jurnal kreatinin

8/20/2019 JURNAL KREATININ

1/8

J urnal MI PA 35(2): 157-164 (2012)

J urnal M IPAhttp:/ / journal.unnes.ac.id/ sju/ index.php/ jm

©2012UniversitasNegeri Semarang

ISSN NO 0215-9945

Abstract

SEQUENTI AL INJECTI ON-FLOW REVERSAL M IX ING (SI-FRM) UNTUK PENENTUAN KREATININ DALAM URIN

A Sabarudin , ERN Wulandari, H Sulistyarti

J urusan K imia, Fakultas M IPA, Universitas Brawijaya, IndonesiaLaboratoriumK imiaAnalitik, FM IPA, Universitas Brawijaya, J l. Veteran 65145, Malang

Sejarah Artikel:Diterima 28 J uli 2012

Disetujui 30Agustus2012Dipublikasikan Oktober 2012

J umlah kreatinin yang diekskresikan melalui urin menunjukkan keadaan ginjal seseorang.Dalam penelitian ini, dikembangkan metode untuk penentuan kreatinin secara otomatisyaitu sequential

inj ection-flow reversal mixi ng (SI-FRM ). Pendeteksian kreatinin didasarkan

pada pembentukan senyawa berwarna (merah-orange) yang dihasilkan dari reaksi antarakreatinin dan asampikratdalamsuasana basadan diukur padapanjanggelombang530 nm.Reaksi pembentukan senyawa kreatinin-pikrat dilakukan melalui pembentukan segmenantara sampel dan reagen di-holding coil dan selanjutnya dilakukan proses flow reversal di- mixing coil . Parameter-parameter yang mempengaruhi metode ini diuji secara detail. Hasilpenelitian menunjukkan bahwa kondisi optimum pengukuran kreatinin yaitu menggunakankonsentrasi asampikrat 0,035 M dan NaOH 3,5%, laju alir fl ow reversal 5 µL/ detik, laju alirproduk reaksi 20 µL/ detik, jumlah f low reversal empat kali dan menggunakan tiga segmen(pikrat-kreatinin-pikrat) dengan masing-masing volume segmen 100 µL. Metode SI -FRMini telah diaplikasikan langsung untuk penentuan kadar kreatinin dalam urin dengan limitdeteksi 1,7 µg/ g.

Alamat korespondensi:E-mail: [email protected]

Keywords:

creatinine

flow reversal mixing

sequential injection

urine

T he amount of creatinine excreted in urine indicates kidney conditi on. I n this experiment, the

automatic determinati on method of determini ng creatini ne was developed by using sequential in jection-flow r eversal mixi ng (SI-FR M ). T he detecti on of creatini ne is based on t he formati on of a

colored product (red-orange) yielded from t he reacti on of creatin in e wit h picrate at alkali ne medium.

T he absorbancei s measured at wavelength of 530 nm. T he formation of creatini ne-picratecomplex is

performed through the segment formation between sample and reagent in the holdi ng coil and then

fl ow reversal process in the mixi ng coil of SI-FR M . Several parameters affecti ng t o thi s method are

investigated i n detail. The results show that the optimum concentrations of picric acid and NaOH are

0.035 M and 3.5%, respecti vely. Other optimi zed condit ions, such as the fl ow reversal rate of there 5

µL / s, fl ow rat e of product of 20 µL / s, amount of fl ow reversal process of four t imes, and segment

amount of three(pi crate-creatin ine -picrate) wi th each volume of 100 µL , wereobtained. T his method

is successfull y applied to the determi nation of creatin ine in u ri ne wi th the detecti on limi t of 1.7 µg/ g.


2/8

Pendahuluan

K reatinin adalah produk akhir darimetabolisme kreatin yang dikeluarkan melaluiginjal. Konsentrasi kreatinin yang terkandung di

dalam urin merupakan petunjuk pentingterhadap kerusakan ginjal, diabeti c nephropathy dan laju filtrasi glomerular ginjal (Khan &Wernet 1997). K reatinin dibentuk oleh tubuhdari pemecahan senyawa kreatin danfosfokreatin dimana jumlah kreatinin sekitar 2%dari total keratin (Garcia & Henry 2004).

Penentuan kreatinin dapat dilakukandengan menggunakan enzim kreatinindeiminase untuk mengkonversi kreatininmenjadi amonia dan 1-methylhydantoin .Selanjutnya amonia di reaksikan dengan cresol

red (2-{4-{2-

hydroxyethyl )-1-

piperzinyl }

ethanesulfonic acid ) dan dideteksi secaraspektrometri pada panjang gelombang 555 nm(Yoshiwara et al . 2005). Metode enzimatis inimemberikan hasil yang selektif walaupunmemerlukan waktu analisis yang lama, dansensitivitasnya kurang baik karena kreatinindideteksi secara tidak langsung berdasarkan jumlah amonia yang terbentuk. Di samping itu juga, konsentrasi bilirubin yang tinggi dalamsampel merupakan masalah tersendiri dalammetodeenzimatis.

Penentuan kreatinin dalam urine danserum menggunakan kromatografi kinerja tinggi(KCK T) telah diteliti oleh Harmoinen et al .(1991) dan Tsai dan Syu (2005). Dalam metodeini kolom penukar kation (LichroCA RT®RP-18column) digunakan untuk memisahkankreatinin dari senyawa lainnya dalam isocratic buffer system . K reatinin dideteksi secaraspektrofotometri pada 234 nm. Pada umumnyametode KCK T memerlukan compli cated assay system dalam pelaksanaannya. Hal yang sama juga dilakukan oleh J ohns et al . (2001) yangmengembangkan metode isokratik KCK T

menggunakan kolom si li ca-based strong cation- exchange (CS103-10 SynChropak) dan matrik 5mM litium asetat pada pH 4.9. Pada metodeini, preparasi sampel melalui serangkaianperlakuan yang rumit yaitu deproteinasi denganasetonitril, evaporasi, dan pelarutan kembalidalam fase gerak yang diikuti dengan kuantisasimenggunakan deteksi UV pada 234 nm. M etodeelektrokimia juga dapat digunakan untukmendeteksi kreatinin. M isalnya amperometribiosensor yang didasarkan pada metodeenzimatis. Metode ini mencakup tiga tahapan

proses yaitu konversi kreatinin menjadi kreatin,

kreatin menjadi sarcosine, sarcosine menjadiglycine dan H2O2. Peroksida yang terbentukinilah yang kemudian dijadikan acuan untukmenentukan kreatinin secara elektrokimia. Tigatahapan proses konversi di atas menunjukkan

kekomplekan dan sensitivitas yang rendahuntuk sistem amperometri (Stefan et al . 2003).

Reaksi J affe merupakan metode yangpalingpopuler untuk penentuan kreatinin dalamurin dan serum. Dalam metode ini, kreatinindireaksikan dengan asam pikrat pada suasanabasa yang membentuk senyawa berwarnamerah-orange dan dideteksi secaraspektofotometri pada panjang gelombang 490-520 nm (Staden 1983). Keuntungan reaksi Jaffeyaitu sederhana dan mudah. Namun karenadilakukan dengan metode batch , maka jumlah

sampel dan reagen yang digunakan sangatbanyak sehingga pembentukan senyawakreatinin-pikrat memerlukan waktu yang cukuplama yaitu sekitar 30 menit. Selain itu,kontaminasi yang besar dari lingkungan dapatterjadi pada metodebatch sehingga memerlukanpengontrolan yang ketat. Metode ini memilikisensitivitas yang rendah dengan limit deteksisebesar 0,2 M (Faria & Pasquini 1992). Untukmengatasi hal ini, dapat digunakan metode on- line dan otomatis yaitu sequential injection analysis (SIA). Sistem ini dikontrol dengan komputerdan biasanya terdiri dari

syri nge pump, holding coil , katup multiposisi, dan detektor. Semuakomponen tersebut dihubungkan satu sama lainmenggunakan pipa kapiler PT FE. Operasionalsistem ini diawali dengan pembentukan segmen-segmen antara reagen dan sampel di holding coil yang selanjutnya didispensikan menuju sel alir(flow cell ) detektor. SIA ini hanya memerlukan jumlah reagen yang sangat sedikit, analisissecara cepat dan otomatis, serta menghasilkanlimbah yang jumlahnya sedikit sehingga analisismenggunakan metode ini akan menghematpemakaian reagen dan lebih bersahabat dengan

lingkungan (Ruzicka & Marshall 1990). Akantetapi, pembentukan segmen di holding coil mengurangi keefektifan/ kesempurnaan reaksiantara sampel dan reagen yang mengakibatkansensitivitas yangrendah.

Atas dasar hal tersebut di atas, makadalam penelitian ini dikembangkan suatu sistemyang disebut dengan Sequenti al I njecti on-Flow Reversal M ixing (SI-FRM). Sistem inimerupakan modifikasi dari SIA denganmenempatkan mixi ng coil pada katup multiposisi(multiposition valve/ selection valve ) sebagai tempat

berlangsungnya flow reversal . Segmen-segmen


3/8

antara reagen dan sampel di holding coil akandialirkan secara berulang-ulang menuju mixing coil secara otomatis (fl ow reversal ) sehinggadiperoleh hasil reaksi yang sempurna danmemberikan sensitivitas yang tinggi ketika

dialirkan menuju detektor. Beberapa parameteryang mempengaruhi metode ini dilakukanoptimisasi yang mencakup konsentrasi asampikrat dan N aOH, laju alir flow reversal , laju alirproduk reaksi ke detektor, jumlah flow reversal ,volume dan jumlah segmen di holding coil .Untuk keseluruhan proses, kreatinin dapatdideteksi dalam waktu 5 menit secara on-line dan otomatis dengan hanya membutuhkan200 L reagen dan 100L sampel.

M etode

Alat-alat yang digunakan dalampenelitian ini antara lain neraca analitis Mettler,pipet mikro 1 mL dan 5 mL (Eppendorf ),L aboratory-made SI-FRM system yang terdiri darisyringe pump (SP; Hamilton, Reno, Nevada,USA) dengan volume 2,5 mL, delapan katupselecti on valve (SV; Hamilton, Reno, Nevada,USA), mixing coil (PTFE tubing, 1.0 mm i.d x 1m) dan detektor kolorimeter Red-Green-Blue Light-Emitting Diode (RGB-LED) yangseluruhnya dikontrol melalui komputermenggunakan home-made software berbasis Visual Basic Program . Semua pipa kapiler yangdigunakan terbuat dari PTFE dengan inner diameter (i.d) 0.75mm, kecuali untuk holding coil (1.8 mm i.d). SI-FRM sistem ini sebenarnyamerupakan modifikasi dari sistem yang telahdibuat oleh penulis dalam penelitiansebelumnya (Sabarudin et al. 2006 & 2007).Adapun portable kolorimeter RGB-LED dibuat

laboratorium berdasarkan penelitian yangdilakukan oleh Suzuki et al. (2004& 2005).

Bahan-bahan yang digunakan dalampenelitian ini merupakan bahan kimia proanalisis (p.a) antara lain natrium hidroksida,

asam pikrat, kreatinin, kreatin (Sigma-Aldrich, Jerman), kecuali urin dan akuades.

Prosedur operasional SI-FRM untukpenentuan kreatinin secara on-line dan otomatisditunjukkan padaGambar 1.

Tahap pertama adalah pencucian pipakapiler (line ) dan detector . Sebelum SI-FRMdigunakan untuk penentuan kreatinin, makasemua line dan flow cell detector harus dicuciterlebih dahulu dengan akuades dengan carasebagai berikut: syringe pump (SP) berada padaposisi in dan mengambil 2500 uL akuadesdengan laju alir 200 uL / detik. Selanjutnya SPdiubah ke posisi out untuk mengalirkan akuadesmenuju holding coil (HC) dan selection valve (SV)pada semua line yang digunakan (port 3, 4, dan7) dengan volume masing-masing 500 uL danlaju alir 50 uL/ detik. Sisa akuades dialirkanmenuju detektor pada port 2 dengan laju alir 30uL/ detik.

Tahap kedua adalah tahap pengisian line .Pada tahap ini dilakukan pengaliran larutansampel kreatinin dan reagen yang berupacampuran asam pikrat dengan NaOH ke dalamline dengan cara SP berada pada posisi out danmengambil 500 uL kreatinin dengan laju alir 50uL/ detik untuk mengisi line pada port 3,selanjutnya SP mengambil 500 uL reagen(pikrat-NaOH) dengan kecepatan 50 uL/ detikuntuk mengisi line pada port 4. Kelebihanlarutan kreatinin dan reagen yang terdapat diHC dibuang melalui port 7 dengan caramendorongnyamenggunakan akuades.

Gambar 1. Skema SI-FRM untuk penentuan kreatinin


4/8

Tahap ketiga adalah tahap pendeteksiankreatinin. Dalam tahap ini, SP berada padaposisi out dan mengambil 100 uL reagen(campuran asam pikrat dengan NaOH) untukdialirkan menuju HC melalui SL port 4 dengan

laju alir 50 uL / detik, kemudian SP mengambillagi 100 uL larutan sampel (kreatinin/ urin)untuk dialirkan menuju HC melalui SL port 3dengan laju alir 100 uL/ detik. Reagen diambillagi melalui port 4 dengan jumlah yang samadengan sebelumnya sehingga pada HC akanterbentuk tiga segmen yaitu reagen-sampel-reagen. Selanjutnya segmen larutan tersebutdialirkan menuju SL port 1 yang terdapat mixing coil (MC) untuk dilakukan proses fl ow reversal (segmen bergerak maju-mundur dari HC ke M Csebanyak 4 kali ulangan). Setelah semua reagen

tercampur maka produk yang dihasilkandideteksi secara on-line dengan menggunakankolorimeter RGB-LED dengan caramengalirkannya melalui SL port 2 dan akanterdeteksi grafik (flow signal ) yang memberikaninformasi absorbansi kreatinin-pikrat.

Prosedur yang sama juga dilakukanuntuk pengujian parameter-parameter yangmeliputi variasi laju alir f low reversal , laju aliroptimum produk ke detektor, banyaknyapengulangan f low reversal , volume dan jumlah

segmen optimum, dan konsentrasi N aOH .

Hasil dan Pembahasan

Optimasi Parameter K imiaParameter kimia yang dioptimasi pada

penelitian ini adalah konsentrasi asam pikratdan konsentrasi NaOH.

Dari Gambar 2 diketahui bahwa denganmeningkatnya konsentrasi asam pikrat makaabsorbansi senyawa kreatinin-pikrat yangterukur juga meningkat, dan mencapai

optimum pada konsentrasi asam pikrat0,035 M. Absorbansi cenderung menurunketika konsentrasi asam pikrat di atas 0,035 Mkarena pembentukan endapan natrium-pikrat.Endapan ini terjadi karena kelebihan dari

Gambar 2. Grafik hubunganantara konsentrasi asampikrat denganabsorbansi kreatinin-pikrat.Kondisi: konsentrasi kreatinin 50 ug/ g, konsentrasi NaOH 1 %, laju alir flow reversal 5 uL/ detik,laju alir produk kedetektor 20 uL/ detik, jumlah flow reversal 4 kali, tigasegmen (reagen-sampel-reagen) masing-masing 100uL.

Gambar 3. Grafik hubungan antara konsentrasi N aOH dengan absorbansi kreatinin-pikrat.Kondisi: konsentrasi asam pikrat 0,03M, kondisi yanglain sama seperti padaGambar 2.


5/8


6/8

terbentuk dengan baik sehingga absorbansi yangterbaca akan menjadi rendah. Sedangkan untukvariasi jumlah f low reversal yang lebih banyakakan menyebabkan absorbansi yang terukur juga rendah karena terjadi dispersi senyawa

kreatinin-pikrat yang terbentuk ke dalam carrier yang ada pada saluran pereaksi (pipa kapiler)dalam alat SI-FRM .

J umlah segmen optimum yaitu tigasegmen. Segmen ini terdiri atas reagen-sampel- reagen . Volume segmen optimum akanmemberikan nilai absorbansi yang paling tinggi

yaitu 100 µL. Dengan adanya penggunaanvolume yang lebih besar dari kondisi optimummaka senyawa kreatinin-pikrat belum terbentukkarena waktu kontak antara sampel dan reagentetap sehingga absorbansi yang diperoleh akan

menjadi kecil. Sedangkan pada penggunaanvolume yang lebih kecil menyebabkanabsorbansi juga kecil karena jumlah sampel danreagen yang kontak untuk membentuk senyawakreatinin-pikrat semakin sedikit jumlahnya.Hasil optimasi parameter kimia dan fisikdirangkumdalamTabel 1.

Tabel 1. Optimasi parameter penentuan kreatinin menggunakan SI-FRM

Tabel 1. Hasil pengukuran kreatinin dalam sampel urin

Perbandingan Deteksi Kreatinin dengan dan Tanpa Flow Reversal

M etode yang digunakan untukmendeteksi kreatinin dalam penelitian ini yaitusequential injection analysis yang dilengkapi

dengan menggunakan proses fl ow reversal (SI-FRM ). Proses ini dimaksudkan untukmembantu penyempurnaan reaksi pembentukansenyawa kreatinin-pikrat sehingga absorbansiyang terbaca oleh detektor menghasilkan satupuncak yang paling tinggi (maksimum). Denganadanya satu puncak tertinggi maka hasilpengukuran menjadi lebih akurat. Flow signal yang diperoleh tanpa menggunakan proses flow reversal ditunjukkan oleh Gambar 5 (A)sedangkan yang melalui proses flow reversal ditunjukkan oleh Gambar 5 (B).

Dari Gambar 5 dapat diketahui bahwa

dengan tidak dilakukannya proses flow reversal maka puncak yang dihasilkan banyak sehinggamenyulitkan pengambilan nilai optimum dariabsorbansi kreatinin tersebut. Hal inidikarenakan tidak terbentuknya senyawakreatinin-pikrat secara sempurna karena segmenantara sampel dan reagen tidak bercampur ataubereaksi dengan baik yang dapat dilihat dariterbentukanya carrier yang banyak. Jadi dapatdikatakan bahwa proses flow reversal (Gambar 5B) menguntungkan apabila dilakukan karenamembantu proses penyempurnaan reaksipembentukan senyawa kreatinin-pikrat sehinggahasil absorbansi yang diperoleh menghasilkanpola yang teratur dengan satu puncak sajawalaupun waktuanalisis menjadi lebih lama.

K urva K alibrasi KreatininKurva kalibrasi dibuat dengan cara

mengukur variasi konsentrasi kreatinin


7/8


8/8

dengan akurasi dan ketelitian yang tinggi.Metode ini juga memiliki sensitivitas yang baikdengan LOD sebesar 1,7 5,69 µg/ g serta waktuanalisis yangrelatif cepat yaitu 5 menit/ sampel.

Daftar Pustaka

Faria LC & Pasquini C. 1992. Spectrophotometricdetermination of creatinine bymonosegmented continuous-flow analysis. J Autom Chem 14: 97-100.

Garcia CD & Henry CS. 2004. Direct detection of renal function markers using microchip CE

with pulsed electrochemical detection. Analyst 129: 579-584.

Harmoinen A, Sillanaukee P & J okela H. 1991.Determination of creatinine in serum andurine by cation-exchange high-pressure liquidchromatography. Clin Chem 37: 563-565.

J ohns BA, Broten T, Stranieri M T, Holahan M A &Cook J J. 2001. Simple high-performanceliquid chromatographic method to analyzeserum creatinine has several advantages overthe Jaffé picric acid reaction as demonstratedwith a cimetidine dose response in rhesusmonkeys. J Chromatogr B 759: 343-348.

K han GF & Wernet W. 1997. A highly sensitiveamperometric creatinine sensor. Anal Chim Acta 351: 151-158.

Ruzicka J & M arshall GD. 1990. SequentialInjection: a new concept for chemical sensors,process analysis and laboratory assays. Anal Chim A cta 237: 329-343.

Sabarudin A, Lenghor N, Liping Y, Furusho Y &M otomizu S. 2006. Automated onlinepreconcentration system for thedeterminationof trace amounts of lead using Pb-selectiveresin and inductively coupled plasma–atomicemission spectrometry. Spectrosc Lett 39: 669-

682.

Sabarudin A, Lenghor N, Oshima M , Hakim L, Takayanagi T, Gao Y H & M otomizu S. 2007.Sequential-injection on-line preconcentrationusing chitosan resin functionalized with 2-amino-5-hydroxy benzoic acid for thedetermination of trace elements inenvironmental water samples by inductivelycoupled plasma-atomic emissionspectrometry. Talanta 72: 1609-1617.

Staden J F. 1983. Determination of creatinine inurine and serum by flow-injection analysisusing the J affe reaction. Fresen Z Anal Chem 315: 141-144.

Stefan RI , Bokretsion RG, Staden J F, Aboul-enein

HY. 2003. Simultaneous determination of creatine and creatinine using amperometricbiosensors. Talanta 60: 1223-1228.

Suzuki Y, Aruga T, Kuwahara H, K itamura M ,Kuwabara T, K awakubo S & Iwatsuki M .2004. A simple and port able colorimeter usinga red-green-blue light-emitting diode and itsapplication to the on-site determination of nitrite and iron in river-water. Anal Sci 20:975-977.

Suzuki Y, Ito Y, Fukusawa T, K awakubo S &Iwatsuki M . 2005. Development of compactphotometric titrator and absorptiometric

detector for flow-injection analysis using light-emitting diode as light source. Bunseki Kagaku 54: 291-295.

Tsai HA & Syu M J. 2005. Synthesis of creatinine-imprinted poly (a-cyclodextrin) for the specificbinding of creatinine. Biomaterials 26: 2759-2766.

Yoshiwara M , Sakuragawa A & M atsuhashi A . 2005.Determination of creatinine by flow injectionanalysis using creatinine deiminase. Bunseki Kagaku 54: 1205-1210.

jurnal kreatinin

Documents