laboratorio calculo eficiencia transformacion_analisis resultados transformacion.pdf

7/25/2019 Laboratorio Calculo Eficiencia Transformacion_analisis resultados transformacion.pdf

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Resultados Prctica

Transformacin


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Eficiencia de Transformacin


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Para clculo de eficiencia

Nmero de colonias transformadas

Cantidad de plsmido agregado a

bacterias que estn en placa

a. Cantidad total de AN de plsmido al inicio

b. Cantidad de AN de plsmido !en las

bacterias" que se agreg a la placa

Clculo transformantes por ug plsmido


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Nmero de colonias transformadas

Conteo en la placa

#i $a% muc$as se puede contar & de laplaca' o la mitad % multiplicar

E() *+,


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E(emplo a partir de una colonia !una colonia

en la solucin de transformacin"


Concentracin de plsmido) ,',- ugu/

0olumen de plsmido) *,u/

0olumen de solucin de transformacin) 12,u/

0olumen /3 !agregado antes de placas") 12,u/


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AN !ug"4 conc. plsmido!ugu/" x5ol. plsmido !ul"

Cantidad AN4 ,.,-ugu/ 6 *,u/

Cantidad total de AN !plsmido" que usaron) ,.-ug


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b. Cantidad de AN de plsmido !en las bacterias" que

se agreg a la placa !es una fraccin del total"

7raccin de AN usado4 0olumen en placa0olumen total en tubo

7raccin AN4 *,,u/ 2*, u/ 4 ,.1

8de dnde salieron los 2,,u/9

Total de plsmido en la placa4 fraccin 6 cantidad inicial plsmido

Total de plsmido en la placa4 ,.1 6 ,.-ug 4 ,.*:ug


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Clculo transformantes por ug

plsmido

Eficiencia de transformacin4

nmero de transformantes ug de plsmido en placa

Eficiencia de transformacin4

*+, transformantes,.*:ug4 **-; transformantesug


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Aplicaciones transformacin


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C2,

C

2,) 7amilia grande en?imas' la ma%or@a

catali?a o6idacin de sustancias orgnicas

/os sustratos de las en?imas C


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Anlisis funcional de mutaciones en

C


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0ariantes anali?adas

Variante Mutacin Haplotipo base (5 SNPs codificantes)

NomenclaturaC


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#ecuencia

Plsmido con gen CP!"!

#ntroducir al gen sil$estre las

$ariantes deseadas por

mutag%nesis dirigida

H

&ransformar ' coli para tenermucas copias de los

plsmidos con las $ariantes

deseadas

&ransformar le$aduras

'xtraer microsomas

Medir concentracin

de CP!"! en

extractos

*eterminar acti$idad

en+imtica


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utagBnesis irigida

M i b i d i di i id


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Mecanismo bsico de mutagnesis dirigida

CAF

FTC

CAF

FCC

CAF

FCC

CAF

+ polimerasa

+ primer

Replicacin

FCC

CFF

Mutante

T$r

Traduccin

Original

FTC

CAF

0al

Traduccin

Cambio de un aminocido

Protena original

Protena mutante

primer

(1)

(2)

(3)

(5)

(4)

(6)

Val Thr


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*ise,o de primers para mutag%nesis

dirigida

#tratagene)

Primer tiene la mutacin utacin debe de estar en el medio /ongitud de 12D>2 nucletidos % contenido FC de

por lo menos >,I. /a Tm alrededor de ;-JC. El e6tremo del primer tiene que ser C o F

5

5

3

3

*

*


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#iguientes pasos

iniprep para aislar plsmidos

#ecuenciar para confirmar cambio


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0ector p


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Transformacin /e5aduras

Transformacin de le5adura es mu%

similar a la transformacin de E.coli


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/e5adura N0#c*DOR

utacin en =RA en?imapara s@ntesis de uracilo. Nopuede crecer en medio sinuracilo

OR) e6presa la en?imareductasa $umana. /a acti5idadde p>2, depende de electrones

que le da la citocromo p>2,reductasa. /a acti5idadendgena de la reductasapuede no ser suficiente' por esose sobree6presa para asegurarla e6presin de C


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E6traccin de microsomas

icrosomas son artefactos tipo

5es@cula que se forman a partir delRE cuando las cBlulas se rompen enel laboratorio

No se encuentran en las cBlulas in5i5o

#e pueden separar del resto de lacBlula por centrifugacin diferencial CBlulas sin romper' ncleos %

mitocondrias sedimentan a *, ,,,g En?imas solubles % RE fragmentado

!que contiene p>2," quedan ensolucin A *,, ,,,g el RE sedimenta como

un KpelletL pero las en?imas solublesquedan en sobrenadante

As@ se a@slan % concentranmicrosomas con p>2,


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Cantidad de prote@na'

concentracin P>2,

Concentracin de prote@na) espectrofotmetro

Concentracin P>2,) mBtodo mura % #ato


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Acti5idad En?imtica

-it

P.5/01lo


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Acti5idad en?imtica


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Abundancia relati5a


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Acti5idad en?imtica relati5a


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Oacer el clculo de eficiencia detransformacin con datos propios

0er manual de insTAclone

E(ercicio adicional de clculo de eficiencia

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