Helmina Br. Sembiring JURNAL PENELITIAN MIPA Volume 1, Nomor 1 Desember 2007

28

TEKNIK IDENTIFIKASI CEPAT FRAKSINASI HASIL PEMISAHAN KROMATOGRAFI MENGGUNAKAN DETEKTOR FLUORESENSI

Bisman Perangin-Angin

Staf Pengajar Dept. Fisika – FMIPA USU Medan

Abstract

Separation component identification according to cromatography can be done quickly with observation fluorescence signal from sample that identified. Molecule sample if illuminated with light uv or visible will emitting fluorescence. Signal fluorescence this can be watched the intensity spectrum in domain wavelength and in domain time. From spectrum domain wavelength determinable maximum wavelength (λmaks) and from domain time determinable life time ( τ ). With known spectrum fluorescence from a molecule emitting fluorescence so as according to sample theory can be identified, as for aim qualitative also qwantitative. Keywords: Identification, molecule, fluorescence PENDAHULUAN

Kandungan senyawa kimia baik yang berupa bahan alam atau sintetik perlu diketahui secara kwalitatip dan kwantitatip untuk dapat digunakan di berbagai bidang seperti industri kimia, industri farmasi dan untuk bahan penelitian. Sebagai langkah awal untuk mengetahui kandungan–kandungan tersebut adalah dengan mengisolasi dengan pemisahan kromatografi. Langkah selanjutnya adalah dengan mengidentifikasi dan menganalisa komponen-komponen yang telah terpisah tersebut. Cara identifikasi yang sering digunakan adalah biasanya secara proses kimia atau dilakukan dengan spektroskofi UV dengan metode spektroskofi serapan. Metode identifikasi diatas dirasa kurang cepat dan kurang praktis. Untuk itu diusulkan suatu cara baru yang dapat mengatasi permasalahan diatas, yaitu identifikasi berdasarkan analisa spectrum fluoresensi yang diemisikan oleh molekul akibat disinari dalam daerah uv-visible.

Ada beberapa keuntungan identifikasi berdasarkan pengamatan spectrum fluorisensi antara lain adalah : simpel dan cepat dan biaya relatip murah. Selain itu permasalahan jika menggunakan Absorptiometry adalah pengamatan untuk multi-component, dimana kemungkinan dua komponen yang berbeda menyerap panjang gelombang yang sama, sehingga spectrum kedua bahan tersebut tak dapat dipisahkan, sedangkan berdasarkan fluorometer sinyal fluorisensi dari kedua komponen tersebut tetap dapat dipisahkan.

Identifikasi molekul organik terutama komponen hasil pemisahan secara kromatografi

adalah suatu hal yang sangat penting dan menentukan. Oleh karena itu teknik identifikasi dirasa perlu ditingkatkan kualitasnya baik dari segi kecepatan, keakuratan dan biaya perlu ditekan seminimal mungkin. Identifikasi yang sering digunakan kebanyakan dengan proses reaksi kimia atau menggunakan spektrofotometer dengan metode spektroskopi serapan. Seperti yang telah diuraikan pada latar belakang banyak kelemahan yang ditemukan pada teknik identifikasi diatas. Tinjauan Pustaka Tingkat Energi Molekuler

Secara keseluruhan susunan tingkatan energi molekular terdiri dari bagian yang berasal dari rotasi molekul, vibrasi atom serta keadaan elektroniknya. Oleh karena itu enegi total molekul adalah jumlah dari kontribusi energi elektronik, energi vibrasi dan energi rotasi. Secara matematik energi total dari molekul adalah seperti persamaan dibawah. E total = E el. + E vib. + E rot. Dengan: E el. = energi elektronik dari molekul E vib = energi vibrasi antara atom dari molekul E rot. = energi rotasi dari molekul Secara hirarki hubungan antara energi level diatas ditunjukkan pada Gambar (1) berikut ini.

Bisman Perangin-angin JURNAL PENELITIAN MIPA Volume 2, Nomor 1 Juni 2008

29

Gambar 1. Energi Level Molekular

Jika molekul dalam suatu pelarut disinari

dengan cahaya dalam daerah cahaya tampak atau uv maka absorbsi cahaya akan menyebabkan transisi molekul terjadi antara energi elektronik yang berbeda, frekuensi dari rumus Plank adalah, h ν = Δ E = E’ – E’’ = ( E’

el.-E’’el ) + ( E’

vib – E’’vib ) + ( E’

rot – E’’rot )

Absorbsi dan emisi fluoresensi pada sampel molekul Jika molekul menyerap energi gelombang elektromagnetik dalam daerah ultraviolet atau visible maka molekul tersebut akan tereksitasi kepada tingkat elektronik yang lebih tinggi. Multiplicity M didefinisikan sebagai berikut;

M = 2S + 1 Dimana S = bilangan spin quantum dari molekul Untuk kebanyakan molekul organik S = 0, karena molekul mempunyai jumlah elektron genap, jadi pada energi paling bawah semua elektron mempunya pasangan spin, sehingga multiplicity menjadi :

M = 1 Hal ini disebut singlet state. Pada ground state singlet didefinisikan sebagai So, dan level pertama dan kedua eksitasi singlet state disebut S1 dan S2 masing-masing.

Secara kualitatif proses absorpsi dan emisi untuk molekul organik dapat dilukiskan dengan menggunakan diagram tingkat energi Jablonski seperti diperlihatkan pada Gambar (2) di bawah. Dalam fase padatan (condensed-phase) molekul yang tereksitasi dengan cepat akan melepaskan kelebihan energi vibrasinya berupa panas. Hal ini terjadi akibat tumbukan antara molekul organic dengan molekul pelarut dalam proses relaksasi vibrasional (vibrational relaxation-VR) pada tingkat tereksitasi S2. Kemudian akan terjadi proses konversi internal (internal convertion – IC), yaitu

perpindahan molekul dari tingkat eksitasi S2 dasar menuju tingkat eksitasi S1 yang setara. Pada tingkat eksitasi S1 akan terjadi pula proses relaksasi vibrasi hingga mencapai tingkat dasar S1. Seluruh proses relaksasi vibrasi dan konversi internal ini terjadi dalam waktu sangat singkat, berkisar sekitar 10-12 detik. Dari tingkat tereksitasi S1 dasar, molekul akan meluruh kembali menuju tingkat dasar S0 dengan memancarakan photon. Proses emisi radiasi ini disebut fluoresensi. Pada umumnya emisifluoresensi mempunyai usia dalam orde nano detik (10-9 sampai 10-7 detik).

Gambar 2. Proses Absorbsi dan Emisi Fluoresensi

pada Energi Level. Jablonski Ringkasan Proses Eksitasi dan Deeksitasi S0 ∅ Sn absorption Sn ∅ S1 internal conversion (10-11 - 10-14 sec) S1 ∅ S0 + hν fluorescence (10-7 - 10-9 sec) S1 ∅ Tn intersystem crossing (10-8 sec) S1 ∅ S0 internal conversion (10-5 - 10-7 sec) T1 ∅ S0 + hν phosphorescence (10 - 10-3 sec) T1 ∅ S0 internal conversion (10 - 10-3 sec Taksiran Energi dan Panjang gelombang untuk berbagai transisi TRANSISI Taksiran Energi

( kJ/ mole ) Taksiran Panjang Gelombang (nm)

Electronic (Ec ) 400 3 x 102

Vibrational ( Ev) 20 6 x 103

Rotational ( Er) 0,4 3 x 108

Prinsip Dasar Pengamatan Fluoresensi Prinsip dasar setup peralatan untuk pengamatan sinyal fluoresensi diperlihatkan pada Gambar 3 berikut ini.

Bisman Perangin-angin JURNAL PENELITIAN MIPA Volume 2, Nomor 1 Juni 2008

30

Gambar 3. Prinsip Dasar Pengamatan Fluoresensi Tujuan dan Manfaat Penelitian ini bertujuan untuk merancang dan merealisasikan perangkat fluorometer untuk melakukan identifikasi pemisahan kromatografi berdasarkan analisa dari spektrum fluoresensi secara cepat, akurat, praktis dan biaya relatif murah, dengan teknik boxcar integrator detector dan berbasis mikrokomputer. Hasil percobaan yang diharapkan adalah berupa spektrum panjang gelombang dan peluruhan intensitas yang ditampilkan dilayar monitor dan dapat disimpan dalam memori, selain itu hasil dapat dibandingkan dengan data referensi yang disimpan pada komputer sehingga identifikasi dapat berlangsung cepat (in-situ).

Dengan berhasilnya alat yang yang dibuat ini diharapkan, identifikasi sampel molekul dapat dilakukan berdasarkan karakristik dari sinyal fluoresensi yang diemisikan oleh sampel yang bersangkutan sehingga identifikasi lebih cepat, simpel dan biaya relatif murah. METODE PENELITIAN

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah bahwa kebanyakan molekul organik dalam suatu pelarut jika disinari dengan cahaya dalam daerah uv atau visible akan berfluoresensi. Proses terjadinya fluoresensi ini dapat dilihat pada tingkat energy Jablonski berikut ini.

Gambar 4. Proses Terjadinya Fluoresensi

Skematik penyinaran dan terjadinya sinyal fluoresensi adalah seperti diperlihatkan pada gambar berikut.

SUMBER

FLUORESENSI

Cell sample

Kurva Intensitas fluoresensi terhadap panjang gelombang adalah seperti diperlihatkan pada gambar berikut ini.

Gambar 5. Kurva Intensitas Fluoresensi terhadap

Panjang Gelombang Pada kurva gambar diatas, sesaat setelah

sampel menyerap cahaya maka sampel akan memancarkan sinyal fluoresensi. Dari kurve fluoresensi yang diperlihatkan, dapat diketahui intensitas maksimum (puncak) pada panjang

Bisman Perangin-angin JURNAL PENELITIAN MIPA Volume 2, Nomor 1 Juni 2008

31

gelombang tertentu. Dengan diperolehnya/ diketahuinya spectrum fluoresensi dari suatu bahan maka dapat diketahui karaktristik bahan tersebut dan proses selanjutnya adalah identifikasi. Sinyal fluoresensi ini adalah sinyal transien yaitu singkat dan lemah. Oleh karena itu untuk mendeteksi sinyal fluoresensi ini diperlukan penanganan khusus. Pada kesempatan ini dirancang dan direalisasikan sebuah perangkat fluoremeter berbasis komputer .

Penelitian ini bersifat sain dan paket teknologi dengan perancangan sistem sensor dan kontrol berbasis mikrokomputer pada peralatan spektroskopi terapan dan langsung digunakan sebagai detektor pada pemisahan kromatograpi. Secara garis besar peralatan terdiri dari sebuah sumber UV/ Visible, Sel sampel, Sistem sensor, Peralatan optic, rangkaian elektronik (penguat sinyal, pencuplik ,integrator dan lainnya), dan Sistem Mikroprosesor (Mikrokomputer) sebagai pengolah data. Selain perangkat keras maka dirancang perangkat lunak program pengendali. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil

Gambar 6. Spektrum Absorbance dari Minyak Zaitun

(Olive Oil), vco dan Minyak Sereh

Gambar 7. Spektrum Fluoresensi dari Rhodamine 6G Pembahasan Pengamatan spektrum absorbance dari sampel merupakan langkah awal untuk menentukan sumber yang digunakan untuk pengamatan sinyal fluoresensi dari bahan tersebut. Dari ketiga spektrum absorbance yang ditunjukkan , maka dapat diketahui bahwa panjang gelombang yang diserap oleh bahan tersebut dalam kisaran daerah uv dan visible. Sinyal fluoresensi adalah merupakan sinyal transien, yaitu singkat dan lemah. Waktu hidup (life time) dari sinyal fluoresnsi adalah dalam orde nano detik (ns). Selain singkat juga sangat lemah, sehingga kadang-kadang sinyal fluoresensi terbenam dalam derau. Sehingga untuk menangkap/ mendeteksi sinyal fluoresensi dari molekul yang berfluoresensi diperlukan penangan khusus. Salah satu cara yang dikembangkan adalah sistem cuplik dan tahan (sample and hold , S/H). Cara ini direalisasikan pada teknik Boxcar Integrator, dimana sinyal fluoresensi dicuplik berkali-kali sehingga sinyal terangkat dari derau. Hal ini dilakukan pada beberapa titik pengamatan sepanjang daerah panjang gelombang fluoresensi.

Bisman Perangin-angin JURNAL PENELITIAN MIPA Volume 2, Nomor 1 Juni 2008

32

Pada pengamatan sinyal fluoresensi dari sampel standard yaitu Rhodamine 6G diperoleh spektrum fluoresensi yaitu kurva antara intensitas terhadap panjang gelombang λ , dan puncak ( peak ) intensitas pada panjang gelombang λ = 600 nm. Hasil pengamatan ini jika dibandingkan dengan tiori maka diperoleh hasil yang bersesuaian. KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Pada penelitian ini telah direalisasikan peangkat fluoremeter berbasis komputer untuk pengamatan sinyal fluoresensi dan telah diperoleh data awal. Untuk penelitian berikutnya peralatan ini perlu disempurnakan (baik perangkat keras maupun perangkat lunak) yaitu pembuatan data logger dan kemudian diaplikasikan untuk pengukuran sinyal fluoresensi dari berbagi sampel. Selain itu dilakukan pengumpulan data dari berbagai literatur dan pembuatan data base. Saran Untuk mendapatkan hasil yang lebih maksimal maka perlu dilakukan penggantian beberapa komponen peralatan yang lebih sensitip dan bersesuaian. Selain itu perlu dilakukan kunjungan studi banding ke beberapa Universitas atau Instansi yang telah mempunyai peralatan Fluorometer. DAFTAR PUSTAKA B Nikolaos, Paulos Skarkalis, 2000, Fluorescence

Spectra Measurement of Olive Oil and Other Vegetable Oils, Journal of AOAC Internatioanal, Vol. 83, pp. 1435-1439

Brahma S.K. , M.P. Baek, D. Gaskill, R.K. Force, W.h. Nelson, J. Sperry,1985, The Rapid Identification of Bacteria Using Time-Resolved Fluorencence Excitation spectral Methods, Applied Spectroscopy vol.41, no.2, hal. 869-872.

Christian. Gary D., James E.O’ Reilly, 1986, Instrumental Analysis, Allyn and Bacon Inc., Boston, London, Sydney, Toronto.

Dahan M, Deniz AA, Ha T, Chemla DS, Schultz PG, and Weiss S. 1999 Ratiometric measurement and identification of single diffusing molecules. Chem Phys 247: 85–106,

Davitt Kristina, Yonn-Kyu Song, 2005, 290 and 340 LED arrays for Fluorescence detection from single airborne particles, Optics Express, Vol.13, No. 23

Fraden Jacob, 1996, Handbook of Modern Sensor, Springer-Verlag New York,Inc .

Hess ST, Huang S, Heikal AA, and Webb WW.2002, Biological and chemical applications of fluorescence correlation spectroscopy: a review. Biochemistry 41: 697–705.

Instruction Manual, 2001, Hithachi Fluoresensi Spectrophotometer, FL Solutions Program, Hitachi High-Technologies Corporation.

Miller, G.N,Ed, 1981,Standardization & fluorescence spectrometry, Chapman and Hall, 1981

Perangin-angin Biman, 1988, N2 Laser Fluorescence Spectrometer Using Boxcar Integrator, Tesis Fakultas Pascasarjana program studi optoelektronika dan aplikasi laser. UI,

Taylor Richard F, Jerome S Schultz,1996, Handbook of Chemical and Biological Sensors, IOP Publishing Ltd .

Tu. Anthony T, 1982, Raman Spectroscopy in Biology –Principles & Applications, Jhon Wiley & Sons.

Weiss S, 1999, Fluorescence spectroscopy of single biomolecules, 1999, Science 283: 1676–1683.

Wollgang Demtroder, 1982, Laser Spectroscopy, Springer-Verlac Berlin Heidelbeg New York.