kati faz fermantasyon yÖntemİ İle bacillus licheniformis
TRANSCRIPT
TC
DİCLE UumlNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTUumlSUuml
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMİ İLE Bacillus licheniformis
ATCC 14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETİMİ UumlZERİNE BAZI
PARAMETRELERİN ARAŞTIRILMASI
Sedat KAYA
YUumlKSEK LİSANS TEZİ
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
DİYARBAKIR
Haziran 2011
TC
DĠCLE UNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml MUumlDUumlRLUumlĞUuml
DĠYARBAKIR
Sedat KAYA tarafından yapılan ldquoKatı Faz Fermantasyon Youmlntemi ile Bacillus
licheniformis ATCC 14580rsquoden Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Bazı Parametrelerin
AraĢtırılmasırdquo konulu bu ccedilalıĢma juumlrimiz tarafından Biyoloji Anabilim Dalında
YUumlKSEK LĠSANS tezi olarak kabul edilmiĢtir
Juumlri Uumlyesinin
Uumlnvanı Adı Soyadı
BaĢkan Doccedil Dr Zuumlbeyde BAYSAL
Uumlye Doccedil Dr Veysel TOLAN
Uumlye Doccedil Dr Fikret UYAR (Danışman)
Tez Savunma Sınavı Tarihi 30062011
Yukarıdaki bilgilerin doğruluğunu onaylarım
07 2011
Prof Dr Hamdi TEMEL
Enstituuml Muumlduumlruuml
I
TEŞEKKUumlR
Yuumlksek Lisans oumlğrenimim ve tez konumun seccediliminde planlamasında deneysel
ccedilalıĢmalarım iccedilin gerekli kimyasal ve teccedilhizatların sağlanmasında ve tezimin yazımında bilgi ve
desteğiyle yol goumlsterip bana oumlrnek olan yardımlarını hiccedil esirgemeden buumltuumln desteğiyle her an
her konuda yanımda olan ccedilok değerli danıĢman hocam Sayın Doccedil Dr Fikret UYARrsquoa teĢekkuumlr
ederim
Deneysel ccedilalıĢmalarım sırasında karĢılaĢtığım sorunları aĢmak iccedilin ccediloumlzuumlm yolları
bulmak adına bilgisini esirgemeyerek destek veren ve yuumlksek lisans eğitimim suumlresince beni
youmlnlendiren yol goumlsteren ve laboratuvar ccedilalıĢmalarıma katkıda bulunan ikinci tez danıĢman
hocam Siirt Uumlniversitesi oumlğretim uumlyelerinden Sayın Yrd Doccedil Dr Nurullah AKCANrsquoa teĢekkuumlr
ederim
Laboratuar ccedilalıĢmalarım ve tez yazım aĢaması sırasında desteğini esirgemeyen Dicle
Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Kimya Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın Doccedil Dr Zuumlbeyde
BAYSALrsquoa ve Dicle Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın
Prof Dr Abdunnasır YILDIZrsquoa teĢekkuumlr ederim
Manevi desteklerini hiccedilbir zaman esirgemeyen sayın hocalarım Yrd Doccedil Dr Birguumll
OTLUDĠL ve Yrd Doccedil Dr Sema AGUumlLOĞLU FĠNCANrsquo a teĢekkuumlr ederim
Tezimin yazım aĢamasında yardımlarını esirgemeyen arkadaĢlarım BARIġ ENEZ
BESĠ SERĠN ve YUSUF OumlNENrsquoe teĢekkuumlr ederim
Molekuumller Biyoloji AraĢtırma Laboratuarırsquonda yardımlarını goumlrduumlğuumlm Yuumlksek Lisans
ve Doktora yapan arkadaĢlara teĢekkuumlr ederim
Manevi desteklerinden dolayı Diyarbakır Ġl Kontrol Labaratuvar ġeflerinden Mehmet
DENĠZrsquoe ccedileviri konusunda yardımlarını esirgemeyen sayın arkadaĢlarım ESıddık
MARANGOZrsquoa ve Medeni AKGUumlNrsquoe teĢekkuumlr ederim
Hep bana destek olan varlıklarıyla daha guumlccedilluuml olmamı sağlayan dostlarıma teĢekkuumlr
ederim Ccedilok değerli arkadaĢım sayın Muumlrvet YILDIRIMrsquoa teĢekkuumlr ederim
Tuumlm hayatım boyunca hep yanımda olan ve desteklerini bana olan guumlvenlerini hep
uumlzerimde hissettiğim aileme teĢekkuumlr ederim
II
İCcedilİNDEKİLER
Sayfa
TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I
İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II
OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V
ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI
CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII
ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII
KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX
1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2
1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5
11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7
1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
III
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
IV
321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44
4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55
6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65
OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
TC
DĠCLE UNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml MUumlDUumlRLUumlĞUuml
DĠYARBAKIR
Sedat KAYA tarafından yapılan ldquoKatı Faz Fermantasyon Youmlntemi ile Bacillus
licheniformis ATCC 14580rsquoden Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Bazı Parametrelerin
AraĢtırılmasırdquo konulu bu ccedilalıĢma juumlrimiz tarafından Biyoloji Anabilim Dalında
YUumlKSEK LĠSANS tezi olarak kabul edilmiĢtir
Juumlri Uumlyesinin
Uumlnvanı Adı Soyadı
BaĢkan Doccedil Dr Zuumlbeyde BAYSAL
Uumlye Doccedil Dr Veysel TOLAN
Uumlye Doccedil Dr Fikret UYAR (Danışman)
Tez Savunma Sınavı Tarihi 30062011
Yukarıdaki bilgilerin doğruluğunu onaylarım
07 2011
Prof Dr Hamdi TEMEL
Enstituuml Muumlduumlruuml
I
TEŞEKKUumlR
Yuumlksek Lisans oumlğrenimim ve tez konumun seccediliminde planlamasında deneysel
ccedilalıĢmalarım iccedilin gerekli kimyasal ve teccedilhizatların sağlanmasında ve tezimin yazımında bilgi ve
desteğiyle yol goumlsterip bana oumlrnek olan yardımlarını hiccedil esirgemeden buumltuumln desteğiyle her an
her konuda yanımda olan ccedilok değerli danıĢman hocam Sayın Doccedil Dr Fikret UYARrsquoa teĢekkuumlr
ederim
Deneysel ccedilalıĢmalarım sırasında karĢılaĢtığım sorunları aĢmak iccedilin ccediloumlzuumlm yolları
bulmak adına bilgisini esirgemeyerek destek veren ve yuumlksek lisans eğitimim suumlresince beni
youmlnlendiren yol goumlsteren ve laboratuvar ccedilalıĢmalarıma katkıda bulunan ikinci tez danıĢman
hocam Siirt Uumlniversitesi oumlğretim uumlyelerinden Sayın Yrd Doccedil Dr Nurullah AKCANrsquoa teĢekkuumlr
ederim
Laboratuar ccedilalıĢmalarım ve tez yazım aĢaması sırasında desteğini esirgemeyen Dicle
Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Kimya Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın Doccedil Dr Zuumlbeyde
BAYSALrsquoa ve Dicle Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın
Prof Dr Abdunnasır YILDIZrsquoa teĢekkuumlr ederim
Manevi desteklerini hiccedilbir zaman esirgemeyen sayın hocalarım Yrd Doccedil Dr Birguumll
OTLUDĠL ve Yrd Doccedil Dr Sema AGUumlLOĞLU FĠNCANrsquo a teĢekkuumlr ederim
Tezimin yazım aĢamasında yardımlarını esirgemeyen arkadaĢlarım BARIġ ENEZ
BESĠ SERĠN ve YUSUF OumlNENrsquoe teĢekkuumlr ederim
Molekuumller Biyoloji AraĢtırma Laboratuarırsquonda yardımlarını goumlrduumlğuumlm Yuumlksek Lisans
ve Doktora yapan arkadaĢlara teĢekkuumlr ederim
Manevi desteklerinden dolayı Diyarbakır Ġl Kontrol Labaratuvar ġeflerinden Mehmet
DENĠZrsquoe ccedileviri konusunda yardımlarını esirgemeyen sayın arkadaĢlarım ESıddık
MARANGOZrsquoa ve Medeni AKGUumlNrsquoe teĢekkuumlr ederim
Hep bana destek olan varlıklarıyla daha guumlccedilluuml olmamı sağlayan dostlarıma teĢekkuumlr
ederim Ccedilok değerli arkadaĢım sayın Muumlrvet YILDIRIMrsquoa teĢekkuumlr ederim
Tuumlm hayatım boyunca hep yanımda olan ve desteklerini bana olan guumlvenlerini hep
uumlzerimde hissettiğim aileme teĢekkuumlr ederim
II
İCcedilİNDEKİLER
Sayfa
TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I
İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II
OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V
ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI
CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII
ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII
KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX
1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2
1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5
11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7
1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
III
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
IV
321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44
4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55
6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65
OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
I
TEŞEKKUumlR
Yuumlksek Lisans oumlğrenimim ve tez konumun seccediliminde planlamasında deneysel
ccedilalıĢmalarım iccedilin gerekli kimyasal ve teccedilhizatların sağlanmasında ve tezimin yazımında bilgi ve
desteğiyle yol goumlsterip bana oumlrnek olan yardımlarını hiccedil esirgemeden buumltuumln desteğiyle her an
her konuda yanımda olan ccedilok değerli danıĢman hocam Sayın Doccedil Dr Fikret UYARrsquoa teĢekkuumlr
ederim
Deneysel ccedilalıĢmalarım sırasında karĢılaĢtığım sorunları aĢmak iccedilin ccediloumlzuumlm yolları
bulmak adına bilgisini esirgemeyerek destek veren ve yuumlksek lisans eğitimim suumlresince beni
youmlnlendiren yol goumlsteren ve laboratuvar ccedilalıĢmalarıma katkıda bulunan ikinci tez danıĢman
hocam Siirt Uumlniversitesi oumlğretim uumlyelerinden Sayın Yrd Doccedil Dr Nurullah AKCANrsquoa teĢekkuumlr
ederim
Laboratuar ccedilalıĢmalarım ve tez yazım aĢaması sırasında desteğini esirgemeyen Dicle
Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Kimya Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın Doccedil Dr Zuumlbeyde
BAYSALrsquoa ve Dicle Uumlniversitesi Fen Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml oumlğretim uumlyelerinden Sayın
Prof Dr Abdunnasır YILDIZrsquoa teĢekkuumlr ederim
Manevi desteklerini hiccedilbir zaman esirgemeyen sayın hocalarım Yrd Doccedil Dr Birguumll
OTLUDĠL ve Yrd Doccedil Dr Sema AGUumlLOĞLU FĠNCANrsquo a teĢekkuumlr ederim
Tezimin yazım aĢamasında yardımlarını esirgemeyen arkadaĢlarım BARIġ ENEZ
BESĠ SERĠN ve YUSUF OumlNENrsquoe teĢekkuumlr ederim
Molekuumller Biyoloji AraĢtırma Laboratuarırsquonda yardımlarını goumlrduumlğuumlm Yuumlksek Lisans
ve Doktora yapan arkadaĢlara teĢekkuumlr ederim
Manevi desteklerinden dolayı Diyarbakır Ġl Kontrol Labaratuvar ġeflerinden Mehmet
DENĠZrsquoe ccedileviri konusunda yardımlarını esirgemeyen sayın arkadaĢlarım ESıddık
MARANGOZrsquoa ve Medeni AKGUumlNrsquoe teĢekkuumlr ederim
Hep bana destek olan varlıklarıyla daha guumlccedilluuml olmamı sağlayan dostlarıma teĢekkuumlr
ederim Ccedilok değerli arkadaĢım sayın Muumlrvet YILDIRIMrsquoa teĢekkuumlr ederim
Tuumlm hayatım boyunca hep yanımda olan ve desteklerini bana olan guumlvenlerini hep
uumlzerimde hissettiğim aileme teĢekkuumlr ederim
II
İCcedilİNDEKİLER
Sayfa
TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I
İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II
OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V
ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI
CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII
ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII
KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX
1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2
1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5
11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7
1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
III
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
IV
321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44
4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55
6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65
OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
II
İCcedilİNDEKİLER
Sayfa
TEŞEKKUumlRhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip I
İCcedilİNDEKİLERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip II
OumlZEThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip V
ABSTRACThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VI
CcedilİZELGE LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VII
ŞEKİL LİSTESİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip VIII
KISALTMA VE SİMGELERhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip IX
1 GİRİŞhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
11 Enzimlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip1
112 Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip2
1121 Proteazların Genel Oumlzelliklerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1122 Proteazların Sınıflandırılmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip4
1123 Mikrobiyal Proteaz CcedileĢitlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip5
11231 Ekzopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
11232 Endopeptidazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip6
1124 Proteazların Etki Mekanizması helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip7
1125 Proteaz Kaynaklarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1126 Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip8
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip9
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip11
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11282 Fırında PiĢirme Uygulamalarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip12
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlarhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11284 Atık Arıtımı ve DoumlnuumlĢuumlmuumlhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip13
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
III
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
IV
321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44
4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55
6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65
OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
III
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip14
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteazların Kullanımıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
12 Bacillus Cinsihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip15
121 Bacillus licheniformishelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip16
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip17
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajlarıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip21
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1321 Biyolojik Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
1322 Fiziko-Kimyasal Faktoumlrlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip23
2 KAYNAK OumlZETLERİhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip25
3 MATERYAL ve METOThelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
31 Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
311 Kullanılan Kimyasal Maddeler helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3111 Azot Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3112 Karbon Kaynakları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3113 Deterjanlar helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3114 Metal Tuzları helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
3115 Besi Yeri Maddeleri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip33
312 Kullanılan Aletlerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip 34
313Biyolojik Materyalhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
314 Mikroorganizmaların Uumlretimi ve Saklanmasıhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip34
315 Substrat Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
316 Substrat Parccedila Buumlyuumlkluumlğuuml helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
317 Kullanılan Besiyerlerihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip35
318 SSF Besiyeri helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip36
32 Metothelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
IV
321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44
4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55
6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65
OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
IV
321 Mikroorganizma Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
322 Ccediloumlzeltilerhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip37
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonuhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
324 Proteaz Aktivite Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip38
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
326 Protein Miktar Tayinihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Parametrelerin Etkisinin Ġncelenmesihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine DeğiĢik Besiyerlerinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip39
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip40
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip41
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip42
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi42
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisihelliphelliphelliphellip42
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphellip 43
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisihelliphelliphelliphellip43
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisihelliphelliphelliphelliphellip43
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisihelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip44
4 ARAŞTIRMA BULGULARIhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip45
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil helliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip55
6 KAYNAKLARhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip65
OumlZGECcedilMĠġhelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphelliphellip77
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
V
OumlZET
KATI FAZ FERMANTASYON YOumlNTEMĠ ĠLE Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoDEN PROTEAZ UumlRETĠMĠ UumlZERĠNE BAZI PARAMETRELERĠN
ARAġTIRILMASI
YUumlKSEK LĠSANS TEZĠ
Sedat KAYA
DĠCLE UumlNĠVERSĠTESĠ
FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTUumlSUuml
BĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI
2011
Enzimler genelde biyoteknolojide enduumlstride yiyecek tekstil kağıt tıp ve eczacılık
gibi alanlarda kullanılmaktadır Enzimler bitkisel hayvansal kaynaklardan ve
mikroorganizmalardan elde edilmektedir Mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya
hayvansal kaynaklı enzimlere goumlre katalitik aktivitelerinin ccedilok yuumlksek olmaları istenmeyen yan
uumlruumln oluĢturmamaları daha stabil ve ucuz olmaları kuumlltuumlr ortamında kolay ccediloğalmaları fazla
miktarda elde edilebilmeleri gibi avantajları vardır Proteazlar enduumlstriyel enzim grupları
iccedilersinde oumlnemli bir role sahiptirler Deterjan ilaccedil dericilikte et suumlt bira gibi gıda
enduumlstrilerinde boynuz tuumly saccedil gibi proteinlerin hidrolizinde X-ray filmlerindeki guumlmuumlĢuumln
geri kazanılmasında ve daha birccedilok enduumlstri alanında kullanılmaktadır
CcedilalıĢmamızda katı faz fermentasyonu (SSF) youmlntemiyle Bacillus licheniformis ATCC
14580rsquoden proteaz uumlretimi uumlzerine ccedileĢitli parametrelerin etkisi incelendi SSF besiyeri iccedilin
pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu pamuk sapı mısır kuumlspesi ve mercimek kabuğu
katı substrat olarak kullanıldı En iyi aktivite mısır kuumlspesi elde edildiğinden dolayı sonraki
ccedilalıĢmalarımızda katı substrat olarak mısır kuumlspesi kullanıldı Proteaz iccedilin en iyi inkuumlbasyon
suumlresinin 24saat olduğu belirlendi Substratın partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuumln proteaz uumlretimi uumlzerine
etkisini incelemek iccedilin yapılan ccedilalıĢmada 1500 μm partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta en iyi
proteaz uumlretimi tespit edildi Maximum proteaz aktivitesi sırasıyla pH80rsquoda ve 370Crsquode tespit
edildi Ġnokuumlluumlm hacmi 2 ml olarak belirlendi Enzim uumlretimi uumlzerine azot ve karbon
kaynaklarının etkisini araĢtırmak iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin 1 maya oumlzuumltuuml ve
amonyum klorid ve 1 galaktoz bulunan ortamda maksimum aktivite elde edilmiĢtir Kepek
miktarı ve kepek karıĢım oranlarının etkisinin incelenmesi iccedilin yapılan ccedilalıĢmada proteaz iccedilin
30 kepek (25 mısır kuumlspesi+5 pirinccedil kabuğu) bulunan ortamda en yuumlksek enzim uumlretimi
belirlendi
Anahtar Kelimeler Katı faz fermentasyonu (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580
Proteaz Mısır kuumlspesi
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
VI
ABSTRACT
THE EFFECT of SOME PARAMETERS on PROTEASE from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with SOLID STATE FERMENTATION METHOD
WAS EXAMINED
MSc THESIS
Sedat KAYA
DICLE UNIVERSTY
INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES
DEPARTMENT of BIOLOGY
2011
The usages of enzymes are used in biotechnology industry food textil paper medicine
and pharmaceutical Enzymes obtained from microorganisms are produced by microorganisms
have some advantages when compared with enzymes produced by plants or animals they have
considerably higher catalytic activity they donrsquot from undesirable by-products they are more
stable and relatively cheap and they can be obtained much quantity Proteases that are a group
of industrial enzymes have an important role Proteases were used detergent pharmaceutical
leather meat milk beer induumlstries hydrolysis of proteins such as horn feather and hair
recovery of silver from x-ray films and used many more industries field
In our study the effect of various parameters on protease from the Bacillus
licheniformis ATCC 14580 with the Solid state fermentation (SSF) method was evaluated Rice
husk wheat husk barley husk cotton stalk crushed maize and lentil husk were used as solid
substrate for SSF medium The best result was gained crushed maize therefore crushed maize
was used as solid substrate in the following studies The suitable incubation time for the
obtaining for the protease has been determined as 24th hour The effect of substrat particle size
on the protease production was tested Maximum protease production was detected at 1500 μm
substrat particle size Maximum protease pruductıon was detected at pH 80 and 37degC
respectivelly Inoculum volume was found to be 2 ml The effect of carbon and nitrogen sources
on protease pruduct were observed the highest with yeast extract and 1 galactose The effect
amount of solid substrate and mixed solid substrate on highest protease activity was
investigated The highest protease activity was observed at 30 mixed substrate (25 Crushed
maize+5 Rice husk)
Keywords Solid state fermentation (SSF) Bacillus licheniformis ATCC 14580 Protease
Crushed maize
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
VII
CcedilİZELGE LİSTESİ
Ccedilizelge No Sayfa
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları 3
Ccedilizelge 12 Bakteriyel Alkali Proteazlar Kaynakları Enduumlstriyel Uygulama
Alanları ve Uumlreticileri 10
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları 11
Ccedilizelge 14 SSFrsquoin Tarihsel GeliĢimi 20
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
VIII
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil No Sayfa
Şekil 11 Proteazların Sınıflandırılması 5
Şekil 12 Proteazların Hidroliz Reaksiyon Mekanizması 7
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi 45
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi 46
Şekil 43 Ssf Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti 47
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 48
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi 48
Şekil 46 Uygun Nem Miktarının Seccedilimi 49
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ġnokuumlluumlm Hacminin Etkisi 50
Şekil 48 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi 50
Şekil 49Enzim Uumlretimi Uumlzerine En Ġyi Aktivite Goumlsteren Substrat KarıĢımının Belirlenmesi 51
Şekil 410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi 52
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi 52
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi 53
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi 54
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi 54
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)
IX
KISALTMA VE SİMGELER
SSF Katı faz fermantasyonu
SmF Submerged fermentasyonu
YE Maya Oumlzuumltuuml
NB Nutrienth Broth
LB Laura Broth
IMC BaĢlangıccedil nem iccedileriği
RGPW Red Gram Plant Waste
TCA Trikloroasetikasit
CSL Corn Speed Luquor
pH0 BaĢlangıccedil pHrsquosı
aw Su aktivite faktoumlruuml
SDS Sodyum dodesil suumllfat
BSA Bovim serum albuumlmin
CaCl2 Kalsiyuumlm kloruumlr
CuCl2 Bakır kloruumlr
MgCl2 Magnezyum kloruumlr
ZnCl2 Ccedilinko kloruumlr
FeCl2 Demir kloruumlr
MnCl2 Mangan kloruumlr
NaCl Sodyum kloruumlr
Na2CO3 Sodyum karbonat
CuSO4 Bakır suumllfat
MgSO4 Magnezyum suumllfat
NaOH Sodyum hidroksit
(NH4)2SO4 Amonyum suumllfat
Sedat KAYA
1
1GİRİŞ
11 Enzimler
Biyokimyasal reaksiyonları hızlandıran genel olarak protein yapısında olan ve
organizmadaki biyokimyasal reaksiyonları katalizleyen biyolojik makromolekuumlllere
enzim denir Enzimler biyolojik katalizoumlrler olmaları nedeni ile duumlnyamızdaki canlıların
yaşamını olası kılan etmenlerin başında gelir Enzimlerin katalitik guumlccedilleri gerccedilekten
şaşırtıcıdır Enzimler molekuumllleri parccedilalar birleştirir veya belirli grupları bir
molekuumllden diğerine taşırlar (Telefoncu 1997)
Enzimlerden guumlnluumlk hayatta yararlanma olgusu oldukccedila eskidir İnsanlar
farkında olmadan enzimlerden peynir bira şarap vb maddelerin yapımında ve ilaccedil
olarak yararlanmışlardır Enzimlerin huumlcre dışı bir aktivitelerinin olduğu ilk kez 1783
yılında Spallanzi tarafından atmacanın mide suyunun eti eritebildiği goumlsterilerek
kanıtlanmıştır Daha sonra 1811 yılında Kirchoff buğday nişastasının zamanla şekere
doumlnuumlştuumlğuumlnuuml saptamıştır (Gupta ve ark 2003) 1825 yılında Berzellius buğdaygillerden
elde edilen enzim karışımının nişastayı suumllfirik asitten daha hızlı parccedilaladığını
saptamıştır (Goumlzuumlkara 1989) Willy Kuumlhne 1878 yılında biyolojik reaksiyonları
hızlandıran biyokatalizoumlrler iccedilin ldquohuumlcrede bulunanrdquo anlamına gelen ldquoenzimrdquo deyimini
ilk kez kullanmıştır Ccedilağdaş enzim kimyası ccedilalışmaları enzimatik reaksiyonlarla ilgili
Michelis-Menten varsayımı ve Sumner tarafından 1926 yılında saf olarak kristal uumlreaz
enziminin izolasyonu ile başlamıştır (Follmer 2008)
Duumlnyadaki enzim talebi 2006 yılında 41 milyar $‟a ulaşmıştır Duumlnya enzim
piyasasındaki bu değerin yıllık 76‟lık bir artışla 2011 yılında 6 milyar $ olacağı
beklenmektedir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 59‟unu proteazlar 28‟ini
karbohidrazlar 3‟uumlnuuml lipazlar ve 10‟unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır
Proteazlar ccedilamaşır deterjanları deri et suumlt ilaccedil bira fotoğraf vb enduumlstriyel alanlarda
organik sentezlerde ve atık arıtımında kullanılmaktadır (Patel ve ark 2005 Alpan
2008)
Enduumlstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler mikroorganizmalardan
bitkilerden mantarlardan ve hayvanlardan elde edilmektedirler Son yıllarda enduumlstriyel
katalizoumlrler olarak enzimlerin kullanımında buumlyuumlk bir artış goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
2
Buguumln 3000‟den fazla enzim tanımlanmış ve bunların ccediloğu biyoteknolojik ve
enduumlstriyel uygulamalar yoluyla bulunmuştur Bu kadar ccedileşitli enzime rağmen
enduumlstriyel talepleri karşılamada enzimlerin yetersiz olduğu goumlruumllmuumlştuumlr (Patel ve ark
2005)
Son yıllarda diğer tekniklere oranla daha fazla uumlruumln elde edilmesinden oumltuumlruuml Katı
Faz Fermantasyonu (SSF) tekniği biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanlarda gittikccedile artan
bir oumlnem kazanmıştır Bu teknikte ticari oumlnemi olmayan veya az olan ccedilevre kirliliğine
yol accedilan bazı bitkisel atıkların substrat olarak kullanılmasıyla ekonomik ve ekolojik
accedilıdan değerlendirilebilirliklerinin araştırılması amaccedillanmaktadır Bu amaccedilla enzim
uumlretim kaynağı olarak elimizde bulunan bakterilerden en fazla proteaz uumlretimine sahip
Bacillus licheniformis ATCC 14580 kullanılacak ve uygun substrat enzim uumlretim
şartları belirlenecektir
112 Proteazlar
Proteazlar proteinlerin yapısındaki peptid bağlarının hidrolitik parccedilalanmasını
katalizleyen enzimlerdir Enduumlstride kullanılan enzimlerin 75‟i hidrolitik enzimlerdir
Proteazlar da bu 75‟lik kısımda yer alan uumlccedil buumlyuumlk gruptan birini oluştururlar (Ccedilelik
2006) Proteazlar enzimlerin oldukccedila kompleks bir grubunu oluştururlar ve farklı
fizikokimyasal ve katalitik oumlzelliklere sahiptirler Proteazlar enzim sınıfları iccedilerisinde
hem fizyolojik hem de ticari alanda buumlyuumlk bir uygulama alanına sahiptirler (Mukherjee
ve ark 2008)
İnsanoğlu uzun yıllardan beri peynir şarap ve bira uumlretimi gibi birccedilok
uygulamada enzimlerin katalitik aktivitelerinden faydalanmaktadır (Pandey 2006)
Mikrobiyal enzimlerin duumlnya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığında alkalin
proteazlar 25 diğer proteazlar 21 amilaz 18 rennin 10 analitik enzimler
10 tripsin 3 lipaz 3 ve diğer karbonhidratları parccedilalayan enzimler 10 şeklinde
bir dağılımla karşılaşılmaktadır Doğada var olan enzim sayısının 25000 olduğu tahmin
edilmektedir Ccediloğunluğu hidrolazlar transferazlar ve oksidoreduumlktazlar olmak uumlzere
yaklaşık 400 tanesi araştırmalar iccedilin ticari olarak elde edilmektedir (Adlercreutz ve ark
1994 Schrerier 1997)
Proteolitik enzimler hem ekstraselluumller ve hem de intraselluumller olarak
sentezlenirler (Kumar ve Sharma 2005) Proteazlar fizikokimyasal ve katalitik
Sedat KAYA
3
oumlzelliklerinde muazzam farklılıklar goumlstermektedirler ve bu enzimlerle ilgili yapılan
ccedilalışmaların birccediloğu biyokimyasal ve biyoteknolojik yaklaşımları iccedilermektedir (Rao ve
ark 2009 Saeki ve ark 2007) Proteazlar fırınlama bira yapımı ccedilamaşır deterjanları
deri uygulamaları gıda enduumlstrisinde etlerin yumuşatılması organik sentezlerde atık
arıtımında kumaş ağartma ipek kalitesinin yuumlkseltilmesinde kozmetik uumlruumlnlerde
peptit sentezleri ve tıbbi teşhisler olmak uumlzere enduumlstriyel uygulamaların geniş bir
kısmında oumlnemli bir rol oynarlar (Gupta ve ark 2002 Najafi ve Deobagkar 2005)
Enzimlerin kullanıldığı enduumlstriyel işlemler daha ucuz ve kaliteli uumlruumln elde
edilmesine olanak sağlamaktadır Alkali proteazlar geniş pH ve sıcaklık aralıklarında
kararlı olduklarından birccedilok enduumlstriyel alanda kullanılmaktadır ve bu nedenle enzim
pazarında oldukccedila buumlyuumlk bir paya sahiptir (Rao ve ark 1998) Bazı proteaz kaynakları
ve enduumlstriyel uygulamaları Ccedilizelge 11‟de verilmiştir
Ccedilizelge 11 Bazı Proteaz Kaynakları ve Enduumlstriyel Uygulamaları (Pandey 2008)
Mikroorganizma Proteaz Ccedileşidi Enduumlstri
Bakteriler
Bacillus licheniformis Alkalin Deterjan
Bacillus amyloliquefaciens Alkalin Deterjan
Bacillus firmus Alkalin Deterjan
Bacillus megaterium Alkalin Deterjan
Bacillus pumulis Alkalin Deterjan
Streptomyces fradiae Alkalin Deterjan
Streptomyces griseus Alkalin Noumltral Deterjan
Streptomyces rectus Noumltral Deterjan Deri Gıda
Bacillus subtilis Noumltral Deri Gıda
Bacillus cereus Noumltral Deri Gıda
Bacillus megaterium Noumltral Deri Gıda
Pseudomonas aeruginosa Noumltral Deri Gıda
Mantarlar
Aspergillus niger Alkalin Deterjan
Aspergillus sofae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus oryzae Alkalin Noumltral Deterjan Deri Gıda
Aspergillus flavus Alkalin Deterjan
Pericularia oryzae Noumltral Deri Gıda
Endothia parasitica Asidik Eczacılık Gıda
Mucor michei Asidik Eczacılık Gıda
Mucor pusillus Asidik Eczacılık Gıda
1 GİRİŞ
4
1121 Proteazların Genel Oumlzellikleri
Proteazlar en oumlnemli enduumlstriyel enzimler arasındadır Proteolitik (protein
sindirim) aktivite goumlstermeleri nedeniyle yuumlzyıllardır mandıra enduumlstrisinde peynir
yapımı iccedilin suumlt-pıhtılaşma ajanları (rennet) gibi kullanılmışlardır
Proteazlar tuumlm canlı sistemlerde bulunur ve ccedileşitli metabolik reaksiyonları
katalizleyerek normal ve anormal ccedilevre şartlarında oumlnemli rol oynarlar Proteazlar
saprofitlerde proteinlerin parccedilalanması gelişmiş organizmalarda peptidazlar ile
proteinlerin belirli sinyal dizilerindeki bağların koparılması gibi ccedilok youmlnluuml bir role sahip
olmaları ile biyosferdeki etkilerini accedilıkccedila goumlstermektedirler (Pandey 2006)
Proteolitik enzimlerin spesifikliği aminoasitlerin yapısı ve diğer fonksiyonel
gruplar (aromatik alifatik ve suumllfuumlr iccedilerenler) tarafından kontrol edilmektedir Bu
enzimler sadece proteolitik reaksiyonları gerccedilekleştirmezler aynı zamanda
karbonhidratlar ve yağların yıkımını iccedileren tuumlm metabolik reaksiyonları etkileyerek
değişik metabolik reaksiyonları da duumlzenlerler (Sumantha ve ark 2006)
Mikroorganizmalardaki proteolitik enzimler huumlcre iccedilinde (intraselluumller) huumlcre
duvarı ile ilişkide (periplazmik) ve bulunduğu ortama (ekstraselluumller) salgılanırlar
Ekstraselluumller enzimler genelde selluumlloz protein nişasta gibi ccediloumlzuumlnmeyen besinlerin
sindirimini gerccedilekleştirirler ve sindirim sonucu meydana gelen uumlruumlnler buumlyuumlme iccedilin
gerekli besinler şeklinde kullanılmak uumlzere huumlcre iccediline alınırlar (Oh ve ark 2000
Andrade ve ark 2002) İntraselluumller proteazlar sporlanma farklılaşma protein yıkımı
enzim ve hormonların uumlretimi huumlcresel protein rezervlerinin onarımı gibi ccedileşitli
metabolik olaylarda rol oynamaları ile huumlcreler iccedilin oumlnemlidirler (Gupta ve ark 2002)
1122 Proteazların Sınıflandırılması
Ken McDonald (1985) tuumlm proteolitik enzimlerin sınıflandırılması ve
adlandırılması iccedilin peptidaz (peptit bağlarını hidrolize edenler) ve proteaz olmak uumlzere
iki terim belirleyerek terminolojideki sorunları buumlyuumlk oranda ccediloumlzmuumlştuumlr
Proteazlar ayrıca kataliz ettikleri reaksiyon tipine goumlre ekzopeptidazlar ve
endopeptidazlar olmak uumlzere iki gruba ayrılır (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve ark
1998) Bu tanımlamada belirleyici olan enzimlerin substratta etkili oldukları boumllgedir
Sedat KAYA
5
Proteazlar katalitik mekanizmalarına ve aktif boumllgelerinde bulunan fonksiyonel
gruplarına goumlre 4 gruba ayrılmışlardır Bunlar serin proteazlar (EC 3421) sistein
proteazlar (EC 3422) aspartik proteazlar (EC 3423) ve metallo proteazlar
(EC 3424) şeklindedir (Kumar ve ark 2008)
Proteazlar aktivite goumlsterdikleri pH aralığına goumlre asidik proteazlar noumltral
proteazlar ve alkali proteazlar olarak sınıflandırılmışlardır (Nduvimana ve ark 1995)
1123 Mikrobiyal Proteaz Ccedileşitleri
Etki oumlzelliklerine bağlı olarak Uluslararası Biyokimya Birliği proteazları başlıca
peptidazlar ve proteinazlar olmak uumlzere iki buumlyuumlk gruba ayırmışlardır Peptidazlar daha
sonra aşağıdaki kriterlere goumlre sınıflandırılmıştır (El Enshasy ve ark 2008)
1- Reaksiyon katalizi
2- Katalitik boumllgenin kimyasal yapısı
3- Yapı ile bağlantılı evrimsel ilişkiler
Proteazların sistematik dağılımı Şekil 11‟de verilmiştir
Şekil 11 Proteazların sınıflandırılması (Kumar ve ark 2008)
1 GİRİŞ
6
Genelde proteazlar aktif merkezlerinde katalitik bir uumlccedilluumlye sahiptirler Bu uumlccedilluuml
katalizin meydana geldiği aktif merkezde bulunmaktadır Oumlrneğin tuumlm serin
proteazlarda bu boumllge korunmaktadır Katalitik uumlccedilluumlyuuml histidin (His 57) serin (serin195)
ve aspartik asit oluşturmaktadır Bu aminoasitler birbirlerine yakın olarak
bulunmaktadırlar ve proteazların hidroliz yeteneğinde oumlnemli rol oynamaktadırlar
11231 Ekzopeptidazlar
Ekzopeptidazlar polipeptit zincirinin amino ya da karboksil ucundaki peptit
bağlarını hidroliz ederler Proteinin amino ucundaki peptit bağlarını hidroliz eden
ekzopeptidazlar aminopeptidazlar karboksil ucundaki peptit bağlarını hidroliz edenler
ise karboksipeptidazlar olarak adlandırılırlar Proteazlarda zincirin amino ucundaki ilk
peptit bağını hidrolizleyen aminopeptidazlar amino ucundaki ikinci peptit bağının
hidrolizini kataliz eden endopeptidazlar dipeptilaminopeptidazlar vb olarak bilinirler
Karboksipeptidazlar proteinlerin karboksil ucunda etki goumlsterirler Gerccedilek
karboksipeptidazlar bu uccediltaki son peptid bağını hidroliz ederler Dipeptidil
karboksipeptidazlar ise karboksi uccedilta bulunan son peptid bağından bir oumlnceki peptid
bağını hidroliz ederler (Nduvimana ve ark 1995)
11232 Endopeptidazlar
Endopeptidazlar ekzopeptidazların aksine amino veya karboksil uccedillarda bulunan
peptit bağları yerine iccedil kısımlarda bulunan peptit bağlarını hidroliz ederler (Nduvimana
ve ark 1995)
Serin proteazlar aktif merkezlerindeki aspartik asit (Asp) serin (Ser) ve
histidinden (His) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapılar ile karakterize edilirler Bu yapı iccedilinde
serin substrat ile kovalent bağ oluşturan oldukccedila reaktif bir elemandır (Nduvimana ve
ark 1995) Serin proteazlar alkali koşullarda aktivite goumlstermeleri ve kararlılıkları
nedeni ile farklı enduumlstriyel uygulama alanlarına sahip enzimlerdir Alkali pH
değerlerinde aktif olan bu enzimler geniş bir substrat ccedileşitliliğine sahiptirler Molekuumll
ağırlıkları ise ccediloğunlukla 18-35 kDa aralığındadır (Rao ve ark 1998)
Sistein proteazlar tiolproteazlar olarak de bilinir ve aktif merkezlerindeki sistein
(Cys) histidin (His) ve aspartik asitten (Asp) oluşan uumlccedilluuml katalitik yapıları ile
karakterize edilirler Sistein substrat ile kompleks oluşturulmasında etkili olup aktif
Sedat KAYA
7
merkezlerinde bir -SH grubu iccedilermektedirler Bu grup ağır metal iyonları ile okside
edici ajanlarla kolayca inhibe edilmektedir
Aspartat proteazlar asit endopeptidazlar olarak da bilinirler Bu enzimlerin
katalitik boumllgeleri iki aspartik asit iccedilerir ve bu proteazlar genellikle duumlşuumlk pH
değerlerinde aktivite goumlsterirler Molekuumll ağırlıkları 30-45 kDa aralığındadır
Metallo proteazlar bu grup etki mekanizması youmlnuumlnden diğer protezlara
goumlreceli olarak en ccedilok farklılık goumlsteren enzimleri iccedilerirler Metallo proteazlar
aktiviteleri iccedilin divalent katyonlara gerek duyan enzimlerdir Metallo proteazların
yapısında katyon olarak genellikle ccedilinko (Zn+2
) bulunmaktadır bunlar EDTA gibi şelat
yapıcı ajanlar tarafından inhibe edilen enzimlerdir Metallopeptidazlar noumltral alkali
miksobakter I ve II olmak uumlzere doumlrt gruba ayrılırlar (Nduvimana ve ark 1995 Rao ve
ark 1998)
1124 Proteazların Etki Mekanizması
İki amino asit yan yana geldiklerinde -COOH ve -NH2 grupları arasında
bağlanma meydana gelir ve bu bağa Peptid bağı adı verilir Bağlanma sırasında ise bir
su molekuumlluuml serbest kalır İki amino asitin yanyana gelmesiyle oluşan peptid bağına
Dipeptid uumlccedil veya daha fazla (yuumlzlerce ya da binlerce) amino asitin yanyana
gelmesiyle oluşan zincirdeki peptid bağlarına ise Polipeptid adı verilir Proteazların
etki mekanizması şekilde goumlruumllduumlğuuml gibidir Reaksiyon ccedilift youmlnluuml olarak oluşmaktadır
Şekil 12 Proteazların hidroliz reaksiyon mekanizması (Ccedilelik N 2006)
1 GİRİŞ
8
1125 Proteaz Kaynakları
Proteolitik enzimler bitki mantar hayvan ve mikrobiyal kaynaklarda
bulunmaktadır Bununla birlikte mikroorganizmalar geniş biyokimyasal ccedileşitlilik
goumlstermeleri ve genetik manipulasyonlara uygun olmalarından dolayı proteaz kaynakları
olarak tercih edilmektedirler Bunlar arasında fungilerin enzim uumlretiminde kullanımları
birccedilok avantaj sağlamaktadır Ekstraseluumller enzimlerin fermentasyon ortamlarında geri
kazanımları kolaydır (Pandey 2006)
Proteaz biyosentezinin Aspergillus (Fan-Ching ve ark 1998) Rhizopus (Rao ve
ark 1998) ve Penicillum (Farley ve ark 1992) gibi funguslar tarafından yapılabildiği
belirtilmektedir
1126 Proteaz Uumlretimi
Geleneksel olarak proteazların ticari uumlretimleri submerged fermentasyonunun
(SmF) kullanılmasıyla başarılmıştır Ancak yapılan son ccedilalışmalarda SSF‟in enzim
uumlretimlerinde buumlyuumlk bir potansiyele sahip olduğu kabul edilmektedir
Proteolitik enzimler biyoteknolojik faaliyetlerin buumlyuumlk bir boumlluumlmuumlnde uygulama
alanı bulurlar ve birccedilok enduumlstriyel alanlarda kullanılırlar (El Enshasy ve ark 2008)
Proteaz ccedileşitlerinden olan alkalin proteazlar gıda deri eczacılık ve deterjan enduumlstrileri
gibi ccedileşitli enduumlstrilerde yaygın kullanımlarından dolayı en fazla ccedilalışılmış enzim
gruplarından biridir (Gupta ve ark 2002) Aynı zamanda protein ultrafiltrasyonunda
membran temizliği iccedilin kullanılmışlardır (Dayanandan ve ark 2003) Değişik
uygulamalardan biri de alkalin proteazların başlıca deterjan enduumlstrisinde kullanımına
youmlneliktir Alkalin proteazlar proteinli lekeleri parccedilalama aktivitesi goumlsterirler (Saeki ve
ark 2007) Mikrobiyal proteazlar bakteri fungi ve mayaların kullanılması ile katı-faz
fermentasyonu ve submerged fermentasyonu gibi ccedileşitli youmlntemlerle uumlretilebilirler
(Haki ve Rakshit 2003)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Bacillus tuumlrleri logaritmik artış oumlncesi ve
durağan fazlarda ekstraseluumller proteazları uumlretirler (Pandey 2006) Mikroorganizmaların
uumlrettiği ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi
kolay metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun
Sedat KAYA
9
şekilde etkilenirler Proteaz sentezi ortamdaki aminoasitler gibi hızlı metabolize
edilebilen azot kaynaklarından da etkilenir (Gupta ve ark 2003) Ayrıca havalandırma
inokuumlluumlm hacmi pH ve inkuumlbasyon sıcaklığı gibi diğer fiziksel faktoumlrlerde proteaz
sentezini etkilerler (Puri ve ark 2002)
1127 Enduumlstriyel Accedilıdan Alkalin Proteazlar
Alkalin proteazlar bakteri fungi kuumlf maya ve boumlcekler gibi ccedileşitli
kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus tuumlrleri biyoteknolojide en fazla
kullanılan mikroorganizmadır (Anwar ve Saleemuddin 1998) Bunun nedeni ccedilok ccedileşitli
ortamlardan izolasyonu nispeten kolaydır Bununla birlikte Bacillus hem kompleks
hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir Termofilik ve alkalifilik Bacillus tuumlrleri
tarafından uumlretilen alkalifilik proteazlar yuumlksek sıcaklık ve pH‟a dayanmaktadır Ayrıca
Bacillus tuumlrleri post-eksponansiyal ve durgunluk fazlarında da ekstraselluumller proteazlar
uumlretebilmektedir (Fogarty ve Kelly 1990) Alkalin proteazlar etkili enzimler olup oumlnemli
oumllccediluumlde deterjan deri guumlmuumlş ilaccedil yiyecek tohum ve kimya sanayinde kullanılırlar Bu
enzimler yuumlksek kaliteli sindirimde kullanılırlar (Kumar ve ark 1999)
Proteazların enduumlstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğini bazı oumlzellikleri
belirler daha oumlnce bu alanda yapılan ccedilalışmalarda proteaz uumlruumlnleri iccedilin fungal
kuumlltuumlrlerde ccedilalışılmış ve uumlruumln miktarının kullanılan tuumlr ve ortama goumlre fazlasıyla
değişken olduğu ortaya konmuştur Proteaz uumlretimi iccedilin etken suumlreccedillerin geliştirilmesi
alkali proteazların enduumlstride birccedilok alanda kullanılmasında etken olmuştur Ccedilizelge
12de alkali proteazların guumlncel enduumlstriyel kullanım alanları kaynakları ve uumlreticileri
goumlruumllmektedir Alkali proteazların yuumlksek pH ve sıcaklıklarda ccedileşitli surfaktanların
varlığında aktivite goumlstermeleri bunları enduumlstriyel uygulamalar iccedilin elverişli
kılmaktadır (Kumar ve Takagi 1999 Anwar ve Saleemuddin 1998)
1 GİRİŞ
10
Ccedilizelge 12 Bakteriyel alkali proteazlar kaynakları enduumlstriyel uygulama alanları ve
uumlreticileri (Gupta ve ark 2002)
Uumlretici Uumlruumln İsmi Mikrobiyal
Kaynak
Uygulama Alanı
Novo Nordisk
Danimarka
Alcalase
Savinase
Esparase
Biofeed pro
Durazym
Novozyme47 1MP
Novozyme 243
Nue
B licheniformis
Bacillus sp
B lentus
B licheniformis
Bacillus sp
Belirtilmiyor
B licheniformis
Bacillus sp
Deterjan ipek
Deterjan tekstil
Deterjan gıda ipek
Yem
Deterjan
Fotoğraf
Deri
Genencor
International
ABD
Purafact
Primatan
B lentus
Bakteriyel
Kaynaklı
Deterjan
Deri
Gist-Brocades
Hollanda
Subtilisin
Maxacal
Maxatase
B alcalophilus
Bacillus sp
Bacillus sp
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Solvay Enzymes
Almanya
Opticlean
Optimase
Maxapem
HT-proteolytic
Protease
B alcalophilus
B licheniformis
Bacillus spnin
Protein
muumlhendisliği ile
uumlretilmiş varyantı
B sublilis
B licheniformis
Deterjan
Deterjan
Deterjan
Alkol iccedilki ekmek
yem gıda deri
fotoğrafik atık
Gıda atık
Amano
Pharmaceuticals
Japonya
Proleather
Collagenas
Amano protease S
Bacillus sp
Clostrodium sp
Bacillus sp
Gıda
Teknik
Gıda
Enzyme
Development
ABD
Enzeco alkaline
protease-L FG
Enzeco high
alkaline protease
B licheniformis
B licheniformis
Bacillus sp
Teknik
Gıda
Enduumlstriyel
Nagase
Biochemicals
Japonya
Bioprase
concantrate
Ps Protease
Ps Elastase
CrystProtease
CrystProtease
Bioprase
Bioprase SP-10
B sublilis
P aeruginoso
P aeruginoso
B subtilis(K2)
Bsubtilis(bioteus)
B sublilis
B sublilis
Kozmetik
farmasoumltik
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Araştırma
Deterjan temizlik
Gıda
Jodo Shusei Japonya Codo Bap
B licheniformis Deterjan gıda
Rohm Almanya Corolase 7089
B sublilis Gıda
Sedat KAYA
11
1128 Proteazların Enduumlstriyel Uygulama Alanları
Proteazların bazı enduumlstriyel alanlardaki uygulamaları ccedilizelge 13‟te verilmiştir
Ccedilizelge 13 Proteazların Bazı Enduumlstriyel Alanlardaki Uygulamaları (Gupta ve ark 2002
Pandey 2004)
Enduumlstri
Proteaz Uygulama
Ekmek yapımı Noumltral proteaz
Hamur kalitesini arttırma
İccedilecek Papain Soğuktan etkilenmeme
iccedileceklerde bulanıklığın
giderilmesi
Mandıra
Fungal proteazlar simozin
diğer proteazlar
Sığır renneti yerine kesilmiş suumlt
suyunun işlenmesi modifiye
peynir enzim uumlretimi
Deterjan Alkali proteaz subtilisin Giysilerdeki protein lekelerinin
uzaklaştırılması
Gıda uumlretimi Bazı proteazlar Soya protein veya buğday
gluteni gibi zengin protein
metaryallerinin modifikasyonu
Deri Tripsin diğer proteazlar Derinin asitlenmesi derilerden
tuumlylerin uzaklaştırılması
Et ve balık Papain diğer proteazlar Et yumuşatılması kemik ve
balık atıklarından protein eldesi
Tıp Tripsin Oumlluuml dokunun uzaklaştırılması
kan pıhtısını ccediloumlzme doku
iltihaplarının azaltılması tıbbı
uumlruumlnlerin geliştirilmesi kontakt
lensler ve takma dişlerin
temizlenmesi
Fotoğraf Bazı proteazlar Kullanılan X-ışını ve fotoğraf
filmlerinden guumlmuumlş eldesi
Tatlandırma Termolizin Aspartam sentezinde revers
Hidroliz
Enduumlstriyel ve Evsel
Atıkların İşlenmesi
Bazı proteazlar Gıda enduumlstrilerinde ve evsel
faaliyetler sonucu meydana gelen
atıkların işlenmesi
1 GİRİŞ
12
11281 Deterjan Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
İlk olarak 1913 yılında pankreas ekstresi ve sodyum karbonat karışımı şeklinde
patenti alınan bdquobiyo-ıslatma‟ uumlruumlnuumlnden sonra pek oumlnemsenmeyen bu sektoumlr 1960
yıllarında Bacillus subtilis alkalin proteazının nispeten bol ve ucuz uumlretimi ile tekrar
guumlndeme gelmiş ve devamlı gelişmiştir Zamanla Bacillus licheniformis ve Bacillus
alcalophilus gibi suşların seccedilimi ile pH optimum değerleri alkaline kayan proteazlar
uumlretilmiştir Son zamanlarda ise protein muumlhendisliği sayesinde deterjanlarda ağartıcı
madde olarak kullanılan perborata dayanıklı alkalin proteazlar kullanılmaktadır
(Dağaşan 1997)
Deterjanlar proteaz amilaz lipaz gibi farklı enzimler iccedilerir ve deterjan katkı
maddesi olarak farklı enzimlerin kullanılması protein iccedilerikli lekelerin yanı sıra nişasta
ve karbohidrat lekelerinin de ccedilıkarılmasına olanak sağlar Enzimlerin deterjan katkı
maddesi olarak kullanılmasında etken olan başlıca oumlzellikler alkali pH‟da ccedilalışmaları
ve deterjanlarla uyumlu olmalarıdır Deterjan enduumlstrisinde genellikle subtilisinler
kullanılmaktadır Subtilisinlerin başarılı kullanımının temelinde yuumlksek sıcaklıklardaki
kararlılık ve yuumlksek substrat oumlzguumllluumlluumlğuuml gibi nitelikleri yatmaktadır Bu proteazlar her
tuumlrluuml ccedilamaşır ve bulaşık deterjanlarında kullanılmakta işlevleri kan suumlt yumurta gibi
protein iccedilerikli lekelerin ccedilıkarılmasını sağlamaktadır (Maurer 2004)
11282 Fırında Pişirme Uygulamaları
Proteazlar hamurun karıştırılması ve fermantasyon aşamalarında ortama ilave
edilerek hamur vizkozitesi yoğurmaya karşı direnccedil ve yoğurma zamanının azalması
sağlanır ve boumlylece vizkoelastik oumlzellikler iyileşir Proteazın etkisiyle hem hamurun
makine ile işlenebilirliği artar hem de ekmek iccedili yapısı gelişir (Linko ve ark 1999 Puri
ve ark 2002)
Yuumlksek miktarda buğday proteini (gluten) iccedileren hamurların işlenmesi mekanik
olarak daha zordur Bu amaccedilla proteaz tipi enzimlere gereksinim duyulmaktadır
Oumlzellikle biskuumlvi ve kraker yapımında duumlşuumlk gluten iccedileren unlar tercih edilmekte ancak
bunun yeterli olmadığı durumlarda proteaz tipi enzimlerle bu ihtiyaccedil
giderilebilmektedir Proteaz tipi enzimler ekmeğin besin değerini etkilemeden unun
yapısında bulunan gluteni hidroliz etmekte ve hamurun kolay işlenebilirliliğini
sağlamaktadır (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
13
11283 Suumlt Teknolojisinde Proteazlar
Proteazlar suumlt işleme suumlrecinde kullanılan en oumlnemli enzimlerdendir Peynirin
olgunlaşmasına yardımcı olurlar Peynir yapımı sırasında suumlt proteinlerinin
ccediloumlktuumlruumllmesi iccedilin chymosin (renin) adı verilen bir proteaz kullanılmaktadır Bu enzim
suumlt danalarının midesinin doumlrtuumlncuuml boumlluumlmuumlnde bulunmaktadır Renin suumlt danalarından
tuzlu su ekstraksiyonu ile elde edilmektedir Yetişkin hayvanların midesinde renine
ilaveten pepsin de bulunur ancak pepsin peynir yapımı sırasında istenmeyen aromalara
sebep olduğu iccedilin kullanılması istenmemektedir Bu youmlnde yapılan araştırmalar
sayesinde bakteriyel koumlkenli renin elde edilmiş ve 1985 yılından itibaren tuumlm duumlnyada
yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır (Dağaşan 1997)
Laktik asit bakterileri suumlt teknolojisinde peynir ve suumlt uumlruumlnlerinin yapımında ccedilok
oumlnemli bir mikroorganizma grubunu oluşturur (Thomas ve Mills 1981) Bu bakterilerin
salgıladıkları proteazlar suumltte bulunan kazeinin peptit bağlarını kırarak kazeinin
pıhtılaşmasını ve buna bağlı olarak peynirin oluşumunu sağlarlar Laktik asit bakterileri
peynir uumlretiminde suumltuumln asitlenmesi ile peynirin olgunlaşmasında işlevseldir ve oumlzguumln
lezzetin oluşumuna da katkıda bulunurlar Laktik asit bakterileri başka besinlerin
fermentasyonu ve fermentasyon iccedilin uygun ortamın oluşturulmasında da
kullanılmaktadır Proteazlar ayrıca gıda sektoumlruumlnde bebek maması diyet uumlruumlnleri
meyve suyu vb uumlruumlnlerin uumlretilmesinde kullanılmaktadır (Anwar ve Saleemuddin
1998)
11284 Atık Arıtımı ve Doumlnuumlşuumlmuuml
Boynuz tuumly tırnak ve saccedil gibi lifsel proteinler doğada atık olarak oldukccedila bol
miktarda bulunurlar Bu atıklar bazı mikroorganizmalardan elde edilen proteazlarla
kullanılabilir hale doumlnuumlştuumlruumllebilir veya yok edilebilirler Proteazların proteolitik
aktivitesi ile protein iccedilerikli bu atıkların parccedilalanarak giderimi sağlanmaktadır Bu
etkileri ile proteazlar son zamanlarda atık youmlnetiminde yaygın olarak kullanılmaktadır
Kuumlmes atıklarının duumlzenlenmesi proteazların kullanım alanları arasındadır bu yolla
atıklar ve tuumly birikintileri giderilebilmektedir
1 GİRİŞ
14
11285 Fotoğrafccedilılıkta Proteaz Kullanımı
Alkalin proteazlar fotoğrafccedilılık sektoumlruumlnde de kullanılmaktadır Fotoğraf filmleri
uumlzerinde oumlnemli miktarda guumlmuumlş bulunmaktadır Filmlerin yakılması ile yuumlzeyindeki
guumlmuumlş geri kazanılmakta ancak bu youmlntemle ccedilevre kirliliğinin artmasına yol
accedilılmaktadır Bu işlemde proteazların kullanılması guumlmuumlşuumln geri doumlnuumlşuumlmuuml iccedilin ccedilevre
dostu bir youmlntem olarak goumlruumllmektedir Filmler uumlzerindeki jelatinin enzim tarafından
parccedilalanması ile uumlzerinde bulunan guumlmuumlş kolayca geri kazanılmakta proteazlar film
sektoumlruumlnde de giderek oumlnemli bir yer edinmektedir (Anwar ve Saleemuddin 1998)
11286 Deri Enduumlstrisinde Proteaz Kullanımı
En eski sanayi kollarından birisi olan dericilikte proteaz enzimleri farkında
olunmadan yuumlzlerce belki binlerce yıldır kullanılmıştır Hayvan derileri epidermis
denilen ve kıl koumlkleri ile yağ ve ter bezlerini iccedileren dış deri korjium denilen ve kollajen
fiberleri ile elastin ve diğer proteinleri iccedileren esas deri ve nihayet deriyi besleyen
damarları da iccedileren bağ dokusundan oluşmaktadır Bu enzimlerle tabaklama işlemleri
sırasında ıslatma kireccedillik-kıl doumlkme ve sama işlemi gibi uumlccedil ayrı uygulama
yapılmaktadır (Dağaşan 1997) Deri enduumlstrisinde enzim kullanımı ile hayvan
derilerinin daha duumlzguumln bir yuumlzeye sahip olmasını sağlamaktadır (Anwar ve
Saleemuddin 1998)
11287 Tekstil Sanayinde Proteaz Kullanımı
Ham ipek sericin adı verilen mumsu ve mat bir protein kılıfı ile sarılıdır Tipik
ipek parlaklığının ve yumuşaklığının ortaya ccedilıkabilmesi iccedilin sericinin ağartma adı
verilen işlemle ccediloumlzuumllmesi gerekmektedir Bu operasyon geleneksel olarak ipek ccedililelerini
sabunlu ve sodalı suda kaynatarak yapılmaktadır ve kayıplara neden olmaktadır Alkalin
proteaz enzimi non-iyonik bir ıslatıcıyla pH80 civarında 50ndash55degC kullanılarak
1-2 saatte ekonomik bir şekilde ağartma işlemi yapılabilir Boumlylece ipek kalitesi
yuumlkseldiği gibi kayıplar da asgariye indirilebilir (Dağaşan 1997)
Sedat KAYA
15
11288 Et ve Balık Sanayinde Proteaz Kullanımı
Et enduumlstrisinde papain fisin ve bromelain gibi bitkisel proteazlar ile fungal
proteazlardan et yumuşatma (tenderizasyon) amacıyla yararlanılmaktadır Bu proteolitik
enzimler etteki elastin ve kollajeni kısmi hidrolize uğratarak etin yumuşamasına neden
olurlar Bu etki oumlzellikle kas fibrillerini tutan sarkolemma ve benzeri kas doku
boumllgelerinde olmaktadır Kas fibrillerindeki aşırı proteolitik parccedilalanma etin lapalaşma
şeklinde istenmeyen bir değişikliğe uğramasına neden olur Etin rigor mortis (oumlluumlm
sertliği) fazındaki sertliğinden uzaklaşarak daha fazla yumuşaması ise ette doğal olarak
bulunan ve Ca+2
tarafından aktive edilen proteazlar ile katepsinler tarafından gerccedilekleşir
(Claus ve ark 1986)
Et ve balık işleme sanayinde bunlardan başka balık protein hidrolizatlarının elde
edilmesinde bazı kabuklu deniz hayvanlarının etlerinden ayrılmasında ve kabukların
accedilılmasında proteolitik enzimler kullanılmaktadır Proteince zengin bazı sebze ve
meyvelerden oumlrneğin soyadan yapay et elde edilmesinde de proteazlardan
yararlanılmaktadır (Patel ve ark 2005)
11289 Alkol ve Bira Uumlretiminde Proteaz Kullanımı
Bira teknolojisinde uumlretim suumlrecini kısaltmak yatırım ve işccedililik giderlerini en az
duumlzeye indirmek iccedilin bu dalda enzim kullanımının esas amacını oluşturmaktadır Bu
amaccedilla en ccedilok alfa amilaz ve proteazlardan yararlanılmaktadır
Proteazlardan biracılıkta biyolojik olmayan bulanıklığı engellemek amacıyla da
yaralanılmaktadır Birada biyolojik ve biyolojik olmayan iki tip bulanıklığa
rastlanmaktadır Biyolojik bulanıklığın nedeni mikroorganizmalardır Biyolojik
olmayan bulanıklık ise biradaki protein ve taninin goumlzle goumlruumllebilir partikuumlller halinde
kompleksler oluşturmasından kaynaklanmaktadır (Claus ve ark 1986)
12 Bacillus Cinsi
Bacillus cinsinin uumlyeleri mezofiller ve ekstremofilleri iccedileren ccedilubuk şeklinde
endospor formundaki gram-pozitif bakterilerdir Bacillus‟ların vejetatif huumlcreleri tek
başına veya zincir şeklinde bulunabilir 05x12μmndash25x10μm buumlyuumlkluumlkte olan
huumlcrelerin yuvarlak veya koumlşeli şekilde goumlruumlnuumlmleri vardır (Rosovitz ve ark 1998
Tunail ve Koumlşker 1986) Bacillus tuumlrleri toprak ve bununla ilişkili nehirler nehir
1 GİRİŞ
16
ağızları ve kıyı suları gibi su kaynakları ve bitkileri de iccedileren ortamlarda en fazla yayılış
goumlsteren mikroorganizmalardır (Telefoncu ve ark 1997 john 2009) Ccedilok farklı
enzimler antibiyotikler ve kuumlccediluumlk metabolitleri uumlreterek enduumlstriyel amaccedillarda
kullanılmak uumlzere arzu edilen uumlruumlnleri oluştururlar Enzim salgılamak iccedilin optimum
37degC‟ye ihtiyaccedil duyarlar (Priest ve ark 1994 Veith ve ark 2004) Proteaz ve ccedileşitli
enzimlerini uumlretebilmeleri ile besin doumlnguumlsuumlne katkıda bulunan organizmalar gibi
duumlşuumlnuumllmektedirler
Genellikle aerobik koşullar altında ortamda gıda maddelerinin tam olarak
tuumlketilmediği veya besin maddelerinin (mineral maddeler uumlreme faktoumlrleri nitrojen
karbon ve enerji kaynakları) azaldığı ve ccedilevresel koşulların değiştiği durumlarda olgun
basiller iccedilersinde spor oluşturmaktadırlar Sporilizasyon işlemi bakteri uumlremesinin
duraksama fazında gerccedilekleşmektedir Sporlar genellikle oval veya yuvarlak şekilde
olup huumlcrenin ccedileşitli yerlerinde bulunabilirler Normal fiziksel faktoumlrlere (ısı ışık
donma kuruma radyasyon vs) kimyasal maddelere (dezenfektanlar vs) ve mekanik
tesirlere karşı vejetatif formlarından ccedilok daha fazla dayanıklıdırlar (Arda 2000)
Bacillus huumlcrelerinde genelde sitoplazmik membran uumlzerinde bir veya birkaccedil
aniyonik polimer ve birkaccedil peptidoglikan tabaka ile sarılmış huumlcre duvarı
bulunmaktadır Bazı Bacillus tuumlrleri huumlcre duvarından ayrı olarak ve huumlcre duvarının
dışında jelatinoumlz viskoz elastik veya mukoid karakterde olan kapsuumll iccedilermektedirler
(Sneath 1986) Ayrıca bazı Bacillus tuumlruumlnde ince uzun dalgalı fleksibilitesi fazla
sarmal yapıda ve hareketi sağlayan ldquoflagellumrdquo organeli bulunmaktadır Bacillus
bakterileri karbon kaynağı olarak organik asit şeker alkol ve nitrojen kaynağı olarak
amonyum iccedileren besiyerlerinde iyi gelişirler Gelişimleri sıvı ve katı besiyerlerinin uumlst
kısımlarında olmaktadır Katı besiyerlerinde kenarları ve uumlzeri puumlruumlzluuml granuumlller yapıda
olan koloniler meydana getirirler (Tunail ve Koumlşker 1986 Taubman 1992)
121 Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis doğada yaygın olarak bulunan ve uumlyelerinin ccedileşitli
enzimleri uumlretmesinden dolayı besin doumlnguumlsuumlne oumlnemli katkı sağladığı duumlşuumlnuumllen
saprofit bir bakteridir Blicheniformis her yerde bulunan ve ccedilubuk şeklinde olan gram
pozitif bir bakteridir (Claus ve ark 1986)
Sedat KAYA
17
Bacillus licheniformis fermantasyon enduumlstrisinde biyoteknolojik oumlneme sahip
amilaz proteaz antibiyotikler ccedilevre ve insan sağlığı accedilısından ccedilok az risk oluşturan
oumlzel kimyasalların uumlretimi iccedilin yaygın olarak kullanılır Tıp ve veterinerlikte yaygın
olarak kullanılan bdquoBacitracin‟ adı verilen ilk antibiyotik peptidi Bacillus licheniformis
kuumlltuumlruumlnden elde edilmiştir (He ve ark 2006) Bacillus licheniformisrsquoten elde edilen
diğer enzimler ve bazı metabolitler aşağıda verilmiştir Guumlmuumlş nano-kristalleri
(Kalimunthu ve ark 2008) β-laktamaz BS3 (Beck ve ark 2008) ksilanaz (Liu ve Liu
2008) endoglukanaz (Bischoff ve ark 2007) elastaz (Qihe ve ark 2007)
Bacillus licheniformisrsquoin metabolik farklılıkları oumlnemli genetiksel
farklılıklarından kaynaklanmaktadır DNA‟sının GC iccedileriği 33-67 arasında
değişmektedir (Akcan 2009)
13 Katı Faz Fermantasyonu Tekniği
Katı faz fermantasyonu genel olarak suyun olmadığı veya az olduğu ortamda
katı (nemli) materyaller uumlzerinde mikroorganizmaların gelişimi olarak tanımlanır
(Pandey 2008) SSF son yıllarda bazı biyolojik uygulamalar ve uumlruumlnlerin gelişiminde
umut vermektedir SSF mikroorganizmaların doğal habitat ortamına benzer ve bu
nedenle mikroorganizmaların buumlyuumlmesi iccedilin tercih edilmektedir Denizde yaşayan
mikroorganizmalar bile suda serbest halde yaşamayı istemezler Ccediluumlnkuuml deniz ortamında
bulunan canlıların 98‟inden fazlası su altındaki katı substratların yuumlzeyinden izole
edilmiştir (Singhania ve ark 2009)
Katı faz fermentasyonu işlemleri Asya uumllkelerinde eski zamanlardan beri
uygulanmaktadır Batı uumllkelerinde ise 1940‟lardan sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
Penisilinin sıvı fermentasyonu suumlrecinde uumlretilmesi nedeniyle o doumlnemde araştırıcılar
buumltuumln ilgilerini sıvı ortam fermentasyonuna youmlnlendirmişler ve bu nedenle batı
uumllkelerinde katı faz fermentasyonu 1940‟lardan daha sonra oumlnem kazanmaya başlamıştır
(Pandey 2003) Katı faz fermentasyonunun tipik oumlrnekleri geleneksel
fermentasyonlardır Bunlara oumlrnek olarak Japonya‟da buharla muamele edilmiş pirinccedil
kullanılan ldquokojirdquo Endonezya‟da mikrobiyal kaynak olarak kuumlf ve katı substrat olarak
buhar uygulanmış bezelye tohumlarının kullanıldığı ldquotempehrdquo veya Hindistan‟a ait
ldquoragirdquo verilebilir Yine Penicillum roquefortii veya Penicillum camemberti ile kuumlfluuml
peynir uumlretimi uzun yıllardan beri uygulanan katı faz fermentasyonlarına oumlrnek
1 GİRİŞ
18
verilebilir Fransa‟da kuumlfluuml peynir uumlretimi ccedilevresel şartların kontroluuml kuumlf sporlarının
uumlretimi ve peynirin mekanik durumunun geliştirilmesiyle modernize edilmiştir Benzer
olarak fungusların kuumlccediluumlk oumllccedilekli uumlretimi iccedilin kullanılan kompost işlemi modernize
edilip Avrupa ve ABD‟de geliştirilmiştir (Raimbault 1998)
Son on yılda SSF sistemleriyle tıpta tedavi amaccedillı kullanılan antibiyotikler
alkoloidler bitki buumlyuumlme faktoumlrleri ccedileşitli yiyecekler tatlandırıcılar vb iccedileren biyolojik
olarak aktif sekonder metabolitler ccedileşitli biyoteknolojik ve enduumlstriyel alanda
kullanılan enzimler organik asitler mikopestisitler ve biyoherbisitleri iccedileren
biyopestisitler biyosurfaktanlar biyoyakıt aroma bileşikleri gibi değerli katkı
maddelerinin SSF ile uumlretimindeki metotların gelişimi iccedilin eşi goumlruumllmemiş olağanuumlstuuml
bir ccedilabaya şahit olunmuştur (Mehrotra ve ark 1999 Patel ve ark 2005)
SSF işlemlerinde genelde katı atıklar zirai-enduumlstriyel substratlar
kullanılmaktadır Bu amaccedilla portakal kabuğu mısır kuumlspesi şeker kamışı kabuğu
pirinccedil kabuğu pirinccedil sapı buğday kepeği buğday unu pirinccedil unu nohut unu mısır
unu soya unu mercimek kabuğu muz kabuğu manyok koumlkuuml gibi katı substratlar
kullanılmaktadır (Economou ve ark 2010 Uyar ve Baysal 2004 Mukherjee ve ark
2009)
Araştırmacılar SSF‟in SmF‟ye goumlre uumlstuumln olduğunu ileri suumlrmuumlşlerdir SmF
genelde sentetik olarak hazırlanmış ortamlarda meydana gelen fermantasyon işlemidir
SmF ortamında katı destekleyici yerine sıvı ortam bulunmaktadır Mikroorganizmaların
SSF‟te doğal ortamına daha yakın olması ve buna bağlı olarak daha etkin aktivite
goumlstermektedir (Pandey 2003) SSF‟te maksimum verime ulaşabilmek iccedilin kullanılan
mikroorganizmanın ccedilevre koşullarını bilmek ccedilok oumlnemlidir Ccedilalışmalar SSF‟in oumlnemli
avantajlarından birinin de esas substrat gibi kullanılan ham materyallerin son derece
ucuz olduklarını goumlstermiştir Hem gıda hem de tarım atıkları bol miktarda uumlretilmekte
ve bu atıklar karbonhidratccedila ve diğer besinlerce zengin olduklarından SSF tekniğinin
kullanımıyla enzimler ve oumlnemli kimyasalların uumlretiminde bir substrat gibi hizmet
ederler Aynı zamanda ccedilevre kirliliğini azaltırlar (Couto ve Sanromaacuten 2006) Daha fazla
biyokuumltle yuumlksek enzim uumlretimi ve daha duumlşuumlk protein bozulması SSF‟de daha iyi
oumlzellikte uumlretime katkıda bulunur SSF youmlntemlerinde ekstre edilen enzimin yuumlksek
kararlılık goumlstermesi bu tekniğin diğer oumlnemli avantajıdır (George ve ark 1997)
Sedat KAYA
19
SSF‟te dikkat edilmesi gereken bir nokta da parametrelerin ve optimum
koşulların seccedilimidir Bunlar partikuumll buumlyuumlkluumlğuuml substrat seccedilimi bağıl nem pH
inkuumlbasyon suumlresi ccedilalkalama hızı uumlreme sıcaklığı inokuumlluumlm hacmi ortama eklenen
azot ve karbon kaynaklarıdır (Pandey 2003 Singhania ve ark 2009)
Biyoteknolojide alkalin proteaz daha ccedilok SmF ile uumlretilir fakat son zamanlarda
SSF ile uumlretilmektedir SSF ile alkalin proteaz uumlretimi daha az su isteği ve substrat
olarak zirai enduumlstriyel katı atıkların kullanımından dolayı maliyeti azalttığı iccedilin
SmF‟ye kıyasla daha ekonomik ve ccedilevre dostudur (Uyar ve Baysal 2004)
SSF kullanılan mikroorganizmalara goumlre 2 ccedileşide ayrılmaktadır
1-Doğal SSF doğal mikrofloranın kullanıldığı SSF suumlrecidir
2-Saf kuumlltuumlr SSF mikroorganizmaların saf kuumlltuumlrleri ya tek veya kombine olarak
kullanılır (Nigam ve Singh 1994)
1 GİRİŞ
20
Ccedilizelge 14 SSF‟in Tarihsel Gelişimi (Pandey ve ark 2000)
ABİYOLOJİK UYGULAMALARI
MOuml 2000 Mısırlılar tarafından ekmek yapımı
Hz İsa‟nın doğumundan
oumlnce Asya‟da
Peynir yapımı iccedilin Penicillium roquefortiii‟den
yararlanılmıştır
MOuml 1500 Balık fermantasyonuşeker nişasta ve tuzlar ile koruma
MOuml 1500 Koji işlemi
7 yuumlzyıl Koji uygulamasının Ccedilin‟den Japonya ya geccedilmesi
18 yuumlzyıl Meyve ezmesinden sirke yapımı
18 yuumlzyıl Tabaklama ve baskı uygulamalarında gallik asit
kullanımı
1860-1900 Kanalizasyon ıslah işlemleri
1900-1920 Fungal enzimlerin uumlretilmesi kojik asit
1920-1940
Fıccedilı tipi fermentoumlrin geliştirilmesi sayesinde fungal
enzimler gallik asit ve sitrik asit uumlretimlerinin
gerccedilekleştirilmesi
1940-1950 Fermantasyon enduumlstrisinde penisilin uumlretimi ile goumlruumllen
olağanuumlstuuml gelişme
1950-1960
Steroid transformasyonu
1960-1980 Mikotoksinler ve protein değeri artırılmış hayvan
yemlerinin uumlretimi
1980-1990
Ccedileşitli primer ve sekonder metabolitlerin uumlretimi
column tipi fermentoumlruumln geliştirilmesi SSF kinetikleri
ve modellerine youmlnelik ccedilalışmalar
1990-Guumlnuumlmuumlze kadar
SSF‟e youmlnelik temel yaklaşımlardaki gelişmeler
biyolojik uygulamalarelde edilen uumlruumlnlerdeki
ilerlemeler
Tehlikeli bileşiklerin ıslahı biyolojik doumlnuumlşuumlmuuml tarım
enduumlstrisi atıklarının detoksifikasyonu
biyotranformasyonlar
Sedat KAYA
21
B SSF İLE ELDE EDİLEN UumlRUumlNLER
Biyoaktif bileşikler Alfatoksin osiratoksin bakteriyel endotoksinler giberillik asit zearalenon
ccedilavdar alkaloidleri penicilin cephalosporin cephalomycin C tetrasiklin klorotetrasiklin
oksitetrasiklin iturin aktinorhodin metilenomisin surfaktin monordan siklosporin
Austiloksinler antifungal uccedilucu bilesikler destruksin A ve B klavulanik asit mikofenolik asit
Enzimler Sellulaz β-glukosidaz CMCaz lakkaz ksilanaz poligalaktorunaz ligninaz β-
ksilosidaz α-arabinofuranosidaz lakkaz Li-peroksidaz Mn-peroksidaz proteazlar (asidik
noumltral ve alkalin) lipazlar α-amilaz β-amilaz glukoamilaz glutaminaz inulinaz fitaz tannaz
feruloil para-kaumaroil esteraz
Organik asitler Sitrik asit fumarik asit laktik asit oksalik asit gallik asit
Diğer bileşikler L-glutamik asit pigmentler karotenoidler xanthangum suumlksinoglikan etanol
aramo bilesikleri vitamin B-12 B-6 riboflavin tiamin biyosurfaktanlar
biyopestisitlerbiyoherbisitler
131 SSFrsquoin Avantajları ve Dezavantajları
SSF verimlilik uumlruumln konsantrasyonu ve atık oluşumu gibi hallerde SmF‟ye goumlre
belirgin avantajlara sahiptir SSF‟in ccedileşitli avantajları aşağıda sıralanmıştır
SSF‟in daha fazla verime sahip olması
SSF‟de bakteri ve maya kontaminasyonu daha azdır
Atık su ccedilok az olduğundan daha az ccedilevre kirliliğine yol accedilmaktadır
Geri besleme baskılanması SmF‟ye goumlre daha duumlşuumlk ya da hiccedil yoktur (Perez-
Guerra ve ark 2003)
Duumlşuumlk maliyet ve tekrarlanabilir harcamalar
Duumlşuumlk enerji ihtiyacı (Pandey ve ark 2000)
Koumlpuumlklenmenin olmaması
Basit ve daha kolay uumlretilebilirlik
Daha basit fermantasyon ortamı
Daha kolay havalandırma
1 GİRİŞ
22
Kuumlccediluumlk oumllccedileklerde bile ekonomik kullanım
Kontaminantların basit kontroluuml (Akcan 2009)
Fermantasyonda kullanılan katıların doğrudan uygulanabilirliği
Kurutulmuş fermantasyon materyallerinin muhafazası
Uumlruumln elde edilme suumlrecindeki daha duumlşuumlk maliyet
Mikroorganizmaların doğal habitatlarına benzer ortamlarda gelişimine izin veren
yabani-tip mikroorganizmaların kullanılmasına olanak sağlaması
Enerji gereksinimi duumlşuumlktuumlr (Mazutti ve ark 2006) Bazı durumlarda
otoklavlama buhar uygulama mekanik ccedilalkalama ve havalandırmaya
gereksinim yoktur
Oksijen sirkuumllasyonu daha iyidir
Katabolik baskılama genellikle daha duumlşuumlktuumlr (Perez-Guerra ve ark 2003)
SSF‟te ccediloğunlukla yabani suş mikroorganizmalar genetik yapısı değiştirilmiş
mikroorganizmalara nazaran daha iyi uygulama imkacircnı sağlar ve daha
guumlvenilirdir
Yukarıda adı geccedilen avantajlara rağmen SSF tekniği SmF tekniği ile
karşılaştırıldığında bazı dezavantajları vardır Bunlar
Nadiren meydana gelen bakteriyel ve fungal kontaminasyon
Kullanılabilen mikrobiyal tuumlrlerin sınırlı olması
Biyokuumltle değerlendirmesi iccedilin dolaylı metotlara ihtiyaccedil duyulması
Ortamın nem iccedileriğinin kontroluumlndeki zorluklar
Yapılan oumln işlemlerin pahalı olabilmesi
Buumlyuumlk miktarda spor inokuumlluumlmuumlne ihtiyaccedil duyulması
Fermantasyon suumlresince pH kontroluumlnuumln muumlmkuumln olmaması
Devamlı ccedilalkalama iccedilin yuumlksek enerji gereksinimi
Sedat KAYA
23
Substratlar genellikle oumln uygulamaya ihtiyaccedil duyar (oumlğuumltme parccedilalama
homojenizasyon fiziksel kimyasal ve enzimatik hidroliz buhar uygulama gibi)
Sıvı substrat fermentasyonuna goumlre biyokuumltle (uumlreme) miktarının saptanması
zordur Ccediluumlnkuuml misel ve katı substrat arasındaki sıkı penetrasyon biyokuumltlenin
tamamen elde edilmesini engeller (Rahardjo ve ark 2004)
Uumlreme esnasında oluşan metabolik sıcaklığın uzaklaştırılması oldukccedila zordur
Temel bilimsel ve muumlhendislik bilgileri accedilısından belirsizlikler vardır Buumlyuumlk
oumllccedilekli reaktoumlrlerin dizaynı ve işlenmesi hakkındaki bilgiler ccedilok azdır (Perez-
Guerra ve ark 2003)
132 SSFrsquoi Etkileyen Faktoumlrler
Genel olarak SSF‟i etkileyen 2 tip faktoumlr vardır ( Pandey 2004)
1 Biyolojik faktoumlrler
2 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
1321 Biyolojik Faktoumlrler
Bu faktoumlrler yaşayan tuumlrler veya organizmanın biyolojisi metabolik işleyişi ve
uumlremesiyle ilişkili faktoumlrlerdir Bu faktoumlrlerin spesifik bir yol ile incelenmesi belirli
tuumlrlerin davranışlarının saptanmasını sağlar (Prakasham ve ark 2006)
Uygun bir tuumlr seccedilimi SSF‟in en oumlnemli kriterlerinden biridir
Mikroorganizmalar hedeflenmiş uumlruumlnlerin ticari olarak uygun verimlerde olması yan
uumlruumln miktarı ve substrat uumlzerindeki uumlreme ve gelişim şekillerine goumlre ayırt edilirler
1322 Fiziko-kimyasal Faktoumlrler
Karbon ve azotun yapı ve kaynağı her fermantasyon işleminde en oumlnemli
faktoumlrlerdendir Karbon kaynağı mikroorganizmanın gelişimini sağlayacak enerjiyi
sağlar Bu nedenle herhangi bir fermantasyon işleminde uygun bir enerji veya karbon
kaynağı seccedililmelidir Azot buumlyuumlme ve nuumlkleik asit-aminoasit bileşeni gibi protein
sentezini belirler Karbon ve azot miktarı arasındaki ilişki spesifik bir uumlruumlnuuml elde etme
işleminde ccedilok oumlnemlidir SSF ortamına organik ve inorganik azot bileşiklerin
eklenmesiyle genelde enzim aktivitesinin arttığı goumlzlenmiştir
1 GİRİŞ
24
Biyolojik işlemler genelde belirli sıcaklık derecelerinde
gerccedilekleştirilmektedirler Biyolojik bir işlemin geliştirilmesinde sıcaklığın oumlnemi
protein denatuumlrasyonu enzimatik inhibisyon belirli bir metabolit uumlretiminin
induumlklenme ve baskılanması veya huumlcre yaşamoumlluumlmuuml gibi etkilerin belirlenmesi
şeklindedir
Yaşayan huumlcreler ortamın 70-80 nem iccedileriği ile karakterize edilir ve bu
nedenle su iccedileriği yeni huumlcrelerin sentezini belirleyen bir faktoumlrduumlr Bir faktoumlr olarak
nem SSF‟in tanımlanmasıyla ilişkilendirilmiştir
Herhangi bir SSF işlemi iccedilin en oumlnemli faktoumlrler arasında pH bulunmaktadır
SSF işlemi sırasında farklı pH değerlerini dengede tutmak iccedilin yapılan ccedilalışmalardan
biri biyolojik aktivite uumlzerinde ters etki yapmayacak tamponların kullanılması ile
sağlanabilir
Genel olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey
alanı sağlar ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok
kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok
mikrobiyal solunumhavalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme
meydana getiren olay goumlruumlluumlr (Liu ve Tzeng 1999 ) Buna karşın daha buumlyuumlk partikuumlller
kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk parccedilacıklar daha
etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin sınırlı bir alan
oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnuuml
belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Sedat KAYA
25
2 KAYNAK OumlZETLERİ
Klingeberg ve ark (1995) ekstrem termofil arke olan Thermococcus stetteri‟den
elde edilen yuumlksek sıcaklıkta kararlı alkali proteazın ccedilok geniş bir sıcaklık ve pH
aralığında (50-100degC pH 5-11) aktif olduğunu belirlemişlerdir Bu enzimin 85degC ve pH
85-90 arasında kazeine karşı optimum aktivite goumlsterdiğini saptamışlardır
Ferrero ve ark (1996) farklı karbon ve azot kaynaklarının varlığında farklı
duumlzeylerde enzim uumlretebilen 60ordmC sıcaklığa ve pH 90 değerine kadar gelişebilen
Bacillus licheniformis MIR 29 ile yapılan ccedilalışma sonucunda kazeinin enzim sentezini
uyardığını ayrıca uumlst kuumlltuumlr sıvısının amino asit ve peptidlerden (10 kDa‟dan kuumlccediluumlk
molekuumlller) arındırılmadığı koşullarda aktivitenin azaldığı enzim uumlretiminin son uumlruumln
inhibasyonu ile duumlzenlenebileceğini oumlnermişlerdir Uumlre Besiyerinde azot kaynağı olarak
kullanıldığında enzim uumlretimini baskıladığını ifade etmişlerdir
Mehrotra ve ark (1999) tuzlu ve alkali topraklardan izole edilen 52 alkalofilik
bakteriyel suşu alkalin proteaz uumlretmeleri iccedilin suumlt-agar besi yerinde uumlretmişler
Topraktan izole edilen 52 suştan sadece 15 suşun alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirdiği bildirilmiştir Burada karbon kaynağı olarak 1 suumlkroz fruktoz
mannitol glukoz maltoz nişasta ve laktoz kullanılmış azot kaynağı olarak 1
NH4NO3 (NH4)2SO4 NaNO3 NH4H2PO4 NH4Cl pepton kazein ve maya ekstraktı
kullanılmıştır Maximum enzim aktivitesi iccedilin 1 glikoz 1 amonyum kloruumlr
kullanmışlar Maksimum enzim aktivitesi pH 105 40ordmC ve 20 saatlik inkuumlbasyonda
elde edilmiştir
Towatana ve ark (1999) yaptıkları bir ccedilalışmada hidrotermal kaynaklarından
izole ettikleri ve 55ordmC sıcaklıkta gelişen alkalifilik ve termofilik bir Bacillus PS719
suşunun proteolitik aktivitelerini incelemişlerdir Sonuccedil olarak ekstraseluumller proteazın
azokazein substrata karşı 75 degC sıcaklıkta ve pH 90‟da maksimum aktivite goumlsterdiği
belirlenmiştir Enzim aktivitesinin 2 mM CaCl2 varlığında 185 oranla artığı ve Fe2+
ve
Cu2+
iyonlarının inhibitoumlr olarak etkili olduğu belirlenmiştir
Johnvesly ve Naik (2001) Bacillus sp JB-99‟un uumlrettiği termostabil alkali
proteazın (optimum pH 110 optimum sıcaklık 75ordmC) en yuumlksek enzim aktivitesini
karbon kaynağı olarak sitrik asit ccediloumlzuumlnuumlr nişasta veya fruktoz (10gL) azot kaynağı
olarak da NaNO3 veya KNO3 (10gL) iccedileren besiyerinde goumlsterdiğini belirlemişlerdir
2 KAYNAK OumlZETLERİ
26
Karbon kaynağı olarak kullanılan glukozun (10gL) alkali proteaz sentezini
baskıladığını tespit etmişlerdir
Haki ve Rakshit (2003) geccedilmiş yıllarda Bacillus brevis Bacillus licheniformis
Bacillus thermoruber Bacillus pumilus Bacillus stearothermophilus gibi
mikroorganizmalar kullanılarak 45-90ordmC sıcaklık aralığında optimal aktiviteye sahip
proteazlar uumlretilmiştir Yine Bacillus tuumlrlerinde yapılan ccedilalışmalarda proteazların pH
60-120 gibi geniş bir aralıkta aktivite goumlsterebildiğini belirtmişlerdir
Bahccedileci (2004) Tuz Goumlluuml‟nden izole edilen bakterilerin enduumlstriyel oumlneme sahip
ksilanaz seluumllaz α-amilaz ve proteaz enzimlerini uumlretip uumlretmediklerini belirlemek
amacıyla ccedilalışmalar yapmıştır Elde edilen izolatların birinin Bacillus pumilis iki
izolatın Bacillus subtilis ve geriye kalanların Bacillus licheniformis olduğunu tespit
etmiştir Bu izolatların oumlnemli oumllccediluumlde amilaz ve proteaz enzimi uumlrettiği belirlenmiştir
Proteaz enziminin optimum aktivite sıcaklıkları 50ndash60ordmC ve optimum pH 70ndash74 olarak
belirlenmiştir Proteaz enziminin 80ordmC ve pH9‟a kadar stabilite goumlsterdiği belirtilmiştir
Joo ve ark (2004) Alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin patates nişastası mısır nişastası buğday
kepeği ve buğday ununu katı substrat olarak kullanmışlar En iyi enzim aktivitesini
buğday unundan (38560 Uml) elde etmişlerdir Alkalin proteaz uumlretiminde maksimum
enzim aktivitesi elde etmek iccedilin mikroorganizma 2 soya 1 kazein 1 buğday unu
05 K2HPO4 05 sodyum sitrat 001 MgSO4 ve 04 sodyum karbonat 37 ordmC
250 rpmbdquode 48 saat inkuumlbasyona bırakılmıştır Enzim pH 55-12 arasında aktivite
goumlsterirken optimum aktivite pH10‟da elde edilmiştir Optimum sıcaklık ise 50ordmC‟de
goumlzlenmiştir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus kullanarak SSF tekniği ile mercimek kabuğu ve
buğday kepeğinin bulunduğu ortamda alkalin proteaz aktivitesini incelemişlerdir
Buğday kepeğinin katı subsrat olarak kullanıldığı SSF besiyerinde en yuumlksek enzim
aktivitesini belirlemişlerdir Maksimum aktivite 429041 Umg ve 168640 Umg olarak
buğday kepeğinin ve mercimek kabuğunun substrat olarak kullanıldığı ortamda 40‟lık
başlangıccedil nem iccedileriği ve pH10‟da inkuumlbasyonun 24 saatinde elde edilmiştir İnokuumlluumlm
hacmi 20 olarak rapor etmişler
Sedat KAYA
27
Agrawal ve ark (2005) topraktan izole edilen Beauveria feline‟da soya
proteinini hidrolizleyen alkalin proteaz aktivitesini alkalin proteaz uumlreticisi olarak
bilinen Aspergillus oryzae NCIM 649 ile karşılaştırmışlardır SSF ortamında alkalin
proteaza etki eden parametreleri inceleyerek Beauveria feline‟da buğday unu
kullanarak 7 guumln boyunca inkuumlbasyona bırakılan ortamda maksimum enzim aktivitesini
20000 Ug olarak tespit etmişlerdir Başlangıccedil nem oranı 120 ve optimum pH 70
olarak tespit etmişlerdir Aspergillus oryzae NCIM 649‟un Beauveria felinersquoya oranla
iki kat daha fazla alkalin proteaz uumlrettiğini tespit etmişlerdir
Kazan ve ark (2005) Bacillus clausii GMBAE 42 suşundan uumlretilen bir serin
alkali serin proteazın optimum pH değerinin 113 optimum sıcaklığının ise 60degC
olduğu 5 mM CaCl2 ilavesiyle optimum sıcaklığın 70degC‟ye yuumlkseldiğini belirtmişlerdir
Enzimin pH 105‟ta 2 saat inkuumlbasyon sonucunda 30ordmC ve 40degC sıcaklıklarda stabil
olduğu 50degC sıcaklıkta aktivitesini 86 duumlzeyinde koruyabildiğini tespit etmişler
Sandhya ve ark (2005) tarımsal enduumlstriyel atıklar kullanarak noumltral proteaz
uumlretiminin SmF ile karşılaştırılmasını yapmışlardır Aspergillus oryzae‟nın 3 ırkı
Penicillumrsquoun 4 ırkı olan P sp P funiculosum P pirophillum P aculetum kullanarak
proteaz uumlretimleri karşılaştırılmıştır Buğday kepeği pirinccedil kabuğu Hindistan cevizi
kuumlspesi susam yağı kuumlspesi bira yapımında ortaya ccedilıkan atıklar ve palmiye kuumlspesi
gibi tarımsal ve enduumlstriyel atıklar kullanılarak SSF ortamı hazırlanmış ve uumlretilen
enzim SmF‟te uumlretilen enzimle karşılaştırılmıştır Bu sistemde en iyi substrat kaynağı
olarak buğday kepeği belirlenmiştir SSF‟te başlangıccedil nem seviyesi olarak optimum
436 en iyi aktivite sıcaklığı 30ordmC optimum pH 75 suumlre olarak‟ta 72 saat olarak
belirlenmiştir SmF‟te optimum pH 75 ve 2 buğday kepeği ve 3 ml spor suumlspansiyonu
kullanarak 30ordmC‟de 180 rpm‟de 72 saatte maksimum enzim verimi 87 Ugds olarak
belirlenmiştir Bu iki fermantasyon sisteminin karşılaştırılması goumlstermiştir ki SSF
youmlntemiyle 35 kat daha fazla enzim uumlretilmiştir
Chellappan ve ark (2006) Engyodontium album BTMFS deniz tortularından
izole edilmiş ekstraselluumller proteaz uumlretimini pH11‟de tespit etmişlerdir Partikuumll
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 425 microm başlangıccedil nem iccedileriğini 60 bulmuşlardır Buğday kepeği katı
substrat olarak kullanılmış ve proteaz uumlretimi iccedilin 25ordmC‟de 120 saat inkuumlbasyona
bırakılmıştır Karbon kaynağı olarak sukroz inorganik azot kaynağı amonyum hidrojen
2 KAYNAK OumlZETLERİ
28
karbonat ilavesi ve aminoasitlerden loumlsin kullanıldığında enzim uumlretimi artmıştır
Enzimin maksimum aktivite goumlsterdiği sıcaklık ise 60ordmC‟dir Enzimin yuumlksek pH ve
sıcaklıkta maksimum aktivite goumlstermesi deterjan enduumlstrisinde kullanılabilirliğini
goumlstermektedir
Mehta ve ark (2006) SSF youmlntemiyle alkalofilik aktinomisetes uumlzerinde
yaptıkları ccedilalışmada glukoz pepton maya ekstraktı KH2PO4 farklı konsantrasyonlarda
kullanarak alkalin proteaz uumlretimi uumlzerindeki etkilerini incelemişlerdir Bu ccedilalışmada
katı substrat olarak molas buğday unu ve buğday kepeğine 0-2 oranında bu kaynaklar
ilave edilerek 37ordmC‟de 32 saatlik inkuumlbasyona bırakıldı Alkalin proteaz uumlretiminde SSF
youmlntemiyle kullandıkları katı substratlardan en yuksek aktiviteyi 32 saatte elde
etmişlerdir Bu inkuumlbasyondan sonra glukozun 05 ile 1‟de enzim aktivitesini
olumlu etkilediği 2 ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi olumsuz etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr KH2PO4‟an ise 15 konsantrasyonunda enzim aktivitesini artırdığı 2
ve daha yuumlksek konsantrasyonlarda aktiviteyi baskıladığını goumlzlemişlerdir Pepton ve
maya ekstraktının ise sırasıyla 05 ve 1 konsantrasyonlarında aktiviteyi olumlu
etkilerken bunun dışındaki konsantrasyonlarda enzim aktivitesini azalttığı goumlruumllmuumlştuumlr
Prakasham ve ark (2006) alkalofilik Bacillus sp yi kullanarak SSF youmlntemiyle
alkalin proteaz uumlretimini gerccedilekleştirmişler Kullandıkları katı atıklar arasında en iyi
aktiviteyi yeşil gram kabuğunda elde etmişlerdir Ortamda 15 maltoz ve 2 maya
ekstraktı kullandıklarında optimum enzim uumlretimi kontrole goumlre 371 daha fazla
artmıştır Glukoz enzim uumlretimini baskılamamış fakat kullanılan inorganik azot
kaynakları ise enzim uumlretimi uumlzerine negatif etki goumlstermişlerdir Maksimum enzim
uumlretiminde optimum pH 90 nem iccedileriği 140 inokuumlluumlm oranı 3 ve inkuumlbasyon
suumlresi 60 saat olarak belirlenmiştir
Aguumlloğlu ve Okumuş (2007) yaptıkları ccedilalışmada SSF ortamı olarak karpuz ve
kavun kabuğunu kullanmışlar En iyi proteaz uumlretimini kavun kabuğunda tespit
etmişlerdir Partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlnuuml 1500 microm olarak bulmuşlar Maksimum proteaz
uumlretimini pH 10‟da ve 65degC sıcaklıkta tespit etmişlerdir Karbon kaynaklarından nişasta
ve arabinoz metal tuzu olarak ta CaCl2 ve BaCl2 azot kaynaklarından ise pepton ve
amonyum suumllfat enzim aktivitesini artırmıştır
Sedat KAYA
29
Wei-Hua Chu (2007) ekstraselluumller alkalin proteaz uumlretebilen 34 tuumlruuml topraktan
ve değişik ccedilevrelerden izole etmiştir Bacillus sp APP1 tuumlruuml ile en yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi elde edilmiştir Maksimum enzim uumlretimi iccedilin kuumlltuumlr şartları optimize
edilmiştir Ortam başlangıccedil pH‟sı 90 olduğunda maksimum proteolitik aktivite
(2560 U ml-1
) değeri 48 saatten sonra (g-1
) 15 soya unu 30 buğday unu 4 K2HPO4
1 Na2HPO4 01 MgSO47H2O ve 6 Na2CO3 iccedileren ortamdan elde edilmiştir Alkalin
proteaz 72 saatte 5 SDS ve 5 H2O2 gibi SDS ve oksitleyici ajanlar varlığında
stabilite goumlstermiştir
Mahanta ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada yağı alınmış Jatropha tohum
kuumlspesinin SSF‟te enzim uumlretimi iccedilin substrat olarak kullanılabileceğini belirlemişlerdir
Araştırmacılar daha oumlnce kendileri tarafından rapor edilen ccediloumlzuumlcuuml tolerant Pseudomonas
aeruginosa PseA soyunu fermantasyon iccedilin kullanmıslardır Bu tohum kuumlspesinin
bakteriyel gelişimi ve enzim uumlretimini iyi bir şekilde desteklediğini goumlrmuumlşlerdir
(Proteaz 1818 Ug ve lipaz 625 Ug) Araştırmacılar maksimum proteaz ve lipaz
aktivitesini 50 substrat nemliliğinde ve 72-120 saat geliş periyotlarında pH 60-70‟
da tespit etmişlerdir Karbon kaynağı olarak maltoz ile zenginleştirmenin proteaz
uumlretimini 63 kat artırdığını tespit etmişlerdir Proteaz uumlretimi iccedilin azot kaynağı olarak
pepton eklenmesinin enzim uumlretimini Jatropha tohum kuumlspesinin gramı başına proteaz
aktivitesi 11376 Umg arttırdığını belirtmişlerdir Araştırmacılar elde edilen bu
sonuccedilların enduumlstriyel enzimlerin uumlretimi iccedilin değerlendirilmesi ve değişken
yaklaşımların olabileceğini goumlstermişlerdir
Mukherjee ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada termofilik Bacillus subtilis
DM-04 bakterisi SSF metodunu kullanarak farklı tarımsal-enduumlstriyel atıklar ve mutfak
atıklarını buğday kepeği pirinccedil kepeği Imperata cylindrica ccedilimeni muz yaprağı
patates kabuğu ve ccedilay yapraklarını substrat olarak kullanarak alkalin proteaz uumlretiminin
hangisinde maksimum aktivite goumlsterdiğini incelemişler En yuumlksek proteaz aktivitesi
patates kabuğu ve Imperata cylindrica ccedilimeninde goumlzlemişler Hatta patates kabuğu ve
Imperata cylındrica ccedilimeni 11 oranında karıştırıldığında aktivitenin daha da
yuumlkseldiğini goumlzlemişler I cylındrica ccedilimenine azot kaynağı olarak sığır eti ekstraktı ve
maya ekstraktı ayrı ayrı ilave edildiğinde proteaz uumlretimini olumlu etkilediği
goumlruumllmuumlştuumlr Karbon kaynaklarından sadece maltozun kontrolden daha fazla proteaz
uumlretimine neden olduğunu dile getirmişlerdir Ham proteazın optimum aktivitesi
2 KAYNAK OumlZETLERİ
30
37-45ordmC‟de ve pH 80 ve 90‟da bulmuşlardır Bacillus subtilis DM -04‟ten elde edilen
enzimin 60ordmC‟de 15 dk bekletildikten sonra 67 oranında aktivitesini koruduğu
goumlzlenmiştir Bu oumlzelliğinden dolayı enzim ticari deterjanlara ilave edilip olumlu
sonuccedillar alınacağı umulmaktadır
Nadeem ve ark (2008) yaptıkları ccedilalışmada alkalofilik Bacillus licheniformis
N-2 tarafından meydana getirilen proteaz uumlretimini gL‟de 10 glukoz 10 soya unu 3
K2HPO4 05 MgSO47H2O ve 05 CaCl2 iccedileren 50 ml kuumlltuumlr ortamında
gerccedilekleştirmişlerdir Farklı karbon ve azot kaynakları organik ve inorganik formda ve
yağı ccedilıkarılmış unlar uygun substratı belirlemek iccedilin kullanılmıştır En yuumlksek alkalin
proteaz aktivitesi (67764 Umg) buğday kepeği ccediloumlzuumlnuumlr nişasta ve glukoz iccedileren
ortamda elde edilmiştir Değişik azot kaynakları arasında soya unu alkalin proteaz
uumlretimini en iyi seklide induumlklemistir İnorganik azot kaynaklarından amonyum tuzları
96 oranında enzim uumlretimini baskılamıştır Termostabilite ccedilalışmalarında enzim 10
mM Ca2+
iyonları varlığında 12 saat 40ordmC‟de kaldıktan sonra 80 oranında aktifliğini
korumuştur Enzim pH 80-110 gibi geniş bir aralıkta aktif olarak kalmış ve
pH120‟da aktivitesini 52 oranında korumuştur Enzim Tween 20 Tween 45 Tween
65 Triton X-45 H2O2 ve sodyum perborat gibi kimyasallarla 1 konsantrasyonunda
muamele edildikten sonra enzim aktivitesini sırasıyla 105 82 116 109 135
ve 126 oranlarında koruyabilmiştir
Hmidet ve ark (2009) alkalofilik oumlzellik goumlsteren Bacillus licheniformis NH1
tuumlruumlnuumln beş oumlnemli ekstraselluumller proteaz uumlrettiğini belirlemislerdir Alkalin proteaz iccedilin
optimal pH ve sıcaklığı sırasıyla 100 ve 70ordmC‟de elde etmişlerdir Ham alkalin
proteazın ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlarda kullanımı denenmiştir ve yıkama perfomansı
test edilmiş kan ccedilikolata ve salccedila gibi lekeleri temizlemede başarılı bulunmuştur
Ayrıca saf enzim ccedileşitli katı ve sıvı deterjanlar ile kusursuz bir uyum ve stabilite
goumlstermiştir Ccedileşitli metal iyonlarının enzim aktivitesi uumlzerindeki etkisi incelendiğinde
oumlzellikle Ca2+
Mg2+
ve Cu2+
bdquonin aktiviteyi olumlu etkilediği goumlzlenmiştir Kullanılan
inhibitoumlrler arasında PMSFbdquonin proteaz uumlretimi uumlzerinde guumlccedilluuml bir inhibisyona neden
olduğunu tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
31
Lazim ve ark (2009) Stretomyces sp CN902 ile SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini ve optimizasyonunu gerccedilekleştirmişler Burada ccedileşitli zirai enduumlstriyel atıklar
katı substrat olarak kullanılmış ve en iyi aktivite buğday kepeği ve ezilmiş hurma
ccedilekirdeği karışımında elde edilmiştir Bu iki substratı beraber kullanmaları durumunda
enzim aktivitesi 9050 Ug iken ayrı ayrı kullanıldıklarında buğday kepeğinde 7450 Ug
ezilmiş hurma ccedilekirdeğinde ise 6950 Ug olarak tespit edilmistir 60‟lık başlangıccedil
nem iccedileren ortamda ve 45ordmC‟de 5 guumlnluumlk inkuumlbasyondan sonra enzim uumlretimi
22050 Ug olarak bulunmuştur Optimal pH ise 90‟da goumlzlenmiştir Bu karışıma azot
kaynağı olarak maya oumlzuumltuuml eklendiğinde SSF tekniğiyle enzim uumlretimi 24550 Ug
yuumlkselmiştir Kullanılan karbon kaynaklarının enzim aktivitesi uumlzerine olumsuz etkide
bulunduğunu belirlemişlerdir
Rao ve ark (2009) Bacillus circulansrsquotan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Enzim geniş bir sıcaklık aralığında aktivite goumlsterip optimum
aktivitesi 70ordmC‟de alkalin pH ortamında surfaktanlar ve oksitleyici ajanların bulunduğu
ortamda goumlruumllmuumlştuumlr Enzim iccedilin optimum pH11 olarak tespit edilmiştir Ca2+
Mg2+
ve
Mn2+
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu etkilerken Cu2+
‟nin olumsuz
etkilediğini bildirmişlerdir Enzim bu ortamlarda aktivite goumlsterdiği iccedilin hayvan
derilerindeki kıl tuumly gibi maddeleri temizlemekte ve pamuk ipliklerindeki kan lekelerini
yok ettiği rapor edilmiştir Ayrıca serin proteaz uumlretiminde 1 oranında Tween-20
Triton X-100 ve SDS‟yi enzime ilave ettikten sonra aktivite tayini yapmışlardır Kontrol
ile karşılaştırıldığında Triton X-100 ve Tween 20‟nin enzim aktivitesinde artışa neden
olduklarını tespit etmişlerdir Fakat SDS‟nin enzim aktivitesini olumsuz etkilediğini
goumlzlemlemişlerdir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amycolatopsis sp RSP 3rsquoten ziraindashenduumlstriyel atık
materyallerini kullanarak SSF youmlntemiyle Rifamycin B uumlretmişlerdir Kullanılan katı
substratlardan mısır kabuğu buğday kepeği ve mısır koccedilanına goumlre 4 kat daha fazla
uumlretim gerccedilekleştirmiştir
Rajkumar ve ark (2011) SSF tekniği ile Bacillus sp RRM1 den proteaz uumlretimi
ve karakterizasyonu uumlzerine ccedilalışma yapmışlardır En iyi proteaz aktivitesini buğday
kepeğinde belirlemişlerdir Enzimin 30-60degC sıcaklıkta ve pH 60-12 arasında stabil
olduğunu maksimum aktiviteyi ise 50degC de ve pH 90 da tespit etmişlerdir Na+ Ca
+2
2 KAYNAK OumlZETLERİ
32
ve K+ metal iyonları aktiviteyi arttırırken Hg
+2 Cu
+2 Fe
+2 Co
+2 ve Zn
+2 iyonları ise
aktiviteye neğatif bir etki goumlsterdiğini belirtmişlerdir Enzim aktivitesini EDTA inhibe
ederken Cu+2
iyonun aktiviteyi arttırdığını goumlzlemlemişler ve bu sonuca goumlre proteazın
metaloproteaz olduğunu soumlylemişlerdir
Sevinccedil ve ark (2011) topraktan izole edilen 54 bacillus tuumlruumlnde proteaz uumlretimi
iccedilin tarama yapmışlardır Maksimum proteaz uumlreten bir tuumlr seccedililerek proteaz uumlretimi
iccedilin besi yeri iccedileriğine karbon azot kaynakları metal iyonları eklenerek enzim
uumlretimine etkisi araştırıldı Kullanılan karbon kaynakları arasında fruktozun en fazla
uumlretim potansiyeline sahip olduğu belirlendi En iyi organik azot kaynağı ise skim milk
olarak bulundu Birleştirerek eklenen metal iyonları enzim uumlretimine minimum etki etti
Ca2+
ve Mg2+
kombinasyonu en iyi ortam olduğu tespit edildi Saflaştırılan enzimin
optimum sıcaklığı 55oC ve pH‟sı ise 70 olduğu goumlruumllduuml Stabilite ccedilalışmasında alkalin
pH da 60-90 ve 40deg ve 70degC sıcaklık aralıklarında stabil olduğu bulundu Mn2+
ve Ca2+
iyonları enzim aktivitesini arttırmış SDS-PAGE ile enzimin molekuumller ağırlığı 52 kDa
olarak tespit etmişlerdir
Sedat KAYA
33
3 MATERYAL ve METOT
31 Materyal
311 Kullanılan kimyasal maddeler
Folin-Ciocalteu‟s ayıracı (FCR) tris-hidroksimetilaminometan sodyum
dihidrojen fosfat (NaH2PO4) di sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) sodyum hidroksit
(NaOH) trikloroasetik asit (TCA) Tris-base [Tris (hydroxymetyl)] sodyum sitrat
sodyum-potasyum tartarat MERCK‟ten hidroklorik asit (HCl) ve NaCI Riedel-de
Hean‟dan azocasein SIGMA‟dan temin edilmiştir
3111 Azot kaynakları
Pepton beef extract kazein OXOID‟den amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) Riedel-de Haen‟dan amonyum suumllfat (NH4)2SO4 yeast extract
MERCK‟ ten tryptone DIFCO‟dan temin edilmiştir
3112 Karbon kaynakları
Laktoz sukroz fruktoz ve galaktoz SIGMA‟dan glukoz ve maltoz MERCK‟den
temin edilmiştir
3113 Deterjanlar
Sodyum dodesil suumllfat (SDS) tween-80 MERCK‟ten triton-X100 Sigma‟dan
temin edilmiştir
3114 Metal tuzları
FeSO47H2O CaCl2 ve MgSO47H2O MERCK‟ ten CuSO45H2O Riedel-de
Haen‟dan ZnSO47H2O AnalaR‟dan temin edilmiştir
3115 Besi yeri maddeleri
Nutrient Broth (NB) OXOID‟den yeast extract sodyum kloruumlr (NaCl) tryptone
ve agar MERCK‟ten temin edilmiştir
3 MATERYAL ve METOD
34
312 Kullanılan aletler
İnkuumlbatoumlr (Sanyo) (EN 400)
Steril Kabin ( Telstar AV-100)
Spektrofotometre (UV-VIS SHIMADZU 1240)
Ccedilalkalayıcı (Julobo) (Selecta P)
Soğutmalı Santrifuumlj (Sigma Christ 2K15)
Vorteks (Stuart) (VWR International )
Magnetik Karıştırıcı (Stuart)
Deep-Freeze (Haris -70ordmC)
Etuumlv (Heraus)
Dijital Goumlstergeli Hassas Terazi (GEG AVEY)
Otoklav (HIRAYAMA)
Su Banyosu (Grant 6G -20 +100ordmC)
pH metre (Jenvay 3010 PCP J01 elektrod) (METTLER TOLEDO MP220)
Sterilizatoumlr (Heraus)
Blender (Waring Commercial Laboratory Blender)
313 Biyolojik materyal
Ccedilalışmamızda MicroBioLogics Inc‟ten temin edilen Bacillus licheniformis
ATCC 14580 suşu kullanılmıştır
314 Mikroorganizmaların uumlretimi ve saklanması
Katı besiyerine ekilen bakterilerin stok bakteri kuumlltuumlrleri olarak katı besiyerlerine
ekim yapıldı Ekim iccedilin guumlnluumlk bakteri kuumlltuumlrleri kullanıldı Daha sonraki ccedilalışmalarda
kullanılmak uumlzere bakteri kuumlltuumlrleri +4degC‟de saklandı
Sedat KAYA
35
315 Substrat seccedilimi
Ccedilalışmamızda substrat olarak ccedilevremizdeki tarımsal uumlruumln atıklarından buğday
kabuğu arpa kabuğu pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi
kullanılmıştır
316 Substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml
Ccedilalışmamızda kullanılan bitkisel atıklardan buğday kabuğu arpa kabuğu pirinccedil
kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı ve mısır kuumlspesi oumlğuumltuumllduumlkten sonra 3 farklı
elek (500 1000 ve 1500 μm ccedilaplı) yardımıyla elendi ve kurutuldu Elde edilen farklı
substratlardan 1500 μm ccedilapındaki parccedilalar kullanılıp enzim uumlretimi sağlandı
317 Kullanılan Besiyerleri
Sıvı besiyeri
Luria Broth (LB) 10 g yeast extract 5 g NaCl (Merck) 5 g tryptone 1 litre saf
suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
Nutrient Broth (NB) 8 g Nurtient Broth 1 litre saf suya tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi
sağlandıktan sonra otoklavlandı
Katı besiyeri
10 g yeast extract 5 g NaCl 5 g tryptone ve 15 g agar 1 litre saf suya
tamamlanıp ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
8 g Nutrient Broth (Oxoid) ve 16 g agar (Merck) 1 litre saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
SmF besiyeri
02 g yeast extract 01 g NaCl 01 g tryptone (LB) 100 ml‟lik erlenmayerler
iccedilinde 20 mL saf suya tamamlanıp otoklavlandı
016 g NB 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilinde 20 ml saf suya tamamlanıp
ccediloumlzuumlnmesi sağlandıktan sonra otoklavlandı
3 MATERYAL ve METOD
36
318 SSF besiyeri
Pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu kurutularak blendırdan geccedilirildi Farklı goumlzenek buumlyuumlkluumlğuumlndeki
eleklerden geccedilirilerek 500 1000 ve 1500 μm olmak uumlzere uumlccedil farklı parccedila buumlyuumlkluumlğuumlnde
substratlar elde edildi 1500 μm buumlyuumlkluumlğuumlnde olanlar alınarak 100 ml‟lik erlenmayer
iccedilerisinde hacim 30 olacak şekilde 3 g tartılıp uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu eklendi
121degC‟de 15dk otoklavlanarak steril edildi Soğuduktan sonra 600 nm‟de 06 OD‟ye
gelen bakterilerden 20 inokuumlluumlm besiyerinden katılarak 37degC‟de inkuumlbasyona
bırakıldı
Sedat KAYA
37
32 METOT
321 Mikroorganizma Uumlretimi
Ccedilalışmamızın başında Bacillus licheniformis ATCC 14580 alındı Bakterimizi
katı besiyerine ekimi yapıldı Daha sonra petri kutuları 37degC 24 saat inkuumlbasyona
bırakıldı Katı besiyerinde uumlreyen bakteriler LB ve NB besiyerlerine aktarıldı LB ve
NB besiyerleri 37degC 24 saat boyunca 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı
İnkuumlbasyondan sonra bakteri uumlretimi iccedilin LB ve NB sıvı besiyerleri kullanıldı
Bu besiyerleri 121degC‟de 15 dakika otoklavlanarak steril edildi 250 ml‟lik
erlenmayerlerde 100 ml farklı sıvı besiyeri iccedileren ortamlara 5 ml oumlrnek eklenerek
mikroorganizmalar 06 absorbansa gelecek şekilde 37degC‟de 24 saat suumlreyle uumlretildi
Buradan alınan 05 ml alınarak taze NB besiyerine ekimi yapıldı Ardından 37degC‟de
150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı Bu suumlrelerin
sonunda oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan
arındırıldı Enzim aktivitesi ve optimizasyon ccedilalışmaları iccedilin uumlst sıvı kullanıldı
322 Ccediloumlzeltiler
Ccediloumlzeltilerin hazırlanması
Ccediloumlzeltiler 1 Tampon Ccediloumlzeltilerin Hazırlanması
pH70 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 466 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH80 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris-baz ve 292 ml
01 M HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan
sonra hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH90 01 M Tris- HCl Tamponu 50 ml 01 M Tris- baz ve 57 ml 01 M
HCI hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
pH68 01 M Fosfat Tamponu 245 ml 01 M Na2HPO4 ve 255 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
3 MATERYAL ve METOD
38
pH70 01 M Fosfat Tamponu 30 ml 01 M Na2HPO4 ve 19 ml 01 M
NaH2PO4 hazırlandı Hazırlanan bu ccediloumlzeltiler bir beher iccedilerisinden karıştırıldıktan sonra
hacimleri saf su ile 100 ml‟ye tamamlandı
Alkalin Ccediloumlzeltisi
4 Na2CO3
4 Na-K tartarat
2 CuSO4
Bir beherde 100 ml iccedilin 4 oranında Na2CO3 hazırlandı Ayrı tuumlplerde
hazırlanan Na-K tartarat ve CuSO4 ‟ten 1‟er ml ilave edilerek karıştırıcıda karışmaları
sağlandı Alkalin ccediloumlzeltisi protein miktar tayininde kullanıldı
Azo-kazein hazırlanması
005 gr azokazein 10 ml 01 M Tris-HCl tamponu (pH9) iccedilerisinde ccediloumlzuumlnmesi
sağlanarak hazırlandı
323 SSF Besiyerinde Enzim Ekstraksiyonu
Bakteriyel kuumlltuumlr ortamında bulunan enzimi ekstrakte etmek iccedilin SSF besiyeri
ortamına 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanması sağlandı Bu suumlre
sonunda oumlrnekler steril sargı beziyle suumlzuumllduumlkten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5
dakika santrifuumljlenerek huumlcre sporlardan ve katı atıklardan arındırıldı Suumlpernatant
uumlzerinden proteaz aktivite tayini yapıldı
324 Proteaz Aktivite Tayini
Proteaz aktivite tayini iccedilin 150 μl enzim ccediloumlzeltisine 250 μl 05 azokazein
(01 M Tris-HCI tamponu pH 90) ilave edilerek 37degC‟de 30 dakika inkuumlbe edildi Bu
suumlre sonunda ortama 1 ml TCA katılarak reaksiyon durduruldu 15 dakika +4degC‟de
bekletildikten sonra +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika 10000 rpm de santrifuumlj edildi
1 ml uumlst sıvı uumlzerine 500 μl NaOH ilave edilerek 420 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm ile
gerccedilekleştirildi (Leighton ve ark 1973)
Bir enzim uumlnitesi deney koşullarında 1 μmol azokazeini 30 dakikada parccedilalayan
enzim miktarı olarak tanımlandı
Sedat KAYA
39
325 SSF Besiyerinde Proteaz Uumlretimi
Ccedilalışmamızda pamuk kabuğu mısır kuumlspesi pirinccedil kabuğu buğday kabuğu
arpa kabuğu ve mercimek kabuğu kullanarak SSF besiyeri hazırlamak iccedilin bu
substratlar 3‟er gr tartılarak 100‟lik erlenlere koyuldu Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave
edildikten sonra 121degC‟de 15 dk otoklavlandı
NB besiyerinde uumlretilen stok bakteriler steril ortamda her bir erlene 3 ml ilave
edildi Daha sonra oumlrnekler 37degC ve 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saatte kadar
inkuumlbasyona bırakıldı Ekstraksiyon iccedilin her 24 saattin bitiminden yarım saat oumlnce
oumlrneklere 10 ml ccedileşme suyu daha ilave edilip 30 dk ccedilalkalandıktan sonra SSF
besiyerindeki sıvı kısım suumlzuumllduuml Suumlzuumlntuuml santrifuumlj tuumlpuumlne alınarak soğutmalı
santrifuumljde 10000 rpm‟de 5 dk santrifuumlj edildikten sonra elde ettiğimiz uumlst sıvı
(suumlpernatant) enzim aktivite tayininde kullanıldı
326 Protein Miktar Tayini
Protein miktar tayini standart olarak Bovin Serum Albumin (BSA) kullanılarak
Lowry youmlntemine goumlre yapıldı Standart eğriyi ccedilizmek iccedilin derişimi bilinen
(5 mgml-1) Bovin serum albumin‟den bir seri standart ccediloumlzeltiler hazırlandı Oumlrneklerin
protein iccedilerikleri BSA eğrisi standart olarak kullanılarak hesaplandı
Tuumlplere 25 ml alkalin ccediloumlzeltisi konulduktan sonra uumlzerine 25 μl enzim ve 225 μl
saf su ilave edildi Oumlrnekler 15 dakika 40ordmC‟de su banyosunda bekletildikten sonra
uumlzerine 11 oranında saf suyla seyreltilmiş 250 μl Folin Reaktifi (FCR) ilave edilerek
30 dakika karanlıkta bekletildi Bu suumlrenin sonunda 660 nm‟de spektrofotometrik oumllccediluumlm
yapıldı (Lowry ve ark 1951)
327 Enzimi Uumlretimi Uumlzerine Değişik Parametrelerin Etkisinin İncelenmesi
3271 SmF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Değişik Besiyerlerinin
Etkisi
SmF youmlntemiyle enzim uumlretimi uumlzerine değişik besiyerlerinin etkisini incelemek
iccedilin NB ve LB besiyerlerleri kullanıldı Hazırlanan besiyerlerine 05 bakteri ekimleri
yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de 24 48 72 96 ve 120 saat suumlreyle inkuumlbasyona bırakıldı
3 MATERYAL ve METOD
40
İnkuumlbasyon suumlresi sonunda alınan oumlrnekler +4degC‟de 10000 rpm‟de 5 dakika
santrifuumljlendi ve uumlst sıvılardan proteaz aktivite tayinleri yapıldı
3272 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
Pirinccedil kabuğu pamuk kepeği mısır kuumlspesi buğday kepeği arpa kabuğu ve
mercimek kabuğu her biri ayrı ayrı 3‟er gram tartılarak 100 ml‟lik erlenlere
aktarıldıktan sonra uumlzerlerine ccedileşme suyu eklenip 121degC‟ de 15 dk otoklavlandı
Daha sonra 600 nm‟de 06 ODbdquoye gelen bakterilerden her bir erlene 3‟er ml
ekimi yapılarak 37degC ve 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı elde edilen suumlzuumlntuuml enzim
kaynağı olarak kullanıldı
3273 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin
Etkisi
Farklı partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar alınarak 3‟er gr tartılıp erlenlere
konuldu uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu ilave edilip steril etmek iccedilin otoklavlandı Daha
sonra sıvı besiyerinden (NB) her bir erlene 3‟er ml bakteri ekimi yapıldıktan sonra
37 degC 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Her 24 saatte bir 5 guumln suumlreyle (24 48 72 96
120 saat) oumlrnekler alınıp enzim aktivite tayini yapılarak en uygun inkuumlbasyon suumlresi
belirlendi
3274 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml
bakteri ekimi yapılarak 37degC‟de 150 rpm‟de inkuumlbasyona bırakıldı Enzim uumlretimi
uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek amacıyla proteaz iccedilin 24 saat
sonunda SSF ortamlarına ekstraksiyon kaynakları olarak ccedileşme suyu (kontrol) tampon
(01 M pH90 Tris-HCI tamponu) ccedileşme suyu ile 10 ml olacak şekilde hazırlanan
1 SDS 50 mM NaCl 1 Tween-80 1 Triton X-100 ccediloumlzeltileri ve saf su (10 ml)
eklendikten sonra 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril
sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Uumlst
sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Sedat KAYA
41
3275 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin oumlrnekler 25 30 35
37 40 45 50 55degC‟deki sıcaklıklarda inkuumlbasyona bırakıldı 24 saat bekletildikten
sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık belirlenmeye ccedilalışıldı
3276 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Enzimlerin uumlretimi uumlzerine pH‟ ın etkisini incelemek iccedilin ccedileşme suyunun pH‟sı
pH 4‟ten pH 10‟a kadar 10 birim aralıklarla 01 M HCl ve 01 M NaOH ile ayarlandı
Hazırlanan SSF besiyerlerine ccedileşme suyu eklendikten sonra otoklavlandı Otoklav
sonucunda oumlrneklere 3 ml ekim yapıldı Daha sonra oumlrnekler inkuumlbasyona bırakıldı
3277 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Proteaz uumlretimine etki eden uygun nem miktarını tespit etmek iccedilin SSF
besiyerine besiyeri hacminin 10 20 30 40 50 ve 60 olacak şekilde sırasıyla 1 g
2 g 3 g 4 g 5 g ve 6 g ağırlığında mısır kuumlspesi ilave edildi Uumlzerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenerek otoklavlandı Daha sonra SSF besiyerlerine bakteri ekimi yapılarak
inkuumlbasyona bırakıldı 120 saate kadar her 24 saatte bir oumlrneklerin uumlst sıvısından
aktivite tayini yapıldı
3278 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml ‟lik erlenmayerler iccedilerisine konuldu ve 10 ml
ccedileşme suyu eklenip otoklavlandı Uygun inokuumlluumlm hacminin belirlenmesi iccedilin sıvı
besiyerinden SSF ortamına 1-2-3-4-5-6 ve 8 ml‟ye kadar arttırılarak bakteri ekimi
yapıldı Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Proteaz iccedilin 24 saat sonunda
ekstraksiyon medyumu olarak 10 ml ccedileşme suyu uygun ekstraksiyon ccediloumlzeltisi olarak
eklendi ve 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Bu suumlre sonunda oumlrnekler steril sargı bezlerinde suumlzuumllduumlkten sonra santrifuumljlenen
materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp
proteaz aktivite tayini yapıldı
3279 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
3 MATERYAL ve METOD
42
Mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda katı bitki
atıkları tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konulup otoklavlandı Otoklav işlemi sonrası
her aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarlarda ekim yapıldı ve daha sonra
farklı ccedilalkalama hızlarında (60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakılan
oumlrneklere proteaz iccedilin 24 saatte 10 ml ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyallerin uumlst sıvısından proteaz aktivite tayini yapıldı
32710 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat
Karışımının Belirlenmesi
Enzim uumlretimi uumlzerine kepek karışım miktarını belirlemek iccedilin proteaz iccedilin 24
saat pirinccedil kabukları ile mısır kuumlspesi toplam kuumltleleri 3 g olacak şekilde 05 gram mısır
kuumlspesinden başlanarak (05 g mısır kuumlspesi +25 g pirinccedil kabuğu 1 g+2 g 15 g+15 g
2 g+1 g 25 g+05 g) farklı karışım oranlarında karıştırıldı 3 g tartılan tarımsal atıkların
her biri farklı 100 ml‟lik erlanmayerler iccedilerisine konuldu Uumlzerlerine 10 ml ccedileşme suyu
eklenip otoklavlandı Daha sonra sıvı besiyerinden (NB) her birine 3‟er ml bakteri ekimi
yapıldı
Ccedilalkalayıcıda 37degC‟de 150 rpm‟de ccedilalkalandı Her inkuumlbasyon suumlresi sonunda
SSF ortamlarına 10 ml ccedileşme suyu ilave edilerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı
olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32711 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki
Substratın Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırde oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 1000 ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Elde edilen bu
subtratlardan SSF besiyeri hazırlanarak sterilizasyon ve ekim işlemleri yapıldıktan sonra
inkuumlbasyona bırakıldı Daha sonra enzim aktivitesine bakılarak uygun buumlyuumlkluumlkteki
substrat tespit edildi Ccedilalışmanın bundan sonraki aşamalarda bu buumlyuumlkluumlkteki substrat
kullanıldı
32712 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının
Etkisi
Sedat KAYA
43
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarlarında tartılan farklı karbon
kaynaklarından maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz ve suumlkroz steril edildikten
sonra mısır kuumlspesi daha oumlnceki deney basamağında belirlenen miktarlarda tartılıp
100 ml ‟lik erlenmayerlere 10 ml ccedileşme suyu eklenerek otoklavlanıp SSF besiyerlerine
eklendi Proteaz aktivite tayini iccedilin 2 ml bakteri ekimi yapıldı
Daha sonra proteaz iccedilin 24 saatin sonunda aktivite tayini iccedilin uygun
ekstraksiyon sıvısı (10 ml) ccedileşme suyu eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya devam etti
Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Proteaz iccedilin 24 saatin sonunda elde
edilen uumlst sıvılar enzim kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32713 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Besiyeri ortamlarına 1 olacak şekilde 01 g miktarında tartılan azot
kaynaklarından pepton beef extract kazein amonyum nitrat (NH4NO3) amonyum
klorid (NH4Cl) yeast extract amonyum suumllfat (NH4)2SO4 ve tryptone daha oumlnce tartılıp
hazırlanmış 100 ml‟lik erlenmayerler iccedileresinde bulunan mısır kuumlspesi bulunan SSF
ortamlarına eklenerek otoklavlandı
Otoklav sonrası aktivite tayini iccedilin daha oumlnceden belirlenen miktarda ekim
yapıldı Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32714 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal İyonlarının
Etkisi
Mısır kuumlspesi 3 g tartılıp 100 ml‟lik erlenmayerlere konuldu Daha sonra 01
olacak şekilde FeSO47H2O CuSO45H2O ZnSO47H2O MgSO47H2O ve CaCl2
001 g miktarlarında metal tuzlarından tartıldı ve SSF besiyerlerine eklenip
otoklavlandı Otoklav sonrası proteaz aktivite tayini iccedilin oumlrneklere 2 ml bakteri ekimi
yapıldı
Proteaz iccedilin 24 saat inkuumlbasyona bırakılan oumlrneklere inkuumlbasyon suumlresi sonunda
aktivite tayini iccedilin uygun ekstraksiyon sıvısı (10 ml) eklenerek 30 dakika ccedilalkalanmaya
3 MATERYAL ve METOD
44
devam etti Santrifuumljlenen materyalden uumlst sıvı elde edildi Elde edilen uumlst sıvılar enzim
kaynağı olarak kullanılıp proteaz aktivite tayini yapıldı
32715 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin reaksiyon
başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 ve 90degC‟deki
sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapılarak optimum sıcaklık
belirlenmeye ccedilalışıldı
Sedat KAYA
45
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
41 SSF Ortamında Uygun Substratın Seccedilimi
SSF ortamında buğday kepeği pirinccedil kabuğu mercimek kabuğu pamuk sapı
arpa kabuğu mısır kuumlspesi substrat olarak kullanılarak Bacillus licheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edilmesi sonucu elde edilen proteaz aktivite değerleri Şekil 41‟de
goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Pirinccedil
Kab
uğu
Mer
cim
ek K
abuğ
u
Mıs
ır K
uumlspe
si
Arp
a K
abuğ
u
Buğ
day
Kab
uğu
Pam
uk K
abuğ
u
Sp
esif
ik A
ktiv
ite(
Um
g
24
48
72
96
120
Şekil 41 Uygun Substratın Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin farklı bitki atıklarının bulunduğu SSF
ortamlarında 120 saat kadar uumlretilmesiyle ilgili sonuccedillara goumlre maksimum proteaz
uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg olarak oumlğuumltuumllmuumlş mısır kuumlspesinin bulunduğu
ortamda elde edilmiştir Bunun dışındaki inkuumlbasyon suumlrelerinde proteaz aktivite
değerleri 24 saate goumlre daha duumlşuumlk bulunmuş ve en duumlşuumlk proteaz uumlretimi pamuk
kabuğunda elde edilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
46
42 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Uygun inkuumlbasyon suumlresini tespit etmek iccedilin 24 saatten 120 saate kadar ilk
oumlrnek 24 saatte alındıktan sonra her 24 saatlik suumlrelerde Blicheniformis ATCC
14580‟nin kuumlltuumlr edildiği ortamlardan oumlrnekler alınıp proteaz aktivite tayini yapıldı
Bulunan değerler Şekil 42‟de goumlsterilmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamlarında en yuumlksek proteaz uumlretimi 24 saatte 1401905 Umg
olarak gerccedilekleşmiştir Proteaz aktivitesinin diğer inkuumlbasyon suumlrelerinde 24 saatte
goumlre azaldığı belirlenmiştir
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
12 24 48 72 96 120
Zaman
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
um
g)
Şekil 42 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnkuumlbasyon Suumlresinin Etkisi
Sedat KAYA
47
43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemede uygun katı
substratların bulunduğu SSF ortamlarının her biri iccedilin ayrı ayrı 10 ml 50 mM NaCl
1 TritonX100 1 SDS 1 Tween-80 saf su Tris-HCI pH90 tamponları ve ccedileşme
suyu (kontrol) eklenerek elde edilen uumlst sıvılar proteaz aktivitesi iccedilin enzim kaynağı
olarak kullanıldı
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
Saf su
Ccedileş
me
suyu
NaC
I
Tris-
HCl p
H9
SDS
Tw
een-
80
Trit
onX
100
Ekstraksiyon ortamı (10 ml)
Sp
esif
ik A
kti
vit
e (U
mg
)
Şekil 43 SSF Ortamında Uygun Ekstraksiyon Ortamının Tespiti
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında eklenen 10 ml ccedileşme suyunun diğer ekstraksiyon
ortamlarına goumlre daha yuumlksek oranda proteaz uumlretimi (132639 plusmn 674 Umg) meydana
getirdiği belirlendi SDS ekstraksiyon medyumu olarak kullanıldığı ortamda en duumlşuumlk
proteaz uumlretimine rastlanıldı
44 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580 mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı
SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini belirlemek iccedilin
SSF besiyerleri 25 30 35 37 40 45 50 ve 55ordmC‟de inkuumlbasyona bırakıldı Proteaz
aktivitesi incelendiğinde en uygun proteaz uumlretim sıcaklığı 37ordmC (136807 plusmn 967 Umg)
olarak tespit edildi Bulunan değerler şekil 44‟te goumlsterilmiştir
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
48
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 30 35 37 40 45 50 55
İnkubasyon sıcaklıgı (degC)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 44 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
45 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine pHrsquoın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği ortamda proteaz uumlretimi iccedilin
mısır kuumlspesi katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamında pH40 ile başlayan
ortamda proteaz uumlretiminde giderek bir artış goumlzlenmiş ve en uygun uumlretim pH‟sı 80
(134223 plusmn 128 Umg) olarak belirlenmiştir (Şekil 45)
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
4 5 6 7 8 9 10pH
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 45 Enzim Uumlretimi Uumlzerine pH‟ın Etkisi
Sedat KAYA
49
46 SSF Ortamında Uygun Nem Miktarının Seccedilimi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kullanıldığı SSF ortamında proteaz uumlretimi
iccedilin en uygun substrat miktarı olarak 30‟luk (3 g) mısır kuumlspesinin kullanıldığı
ortamda proteaz uumlretimi 135542plusmn174 Umg olarak belirlendi Kepek miktarı
arttırıldığında proetaz aktivitesinin aşamalı olarak duumlştuumlğuuml goumlruumllduuml Ccedilalışmada elde
edilen sonuccedillar Şekil46‟da verilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
10 20 30 40 50 60 70
Nem seviyesi ()
Sesi
fik
ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 46 Uygun Nem Miktarlarının Seccedilimi
47 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 plusmn 451 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
50
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1 2 3 4 5 6 8
İnokulum (ml)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 47 Enzim Uumlretimi Uumlzerine İnokuumlluumlm Hacminin Etkisi
48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin mısır kuumlspesi farklı ccedilalkalama hızlarında
(60- 100- 120- 150- 180 ve 200 rpm) inkuumlbasyona bırakıldı Maksimum proteaz uumlretimi
iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 plusmn 972 Umg) olarak tespit edildi
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
60 100 120 150 180 200
Ccedilalkalama hızı (rpm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 48 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Ccedilalkalama Hızının Etkisi
Sedat KAYA
51
49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının
Belirlenmesi
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneyde maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin 25 g mısır kuumlspesindash05 g pirinccedil
kabuğunun (120606 plusmn 178 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında
maksimum enzim uumlretimleri gerccedilekleşmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
25 g pk +
05 g mk
20 g pk + 10
g mk
15 g pk + 15
g mk
10 g pk + 20
g mk
05 g pk+ 25
g mk
Mısır
Kuumlspesi 3 g
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 49 Enzim Uumlretimi Uumlzerine En İyi Aktivite Goumlsteren Substrat Karışımının Belirlenmesi
mk Mısır kuumlspesi pk Pirinccedil kabuğu
410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın
Etkisi
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş tarımsal atıklar blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra 3 farklı elek yardımıyla (500 microm 1000 microm ve 1500 microm ccedilaplı) elendi Farklı
partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Şekil 410‟da da
goumlruumllduumlğuuml gibi en fazla enzim uumlretiminin en buumlyuumlk partikuumll buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta
1500 microm‟de (139879 plusmn 984 Umg) olduğu belirlendi
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
52
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
500 1000 1500
Parccedila buumlyuumlkluumlğuuml (microm)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil410 Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Partikuumll Buumlyuumlkluumlğuumlndeki Substratın Etkisi
411 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları (1 maltoz glukoz galaktoz fruktoz laktoz
suumlkroz) ilave edilmiştir Maksimum proteaz uumlretimi galaktozun bulunduğu ortamda
(139006 plusmn 182 Umg) olarak tespit edildi
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarının galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Glukoz Galaktoz Fruktoz Maltoz Laktoz Sukroz
Karbon Kaynakaları (1)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 411 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Karbon Kaynaklarının Etkisi
Sedat KAYA
53
412 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Azot Kaynaklarının
Etkisi
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı organik ve inorganik azot kaynakları (1 kazein pepton tripton
maya oumlzuumltuuml amonyum nitrat amonyum suumllfat amonyum klorid ve et oumlzuumltuuml) ilave
edilmiştir Azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
aktivitesini kontrole goumlre artırmıştır Elde edilen sonuccedillar şekil 42‟de goumlsterilmiştir
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
Kon
trol
Et oumlzuuml
tuuml
Kaz
ein
Pepto
n
Tripto
n
May
a oumlz
uumltuuml
Am
onyu
m n
itrat
Am
onyu
m suumll
fat
Am
onyu
m k
lorid
Azot Kaynakları (1)
Spes
ifik
Akti
vit
e (U
mg)
Şekil 412 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Azot Kaynaklarının Etkisi
413 SSF Ortamında Enzim Uumlretimi Uumlzerine Farklı Metal Tuzlarının Etkisi
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen
01 konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen
Blicheniformis ATCC 14580‟nin uumlretildiği MgSO47H2O (148848 plusmn 497 Umg)
ortamında maksimum proteaz uumlretimi kontrole goumlre daha fazla olduğu tespit edildi
Metal tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi inhibe
edilmiştir (Şekil 43)
4 ARAŞTIRMA BULGULARI
54
000
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Kontrol Kalsiyum kloruumlr Magnezyum
suumllfat
Ccedilinko suumllfat Demir suumllfat Bakır suumllfat
Metal Tuzları ( 01)
Sp
esi
fik
Ak
tiv
ite (
Um
g)
Şekil 413 Proteaz Uumlretimi Uumlzerine Metal Tuzlarının Etkisi
414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Blicheniformis ATCC 14580‟nin mısır kuumlspesinin katı substrat olarak
kullanıldığı SSF ortamında kuumlltuumlr edildi Proteaz aktivitesi uumlzerine sıcaklığın etkisini
belirlemek iccedilin reaksiyon başlatıldıktan sonra oumlrnekler 15 20 25 30 35 40 45 50
60 70 80 ve 90degC‟deki sıcaklıklarda 30 dk bekletildikten sonra aktivite tayini yapıldı
Optimum aktivite sıcaklığı 70degC‟de tespit edildi Bulunan değerler şekil 414‟te
goumlsterilmiştir
0
20
40
60
80
100
120
15 20 25 30 35 40 45 50 60 70 80 90
Sıcaklık (degC)
Roumlla
tif
Akti
vit
e
Şekil 414 Enzim Aktivitesi Uumlzerine Sıcaklığın Etkisi
Sedat KAYA
55
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
Katı faz fermentasyonu yıllardır bilinen bir teknik olmasına rağmen son yıllarda
oumlnem kazanmaya başlamıştır (Botella ve ark 2005) Bu işlem tarımsal atıkların doğal
formlarında kullanılabildiğinden ve atıkların birikimi sonucu oluşan ccedilevresel problemler
azaldığından dolayı da avantajlıdır
Bu ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnden tarımsal atıkların substrat
olarak kullanıldığı katı substrat fermantasyon tekniği ile proteaz uumlretimi incelenmiştir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin tercih edilmesinin nedeni değişik ekstraseluumller
enzimleri sentezleyebilme ve bu enzimleri ccedilok miktarlarda salgılama yeteneğinde
olması ve buumlyuumlme gereksiniminin basit oluşudur En oumlnemli avatanjlarından biri de
kuşkusuz bir ccediloğunun patojen olmamasıdır (Jose ve Kurup 1999)
Katı faz fermantasyonunda mikroorganizmalar nemli katı bir yuumlzey uumlzerinde
gelişir ve ortamda bulunan serbest hava kullanılır Boumlylece fermantasyon ortamı ideal
olarak bazı mikroorganizmalardan belirli metabolitleri elde etmek iccedilin uygun olan doğal
bir buumlyuumlme ortamına benzer hale gelmektedir (Pandey 2008)
SSF‟te fermantasyon suumlreci iccedilin uygun katı substrat seccedilimi oldukccedila oumlnemli bir
faktoumlrduumlr Bu yuumlzden mikrobiyal buumlyuumlme ve uumlruumln eldesi iccedilin ccedilok sayıda tarımsal sanayi
atıkları kullanılmaktadır SSF‟te kullanılan başlıca substratlar daha oumlnceki ccedilalışmalarda
da belirtildiği gibi genellikle pirinccedil buğday darı arpa mısır soya fasulyesi gibi youmlresel
olarak farklı kullanım oranları goumlsteren sanayi ve tarımsal atıklardır (Pandey 2006)
Ccedilalışmamızda SSF youmlntemiyle Blicheniformis ATCC 14580 tuumlruumlnuumln proteaz
uumlretimi incelenmiştir Farklı tarımsal atıkların bulunduğu SSF ortamlarında kuumlltuumlr
edilen Blicheniformis ATCC 14580 en iyi proteaz uumlretimini mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamlarda gerccedilekleştirmiştir Kullanılan tarımsal atıklar karbonhidratlarca
zengin olması oumlnemli oranda vitamin ve mineral madde iccedilermeleri
mikroorganizmaların uumlremesini kolaylaştırmış ve enzim uumlretme kapasitelerini arttırmış
olabilir
Mahalaxmi ve ark (2010) Amcolatopsis sp RSP suşunu kullanarak SSF
youmlntemiyle Rifamycin Bbdquoyi uumlretmek iccedilin ccedileşitli tarımsal ve zirai atık kullanmışlardır En
iyi uumlretimi mısır kabuğundan elde etmişler Mukherjee ve ark (2008) termofilik
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
56
Bacillus subtilis kullanarak SSF youmlntemiyle alkalin proteaz uumlretmek iccedilin yaptığı
ccedilalışmada en iyi proteaz aktivitesini patates kabuğu ve Impereta cylindrica ccedilimeninde
elde etmişlerdir Joo ve ark (2004) Bacillus sprsquoden SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretimini gerccedilekleştirmek iccedilin en iyi enzim aktivitesini buğday unundan elde
etmişlerdir
Mikrobiyal metabolizma kompleks bir suumlreccedil olup fermantasyon ve ortam
bileşenleri tarafından etkilenir Maksimum enzim uumlretimi gerccedilekleşen inkuumlbasyon
suumlrelerinden sonra enzim aktivitelerinde goumlruumllen azalmaların nedeni fermantasyon
ortamında bulunan diğer bileşenler ile meydana gelen enzim etkileşimleri sonucunda
enzim yapısında oluşan konformasyonel değişiklik ve meydana gelen denatuumlrasyondan
kaynaklı olabilir Bunun yanında ortama salgılanan diğer hidrolitik enzimlerin etkisi
sonucu enzim uumlretiminde azalma meydana gelmiş olabilir (Hamilton ve ark 1997)
Bu ccedilalışmada B licheniformis ATCC 14580 katı substrat olarak mısır kuumlspesinin
bulunduğu ortamda kuumlltuumlr edildiklerinde maksimum proteaz aktivitesi 24 saatte
1401905 Umg olarak elde edilmiştir (Şekil 41) Elde ettiğimiz sonuccedillar daha oumlnceki
ccedilalışmalarla paralellik goumlstermektedir (Pandey 2006 Uyar ve Baysal 2004)
Mehrotra ve ark (1999) Bacillus sprsquoden alkalin proteaz uumlretimi sırasında
enzimdeki maksimum aktivitenin 20 saatte olduğunu raporlamışlardır Mehta ve ark
(2006) alkalofilik actinomycete‟den alkalin proteaz uumlretiminde SSF youmlntemiyle
kullandıkları katı substratlardan en yuumlksek aktiviteyi 32 saatte elde etmişlerdir
Ekstraksiyon fermente olmuş biyokuumltleden enzim elde etmek iccedilin oumlnemlidir ve
bundan dolayı uygun bir solvent seccedilimi gereklidir Ekstraksiyon işlemi iccedilin duumlşuumlk
solvent hacmi kullanılırsa total aktivitede azalma goumlzlenir ve bu yetersiz solvent hacmi
fermente olmuş katı substrat kuumltlesine yeterince nuumlfus edemez (Swain ve Ray 2007)
Uygun ekstraksiyon sıvısı seccedilimi enzim elde etme aşamasında maliyeti azaltan oumlnemli
bir farktoumlrduumlr
Enzim uumlretimi uumlzerine ekstraksiyon ortamının etkisini belirlemek iccedilin katı
substrat olarak mısır kuumlspesinin kullanıldığı SSF ortamında en yuumlksek proteaz aktivitesi
ekstraksiyon ortamı olarak ccedileşme suyunda (132639 Umg ) elde edilmiştir Ccedileşme
suyunun mineral madde bakımından zengin olması mikroorganizmanın enzim uumlretme
yeteneğini arttırmış olabilir (Priest ve ark 1994 Chellappan ve ark 2006) SSF‟te
Sedat KAYA
57
amaccedillanan enzim uumlretimi iccedilin oluşturulacak ortamın uumlretim maliyetini azaltmak oldukccedila
oumlnemlidir
Kumar ve Takagi (1999) Bacillus sp‟dan SSF youmlntemiyle alkalin proteaz
uumlretiminde aktivitenin en fazla Tween-20‟de olduğunu SDS‟nin ise proteaz
aktivitesinde azalmaya neden olduğunu tespit etmişlerdir (Akcan 2009)
Enzim uumlretimi uumlzerine sıcaklığın etkisini incelemek iccedilin yaptığımız ccedilalışmada
proteaz iccedilin maksimum enzim uumlretimi 37degC‟lik (136807 Umg) inkuumlbasyon ortamından
elde edilmiştir Sıcaklık 45degC‟den sonra ani bir duumlşuumlş goumlzlenmiştir Daha oumlnce yapılan
ccedilalışmalarda da benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Hamilton ve ark 1997 Jin ve ark
1990) Bunun yanında yapılan ccedilalışmalarda uygun inkuumlbasyon sıcaklıkları 25degC ile
45degC arasında değişiklik goumlstermektedir (Oberoi ve ark 2001 Ferrero ve ark 1996
Gangadharan ve ark 2006)
SSF‟te sıcaklık kontroluumlnuumln ccedilok oumlnemli olduğu ve mikroorganizmanın
gelişebilmesi enzim ya da metabolitleri uumlretebilmesinin ortam sıcaklığıyla yakından
ilişkili olduğu belirtilmektedir (Sodhi ve ark 2005) Genellikle katı substrat
fermantasyonunda ortam sıcaklığı 25-37ordmC aralığında değişmektedir ve
mikroorganizmaların buumlyuumlme kinetiğine bakıldığında sıcaklığa bağlı olarak bu sıcaklık
aralıklarında kararlı kaldığı belirtilmektedir (Krisha ve Chandrasekaran 1996)
Maksimum enzim uumlretimi 37degC‟de yapılan deneylerde elde edilmiştir ve bu sıcaklık
literatuumlrde belirtilen sıcaklık değerlerine oldukccedila yakındır
İnkuumlbasyon suumlrelerinden sonra ortamda oluşmaya başlayan sekonder
metabolitlerin enzimin denatuumlrasyonuna neden olup enzim miktarında duumlşuumlşe yol
accediltığını duumlşuumlnmuumlşlerdir (Johnvesly ve Naik 2001) Kullanılan bakterinin buumlyuumlme hızı
ve enzim uumlretme oumlzelliğinin inkuumlbasyon suumlresini etkilediğini soumlylemişlerdir (Uyar ve
Baysal 2004) Aynı zamanda inkuumlbasyon suumlrelerinin farklı olması ccedilalışmalarda
kullanılan mikroorganizma oumlzelliklerinin farklı olması ve katı substratların iccedilerdikleri
besin maddelerinin farklı olmasından kaynaklandığı duumlşuumlnuumllmektedir Sıcaklık
biyokimyasal reaksiyon oranlarını etkiler ve SSF‟te oumlnemli bir parametredir ancak
kontroluuml SmF‟den daha zor olduğu belirtilmiştir (Mitchell ve ark 2008)
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
58
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamlarının başlangıccedil
pH‟sı 40-100 değerleri arasında maksimum proteaz iccedilin pH80 (134223 Umg) olarak
tespit edilmiştir (Şekil 45)
pH ccedileşitli metabolik aktiviteler uumlzerinde etki goumlstererek huumlcre zarından geccedilen
bazı bileşikleri etkileyen her fermantasyon işleminde goumlz oumlnuumlnde bulundurulması
gereken oumlnemli bir faktoumlrduumlr (Battal 2004) Enzimler pH‟a karşı oldukccedila duyarlıdırlar
Enzimler protein yapısında olduklarından dolayı enzimin primer ve sekonder yapısını
oluşturan aminoasitlerin iyonlaşması pH‟tan etkilenir Bu durum enzim aktivitesine de
etki eder pH‟ta meydana gelen herhangi bir değişiklik protein yapısında anlamlı
değişikliklere yol accedilar pH enzimlerin aktivasyon ve inaktivasyonunda oumlnemli bir rol
oynar Her enzim maksimum enzim aktivitesi iccedilin optimum bir pH değerine sahiptir
Mikrobiyal buumlyuumlme ve metabolizma hidrojen iyon dengesini ve dolayısıyla
kuumlltuumlr ortamının pH‟ını bozar (Pedersen ve Nielsen 2000) Proteaz uumlretimi uumlzerine
başlangıccedil pH‟sı etkisi ile ilgili elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarla paralellik
goumlstermektedir (Olajuyigbe ve Ajele 2005)
Proteazlarda oumlzellikle alkalin olanlar iccedilin genellikle pH80 ve uumlzeri olarak rapor
edilmiştir Ccedilalışmamızda proteaz uumlretimi iccedilin uygun başlangıccedil pH‟ı 80 olarak tespit
edilmiştir Serin proteazların (EC 3421) bir alt tipi olan ldquoalkalin proteazlarrdquo yuumlksek
pH değerlerinde ve yuumlksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan
enduumlstrisi olmak uumlzere deri gıda ipek ve kacircğıt enduumlstrilerinde yaygın şekilde
kullanılmaktadır (Abu Sayem ve ark 2006)
Mehta ve ark (2006) izole ettikleri haloalkalofilik Bacillus sp‟den proteaz
aktivitesini incelemişler ve pH80 ve 90‟da maksimum uumlretimin gerccedilekleştiğini tespit
etmişlerdir
Yapılan bir ccedilalışmada sterilizasyon iccedilin otoklavlanan oumlrneklerin başlangıccedil
pH‟larının farklı olmasına rağmen oumlrneklerin aynı pH oumlzelliği goumlsterdiği tespit
edilmiştir Bunun uumlzerine ccedilalışmada katı substrat olarak kullanılan subtratın iccedilerdiği
yuumlksek yapıdaki proteinlerden (yaklaşık 60) dolayı bu proteinlerin tampon olarak
goumlrev yaptığını duumlşuumlnmuumlşler (Souza ve ark 2008)
Kumar ve Takagi (1999) alkali proteazların optimum pH aralığı genellikle 90-
110 olarak rapor edilmiştir Bununla birlikte pH 60-125 değerleri arasında aktivite
Sedat KAYA
59
goumlsteren alkali proteazlar da bulunmakta olup geniş bir pH aralığında aktivite yeteneği
alkali proteazların farklı enduumlstriyel alanlarda kullanılmasına olanak sağlamaktadır
Cheng ve ark (1995) Bacillus licheniformis PWD-1 suşundan optimum pH
değerinin 85 olduğunu accedilıklamışlardır Kazan ve ark (2005) ise Bacillus clausi
GMBAE 42‟den uumlretilen proteazın maksimum aktivite pH‟sının ise 113 olduğunu
belirtmişlerdir
Blicheniformis ATCC 14580‟nin kuumlltuumlr edileceği SSF ortamına katı substrat
olarak eklenen substrat miktarının (nem) proteaz uumlretimi uumlzerine etkisini belirlemek iccedilin
yapılan ccedilalışmada en yuumlksek proteaz aktivitesi 30‟luk (3 g ve 135542 Umg) substrat
miktarında olduğu tespit edilmiştir (Şekil 46) SSF tekniği kullanılarak yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda kullanılan substrat miktarları farklı değerlerde (15 20 70 ve 85) rapor
edilmiştir (Krisha ve Chandrasekaran 1996 Kunamneni ve ark 2005 Kokab ve ark
2003) Elde ettiğimiz sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
Uyar ve Baysal (2004) Bacillus sp‟den proteaz uumlretmek iccedilin buğday kabuğunda
nem oranını 30 mercimek kabuğunda ise 40 olarak raporlamışlar
Ortamın nem iccedileriğindeki değişimler fermantasyon suumlresince havalandırma ve
metabolik aktivitelerde değişimlere yol accedilar bu yuumlzden SSF işleminde nem oranını
optimize etmek oldukccedila oumlnemlidir (Baysal ve ark 2003) Ortamın nem iccedileriğinin de
değiştiği bu deneylerde duumlşuumlk substrat konsantrasyonlarında enzim uumlretiminin duumlşuumlk
olduğu goumlruumllmuumlştuumlr Kepek miktarı azlığında ortamda substrat az olacağından uumlreme ve
enzim uumlretimi de yavaş olacaktır Substrat miktarı belli bir miktarın uumlzerine ccedilıktığında
ise mikroorganizmalar iccedilin havalandırmanın guumlccedilluumlğuuml su oranının duumlşmesi gibi
nedenlerden dolayı enzim uumlretimi de azalmış olabilir
Enzim uumlretimi uumlzerine inokuumlluumlm hacminin etkisini belirlemek iccedilin yapılan
ccedilalışmada Blicheniformis ATCC 14580‟den en yuumlksek proteaz uumlretimi iccedilin uygun
inokuumlluumlm hacmi 20 ml (133976 Umg) olarak tespit edilmiştir (Şekil 47)
Araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda kullanılan mikrooganizma ve
substrat tuumlruumlne bağlı olarak inokuumlluumlm hacimleri farklı değerlerde ( 10 20 25 ve 30)
bildirilmiştir (Kunamneni ve ark 2005 Chutmanop ve ark 2008) Elde ettiğimiz
sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalar ile paralellik goumlstermektedir
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
60
İnokuumlluumlm seviyesindeki artış genelde organizmanın buumlyuumlmesi ve buumlyuumlme ile
ilgili aktiviteleri belirli oranda arttırmaktadır İnokuumlluumlm seviyesindeki artış besin
azlığından dolayı mikrobiyal aktivitede azalmaya neden olabilir Duumlşuumlk inokuumlluumlm
hacmi uumlretim ortamındaki huumlcrelerin sayısında azalmayla sonuccedillanabilir Bu istenen
uumlruumln oluşumu ve substrat kullanımı iccedilin daha fazla zaman gereksinimine yol accedilar
(Kunamneni ve ark 2005) Yuumlksek miktarda bakteri ekimi nem seviyesini arttırarak
yuumlzeyde emilmeyen bir tabaka oluşumuna ve difuumlzyon bariyeri gibi goumlrev yapmasına ve
katı substratın olumsuz etkilenmesine yol accedilar Bu durum mikrobiyal aktiviteyi
azaltacağından enzim uumlretiminde duumlşuumlşe yol accedilabilir (Kunamneni ve ark 2005
Chutmanop ve ark 2008)
Uyar ve Baysal (2004) ettikleri Bacillus sp‟den enzim uumlretimi iccedilin en uygun
inokulum hacminin 20 olduğunu Prakasham ve ark (2006) ise alkalofilik Bacillus
sp‟yi kullanarak enzim uumlretiminde optimum inokuumlluumlm oranını 30 olarak tespit
etmşlerdir
Yaptığımız ccedilalışmada SSF ortamlarında Blicheniformis ATCC 14580‟den
maksimum proteaz uumlretimleri iccedilin uygun ccedilalkalama hızı 150 rpm (133158 Umg)
olarak tespit edilmiştir (Şekil 48) Elde ettiğimiz bu sonuccedil oumlnceki ccedilalışmalar ile
paralellik goumlstermektedir (Larson ve ark 1994 Swain ve Ray 2007) Ccedilalışmamızda
60 100 120 180 ve 200 rpm de yapılan deney sonuccedillarında ise enzim uumlretiminin
azaldığı belirlenmiştir Bu sonuccedil derin fermantasyona goumlre daha viskoz olan katı
substratın kullanıldığı ortamda duumlşuumlk karıştırma hızında oksijen transferi sınırlanmakta
yuumlksek karıştırma hızlarında ise mikroorganizmanın gelişmesi olumsuz youmlnde
etkilenmektedir Duumlşuumlk karıştırma hızında enzim aktivitesindeki azalma
fermantasyonun oksijen sınırlandırmasından veya katı substrata bağlı besinlerin ortama
yeterince geccedilememesinden kaynaklanabileceğini goumlstermektedir
Mikroorganizmalardan enzim optimizasyonu ccedilalışmalarında ccedilalkalama hızları
farklılık goumlstermektedir Bunun yanında diğer araştırmacılar tarafından yapılan oumlnceki
ccedilalışmalarda enzim uumlretimi iccedilin uygun ccedilalkalama hızları 120 150180 200 ve 250 rpm
olarak tespit edilmiştir (Uyar ve Baysal 2004 Chutmanop ve ark 2008) Fermantasyon
sisteminde ccedilalkalama sistemdeki homojeniteyi arttırır ve gradiyentleri bozar Bakteri
huumlcreleri substrat yuumlzeyine sıkıca bağlanmadıklarından ccedilalkalama ile başlıca hava
Sedat KAYA
61
akımıyla ilişkili biyokuumltle engeli ortadan kaldırılabilir Karmaşık molekuumlller olan
enzimleri mekanik guumlce duyarlıdırlar ve uygun olmayan ccedilalkalama hızlarında enzim
denatuumlrasyonu meydana gelebilir (Kunamneni ve ark 2005) Duumlşuumlk ccedilalkalama hızı
fermantasyon ortamında organizmanın buumlyuumlmesi ve enzim uumlretimi iccedilin gerekli olan
zayıf havalandırma oranına neden olabilir
Joo ve ark (2004) alkalofilik Bacillus sp 103 bakterisinden ekstraselluler
alkalin proteaz uumlretiminde maksimum enzim aktivitesi elde etmek iccedilin
mikroorganizmayı 250 rpm bdquode tespit etmişler B Elibol ve Moreira (2005) SSF
koşulları altında Teredinobacter turnirae maksimum proteaz uumlretimini 120 rpm
ccedilalkalama oranında gerccedilekleştirilmiştir
SSF ortamında en iyi aktivite veren substrat karışımlarının kullanılması ile
yaptığımız deneylerde maksimum proteaz uumlretimi iccedilin 25 mısır kuumlspesi - 5 pirinccedil
kabuğunun (120606 Umg) substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarında maksimum
enzim uumlretimi gerccedilekleşmiştir (Şekil 49)
Yapılan oumlnceki ccedilalışmalarda farklı tarım atıkları farklı oranlarda karıştırılarak
SSF ortamında substrat olarak kullanılmış ve benzer sonuccedillar elde edilmiştir (Uyar ve
Baysal 2004 Gangadharan ve ark 2006 Chutmanop ve ark 2008 Murthy ve ark
2009 Tanyıldızı ve ark 2007)
Ccedilalışmamızda kullandığımız kurutulmuş bitkisel atıkları blendırda oumlğuumltuumllduumlkten
sonra substratlar SSF besiyerinde kullanıldı Maksimum enzim uumlretimi en buumlyuumlk
partikuumll (1500 microm) buumlyuumlkluumlğuumlndeki substratta (139879 Umg) olduğu belirlendi (Şekil
410)
Mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin substrat parccedila buumlyuumlkluumlğuuml oldukccedila oumlnemlidir Genel
olarak kuumlccediluumlk substrat parccedilacıkları mikrobiyal buumlyuumlme iccedilin geniş bir yuumlzey alanı sağlar
ve bu nedenle arzu edilen bir faktoumlr gibi duumlşuumlnuumlluumlr Bununla birlikte ccedilok kuumlccediluumlk substrat
parccedilacıkları substrat yığını oluşturabilir bu gibi hallerde en ccedilok mikrobiyal solunum
havalanmayı engelleyen ve bu nedenle zayıf huumlcresel buumlyuumlme meydana getiren olay
goumlruumlluumlr (Barrios-Gonzalez ve ark 1993 Liu ve Tzeng 1999) Buna karşın daha buumlyuumlk
partikuumlller kullanıldığında iccedil kısımdaki parccedilalar arasındaki alan arttığından buumlyuumlk
parccedilacıklar daha etkili solunumhavalanmayı sağlayabilir ancak mikrobiyal buumlyuumlme
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
62
iccedilin sınırlı bir alan oluşmasına neden olur Bu nedenle belirli bir SSF işleminde parccedila
buumlyuumlkluumlğuumlnuuml belirlemek oldukccedila oumlnemlidir (Graminha ve ark 2008)
Genel olarak mikroorganizmaların meydana getirdiği proteazlar doğada temel ve
kısmen birccedilok kuumlltuumlr şartlarında induumlklenirler Mikroorganizmaların uumlrettiği
ekstraseluumller proteazlar aynı zamanda CN oranındaki farklardan glukoz gibi kolay
metabolize edilen şekerler ve metal iyonları gibi ortam bileşenlerinden yoğun şekilde
etkilenirler (Varela ve ark 1996 Beg ve ark 2003) Karbon ve azot kaynakları
bakterilerin uumlremeleri uumlzerinde oumlnemli etkiye sahiptir Mikroorganizmaların enzim
sentezi kuumlltuumlr ortamında bulunan farklı aminoasit ve azot kaynaklarının bulunup
bulunmaması ile ilişkilidir
Genelde birccedilok mikroorganizma huumlcresel fonksiyonlarını sağlamak biyokuumltle
formasyonu ve metabolit uumlretimi iccedilin bir karbon kaynağına ihtiyaccedil duyarlar Bakteriyel
tuumlrler proteaz uumlretimi sırasında karbon kaynağı tuumlruumlne ve konsantrasyonuna goumlre farklı
tepkiler verirler Ortama eklenen karbon kaynakları mikroorganizmaların
beslenebilmeleri uumlremeleri ve enerji uumlretebilmeleri iccedilin gereksinim duydukları en
buumlyuumlk besin kaynağıdır
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmaların kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına farklı karbon kaynakları ilave edilmiştir İncelenen proteaz aktivite
değerlerinde galaktoz (139006 Umg) bulunan ortamlarda proteaz uumlretiminde artış
goumlzlenmiştir Benzer sonuccedillar oumlnceki ccedilalışmalarda da mevcuttur (Naveena ve ark 2005
Mukherjee ve ark 2009)
Kuumlltuumlr ortamına eklenen karbon kaynaklarından galaktoz dışında hiccedilbiri proteaz
uumlretiminde arttırıcı rol oynamamıştır SSF ortamına eklenen karbon kaynaklarından
kontrole goumlre galaktoz 110 proteaz uumlretimini artırmıştır (Ccedilizelge 41)
Proteaz uumlretimi ortamdaki azot ve karbon kaynaklarının varlığına sıkı bir şekilde
bağlıdır Azot ve karbon kaynaklarının her ikisi de enzim sentezi uumlzerinde regulatoumlr
etkiye sahiptir (Patel ve ark 2005 Moon ve Parulekar 1991) Ortamdaki azot oranı az
olunca bu oran enzim uumlretimi iccedilin yetersiz gelmektedir Bununla birlikte azot oranındaki
fazlalık enzim uumlretiminde inhibisyona neden olabilir (Kole ve ark 1988)
Yaptığımız ccedilalışmada kullandığımız mikroorganizmanın kuumlltuumlr edildiği SSF
ortamlarına azot kaynakları arasında amonyum klorid 105 ve et oumlzuumltuuml 111 proteaz
Sedat KAYA
63
aktivitesini kontrole goumlre arttırdığı tespit edilmiştir Elde edilen sonuccedillar ccedilizelge 42‟de
goumlsterilmiştir
Organik azot kaynaklarından (amonyum klorid ve et ekstraktı) bakteriyel
suşlarda maksimum enzim uumlretimi sağladığı yapılan birccedilok ccedilalışmada ifade
edilmektedir (Jin ve ark 1990 Cheng ve ark1995) Et oumlzuumltuuml ve amonyum klorid gibi
azot kaynaklarının bulunduğu SSF ortamlarında enzim uumlretiminin artması bakterinin
besiyerindeki bu azot kaynaklarını kullanarak proteine doumlnuumlştuumlrduumlğuuml fikrini
vermektedir Uygun karbon ve azot kaynaklarının veya diğer besinlerin seccedilimi etkili
ekonomik bir işlemin geliştirilmesinde ccedilok oumlnemli bir faktoumlrduumlr Benzer sonuccedillar oumlnceki
ccedilalışmalarda da mevcuttur (Pandey ve ark 2000 Linko ve ark 1999 Chakraborty ve
ark 1995)
Mukherjee ve ark (2008) Bacillus subtilisrsquo ten proteaz aktivitesini en yuumlksek et
ekstraktında tespit ettiklerini raporlamışlardır
Mısır kuumlspesinin substrat olarak kullanıldığı ortama eklenen karbon (galaktoz)
ve azot kaynaklarının (beef extract ve amonyum khlorid) proteaz sentezini arttırmaları
bu maddelerin Blicheniformis ATCC 14580‟ne besin teşkil etmesi ve enzim uumlretimini
olumlu youmlnde etkilemesi şeklinde accedilıklanabilir Ccedilalışmalarımızda tarımsal atıkların
substrat olarak kullanılması ile azot ihtiyacı bu substratlardan karşılanmış olabilir
Kuumlltuumlr ortamında karbon kaynakları gibi tarım maddelerinin kullanımı enzim uumlretim
maliyetini azaltmaktadır
Mısır kuumlspesinin katı substrat olarak kullanıldığı SSF ortamlarına eklenen 01
konsantrasyonundaki metal tuzları bulunan ortamlarda kuumlltuumlr edilen Blicheniformis
ATCC 14580‟nin uumlrettiği proteaz aktivite tayinlerinde MgSO47H2O (148848 Umg)
iccedileren ortamdan elde edilen aktivite değerleri kontrole goumlre daha fazla ccedilıkmıştır Metal
tuzlarını iccedileren ortamlardan CuSO4 iccedileren ortamda proteaz uumlretimi baskılanmıştır
Yaptığımız ccedilalışmaya benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda kuumlltuumlr ortamında
eklenen ccedileşitli tuzların enzim aktivitesini arttırdığı veya inhibe ettiğine youmlnelik
ccedilalışmalar mevcuttur (Asgher ve ark 2007 Ramesh ve Lonsane 1989 Kumar 2003)
Metal tuzlarının kullanımının enzim uumlretimi uumlzerine oumlnemli bir etkisinin
bulunmadığının tespit edilmesi kullandığımız bakterinin tuz ihtiyacını substrat olarak
kullanılan mısır kuumlspesi ve ccedileşme suyundan karşıladığı fikrini vermektedir Bu youmlnuumlyle
5 TARTIŞMA VE SONUCcedil
64
B licheniformis ATCC 14580 ile yapılacak enzim uumlretim ccedilalışmalarında uumlretim maliyeti
azalabilir
Thangam ve ark (2002) alkalofilik Alcaligenes faecalis‟ten saf olarak elde
edilen alkali proteazın aktivitesinin 2 mM CaCl2 ve MgSO4 ile arttığı Cu2+
ve Hg2+
iyonları ise inhibisyona neden olduğunu raporlamışlardır
Rao ve ark (2009) Bacillus circulans‟tan alkalin proteaz uumlretimini
gerccedilekleştirmişlerdir Ca+2
Mg+2
ve Mn+2
gibi metal iyonlar enzim aktivitesini olumlu
etkilerken Cu+2
nin olumsuz etkilediğini bildirmişlerdir
Ccedilalışmamıza benzer şekilde daha oumlnce yapılan ccedilalışmalarda da kuumlltuumlr
ortamlarına eklenen metal tuzlarının (ZnSO47H2O FeSO47H2O CaCl2) enzim
uumlretimini inhibe ettiği rapor edilmiştir (Kıran ve ark 2005 Leveque ve ark 2000)
İnhibisyon ortamdaki katyonlar ile proteinlerle ilişkili katyonlar arasındaki rekabetten
dolayı enzim aktivitesinde azalmaya neden olmuş olabilir
Sonuccedil olarak mikroorganizmalar kullanılarak SSF ortamında enzim uumlretme
ccedilalışmaları son yıllarda giderek artmaya ve SmF‟ye alternatif bir teknik haline gelmeye
başlamıştır Duumlnya genelinde artan tarımsal atıkların tekrar kullanılmaları ekolojik ve
ekonomik olarak oldukccedila oumlnemlidir Bu yuumlzden ccedilalışmamız sonucunda tarımsal
atıkların sadece hayvan yemi vb alanlarda kullanılamayacağını bunun yanında
enduumlstriyel enzim uumlretilebileceğini ve SSF tekniğinin kullanımı ile bu atıklardan daha
fazla ekonomik yarar sağlamanın da muumlmkuumln olacağını goumlstermiştir Tarımsal atıkların
kullanımı ile oumlnemli ccedilevre sorunları da ccediloumlzuumlme ulaşılabileceği duumlşuumlnuumllmektedir
SEDAT KAYA
65
6 KAYNAKLAR
Abu Sayem SM Alam MJ Mozammel Hoq MD 2006 Process Pakistan Academi
Science 43(4) 257-262
Adlercreutz P Ibora L J Schmıdt E Pederson S 1994 Applied Biocatalysis
Hoawood Academic Publishers GmbH Switzerland 109-156
Agrawal D Patıdar P Banerjee T Patıl S 2005 Alkaline protease production by a
soil isolate of Beauveria felina under SSF condition parameter optimization and application to
soy protein hydrolysis Process Biochemistry 40 1131ndash1136
Akcan N 2009 Bazı Bacillus tuumlrlerinin ekstraselluumller enzimlerinin araştırılması
Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Diyarbakır
Alpan LG 2008 Bazı ekstrem termofil anaerobik bakterilerin alkali proteazlarının
oumlzelliklerinin belirlenmesi Yuumlksek Lisans Tezi Ankara Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Ankara
Andrade VS Sarubbo LA Fukushima Miyaji M Nishimura K de Campos-
Takaki G M 2002 Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-
glucose as substrate Brazilian Journal of Microbiogy 33 106-110
Anwar A Saleemuddin M 1998 Alkaline Proteases A review Bioresource
Technology 64 175ndash183
Arda M 2000 Temel mikrobiyoloji Medisan Yayınları Ankara 548
Asgher M Asad MJ Rahman SU Legge RL 2007 A thermostable α-amylase
from moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for strach processing Journal of Food
Engineering 79 950-955
Bahccedileci H 2004 Tuz Goumlluuml bakteri izolatlarının yağ asidi metil ester analizi ve huumlcre
dışı enzimlerin karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Orta Doğu Teknik Uumlniversitesi Fen
Bilimleri Enstituumlsuuml Ankara
Barrıos-Gonzalez J Gonzalez H amp Mejıa A 1993 Ect of Particle Size Packing
Density and Agitation on Penicillin Production in Solid State Fermentation Biotechnology
Advances 11 539ndash547
6 KAYNAKLAR
66
Baysal Z Uyar F Aytekin C 2003 Solid State Fermentation for production of α-
amylase by a Thermotolerant Bacillus subtilis Fromhot-Spring Water Process Biochemistry
38 1665ndash1668
Battal M 2004 Alkalin proteaz uumlreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu
nitelendirilmesi ve enzim uumlretiminin optimizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Gebze Yuumlksek Teknik
Enstituumlsuuml Kocaeli
Beck J Sauvage E Charlier P Marchand-Brynaert J 2008 2-Aminopropane-123-
tricarboxylic acid Synthesis and co-crystallization with the class A β-lactamase BS3 of Bacillus
licheniformis Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18 3764ndash3768
Beg QR Gupta R 2003 Purification And Characterization Of An Oxidation-Stable
Thiol- Dependent Serine Alkaline Protease From Bacillus Mojavensis Enzyme And Microbial
Thecnology 32 294-304
Bıschoff KM Liu S Hughes Sr 2007 Cloning And Characterization Of A
Recombinant Family Endoglucanase from Bacillus licheniformis Strain B-41361 Process
Biochemistry 42 1150-1154
Boyacı M 2000 Un Mamuumllleri Teknolojisi 9 5
Botella C Ory I de Webb C Cantero D Blandino A 2005 Hydrolytic enzyme
production by Aspergillus awamori on grape pomace Journal Biochemical Engineering
26 100-106
Cheng SW Hu MN Shen SW Takagi H Asano M Tsai YC 1995
Production and characterization of keratinase of a feather-degrading Bacillus licheniformis
PWD-1 Bioscience Biotechnology Biochemistry 59 2239-2243
ClausD Berkeley PHA 1986 Genus Bacillus Bergey‟s Manual of Systematic
Bacteriology 1105ndash1141
Chakraborty R Srinivasan M Sarkar SK Raghvan KV 1995 Production of acid
protease by a new Aspergillus niger by solid substrate fermentation Journal of Microbial
Biotechnology 10 17ndash30
Chellappan S Jasmin C Basheer S M Elyas K K Bhat G S Chandrasekaran
M 2006 Production purification and partial chacraterization of a novel protease from marine
Engyodontium album BTMFS10 under solid state fermentation Process Biochemistry 41 956-
961
SEDAT KAYA
67
Chutmanop J Chuichulcherm S Chisti Y Srinophakun P 2008 Protease
production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates
Journal Chemical Technology and Biotechnology 83 1012-1018
Couto SR Sanromaacuten MR 2006 Effect of two wastes from groundnut processing on
laccase production and dye decolourisation ability Journal of Food Engineering 76 291-302
Ccedilelik N 2006 Bacillus clausii GMBAE 42‟den saflaştırılan alkalen proteazın termal
inaktivasyon kinetiğinin belirlenmesi ve Cu+2
iyonları ile termostabilizasyonu Yuumlksek Lisans
Tezi Kocaeli Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Kocaeli 1-5
Dağaşan L 1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Gıda ve Hayvan Yemi Uumlretimindeki Uygulamaları-Enzim Muumlhendisliğinde Temel
Konular ve Uygulamalar 14-15
Dayanandan A Kanagaraj J Sounderraj L Govındaraju R Suseela Rajkumar G 2003
Application of an alkaline protease in leather processing an ecofriendly approacher Journal
Cleaner Production 11 533ndash611
Economou C N Makri A Aggelis G Pavlou S Vayena D V 2010 Semi-solid
state fermentation of sweet sorghum for the biotechnological production of single cell oil
Bioresource Technology 101 1385-1388
El Enshasy H Abuoul Enein A Helmy S El Azaly Y 2008 Optimization of the
ındustrial production of alkaline protease by Bacillus licheniformis in different production
scales australian Journal of Basic and Applied Sciences 2(3) 583-593
Elıbol M Moreıra AR 2005 Optimizing some factors affecting alkaline protease
production by a marine bacterium Teredinobacter turnirae under solid substrate fermentation
Process Biochemistry 40 1951ndash1956
Fan-Chıng Y Lın Ih 1998 Production of acid protease using thin stillage from a rice
spirit distillery by Aspergillus niger Enzyme Microbiology Technology 23 397ndash402
Farley Pc Ikasarı L 1992 Regulation of secretion of Rhizopus oligosporus extra
cellular carboxyl proteinases Journal Gen Microbiology 138 2539ndash2544
Ferrero MA Castro GR Abate CM Baigori MD and Sineriz F 1996
Thermostable alkaline protease of Bacillus licheniformis MIR 29 isolation production and
characterization Apply Microbiology Biotechnology 45 327-332
Follmer C 2008 Insights into the role and structure of plant ureases Phytochemistry
69 18-28
6 KAYNAKLAR
68
Fogarty WM Kelly CT 1990 Studies on the thermostability of the α-amylase of
Bacillus caldovelox Microbial enzymes and biotechnology 71ndash132
Gangadharan D Sivaramakrishnan S Nampoothiri KM Pandey A 2006 Solid
Culturing of Bacillus amyloliquefaciens for Alpha amylase production Food Technology
Biotechnology 44 (2) 269ndash274
George S Roju V SubramanionTv Jayaraman K 1997 Comparative study of
protease production in solid substrate fermentation versus submerged fermentation Bioprocess
Engineering 16 381-382
Goumlzuumlkara EM 1989 Biokimya Nobel Tıp Kitabevleri 225 577 Ankara
Gupta R Gıgras P Mohapatra H Goswamı VKChauhan B 2003 Microbial α-
amylases a biotechnological perspective Enzyme and Technology 38 1599-1616
Gupta R Beg QK Lorenz P 2002 Bacterial alkaline proteases molecular
approaches and industrial applications Apply Microbiology Biotechnology 59 15ndash32
Graminha EBN Goncaacutelves AZL Pirota RDPB Balsalobre M A A Da Silva
R Gomes E Enzyme production by solid state fermentation application to animal nutrition
2008 Animal Feed Science and Technology 144 1ndash22
Haki GD Rakshit SK 2003 Developments in industrially important thermostable
enzymes Bioresource Technology 89 17-34
Hamilton LM Kelly TC Fogarty WM Kelly CT Bolton DJ Fogarty WM
1997 Production and properties of the raw starch digesting α-amylase of Bacillus sp IMD 435
Biotechnology Letters 19 675ndash712
He L Chen W Lıu Y 2006 Production and partial characterization of bacteriocin-
like pepitdes by Bacillus licheniformis Zju12 Microbiological Research 161 321-326
Hmidet N Ali N E H Haddar A Kanoun S Alya S K Nasri M 2009 Alkaline
proteases and thermostable alpha amylase co-produced by Bacillus licheniformis NH1
Characterization and potential application as detergent additive Journal Biochemical
Engineering 4771-79
Jin F Cheng X Shi Y Zhang C 1990 Isolation of new thermophilic aerobic
bacteria which produce thermostable alpha -amylase Journal Gen Apply Microbiology 36
415- 424
Jose J Kurup M 1999 Journal of Experimental Biology 37 1217-1231
SEDAT KAYA
69
John E S 2009 Biotechnology 5 th ed University of Strathclyde 14-16
Johnvesly B Naik G R 2001 Pigeon pea waste as a novel inexpensive substrate
for production of a thermostable alkaline protease from thermoalkalophilic Bacillus sp JB-99 in
a chemically defined medium Process Biochemistry 37 139-144
Joo H S Kumar C G Park G C Raik S R Chang C S 2004 Bleachresistant
alkaline protease produced by a Bacillus sp isolated from the Korean polychaete Periserrula
leucophryna Process Biochemistry 39 1441-1447
Kalimuthu K Babu Sr Venkataraman D Bilal M Gurunathan S 2008 Biosynthesis
of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis Colloids and Surfaces B Biointerfaces 65
150ndash153
Karataş H 2008 Bazı bitki atıklarından katı faz fermantasyon (SSF) tekniği ile
ekstraseluumller enzim uumlretimi Doktora Tezi Dicle Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml
Diyarbakır
Kazan D Denizci AA Kerimak Oumlner MN Eraslan A 2005 Purification and
characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE- 42 Journal
Microbiology Biotechnology 32 335-344
Ken McDonald J 1985 An overview of protease specificity and catalytic mechanisms
aspects related to nomenclature and classification Journal The Histochemical 17 773-785
Klingeberg M Galunsky B Sjoholm C Kasche V Antranikian G 1995
Purification and properties of a highly thermostable sodium dodecyl sulfateresistant and
stereospecific proteinase from the extremely thermophilic archaeon Thermococcus stetteri
Apply Environment Microbiology 61 3098-3104
Krısha C Chandrasekaran M 1996 Banana Waste As Substrate For α-Amylase
Production By Bacillus Subtilis Cbtk 106 Under Solid-State Fermentation Microbial
Biotechnology 46 106-111
Kumar GC Takagi H 1999 Microbial alkaline proteases From a bioindustrial
viewpoint Biotechnology Advances 17 561-594
Kumar D Jaın Vk Shanker G Srıvastava A 2003 Utilisation of Fruit Wastes For
Citric Acid Production by Solid State Fermentation Process Biochemistry 381725-1729
Kumar S Sharma N S Saharan M R Sıngh R 2005 Extracellular Acid Protease
From Rhizopus Oryzae Purifuc ation And Characterization Process Biochemistry 40 1701-
1705
6 KAYNAKLAR
70
Kumar D Savitri N T Verma R Bhalla TC 2008 Microbial Proteases and
Application as Laundry Detergent Additive Research Journal of Microbiology 3(12) 661-672
Kunamnenı A Permaul K Sıngh S 2005 Amylase Productionin Solid State
Fermentation by The Thermophilic Fungus Thermomyces Lanuginosus Journal of Biosciencr
Bioengineering 100 168ndash17
Kole MM Draper I Gerson DF 1988 Microbial alkaline proteases From a
bioindustrial viewpoint Apply Microbiology Biotechnology 28 404ndash422
Kokab S Asghar M Rehman K Asad M J Adedyo O 2003 Statistical
Optimization and neural modeling of amylase production from banana peel using Bacillus
subtilis MTCC 441 International Journal of Agriculture and Biology 5 (1) 36-39
Kıran E Ouml Ccediloumlmlekccedilioğlu U Arıkan B 2005 Effects of carbon sources and various
chemicals on the production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-1229
Turkish Journal of Biology 99-103
Larson SB Greenwood A Cascio D Day J McPherson A 1994 Refined
Molecular Structure of Pig Pancreatic α-Amylase at 2middot1 Aring Resolution Journal of Molecular
Biology 235 1560-1584
Lazim H Mankai H Slama N Barkallah I Limam F 2009 Production and
optimization of thermophilic alkaline protease in solid state fementation by Streptomyces sp
CN902 Microbiol Biotechnology 36 531-537
Leighton TJ Doı RH WarrenRAJ Kelln RA 1973 The Relationshipof Serine
Protease Activity To Rna Polymerase Modification And Sporulation İn Bacillus Subtilis
Journal Moleculer Biology 76 103-122
Leveque E Janecek S Haye B Belarbi A 2000 Thermophilic archaeal amylolytic
enzymes Enzyme and Microbial Technology 26 3ndash14
Lıu Mq Lıu Fg 2008 Expression of recombinant Bacillus licheniformis xylanase A
in Pichia pastoris and xylooligosaccharides released from xylans by it Protein Expression and
Purification 57 01ndash107
Lıu B L Tzeng Y M 1999 Water Content And Water Activity For The Production
of Cyclodepsipeptide in Solid State Fermentation Biotechnology Letters 21 657ndash661
Linko Y Javanainen P Linko S 1999 Engineering baker‟s yeast room for
improvement Trends in Food Science and Technology 8 339
SEDAT KAYA
71
Lowry O H Rosebrough N J Farr A L 1951 Protein measurement with the folin
phenol reagent Journal Biology Chemistry 193 265-275
Mazutti M JP Bender H Treichel MD Luccio 2006 Optimization of inulinase
production by solid-state fermentation using sugarcane bagasse as substrate Enzyme and
Microbial Technology 39 56ndash59
Maurer KH 2004 Detergent proteases Current opinion in biotechnology 15 1-5
Mahanta N Gupta A Khare SK 2008 Production of protease and lipase by solvent
tolerant Pseudomonas aeruginosa in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as
substrate Bioresource Technology 99 1729ndash1735
Mahalaxmi Y Satshish T Rao C S Rrakasham R S 2010 Corn husk as a novel
substrate for the production of rifamycin B by isolated Amycolatopsis sp RSP3 under SSF
Process Biochemistry 45 47-53
Mehta V J Thumar J T Singh S P 2006 Production of alkaline protease from an
alkaliphilic actinomycete Bioresource Technology 97 1650-1654
Mehrotra S Pandey P K Gaur R Darmwal N S 1999 The production of alkaline
protease by a Bacillus species isolate Bioresource Technology 67 201-203
Moon S Parulekar S 1991 Biotechnology Bioengineering 37 467ndash83
Mukherjee A K Adhikari H Rai S K 2008 Production of alkaline protease by a
thermophilic Bacillus subtilis under solid state fermantation (SSF) condition using imperate
Cylindrica gres and potato peel as low-cost medium Characterization and application of
enzyme in detergent formulation Journal Biochemical Engineering 39 353-361
Murthy PS Naidu MM Srinivas P 2009 Production of α-amylase under
solid-state fermentation utilizing coffee waste Journal of Chemical Technology and
Biotechnology 84 (8) 1246-1249
Mitchell DA Berovic M Krieger N 2008 A Note on Rising Food Prices
Advanced Biochemistry Engineer Biotechnology 68 61ndash78
Nadeem M Qazi JI Baig S Qurat-ul-Ain Syed 2008 Effect of medium
composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis
N-2 Food Technology Biotechnology 46 (4) 388ndash394
Najafi MF Deobagkar D 2005 Purification and characterization of an extracellular
α-amylase from Bacillus subtilis AX20 Electronic Journal Biotechnology 8 197-203
6 KAYNAKLAR
72
Naveena BJ Altaf Md Bhadriah K Reddy G 2005 Application of solid-state
fermentation to food industry Bioresource Technology 96 (4) 85ndash90
Nduwimana J Guenet L Dorval I Blayau M Le Gall JY and Le Treut A 1995
Proteases Annual Biology Clinec 53 251-264
Nigam P Singh D 1994 Solid-state (substrate) fermentation systems and their
applications in biotechnology Journal of Basic Microbiology 34 405-423
Oh Y S Shih I L Tzeng Y M Wang S L 2000 Protease produced by
Pseudomonas aeruginosa K-187 and its application in the deproteinization of shrimp and crab
shell wastes Enzymes Microbiology Technology 27 3-10
Oberoi R Beg QK Puri S Saxena RK Gupta R 2001 Characterization and wash
performance analysis of an SDS-stable alkaline protease from a Bacillus sp World Journal
Microbiology Biotechnology 17 493ndash497
Olajuyigbe FM Ajele JO 2005 Production dynamics of extracellular protease from
Bacillus species African Journal Biotechnology 4(8) 776-779
Oumlztuumlrk S 2007 Uumllkemizde izole edilen Bacillus licheniformis BA17‟den alkalen
proteaz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu Yuumlksek Lisans Tezi Marmara
Uumlniversitesi Fen Bilimleri Enstituumlsuuml İstanbul
Pandey A Soccol CR Mıtchell D 2000 New Developments İn Solid State
Fermentation Bioprocesses and Products Process Biochemistry 35 1153ndash1169
Pandey A 2003 Solid-state fermentation Journal Biochemical Engineering 13 81-84
Pandey A 2004 Comparison of phytase production on wheat bran and oilcakes in
solid-state fermentation by Mucor racemosus Concise encyclopedia of bioresource technology
16 578-584
Pandey A Sekaran M Renuvathani M 2006 Productivity of laccase in solid
substrate fermentation of selected agro-residues by Pycnoporus sanguineus Bioresource
Technology 97 (1) 171-177
Pandey A B Bogar Szakacs G Linden J C Tengerdy R P 2008 Optimization
of phytase production by solid substrate fermentation Current Developments in Solid-state
Fermentation 33-183-189
SEDAT KAYA
73
Patel R Dodia M Sıngh S P 2005 Extracellular alkaline protease from a newly
ısolated haloalkalophilic Bacillus sp Production and optimization Process Biochemistry 40
3569-3575
Perez-Guerra N Torrado- Agrasar A Lopez-Macias C and Pastrana L 2003 Main
characteristics and applications of solid substrate fermentation Electronic Journal of
Environmental Agricultural and Food Chemistry 2(3)
Pederson H Nıelsen J 2000 The influence of Nitrogen sources on the α-amylase
productivity of Aspergillus Oryzae in continuous cultures Microbial Biotechnology 53 278-
281
Prakasham R S Rao C S Sarma P N 2006 Green gram husk-an inexpensive
substrate for alkaline protease by Bacillus sp in solid state fermentation Bioresource
Technology 97 1449-1453
Priest FG Harwood CR in YH Hui GG 1994 Regulation of polyglutamic acid
Synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis Food Biotechnology and
Micro-organisms 377ndash421
Puri S Beg QK Gupta R 2002 Optimization of alkaline protease production from
Bacillus sp by Response Surface Methodology Current Microbiology 44 286ndash290
Qihe C Guoqing H Jinling W 2007 Journal Acid shock of elastase-producing
Bacillus licheniformis ZJUEL31410 and its elastase Characterization evaluation of Food
Engineering 80 490ndash496
Raimbault M1998 General and microbiological aspects of solid substrate
fermentation Electronic Journal of Biotechnology 1717-3458
Rajkumar R Kothilmozhian J Ramasamy R 2011 Production and characterization of a
novel protease from Bacillus sp RRM1 under solid state fermentation Journal Microbiology
and Biotechnology 21(6) 627-636
Ramesh MV Lonsane BK Solid state fermentation for production of higher titres of
thermostable alpha-amylase with two peaks for pH optima by Bacillus licheniformis M27
Biotechnology Letters 1989 11 49ndash52
Rahardjo YSP Korona D Haemers S Weber FJ Tramper J Rinzema A
2004 Limitations of membrane cultures as a model solid-state fermentation system Letters in
Applied Microbiology 39 504ndash508
6 KAYNAKLAR
74
Rao MB Tanksale AM Ghatge MS and Deshpande VV 1998 Molecular and
biotechnological aspects of microbial proteases Microbiology and Molecular Biology 62 597-
635
Rao C S Sathish T Ravichanda P Rrakasham R S 2009 Characterization of
thermo-and detergent stable serine protease from isolated Bacillus circulans and evaluation of
eco friendly applications Process Biochemistry 44 262-268
Rosovitz M J Voskuil M I Chambliss G H 1998 Bacillus topley and Wilson‟s
microbiology and microbial infections systematic bacteriology Applied microbiology 2 55-
193
Sandhya C Sumantha A Szakacs G Pandey A 2005 Comparative evaluation of
neutral protease production by Aspergillus oryzae in submerged and solid-state fermentation
Process Biochemistry 40 2689ndash2694
Saeki K Ozaki K Kobayashi T 2007 Detergent alkaline proteases enzymatic
properties genes and crystal structures Journal Bioscience and Bioengineering 103 501-508
Schrerier P 1997 Enzymes and Flovour biotechnology Advances in Biotechemical
EngineeringBiotechnology 51-72
Sevinccedil N Demirkan E 2011 Production of protease by Bacillus sp N-40 ısolated
from soil and ıts enzymatic properties Journal Biology and Environtment Scıence
5(14) 95-103
Sodhı HK Sharma K Gupta JK Sonı SK 2005 Production of A thermostable
A-amylase from Bacillus Sp Ps-7 by solid state fermentation and its synergistic use in the
hydrolysis of malt starch for alcohol production Process Biochemistry 40 525ndash534
Souza CFV Rodrigues RC Heck JX Ayub MAZ 2008 Optimization of
transglutaminase extraction produced by Bacillus circulans BL32 on solid-state
cultivation Journal of Chemical Technology and Biotechnology 83 1306-1313
Sumantha A Larroche C Pandey A 2006 Microbiology and Industrial
Biotechnology of Food-Grade Proteases A Perspective Food Technology Biotechnology 44
211ndash220
Singhaniaa RR Patel AK Soccol CR Pandey A 2009 Recent advances in solid-
state fermentation Journal Biochemical Engineering 44 13ndash18
SEDAT KAYA
75
Swain MR Ray RC 2007 Alpha-amylase production by Bacillus subtilis CM3
in solid state fermentation using cassava fibrous residue Journal of Basic Microbiology
47 417 - 425
Sneath P H A 1986 Endospore-forming gram positive rods and cocci Bergey‟s
Manual of Systematic Bacteriology 2 1104-1139
Uyar F Baysal Z 2004 Production and optimization of process parameters for
alkaline protease production by a newly isolated Bacillus sp under solid state fermentation
Process Biochemistry 39 1893-1898
Varela H Ferrari MD Belobradic L Weyrauch R Loperena ML 1996 Short
Communication Effect of medium composition on the production by a new Bacillus subtilis
isolate of protease with promising unhairing activity World Journal Microbiology
Biotechnology 12 643-645
Veith B Herzberg C Steckel S Feesche J Maurer K H Ehrenreich P Baumlumer
S Henne A Liesegang H Merkl R Ehrenreich A Gottschalk G J 2004 The complete
genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13 an organism with great industrial potential
Moleculer Microbiology Biotechnology 7(4) 204-211
Wei-Hua Chu J 2007 Optimization of extracellular alkaline protease production from
species of Bacillus Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34 241ndash245
Tanyıldızı MS Ozer D Elıbol M 2007 Production of bacterial alpha-amylase by
B amyloliquefaciens under Solid Substrate Fermentation Biochemical Engineering Journal
37 294ndash297
Taubman S 1992 Genus Bacillus Contemporary Oral Microbiology and
Immunology 355-356
Telefoncu A1997 Marmara Araştırma Merkezi Lisans Uumlstuuml Yaz Okulu (EMTU)
Enzimlerin Enduumlstriyel Uygulamaları 21-27 Eyluumll Kuşadası Aydın- Tuumlrkiye 1 5-8
Thomas TD Mills OE 1981 Proteolytic enzymes of starter bacteria Journal
Netherlands Milk and Dairy 35 255-273
Tunail N Koumlşker Ouml 1986 Suumlt mikrobiyolojisi Ankara Uumlniversitesi Ziraat Fakuumlltesi
Yayınları Ankara 966 138
6 KAYNAKLAR
76
Towatana NH Painupong A Suntinanalert P 1999 Purification and
characterization of an extracellular protease from alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp
PS-719 Journal of Bioscience and Bioengineering 87 581-587
SEDAT KAYA
77
OumlZGECcedilMİŞ
Adı Soyadı Sedat KAYA
Doğum Yeri Mardin Mazıdağı
Doğum Tarihi 05051987
Medeni Hali Evli
Yabancı Dili İngilizce
E-Posta biyologsedatgmailcom
Eğitim Durumu
Lise Birlik Lisesi (Diyarbakır) 2001 ndash 2004
Lisans Dicle UumlniversitesiFen Edebiyat Fakuumlltesi Biyoloji Boumlluumlmuuml (2005-2009)
Yuumlksek Lisans DUuml Fen Bilimleri Enstituumlsuuml Molekuumller Biyoloji (2009-2011)