8/2/2019 Isolation of 2,6-Dibromophenol From Marine Hemichrordate

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I s o l a t i o n o f 2 , 6 - D i b r o m o p h e n o lf r o m t h e M a r i n e H e m i c h o r d a t e ,B a l a n o g l o s s u s b i m i n i e n s i s

A b s t r a c t . 2 , 6 - D i b r o m o p h e n o l h a sb e e n i s o l a t e d f r o m a l u m i n o u s m a r i n ee n t e r o p n e u s t , B a l a n o g l o s s u s b i m i n i e n s i s ,f o u n d o n i n t e r t i d a l b e a c h a r e a s a tS a p e l o I s l a n d , G e o r g i a . T h i s c o m -p o u n d , r e s p o n s i b l e f o r t h e c h a r a c t e r i s -t i c " i o d o f o r m - l i k e " o d o r o f t h e s e a n i -m a l s , i s p r e s e n t i n r e l a t i v e l y l a r g ea m o u n t s ; t h e e s t i m a t e d q u a n t i t y p e ro r g a n i s m i s 1 0 t o 1 5 m i l l i g r a m s . I d e n -t i t y o f t h e i s o l a t e d s u b s t a n c e a s 2 , 6 -d i b r o m o p h e n o l i s b a s e d o n a n a l y s e s o fu l t r a v i o l e t , i n f r a r e d , a n d n u c l e a r m a g -n e t i c r e s o n a n c e s p e c t r a , m a s s s p e c t r o m -e t r y a n a l y s i s , a n d o n m e l t i n g - p o i n td a t a .

B a l a n o g l o s s u s b i m i n i e n s i s , common-l y r e f e r r e d t o a s a n a c o r n w o r m , i s am a r i n e h e m i c h o r d a t e w h i c h l i v e s i n t h ei n t e r t i d a l w a t e r s a l o n g t h e c o a s t o ft h e s o u t h e r n U n i t e d S t a t e s . T h i s o r g a n -i s m i s a b o u t 2 5 t o 3 0 c m i n l e n g t h ,o r a n g e - y e l l o w i n c o l o r , a n d p o s s e s s e s as t r o n g o d o r t h a t h a s b e e n c h a r a c t e r i z e da s " i o d o f o r m - l i k e " ( 1 ) . I n a d d i t i o n ,t h e o r g a n i s m p r o d u c e s a b r i l l i a n t b l u i s hl u m n i n e s c e n c e w h e n e x c i t e d m e c h a n i c a l -l y o r e l e c t r i c a l l y ( 1 ) . The r e q u i r e m e n t sf o r b i o l u m i n e s c e n c e a n d t h e m e c h a n i s m

1 . 00 . 9

0 . 8

0 . 7 -

~ 0 . 6 -z4

04C O .

o f t h e l i g h t r e a c t i o n h a v e b e e n d e -s c r i b e d ( 2 - 4 ) .We i s o l a t e d t h e o d o r - p r o d u c i n g c o m -p o u n d b e c a u s e i t o c c u r r e d i n r a t h e rl a r g e a m o u n t s a n d b e c a u s e i t m i g h tb e r e l a t e d t o l u c i f e r i n o r i t s o x i d i z e df o r m . A c t u a l l y , a n y r e l a t i o n s h i p o f t h ei s o l a t e d c o m p o u n d t o B a l a n o g l o s s i d 'l u c i f e r i n a p p e a r s d o u b t f u l . H o w e v e r ,t h e compound i s m o s t u n u s u a l b e c a u s eo f i t s b r o m i n a t e d c h a r a c t e r a n d t h el a r g e q u a n t i t i e s o c c u r r i n g i n t h e s e o r -g a n i s m s ( c a l c u l a t e d minimum c o n t e n t i s1 0 t o 1 5 m g o f c o m p o u n d p e r o r g a n -i s m ) .

B a l a n o g l o s s i d worms w e r e o b t a i n e db y d i g g i n g i n a r e a s m a r k e d b y c o n e - l i k es t r u c t u r e s f o u n d a t b u r r o w e n t r a n c e s o ft h e o r g a n i s m . When w h o l e worms w e r el y o p h i l i z e d , s m a l l a m o u n t s o f l u c i f e r i na c t i v i t y w e r e f o u n d i n t h e m e l t e d c o n -d e n s a t e ( f r o m t h e c o n e ) w h i c h a l s oc o n t a i n e d f a i r l y l a r g e q u a n t i t i e s o f t h ecompound r e s p o n s i b l e f o r t h e c h a r a c -t e r i s t i c o d o r o f t h e s e a n i m a l s .T h e B a l a n o g l o s s i d c o m p o u n d w a so b t a i n e d b y d i r e c t e x t r a c t i o n w i t hc h l o r o f o r m a t a c i d a n d a l k a l i n e p H ' sf r o m t h e c o n d e n s a t e o f t h e c o n e . I n i -t i a l l y , 1 0 0 m l o f t h i s c o n d e n s a t e w a sa d j u s t e d t o p H 1 0 w i t h IN NaOHa n d e x t r a c t e d w i t h 1 0 - m l p o r t i o n s o fc h l o r o f o r m . E f f i c i e n c y o f t h e e x t r a c t i o nw a s j u d g e d b y t h e a b s o r p t i o n o f t h e

220 240 260 280 30 0 32 0WAVELENGTH ( m , )

F i g . 1 . E f f e c t o f p H on t h e u l t r a v i o l e t - a b s o r p t i o n s p e c t r a of t h e B a l a n o g l o s s i d com-p o u n d . C o n c e n t r a t i o n s w e r e 0 . 3 3 , u m o l e / m l a t p H 3 . 0 a n d 5 . 6 , a n d 0 . 1 6 5 , m o l e / m la t p H 9 . 5 .1 5 5 8

c h l o r o f o r m s o l u t i o n a t 3 0 5 m , u . F o u rs u c c e s s i v e 1 0 - m l e x t r a c t i o n s u s u a l l yb r o u g h t t h e a b s o r p t i o n a t 3 0 5 m / M t or e a d i n g s o f l e s s t h a n 0 . 1 u n i t .T h e p H o f t h e a q u e o u s p h a s e w a st h e n a d j u s t e d t o p H 3 w i t h IN H C I ,a n d t h e e x t r a c t i o n w i t h 1 0 - m l p o r t i o n so f c h l o r o f o r m w a s r e p e a t e d . A g a i n ,f o u r s u c c e s s i v e 1 0 - m l e x t r a c t i o n s w e r es u f f i c i e n t t o c o m p l e t e t h e e x t r a c t i o n .E f f i c i e n c y o f e x t r a c t i o n i n t h e a c i ds y s t e m w a s f o l t o w e d b y m o n i t o r i n g u l -t r a v i o l e t a b s o r p t i o n a t 2 8 0 m i u i n aM o d e l 1 4 C a r y r e c o r d i n g s p e c t r o p h o -t o m e t e r . E x a m i n a t i o n o f t h e a q u e o u sp h a s e a f t e r t h e f i n a l e x t r a c t i o n s h o w e dt h a t e s s e n t i a l l y a l l u l t r a v i o l e t - a b s o r b i n gm a t e r i a l h a d b e e n e x t r a c t e d .E x t r a c t s f r o m t h e a c i d a n d a l k a l i n es y s t e m s w e r e t h e n p o o l e d i n s e p a r a t ec o n t a i n e r s a n d e v a p o r a t e d w i t h a g e n t l es t r e a m o f a i r . C r y s t a l l i n e m a t e r i a l s e p -a r a t e d f r o m t h e p o o l e d e v a p o r a t e d a c i de x t r a c t w h i c h h a d a s t r o n g o d o r r e m i -n i s c e n t o f i o d o f o r m . T h e a l k a l i n e - e x -t r a c t e d m a t e r i a l p o s s e s s e d o n l y a f a i n to d o r a n d w a s n o t f u r t h e r e x a m i n e d .Q u a l i t a t i v e t e s t s o n t h e i s o l a t e d com-p o u n d w i t h n i t r o u s a c i d a n d b r o m i n ew a t e r i n d i c a t e d t h a t t h e c o m p o u n dw a s a p h e n o l . An i n i t i a l m e l t i n g p o i n t( u n c o r r e c t e d ) w a s 5 0 0 t o 5 1 C . Du e t ot h e f a c t t h a t t h e c o m p o u n d was v o l a -t i l e , i t c o u l d b e p u r i f i e d b y s u b l i m a t i o ni n a v a c u u m . A c c o r d i n g l y , t h e c r y s t a l so b t a i n e d f r o m t h e c h l o r o f o r m e x t r a c tw e r e d i s s o l v e d a g a i n i n a s m a l l v o l u m eo f c h l o r o f o r m a n d q u a n t i t a t i v e l y t r a n s -f e r r e d t o a s u b l i m a t i o n t u b e o f t h et y p e d e s c r i b e d b y M i l l s ( 5 ) , e x c e p tt h a t t h e i n n e r a n d o u t e r t u b e s w e r e o fc o n i c a l - t i p d e s i g n . A f t e r t h e c h l o r o f o r mw a s g e n t l y e v a p o r a t e d , t h e c o m p o u n ds u b l i m e d o n t o t h e c o l d f i n g e r o f t h ea p p a r a t u s . I t w a s t h e n r e m o v e d f r o mt h e c o l d - f i n g e r t i p b y s m a l l a m o u n t so f c h l o r o f o r m a p p l i e d w i t h a n e y ed r o p p e r , a n d t h e s o l u t i o n w a s t r a n s -f e r r e d t o a s m a l l t e s t t u b e . A f t e r e v a p -o r a t i o n o f t h e c h l o r o f o r m , w h i t en e e d l e - l i k e c r y s t a l s w i t h a v e r y p o w e r -f u l o d o r , n o w s o m e w h a t r e m i n i s c e n to f c r e s o l , w e r e o b t a i n e d .U l t r a v i o l e t s p e c t r a o f t h e c o m p o u n dw e r e o b t a i n e d w i t h a C o l e m a n - H i t a c h is p e c t r o p h o t o m e t e r , M o d e l E P S - 3 T . T w om o l e c u l a r s p e c i e s w e r e f o u n d ( F i g . 1 ) .A t p H v a l u e s b e l o w 4 , o n l y t h e a c i df o r m w a s s e e n w i t h t w o p e a k s a t 2 7 9a n d 2 8 6 m i u , w i t h e s t i m a t e d m o l a ra b s o r p t i v i t i e s o f 2 1 8 4 a n d 2 1 3 5 , r e -s p e c t i v e l y . Fr o m p H 4 t o a b o u t 5 . 8 at r a n s i t i o n a l f o r m w a s e v i d e n t , h a v i n gm a x i m a a t 2 7 9 , 2 8 6 , a n d 3 0 5 m i u . B e -t w e e n p H 4 a n d 7 , t h e maximum a t

SCIENCE, VOL. 1 5 5

8/2/2019 Isolation of 2,6-Dibromophenol From Marine Hemichrordate

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WAVENUMBER C M'F i g . 2 . C o m p a r i s o n o f t h e i n f r a r e d s p e c t r a o f t h e B a l a n o g l o s s i d compound (A) t ot h a t o f 2 , 6 - d i b r o m o p h e n o l ( B ) . C o n c e n t r a t i o n s w e r e 1 . 2 p e r c e n t i n C H C L I i n each c a s e .2 7 9 m , u d i s a p p e a r e d e n t i r e l y , t h e m a x i -mum a t 286 m / A d i m i n i s h i n g more s l o w -l y . T h i s ma x i m u m was a l m o s t o b l i t e r -a t e d b y t h e t i m e p H 7 . 2 was r e a c h e d .Th e maximum a t 30 5 m , u i n c r e a s e ds l o w l y o ve r t h e range o f p H 3 t o 5 . 6 .B e t w e e n p H 5 . 6 and 6 . 2 t h e r e was am a r k e d i n c r e a s e i n a b s o r p t i o n a t 3 0 5m , u , t h e m o l a r a b s o r p t i v i t y f o r t h i s p e a ka p p r o x i m a t e l y d o u b l i n g . At p H 7 . 5 t h emaxima a t 2 7 9 a n d 2 8 6 m , u w e r e com-p l e t e l y o b l i t e r a t e d , a n d o n l y a s p e c i e sh a v i n g an a b s o r p t i o n a t 305 m , u wase v i d e n t . E s t i m a t e d molar a b s o r p t i v i t yf o r t h i s f orm was 5 0 4 0 . T h i s b a t h o -c h r o m i c s h i f t i s t y p i c a l o f p h e n o l s .V W h e n c h a n g e s i n a b s o r p t i o n a t 305mMu w e r e p l o t t e d a g a i n s t p H , t h e p Ko f t h e compound was e s t i m a t e d t o b ea t p H 6 . 2 . Th e d i - o r t h o p o s i t i o n s o ft h e b r o m i n e - a t o m s ar e u n d o u b t e d l y

t h e reason f o r t h e s t r o n g a c i d i t y . U l t r a -v i o l e t - a b s o r p t i o n s p e c t r a f o r t h e c o m -p o u n d f r o m B a l a n o g l o s s u s a n d t h e a u -t h e n t i c 2 , 6 - d i b r o m o p h e n o l w e r e i d e n t i -c a l i n every r e s p e c t .Th e i n f r a r e d a n d n u c l e a r m a g n e t i cr e s o nanc e s p e c t r a o b t a i n e d f o r t h eB a l a n o g l o s s i d compound a n d 2 , 6 - d i -b r o m o p h e n o l w e r e i d e n t i c a l a n d s u p e r -i m p o s a b l e ( F i g s . 2 a n d 3 ) . Mass s p e c -t r a l a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e com-p o u n d h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 5 2a n d a f r a g m e n t a t i o n p a t t e r n t y p i c a lo f d i b r o m o p h e n o l . F o r e x a m p l e , t h em o l e c u l a r i o n s 2 5 0 , 2 5 2 , a n d 2 5 4 w e r ei n t h e c o r r e c t d i s t r i b u t i o n f o r t w o b r o -m i n e a t o m s .A c o m p a r i s o n o f m e l t i n g p o i n t s f o rd i b r o m i n a t e d p h e n o l s r u l e d o u t a l l d i -b r o m o p h e n o l s e x c e p t t h e 2 , 6 - s u b s t i -t u t e d c o m p o u n d . A m e l t i n g p o i n t h i g h -

e r t h a n 5 2 C ( u n c o r r e c t e d ) c o u l d n o tb e o b t a i n e d e i t h e r f o r t h e c o m p o u n di s o l a t e d f r o m B a l a n o g l o s s u s o r f o r au -t h e n t i c 2 , 6 - d i b r o m o p h e n o l ( 6 ) p u r i f i e db y s u b l i m a t i o n a n d r e c r y s t a l l i z e d f r o mw a t e r . H o w e v e r , t h e t w o m e l t i n g p o i n t sw e r e w i t h i n 1 C o f e a c h o t h e r , a n d am i x e d m e l t i n g p o i n t was 5 1 0 t o 5 2 C .B o t h c o m p o u n d s w e r e e x t r e m e l y v o l a -t i l e a n d s u b l i m e d r e a d i l y . T h e s e d a t al e a v e no d o u b t t h a t t h e B a l a n o g l o s s i dc o m p o u n d i s 2 , 6 - d i b r o m o p h e n o l .The p r e s e n c e o f l a r g e amounts o f2 , 6 - d i b r o m o p h e n o l i n a l i v i n g o r g a n i s mi s h a r d t o u n d e r s t a n d i n v i e w o f t h eg e n e r a l t o x i c i t y o f s u c h c o m p o u n d s .F o r e x a m p l e , t h e r e l a t e d c h l o r i n a t e dp h e n o l s ar e w e l l known f o r t h e i r p o -t e n c y as d i s i n f e c t a n t s . U n l e s s B a l a n o -g l o s s i d s m u s t c o n t i n u o u s l y s u r r o u n dt h e m s e l v e s w i t h a d i s i n f e c t a n t f o r t h e i rown s u r v i v a l , i t i s d i f f i c u l t t o i m a g i n et h e f u n c t i o n t h a t 2 , 6 - d i b r o m o p h e n o lserves i n t h e s e a n i m a l s .

N o t h i n g i s k n o w n a b o u t t h e b i o -s y n t h e s i s o f t h i s c o m p o u n d i n B a l a n o -g l o s s i d s . H o w e v e r , t h e l u c i f e r a w e o ft h e s e o r g a n i s m s may p l a y a r o l e h e r ei n v i e w o f t h e f a c t t h a t l u c i f e r a s e i s ap e r o x i d a s e ( 3 ) a n d t h a t p e r o x i d a s e st h a t c a t a l y z e t h e b r o m i n a t i o n o f p h e -n o l s h a v e b e e n i s o l a t e d ( 7 ) . B r o m i n a t e dc o m p o u n d s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o mn a t u r e o n l y i n rare i n s t a n c e s , s u c h ast h e i s o l a t i o n b y M o r n e r ( 8 ) o f d i b r o -m o t y r o s i n e f r o m tw o s p e c i e s o f c o r a la n d t h a t o f some b r o m i n a t e d com-p o u n d s o f i l l - d e f i n e d s t r u c t u r e f r o ms e v e r a l s p e c i e s o f r e d a l g a e ( 9 ) .RAYMOND B . ASHWORTHMILTON J . C O R M I E RD e p a r t m e n t o f B i o c h e m - i s t r y ,U n i v e r s i t y o f G e o r g i a , A t h e n s 3 0 6 0 1

80 7 . 0 P P M A ( M 6 . 0 50F i g . 3 . C o m p a r i s o n o f t h e n u c l e a r m a g n e t i c r e s onance s p e c t r a o f t h e B a l a n o g l o s r i dcompound ( A ) t o t h a t o f 2 , 6 - d i b r o m o p h e n o l ( B ) . A 3 0 - m g s a m p l e d i s s o l v e d i n C D C h 5was u s e d i n e a c h c a s e . T h e s m a l l p e a k w h e r e a i s a b o u t 7 . 2 i s d u e t o t r a c e s o f C H C 1 6i n t h e C D C l a .2 4 MARCH 1 9 6 ?

R e f e r e n c e s and N o t e s1 . E . N . H a r v e y , B i o l u m i n e s c e n c e ( A c a d e m i cP r e s s , N e w Y o r k , 1 9 5 2 ) , pp . 2 0 2 - 2 0 5 .2 . M. J . C o r m i e r a n d L . S . D u r e , J . B l o l . ChenL2 3 8 , 7 8 5 ( 1 9 6 3 ) .3 . L . S . Dure a n d M. J . C o r m i e r , i b i d . , p . 7 9 0 .4 . , i b i d . 2 3 9 , 2 3 5 1 ( 1 9 6 4 ) ; M. J . C o r m i e r ,P . K r e i s s , P . M. P r i c h a r d , i n B i o l u m n e s c e i n c e

i n P r o g r e s s , F . H . J o h n s o n a n d Y . H a n e d a ,E d s . ( P r i n c e t o n U n i v . P r e s s , P r i n c e t o n , N . J . ,1 9 6 6 ) , p. 3 6 3 .5 . G . L . M i l l s , B i o c h e m . J. 5 0 , 7 0 7 ( 1 9 5 2 ) .6 . O b t a i n e d f r o m E a s t m a n C h e m i c a l C o .7 . L . P . H a g e r , D . R . M o r r i s , F . S . B r o w n , H .E b e r w e i n , J . B i o l . Chem. 2 4 1 , 1 7 6 9 ( 1 9 6 6 ) .8. C . T . M o r n e r , Z . P h y s i o l . Chem. 8 8 , 1 3 8( 1 9 1 3 ) .9 . M. P e g u y , i n C o m p t e s Rendus du IV6 C o n -g r e s I n t e r n a t i o n a l d e s A l g u e s M a r i n e s , A . D.V i r v i l l e a n d J . F e l d m a n n , E d s . ( M a c m i l l a n ,N e w Y o r k , 1 9 6 4 ) , p . 3 6 6 .1 0 . S u p p o r t e d i n p a r t b y N S F a n d AEC. M . J . C .h o l d s career d e v e l o p m e n t a w a r d 1 - K 3 - G M -3 3 3 1 - 0 1 . We t h a n k D r . M. G r o s t i c o f t h eU p j o h n Company f o r p e r f o r m i n g t h e masss p e c t r o m e t r y a n a l y s i s , a n d D r . L . K e i t h o ft h e S o u t h e a s t W a t e r R e s e a r c h L a b o r a t o r y ,A t h e n s , G e o r g i a , f o r t h e n u c l e a r m a g n e t i creso nanc e a n a l y s i s . C o n t r i b u t i o n 1 2 4 from

t h e U n i v e r s i t y o f G e o r g i a M a r i n e I n s t i t u t e ,S a p e l o I s l a n d , G e o r g i a .1 3 F e b r u a r y 1 9 6 7

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