manual de. microbiologia.[1]

Facultad de Medicina

Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa Mdica

Edicin 2013-2

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Dr. Simitrio Rojas Vergara Director de Medicina

Dra. Blanca Selene Hernndez Torres Coordinador de Primer Nivel

Dra. Naidy A. Pinocely De Gante Jefatura de Laboratorios

Titulares de Laboratorio de Microbiologa Mdica Qumicos Certificados por la

Asociacin Estatal de Colegios de Qumicos de Baja California

ltima revisin: Junio 2013. QFB Ma. Ins Araceli Ayala Snchez

La presente edicin es propiedad de Universidad Xochicalco

Prohibida la reproduccin total o parcial.

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INDICE

Descripcin del Manual de Prcticas 3

Dinmica de las prcticas de Laboratorio de Microbiologa Mdica 4

Evaluacin de Laboratorio 4

Reglamento General de Laboratorios de Materias Semestrales 6

Prctica N1

Toma de muestras para estudios microbiolgicos 8

Prctica N2

Tincin de Gram 11

Prctica N3

Cultivo Bacteriolgico; Identificacin y Antibiograma 16

Prctica N4

Baciloscopa 28

Prctica N5

Examen Coproparasitoscpico 31

Prctica N6

Pruebas Inmunolgicas 36

Prctica N7

Investigacin de Hongos contaminantes 41

Prctica N8

Diagnstico de Micosis superficiales 46

Prctica N9

Deteccin de anticuerpos anti VIH 50

Descripcin del Manual de Prcticas

El presente Manual contiene protocolos para efectuar algunas pruebas

tiles en la investigacin microbiolgica, con la intencin de encontrar al agente

causal de distintas enfermedades infecciosas. Al inicio de cada prctica est

sealada la Competencia que se pretende que el alumno alcance y una

pequea Introduccin al tema a tratar en esa prctica para que se entienda el

por qu o para qu est diseada esa prueba de laboratorio. Se anotan los

Materiales y Reactivos necesarios para su desarrollo, asi como el tipo de

Muestra Biolgica que resulta idnea para la investigacin. Las muestras

debern ser conseguidas por los alumnos en caso de presentarse a la

practica sin la muestra correspondiente no podr el equipo efectuar la

prctica (ver Reglamento General de Laboratorios de Materias Semestrales).

Se anota y describe el Procedimiento o Mtodo de cada prueba y se

tiene un apartado para que el alumno anote sus Resultados y observaciones,

mismos que utilizar posteriormente para la elaboracin del Informe (ver

Evaluacin).

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Dinmica de las sesiones de prctica de Laboratorio de Microbiologa Mdica

Primeramente, se inicia puntualmente a la hora asignada en el horario, en el

Laboratorio Clnico, ubicado en el tercer piso, al fondo del pasillo frente a la Direccin de

la Escuela de Medicina.

Se divide el grupo en equipos de 4 5 alumnos, seleccionados al azar por los

docentes. No habr cambios de equipo. Se trabajar guardando orden, limpieza,

respeto entre todos los participantes. Las sesiones de trabajo estn ya calendarizadas

en su horario de clases son nueve prcticas.

Cada una de ellas tiene como finalidad que el alumno adquiera una determinada

Competencia, que al final del curso le llevar a plantear diagnsticos microbiolgicos

bien fundamentados, para un buen manejo de enfermedades infecciosas causadas por

diversos microorganismos de inters mdico.

El desarrollo de la prctica inicia con el pase de lista para anotar a quienes

llegaron puntualmente, a quienes tienen retardo y a quienes tienen derecho a entrar,

pero ya no tienen derecho a calificacin (ver Reglamento General de Laboratorios de

Materias Semestrales).

Posteriormente hay una Introduccin por parte de los instructores, y se procede

a responder un Cuestionario, relativo al tema de la prctica a realizar, habindose

documentado el grupo en informacin recomendada por los instructores con

anticipacin. Enseguida el grupo, trabajando en equipos, realizar el procedimiento o la

tcnica siguiendo las instrucciones anotadas en el protocolo correspondiente que se

encuentra en este Manual.

Durante el desarrollo de la misma, podr haber preguntas al azar o dirigidas, por

parte de los instructores. Se revisar que el desempeo de la misma se lleve dentro del

orden y limpieza requeridos, as como el manejo adecuado de muestras y de Residuos

Peligrosos Biolgico Infecciosos. Al terminar el procedimiento de la prctica, el equipo

limpiar la mesa y devolver el material.

El equipo proceder a interpretar los resultados obtenidos elaborando un caso

clnico en el que se aplique el estudio o medicin realizada en la prctica, guardando el

esquema SOAP (que se explica en el Encuadre), y ser entregado en la sesin para ser

revisado y evaluado de manera individual, aunque haya sido elaborado por todo el

equipo. Los instructores firmarn el Manual de prcticas anotando la evaluacin y la

puntuacin obtenida en cada sesin. Es importante que cada alumno conserve y

resguarde su Manual de Prcticas durante el semestre, ya que all se estarn anotando

todas sus calificaciones.

Se recomienda anotar su nombre en el cuadro de evaluacin al final de cada prctica

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CICLO ESCOLAR 2013-2

ENCUADRE DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA MDICA

ASISTENCIA: Se requiere un mnimo de 80% de asistencias. Si existe un documento Justificante de esa falta, se

tiene un lmite de tres das para presentarlo. No hay reposicin de prcticas.

PUNTUALIDAD: El alumno tiene un lmite de 5 minutos, dentro de los cuales se considera retardo. NO se permite

la entrada despus de 10 minutos. Dos retardos equivalen a Una falta (2 Retardos = 1Falta).Entre 5 y 10 minutos

puede entrar, pero sin derecho a calificacin de esa prctica.

UNIFORME COMPLETO: Ropa limpia y en buenas condiciones, pantaln blanco, camisola tipo Polo con logotipo

de la Universidad, zapatos blancos, NO TENIS. Bata limpia y en buenas condiciones, EXCLUSIVA DEL LABORATORIO

con logotipo de la Universidad y personalizada, que debern cambiarse por la del uniforme antes de salir de la sesin

de laboratorio. (Portar Bata ajena no causa fala, pero pierde derecho a calificacin de esa prctica). NO se permiten

PIERCING, ARETES, GORROS, CACHUCHAS, LENTES OSCUROS dentro del laboratorio. Hombres con cabello corto, afeitados,

uas cortas. Mujeres con el cabello recogido y sin maquillaje.

TELFONOS CELULARES, RADIOCOMUNICADORES, LAPTOPS, MP3 o cualquier otro dispositivo

electrnico que en su momento pudiera distraer al alumnado, interrumpir la clase o favorecer el manejo inadecuado

de informacin va electrnica : DEBERN PERMANECER APAGADOS Y GUARDADOS; por cuestiones de Bioseguridad, no

est permitido tenerlas en el rea de trabajo. Si se le sorprende utilizando este tipo de equipo en clase ser retirado

de la sesin y se le tomar como inasistencia. NO se permite el uso de audfonos, aun cuando no se encuentren

conectados a ningn aparato.

COMPORTAMIENTO: Respetuoso, hablar en tono bajo (no gritar); desplazarse dentro del laboratorio a paso

normal (no correr); NO se permite la entrada de personas ajenas al grupo. NO introducir BEBIDAS ni ALIMENTOS, NO

est permitido FUMAR dentro de ninguna de las instalaciones de la Universidad. Si no se tiene un comportamiento

adecuado, se le amonestar retirndosele del laboratorio, contndole como una falta. Si adems se incurre en una

falta al Reglamento, se reportar a Coordinacin de Primer Nivel y al Tutor de su respectivo semestre.

SESIONES DE CLASE: No est permitido estar entrando y saliendo; la sesin es continua sin interrupciones.

EVALUACIN:

La parte Prctica de la materia corresponde al 25 % de la calificacin total de la Materia (la teora aporta el 75%) y

esta calificacin se obtiene mediante:

Prctica (15%)

a)Desarrollo de la prctica con orden y limpieza, guardado disciplina, con un manejo adecuado de muestras y de

Residuos Peligrosos Biolgico Infecciosos (RPBI)...................0 a 4.0 puntos

b) Cuestionario presentado al inicio de la prctica...0 a 4.0 puntos

c) Interpretacin de los resultados obtenidos, presentados como un caso clnico, donde se vea reflejada la

aplicacin de la prueba o examen realizado y la fundamentacin clnica del mismo. 0 a 7.0 puntos

Examen Final (10%). Se puede perder derecho a este examen por falta de ms de 2 informes, o por no tener el

80% de asistencias.

NO HAY EXAMEN DE REGULARIZACION NI EXTRAORDINARIO DE LABORATORIO

TODA INFORMACIN OFICIAL SER CON EL JEFE DE GRUPO

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CENTRO DE ESTUDIOS UNIVERSITARIOS XOCHICALCO Escuela de Medicina. Campus Ensenada

Fecha: 31/febrero/2014 Grupo: 4 A Equipo: 3_ N de Prctica: 3

Nombre de la Prctica: Cultivo Bacteriolgico, Identificacin Bacteriana y Antibiograma

Elaborado por: Integrantes del Equipo (*)

Nombre del paciente: Sra. Mara Esther Nava Segovia Edad: 58 aos Sexo: Femenino

Historia Clnica (en esquema SOAP): Se presenta a consulta paciente femenina, proveniente de Mxico, D.F., que viene por presentar disuria, febrcula, mal estado general anotar signos y sntomas, datos de exploracin fsica, TA, temperatura, datos clnicos; si no los tienen, pueden inventarlos, siempre y cuando sean congruentes con el caso.(Datos SUBJETIVOS)

Diagnstico presuntivo: Infeccin de vas urinarias Diagnstico diferencial: Litiasis renal

Observaciones: Se le solicitan estudios de laboratorio, para lo cual se le indica presentarse a laboratorio con una muestra de primera orina matutina, en recipiente estril, para realizar un Examen General de Orina y Urocultivo. Se le indica que no utilice antibiticos en los 4 das previos a la obtencin de la muestra, pues esto interfiere en los resultados; se complementa con informacin clnica que apoye la necesidad de los estudios de laboratorio, lo que se espera confirmar y/o descartar, segn diagnsticos presuntivo y diferencial etc.

Resultados: (Datos OBJETIVOS) El Examen General de orina reporta una orina de pH alcalino, con presencia de Nitritos y trazas de sangre. Un sedimento urinario con 80 leucocitos por microlitro, de los cuales el 75% son piocitos. Tambin reporta 250 eritrocitos por microlitro, sin dismorfias; abundantes cristales de fosfato triple de amonio y magnesio, escasos de fosfato amorfo y abundantes bacterias. El Urocul tivo reporta el aislamiento de cepas de Proteus mirabilis en un conteo total de 180 000 UFC/mL.

Interpretacin: (Mnimo 15 renglones) Por los resultados obtenidos, la paciente presenta disuria por la inflamacin causada por una infeccin en vas urinarias (cistitis), adems de la presencia de abundantes cristales que en su momento pueden llegar a provocar litiasis. La presencia de Nitritos implica el diagnstico de infeccin por bacterias reductoras de nitratos (se puede comentar un poco sobre la enfermedad, Asessment=Validar). Se le recomienda a la paciente no ingerir refrescos embotellados, slo beber agua natural, evitar agua mineral, y se le prescribe un antibitico de amplio espectro durante 7 das, al final de los cuales dejar pasar 4 das y se har un Examen General de Orina de Control post tratamiento. (PLAN a seguir)

S O A P : (S) Datos Subjetivos (O) Datos Objetivos

(A) Asessment= Validacin (P) Plan a seguir

(*) Nombres de los Integrantes que hayan participado en la elaboracin del informe (y que hayan estado presentes y trabajado en la prctica), alfabticamente y comenzando por Apellidos Paterno, luego Materno, luego Nombre(s)

CICLO ESCOLAR 2013

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Reglamento General de Laboratorios de Materias Semestrales

1) El alumno debe presentarse puntualmente a la prctica, dentro de un lmite de tolerancia de 5 minutos, que es ya considerado retardo. No perder derecho a entrar si llega despus de 5 minutos, sin exceder los 10 minutos, pero perder el puntaje correspondiente a Participacin e Informe de esa prctica; no perder derechos por faltas ni la competencia respectiva en este margen de 10 minutos. Dos retardos equivalen a una falta y es requisito tener un 80% de asistencias en Laboratorio. Ms de 20% de inasistencias, le deja sin derecho a Examen Final de Laboratorio y le enva a Examen Extraordinario de la materia a la que corresponde ese Laboratorio. Una vez iniciada la sesin no se permitirn interrupciones; no hay permiso para salir por ningn motivo.

No hay reposicin de prcticas; si el alumno presentara un oficio justificante de una inasistencia, slo podra recuperar la prctica por autorizacin de la Jefatura de Laboratorios, la Coordinacin de primer Nivel o la Direccin de la Escuela de Medicina. (Ttulo Primero, Captulo II, Art.17 del Reglamento de los Servicios de Apoyo)

2) Son obligatorios para la sesin: traer individualmente su propio ejemplar del Manual de prcticas impreso en original, a color y engargolado, guantes desechables, portar el uniforme completo y una Bata blanca exclusiva para el laboratorio, con el logotipo de la Facultad de Medicina y personalizada, limpia, en buen estado y mantenerla abotonada. La bata debe estar personalizada y con el logotipo de la Universidad. Presentarse con bata ajena no le computar falta, pero le quitar derecho a califica-cin de participacin e informe, es decir, calificacin de cero en esa prctica. Por falta de guantes, se le permite permanecer slo como observador, pues no se le permitir tocar nada sin guantes; esto no le contar administrativamente como falta, pero no le contar participacin ni informe, es decir, calificacin de cero en esa prctica. Por falta de Manual, se le permite permanecer sin que le cuente falta, pero no le contar participacin ni informe, es decir, cero de calificacin en esa prctica.

Asimismo, deber llevar de manera individual o por equipo, segn se le haya sealado, el material o muestras requeridas para la prctica. Sin esto no se le permitir trabajar. El equipo que no traiga muestras para trabajar ser desalojado y se le computar falta, con la consecuente calificacin de cero en esa prctica. (Ttulo Primero, Captulo II, Art.17 del Reglamento de los Servicios de Apoyo)

3) En las mesas de trabajo est prohibido: sentarse, colocar libros, cuadernos, objetos personales; stos debern ser colocados en las repisas debajo de cada mesa. Solamen te deber haber muestras, material de trabajo y sus Manuales de Laboratorio. (Ttulo Primero, Captulo II, Art.17 del Reglamento de los Servicios de Apoyo)

4) Est prohibido durante las sesiones de trabajo: la entrada a personas ajenas al gru-po, fumar, ingerir cualquier tipo de alimentos o bebidas, masticar chicle, utilizar compu-tadora porttil, telfono celular, radiocomunicadores, u otros artculos electrnicos. Dentro del laboratorio los telfonos celulares y radiocomunicadores debern permanecer apagados y guardados. Faltar a este punto le quitar el puntaje de Participacin correspondiente a esa prctica, que tiene un valor en puntaje de 10, de los 25 puntos porcentuales que aporta el Laboratorio a la materia a la que corresponde ese Laboratorio (Ttulo Primero, Captulo I, Art.11 del Reglamento de los Servicios de Apoyo)

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5) Est prohibido maltratar las instalaciones, el equipo, mobiliario propio del laboratorio, como tambin est prohibido sustraer objetos o material propios del laboratorio, sin autorizacin del encargado el laboratorio o del docente de la asignatura. (Ttulo Primero, Captulo I, Art.11 del Reglamento de los Servicios de Apoyo)

6) Por ningn motivo los alumnos debern permanecer sin supervisin del profesor o instructor durante la realizacin de las prcticas en el horario programado ni extra clase. (Ttulo Primero, Captulo I, Artculo 10 del Reglamento de los Servicios de Apoyo).

7) Dentro del laboratorio se deber guardar un comportamiento y lenguaje adecuados, en el marco de respeto a todos los participantes de la sesin. (Ttulo Quinto, Captulo V, Art. 47, Fracc. VI, VIII del Reglamento de Alumnos).

8) Al trmino de la prctica, los alumnos se harn cargo de dejar limpia y desinfectada el rea de trabajo, as como depositar los Residuos Peligrosos Biolgico Infecciosos (RPBI) en los recipientes correspondientes, segn el tipo de residuo, para su disposi-cin final. El material que requiera lavarse, deber colocarse en el recipiente destinado para su posterior lavado por el encargado del laboratorio. (Ttulo Primero, Captulo I, Artculos 11 y 13 del Reglamento de los Servicios de Apoyo).

9) La calificacin total de Laboratorio, equivale a un 25% de la calificacin total de la materia semestral, y los rubros a calificar y sus respectivos puntajes se detallan en el Encuadre que se presenta al inicio de semestre en el laboratorio de cada materia en particular. (Ttulo Quinto, Captulo III, Art. 30 del Reglamento de Alumnos).

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Prctica N 1: Toma de muestras biolgicas para estudios microbiolgicos

Competencia: El alumno ser competente para obtener correctamente diferentes muestras biolgicas y para dar las indicaciones adecuadas al paciente para que se presente en ptimas condiciones al laboratorio con el fin de que la muestra obtenida sea realmente representativa y til para estudios microbiologicos.

Introduccin al tema La principal funcin del laboratorio de Microbiologa clnica es la de ayudar al mdico en el diagnstico y tratamiento de pacientes con enfermedades infecciosas. La correcta recoleccin de una muestra corresponde a la fase preanalitica, determinante en el aislamiento de microorganismos responsables de enfermedades infecciosas.

Conceptos bsicos para la correcta recoleccion de muestras:

1.- La muestras para estudios microbiolgicos deben ser material del verdadero sitio de infeccion y debe obtenerse con un minimo de contaminacion de tejidos, organos o secreciones adyacentes. ej: muestras de expectoracin, orina, sangre excremento, liquido cefalorraquideo, exudados etc.

2.- Establecer perodos ptimos para la recoleccin de muestras con el fin de tener la mejor oportunidad de aislar los microorganismos responsables. ej: diagnostico de fiebre tifoidea.

3.- Obtener suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo las tcnicas mas adecuadas. ej: LCR.

4.- Utilizar recipientes adecuados ya sean de transporte o de recoleccion. utilizando los medios de cultivo ideales de acuerdo a las caracteristicas bioquimicas y fisiologicas de cada microorganismo.

5.- Obtener las muestras antes de la administracin de antibioticos.

6.- El recipiente recolector de la muestra debe estar correctamente etiquetado. nombre completo y datos del paciente, hora de recoleccion y tipo de muestra.

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Transporte de muestras: Se recomienda el menor tiempo posible para que la muestra sea enviada al laboratorio. Los medios de transporte que se utilizan mayormente constan esencialmente de amortiguadores de pH con exclusion de carbohidratos, peptonas y otros nutrientes ya que solo se desea conservar la viabilidad de las bacterias durante el transporte sin que ocurra multiplicacin significativa de los microorganismos. Procesamiento de muestras: Toda muestra que se recibe en el laboratorio de Microbiologia, se debe examinar visualmente o macroscpicamente con el fin de evaluar si es adecuada para su posterior procesamiento.

Investigacin: El alumno expondr antes de iniciar su prctica: a).- Condiciones en que debe estar el paciente antes de la toma de muestra. b).- Tcnica correcta para obtencin de la muestra. c).- Muestras Biolgicas: Orina, Excremento, Lquido Cefalorraqudeo, Esputo, Sangre y Exudados diversos, como: Farngeas, Vaginales, Uretrales, Oculares, ticas, Heridas.

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CUESTIONARIO (PEGAR EN ESTE ESPACIO YA CALIFICADO)

EVALUACION DE LA PRCTICA 1

Nombre del alumno____________________________ Grupo :_____________

Firma del alumno ________________________________

Firma del catedratico ____________________________

Concepto Puntaje Obtuvo

Cumple con todos los requisitos para tener derecho a realizar la prctica: Asistencia puntual, Bata Guantes, Muestras, Manual engargolado

SI NO

Buen desarrollo de la prctica: Disciplina, Orden, limpieza, Obtencin de Resultados, Manejo adecuado de muestras y de RPBI

4.0

Cuestionario aplicado durante la prctica 4.0

Fundamentacin clnica: Aplicacin de lo obtenido a un caso clnico ficticio bien fundamentado

7.0

Total 15.0

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Prctica N 2: Tincin de Gram Competencia: El alumno entender el fundamento de la tcnica de Tincin de Gram para tener la habilidad de diferenciar microscopicamente entre una bacteria grampositi va y una gram negativa y tomar las decisiones teraputicas acorde a la composicin de la pared de estos agentes infecciosos.

Fundamentacin Tincion de Gram: Algunas especies bacterianas, debido a la naturaleza quimica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta, aun luego del tratamiento con un decolorante orgnico como la mezcla de alcohol y acetona. Tales bacterias se denominan Gram positivas, bacterias en que su pared celular contiene el 80 % de peptidoglucano capturando el primer colorante al que son expuestas tiendose de color morado intenso.

Las bacterias que no toman la coloracin primaria (cristal violeta) tienen una membrana externa , con un contenido importante de lpidos, requirindose ser tratadas con el decolorante (solucin alcohol-acetona) para poder capturar el colorante de contraste, que en este caso es la Safranina, de color rojo; estas bacterias se denominan Gram negativas, pues no retienen el colorante primario de Gram (cristal violeta, es decir, que son negativas al Gram, y aparecen en el microscopio de color rosado.

Material y Reactivos -Hisopos Estriles - Abatelenguas -Portaobjetos -Mechero de Bunsen -Agua Destilada Colorantes y soluciones de Gram: Cristal Violeta, Yodo de Gram, Solucion de Alcohol-Acetona y Safranina -Aceite de Inmersin -Microscopio y papel seda.

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OBTENCION DE UNA MUESTRA DE EXUDADO FARINGEO

La muestra a examinar ser exudado farngeo, dado que es una muestra que contiene una microbiota mixta, donde el alumno podr observar una gran diversidad de microorganismos de distintas morfologas y caractersticas de tincin. Tcnica para la preparacin de la muestra:

1) Pedirle al paciente que abra la boca ampliamente, para exponer faringe;

2) Colocar un abatelengua e introducir un aplicador teniendo cuidado de no tocar los carrillos ni la lengua y girar el hisopo al llegar a la faringe y amgdalas

3)Colocar la muestra suavemente en un portaobjetos con movimientos circulares

4)Dejar secar al aire y fijar con el mechero, procurando no quemar la muestra.

Tcnica para la Tincion de Gram:

1) Sumergir el frotis preparado en el vaso de Coplin que contiene el colorante Cristal Violeta durante 1 minuto 2) Enjuagar con agua de la llave bajo un chorro suave 1

3) Sumergir en la solucin de yodo de Gram por 1 minuto 2

4) Repetir el enjuague con agua de la llave.

5)Agregar unas gotas del decolorante de alcohol acetona, 3 hasta ver que ya no arrastra color (~10 segundos). 4

6) Repetir el enjuague con agua de la llave.

7) Sumergir en el colorante de contraste Safranina por 1 minuto

8) Repetir el enjuague con agua de la llave; secar al aire. 5 6 7 8

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Resumen de la tcnica de Tincin de Gram

Examen Microscpico Para examinar al microscopio, es necesario que el frotis teido ya se encuentre seco. Colocarlo sobre la platina y sujetarlo con la pinza. Limpiar de antemano las lentes de los oculares y objetivos con el papel seda especial para lentes.

1) Con el objetivo de mnimo aumento (4x, lupa), localizar la altura a la que se encuentra la muestra, subiendo la platina con el tornillo Macromtrico y observando a travs de los oculares. Ajustar la distancia interpupilar de los oculares para observar con comodidad utilizando ambos ojos. Para este objetivo de mnimo aumento, el lente condensador deber colocarse hasta el tope inferior y el diafragma deber cerrarse, pues se requiere de poca luz.

2) Una vez localizada la muestra, rotar el revlver para colocar el objetivo de 40x (se denomina objetivo seco fuerte). Para este aumeto, subir el condensador a la mitad y abrir el diafragma a la mitad. Recorrer la laminilla con la muestra para buscar un campo que resulte interesante, para proceder a observar con mayor aumento. Una vez elegida el rea de observacin. Retirar con el revlver ese objetivo (40x) y colocarle al frotis 1-2 gotas de aceite de inmersin para proceder a colocar el objetivo 100x con el revlver.

3) Colocar el objetivo 100x, subir el condensador a su tope superior y abrir totalmente el diafragma pues se reuiqre de la mxima luz posible. NO VOLVER A TOCAR EL TORNILLO MACROMTRICO, pues sube y baja la platina grandes distancias y en ese momento la laminilla ya est pegada al objetivo. Si se sube demasiado, la laminilla se romper. Para enfocar SOLO UTILIZAR EL TORNILLO MICROMTRICO. Con 100x se requiere de mucha luz. El aceite de inmersin tiene el mismo ndice de refraccin que el vidrio, por lo que hace el efecto de estar sumergido en la muestra; le da continuidad al vidrio del que estn fabricados los portaobjetos y las lentes de aumento, sin desviar el rayo de luz una vez que este lente (100x) se encuentra inmerso en el aceite, por eso se llama Aceite de inmersin.

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Notas: En una muestra de exudado farngeo, es comn observar clulas epiteliales, filamento de moco, algunos leucocitos y distintas bacterias, como bacilos cortos, largos, cocobacilos, cocos aislados (solos) o agrupados ya sea en cadena, cmulos o racimos, en ttradas y su afinidad tintorial tambin es variada. Pueden incluso observarse algunas levaduras (hongos unicelulares) que usualmente son positivas al Gram. Tanto las clulas epiteliales como los leucocitos, no retendrn el colorante primario, ya que en su pared no hay molculas afines al cristal violeta, por lo que se observarn de color rojo, pero para estas estructuras no se utiliza el trmino gramnegativo, ya que stas no son bacterias para clasificarlas.

Leucocitos Clula epitelial Cocos Grampositivos Bacilos cubierta de bacterias Gramnegativos

Resultados Dibuje lo observado describiendo lo siguiente:

1) La presencia y cantidad de leucocitos (pocos no es clnicamente significativo; slo si son abundantes y se acompaan del predomonio de un tipo bacteriano en especial)

2) La morfologa microbiana (coco, bacilo , levadura, cocobacilo, espirilo) 3) Su agrupacin (aislado, cadena, ttrada, cmulo o racimo) 4) Su afinidad tintorial (Gramnegativo o Grampositivo)

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Firma del alumno ________________________________

Firma del catedratico _____________________________



SI NO


4.0



7.0

Total 15.0

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Prctica N3: Cultivo Bacteriolgico Competencia: El alumno conocer la utilidad del Cultivo Bacteriolgico para solicitarlo y utilizarlo en la intencin de aislar, identificar y erradicar al agente causal de una infeccin bacteriana.

Introduccin al tema: Las bacterias hetertrofas (que no pueden proveerse su propio alimento y tienen que obtenerlo o tomarlo de alguna otra fuente) son las de mayor importancia mdica y requieren compuestos orgnicos ms complejos como fuente de carbono y nitrgeno, as como protenas o sus derivados y tambin requieren carbohidratos y grasas, por lo que se utilizan, a nivel laboratorio, medios de cultivo artificiales a los que se adicionan estas substancias a fin de hacer crecer a los microorganismos en un ambiente artificial, bajo condiciones de temperatura, pH, humedad controlados. La intencin es aislar al agente patgeno a partir de las muestras biolgicas del sitio de infeccin, simulando las condiciones en la que la bacteria se encontraba en el paciente causando dao. Dependiendo del tipo o la fase de la investigacin, se utilizan diferentes tipos de medios, como:

a) Medios para Aislamiento: Se utilizan para sembrar muestras para un aislamiento general o para un aislamiento selectivo de un organismo o grupo de organismos determinados. En estos medios pueden agregarse substancias inhibidoras. ej: agua peptonada, agar nutritivo.

b) Medios para Enriquecimiento: Son medios muy ventajosos, ya que estan concebidos para aumentar la propagacion de ciertos organismos sin favorecer a otros. Son muy utilizados en las muestras entricas. ej: caldo tetrationato, caldo selenito.

c) Medios para Identificacin y Diferenciacin: Son de varios tipos y comprenden desde los medios bsicos lquidos con carbohidratos pasando por los semislidos hasta los ms comple-jos y slidos; son tiles para la diferenciar especies de bacterias. ej: SIM, Kligler, Urea, Citrato.

d) Medios para Mantenimiento: Son utilizados para el transporte de muestras, sin permitir su crecimiento, slo para mantenerlos vivos y luego proceder a cultivarlos.Ej: Medio de Stuart o de Aimes. Materiales y Reactivos Medios de cultivo preparados en placa: Agar Sangre, Agar Sal y Manitol, Agar EMB Asas Bacteriologicas Mechero Estufa de Cultivo Agar Sal y Manitol Agar Sangre Agar EMB Portaobjetos Solucin Salina isotnica Colorantes de Gram Microscopio Papel seda para lentes Aceite de Inmersin

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Procedimiento de Siembra para Cultivo

1) Sembrar las placas Petri que contienen a los diferentes agares, esterilizando el asa y dejndola enfriar cada vez que se va inocular. Incubar a 370c por 24 hr. Las cepas selec cionadas para la prctica son de crecimiento relativamente rpi do, pero son cepas aisladas de hospital, es decir, ya multitratadas y multirresistentes, por lo que debern manejarse con mucha precaucin, cuidando de no manejar nada fuera del rea estril (10 cm alrededor de la flama del mechero), tanto por proteccin personal como del resto del grupo. Obviamente, todo se manejar con guantes y con la bata cerrada para no contaminar su uniforme, que luego llevarn el resto del da a todas partes, incluida la vivienda donde habirtan.

2) Despus de 24 hr. Anotar de las caractersticas que presenta la colonia bacteriana, tomando en consideracin los siguientes datos. Esto se denomina Morfologa Colonial, y arroja informacin importante en la investigacin de la identidad de la cepa aislada.

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3) Preparar un Frotis:Tocar con asa estril y fra una de la colonias separadas de uno de los medios de cultivo que presente mejor el crecimiento de la bacteria y extenderla sobre una laminilla a la que ya se le coloc una gota de solucin salina isotnica. Dejar secar, fijar y teir con la tcnica de Gram para observar al microscopio.

Observar y anotar la morfologa y afinidad tintorial de la cepa bacteriana aislada. Con

este importante dato, ya tenemos bastante avanzada la investigacin del agente causal, pues dependiendo del tipo de bacteria que resulte, es el camino que tomar la investigacin micro-biolgica, ya que tendremos que realizar pruebas bioqumicas para dar con la identidad del microorganismo. La investigacin de la identidad de los gramnegativos es ms compleja que con los cocos grampositivos de importancia mdica. Morfologa Colonial: Describir las colonias que crecieron en los medios, guindose en la ilustracin antes mostrada.

En Agar Sangre:

En Sal y Manitol:

En EMB:

Observacin al Microscopio: Dibuje y describa lo observado en el frotis de la colonia, comen-zando por la morfologa microbiana (coco, bacilo , levadura, cocobacilo, espirilo) , su agrupacin (aislado, cadena, ttrada, cmulo o racimo) y su afinidad tintorial (Gramnegativo o Grampositivo)

Si el microorganismo aislado result ser una levadura y no una bacteria, no se debe

continuar con la investigacin bioqumica de identificacin, ya que sta est diseada para bacterias.

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IDENTIFICACION DE LA CEPA BACTERIANA

Fundamentacin Los bacilos gram negativos de la familia Enterobacteriaceae son los microorganismos

ms frecuentemente aislados en el laboratorio de Microbiologia. La morfologa observada mediante la tcnica de Gram y la morfologia colonial no es suficiente para diferenciar las Enterobacterias de otros bacilos gramnegativos ni para identificar especies.

La clasificacin de las enteroabacterias esta basada principalmente en la determinacin de la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas genticamente en el cromosoma bacteriano. Estas enzimas, determinan el metabolismo de las bacterias.

Pruebas Bioquimicas para Identificacin Bacteriana Los sustratos sobre los cuales estas enzimas pueden actuar se incorporan a un medio

de cultivo, junto con un sistema indicador que puede detectar la utilizacn o no del sustrato o la presencia de productos metablicos especficos. Generalmente la utilizacin del sustrato se pone de manifiesto por cambio de color pues esos cambios bioqumicos dan como resultado un pH distinto al inicial.

Para la identificacin de Cocos Grampositivos, es indispensable, de inicio, saber si se trata de cocos del gnero Staphylococcus (los cuales contienen la enzima Catalasa) o son de algn otro gnero bacteriano como Streptococcus, Micrococcus, etc. Comenzaremos por distinguir si esos cocos son o no Staphylococcus mediante la siguiente prueba:

Prueba de Catalasa Utiliza el perxido de hidrgeno el cual se produce como uno de los pro-ductos finales del metabolismo oxidativo aerbico de carbohidratos. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las celulas bacterianas. La catalasa transforma al perxido de hidrgeno en agua y oxgeno como lo demuestra la siguiente reaccion manifestandose por formacion de burbujas.

H2O2

H2O + O2 Catalasa

Prueba de Coagulasa: Conocida como factor de coagulacion, est unida a la pared celular bacteriana y no esta presente en los filtrados de cultivos. Los hilos de fibrina formados entre las celulas bacterianas suspendidas en plasma (fibringeno) provocan su aglutinacion, indicada por la presencia de agregados visibles en el tubo de ensayo. Una vez que supimos que la cepa era efectivamente un estafilococo, la prueba de Coagulasa nos llevar a averiguar si se trata de cepas patgenas productoras de Coagulasa (Staphylococcus aureus). Las cepas Coagulasa Negativas no son clnicamente significativas.

Materiales y Reactivos

-Aplicadores de madera

-Portaobjetos -Perxido de Hidrgeno

-Goteros -Plasma con Anticoagulante EDTA -Tubos de ensayo -Reactivo de Oxidasa (p-Fenilendiamina) -Bateria de pruebas bioquimicas (BBL Crystal) -Asa Bacteriolgica -Cepa bacteriana

Procedimiento o Tcnica

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Todo manejo de cepas deber hacerse dentro del rea estril (10cm alrededor del la flma de mechero; cuidar de no salirse de ah)

Prueba de Catalasa: Se utiliza un aplicador de madera para transferir un poco de colonia bacteriana (no utilizar clonias aisladas en Agar Sangre, pues da resultados Falsos Positivos) al centro de un portaobjetos en la que se aadieron unas gotas de perxido de hidrgeno. La formacin de burbujas significa una prueba Positiva. Prueba de Coagulasa: Colocar en un tubo de ensayo 0.5 ml de plasma humano tomado con anticoagulante de EDTA y suspender en l 2 o 3 colonias que hayan dado positiva la prueba de Coagulasa. Colocar en incubacin a 37oC por 18 a 24 hrs. Observar en busca de la formacion de un cogulo o de un precipitado granular. No exceder las 24 horas, pues si se trata de una cepa de Staphylococcus aureus, ste contiene tambin otra enzima (fibrinolisina) capaz de deshacer el cogulo formado, y reportaramos una cepa Coagulasa Negativa (FALSA NEGATIVA) cuando en realidad no lo era.

Identificacin Bioquimica de Gramnegativos utilizando el Sistema BBL Crystal

El equipo BBL Crystal contiene 30 sustratos bioqumicos y enzimticos. La ubicacin del panel indica la fila y la columna donde se encuentra el pocillo. Determine segn el cambio o no de color si es negativo o positivo, es decir, si la bacteria utiliz o no ese sustrato proporciona do.

1)Tome el tubo para inculo del equipo BBL Crystal (tubo de vidrio etiquetado con tapa de rosca

que contiene un lquido) y con el asa bacteriolgica estril tome una colonia grande bien aislada de la placa de agar sangre que ya haya sido demostrado mediante el Gram que se trata de un bacilo gramnegativo y suspenda las colonias en el lquido. Tape el tubo y agitelo durante 10 a 15 seg.

ESTE SISTEMA DE IDENTIFICACIN NO SE UTILIZA CON COCOS GRAMPOSITIVOS

2) Vierta todo el fluido del tubo de inculo en el rea objetivo de la base. Sostenga la base con ambas manos y mueva el inculo suavemente de lado a lado hasta que se hayan llenado todos los pocillos. Haga retroceder cualquier lquido sobrante del rea objetivo.

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3) Coloque la cubierta que contiene los sustratos y apriete hasta percibir una ligera resistencia. Coloque el pulgar en el borde de la tapa hacia la parte media del panel en cada lado y aprie-te simultaneamente hasta que la tapa encaje en su lugar. Coloque en la incubadora a 37C por 24hr. Despus de las 24 hr: Compare los resultados con la tabla del instructivo del equipo

para ver

cules pruebas bioqumicas resultaron positivas, y con estos datos (30 substancias investigadas) identificar el gnero y especie bacteriana. Los resultados deben ser congruentes con la morfolo ga colonial, los hallazgos en la tincin de Gram. La tabla les ser proporcionada por el auxiliar de laboratorio.

Resumen de los pasos a seguir en la identificacion bacteriana

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ANTIBIOGRAMA

COMPETENCIA: Conocer la utilidad del Antibiograma como parte del estudio microbiolgico, para utilizarlo como fundamento y argumento en la decisin teraputica ante el aislamiento de una bacteria demostrada (mediante el cultivo) como el agente causal de una enfermedad infecciosa.

Fundamentacion

Una vez aislados los microorganismos e identificados patgenos o como posibles agen tes causales de la patologia que se sospecha, se procede a realizar la prueba de susceptibili dad a antimicrobianos, tambin conocida como ANTIBIOGRAMA y consiste bsicamente en poner en contacto a la cepa bacteriana con antimicrobianos para investigar cul de ellos es el que puede inhibir su crecimiento y a cules puede ser resistente. Tcnica de Kirby-Bauer: Consiste en inocular el microorganismo que nos interesa en un medio slido que favorezca la difusin de los antimicrobianos. Sobre la superficie inoculada se colocan discos de papel filtro impregnados de antimicrobianos de determinadas concentracio-nes estandarizadas y se incuba. El comportamiento del antimicrobiano ante la cepa se obser-var como zonas ntidas de inhibicion del crecimento alrededor del disco con antimicrobiano al cual la bacteria estudiada es susceptible. Si la bacteria crece alrededor de un determinado antibitico, ste no le caus ningn efecto letal. Es importante recordar que el antibiograma slo refleja del comportamiento "in vitro" del microorganismo ante el antimicrobiano. Materiales y Reactivos -Placas de agar Mueller Hinton -Hisopos estriles -Multidiscos de Antibiticos para gram positivos -Multidiscos de Antibiticos para gram negativos -Tubos con caldo BHI (infusion de cerebro corazn) -Cepa bacteriana identificada como patgena o agente causal -Mechero Bunsen

Procedimiento o tcnica: Dentro del rea estril (10cm alredeor de la flama del mechero)

1.-Seleccionar la colonia bacteriana utilizada para la identificacin bioqumica de la placa de agar original con asa bacteriolgica estril.

2.-Inocular el caldo de enriquecimiento con la colonia, tapar e incubar a 37C hasta que se haya reproducido lo suficiente (el caldo se enturbia). Ajustar la turbidez con el tubo patrn (Nefelmetro de MacFarland, tubo 0.5, equivalente a 10

8 millones de organismos/ml) Se puede diluir con sol.salina estril si est muy turbio.

3.- Sumergir un hisopo estril en la suspensin bacteriana y antes de retirarlo eliminar el exceso de lquido haciendo rotar el hisopo presionando contra la pared interna del tubo.

4.-Inocular con este hisopo la superficie de la placa de agar Mueller Hinton. Cubrir uniformemente toda la placa esparciendo con el hisopo en 3 direcciones: Vertical, horizontal y diagonal (90,180 y 45 de inclinacin)

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5-Dejar reposar unos minutos el inculo y utilizando una pinza estril colocar sobre la superficie del agar los discos de antibitico con las letras hacia abajo. Incubar a 37C 18 a 24hr. 6.- Medir cuidadosamente los dimetros de inhibicin alrededor de los discos de antimicro-bianos en milmetros. Anotar los resultados para interpretar la susceptibilidad de la cepa ante cada antimicrobiano, guindose en la tabla de la siguiente pgina.

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Resultados Tomando como gua la presente tabla, anotar en la tabla de la siguiente pgina los resultados obtenidos de la lectura del antibiograma.

Dimetro del Halo de Inhibicin Siglas

Internacionales Antimicrobiano

Concentracin en el disco R I MS S

AK Amikacina 30 g 14mm 15-16mm 17mm

AM

Ampicilina

10 g

Staphylococcus sp 11mm 12-13 mm 14mm Staphylococcus sp 28mm 29m Enterococos 16mm 17mm Otros estreptococos 21mm 22-29mm 30mm

CB Carbenicilina

100 g

Enterobacteriaceae 17 mm 18-22mm 23mm

Pseudomonas sp 13mm 14-16mm 17mm

CF Cefalotina 30 g 14mm 15-17mm > 18mm

CTX Cefotaxima 30 g 14mm 15-22mm 23mm

CAZ Ceftazidima 30 g 14mm 15-17mm 18mm

CRO Ceftriaxona 30 g 13mm 14-20mm 21mm

CXM Cefuroxima 30 g 14mm 15-17mm 18mm

CL Cloranfenicol 30 g 12mm 13-17mm 18mm

DC

Dicloxacilina

1 g

11-12mm

Staphylococcus sp 10mm 13mm

Penicilina vs Neumococo 19mm 20mm

E Eritromicina 15 g 14-17 mm 18mm

GE Gentamicina 10 g 12 mm 13-14mm 15mm

FEP Cefepime 30 g 14mm 15-17mm 18mm

NET Netilmicina 30 g 12mm 13-14mm 15mm

LEV Levofloxacina 5 g 13mm 14-16mm 17mm

NF Nitrofurantona 300g 14mm 15-16mm 17mm

PEF Pefloxacina 5 g 14 mm 15-22mm 23mm

PE

Penicilina

10 U

Staphylococcus sp 28mm 28mm

N.gonorrhoeae 19mm 20mm

Enterococos 14mm 15mm

Otros estreptococos 19 mm 20-27 mm 29mm

TE Tetraciclina 30 g 14mm 15-18mm 19mm

SXT Sufametoxazol con Trimetoprim

25 g 10mm 11-15mm 16mm

LOR Loracarbef 30 g 14 mm 15-17mm 18mm

LOM Lomefloxacina 10 g 15mm 16-21mm 22mm

TM Tobramicina 10 g 12mm 13-14mm 15mm

CFX Ceftizoxima 30 g 14 mm 15-19mm 20mm

CIP Ciprofloxacina Haemophilus y N gonorrhoeae

15 g 15mm 16-20mm 21mm

Enoxacina 10 g 14mm 15-17mm 18mm R = RESISTENTE I = DE SUSCEPTIBILIDAD INTERMEDIA S = SUSCEPTIBLE MS = MODERADAMENTE SUSCEPTIBLE (Esta categora indica un nivel de susceptibilidad que

requiere la mxima dosis permitida para la terapia; las cepas pertenecientes a esta clasificacin son susceptibles y no deben considerarse como intermedias)

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Resultados

Anote los resultados obtenidos de su antibiograma:

ANTIMICROBIANO

Halo de Inhibicin

en mm

Interpretacin

(R),(I), (MS),(S)

Siglas Nombre Concentracion

M u l t i s c o s G r a m n e g a t i v o s AK Amikacina 30 g

AM Ampicilina 10 g

CB Carbenicilina 100 g

CF Cefalotina 30 g

CTX Cefotaxima 30 g

CL Cloranfenicol 30 g

GE Gentamicina 10 g

NET Netilmicina 30 g

NF Nitrofurantona 300g

PEF Pefloxacina 5 g

SXT Sufametoxazol con Trimetoprim 25 g

M u l t i s c o s G r a m p o s i t i v o s AM Ampicilina 10 g

CF Cefalotina 30 g

CTX Cefotaxima 30 g

CXM Cefuroxima 30 g

DC Dicloxacilina 1 g

E Eritromicina 15 g

GE Gentamicina 10 g

PEF Pefloxacina 5 g

TE Tetraciclina 30 g

SXT Sufametoxazol con Trimetoprim 25 g

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REPORTE FINAL Cuando el mdico solicita al laboratorio el estudio denominado Cultivo Bacteriolgico de determinada muestra biolgica (del sitio real de infeccin, por supuesto), obtiene un reporte final con la informcin requerida:

Nombre del agente patgeno aislado (gnero y especie) y

Los antimicrobianos a los que dicho agente result susceptible y a los que result ser resistente in vitro, y

La concentracin de dichas substancias, de tal modo que el mdico pueda tomar decisiones teraputicas bien fundamentadas, seleccionando entre los medicamentos que resultaron ser efectivos ante el microorganismo.

Ejemplo de reporte de un Cultivo:

Estudio Microbiolgico de Exudado Farngeo Examen Microscpico

Frotis Gram: Leucocitos polimorfonucleares (3+); abundantes cocos grampositivos, regular cantidad de diplococos gramnegativos.

C u l t i v o

Se aislaron cepas de Staphylococcus aureus en asociacin con flora habitual de orofaringe.

A n t i b i o g r a m a

CEPA SUSCEPTIBLE A: Tetraciclina 30g, Sulfametoxazol/Trimetoprim 25g,

Cefotaxima 30g, Gentamicina 10g, Cefuroxima 30g,

Cefalotina 30g, Pefloxacina 5g;

DE SUSCEPTIBILIDAD INTERMEDIA A: Eritromicina 15g, Dicloxacilina 1g;

RESISTENTE A: Ampicilina 10g, Ceftazidima 30g, Penicilina 10U.

NOTAS DE INTERS RESPECTO AL CULTIVO BACTERIOLGICO:

Un reporte de Cultivo Bacteriolgico tarda varios das, pues como pudimos observar en esta prctica, la incubacin inicial para aislar a los microorganismos a partir de la mues-tra biolgica, toma al menos 24 a 36hr. Una vez aisladas las cepas, se necesita investi-gar la identidad de las colonias sospechosas de ser el agente patgeno. La identifica-cin de las cepas toma al menos otras 24 horas. De resultar patgenas, es necesario efectuar el antibiograma, que toma otras 24 horas.

En los cultivos de muestras biolgicas que normalmente deberan ser estriles (orina, semen, LCR, conjuntiva ocular, por citar algunos ejemplos) debe efectuarse antibiograma a cualquier organismo que haya crecido en cultivo, que usualmente es una cepa nica. Si crecen dos o ms cepas, es muy probable que haya existido contaminacin de la muestra durante su recoleccin o transporte al laboratorio.

En los cultivos de muestras biolgicas que usualmente contienen una flora microbiana local o microbiota (excremento, exudados farngeo, vaginal por citar algunos ejemplos), el laboratoro seleccionar los medios de cultivo convenientes (selectivos y diferenciales) para el aislamiento de cepas que usualmente son patgenas en ese sitio anatmico, dejando fuera a la flora normal, para que no interfiera. Una vez demostrado un agente patgeno, se efectuar el antibiograma.

No se efectuar antibiograma a la flora habitual, porque est contraindicado eliminar a la microbiota protectora, pues dejara al paciente susceptible al establecimiento de microorganismos oportunistas.

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Firma del alumno ________________________________

Firma del catedratico ____________________________



SI NO


4.0



7.0

Total 15.0

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Prctica N4: Baciloscopa Competencia: El alumno comprobar la utilidad de la tincin para Acidorresistentes como parte de la investigacin microbiolgica para diagnstico de tuberculosis. Fundamentacin:

Las micobacterias (gnero Mycobacterium) son bacilos que poseen una pared celular gruesa y cerosa, resistente a la tincin de Gram, por lo que requieren ser tratadas con potentes solventes orgnicos tales como el alcohol cido. Para que el colorante primario penetre a travs de las cpsulas cerosas de estos bacilos, se requiere un tratamiento fisico; en la tcnica de Ziehl-Neelsen se utiliza calor; y en la tcnica de Kinyoun se aade al colorante un detergente tensoactivo. A este grupo de microorganismos se les denomina Acidorresistentes, pues se resisten a la decoloracin por alcohol acidificado. Los microorganismos acidorresisten tes se tien de rosa y el fondo del frotis se observa azul claro, pues el colorante de contraste es Azul de Metileno. Comunmente, los bacilos causales de tuberculosis, son llamados BAAR, siglas que significan: Bacilos Alcoho cido Resistentes. Material y Reactivos -Muestra Biolgica en estudio -Portaobjetos -Asas Bacteriologicas -Mechero de Bunsen -Agua Destilada -Colorantes para tincin de Acidorresistentes de Kinyoun: Carbolfucsina Kinyoun, Solucion de Alcohol Acido, Azul de Metileno -Aceite de Inmersion -Microscopio, papel seda para lentes

Tcnica de Kinyoun

1.-En un portaobjetos, preparar un extendido fino del material en estudio y dejarlo secar al aire. 2.-Fijar el material pasndolo 3 4 veces por la flama de un mechero de Bunsen. 3.-Colocar el frotis preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie del frotis con un trozo de papel filtro. Agregarle unas gotas de colorante de Carbolfucsina hasta humedecer el frotis. Dejar actuar 5 minutos. Si se seca el papel filtro, aadir mas colorante.

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5.-Retirar con unas pinzas el papel filtro y enjuagar con agua destilada. Dejar escurrir, pero no deje secar.

6.-Agregar decolorante alcohol acido a gotas hasta no arrastrar mas colorante (no mas de 2 min).Enjuagar con agua destilada. Escurrir y no dejar secar.

7.- Agregar el colorante de contraste Azul de Metileno durante 1 minuto, lego enjuagar de nue-vo con agua destilada y secar al aire para posteriormente observar al microscopio con objetivo de inmersin. Como en el Gram, si se observarn bacterias, se requerir de un mximo aumen-to, que es el objetivo 100x, para lo cual se requiere tambin de mucha luz. El condensador se coloca hasta el tope superior y el diafragma se abre totalmente.

RESULTADOS

Dibujar y describir lo observado:

Mycobacterium tuberculosis

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Firma del alumno ________________________________




SI NO


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7.0

Total 15.0

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Prctica N5: Examen Coproparasitoscpico

Competencia: El alumno aprender la utilidad y la aplicacin del estudio Coproparasitosc- pico en el diagnstico de las parasitosis intestinales.

Introduccin al tema En este estudio las muestras a examinar son heces fecales (el olor es ocasionado por la

presencia de indol y escatol producidos a partir de triptofano por las bacterias), pero incluso la simple observacin macroscopica puede conducir a importantes indicios diagnsticos. El estudio de una muestra de heces, permite detectar diversos tipos de parsitos intestinales. Algunos organismos viven en simbiosis no patgena, en tanto que otros son definitvamente parsitos, ocasionando enfermedad en el intestino y en algunas otros organos.

Mtodos de Diagnstico: Los mtodos de laboratorio, actualmente dependeran de los datos clnicos del paciente y de la orientacin diagnstica a que el mdico se refiera. Estos pueden variar desde un simple examen directo al microscopio (amiba en fresco) hasta una prueba inmunolgica como ELISA para detectar a los parsitos mediante la demostracin de sus antgenos en la muestra de excremento. Para fines didcticos, esta prctica slo se enfocar al examen directo de la muestra y al mtodo de concentracin por flotacin ya que son stos los que ms se utilizan en los laboratorios clnicos.

El nmero de formas parasitarias en las muestras fecales es con frecuencia demasiado escaso como para que se puedan observar microscpicamente en fresco o en preparados teidos, por lo tanto, se deben emplear mtodos de concentracin para poder detectarlos. Los mtodos ms comunmente utilizados son los de flotacin y sedimentacin. Mtodo Directo: Se realiza con el propsito de detectar la presencia de quistes o huevecillos parasitos y para visualizar la presencia de leucocitos y eritrocitos. Concentracin por flotacin (Mtodo de Faust): Los quistes de protozoarios y huevecillos de helmintos de baja densidad se pueden hacer flotar en la superficie de una solucin de densidad elevada. Los parasitos que flotan en la superficie se pueden recoger de la parte superior de la solucin mediante un asa o una pipeta capilar, o con un cubreobjeto que se apoya sobre el menisco.

Con esta prctica el alumno conocer los fundamentos de los diferentes mtodos de laboratorio para el diagnostico de parasitosis intestinales y ser capaz de conocer y distinguir diferentes formas de parsitos.

Material y Reactivos -Solucin de sulfato de zinc con densidad 1.180gr/dL -Solucin de Yodo de Lugol -Solucin salina isotnica -Portaobjetos -Cubreobjetos -Aplicadores de madera -Tubos cnicos para centrifuga -Centrifuga -Gasas y embudos -Gradilla para tubos -Microscopio -Muestras de heces (el alumno la conseguir)

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Procedimiento o Tcnica Muestra: Colectar una muestra de excremento en un frasco de boca ancha con tapa de rosca. Una porcin del tamao de una nuez es suficiente. La muestra no debe contaminarse con orina porque tiene un efecto nocivo sobre los protozoos. Si la consistencia es lquida, debe examinarse cuanto antes, dentro de la primera hora de evacuada. Heces bien formadas, pueden examinarse dentro de las 24 horas posteriorres a la obtencin. Mtodo Directo:Sobre un portaobjetos, colocar una gota de solucin de yodo de Lugol y con un aplicador de madera agregar una pequea cantidad de muestra, mezclar hasta suspenderla en el yodo. Colocar el cubreobjetos y examinar con objetivo 10x y 40x en el microscopio. Condensador y diafragma a la mitad de su capacidad.

Metodo de Concentracin por Flotacion (Faust)

1.-Agregar al frasco que contiene la muestra, solucin salina isotnica hasta cubrirla; cerrar hermticamente el frasco y agitar para suspenderla. Transferir parte de esta suspensin fecal a un tubo de ensayo hacindola pasar a travs de gasa por un embudo, para quitar restos de alimentos. Llenar el tubo hasta aproximadamente a 5 mm del borde y taparlo.

2.- Centrifugar a 1,500 rpm durante 3 minutos. Descartar el sobrenadante. Resuspender el se-dimento con salina isotnica y volver a centrifugar. Este procedimiento de lavado nos dar una muestra ms limpia, ms libre de artefactos. Descartar el sobrenadante para pasar al paso 3. 3.-Aadir al tubo aproximadamente 2 a 3 ml de solucin de Sulfato de Zinc. Mezclar suavemente hasta resuspender el sedimento. Agregar Sulfato de Zinc hasta aproximadamente 2 a 3mm del borde del tubo.

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5.-Centrifugar la suspension durante 45-60seg. Retirar el tubo cuidadosamente de la centr-fuga, sin agitar ni salpicar su contenido y colocarlo en la gradilla en posicin vertical. Agregar ms Sulfato de Zinc hasta el borde sin permitir que se derrame. Colocar un cubreobjetos que toque el menisco del liquido y dejarlo en reposo 10 min. 6.-Colocar 1 gota de yodo de Lugol en un portaobjetos y colocar con sumo cuidado el cubreob jetos con la gota de suspensin fecal concentrada por flotacin de tal manera que se mezclen el yodo y la suspensin fecal concentrada. 7.-Examinar con objetivo 10x y 40x en el microscopio.El condensador y el diafragma debern estar a la mitad de su capacidad. Resultados Tomar notas de las formas observadas con objetivo seco fuerte (40x) y describirlas, tomando como gua las ilustraciones de la siguiente pgina. Concentrado (Faust) Observacion Directa

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Quistes, Trofozoitos de protozoarios , Huevecillos de helmintos

que pueden ser encontrados en heces fecales.

ARTEFACTOS tambin encontrados con frecuencia

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Firma del alumno ________________________________




SI NO


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7.0

Total 15.0

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Prctica N6: Pruebas Inmunolgicas

Competencia: El alumno aprender la utilidad y la aplicacin de los estudios de tipo inmunol gico en la investigacin de enfermedades infecciosas tanto para su deteccin como para el manejo de la evolucin de stas. Introduccin al tema Las pruebas de tipo inmunolgico se fundamentan en reacciones entre antgenos y anticuer pos. Este tipo de pruebas se emplean en el rea de Microbiologa tanto para detectar la presencia de antgenos microbianos como de anticuerpos contra ellos en una muestra biolgica (prue-bas cualitativas), como para monitorear la evolucin del problema infeccioso al notar ascenso, descenso o desaparicin en el ttulo o concentracin de anticuerpos(pruebas cuantitativas o semi cuantitativas). Las pruebas inmunolgicas de mayor aplicacin clnica incluyen a las reacciones de:

Precipitacin

Aglutinacin

Absorcin

Otras reacciones: Inhibicin, Toxina-Antitoxina, Radio Inmuno Anlisisi (RIA) ELISA y/o EIA (Ensayos Inmunoabsorbentes Ligados a Enzimas), Inmunofluorescencia, Hemaglutina-cin, por menionar algunos.

Infecciones bacterianas como Tularemia, Brucelosis, Salmonelosis, Rickettsiosis e infeccio-

nes urinarias, a veces ocasionan fiebre de origen indeterminado, de difcil diagnstico. En este tipo de infecciones y otras causadas por microorganismos difciles de aislar en fluidos biolgi-cos, el estudio denominado Reacciones Febriles constituye una tcnica diagnstica de gran utilidad. Las Reacciones Febriles comprenden 3 reacciones principales que comparten mecanis mos similares:

Reaccion de Widal: Para el diagnstico de salmonelosis causadas por Salmonella typhi, S. paratyphy, S. choleraesuis o S. enteritidis. Las Salmonellas (bacilos gramne gativos no esporulados) presentan antgenos flagelar (H) y somticos (O), contra los que nuestro organismo reacciona formando anticuerpos que son cuantificados por medio de esta reaccin. Estos microorganismos pueden causar: 1) Gastroenteritis 2) Fiebre Tifoidea 3) Septicemia y 4) Muerte

Reaccin de Weil Flix:Para el diagnstico de Rickettsiosis, ya que las especies de Rickettsia que causan Tifo, Fiebre de las Montaas Rocosas, tienen componentes antignicos idnticos a algunas cepas de la enterobacteria Proteus (serotipos Ox2, Ox19, OxK). Las especies de Rickettsia son cocobacios pequeos, pleomrficos que funcionan como parsitos intraceculares. La inmunidad por lo general es de larga duracin.

Reaccin de Huddlesson: Para el diagnstico de infecciones por las bacterias Brucella abortus, B. suis o B. melitensis. La Brucelosis es una enfermedad aguda o crnica que se manifiesta por escalofros, fiebre y debilidad; ocasionalmente episo-dios febriles ondulatorios que han dado lugar al nombre de la enfermedad como Fiebre Ondulante. Si esta reaccin presenta aglutinacin (es decir, positiva) no nos distingue cul de estas especies de Brucella es quien origin esta respuesta de anticuerpos. Huddlesson es uns prueba de inicio, escrutinio o rastreo. Para dar un diagnstico de brucelosis por B.abortus, es necesario efectuar otras pruebs ms especficas como 2-Mercaptoetanol y Rosa de Bengala (NOM-022-SSA2-2012 Para la prevencin y control de la brucelosis en el ser humano).

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Todas las anteriores son reacciones de aglutinacin entre los antigenos (reactivos en los frascos gotero) y los anticuerpos presentes en el suero del paciente formando agregados visibles. Material y Reactivos -Agitador de placas -Placa de aglutinacin -Aplicadores de Madera -Pipeta automtica y puntillas -Antigenos Febriles Conteniendo: A) Antigeno O (Somtico 9, 12) S. typhi B) Antigeno H (Flagelar D) S. typhi C) Antigeno paratyphi A (Flagelar A) D) Antigeno paratyphi B (Flagelar B 1, 2) E) Antigeno Proteus Ox-19 F) Antigeno Brucella abortus

Muestra: Tomar una muestra de sangre sin anticoagulante (tubo de tapn rojo, 5mL). Permitir que coagule a temperatura ambiente. Centrifugar y obtener el suero. Evitar la hemlisis.

Procedimiento La aglutinacin puede realizarse en placa o en tubo. En esta prctica la realizaremos en placa. Comenzaremos por

1) Rotular la placa colocando en el eje vertical las diluciones que haremos del suero del paciente, y en el eje horizontal, los antgenos que pondremos en contacto con dicho suero.

2) Depositar en los crculos asignados para cada antgeno (es decir, en sentido vertical y en orden descendente) : 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml del suero problema respectivamente

3) Agregar 1 gota del antgeno correspondiente a cada una de las cantidades de suero.

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4) Mezclar con un aplicador limpio cada crculo.

5) Agitar suavemente en la placa en el mezclador de rotacin (120 rpm) durante 2 a 3 minutos

6) Leer con luz indirecta o auxiliandose con el microscopio (Lupa, 4x) y valorar la aglutinacion segun corresponda a la maxima dilucion.

7) Anotar los resultados marcando en el crculo correspondiente el signo (+) donde todava presenta reaccin y el signo (-) donde ya no la presenta

Reaccin D i l u c i n o Ttulo Resultante

0.08 ml suero + 0.05 ml de antigeno 1:20





O H A B Br Ox19

0.08

0.04

0.02

0.01

0.005

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Interpretacion de Resultados y Conclusiones

Es de suma importancia considerar la Epidemiologia de cada patologia, considerando

los habitos alimenticios y medidas de higiene en cada pais a fin de interpretar correctamente los resultados de estas pruebas.

El incremento o disminucin confirmadas de los titulos son de importancia para determinar infeccion activa. La reaccion de Widal en la infeccin por Salmonella, las aglutininas "H" y "O" suelen aparecer en el suero despues de 1 semana y los titulos siguen aumentando durante 3 a 6 semanas; los anticuerpos contra "O" suelen descender en 6 a 12 meses en tanto que los anticuerpos contra "H" pueden permanecer elevados por aos. (titulos menor de 1:160). La reaccion de Weil-Felix muestra positividad 6 a 12 dias despues de la infeccin; los ttulos alcanzan su punto mximo en trmino de un mes y se negativizan en 5 6 meses. (titulos menor de 1:320). En la reaccion de Huddlesson los titulos suelen aumentar despues de 2 a 3 semanas y alcanzar su maximo entre las 4 y 8 semanas. (titulos menor de 1:40).Siempre corroborar con los otros mtodos antes mencionados y exigidos por la Norma Oficial. En todas las Reacciones Febriles, el incremento de los titulos cuatro veces por encima del lmite de referencia, es prueba contundente de una infeccion activa. Se recomienda repetir la prueba en 3 a 5 semanas en caso de obtener titulos fuera de los lmites, o bien, si resultaron normales pero el cuadro clnico sugiere que la enfermedad est activa, para detectar incremento en ttulos.

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CUESTIONARIO (PEGAR EN ESTE ESPACIO YA CALIFICADO) EVALUACION DE LA PRCTICA 6


Firma del alumno ________________________________

Firma del catedratico ___________________________



SI NO


4.0



7.0

Total 15.0

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Prctica N7: Hongos Contaminantes

Competencia: El alumno conocer la importancia de detectar hongos contaminantes, en el contexto de la prevencin y manejo de micosis oportunistas en pacientes inmunodeprimidos.

Introduccin al tema

Dentro del inmenso mundo de microorganismos de inters mdico, nos enfocaremos en un solo grupo de ellos; los hongos. Los hongos se clasifican como un reino independiente debi-do a innumerables caractersticas especficas como son:

Su forma de reproducirse que es por medio de esporas sexuales y asexuales.

La unidad fundamental es la hifa que su conjunto forma los micelios.

No efectan la fotosntesis fenmeno que realizan nicamente los vegetales

Son inmviles

Contienen glucgeno como material de reserva.

Su alimentacin es hetertrofa requiriendo materiales orgnicos ya elaborados como: azcares, aminocidos, cidos grasos, glicerol y vitaminas.

Pueden vivir asociados a otros individuos como comensales en simbiosis o como parsitos.

Presentan respiracin aerobia.

El grupo de hongos contaminantes oportunistas se han relacionado a procesos patgenos severos como son: Cncer por la produccin de aflatoxinas (Aspergillus flavus), otitis, problemas pulmonares, procesos alrgicos, Criptococosis cerebral, por mencionar algunos. Ejemplos de ellos: Candida, Penicillium, Alternaria, Rhizopus, Mucor, Aspergillus y Cryptococcus.

En esta prctica tendremos la oportunidad de observar al microscopio gran variedad de hongos con el fin de conocer su estructura morfolgica, tanto hifas como las diferentes esporas que puedan presentar

Con estos conocimientos se tendr la capacidad de diagnosticar una micosis provocada por hongos filamentosos al observar micelios como es el caso de Aspergilosis o mucormicosis, por ejemplo, y al observar abundantes levaduras su diagnstico estar orientado hacia una candidosis.

Penicillium Alternaria Aspergillus

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Material y Reactivos: Portaobjetos Hidrxido de Potasio (KOH) al 20 % Cubreobjetos Azul de Lactofenol. Microscopio Medio de cultivo Sabouraud, selectivo para hongos Bolsas de plstico Muestras de alimentos con crecimiento fngico (Muestra 1) Mechero de Bunsen Muestras de colonias fngicas de cultivo (Muestra 2) Asa Micolgica

Muestra N 1 Con anticipacin (al menos 5 das antes de la prctica), preparar una cmara hmeda, que consiste en: Colocar fruta, verdura (material orgnico en el que le interese haya desarrollo fngico) en una bolsa de plstico con un grado suficiente de humedad y dejarla a temperatura ambiente; la cmara debe conservar el grado de humedad durante los 5 das. Cierre la bolsa de plstico dejando unos pequeos orificios para oxigenar.

Procedimiento

1. En un portaobjetos aada una gota de Azul de Lactofenol 2. Esterilizar en la flama del mechero el asa micolgica en el mechero; dejar enfriar y

tomar una pequea muestra del hongo que desarroll en su cmara hmeda y suspenderla en el Azul de Lactofenol

3. Coloque con cuidado el cubreobjetos y observe al microscopio con 10x y 40x.

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Muestra N 2 En una placa de Agar Sabouraud, medio de cultivo especfico para desarrollo de

hongos, muestrear diferentes lugares de la Universidad como baos, cafetera, aulas, direccin, departamento, depsitos de agua etc. Solamente se necesita abrir la tapa de la caja Petri por 10 minutos para cultivo ambiental, es decir, del aire circulante de esa rea en particular. Si se trata de alguna superficie especfica, se requerir de tomar con un hisopo estril e inocular el medio de cultivo con l.

Llevar al laboratorio el medio inoculado, bien rotulado indicando fecha, hora y lugar de

la toma de muestra, as como el equipo de trabajo y grupo al que pertenece. Se dejara incubar a temperatura ambiente y fuera de la estufa de cultivo por una semana.

El da de la observacin:. a).- Contar el nmero de las diferentes colonias. b).- Morfologa colonial: Observar cada colonia y describir sus caractersticas como color, textura y forma, tanto por el anverso como por el reverso, ya que hay hongos que presentan diferente aspecto y color en sus micelios areos y en los vegetativos (los que estn inmersos en el agar)

c).- Observacin Microscpica: Tomar muestra de las diferentes colonias para su observacin, procediendo de la siguiente manera:

1) En un portaobjetos limpio coloque una gota de Azul de Lactofenol. 2) Esterilizar el asa y dejar en friar, sin salirse del rea estril del mechero (10cm alrededor de la flama) . Tomar con ella una porcin de la parte area de la colonia que le resulte ms interesante y colocarla en el Azul de Lactofenol.

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3) Coloque con cuidado el cubreobjetos formando un ngulo de 450 evitando as la formacin de burbujas.

4) Observe las preparaciones enfocando con 10x y enseguida con 40 x. Las preparaciones en fresco requieren de poca luz para observarse. Condensador a la mitad y el diafragma a la mitad de su capacidad (ver las tablitas de gua que se encuentran frente a cada microscopio). Resultados Tomar nota de lo encontrado en ambas muestras. 1).-Muestra de la cmara hmeda:_______________________________ Describa lo que observ a 400 aumentos (40x):

2).- Colonias del Cultivo Micolgico en Sabouraud, observacin macroscpica y microscpica A).-Lugar de la toma de muestra: ________________________ B).-Numero de colonias diferentes que hayan desarrollado: _______ C) Descripcin macroscpicas de morfologa colonial:

____________________________________________________________

D).- Observacin microscpica de las colonias: Describa lo que observ a 400 aumentos (40x):

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Firma del alumno ________________________________

Firma del catedratico __________________________



SI NO


4.0



7.0

Total 15.0

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Prctica N 8: Diagnstico de Micosis Superficiales

Competencia: El alumno aprender a recolectar correctamente una muestra de piel o anexos para investigar dermatofitos para llegar a un diagnostico certero de una micosis superficial.

Introduccin al tema

El alumno traer muestras de piel y anexos (pelos, uas) para examinar en esta prcti-ca. Recordemos que este tipo de micosis afecta las zonas queratinizadas; se clasifican como superficiales y los agentes causales son los dermatofitos, dentro de los cuales los ms fre-cuentes son: Tricophyton, Epidermophyton y Microsporum.

Es importante mencionar que el hallazgo de micelios en una observacin directa con KOH ser determinante en el diagnstico de este tipo de micosis.

Para que la observacin sea exitosa debemos llevar a cabo un excelente aclaramiento de la muestra que consiste en dejar en reposo de 20 a 30 min la muestra con KOH al 20 %, despus de haberla fijado, con el fin de que los bordes de las clulas no impidan o confundan al estudiante.

OBSERVACION DE MICELIOS

Material y Reactivos: Portaobjetos y Cubreobjetos, Asa Micolgica. Mechero Bunsen, Microscopio, KOH Al 20 % Muestra de escamas de piel, pelo y uas Muestra de escamas de piel, pelo y uas

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Procedimiento Muestra N1: Escamas de Piel

Las lesiones en la piel provocadas por dermatofitos en Tia corporis es caracterstico observar un borde eritematoso y descamativo con una zona central. Primeramente la lesin debe ser frotada con una gasa con alcohol y despus con un bistur estril raspar los bordes con el fin de obtener escamas. En el caso de Pitiriasis versicolor, la descamacin es tan fina que el raspado se realiza utilizando un portaobjetos estril y recibiendo la muestra en otro tambin estril generalmente la lesin se localiza en el cuello y tronco del organismo. Tambin se puede utilizar la Tcnica de la cinta engomada.

Muestra N2: Raspado de uas

En casos de Onicomicosis causada por dermatofitos, se limpia la ua con una gasa o esponja con alcohol colocando la yema del dedo afectado sobre el margen de un portaobjetos estril o dentro de la superficie de una caja de Petri. Se procede a raspar la ua utilizando una hoja de bistur hasta obtener la cantidad suficiente. Si mas de una ua se encuentra lesionada debe usarse otra navaja limpia. En caso de tener barniz deber retirarlo con 3 das de anticipacin.

Muestra N3: Pelo Daado

En el caso de Tia capitis causada por dermatofitos, primeramente debe examinarse la piel cabelluda del paciente para obtener pelos quebradizos y deteriorados con una pinza estril colocndolos de preferencia en una caja de Petri. Se recomienda que con las pinzas tambin obtenga escamas de la lesin. Al realizar la observacin microscpica y en el caso del hallazgo de esporas y micelios, determine si la lesin es Ectotrix (fuera del pelo) o Endotrix (dentro del pelo).

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EXAMEN MICROSCPICO DE PELOS, UAS Y ESCAMAS DE PIEL : Primera Preparacin: 1) Colocar una o dos gotas de KOH al 20% en un portaobjetos. 2) Con un asa micolgica previamente esterilizada, colocar la muestra en el lquido (pelos, escamas, o raspado de uas) 3) Cubrirlo con un cubreobjetos y pasar la preparacin sobre la llama del mechero 2 o 3 veces procurando no quemarla. 4) Deje reposar la preparacin de 20 a 30 minutos para un adecuado aclaramiento facilitando as la bsqueda de micelios. 5) Examine la preparacin con seco dbil (10x) y enseguida con seco fuerte (40x). Resultados y Observaciones: Dibuje lo observado con seco fuerte (40 x) de cada una de las muestras y describa las observaciones. Muestra N1.- Piel:

Hallazgos: _________________ Muestra N2.- Uas:

Hallazgos: _________________ Muestra N3.- Pelos:

Hallazgos: _________________

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Firma del alumno ________________________________




SI NO


4.0



7.0

Total 15.0

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Practica N 9: Deteccin de Anticuerpos Anti VIH Competencia: El alumno conocer el fundamento para la deteccin de anticuerpos contra el Virus de la Inmunodeficiencia Humana utilizando la tcnica de ELISA, con el fin de solicitarlo en el tiempo adecuado y en caso necesario solicitar una prueba confirmatoria para interpretar correctamente los resultados obtenidos. Introduccin al tema

El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus identificado en 1983

como el agente etiologico del sindrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Se han demos trado dos tipos, el VIH-1 y VIH-2. Las principales vas de transmisin del VIH son el contacto sexual, la contaminacin a travs de la sangre o sus productos y la transmisin de madre a feto durante el embarazo.

Las principales clulas infectadas por el VIH son los linfocitos T4, que desempean un papel importante en el sistema de defensa inmunolgica del organismo. La progresiva declinacin del nivel de T4 durante el desarrollo de la enfermedad conduce a infecciones oportunistas con consecuencias fatales.

El virus VIH consiste en una molcula de RNA genmico protegida por una cpside y una envoltura. Esa envoltura es el principal objetivo de la respuesta humoral (por anticuerpos). El diagnstico serolgico de la infeccin por VIH se basa en la deteccin especfica de anticuer-pos contra protenas de la envoltura. La prueba presuntiva de anticuerpos contra VIH 1 y/o de VIH 2 es slo una prueba de tamizaje o rastreo inicial. Debido a que la produccion de anticuerpos contra VIH despus del contacto inicial puede ser tarda, un resultado negativo en esta prueba no debe ser considerado como evidencia concluyente de que el paciente no ha sido expuesto ni se ha infectado con el virus.

La positividad de la prueba de anticuerpos contra el virus no debe ser considerada como un diagnstico de SIDA; debe ser confirmada mediantes pruebas ms especficas de biologa molecular.

(*) Los retrovirus se caracterizan por contener material gentico ARN pero lo transforman en ADN al entrar en la clula hospedante mediante la enzima transcriptasa inversa.

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Fundamento de la prueba: La prueba que realizaremos es un ensayo inmunoenzimatico indi-recto (EIA) de fase slida. Consiste en poner en contacto protenas del virus VIH 1 y del virus VIH 2 en contacto con el suero del paciente a estudiar, para demostrar la presencia o no de anticuerpos contra stos. La reaccin es visible porque una enzima, que est ligada a la fase slida del equipo de detaccin, la pone de manifiesto mediante un cambio de color (ver adelante en el procedimiento, los dientes del peine de reaccin).

Material y Reactivos Perforador Cronmetro Gasas y papel absorbente. Pipeta automtica de 50 L y puntillas desechables Guantes desechables (los traer el alumno).

Peine de reaccin sensibilizado: Punto superior: anticuerpos de cabra contra inmunoglobulina humana ( control interno). Punto medio: pptidos sintticos de VIH-2 (secuencias env de gp36). Punto inferior: pptidos sintticos de VIH-1 (secuencias env de gp41 y gp120).

Sueros control positivo y negativo Bandeja de desarrollo: cubiertas con papel aluminio y que contiene todos los reactivos necesarios para la prueba. Consta de 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una con los contenidos seguientes:

Fila A: Diluyente de Muestra

Fila B: Solucin de Lavado

Fila C: Anticuerpos de Cabra Anti-IgGHumano Marcados con Fosfatasa Alcalina

Fila D: Solucin de Lavado

Fila E: Solucin de Lavado Fila F: Solucin de Sustrato Cromognico , es decir, el sustrato sobre el que la Enzima

Fosfatasa acta produciendo un color visible a simple vista (EIA: Inmunoensayo ligado a Enzima)

Estufa de Cultivo a 37C para incubar las reacciones Muestra: Tomar 5 ml de sangre sin anticoagulante, dejar que coagule, centrifugar y obtener el suero. Evitar la hemolisis.

Precauciones Practique cuidados normales de laboratorio en el manejo de reactivos. Aunque los sueros control Positivo son examinados por el fabricante para Hepatitis B , Hepatitis C y VIH, antes de sacarlos a la venta, deben manejarse como potencialmente infecciosos, como si fueran muestras de pacientes, capaces de transmitir enfermedades Maneje las muestras problema como potencialmente infecciosas capaces de transmitir enfermedades

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PROCEDIMIENTO Reaccion Antgeno-Anticuerpo (Fila A )

1) Perfore en la cubierta plstica-metlica de la bandeja de desarrollo slo los pocillos de la Fila A que van a ser utilizados utilizando el perforador. Recuer de incluir un pocillo para los Controles Positivo y Negativo, respectivamente, adems de la (s) muestra(s) a examinar.

2) Con una puntilla diferente para cada muestra, tomar 50L de: Contol Positi-vo, Control Negativo, Muestra 1, Muestra 2, etc, y colocar cada uno en distin to pocillo de esa Fila A, tomando nota en este manual de la posicin de cada uno de ellos, para no confundir resultados.Desechar adecuadamente las puntillas en el correspondiente recipiente para RPBI.

3) Inserte el peine con el lado impreso hacia usted en los pocillo de la Fila A que contienen las muestras y controles. Mezcle retirando e insertando el peine en los pocillos varias veces.

4) Deje el peine en la Fila A durante exactamente 10 minutos a 37oC.

Mezcle dos veces mas durante la incubacion.

5) Hacia el final de los 10 minutos, perfore la cubierta de los pocillos necesa-rios en la Fila B, utilizando el perforador. No abra ms pocillos que los necesarios.

6) Al cumplirse los 10 minutos, saque el peine de la la Fila A. Absorba el exceso de lquido tocando las puntas de los dientes sobre un papel absorben te limpio. No toque la superficie frontal del peine.

Primer Lavado (Fila B)

7) Inserte el peine en los pocillos de la Fila B. Agite retirando e insertando el peine en los pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces en el transcurso de 2 minutos.

8) Hacia el final de los 2 minutos, perfore la cubierta de los pocillos necesarios en la Fila C, utilizando el perforador. No abra ms pocillos que los necesarios.

9) Al cumplirse los 2 minutos, saque el peine de la Fila B. Absorba el exceso de lquido tocando las puntas de los dientes sobre un papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del peine.

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Union del Conjugado (Fila C)

10) Inserte el peine en los pocillos de la Fila C. Agite retirando e insertando el peine en los pocillos durante al menos 2 segundos. Deje dentro el peine en la Fila C durante exactamente 10 minutos incubar a 37

oC. Mezcle dos veces

mas durante la incubacion.

11) Hacia el final de los 10 minutos, perfore la cubierta de los pocillos necesa-rios en la Fila D utilizando el perforador. No abra ms pocillos que los necesarios.

12) Al cumplirse los 10 minutos, saque el peine de la Fila C. Absorba el exce-so de lquido tocando las puntas de los dientes sobre papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del peine.

Segundo Lavado (Fila D)

13) Inserte el peine en los pocillos de la Fila D. Agite retirando e insertando el peine en los pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces en el transcurso de 2 minutos.

14) Hacia el final de los 2 minutos, perfore la cubierta de los pocillos necesa-rios en la Fila E utilizando el perforador. No abra ms pocillos que los necesarios.

15) Al cumplirse los 2 minutos, saque el peine de la Fila D . Absorba el exce so de lquido tocando las puntas de los dientes sobre papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del peine.

Tercer Lavado (Fila E)

16) Inserte el peine en los pocillos de la Fila E. Agite retirando e insertando el peine en los pocillos durante al menos 10 segundos para que quede bien lavado. Repita el lavado varias veces en el transcurso de 2 minutos.

17) Hacia el final de los 2 minutos, perfore la cubierta de los pocillos necesa-rios en la Fila F utilizando el perforador. No abra ms pocillos que los nece-sarios.

18) Al cumplirse los 2 minutos, saque el peine de la Fila E. Absorba el exceso de lquido tocando las puntas de los dientes sobre papel absorbente limpio. No toque la superficie frontal del peine.

Reaccion de Color (Fila F)

19) Inserte el peine en los pocillos de la Fila F. Agite retirando e insertando el peine en los pocillos durante al menos 10 segundos

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20) Deje introducido el peine en la Fila F durante exactamente 10 minutos incubar a 37

oC. Mezcle dos veces mas durante la incubacion.

21) Al cumplirse los 10 minutos, saque el peine de la Fila F. Absorba el exce so de lquido tocando las puntas de los dientes sobre papel absorbente limpio. No toque la superfic

manual de. microbiologia.[1]

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prctica n1 toma de muestras

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