusoïdal est plus adapté qu’un balayage linéaire. Le traitement du signal est alors légèrement différent, mais le principe reste le même. Lorsqu’un milieu diffusant est introduit dans l’un des bras de l’interféromètre, le spectre enregistré sur une demi-période de balayage, issu d’un interférogramme de speckle, aura « l’aspect d’un signal aléatoire ». Mais la moyenne des spectres enregistrés sur un grand nombre de configurations microscopiques correspond exactement à l’évolution temporelle de la lumière diffuse.

Diode laser

en cavité étendue Acousto-optique Isolateur optique Echantillon Coupleur fibré 50/50

Système de détection

Dispositif avec modulation de la longueur d’onde d’une diode laser

en cavité étendue. Le dispositif, présenté sur la figure ci-dessus, comporte un laser en cavité

entendue qui permet de balayer la longueur d’onde sur une trentaine de GHz à une fréquence de l’ordre de quelques centaines de Hertz. Pour faciliter les mesures, une partie du montage est réalisée avec des fibres optiques. Signalons enfin la présence indispensable d’un modulateur acousto-optique (fonctionnant dans l’ordre 0) qui permet de prendre


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alternativement des mesures avec et sans le signal, de façon à soustraire les contributions moyennes des différents bruits, ainsi surtout de tous les signaux parasites liés à la modulation en longueur d’onde.

Le principe du système est de faire une moyenne sur différentes configurations microscopiques du milieu étudié. Cette moyenne se fera naturellement sur un milieu liquide ou sur un tissu biologique, qui est naturellement en mouvement au niveau microscopique. Il faut cependant que l’acquisition d’un spectre, qui correspond à une demi-période de modulation, se fasse sur un temps suffisamment court pour que l’on puisse considérer le milieu comme immobile. Une fréquence de modulation de 300 Hz est actuellement utilisée, ce qui ne permet pas encore de travailler ni avec des suspensions de microsphères dans l’eau, ni avec des tissus biologiques. Les premières expériences de validation ont donc été réalisées avec une huile végétale, qui est un fluide plus visqueux et transparent dans l’infrarouge proche.

Les résultats présentés sur la figure ci-dessous ont été obtenus en réflectance sur une suspension d’alumine dans de l’huile d’olive avec une distance source-détecteur de 1 cm et en effectuant une moyenne sur environ 20000 spectres. Les mesures effectuées avec cette nouvelle méthode sont représentées avec un cercle sur la figure, tandis qu’est présenté en trait fin, le résultat obtenu dans les mêmes conditions avec un système comprenant un oscillateur Titane-Saphir et une caméra à balayage de fente synchroscan. Les mesures obtenues par ces deux systèmes sont en très bon accord.

0 500 1000 1500 2000 2500

0.01

0.1

1

time (ps)

Ref

lect

ance

(a.u

)

Comparaison entre la réflectance obtenue par caméra à balayage de fente

et par le dispositif avec modulation de la longueur d’onde d’une diode laser en cavité étendue.

Ces réflectances résolues en temps sont obtenues avec une suspension d’alumine dans de l’huile d’olive avec une distance source-détecteur de 1 cm.


Enfin il faut rappeler que le résultat de cette figure a été obtenu en utilisant une simple photodiode pour la détection. La taille du détecteur n’influe pas sur le signal du fait de la nature interférométrique du système. Par contre, on peut tout à fait envisager l’utilisation de détecteurs multiples, avec notamment une variante du procédé adaptée aux capteurs CCD ou CMOS.

Conclusion

Depuis 15 ans, nous sommes passés des premiers travaux de transillumination [Delpy, 1988] à une nouvelle phase d’imagerie fonctionnelle [Okada, 2003], [Taga, 2003], [Bluestone, 2004]. Les approches impulsionnelles sont plus coûteuses mais semblent plus robustes pour les validations cliniques. De nouvelles approches mettant en œuvre des modulations en longueur d’onde devraient permettre d’espérer une analyse plus fine des photons diffusifs avec des coûts très faibles.

D’autres voies notamment OCT et microscopies non-linéaires, devrait permettre de sonder avec d’excellentes résolutions spatiales des profondeurs de plus d’un millimètre de milieux diffusants comme les tissus nerveux corticaux.

Une des voies actuelles est aussi de situer les approches optiques dans le paysage des autres imageries fonctionnelles. Le couplage avec l’imagerie par résonance magnétique est une tendance forte qui devrait se confirmer.

Remerciements

Les auteurs souhaitent remercier Stéphane Ramstein, Pierre Laporte, Clementine Vignal, Nicolas Mathevon, Ha Lien Nghiem, Eric Tinet et Sigrid Avrillier.

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