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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN QUIMICO FARMACOBIOLOGO

Laboratorio de Genética

Instructores del Curso:

Dra. Perla del Carmen Niño Moreno Dr. José Ismael Acosta Rodríguez

M en C. Edgar Alejandro Turrubiartes Martínez M en C. Luis Renato Gámez López

Nombre del alumno:

___________________________________

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Índice

Índice

Introducción

Reglamento Interno

Normas de Higiene y Seguridad

Demostración de ADN en células humanas

Determinación de cromatina (X/Y)

Errores innatos del metabolismo

Cuantificación de Mucopolisacáridos en orina

Observación de cromosomas en células de medula ósea de ratón

Determinación de Polimorfismos por PCR-RFLP

Determinación de alteraciones a nivel de expresión de genes

Determinación de alteraciones a nivel de proteínas

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Introducción

Todos poseemos genes que influencian de manera significativa nuestras

vidas, estos afectan nuestra altura, peso, color de cabello y pigmentación de la

piel. Además, afectan nuestra susceptibilidad a muchas enfermedades y

trastornos e incluso contribuyen con nuestra inteligencia y personalidad. Así, los

genes son fundamentales para ser quien y como somos.

A pesar de que la ciencia de la genética es relativamente nueva comparada con

otras ciencias, los individuos han comprendido la naturaleza heredable de los

rasgos y han practicado genética desde hace miles de años.

El surgimiento de la agricultura se dio cuando la gente comenzó a aplicar los

principios de la genética al cultivo de plantas y domesticación de los animales,

hoy en día los principales cultivos y animales que se utilizan en la agricultura han

experimentado amplias alteraciones genéticas para incrementar su rendimiento

y rasgos genéticos deseables.

La genética tiene un papel crítico en la medicina, ya que muchas enfermedades

y desordenes presentan un componente hereditario. Los avances en la genética

molecular han permitido el desarrollo de numerosas pruebas diagnósticas.

La genética es pues una de las fronteras de la ciencia moderna. Basta solo con

ver cualquier medio informativo y se encontrará algo relacionado con la genética:

el descubrimiento de los genes que causan cáncer, la aplicación de la terapia

génica para curar enfermedades, informes sobre la posible influencia de la

herencia sobre la inteligencia, personalidad y orientación sexual. Estos hallazgos

tienen importantes implicaciones éticas y económicas, lo que hace que el estudio

de la genética sea relevante, oportuno e interesante.

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Reglamento interno del

Laboratorio de Genética

1. El alumno deberá descargar de la página electrónica del laboratorio las

prácticas.

2. Deberá haber leído la práctica antes de iniciar la sesión de laboratorio, para

poder presentar su examen previo.

3. Sin excusa deberá presentarse al laboratorio con bata blanca de manga larga

y en el caso de las alumnas el pelo recogido.

4. Se pasará asistencia al inicio de la práctica. Solo se dará un margen de 10

minutos para entrar.

5. Para acreditar el laboratorio deberá acreditar como mínimo el 80% de las

prácticas.

6. Deberá limpiar su lugar de trabajo antes y después de la sesión.

7. El alumno deberá guardar buena conducta.

8. Deberá colocar el material y reactivos en el lugar asignado al inicio de la

sesión. Será responsable de que sus muestras estén correctamente

identificadas.

9. Los informes de laboratorio serán entregados antes de iniciar una nueva

práctica.

10. La evaluación consistirá en:

35 % Examen prelaboratorio

15% Desempeño en el laboratorio:

7.5% Manejo de equipo, reactivos y material de laboratorio

7.5% Cumplimiento del reglamento interno del laboratorio

50 % Informe de resultados en el manual de prácticas.

10% Cuestionario

5% Resultados

5% Observaciones

25% Conclusiones

5% Bibliografía

11. La calificación mínima aprobatoria será de 6.0

12. La calificación final del laboratorio será considerada en el curso teórico como

un 10% del total siempre y cuando el alumno apruebe todos los exámenes.

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Normas de Higiene y seguridad

1. Mientras este en el laboratorio deberá usar siempre bata de manga larga.

2. Durante cualquier procedimiento deberá usar guantes, queda estrictamente

prohibido tocar reactivos, material o equipo sin guantes.

3. No toque con los guantes piel expuesta u objetos de uso común. No abandone

su lugar de trabajo, queda estrictamente prohibido que pasee por el laboratorio

o pasillos.

4. Mientras este en el laboratorio no coma, beba o fume, no se aplique

cosméticos ni guarde alimentos o enseres personales.

5. Mantenga el Laboratorio limpio y ordenado.

6. Lleve a cabo todos los procedimientos técnicos como le son indicados

evitando al mínimo cualquier riesgo.

7. Seguir las recomendaciones del buen uso de todo el equipo de laboratorio.

8. Todo desecho tóxico o biológico-infeccioso deberá ser confinado en los

recipientes adecuados.

9. Mantener a la temperatura indicada todos los reactivos, muestras y enzimas

utilizadas en el laboratorio.

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PRÁCTICA No. 1 DEMOSTRACION DEL DNA EN CÉLULAS MONONUCLEARES HUMANAS

DE SANGRE PERIFERICA.

OBJETIVO Aislar e identificar por kit comercial el ADN genómico en células sanguíneas humanas INTRODUCCIÓN Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación. La mayoría de los procedimientos para la extracción de ADN consisten de 3 etapas: Homogenización de la muestra El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente, necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el material de interés. Se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas. Es importante comprender que durante la homogenización de la muestra, así como en otros pasos siguientes de la purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados

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para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN. Extracción de proteínas y lípidos Los ácidos nucleicos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro orgánico no polar, los ácidos nucleicos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo. Precipitación de ácidos nucleicos La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales), y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible (mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los mismos. El DNA Humano: De forma característica, el núcleo de una célula humana contiene más de 99% del DNA celular. El genoma nuclear está distribuido entre 24 tipos distintos de moléculas de DNA lineal de doble cadena, cada una de las cuales tiene histonas y otras proteínas no histonas enlazadas a ella para conformar un cromosoma. El DNA seleccionado para secuenciación en el Proyecto del Genoma Humano no fue el genoma nuclear total, sino la porción eucromática, que comprende casi 3000 Mb. También existen más de 200 kb de heterocromatina constitutiva condensada de manera permanente y en regiones inactivas en sentido transcripcional, que proporcionan un tamaño total del genoma del orden de 3200 Mb. DISEÑO DE LA PRÁCTICA. Material Biológico: SANGRE COMPLETA CADA equipo deberá presentarse con una muestra de mínimo 1 ml de sangre con EDTA como anticoagulante.

IMPORTANTE: Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo. PROCEDIMIENTO:

1. Tomar 300µL de sangre completa y colocarla en un tubo eppendorf de 1.5 ml.

2. Agregar 900 µL de solución de lisis celular y mezclar continuamente 3. Incubar durante 10 minutos. 4. Centrifugar 45 segundos a temperatura ambiente.

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5. Descartar sobrenadante quedándose con el pellet (es importante descartar lo más posible porque de eso depende la calidad del ADN).

6. Resuspender el pellet con 300 µL de solución de lisis de núcleo y mezclar por inversión hasta observar la completa disolución del pellet.

7. Adicionar 100 µL de solución de precipitación de proteínas y mezclar por vortex (20 segundos).

8. Centrifugar 5 minutos y recuperar el sobrenadante en un tubo eppendorf estéril y perfectamente marcado.

9. Agregar 300 µL de isopropanol. 10. Mezclar por inversión hasta observar la formación de una redecilla color

blanco (ADN). 11. Centrifugar 2 minutos y descartar el sobrenadante. 12. Lavar el pellet con 300 µL de etanol al 70%, mezclar por inversión sin

que se desprenda el pellet. 13. Centrifugar 2 minutos y eliminar con pipeta todo el sobrenadante sin

tocar el pellet. 14. Secar el pellet a temperatura ambiente destapado el tubo 5 minutos para

eliminar el etanol, tenga cuidado de no contaminar su muestra. 15. Resuspender el pellet en 100 µL de solución de rehidratación. 16. Cuantificar a 260 nm y hacer el cálculo de la concentración

(posteriormente). 17. Cargar 10µl del DNAg con 2µl de buffer de carga 6X y visualizar el

producto en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Fotografiar.

Cálculo de la concentración de DNA [ DNA] = (D.O. 260nm ) (50µg/ml) (F dilución)

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PRÁCTICA No. 2

TÉCNICA DE LA DETERMINACIÓN DE CROMATINA “X” INTRODUCCIÓN Barr y Bertram en 1949, encontraron un cromocentro grande en las células ganglionares de la gata. Aunque en un principio se le consideró un satélite nucleolar vinculado con el núcleo, en investigaciones posteriores , se confirmó que éste elemento, denominado CROMATINA SEXUAL, se haya íntimamente emparentado con la cara interna de la envoltura nucleolar, y se reconoce en la hembra humana. Las pruebas de cromatina fueron las primeras técnicas citogenéticas que encontraron una aplicación clínica práctica. Así, se introdujo el extendido de células de mucosa oral, como recurso útil para establecer el sexo genético empleando colorantes de cromatina “X” (Tionina) y cromatina “Y” (Quinacrina). Es conveniente usar el término CROMATINA SEXUAL, al referirse a las células somáticas femeninas. FUNDAMENTO La cromatina “X” es un pequeño cuerpo intranuclear de forma convexa y de 0.7 a 1.2 micras de diámetro y se tiñe intensamente con colorantes nucleares , tales como la tionina , violeta de crecilo, hematoxilina, verde de metilo, etc., dando acumulos bien definidos de cromatina “X”. El método más simple y más frecuentemente utilizado para su estudio es el frotis de la mucosa oral, obtenido de un raspado suave de ésta , extendiéndola en la laminilla y realizar la tinción. Se ha reportado que está presente en mujeres y ausente en hombres (10 al 98% en mujeres , dependiendo de la técnica y método de tinción empleados) MATERIAL (Biológico). La cromatina “X” puede demostrarse en los extendidos de piel, mucosa oral, vaginal, uretral. Los cortes histológicos de los órganos parenquimatosos de las mujeres, también revelan la cromatina “X”. REACTIVOS -Solución madre de tionina. -Tionina. 1 g -Alcohol etílico 100ml. -Filtrar en papel en filtro normal. Solución de trabajo de Tionina. Mezclar en una jarra Copling: -Solución concentrada de tionina 20 ml - Amortiguador de fosfatos 14 ml - HCl 0.1 N 16 ml Amortiguador de fosfatos pH 5.7 Solución concentrada (0.2 M) - Solución A: NaH2PO4 2.780 g Disolver en 100 ml de agua destilada - Solución B: : NaH2PO4.7 H20 5.365 g

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Disolver en 100 ml de agua destilada - Tomar 93.5 ml de la solución A y 6.5 ml de la solución B y llevar a un volumen total de 200 ml con agua destilada y verificar el pH. Solución de trabajo pH 5.7 Mezclar en el siguiente orden en una jarra Copling: - Solución concentrada de Tionina 20 ml - Amortiguador de fosfatos 14 ml - HCl 0.1 N 16 ml TÉCNICA Con una espátula de metal estéril obtener células epiteliales por raspado de la mucosa oral. Desechar el producto del primer raspado. Colocar las células del segundo raspado (del mismo lado) en una laminilla limpia y realizar la técnica de Squash (apretar con un cubreobjetos la muestra). El segundo raspado produce generalmente las mejores células. No deben hacerse extensiones demasiado finas, pues son difíciles de examinar. Fijar la laminilla con metanol/ácido acético (3:1) a la llama: Hidrolizar con HCl 5 N (recién preparado, 42.75 ml de la solución concentrada comercial y llevar a 100 ml. Esta solución sirve para varias muestras) durante 5 min. Lavar y escurrir. Teñir con la solución de trabajo de Tionina, durante 15 min. Se observan las células al microscopio, se cuentan 100 y se determina cuantas de ellas tienen corpúsculo de Barr. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Debe recordarse que cuando se observan varias cromatinas “ X “ en un mismo núcleo de cromosomas “ X “ el número es uno menos que el número de cromosomas “ X “, en base a la hipótesis de Lyon. Si hay más de un corpúsculo de Barr por núcleo, debe tomarse en cuenta esta observación. Del mismo modo, si hay una incidencia sorprendentemente baja deberá también anotarse. Es absolutamente esencial recordar que la prueba de la Cromatina Sexual no puede ser usada para determinar el verdadero sexo genético de un paciente. El sexo genético de los humanos depende de la presencia ó ausencia de un cromosoma “ Y “, no del número de cromosomas “ X “ qué presente.

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PRACTICA No.3

CROMATINA Y. INTRODUCCIÓN Con el advenimiento de las técnicas de fluorescencia, se puso de manifiesto que la región más brillante del cariotipo correspondía al segmento distal del brazo largo del cromosoma Y o cromosoma masculino. Esta fluorescencia se puso también de manifiesto en los núcleos en interfase, tanto al emplear mostaza de quinacrina, como en el empleo de la clormetacrina. Con esta última metodología, no solo se lograba visualizar el corpúsculo de fluorescencia (cromatina Y) en las células de interfase de la mucosa oral, sin no que también fue posible distinguir citológicamente los espermatozoides que portan cromosoma Y de los que llevan gonosoma X. Los sujetos con complemento gonosómico XYY muestran dos corpúsculos de fluorescencia en sus células en interfase. Con el empleo de la clormetacrina puede evidenciarse la fluorescencia de la mitocondria en tripanosómidos lo cual llegó a una mayor precisión sobre los mecanismos que explican la aparición de bandas en los cromosomas. La cromatina Y puede determinarse también en células amnióticas o en las trofoblásticas, y algunas secuencias génicas localizadas en el cromosoma Y pueden determinarse mediante el empleo de las enzimas de restricción. FUNDAMENTO La región dista del brazo largo del cromosoma Y contiene DNA’s satélites que dan fluorescencia al ser teñidos con quinacrina, y puede observarse como un cuerpo fluorescente brillante en la interfase nuclear. MATERIAL (Biológico). La cromatina “Y” puede demostrarse en los extendidos de piel, mucosa oral y espermatozoides. REACTIVOS --- Regulador de McIlvaine’s (pH=5.6) Ácido cítrico 2.1 g Fosfato dibásico de sodio (Na2HPO4) 3.9 g Agua destilada 500 ml TÉCNICA 1.- Con una espátula de metal estéril obtener células epiteliales por raspado de la mucosa oral. Desechar el producto del primer raspado. Colocar las células del segundo raspado (del mismo lado) en una laminilla limpia y realizar la técnica de Squash (apretar con un cubreobjetos la muestra). El segundo raspado produce generalmente las mejores células. No deben hacerse extensiones demasiado finas, pues son difíciles de examinar. 2.- Fijar la laminilla con metanol absoluto durante 10-15 minutos y secar. 3.- Teñir con la solución de quinacrina de 5 a 10 minutos. 4.- enjuagar con agua destilada 1 minuto

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5.- Añadir 1.0 ml del regulador de McIlvaine’s (pH=5.6) 6.- Observar en un microscopio de fluorescencia a una longitud de onda de 450 a 500 nm. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Debe recordarse que sólo debe observarse una cromatina “ Y “ por núcleo. Si hay más de un corpúsculo por núcleo, debe tomarse en cuenta esta observación. Del mismo modo, si hay una incidencia sorprendentemente baja deberá también anotarse. --- Solución de Quinacrina Quinacrina (atabrina) 100 mg Regulador de McIlvaine’s (pH=5.6) 200 ml

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PRACTICA No. 4 PRUEBA DEL CLORURO FERRICO PARA LA DETERMINACIÓN DE

FENILCETONURIA EN ORINA. INTRODUCCION La fenilalanina es un aminoácido esencial que participa en la síntesis de proteínas en los tejidos y cuya vía metabólica de mayor importancia fisiológica implica su conversión a tirosina mediante una reacción de hidroxilación catalizada por la enzima fenilalanina-4-hidroxilasa (FAH). La anormalidad más común en el metabolismo de la fenilalanina es la fenilcetonuria clásica. En este Error Innato del Metabolismo (EIM), la conversión de fenilalanina a tirosina esta bloqueada debido a una deficiencia total de la enzima FAH. Como resultado de éste bloqueo metabólico se acumula fenilalanina en los tejidos y líquidos corporales y las vías alternas se activan dando lugar a una sobreproducción y excreción de los ácidos fenilpirúvico, feniláctico, fenilacético, O-hidroxifenilacético, feniletilamina y fenilacetilglutamina. FUNDAMENTO Los iones férricos forman un complejo verde con los grupos fenólicos de la fenilalanina y sus derivados cetónicos; ácido fenilpirúvico, ácido P-hidroxi-fenilpirúvico y O-hidroxifenilpirúvico. NOTA también pueden reaccionar con el cloruro férrico compuestos de varias clases, por ello se necesita experiencia y cuidado al interpretar la prueba. REACTIVOS 1.- Cloruro férrico (Fecl3.6H2O) 0.6 N. 2.- Agua desionizada. Disolver 16.2 g del reactivo No. 1 en 80 ml de agua desionizada y aforar a 100 ml). TECNICA 1.- Deposite 2.0 ml de la orina problema en un tubo de ensaye de 12 x 75 mm. 2.- Coloque cerca un agitador Vortex encendido y agregue gota a gota el reactivo de cloruro férrico, agitando inmediatamente después de cada gota. 3.- A medida que las gotas caen, observe el color o colores que se forman. Después de agregar aproximadamente 2.0 ml de cloruro férrico, la reacción se da por terminada. INTERPRETACION DE RESULTADOS Una coloración verde estable, que aparece dentro de los primeros minutos, puede indicar fenilcetonuria (PKU), pero debe ser siempre confirmada con una prueba positiva para dinitrofenilhidrazina (DNFH). También, ocasionalmente puede obtenerse una prueba positiva (verde) en la histidinemia y tirosinemia, una prueba negativa no descarta necesariamente éstas dos últimas aminoacidopatías. La coloración obtenida con más frecuencia es café o amarilla y significa ausencia de fenilalanina o de sus derivados cetónicos en la orina. Algunos medicamentos o drogas también pueden dar positiva la prueba, por lo que deben usarse los controles adecuados.

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PRACTICA No.5 PRUEBA DEL NITROPRUSIATO PARA CISTINURIA EN ORINA.

INTRODUCCION La Cistinuria es un Error Innato del Metabolismo (EIM) debido a la deficiencia del sistema de transporte común para cistina y los aminoácidos dibásicos: lisina, arginina, ornitina. Las consecuencias de este bloqueo metabólico, son una absorción intestinal y una resorción tubular renal deficientes de los aminoácidos mencionados anteriormente, químicamente la enfermedad se caracteriza, por una excreción en la orina en grandes cantidades de cualquiera de estos aminoácidos, en presencia de niveles plasmáticos normales ó ligeramente reducidos de ellos. FUNDAMENTO Esta prueba sirve para buscar cistinuria y homocistinuria. En caso de ser positiva debe hacerse posteriormente la prueba del nitroprusiato-plata, para diferenciar entre ambas, y se basa en la formación de un color púrpura soluble en presencia de nitroprusiato de sodio. MATERIAL (BIOLOGICO) Orina concentrada de la mañana, ó bien orina de 24 hrs. En caso de infantes asegurarse que no sea dentro de las primeras 72 hrs. después del nacimiento. Enviar la muestra de orina al laboratorio lo antes posible. Congelar la muestra en caso de no proceder al examen de inmediato. REACTIVOS 1.- Cianuro de sodio al 5%. Se disuelven 0.5 g de cianuro de sodio en 9.5 ml de agua desionizada (volumen final 10 ml). 2.- Nitroprusiato de sodio al 5%. Disolver 0.5 g de nitroprusiato de sodio en 9.5 ml de agua desionizada. Este reactivo debe prepararse minutos antes de su uso. 3.- Cistina. Preparar como testigo. TECNICA 1.- A 2.0 ml de orina, depositados en un tubo de ensayo, añadir 1 ml de la solución de cianuro de sodio al 5%. 2.- Se prepara una orina testigo positiva, con orina normal añadiendo 10 mg/ml de cistina, o bien orina de un paciente con cistinuria. Añada también un tubo testigo negativo de orina normal. 3.- La mezcla de orina y cianuro de sodio se deja reposar a temperatura ambiente por lo menos 5 pero no más de 20 minutos. 4.- Después, agregue la solución de nitroprusiato gota a gota y agite continuamente en un Vortex. 5.- Observe los cambios de coloración. INTERPRETACION DE RESULTADOS La aparición de un color rojo púrpura indica una concentración anormal de cistina u homocistina. Cualquier compuesto con puentes disulfuro da una

reacción positiva. Con mayor frecuencia la -mercapto-lactato-cisteína-disulfisuria, puede dar reacción positiva. La inhalación de N-acetil cisteína-disulfiduria, puede también dar reacción positiva, mientras que la inhalación de

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N-acetil cisteína puede dar falsos positivos al eliminarse catabolitos de esta droga, se debe realizar la prueba del nitroprusiato de plata para diferenciar cistinuria de homocistinuria.

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PRACTICA No. 6 PRUEBA DE NITROPRUSIATO PARA LA DETERMINACION DE

HOMOCISTINA INTRODUCCION La homocistinuria es clínicamente parecida al síndrome de Marfan, debido a que también puede presentarse el mismo fenotipo, convulsiones, eventos tromboembólicos y retraso mental. Esta aminoacidopatía tiene su base molecular en la deficiencia de la enzima sintetasa de cistationina. Esta técnica es útil para diferenciar homocistina de cistina y debe de realizarse después de una prueba de nitroprusiato positiva. FUNDAMENTO El reactivo de Brand, cianuro de nitroprusiato; (Na2Fe(CN)5.2H2O) reacciona con los grupos sulfhidrilo, los cuales han sido modificados por la adición previa de nitrato de plata amoniacal. La reacción de la plata reduce rápidamente el grupo sulfhidrilo de la homocisteína a tiol; en cambio, el grupo SH de la cistina lo hace muy lentamente. En esta reacción, el grupo cianuro actúa con "unidor de iones". Esta reacción se usa para buscar cantidades elevadas de homocistina en la orina, como en el caso de la homocistinuria. MATERIAL (BIOLOGICO) Se recomienda examinar la orina de la mañana recolectada en frasco limpio, después de la ingestión del alimento. REACTIVOS 1.- Hidróxido de amonio al 3%. Se prepara mezclando 0.5 ml de hidróxido de amonio con 5 ml de agua desionizada. 2.- Nitrato de plata al 1%. Disolver 50 mg de nitrato de plata en 5 ml de la solución anterior. 3.- Nitroprusiato de sodio. Disolver 100 mg de ferrocianuro de sodio (Na2Fe(CN)5.2H2O) en 10 ml de agua desionizada. 4.- Cianuro de sodio al 7%. Disolver 70 mg de cianuro de sodio en 10 ml de agua desionizada. Este reactivo se prepara en la campana de extracción y no se debe pipetear con la boca porque es muy tóxico. NOTA: Todos estos reactivos deben prepararse minutos antes de su uso. 5.- Control positivo: Se disuelven 5 mg de homocistina en 100 ml de agua desionizada. Se preparan alícuotas de 5 ml que se guardan en refrigeración a -20oC. TECNICA 1.- Deposite 2.5 ml de las orinas problema, control positivo y de un sujeto normal (testigo negativo) en tubos de 16 x 100 mm a los cuales se agregó previamente 1.0 g de cloruro de sodio. Mezclar y reposar 5-10 minutos. 2.- Tome 2.5 ml de los sobrenadantes de los tubos anteriores y transfiéralos a otros tubos limpios de 16 x 100 mm.

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3.- Añada 0.25 ml de la solución de nitrato de plata e hidróxido de amonio al 3% (reactivo 2). Mezcle y deje reposar 5-10 minutos. 4.- agregue 0.25 ml de la solución de nitroprusiato de sodio al 1%. 5.- Bajo una campana de succión de aire, agregue 0.5 ml de la solución de cianuro de sodio al 7%, observe el color formado dentro de los primeros segundos. No agite. INTERPRETACION DE RESULTADOS La aparición de un color rosa ó púrpura (rojo intenso) se considera positivo. Cualquier compuesto con puentes disulfuro dará una reacción positiva. Frecuentemente las orinas muy concentradas muestran una reacción débilmente positiva. La homocistina corre junto con la serina en la cromatografía de butanol:ácido acético:agua usados en el tamizaje; y algunas veces es posible que no exista una banda anormal en la región de la serina u homocistina y solo la prueba del nitroprusiato es positiva. Una reacción positiva también puede sugerir otras alteraciones metabólicas en las cuales se secretan compuestos

sulfonados como en la -mercapto-lactato cistinuria-disulfiduria.

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PRACTICA No. 7 PRUEBA DE LA DINITROFENILHIDRAZINA (DNFH) EN ORINA INTRODUCCION Los ácidos orgánicos que se encuentran en la orina constituyen un grupo de metabolitos heterogéneos que difieren en sus estructuras y propiedades químicas. Para detectar una o varias clases de estos ácidos se han empleado diversos métodos de análisis, pero solo recientemente se han desarrollado técnicas simples y apropiadas para el uso clínico de rutina, siendo los más estudiados los métodos químicos cualitativos, por ejemplo: Giorgio y Luhby propusieron una prueba discriminatoria rápida para el ácido metil malonico con para-ninoanilina al 0.1% (peso/volumen) que da un color verde. La presencia de un exceso de cetoácidos en orina puede ser demostrado con 2,4 dinitrofenilhidrazina (prueba de 2,4 DNFH), que da un precipitado amarillo de cetoácidos.

Las siguientes condiciones clínicas pueden indicar la necesidad de la determinación de ácidos orgánicos. 1.- Acidosis metabólica de causa desconocida, con un anion restante aumentado. 2.- Presencia de un olor inusual en un lactante. 3.- Vómitos recurrentes, mala alimentación. 4.- Enfermedad aguda en la infancia, asociada con acidosis metabólica ó hiperamonemia. 5.- Paresia cerebral extrapiramidal, progresiva en la niñez. 6.- Cualquier enfermedad hereditaria de causa no determinada adecuadamente. FUNDAMENTO

Los -ceto derivados y las cetonas de los aminoácidos de cadena ramificada, forman hidrazonas insolubles coloreadas en orina modificada, por una reacción de los grupos carbonilo con la 2,4 dinitrofenilhidrazina. Esta reacción es positiva en padecimientos como la enfermedad de orina de jarabe de Maple y otras aminoacidopatías conocidas como cetoacidurías. MATERIAL (BIOLOGICO) Orina con concentraciones de creatinina superiores a 0.3 mg/ml. REACTIVOS 1.- 2,4 Dinitrofenilhidrazina al 0.5% en HCl 2 N: Disuelva 1.25 g de DNFH en 125 ml de HCl 4 N con agitador magnético durante 120 a 150 minutos. Diluya a 250 ml con agua desionizada continuando la agitación. Esta solución es estable a temperatura ambiente.

2.- Solución estándar de almacenamiento: Disuelva 25 mg de ácido -ceto glutárico en 40 ml de agua desionizada y afore a 50 ml con la misma agua, después de la dilución completa del ácido, almacene en alícuotas de 5 ml a 4oC. 3.- Solución estándar de trabajo: ml de solución estándar de ml de agua desionizada concentración del almacenamiento estándar (mg %) 0.0 2.5 0.0

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0.75 1.75 15.0 1.25 1.25 25.0 2.5 0.0 50.0 TECNICA 1.- Colocar en tubos de 12 x 75 mm 1.0 ml de orina filtrada y de las soluciones estándar respectivamente. Adicionar 0.2 ml de la solución de 2,4 DNFH en HCl 2 N al 5% gota a gota y agitar. 2.- Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. 3.-Examinar los tubos, si se presenta un precipitado amarillo, de hidrazonas insolubles derivados de los aminoácidos de cadena ramificada, se examinan contra la luz. Se comparan los problemas con los estándares. INTERPRETACION DE RESULTADOS La presencia de un precipitado equivalente a 25 mg/100 ml (tercer estándar) ó mayor, hace positiva la prueba de ceto-ácidos en orina en cantidades anormales.

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PRACTICA No. 8 TECNICA DEL NITROSO NAFTOL PARA TIROSINA EN ORINA.

INTRODUCCION La tirosinemia hereditaria (tirosinemia I), es una enfermedad del metabolismo que afecta el hígado en neonatos y niños. La forma aguda (generalmente fatal), fue reconocida por primera vez en Canadá (región francesa) en recién nacidos, los cuales mostraron insuficiencia en el desarrollo, fiebre, irritabilidad y finalmente un estado letárgico, y en unas pocas semanas, cirrosis hepática, que terminaba con la vida del paciente. Actualmente, se sabe que un diagnóstico temprano, modifica el curso de la enfermedad mediante la implantación de una dieta baja en fenilalanina y tirosina, obteniéndose en algunos casos un desarrollo prácticamente normal. Una forma crónica que inicia en los primeros años de vida, cursa con raquitismo, cirrosis e insuficiencia renal progresiva. FUNDAMENTO La tirosina, tiramina y otros derivados del fenol para-alquilados en la orina, forman complejos rojos solubles con nitroso naftol en presencia de ácido nítrico. REACTIVOS 1.- Ácido nítrico 2.63 N; diluir 17 ml de ácido nítrico concentrado (comercial, 1.54 N) a 100 ml con agua desionizada. Almacenar a temperatura ambiente. 2.- Nitrito de sodio al 2.5%; disolver 2.5 g de nitrito de sodio en agua desionizada y aforar a 100 ml. Almacenar a 4oC. 3.- Nitroso Naftol al 0.1%; disolver 0.01 g de 1-nitroso-2-naftol en 100 ml de etanol al 95%. Almacenar a 4oC. 4.- Soluciones estándar de tirosina; disolver 30 mg de tirosina en agua desionizada, y aforar a 30 ml. Esta solución contiene 1.0 mg/ml= SOLUCIÓN ESTÁNDAR A. 5.- Tomar 10 ml de la solución estándar A y mezclarlos con 10 ml de agua desionizada. =SOLUCION ESTÁNDAR B. Esta solución contiene 0.5 mg/ml de tirosina. 6.- Tomar 10 ml de la solución estándar B y mezclarlos con 10 ml de agua desionizada. =SOLUCION ESTÁNDAR C. Esta solución contiene 0.25 mg/ml de tirosina. Guardar las soluciones estándar a 4oC. TECNICA 1.- Colocar 3 tubos de vidrio de 12 x 75 mm para los estándares y uno para cada orina problema. Depositar 1 ml de nitrito de sodio al 2.5% y 10 gotas del reactivo de nitroso naftol, y 3 gotas de ácido nítrico 2.63 N. 2.- Adicionar inmediatamente 3 gotas de c/u de los estándares y de las orinas problema a los tubos correspondientes. 3.- dejar reposar los tubos 5 minutos y después comparar el color de los estándares con el de los problemas. INTERPRETACION DE RESULTADOS La orina normal contiene 0.5 mg/ml ó menos de tirosina o sus derivados, una concentración mayor puede sugerir fallas en el metabolismo de la tirosina.

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PRACTICA No. 9 CUANTIFICACION DE MUCOPOLISACARIDOS EN ORINA.

INTRODUCCIÓN Los mucopolisacáridos son componentes estructurales de cartílago, huesos, cornea, piel, paredes de vasos sanguíneos y otros tejidos conectivos. Son degradados en etapas por enzimas lisosomales y, si existe un bloqueo en alguno de los pasos de la vía de degradación, los mucopolisacáridos se acumulan en los lisosomas y aumentara la excreción urinaria de mucopolisacáridos parcialmente degradados. Las mucopolisacaridosis MPS constituyen un conjunto de enfermedades hereditarias caracterizadas por el depósito de mucopolisacáridos en las células de muchos tejidos las características fenotípicas se manifiestan en etapas tempranas de la vida, en particular con aspecto facial dimórfico o rasgos gruesos, hirsutismo, anormalidades esqueléticas, rigidez de articulaciones y retardo en el desarrollo. El diagnóstico preliminar del tipo de MPS puede realizarse mediante la identificación de los productos de excreción urinaria. El diagnóstico definitivo se establece por el ensayo directo de la enzima en particular en los leucocitos o en cultivos de fibroblastos de piel. FUNDAMENTO Los mucopolisacáridos y mucoproteínas urinarias son precipitados por el cloruro de cetil piridium (CPC) en un amortiguador de citrato de sodio. La turbidez en comparada con la del estándar del sulfato de condroitina. MATERIAL (BIOLÓGICO) Orina de 24 hrs. Las concentraciones de mucopolisacáridos puede ser muy variable en el día por eso se usa preferente orina de 24 hrs. REACTIVOS

- Amortiguador de citrato de sodio pH 4.8 . Disolver 9.68gr de ácido cítrico y 15.88gr de citrato trisódico en agua desionizada, después se afora a 1Lt en matraz volumétrico. Antes de esto ajustar el pH con HCl. Guardar a 5°C.

- Reactivo de cloruro de cetil piridium. Disolver 250mg en amortiguador de citrato de sodio. Guardar a 5°C por 6 meses.

- Solución estándar. Disolver 1.5 y 10 mg de sulfato de condroitin en 100ml de agua desionizada. Guardar a 5°C.

- Control negativo. Orina normal filtrada.

TÉCNICA 1.- Filtrar 2 a 3 ml de orina problema en papel Wathman 40, determinar su concentración de creatinina. 2.- Depositar en un tubo de ensayo 1ml de orina sin filtrar y en otro orina filtrada del paso anterior. 3.- En tres tubos Coleman de 12 x 75mmm poner 1ml de solución estándar de sulfato de condroitin de 1.5 y 10mg. 4.- En otra cubeta Coleman de la misma medida depositar 1ml de agua destilada desionizada.

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5.- A todos los tubos anteriores agregar 1ml de reactivo CPC excepto en el tubo de orina filtrada del problema, en el que se pone 1ml de amortiguador de citrato de sodio pH 4.8. 6.- Mezclar y esperar 15min. 7.- Leer la transmitancia a 680nm. Leer los estándares contra el agua y la orina problema contra la orina filtrada. 8.- Expresar los resultados en unidades CPC (cetilpiridium Chloride) o bien en unidades CCP (cloruro de cetil/gramos de creatinina). 9.- Una unidad CCP equivale a la densidad óptica de la solución conteniendo 1mg de condroitin por 100ml de orina. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS La concentración de mucopolisacáridos son relacionados a la edad: 375 U CCP/ gr de Cr. o menos, en niños menores de 1 año. 175 U CCP/ gr de Cr. o menos, en niños menores de 9 años. 85 U CCP/ gr de Cr. o menos, en niños mayores de 9 años y adultos.

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PRACTICA No. 10 OBSERVACIÓN DE CROMOSOMAS EN CÉLULAS DE MÉDULA ÓSEA DE

RATÓN OBJETIVOS 1. Observar cromosomas mióticos en células de médula ósea de ratón 2. Demostrar el efecto de la colchicina sobre la división celular CONOCIMIENTOS MINIMOS Investigar: 1.- Los conceptos de células madre (stem cells) hematopoyeticas, células totipotenciales, pluripotenciales y unipotenciales. 2.- El concepto de diferenciación celular 3.- Los factores que regulan la hematopoyesis INTRODUCCIÓN En la médula ósea se pueden distinguir los diferentes tipos de células sanguíneas y sus precursores inmediatos por su aspecto característico. Todas ellas se hallan entremezcladas unas con otras, así como con los adipocitos y con otras células del estroma (células conjuntivas) que forman una delicada red estructural de fibras de colágena y de otros componentes de la matriz extracelular. Además, todo el tejido conjuntivo está altamente irrigado por vasos sanguíneos de paredes muy finas (denominados sinusoides sanguíneos) al interior de los cuales van a parar las nuevas células. También se hallan presentes los megacariocitos; estas células, a diferencia de otras células sanguíneas, permanecen en la médula ósea después de haber madurado, lo cual constituye una de sus características más remarcables; además son extraordinariamente grandes (con un diámetro de más de 60µm) y presentan un núcleo con elevada poliploidía. Normalmente se hallan adosados junto a los sinusoides y extienden sus expansiones y son arrastradas por la sangre. Debido a la compleja ordenación celular de la médula ósea, resulta difícil la identificación de los precursores inmediatos de las células maduras. Las células hematopoyéticas de la médula incluyen toda la serie de cambios evolutivos desde la primitiva célula madre (célula madre hematopoyética) hasta los elementos más maduros encontrados en la circulación. Esta célula madre se considera pluripotencial, ya que da lugar a los distintos tipos de células sanguíneas diferenciadas. Mediante la eritropoyesis se originan los eritrocitos formados a partir del proeritroblasto(célula unipotencial). La célula, como tal, se hace cada vez más pequeña y su citoplasma más acidófilo, a medida que acumula hemoglobina y pierde sus organelos. El núcleo se empequeñece, se hace heterocromático, se condensa y, por fin, desaparece. La granulocitopoyesis produce la linea de los granulocitos. Desde el mieloblasto o granuloblasto hasta los neutrofilos en banda y polimorfonucleares (basófilo, acidófilo y neutrófilo). Mediante la linfopoyesis se originan los linfocitos T y B. La trombopoyesis que produce los trombocitos o plaquetas, a partir del megacariocito.

La renovación de células hematopoyéticas maduras implica un constante proceso de proliferación mitótica y la correspondiente diferenciación celular. Al

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final de esta serie de divisiones amplificadas evolucionan a células diferenciadas terminales, que generalmente ya no vuelven a dividirse y mueren al cabo de unos cuantos días o semanas. Las células pueden morir también en alguna de las etapas iniciales del proceso. Estudios de células en cultivo constituyen una vía adecuada para determinar cómo se regulan estos mecanismos celulares: proliferación, diferenciación y muerte. Si se expone un animal a una dosis elevada de rayos X, las células hematopoyéticas se destruyen y el animal muere a los pocos días como consecuencia de su incapacidad de producir nuevas células sanguíneas. El animal irradiado puede salvarse, sin embargo, mediante una transfusión de células extraídas de la médula ósea de un donante sano inmunológicamente compatible. Evidentemente, entre estas células existen algunas (alrededor de 1 célula de cada 10 millones) que pueden colonizar el huésped irradiado y proporcionarle un nuevo tejido hematopoyético de forma permanente. Por otro lado cuando se administra por vía intraperitoneal colchicina al 0.1% a ratones, después de 5 horas de administrada, las células de la médula ósea quedan arrestadas en la metafase. Lo anterior debido al efecto sobre el huso mitótico que tiene la colchicina, despolimerizando a los microtúbulos. Este alcaloide así como otros tal como la vinblastina y la vincristina, han sido usados para la observación de cromosomas, ya que en esta fase es cuando son más visibles. PROCEDIMIENTO Material: Cajas de Petri, pipetas Pasteur, tubos de ensaye, bulbos de goma,

jeringas, estuche de disección, portaobjetos y cubreobjetos. Material biológico: Médula ósea de de ratón adulto. Sustancias: Colchicina al 1%, éter etílico, citrato de sodio al 2.2%, cloruro de

potasio al 1.125 %, cloruro de potasio al 0.56%, solución fijadora de metanol-ácido acético 3:1 y orceína acética como colorante.

Método Inyectar a ratones por vía intraperitoneal 0.25 ml de solución de colchicina al 1%, 3 horas antes de empezar el experimento. 1.- Obtener médula ósea de ratón. 2.- Agregar al sedimento 5 ml de una solución de KCl al 0.56% y dispersar las

células pipeteando suavemente, reposar 15 minutos. 3.- Centrifugar 5 minutos a 1000 r.p.m. 4.- Agregar 5 gotas de solución fijadora recién preparada (metanol-ácido

acético) y dispersar las células pipeteando suavemente. 5.- Agregar más solución fijadora (alrededor de 6 gotas) una a una mientras se

agitan las células suavemente y agregar cada vez más rápido hasta completar 5.0 ml. Reposar 30 min en el refrigerador.

6.- Centrifugar 5 min. A 1000 r.p.m. 7.- Descartar el sobrenadante. 8.- Agregar 0.5 ml de solución fijadora y dispersar cuidadosamente la células. 9.- En un portaobjetos perfectamente limpio dejar caer desde una altura de

20 cm dos gotas de la suspensión celular y dejar que se extiendan sobre la superficie. Nota: si no se observa que la muestra se extiende en la superficie del portaobjetos, la preparación no está bien hecha.

10.- Teñir con orceína-acética por 5 minutos. 11.- Quitar el exceso de colorante con ácido acético al 45%

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12.- Observar al microscopio. Buscar en 40X y definir con 100X 13.- En caso de obtener una buena laminilla, proceder a fijar, deshidratar y

montar para dejar permanente la preparación. Tomar fotografías de las mejores laminillas, recortar los cromosomas y organizar un cariotipo.

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PRACTICA No. 11 DETERMINACIÓN DE POLIMORFISMOS POR PCR-RFLP EN

ENFERMEDADES COMPLEJAS

OBJETIVO Determinar la presencia de polimorfismos de un solo nucleótido como mecanismo de susceptibilidad a tuberculosis (enfermedad compleja) por el método de RFLP´s INTRODUCCIÓN Se entiende por enfermedad compleja aquella patología causada por el efecto de varios genes y de la interacción entre ellos y con el ambiente. A diferencia de las enfermedades monogénicas mendelianas, el tener un gen defectuoso no causa necesariamente la enfermedad, sino que solamente modifica el riesgo de padecerla. Localizar los genes y sus variantes alélicas, llamados polimorfismos, responsables de la variación en rasgos complejos de importancia médica, y determinar su contribución al riesgo de padecer la enfermedad en diferentes ambientes constituye uno de los mayores retos para la biología en la era genómica. El estudio de las enfermedades complejas ha sufrido una evolución conceptual, que ha ido paralela a un gran desarrollo de las técnicas de Genética Molecular, como la automatización de los métodos de genotipado de marcadores y secuenciación de ADN. Además, los avances en Estadística Genética y en computación, en particular en los últimos años, han propiciado el desarrollo de métodos matemáticos cada vez más eficaces para la disección genética de rasgos cuantitativos complejos. Sin embargo, la identificación de los genes y sus polimorfismos que confieren un mayor riesgo de padecer una enfermedad compleja no es una tarea fácil. El diseño del estudio y la utilización de los métodos de análisis apropiados son puntos críticos. Los diseños experimentales utilizados en la identificación y localización de genes pueden ser de dos tipos: estudios de asociación y análisis de ligamiento genético. Los estudios de asociación caso-control analizan la correlación entre fenotipo y genotipo. El fenotipo es usualmente la presencia —casos— o ausencia —controles— de la enfermedad en individuos no relacionados o en familias. El genotipo viene determinado por algún tipo de polimorfismo genético. Existe asociación cuando la distribución, es decir la frecuencia alélica, de este marcador es estadísticamente diferente en los casos y en los controles. El marcador genético es un polimorfismo dentro o cerca de un gen candidato, definido como un gen específico relacionado biológicamente con el proceso de la enfermedad. EXPLICACIÓN SOBRE LA METODOLOGÍA A UTILIZAR La reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) es una alternativa a la clonación para generar cantidades ilimitadas de una secuencia de interés. La PCR puede amplificar selectivamente una sola molécula de DNA o RNA varios miles de millones de veces en pocas horas y ha revolucionado el diagnóstico y el análisis molecular de las enfermedades génicas. Una manera de implementar un diagnóstico para determinar cambios en una sola base es la utilidad de la PCR acoplada a RFLP´s (Restriction Fragment Length polymorphism).

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El polimorfismo de los fragmentos de restricción (RFLPs) es un tipo de marcador de DNA muy utilizado y ampliamente aceptado como fuente de información taxonómica, genética y filogenética. Estos marcadores se basan en la variación en la posición de los sitios de restricción (secuencias de corte de las enzimas de restricción) entre genotipos. Tamaños idénticos de fragmentos de restricción correspondientes a diferentes genotipos representan similitudes genéticas, mientras que, fragmentos de diferentes tamaños son interpretados como diferencias genéticas. Estas diferencias se producen cuando hay una variación en el DNA, que altera, ya sea, la secuencia de reconocimiento o la localización de un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción. De manera que, una mutación puntual puede eliminar o crear un nuevo sitio de restricción, mientras que una inserción o una deleción alterarían la posición relativa de los sitios de restricción. DISEÑO DE LA PRÁCTICA. Material Biológico: Muestra de DNAg obtenido de la práctica anterior. Cada alumno es responsable de la concentración y calidad de la misma. PROCEDIMIENTO de PCR Se realizará una PCR para amplificar la secuencia 3’UTR del gen NRAMP1 y localizar el polimorfismo por la enzima de restricción Fok I, Organizar su experimento y reactivos para optimizar tiempo y evitar equivocarse. Antes de iniciar centrifugar todos los reactivos. Realizar los cálculos para tener 100 ng de DNAg En un tubo de PCR (0.2 ml) rotulado perfectamente colocar los reactivos de PCR en las siguientes cantidades

H2O aforar reacción a un volumen final de 50 µl

Buffer de Taq polimerasa 10X 5 µL

Cloruro de Magnesio 2 µL

dNTP`s 10mM 1 µL

Taq.polimerasa 0.4 µL

Primers (20pŋ/ µL) 2 µL sense 2 µL antisense DNAg 300 nanogramos

Mezclar todos los reactivos y centrifugar por 5 segundos, colocar el tubo en el termociclador. Programa de PCR Desnaturalización inicial 94oC 10 minutos 40 ciclos de amplificación Desnaturalización 94oC 30 segundos Alineamiento 60oC 30 segundos Extensión 72oC 30 segundos Extensión final 72oC 5 minutos Mantener a 4oC PROCEDIMIENTO DE LOS RFLP´S Organizar sus reactivos para optimizar tiempo

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En un tubo eppendorf de 1.5ml estéril y correctamente rotulado realizar la reacción de digestión con las siguientes cantidades. Reacción de Digestión Reacción Control Producto de PCR 17µl Producto de PCR 17µl Buffer de Enzima 2µl Buffer de enzima 2µl Enzima (FokI I) 1µl Agua DNasa/free 1µl Mezclar perfectamente (sin vortex) y centrifugar, a continuación incubar por 1 hora a 37oC. Cargar todo el producto de digestión con 4µl de buffer de carga 6X y visualizar el producto en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Fotografiar.

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PRACTICA No. 12

DETERMINACIÓN DE ALTERACIONES A NIVEL DE EXPRESIÓN DE GENES EN MUESTRAS DE PACIENTES CON ARTRITIS REUMATOIDE.

OBJETIVO Determinar semi-cuantitativamente cambios en los niveles de expresión de genes por PCR de punto final. INTRODUCCIÓN El ARN mensajero (ARNm, o mRNA de su nombre en inglés) es el ácido ribonucleico que contiene la información genética procedente del ADN para utilizarse en la síntesis de proteínas, es decir, determina el orden en que se unirán los aminoácidos. El ARN mensajero es un ácido nucleico monocatenario, al contrario que el ADN que es bicatenario. Todos los ARNm eucarióticos son monocistrónicos, es decir, contienen información para una sola cadena polipeptídica, mientras que en los procariotas los ARNm son con frecuencia policistrónicos, es decir, codifican más de una proteína. El ARN mensajero obtenido después de la transcripción se conoce como transcrito primario o ARN precursor (pre-ARN), que en la mayoría de los casos no se libera del complejo de transcripción en forma totalmente activa, sino que ha de sufrir modificaciones antes de ejercer su función (procesamiento o maduración del ARN). El evaluar los niveles de mensajeros determinados nos proporciona la información sobre cómo se está regulando la transcripción de genes.

La expresión génica es el proceso por el cual se decodifica la información codificada en un gen para formar una proteína. En teoría, la regulación de cualquiera de los diversos pasos de la expresión génica podría conducir a la producción diferencial de proteínas en diferentes tipos de células o estadio de desarrollo o en respuesta a condiciones externas. Los mecanismos moleculares que regulan la iniciación de la transcripción son críticos para numerosos fenómenos biológicos, incluidos el desarrollo de un organismo multicelular a partir de una única célula huevo fecundada, las respuestas inmunes que nos protegen de microorganismos patógenos, y los procesos neurológicos como la memoria y el aprendizaje. Cuando estos mecanismos regulatorios funcionan inadecuadamente, pueden suscitarse procesos patológicos como el cáncer y el envejecimiento. DISEÑO DE LA PRÁCTICA. Material Biológico: Muestra de RNA obtenida en la sesión anterior Se realizará una transcripción reversa utilizando un Oligo de Timinas para obtener DNAc y este producto se amplificará por PCR para determinar niveles de expresión de 18 s y Dectina 1. INDICACIONES ADICIONALES DE ESTA PRÁCTICA. El RNA es una muestra que debe trabajarse con extremas precauciones pues es fácilmente degradado, no se debe hablar, generar corrientes de aire, tocar sin guantes o con guantes sucios ningún reactivo o material durante su manipulación. Las indicaciones de limpieza de su lugar de trabajo y temperaturas deben extremarse.

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PROCEDIMIENTO de RT Transcribir en reversa el RNA mensajero proporcionado por el profesor, en un tubo eppendorf estéril perfectamente rotulado realizar la reacción con los siguientes volúmenes

RNA 5µl Oligo dT O.5µL H2O Aforar la reacción a un volumen final de 20 µL

Incubar a 70 C por 5 minutos Y rápidamente incubar en Hielo 3 minutos Buffer 5x 4 µL DTT 2 µL dNTP ‘ s 1 µL RNasin 1 µL RT mmlv 1 µL Mezclar e incubar a Temperatura ambiente por 10 minutos

Incubar a 37C por 90 minutos

Incubar a 94 C por 5 minutos Congelar a -20oC

PROCEDIMIENTO de PCR Antes de iniciar centrifugar todos los reactivos. En un tubo de PCR (0.2 ml) rotulado perfectamente colocar los reactivos de PCR en las siguientes cantidades

H2O aforar reacción a 25 µl

Buffer de Taq polimerasa 10X 2.5 µL

Cloruro de Magnesio 1 µL

dNTP`s 10mM 0.5 µL

Taq.polimerasa 0.4 µL

Primers (20pŋ/ µL) 1 µL sense 1 µL antisense DNAc 3 µl

Mezclar todos los reactivos y centrifugar por 5 segundos, colocar el tubo en el termociclador. Programa de PCR Desnaturalización inicial 94oC 10 minutos 40 ciclos de amplificación Desnaturalización 94oC 30 segundos Alineamiento 60oC 30 segundos Extensión 72oC 30 segundos Extensión final 72oC 5 minutos Mantener a 4oC Cargar 15µl del producto de PCR con 5µl de buffer de carga 6X y visualizar el producto en un gel de agarosa al 1% con bromuro de etidio. Fotografiar.

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PRACTICA No. 13

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS NCX EN CIRROSIS HEPÁTICA POR WESTERN BLOT.

OBJETIVO El conocer una de las principales técnicas para el estúdio de proteínas, usada como método diagnóstico para algunas enfermedades. I N T R O D U C C I Ó N

Las proteínas son biomoléculas formadas por cadenas lineales de

aminoácidos. El nombre proteína proviene de la palabra griega πρωτεῖος ("proteios"), que significa "primario" o del dios Proteo, por la cantidad de formas que pueden tomar. Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:

Estructural. Ésta es la función más importante de una proteína Inmunológica (anticuerpos), Enzimática (sacarasa y pepsina), Contráctil (actina y miosina). Homeostática: colaboran en el mantenimiento del pH, Transducción de señales (rodopsina) Protectora o defensiva (trombina y fibrinógeno)

Cada día, nuevas proteínas son descubiertas y surge la necesidad de caracterizarlas, siendo las de origen humano las que presentan un mayor interés. Conocer su función nos ayudará a entender padecimientos y diseñar una posible cura, por esta razón es importante evaluar la expresión de proteínas

La genética molecular se relaciona, sobre todo con la interrrelación entre las macromoléculas de información de DNA y RNA y la forma en que se utilizan estas moléculas para sintetizar polipéptidos, el componente básico de todas las proteínas. La expresión de la información genética sigue un principio de colinearidad: la secuencia lineal de nucleótidos en el DNA se descodifica en grupos de tres nucleótidos a la vez (tripletes de bases) para obtener una secuencia lineal de nucleótidos en el RNA que puede descodificarse a su vez en grupos de tres nucleótidos (codones) para crear una secuencia lineal de aminoácidos en el polipéptido. El genético es un código de tres letras. Hay cuatro posibles bases a elegir de cada una de las tres posiciones de bases en un códon. Por consiguiente, hay (4)3 = 64 posibles codones, pero solo 20 tipos mayores de aminoácidos. El Western blot, o inmunoblot, es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (típicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la proteína de interés con anticuerpos específicos contra ella. Finalmente, se detecta la unión

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antígeno-anticuerpo por actividad enzimática y quimiolumiscencia. De esta forma se puede estudiar la presencia de la proteína en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras proteínas. Esta técnica es hoy en día imprescindible en varios campos de la biología, como la biología molecular, la bioquímica, la biotecnología o la inmunología. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de proteínas diferentes. El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en inglés) le fue dado por W. Neal Burnette, y consiste en un juego de palabras con una técnica análoga pero que usa DNA, el Southern (sureño) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras técnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot. DISEÑO DE LA PRÁCTICA. Material Biológico: Muestra de Proteínas proporcionado por el laboratorio Se realizará un corrimiento electroforético en geles de acrilamida para separar por peso molecular las proteínas de un extracto de hígado cirrótico y normal (control) para posteriormente realizar una transferencia a una membrana de nitrocelulosa. Y realizar las incubaciones y el revelado. PROCEDIMIENTO de Western blot Ensamblar el equipo de electroforesis y en un gel de poliacrilamida al 10% cargar los extractos proteícos que se le proporcionen, conectar a la fuente de poder y correr 15 minutos a 100 volts más 30 minutos a 140 volts. MÉTODO: 1. Transferir las proteínas a una membrana de nitrocelulosa como le sea indicado por el profesor. 7. Bloquear la membrana com 10ml de leche al 5%en TBS-T durante 30 minutos 8. Lavar 3 veces con PBS-T por 5 minutos 9. Incubar con el anticuerpo primario (anti-NCX) toda la noche a 4oC 10. Lavar 3 veces con PBS-T por 5 minutos 11. Incubar con el anticuerpo secundario (anti-goat) por 1 hora a temperatura ambiente 12. Lavar 3 veces con PBS-T por 5 minutos 13. Revelar

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Bibliografía

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