manual de practicas-bqexp-0141 2015

7/25/2019 Manual de Practicas-bqexp-0141 2015

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0141 Bioqumica experimental 2015

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Facultad de Qumica

Departamento de Bioqumica

Manual de prcticas de Bioqumica experimental (0141)

Semestre 2013-1

Dra. Sobeida Snchez Nieto

Editora:Dra. Nahieli Greaves Fernndez


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Lista de autores y colaboradores

Luz Del Carmen CastellanosMaestra en Ciencias Qumicas, especialidad Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM.Coordinadora del laboratorio de Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM. Profesora del

curso Bioqumica experimental.

Alicia Cervantes PeredoMaestra en Ciencias Biomdicas, Facultad de Medicina, UNAM. Investigadora del HospitalGeneral de Mxico Dr. Eduardo Liceaga, Mxico, DF.Profesora del curso Introduccin a laGenmica.

Marisol Lpez LpezDoctora en Ciencias Biomdicas, Facultad de Medicina, UNAM. Profesora de la UAMXochimilco. Profesora del curso Introduccin a la Genmica.

Carmina MontielDoctora en Ciencias Qumica, Facultad de Qumica, UNAM. Profesora del curso Bioqumicaexperimental.

Mara del Carmen Parra GonzlezMaestra en Ciencias Qumicas, especialidad Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM.Profesora del curso Bioqumica experimental.

Sobeida Snchez NietoDoctora en Ciencias Qumicas, especialidad Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM.Profesor-investigador de la Facultad de Qumica, UNAM. Profesora del curso de Bioqumica

Experimental.

Lilian Gonzlez SeguraDoctora en Ciencias Qumicas, especialidad Bioqumica, Facultad de Qumica, UNAM.Profesor-investigador de la Facultad de Qumica, UNAM. Profesora del curso de BioqumicaExperimental.

Diana Snchez RangelDoctora en Ciencias Bioqumicas, Facultad de Qumica, UNAM. Profesora del cursoBioqumica experimental.


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CONTENIDO

Seccin I Introduccin al laboratorio de BioqumicaParte I: Reporte cientficoParte II: Revisin de mtodos espectroscpicos y elaboracin de

curva estndar de protenas

Seccin II Estructura y propiedades de protenas: Purificacin de la enzima lactatodeshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo

Parte I. Extraccin y precipitacin por salado.Parte II. Purificacin por cromatografa de intercambio inico y de

afinidadParte III. Monitoreo del proceso de purificacin. A. Determinacin de

concentracin de protenas.Monitoreo del proceso de purificacin. B. Separacin por

electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS

Seccin III Actividad enzimticaParte I. Curvas temporales de actividad enzimtica de la lactato

deshidrogenasa de msculo esqueltico de bovino.Parte II. Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto

de la concentracin de sustrato y de un inhibidor.

Seccin IV Estructura, propiedades y funcin de cidos nucleicos

Transferencia de material gentico I. ConjugacinTransferencia de material gentico II: Transformacin Aislamiento de plsmidos Ensayos de restriccin de plsmido Induccin de protena recombinante

Seccin V Regulacin del metabolismoParte I: Regulacin gentica en el opern lac


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1. INTRODUCCIN AL LABORATORIO DE BIOQUMICAPARTE I: REPORTE CIENTFICO

Objetivos

Conocer la importancia de realizar un reporte cientfico. Conocer las caractersticas y partes de un reporte cientfico: Introduccin, hiptesis,

objetivo, mtodos, resultados, discusin y conclusiones y referencias. Conocer cmo se formulan las hiptesis. Aprender a plantear hiptesis. Aprender a realizar un reporte cientfico.

Actividades sugeridas1. El profesor proporcionar al menos un artculo de investigacin para que los alumnos

identifiquen y analicen en ste las partes de un reporte. Cada equipo deber presentarqu secciones tiene su artculo y si stas cumplen con las caractersticas indicadas en

el texto. Los alumnos deben encontrar la hiptesis aunque sta no est planteada conla estructura descrita aqu, sino como una pregunta de investigacin. Se puede sugerira los alumnos que, con base en la informacin presentada en el artculo y la preguntade investigacin, planteen la hiptesis de la forma como se sugiere en este manual.

2. Asignar un problema a resolver por equipo o solicitar que los estudiantes elijan elproblema a solucionar. Permitir que los estudiantes formulen hiptesis y diseen unexperimento para comprobarla. Se podrn realizar al menos dos formas diferentes dereporte: La primera podra ser un reporte oral al final de la sesin (simulando uncongreso) y la segunda un reporte escrito para la siguiente sesin.

Cuestionario

1. Qu finalidad persigue el cientfico al escribir y publicar un artculo cientfico?2. Investiga cmo se lleva a cabo el diseode un experimento e incluye qu son las

variables independientes, las dependientes y las del control?3. Qu estructura debe tener una hiptesis?4. Cules son las secciones de un reporte cientfico?5. Qu diferencia(s) hay entre la seccin de resultados y la discusin?6. Qu informacin bibliogrfica deben contener las referencias, si son libros, artculos

o catlogos o pginas de internet?

Referencias Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper.4th edition.

Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994. Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace.6th edition. New

York: Longman, 2000.


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PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS YELABORACIN DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA

Objetivos Conocer el manejo de micropipetas y espectrofotmetros. Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena. Construir curvas de calibracin y comprender su importancia. Determinar el intervalo de sensibilidad de una curva estndar.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL

Material y equipoCeldas de metacrilato grado UV para espectrofotmetroTubos de microfuga1 gradilla para tubos de microfuga1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.1 Micropipeta 10 L1 Micropipeta 20-200 L1 Micropipeta 200-1000 LVrtexEspectrofotmetro (por grupo)

Reactivos Albmina de suero bovino (BSA) a una concentracin de 1 mg/mL. Solucin problema de protenas (los profesores la proporcionarn)

Solucin de carbonato-tartrato-cobre (CTC; 10% Na2CO3, 0.1 % CuSO4 y 0.2 % detartrato de Na+y K+) 10% Dodecilsulfato de sodio (SDS) 0.8 N NaOH Reactivo A.Se prepara inmediatamente antes de usarse con partes iguales de CTC,

10% SDS, 0.8 N NaOH y H2O destilada. Reactivo B. Dilucin del reactivo de Folin-Ciocalteu. 1 volumen de reactivo + 5

volmenes de H2O. Guardar en frasco mbar. Preparar preferentemente poco antesde usarse.

Desarrollo experimental

Determinacin de protenas por el mtodo de Lowry.

1. Rotular los tubos de microfuga y adicionar los reactivos en el orden que se indica en laTabla 1.2. Recuerda:debes mezclar con el vrtex despus de aadir cada una de lassoluciones.


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Tabla 1.1.Reactivos y cantidades a aadir para realizar una curva patrn de BSA y la determinacin de la concentracinde protenas de una muestra problema, utilizando el mtodo de Lowry para su determinacin.

Tubo H2O BSA

(1mg/mL)

Reactivo A Reactivo B

Incubaratempera

turaambientepor30minutos

A750m

1 450 L 500 L 250 L

2 445 L 5 L 500 L 250 L

3 440 L 10 L 500 L 250 L

4 435 L 15 L 500 L 250 L

5 430 L 20 L 500 L 250 L

6 425 L 25 L 500 L 250 L

7 420 L 30 L 500 L 250 L

8 415 L 35 L 500 L 250 L

Tubo H2O Muestra

Problema*

Reactivo A Reactivo B A750

m **Cantidad deProtena(g)

9 425 L 25 L 500 L 250 L

10 400 L 50 L 500 L 250 L

* La muestra problema la prepararn y entregarn los profesores.

** Calcular la cantidad de protena que contiene cada tubo de acuerdo a los L que se aadieron del estndar de BSA.En el caso de la muestra problema, calcular la cantidad de protena utilizando los datos de la regresin de la curvaestndar generada.

2. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 30 min.3. Encender el espectrofotmetro y seleccionar la de 750 nm.4. Colocar la mezcla en cada celda, pueden usar una celda y leer en orden creciente de

concentracin o bien usar celdas distintas para cada estndar (se les proporcionarn 6celdas por equipo)

5. Ajustar el espectrofotmetro con la disolucin del primer tubo de la tabla (sin BSA).

6. Realizar las lecturas.7. Llenar la tabla con los datos de absorbancia.8. Construir la grfica de absorbancia vs. cantidad de protena (g).9. Con los datos de regresin lineal y la alcuota de protena aadida al ensayo, calcular

la concentracin de la protena en la muestra (g/L o mg/mL).


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Cuestionario

1. Investiga qu factores contribuyen en la desviacin de la lnea recta al graficar laabsorbancia contra concentracin (desviaciones a la ley de Beer).

2. Cules son los principales mtodos colorimtricos usados en la determinacin deprotenas?

3. Qu sustancias pueden interferir con la determinacin de protenas por el mtodo deLowry?

4. Investiga cul de los siguientes mtodos es ms sensible y menos costoso paradeterminar la concentracin de protenas de una muestra: Lowry, Absorbancias 280nm y Bradford.

5. De acuerdo con tus resultados, cul es el intervalo en el que se podra determinar laconcentracin de una protena en una muestra utilizando la curva estndar dedeterminacin de protenas por Lowry? Da una explicacin.

6. Cules son las aplicaciones de una curva de calibracin o estndar?

Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold

Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182,50-69. Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al.which

is more generally applicable.Analytical Biochemistry83, 346-356. Wang Y, Wade H, Wong E-T, Li YC, Rodewald LW, Wahl GM 2007. Quantitative

analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation.PNAS104 (30), 12365-12370.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wade%20M%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wong%20E%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20YC%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rodewald%20LW%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wahl%20GM%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wahl%20GM%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Rodewald%20LW%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Li%20YC%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wong%20E%5Bauth%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Wade%20M%5Bauth%5D


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2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS.

PURIFICACIN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO

ESQUELTICO DE POLLO.

PARTE I. EXTRACCIN Y PRECIPITACIN POR SALADO.

Objetivos- Conocer las propiedades fisicoqumicas de las protenas: carga, punto isoelctrico,

masa molecular y afinidad.- Conocer las diferentes estrategias utilizadas para aislar protenas a partir de diferentes

fuentes celulares.- Relacionar las propiedades fisicoqumicas de las protenas con el fundamento de las

tcnicas utilizadas en la purificacin de protenas: Centrifugacin diferencial,precipitacin por salado, cromatografa de filtracin en gel, cromatografa deintercambio inico y cromatografa de afinidad.

- Aplicar las tcnicas de centrifugacin y precipitacin por salado como tcnicas inicialesde purificacin de una protena.

DISEO EXPERIMENTALEn esta prctica se purificar la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) de msculo de pollo.En la primera partedel protocolo de purificacin se realizar la clarificacin de la muestramediante filtracin y centrifugacin y posteriormente se llevarn a cabo dos pasossecuenciales de precipitacin con (NH4)2SO4. En la siguiente sesin se realizar eldesalado de la muestra mediante filtracin en gel, para al final purificarla mediante unacolumna de intercambio inico o de afinidad. Posteriormente, en la tercera parte delprotocolo se evaluar el rendimiento al determinar la cantidad total de protena y por ltimo,

en la cuarta partedel protocolo, se determinar su pureza al realizar la separacin de lasmuestras proteicas y visualizacin en un gel de poliacrilamida-SDS.

PRIMERA PARTE

Informacin necesaria para realizar la purificacin

Para iniciar el proceso de purificacin de una protena primero se deben conocer lascaractersticas de esta, en este caso en particular las propiedades de la lactatodeshidrogenasa de pollo, por lo que se te solicita lo siguiente:

Investiga cules son las propiedades de la lactato deshidrogenasa de pollo (lactatedehydrogenase from Gallus gallus cualquiera de las dos isoformas la A o la B), comola localizacin subcelular, su secuencia primaria de aminocidos, su pI (puntoisoelctrico), el nmero de residuos cargados positivamente y negativamente laactividad enzimtica que cataliza, peso molecular, estructura terciaria y/o cuaternaria.

Para lograrlo debes obtener la secuencia de la protena de preferencia en formato FASTA. Lasecuencia en FASTA comienza con una lnea de descripcin seguida por lneas de datos desecuencia de nucletidos o aminocidos. La lnea de descripcin comienza con el smbolo >.


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Se sugieren las siguientes ligas para encontrar la informacin que se te solicita:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(buscar nucleotide sequence o protein)http://www.uniprot.org/uniprot/P00340http://www.expasy.org/http://www.uniprot.org/http://www.brenda-enzymes.info/Para determinar el pI y el nmero de residuos de aminocidos cargadoshttp://web.expasy.org/compute_pi/


Material biolgico80 g de carne de pechuga de pollo por grupo.

Materiales y equipo para la extraccin de la enzima (por grupo)1 tijeras1 esptula1 recipiente para hielo1 par de guantes de ltexGasa1 vaso de precipitados de 1L1 probeta de 250 mL1 probeta de 100 mL4 botellas de centrfugaLicuadoraBalanza granatariaBalanza de dos platos

Materiales y equipo para la precipitacin con sulfato de amonio2 tubos para centrfuga con capacidad para 50 mL1 recipiente para hielo2 vasos de precipitados de 100 mL1 esptulaTubos para microfuga de 1.5 mL1 gradilla para tubos de microfuga1 caja con puntas de 200 L (amarillas) para micropipeta.1 caja con puntas de 1000 L (azules) para micropipeta.1 micropipeta 20-200 L1 micropipeta 200-1000 L1 bandeja pequea1 barra magntica1 agitador magnticoCentrfuga (por grupo)Balanza (por grupo)Caja para almacenar tubos de microfuga en el congelador (por grupo)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.uniprot.org/uniprot/P00340http://www.uniprot.org/uniprot/P00340http://www.expasy.org/http://www.expasy.org/http://www.brenda-enzymes.info/http://www.brenda-enzymes.info/http://web.expasy.org/compute_pi/http://web.expasy.org/compute_pi/http://web.expasy.org/compute_pi/http://www.brenda-enzymes.info/http://www.expasy.org/http://www.uniprot.org/uniprot/P00340http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


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Reactivos Amortiguador A: 20 mM Tris pH 8.6, 1 mM PMSF, 0.5 mM 2 -mercaptoetanol (NH4)2SO4 slido.


Importante.Todo el procedimiento deber realizarse en fro (4C). Mantener las soluciones ysuspensin proteica en bao de hielo. Despus de cada paso de purificacin se tomaruna muestra para analizar posteriormente (en el protocolo de purificacin se indicacundo tomar las alcuotas). Anotar en su libreta el peso del tejido utilizado, as como elvolumen de la solucin de homogeneizacin y los volmenes resultantes despus de cadauno de los pasos de purificacin (Figura 2.1). Estos valores son necesarios para calcularel rendimiento, contenido de protena y actividad enzimtica.

A. Extraccin. Esta primera parte la realizar el profesor con ayuda de un par devoluntarios y se distribuir el homogeneizado a todos los equipos.

1. Cortar en trozos pequeos 80 g de tejido (eliminar el tejido conectivo y graso queacompaa a la carne) y colocarlos en un vaso de licuadora previamente enfriado(mantener el vaso en el cuarto fro hasta su uso).

2. Agregar 3 volmenes de amortiguador A fro por cada g de tejido (240 mL) y licuarbrevemente, hacerlo en pulsos de 3 seg/3 a 6 veces para evitar que la licuadora secaliente. Si se hace necesario aadir ms volumen de amortiguador.

3. Filtrar la mezcla sobre dos capas de gasa grandes (previamente humedecidas conagua destilada). Exprimir suavemente sobre la pared de un embudo y recolectar elfiltrado en un vaso de precipitados de 1L. NOTA.Puede tomarse una alcuota de estafraccin y denominarla Fraccin 0.

4. Distribuir el filtrado en botellas de centrfuga y centrifugar a 7,000 rpm a 4C durante10 minutos. Decantar con cuidado el sobrenadante en un vaso de precipitados de 1 L.

Al sobrenadante lo denominamos homogeneizado total (Fraccin 1). Apartar 1 mL dela fraccin 1 en un tubos de microfuga y almacenar a -20C para su posterior uso.

Nota: Tirar el contenido de la gasa en el recipiente preparado para su deshecho.

B. Precipitacin con sulfato de amonio ((NH4)2SO4) por equipo.5. Tomar 25 mL de la fraccin 1 y colocarlos en un vaso de precipitados.6. Agitar el sobrenadante de manera continua y suave con un agitador magntico,

mientras se aade lentamente sulfato de amonio slido (8.15 g de (NH4)2SO4 por 25mL del sobrenadante). La agitacin debe ser lo suficientemente vigorosa para evitar laformacin de cmulos de sal no disueltos, pero no demasiado fuerte porque se puedeproducir espuma. En ningn momento utilizar varilla de vidrio o esptula paradisolver los grumos, ya que se pierde protena en estos utensilios. Se recomiendacolocar el vaso de precipitados en una bandeja pequea con hielo sobre la parrilla deagitacin para evitar que la solucin se caliente.

7. Cuando toda la sal se ha disuelto la solucin se encuentra a una saturacin del 55%con sulfato de amonio.

8. La mezcla que ahora se encuentra turbia se vaca a un tubo de centrfuga de 50 mL yse centrifuga a 10,000 rpm 4C por 10 minutos.


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9. Recolectar el sobrenadante (Fraccin 2) en una probeta y registrar el volumen.Descartar el botn. Tomar 1 mL de la fraccin 2 y almacenarla en un tubo demicrofuga a20C para su posterior uso.

10. Calcular el peso de (NH4)2SO4para obtener una solucin al 75%de saturacin, (0.125g de (NH4)2SO4 por cada mL del sobrenadante obtenido). Agitar como se describianteriormente.

11. Una vez disuelto el (NH4)2SO4, colocar la mezcla turbia en un tubo de centrfuga.Centrifugar a 10,000 rpm a 4C por 10 min y descartar el sobrenadante.

12. Resuspender el botn en 1 mL de agua. El volumen final es de aproximadamente 1.8mL.

13. Distribuir en 3 tubos de microfuga y etiquetar como Fraccin 3. Uno de los tubos debecontener 1000 L, ese volumen se usar en el siguiente protocolo experimental.(Distribuir el restante en los otros dos tubos). Almacenar a20C.

SUGERENCIAS:

1. Para evitar la congelacin y descongelacin innecesaria de las muestras esconveniente que al final de esta sesin se almacenen las muestras en alcuotas yque se etiqueten apropiadamente.

2. Se recomienda slo descongelar la alcuota una sola vez y despus desecharla.


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_____g Tejido______mL Amortiguador AMoler

Homogeneizado

Filtrar con gasa

HomogeneizadoDistribuir en botellas de centrfuga

Centrifugar 7,000 rpm, 10 min, 4C

Botn Sobrenadante (SN) __________mL VOLUMEN TOTAL(FRACCIN 1; _________mL)

A _______mL SN aadir ________g (NH4)2SO4 (55% saturacin)Agitar

Distribuir en tubos de centrfuga


Botn Sobrenadante(FRACCIN 2;_________mL)

Aadir ________g (NH4)2SO4 (75% saturacin)Agitar

Distribuir en tubos de centrfuga


Botn Sobrenadante(FRACCIN 3)

Aadir 1 mL de H20;Volumen total obtenido______mL

Figura 2.1 Esquema de purificacin de la lactato deshidrogenasa mediante precipitaciones sucesivas con sulfato deamonio. Se sugiere llenar los espacios vacos con las cantidades solicitadas.

Recuerda que ya est al55% de la sal


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Cuestionario1. Menciona cuatro usos que se les puede dar a las protenas purificadas2. Dentro de la gua para purificar a una protena se plantea que es importante

establecer cul va a ser el uso final de la protena purificada. Explica por qu.3. Qu propiedades de la lactato deshidrogenasa se aprovecharn en cada paso de su

purificacin? (Ejemplos: carga, peso, solubilidad y unin a ligantes)4. Por qu es importante mantener la mezcla de protenas a 4C?5. De acuerdo con la reaccin que cataliza y su funcin en el organismo, por qu crees

que se seleccion el msculo esqueltico de pollo para aislar la lactatodeshidrogenasa?

6. Qu tipo de columna y eluyente recomiendas para su purificacin y por qu?7. Existen varios mtodos en la literatura para purificar a la lactato deshidrogenasa, por

qu existe esa variedad si todos purifican a la misma protena?8. Menciona al menos dos protenas que tienen actualmente un uso farmacutico o

mdico y cul es la fuente biolgica de la que se obtienen.

Referencias Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis and

ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley & Sons Inc, NewYork, USA.

Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science 4.1.1-4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.

Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. JohnWiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4

Lehninger, A.L. 2005. Principios de Bioqumica. 4 edicin. Editorial Omega. Barcelona. pp.191-237.

Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden.Code number 18-1132-29 Pp 94.

Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd.Pp 1-7. Consultar la pginawww.els.net Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences.

John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pginawww.els.net Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,

USA. Pp 71-104 Sitio del que se tomo parte de la metodologa para la extraccin de la lactato deshidrogenasa

de pollohttp://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.html autor:John Tymoczko y actualizada por Rebecca Bryant

Sitios recomendados para1. aprender sobre las caractersticas y propiedades de las protenas

http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html pgina desarrollada por el Dr. RogelioRodrguez Sotres.2. calcular la concentracin de sulfato de amonio a aadir a una muestra.http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl3. calcular la fuerza centrfuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa.http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm 4. Macro-Prep Ion Exchange Supports. Instruction manual (2000).Bioradwww.bio-rad.com
http://www.els.net/http://www.els.net/http://www.els.net/http://www.els.net/http://www.els.net/http://www.els.net/http://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.htmlhttp://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.htmlhttp://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.htmlhttp://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.htmlhttp://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.htmlhttp://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htmhttp://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htmhttp://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htmhttp://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htmhttp://www.bio-rad.com/http://www.bio-rad.com/http://www.bio-rad.com/http://www.bio-rad.com/http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htmhttp://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htmhttp://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.htmlhttp://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.htmlhttp://www.els.net/http://www.els.net/


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PARTE II. PURIFICACIN POR CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIOINICO Y DE AFINIDAD

Objetivos

- Aplicar la cromatografa en filtracin en gel como una de las tcnicas para el desalado ycambio de la solucin amortiguadora de extractos proteicos.- Aplicar los mtodos de cromatografa de intercambio inico y de afinidad para purificar unaprotena

Informacin previaDe acuerdo con el pI que encontraste para la lactato deshidrogenasa, predice si su cargaelctrica ser positiva o negativa cuando la protena se encuentre en un amortiguador defosfatos pH 6.5 Y cundo se encuentre en un amortiguador a pH 8.6?


Material biolgicoFraccin 3 obtenida en la seccin anterior

Material y equipo1 columna de cromatografa vaca1 columna de Sephadex G-25 empacada con 2.5 mL de resina1 probeta de 50 mL

Tubos para microfuga de 1.5 mL1 recipiente para hielo1 soporte universal

1 pinzas de tres dedos de sujecin con nuez1 micropipeta de 1000 L1 micropipeta de 200 L1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta1 caja de puntas de 200 L para micropipeta

Centrfuga (por grupo)Balanza (por grupo)

ReactivosDesalado

2.5 % Sephadex-G25 (p/V). La columna contiene 2.5 mL de volumen de cama deSephadex, preparado segn se indica en el Apndice. Se entrega empacada para suuso inmediato.

Amortiguador A para quienes realizaran la cromatografa de afinidad. Contiene20 mM de Tris/HCl pH 8.6, 0.5 mM -Mercaptoetanol y 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride, inhibidor de serin y cisten proteasas, viene disueltoen etanol y se aade justo antes de usarse, preguntar a que concentracin seencuentra el stock).


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Amortiguador C para quienes realizaran la cromatografa de intercambioinico. Contiene 20 mM de Tris/HCl pH 6.5 y 0.5 mM -Mercaptoetanol y 1 mMPMSF.

Agua destilada estril para el lavado de las columnas.

Purificacin por cromatografa de afinidadMatriz para purificacin por afinidad.DEAE affi-gel blue gel (ver Apndice).Amortiguador A. El mismo que para el desalado. Para equilibrar la columnaAmortiguador B. Amortiguador A adicionado con 1 mM NADH.

Purificacin por cromatografa de intercambio inico

Matriz para intercambio CATINICO, Macro-prep High S de BIORAD (verApndice).Amortiguador C. Para equilibrar la columnaAmortiguador D. Contiene 20 mM de Tris/HCl pH 6.5y 0.5 mM -Mercaptoetanol, 1

mM PMSF y 1 M de NaCl.

Diseo experimental

F3

Volumen almacenado:

Determinacin de protenas

Actividad enzimtica

PAGE-SDS

Desalado (F4):

Cromatografa de exclusin molecular

o

Filtracin a travs de membrana

Cromatografa:

Intercambio inico (en columna o enbatch), FIA, FIB,FIC

o

De afinidad FAA, FAB, FAC

Volumen almacenado:


Actividad enzimtica

PAGE-SDS

Volumen almacenado:


Actividad enzimtica

PAGE-SDS


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Desalado A: Mediante cromatografa de exclusin molecular

1. Sujetar a un soporte universal la columna de sefadex (la columna tiene un volumen decama aproximado de 2.5 mL), como se muestra en la Figura 2.2.

2. Aadirle a la columna 3 mL de amortiguador de equilibrio, centrifugar a baja velocidado esperar a que por gravedad salga todo el amortiguador.

3. Adicionar a la columna poco a poco 700 L de la fraccin 3 y esperar a que entre a lacolumna por gravedad (aproximadamente 1 minuto o menos), si tarda ms, centrifugara baja velocidad.

4. Aadir 2 mL de amortiguador de equilibrio a la columna, desechar el primer mL queeluye de la columna (correspondiente al volumen vaco).

5. Agregar a la columna 1 mL de amortiguador A y recolectar en un tubo de microfugafro el segundo mL. Esta fraccin contiene a la LDH (Fraccin 4). Se guardan 100 Lpara llevar a cabo la medicin de actividad y determinacin de la concentracin deprotena. El resto de la muestra se utilizar en el siguiente paso. Todas las muestrasse almacenan a -20C en la caja de almacenamiento destinada para el grupo.

NOTAS.

1. Al term inar de u ti l izar la columna, lavarla con 10 mL d e agua desti lada estril , enel l t imo lavado dejar al menos 1mL d e agua en la colum na y taparla paramantenerla hidratada, entreg arla al pro fesor.

2. No es necesario real izar la operacin en condicio nes de esteri l idad, pero el us aragua estril ayud a a dism inu ir un a pos ible co ntam inacin de la co lum na para eluso p oster ior de otro grup o de estudiantes.

Figura 2.2. Purificacin de protenas por cromatografa lquida. A. Empacado de la columna y B.Colecta de fracciones de protena despus de aadir la solucin de elucin.


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Desalado B: Mediante filtracin en Membrana Ultracel de celulosa regenerada tipoAmicon (Millipore).

1. Adicionar en la parte superior del tubo Amicon (10K)700 L de la fraccin 3 y aadir 3mL del amortiguador A para quienes realizaran la cromatografa de afinidad o 3 mL delamortiguador C si realizaran la cromatografa de intercambio inico.

2. Cubrir con un parafilm la boca del tubo y mezclar por inversin.3. Quitar parafilm y colocar la tapa del tubo y centrifugar a 4000 rpm por 30 min a 4C. Al

trmino de la centrifugacin debe de haberse reducido el volumen del recientesuperior del tubo Amicon.

4. Volver a centrifugar bajo las mismas condiciones anteriores si el volumen es mayor a1 mL. Para no diluir la muestra.

Purificacin por cromatografa de intercambio inico o de afinidad.

La mitad del grupo realizar la purificacin por cromatografa de intercambio inico y la otraparte del grupo se enfocar en la purificacin de la LDH por columna de afinidad. Ambas

secciones del grupo comenzarn su purificacin a partir de la fraccin 4.

A. Empacado de la colum na para la fase 3 de la puri f icacin.Se les proporcionar una columna vaca y a sta se le adicionar alguna de las dosmatrices que el profesor les proporcionar para realizar intercambio catinico o deafinidad. Se colocar resina poco a poco, 1 mL cada vez para obtener al final unempacado de resina de 1.5 mL (cromatografa de intercambio inico) o 0.5 mL(cromatografa de afinidad). Cada que coloques un volumen de 1 mL deja drenar. Esimpo rtante revisar que no se hayan produ cido bu rbujas en la column a para que elflu jo del lqu ido sea cons tant e. Eliminar el eluato (volumen de lquido que eluy).

B. Pu ri f icacin po r cromatogr afa de afinid ad.1. Equilibra la columna empacada con 0.5 mL de DEAE Affi-gel Blue adicionando entre

5 a10 mL de amortiguador A (preguntar al profesor cuanto se usar). El volumenque drena se desecha. Para acelerar el proceso de paso de las soluciones en lacolumna se puede centrifugar a 3000 rpm por 5 min a 4C.

2. Enseguida se adicionan poco a poco 700 L de la Fraccin 4. Se centrifuga a 3000rpm por 5 min a 4C o se deja drenar y se elimina la fraccin no adsorbida(aproximadamente 700 L, ste es el volumen muerto, y no contiene protena).

3. Lavar la columna con al menos 10 mL del amortiguador de equilibrio para eliminarlas protenas no unidas a la columna. Esperar a que todo el lquido drene.

4. Para despegar a la LDH de la columna se adicionan 3 mL de amortiguador de

elucin A y se recolectan tres fracciones en tubos de microfuga fros (Fraccionesde la cromatografa de afinidad, FAA, FAB y FAC).NOTA. Al finalizar, lavar la columna con al menos 10 mL del agua estril, y entregar la columnalavada al profesor. La columna puede ser utilizada nuevamente por otro grupo.

Investiga:Cul es la diferencia entre absorcin y adsorcin?


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B. Puri f icacin por c rom atogr afa de intercambio inic o en c olum na.

1. Utilizar una columna con 1.5 ml de la matriz de intercambio inico. Equilibrar lacolumna adicionando poco a poco en la parte superior de la columna 3 mL deamortiguador C. Es MUY IMPORTANTE adicionar el amortiguador lentamente, demanera que el flujo de salida sea gota a gota. Se puede acelerar el procesocentrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4C.

2. Cuando la ltima gota del amortiguador de equilibrio haya salido, tapar la salida de lacolumna con parafilm y adicionar los 600 L de la fraccin 4. Posteriormente tapar laparte superior de la columna con parafilm y agitar por inversin de 5 a 10 veces.

Destapar la salida y dejar que pase el lquido por la columna desechando estevolumen. (ste es el volumen muerto y no contiene protena). Nuevamente, sepuede acelerar el proceso centrifugando a 3000 rpm por 5 minutos a 4C.

3. Realizar un lavado con 2 mL de amortiguador C (para eliminar la unin no especficade protenas a la columna). Alternativamente centrifugar como se mencion en lospasos 2 y 3.

4. La elucin de la protena se puede realizar aadiendo 2 mL del amortiguador D ycolectando las fracciones que salgan de la columna en tubo de microfuga, aunquetambin se recomienda que se realice mediante un gradiente de NaCl. Para elgradiente se necesitan las siguientes soluciones de amortiguador a diferentesconcentraciones de NaCl:

0.5 M NaCl en amortiguador: 250 L Amortiguador D + 250 L Amortiguador C 0.75 M NaCl en amortiguador: 375 L Amortiguador D+ 125 L Amortiguador C 1 M NaCl en amortiguador: 500 L Amortiguador D

5. Para la elucin en gradiente de NaCl adicionar 500 L de amortiguador adicionadocon 0.5 M de NaCl, dejar drenar y colectar todo el volumen en un tubo de microfuga.Despus aadir a la columna 500 L de amortiguador adicionado de 0.75 M de NaClcolectar todo el volumen en un tubo de microfuga y por ltimo aadir 500 L deamortiguador 1 M de NaCl (amortiguador D) volver a colectar todo lo que sale de lacolumna en un tubo de microfuga (Figura 2.3), a las que denominamos Fraccinpurificada FIA, FIB y FIC, respectivamente. Alternativamente centrifugar como semencion anteriormente.

6. Estas fracciones se usarn posteriormente para la determinacin de protena,actividad enzimtica y para realizar el corrimiento electrofortico. Proporcionar todaslas fracciones al profesor para que las almacene a -20C.NOTA. Al final izar, lavar la columna co n al menos 10 mL de agua estril yentregar al profesor. La colum na lavada puede ser reut il izada por otro grup o deestudiantes.

Recuerda:La resina Macroprep high S (BIORAD) es un fuerte intercambiador catinico, por lo que laLDH la debes mantener a pH debajo de su pI para que se encuentre cargadapositivamente.

Adems, hay que considerar que la forma B de la LDH es estable a pHs entre 6.0 y 10.0.


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C. Puri f icacin po r cromato grafa de intercam bio inico en batch .1. Tomar 1.5 ml de la matriz de intercambio inico y colocarla en un tubo de microfuga

de 2 mL centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos a 4C.2. Remover el sobrenadante y aadir 1 mL de amortiguador de equilibrio (amortiguador

C). Volver a centrifugar por 5 min.3. Remover el sobrenadante y adicionar los 600 L de la fraccin 4 y agitar por inversin

de 5 veces y dejar en el hielo por 10 min (La resina estar en contacto con laprotena a purificar).

4. Nuevamente centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos a 4C.5. Realizar un lavado aadiendo 1 mL de amortiguador C (para eliminar la unin no

especfica de protenas a la columna). Centrifugar y eliminar el sobrenadante. Repetiruna vez ms este lavado.

6. Estas fracciones se usarn posteriormente para la determinacin de protena,actividad enzimtica y para realizar el corrimiento electrofortico. Proporcionar todaslas fracciones al profesor para que las almacene a -20C.NOTA. Al fin al izar, lavar la resin a co n al m enos 10 mL de agu a estril y entregaral profesor. La columna lavada puede ser reut i l izada por otro grupo deestudiantes.

Cuestionario1. Por qu es necesario llevar a cabo el proceso de desalado de la o las fracciones con

alto contenido de sal en protocolo experimental antes de someterla a cromatografa deafinidad o de intercambio inico?

2. Cules otros usos tiene la cromatografa de exclusin molecular que no sea la deayudar a desalar una suspensin de protenas?

3. Qu intervalo de fraccionamiento de molculas tiene el Sephadex-G25 y queaplicaciones tiene?

4. Qu es el volumen vaco en una columna de filtracin en gel?5. A qu se refiere el trmino volumen muerto en una columna cromatogrfica?6. Investiga la composicin de la matriz de intercambio inico que se us para purificar a

la LDH.7. De acuerdo con pI de la LDH, si contaras con una columna de intercambio aninico

como DEAE-celulosa, a qu pH mantendras a tu protena y a qu pH mantendras elamortiguador para eluir a la protena de la columna? Fundamenta tu respuesta.

8. Qu propiedad de la protena se utiliza para purificar a la protena mediante unacolumna de intercambio catinico?

9. Qu debe contener el eluyente para la purificacin de la LDH en la cromatografa deintercambio inico que se propone en este protocolo y por qu?

10. Qu propiedad de la protena ests utilizando para purificarla por cromatografa deafinidad y cul es el componente clave para la purificacin de la LDH en estacolumna?

Referencias Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John Wiley & Sons Inc, New

York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala, Sweden. Catlogo 18-1132-29

Pp 94.


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Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar lapgina www.els.net

Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of life sciences. John Wiley & SonsLtd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net

Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 71-104. Macro-Prep Ion Exchange Supports Instruction manual. 2000. BIORAD www.bio-rad.com

Sitios recomendados para1.Aprender sobre cromatografa http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm2. Realizar una autoevaluacin sobre los fundamentos de la cromatografa http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm


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Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin.A. Determinacin de la concentracin de protenas

Objetivos Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificacin de una

protena. Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificacin de una protena. Aplicar un mtodo espectrofotomtrico para medir la concentracin de una protena. Determinar la concentracin mediante la deteccin de la absorbancia a 280nm. Determinar la concentracin de una protena utilizando un mtodo colorimtrico:

Determinacin de protenas por Bradford. Analizar el progreso de la purificacin de una protena. Conocer algunos parmetros que se determinan durante la purificacin de una

protena: rendimiento y pureza. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificacin de

protenas.

Para monitorear el proceso de purificacin y su eficiencia se debe determinar laconcentracin de protenas de cada una de las fracciones del proceso de purificacin de laprotena en estudio. En esta prctica se realizaran dos mtodos de determinacin deprotenas la medicin de la absorbencia intrnseca de la protena en el rango del UV y por elmtodo colorimtrico de Bradford.

Protocolo experimentalMaterial biolgicoFracciones obtenidas durante el proceso de la purificacin de la LDH

Material y equipo1 Recipiente para hieloCeldas metacrilato grado UV para espectrofotmetroCeldas de polipropileno para espectrofotmetroTubos para microfuga de 1.5 mL1 vrtexMicropipeta de 200-1000 LMicropipeta de 20-200 LMicropipeta de 5 a 10 L1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta1 caja de puntas de 200 L para micropipeta1 piseta con etanol y una con agua bidestilada.1 gradilla para tubos de microfugaEspectrofotmetro

Reactivos Reactivo de Bradford (Solucin en cido fosfrico de azul de Coomassie Brilliant

Blue G-250) Solucin estndar de albmina de suero bovino (BSA) 0.1mg/mL.


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Determinacin de protenas por el mtodo Abs 280 nm.1. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este

protocolo y que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactatodeshidrogenasa.

2. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.3. Colocar las fracciones en celdas de metacrilato grado UV.4. Leer la absorbancia a la longitud de 280 nm de las fracciones que les indique su

profesor.5. Calcular la concentracin de protena usando la frmula 4 (recuerden usar el

coeficiente de extincin molar adecuado). Llenar la Tabla 2.1.6. Usar este estimado para determinar las diluciones o alcuotas a usar en la

determinacin colorimtrica de protenas. Para determinar cul es la concentracinadecuada, recuerden que la sensibilidad del mtodo de Bradford es de 1 a 20 g deprotena con una absorbancia mxima aproximada de 0.6.

Tabla 2.1 Concentracin de protena calculada por la Absorbancia a 280nm

Tubo Absorbancia Concentracin (g/L)F0F1F2F3F4FPAFPB

Determinacin colorimtrica de protenas por el mtodo de Bradford. Se utilizar unacurva estndar de BSA y las muestras (fracciones) se harn por duplicado, utilizando tubosde microfuga para hacer las mezclas del ensayo.

Para la curva estndar:1. Etiquetar los tubos de microfuga segn se indica en la tabla 2.2. Despus aadir los

reactivos en el orden mostrado, agitando despus de cada adicin. Precaucin,maneja con cuidado el reactivo de Bradford, ya que contiene H3PO4!

2. Importante: incubar a temperatura ambiente por al menos 5 minutos. Registrar laabsorbancia a 595 nm. La absorbancia se incrementar con el tiempo, por lo que lasmuestras nodeben incubarse por ms de 1 h a temperatura ambiente.

Investiga y discute con tus compaeros:Por qu es importante tomar en cuenta que la absorbancia mxima en el mtodo deBradford sea de aproximadamente 0.6?


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Tabla 2.2 Orden de adicin de reactivos para la determinacin de protenas del estndar de BSATubo B 1 2 3 4 5

H2O (L) 800 770 760 740 720 700

BSA (L) 0 30 40 60 80 100

Reactivo Bradford (L) 200 200 200 200 200 200Absorbancia

3. Graficar absorbancia del estndar vs. cantidad de protena (g) y obtener losparmetros de regresin.

Para las muestras:4. Descongelar slo las alcuotas de las fracciones de protena destinadas para este

protocolo y que fueron recolectadas durante la purificacin de la lactatodeshidrogenasa o usar las muestras que descongelaron para la determinacin deprotenas por Abs 280nm.

5. Mantener las fracciones en un recipiente con hielo durante todo el experimento.6. Hacer las diluciones de cada una de las fracciones, segn indicaciones de su

profesor. Cada muestra diluida se determinar por duplicado. Anotar la dilucinempleada en la Tabla 2.3

Tabla 2.3.Determinacin de la concentracin de protena de las fracciones obtenidas durante los diferentes pasos de lapurificacin de la LDH de msculo esqueltico de pollo. F corresponde a Fraccin y conc a que la muestra se usarconcentrada.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

H2O (L)

cbp 800 L

F0 dil ____ (L)

F1 dil____ (L)

F2 dil____ (L)

F3 dil____ (L)

F4 dil____ (L)

FPA conc (L)

FPB conc (L)

ReactivoBradford (L)

200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200

Absorbancia

7. Numerar los tubos segn se indica en la Tabla 2.3 y dependiendo de los volmenesde protena indicado por el profesor, registrarlos en la tabla.


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8. El volumen total (volumen de muestra ms volumen de agua) debe ser de 800L, por tanto calcular el volumen de agua a aadir y completar la tabla.

9. Aadir los reactivos segn lo indicado en la Tabla 2.3.10. Para leer las muestras una vez que se desarrolla el color usar el tubo B del

estndar como blanco.11. Utilizar los parmetros de regresin obtenidos de la curva estndar para calcular el

contenido de protena de cada una de las muestras de acuerdo a la siguiente frmula:

Fm

bAbsgprotenadeContenido nm *)( 595

Donde, bes la ordenada al origen,

mla pendiente yFes el factor de dilucin de cada muestra (recuerda el factor de dilucin es adimensional y si

hiciste dilucin el valor es mayor a 1 y corresponde al nmero de veces que diluiste)

12. Dividir el valor de contenido de protena entre el volumen de muestra que utilizaronen el ensayo para obtener la concentracin de protena expresada en g/L.

13. Posteriormente realizar los promedios por muestra (recuerda que tienes duplicadospara cada fraccin).

14. Determinar la cantidad de protena total que se obtuvo de cada una de las fraccionesde los diferentes pasos de purificacin. Para ello multiplicar el volumen total de lafraccin por el promedio obtenido en el punto 7. Con los datos llenen la Tabla 2.4.

Tabla 2.4.Rendimiento proteico durante las diferentes fases de la purificacin de la LDHFraccin Promedio

(g protena/L)

Volumen total en la

fraccin(L)

Protena total en la

fraccin(g o mg )

0

1

2

3

4

FA

FB

FC


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Cuestionario1. Compara ambos mtodos de cuantificacin de protenas utilizados en la prctica y

enlista sus diferencias. Considera tanto el fundamento de las tcnicas como lametodologa para llevarlas a cabo.

2. Compara los resultados de concentracin que obtuviste con los dos mtodosempleados en la prctica.

3. Qu desventajas tiene determinar la concentracin de protena por Abs 280 conrespecto al mtodo de Bradford en muestras que tienen una cantidad variable deprotenas, como en nuestras fracciones de la purificacin de la lactatodeshidrogenasa?

4. Puedes usar otra protena que no sea BSA como estndar? Si es as cul y porqu?

5. Qu sustancias pueden interferir en cada uno de los mtodos empleados y si sepuede, cmo evitas su interferencia?

6. Investiga el intervalo de concentracin de protenas que detecta cada uno de losmtodos.

7. Por qu es necesario construir una curva de calibracin en la determinacincolorimtrica de protenas por el mtodo de Bradford?

8. Investiga qu otro mtodo existe para cuantificar protenas y explica su fundamento.

Referencias Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual. Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY. Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182,50-69.

Pgina web para consultar mtodos para determinar protenas:

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.htmlhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.htmlhttp://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html


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Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin.

B. Separacin de las protenas en gel de poliacrilamida-SDS

Objetivos

Conocer los mtodos que se utilizan para monitorear el proceso de purificacin de unaprotena. Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una

protena. Analizar el progreso de la purificacin de una protena. Conocer algunos parmetros que se determinan durante la purificacin de una

protena: rendimiento y pureza. Aplicar el conocimiento adquirido para elaborar esquemas de purificacin de

protenas.

El mtodo ms comn para monitorear el proceso de purificacin de una protena es su

visualizacin en un gel de poliacrilamida-SDS (PAGE-SDS). El peso molecular y la intensidadde la banda de protena en el gel permitirn evaluar la eficiencia del proceso de purificacinde la LDH.

Material biolgicoFracciones obtenidas durante el proceso de purificacin de la LDH

Material y equipo2 vasos de precipitados 25 mL1 pipeta Pasteur con bulboTubos para microfuga de 0.5 mL

1 recipiente para hielo1 micropipeta de 2-10 L1 micropipeta de 20-200 L1 caja de puntas de 200 L para micropipeta1 recipiente de plstico/gel para la tincin.1 equipo completo para electroforesis de protenas marca BIORAD (incluye: reservorio conelectrodos, placas de vidrio, peines, sujetadores de las placas de vidrio y mdulo parapreparar el gel)1 fuente de poder

Reactivos

Acrilamida. Mezcla de 30% acrilamida y 0.8% NNmetilen-bisacrilamida. 2 M Tris /HCl pH 8.8 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 20% SDS TEMED 10% Persulfato de amonio Agua destilada Isopropanol o butanol Mezcla de estndares de peso molecular de protenas.


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Amortiguador de muestra. Stock generalmente preparado a 2X y contiene 350 mMTris base, 0.8% SDS, 160 mM DTT (ditiotreitol, agente reductor de protenas conpuentes disulfuros, se puede usar en su lugar -mercaptoetanol), 7.5% Glicerol.

Amortiguador de corrida (0.05 MTris Base, 0.38 M Glicina, 0.1 % SDS) Solucin teidora tiempo largo0.125% (p/v) azul de Coomasie Blue R250 en 50%

(v/v) metanol, y 10% (v/v) cido actico. Tincin que se logra despus de 2 h. Solucin desteidora para tincin tiempo largo (45% Metanol.10% cido actico)


Preparacin del gel de po l iacri lamid a-SDS.1. Lavar perfectamente las placas de vidrio. Ensamblar las dos placas de vidrio con los

separadores. Hay que asegurarse de que las placas queden bien niveladas y fijas conlas pinzas.

2. Hacer una marca a los 2/3 de la capacidad de los vidrios (ver Figura 2.3).3. Mezclar los componentes del gel separador que se indican en la Tabla 2.5, aadiendo

al final el persulfato de amonio y el TEMED. Agitar cuidadosamente la solucin (USARGUANTES MIENTRAS SE MANIPULE LA ACRILAMIDA).

Tabla 2.5. Minigel en placa al 12 % de acrilamida con SDS.

Reactivos Gel separador Gel concentrador

30% Acrilamida + 0.8% Bisacrilamida 2 mL 0.66 mL2 M Tris/HCl pH 8.8 1 mL 0.5 M Tris/HCl pH 6.8 0.6 mL10% SDS 50 L 50 LH2O 1.94 mL 3.67 mLTEMED* 5 L 10 L10% Persulfato de amonio* 40 L 80 LVolumen total 5 mL 5 mL

*Aadir justo antes de vaciar entre las placas de vidrio.

4. Aadir inmediatamente la mezcla anterior en el espacio entre las dos placas de vidrio.5. Agregar poco a poco, con la ayuda de una pipeta pasteur, isopropanol o n-butanol

con la finalidad de disminuir la tensin superficial y que no se forme un menisco en laparte superior del gel.

6. Esperar a que polimerice la acrilamida, no ms de 20 minutos.7. Decantar el isopropanol o butanol y lavar con agua bidestilada. Eliminar el exceso de

agua con papel absorbente cuidando de no tocar el gel

8. Preparar la mezcla del gel concentrador similar al punto 3. Aadir todos loscomponentes del gel concentrador y justo antes de aadir entre las placas de vidrioaadir los volmenes indicados de TEMED y persulfato.

9. Aadir el gel concentrador entre las placas de vidrio e inmediatamente insertar elpeine en la parte superior para formar los depsitos en los que colocaremos lamuestra.

10. Esperar a que se forme este segundo gel, el cual tarda aproximadamente 20 min.11. Remover con cuidado el peine y fijar el gel con las placas de vidrio a la cmara de

electroforesis.


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12. Aadir el amortiguador de corrida en ambos reservorios.

Figura 2.3.Pasos a seguir para la preparacin de un gel de poliacrilamida-SDS.

Preparacin de muestras13. Calcular cul es el volumen necesario para tener 20 g de protena utilizando los

datos de concentracin de protena obtenidos en la Parte II de la prctica (en g

protena/L). Con los datos llenar la tabla 2.6.Tabla 2.6.Preparacin de muestras para su corrimiento electrofortico.

Fraccin Concentracin

de protena

(g/L)

L para 20 g Amortiguador de

muestra

(L)

Estndar

(L)

0

1

2

3

4

FA

FB

FC __

Estndar 13 7


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14. Descongelar las muestras, colocar el volumen que se calcul en un tubo de microfugay a ese volumen aadirle amortiguador de muestra. Generalmente al preparar lamuestra para correr en geles de poliacrilamida-SDS se mezcla un volumen de muestraproteica con 1 volumen de amortiguador de muestra. Si los volmenes resultantes son

muy diferentes entre las diferentes muestras ya mezcladas con el amortiguador demuestra, es recomendable ajustar todas a un volumen total similar usandoamortiguador de muestra. Recuerda:slo ajustamos los volmenes con amortiguadorde muestra por lo que la cantidad de protena en cada carril no cambia, lo quehacemos es uniformar el volumen en el carril para que la difusin entre carriles seminimice o sea homognea. Cabe sealar que los pozos del gel tienen una capacidadmxima de 30 Lpor lo que la mezcla protena: amortiguador de muestra no debeexceder ese volumen.

15. Realizar tambin una mezcla de estndares de peso molecular ver la tabla 2.6.

Aplicacin de muestras y corrida

16. Aplicar las muestras en los pozos del gel concentrador en el orden en el que seobtuvieron las fracciones y colocar el estndar en el ltimo pozo (Figura 2.4).PREGUNTAR A SU PROFESOR LOS PESOS MOLECULARES DE LOSESTNDARES.

17. Iniciar la electroforesis de 10 a 15 mA hasta que el frente haya entrado en el gelseparador. Despus incrementar el amperaje a 25 mA, siempre y cuando no secaliente el gel.

18. Terminar la corrida una vez que el frente haya alcanzado el borde inferior del gel osegn se desee.

19. Enseguida desprender el gel de las placas y realizar una tincin depositando el gel en

una charola que contenga solucin teidora y colocando la bandeja en agitacinconstante.

Figura 2.4Aplicacin de las muestras en los carriles de un gel de poliacrilamida-SDS.


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20. Decantar la solucin teidora, lavar el exceso con H2O destilada y aadir la solucindesteidora. Poner a agitar suavemente.

21. Tomar una foto al gel teido.22. De acuerdo con los resultados, sealar el o los pasos de purificacin en donde se

produjo el mayor enriquecimiento en la protena de inters, la lactato deshidrogenasa.23. Con la informacin de los pesos moleculares utilizados en la electroforesis, realizar la

curva de log peso molecular del estndar vs Rf.24. Determinar el Rf y la distancia en la que se espera se encuentre la lactato

deshidrogenasa (utilizando el peso molecular esperado para esta protena).25. Sealar en la foto del gel en dnde se localizara la LDH.

Cuestionario1. En cul de los pasos de la purificacin se obtuvo una mayor cantidad de LDH?2. Cul de los dos mtodos de purificacin cromatogrfica produce una mayor cantidad

de LDH, la cromatografa de afinidad o la de intercambio inico?3. Usualmente, en una purificacin se utilizan la cromatografa de intercambio inico y la

de afinidad como pasos secuenciales, una despus de otra, pero por costos hemosutilizado slo una de ellas. Con los resultados que obtuvo tu equipo y los otrosequipos, predice cul sera el resultado si primero se realizara la cromatografa deintercambio catinico y luego la cromatografa de afinidad.

4. Cuntos contaminantes se tienen en la mezcla de protenas obtenida en el procesocromatogrfico final?

5. Elabora un esquema de purificacin o diagrama de flujo del protocolo de purificacinpara una de las protenas que se encuentran en el programa virtual:http://www.wcer.wisc.edu/archive/cl1/ilt/case/madison/creatingLE.htm

6. Fundamenta el porqu de cada paso de purificacin, indicando en cada paso endnde est la protena. Recuerda que tiene caractersticas muy distintas a la lactato

deshidrogenasa por lo que no necesariamente se tienen que usar los pasos depurificacin usados en este protocolo experimental.Recuerda que para cada tipo de protena el protocolo de purificacin puedevariar.

Referencias Bradley JSCO, Markwell J. 2007. Assay for determination of protein concentration. Current

protocols in protein science 3.4.1-3.4.29. Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin. 1997. John

Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4 Reiner W. 2005. Gel electrophoresis. John Wiley & sons, Ltd.www.els.net

Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc, New York,USA. Pp 71-104

Problemas resueltos de purificacin de protenashttp://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.html
http://www.wcer.wisc.edu/archive/cl1/ilt/case/madison/creatingLE.htmhttp://www.wcer.wisc.edu/archive/cl1/ilt/case/madison/creatingLE.htmhttp://www.els.net/http://www.els.net/http://www.els.net/http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.htmlhttp://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.htmlhttp://depa.pquim.unam.mx/proteinas/webprobs/solucion.htmlhttp://www.els.net/http://www.wcer.wisc.edu/archive/cl1/ilt/case/madison/creatingLE.htm


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3. ACTIVIDAD ENZIMTICA

PARTE I: CURVAS TEMPORALES DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LALACTATO DESHIDROGENASA DE MSCULO ESQUELTICO DE POLLO.

Objetivos- Conocer las caractersticas generales de las enzimas como catalizadores biolgicos.- Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un mtodo

espectrofotomtrico.- Relacionar los distintos parmetros asociados a la medicin de la actividad enzimtica

que permiten seguir y evaluar la purificacin de una enzima (actividad especfica,rendimiento y grado de pureza o enriquecimiento).

Informacin previa.Uno de los mtodos para seguir el proceso de purificacin de una protena es la deteccin desu funcin, en la prctica se determinar la actividad de la LDH de msculo esqueltico de

pollo. En esta parte del protocolo se medir la reaccin en el sentido de piruvato a lactato adiferentes tiempos, utilizando como fuente de enzima las fracciones obtenidas durante elprotocolo de purificacin de la LDH de la seccin II del manual.

El ensayo de actividad est basado en la deteccin del cambio de absorcin del NADH y elNAD+. El NADH es una molcula que absorbe a 340 nm, mientras que el NAD+no absorberadiacin a esta longitud de onda. Entonces, la actividad de la enzima en las muestras sedetectar como una disminucin en la absorbancia a 340 nm, debido a que durante lareaccin el NADH es convertido a su forma oxidada, el NAD+.


Material biolgicoFracciones obtenidas durante la purificacin de la LDH (seccin II del manual)

Material y equipoCeldas de plsticoTubos de microfugaParafilm1 recipiente para hielo1 micropipeta de 200-1000 L1 micropipeta de 20-200 L

1 micropipeta de 2-10 L1 caja de puntas de 1000 L para micropipeta1 caja de puntas de 200 L para micropipeta1 vrtexEspectrofotmetro (por grupo)

Reactivos 100 mM amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM piruvato de sodio


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4 mM NADH. Reactivo que debe prepararse justo antes de usarlo, puede usarseel amortiguador de fosfatos para su disolucin. Verificar que la absorbancia a 340nm sea mayor de 1.0, si no es as volver a pesar y medir. El NADH no se puedealmacenar disuelto, por lo que al final la sesin experimental se desecha el reactivo.

Desarrollo experimental.

Curvas temporales de actividad de lactato deshidrogenasa.

Se sugiere que todos los equipos midan primero la curva temporal de actividad a la fraccin3, que es la fraccin que usarn para obtener los parmetros cinticos de la enzima. Paraobtener las curvas de actividad se determinar la dilucin ptima de enzima para realizar losensayos (ver abajo). Diluciones sugeridas F11:50, F21:25, F31:300, F41:50; FA1:10; FByFCconcentradosUna vez que concluyan con esa fraccin y dependiendo del tiempo que hayan consumido dela sesin, realizar posteriormente las curvas temporales de actividad de las fraccionesrestantes.

Ensayo de actividad enzimtica:1. Descongelar la protena y mantenerla a 4C en un recipiente con hielo. Hacer una primera

dilucin de la fraccin 3, se recomienda 1:300.2. Etiquetar 5 celdas. Realizar las mezclas de reaccin directamente en las celdas de

plstico y a temperatura ambiente. Utilizar agua para ajustar a 0 el espectrofotmetro.3. Aadir a cada una de las celdas los siguientes componentes:

600 L 100 mM amortiguador de fosfatos36 L 10 mM piruvato

291 L Agua

4. Adicionar a una de la celdas preparadas previamente 63 L de 4 mM NADH tapar lacelda con parafilm y agitar por inversin, leer la absorbancia a una longitud de onda de340 nm y registrar.

5. Inmediatamente despus de leer la absorbancia de esta solucin, agregar 10

L de lamuestra de la enzima diluida o la cantidad indicada por los profesores.

6. Tapar la celda con parafilm, agitar por inversin dos veces y leer inmediatamente laabsorbancia.

Consideraciones: si la primera absorbancia leda una vez que se aadi enzima esmenor de 0.4, es posible que la actividad de la enzima sea muy alta, por lo que se

recomienda repetir el ensayo en una de las celdas ya preparadas, aadir NADH y luego laenzima ms diluida.


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Tabla 3.1. Registro de absorbancia de las fracciones obtenidas de la purificacin de protenas. Anotar la fracciny su dilucin.

Tiempo(min)

F3 F__ F___ F____ F____ F____ F____ F____ F____

7. Dejar la celda dentro del espectrofotmetro y registrar los valores de la absorbancia,preguntar a los profesores el tiempo en que se leern las celdas. Se sugiere que seacada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla 3.1).Aunque se puede registrar la actividada tiempos menores de 30 seg, por ejemplo cada 15 seg durante 3 min. Esto reduce eltiempo de uso del espectrofotmetro y an se tiene un buen nmero de puntos paraconstruir una curva y obtener la pendiente.

8. Realizar grficas de absorbancia vs. tiempo (minutos) para cada una de las diluciones detodas las fracciones y obtener las pendientes de la rectas. Se sugiere colocar lainformacin de todas las fracciones en una misma grfica para poder compararlas.

9. Con los datos de la pendiente de las grficas del punto 8 de esta seccin y los volmenesy concentracin de protena obtenidos en la prctica de purificacin de protenas,construir la tabla de purificacin de la LDH (llenar la Tabla 3.2).


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Tabla 3.2. Tabla de purificacin de la LDH de msculo esqueltico de pollo.Procedimiento Protena total

en la fraccin(mg)

Actividad totalmmolmin-1

Actividadenzimticaespecfica

(mmol min-1mg-1)

Grado depureza o vecesde purificacin

Rendimiento

Homogeneizado(F1 o F0)

1 100

Sobrenadante de laprecipitacin con sulfato

de amonio 45% (F2)Botn obtenido de la ppcon sulfato de amonio

70% (F3)Primera fraccin que

sali de lacromatografa* (FPA)Segunda fraccin que

sali de lacromatografa* (FPB)

*Anotar el tipo de cromatografa que realizaste intercambio inico o de afinidad.

Para calcular la actividad totalde la enzima se realizan los siguientes tres pasos:A. Utilizar la pendiente de la curva de la grfica de absorbancia vs. tiempo y sustituir

los valores en la siguiente ecuacin

11

11 min

*

min

mLmmolcmbcmM

Absm

Actividad

Donde:

m: es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min

: es el coeficiente de extincin molar para el NADH, 6.22 x 103M-1cm-1.b: es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cm

B. Para considerar la cantidad de enzima aadida en la celda de reaccin y sudilucin realizar lo siguiente

11min** mLmmolenzimadeaadidovolumen

dilucindeFactorreaccinvolumenActividadActividad

C. En vista de que se tienen diferentes fracciones de un proceso de purificacin deprotenas, se tienen volmenes distintos de cada fraccin entonces hay quemultiplicar el valor obtenido en el paso anterior por el volumen de la fraccin locual nos da la activ idad enzimtica tot alen unidades de mmol min -1.

Para obtener el valor de la actividad especfica, cuyas unidades son mmol min-1mg-1 dividela actividad total dada en mmol min-1entre la cantidad de protena total de la fraccin (mg).

El valor de grado de pureza tambin llamado veces de purificacin se obtiene al dividir laactividad enzimtica especfica de la fraccin entre la actividad especfica de la fraccin


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inicial en este caso la F1. Se espera que conforme se pierdan protenas contaminantes elgrado de pureza se vaya incrementando.

Para la obtencin del rendimiento en cada paso de purificacin se considera que laactividad total recuperada en la fraccin inicial es el 100%, as que se divide la actividadtotal obtenida despus del paso de purificacin que corresponda entre la actividad totalobtenida antes de empezar a purificar (en este caso F1) y se multiplica por 100.

Cuestionario1. Qu solucin se us como blanco para calibrar el espectrofotmetro en la prctica?

Por qu?2. Realiza el anlisis dimensional de la frmula que se propone para calcular la actividad

de la enzima.3. Define actividad especfica y katal.4. Propn un protocolo para determinar la actividad de la enzima que no sea el de

realizar una curva temporal de aparicin de productos.5. Analizando los resultados que se encuentran en la tabla 3.2 menciona cul fue el paso

en el que la protena se enriqueci ms. A qu crees que se debe?6. Al analizar en conjunto los datos obtenidos en la electroforesis y los de actividad en

qu pasos de la purificacin se eliminan ms contaminantes?7. Cul es la utilidad de realizar una tabla de purificacin en la que se toma en cuenta la

actividad de la enzima?

Referencias Devlin TM. 1992. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Ed. Wiley- Liss, pp. 135-190.

LocalizacinQP514.2 Kopperschlger G, Kirchberger J. 1996. Methods for separation of lactate dehydrogenases and clinical

significance of the enzyme. Journal of chromatography B, 684, 25-49.

Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433.LocalizacinQP514.2 Nelson D. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp. 202-233.QH345

L43 Pardo-Vzquez JP. Cap 10. Cintica enzimtica. En Bioqumica de Laguna. El Manual Moderno, SA de

CV., 2002, pP185

Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S. A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2


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PARTE II. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS:EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO Y DE UN INHIBIDOR.

Objetivos:

- Determinar la concentracin de sustrato en la cual la enzima alcanza su velocidadmxima.- Entender el significado de los parmetros cinticos Vmax y Km.- Calcular los parmetros cinticos de la reaccin catalizada por la lactato

deshidrogenasa utilizando diferentes grficos de la ecuacin linealizada de Michaelis-Menten.

- Determinar el efecto de una inhibidor en la actividad de la lactato deshidrogenasa- Analizar el efecto de un inhibidor sobre los parmetros cinticos de la enzima.

Informacin previaEn la prctica se determinarn las constantes cinticas, Km y Vmax, de la lactato

deshidrogenasa de msculo de pollo, para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato,manteniendo constante la concentracin de enzima, el pH y la temperatura de reaccin.Tambin se determinar el tipo de inhibicin que el oxamato (un cido carboxlico) produceen la actividad de la enzima (Figura 3.5). Para la determinacin de las constantes se medirla actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato y a una sola concentracinde inhibidor. A travs del anlisis del efecto del inhibidor en los parmetros cinticos de laenzima se determinar el tipo de inhibicin que produce el oxamato.

Figura 3.1Estructuras del piruvato y el inhibidor que se usar en la prctica, el oxamato.

PROTOCOLO EXPERIMENTALMaterial biolgicoFraccin 3 obtenida en la prctica de purificacin.

Materiales y equipo

10 celdas de plsticoTubos para microfuga1 recipiente para hielo1 vaso de precipitados de 25 mL3 tubos de ensayo 13x100mm1 micropipeta de 1000 L1 micropipeta de 200 L1 micropipeta de 10 L1 micropipeta de 50 L


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Puntas para micropipeta de diferentes capacidadesParafilmEspectrmetro (por grupo)

Reactivos 100 mM amortiguador de fosfatos pH 7.0 10 mM piruvato de sodio 10 mM oxamato de sodio 4 mM NADH.


Efecto de la concentracin de sustrato.1. Numerar las celdas.2. En una celda de plstico adicionar el amortiguador de fosfatos, el agua y el piruvato de

acuerdo a lo que se indica en la Tabla 3.3. Mantener a temperatura ambiente.

Tabla 3.3.Efecto de la concentracin de sustrato.Solucin 1 2 3 4 5 6

*Concentracin final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*

100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0

(L)

600 600 600 600 600 600

H2O c.b.p. 1000 L (L) 321 318 312 302 291 277

10 mM Piruvato (L) 6 9 15 25 36 50

4 mM NADH (L) 63 63 63 63 63 63

Enzima (diluida**) (L) 10 10 10 10 10 10

**Usar la dilucin apropiada de enzima, preguntar a su profesor.

3. Preparar la dilucin de la enzima. El volumen preparado debe ser suficiente para quealcance para la determinacin del efecto de la concentracin de sustrato y para la delefecto del inhibidor.

4. Justo antes de medir en el espectrmetro aadir a la celda 63

Lde NADH 4 mM,tapar con parafilm y mezclar por inversin. Registrar la lectura. Este paso se realiza

para asegurarse de que la mezcla de reaccin contiene NADH.5. Posteriormente aadir a la celda 10 L de la muestra de la enzima diluida, fraccin 3

obtenida en la prctica de purificacin. Tapar la celda con parafilm y agitar 2 veces porinversin.

6. Ajustar el espectrofotmetro con agua y leer la absorbancia de la muestra a unalongitud de onda de 340 nm.


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Tabla 3.4. Lecturas de absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.Tiempo

(min)

Piruvato (mM)

0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

0

7. Los valores de la absorbancia se registran cada 30 segundos durante 3 minutos(Tabla 3.4). Sugerencia: Se puede registrar la actividad a tiempos menores de 30seg, por ejemplo cada 15 seg por 3 min, reduce el tiempo de uso delespectrofotmetro y an se tiene un buen nmero de puntos para construir una curvay obtener la pendiente.

8. Obtener la pendiente y calcular la actividad, segn la siguiente frmula:

11

11 min

)(**

*min

mgmmolmgenzimadecantidadcmbcmM

reaccinVolAbs

mActividad

Donde:

m:es la pendiente de la recta (Abs/t) en unidades de abs / min

: es el coeficiente de extincin molecular para el NADH, 6.22 x 103M-1cm-1.b:es la distancia de la celda, que corresponde a 1 cmCantidad de enzima: En vista de que no se comparar la actividad de la enzima de un proceso depurificacin, hay que calcular la cantidad de enzima que se aade al medio de reaccin tomando en cuenta laconcentracin de protena de la muestra, la dilucin y el volumen que se tom para el ensayo de esta

dilucin.Por ejemplo, si la concentracin de la enzima F3 es 22 g/L e hiciste una dilucin 1:300 de la fraccin y desta tomaste 10 L, entonces la cantidad de enzima que aadiste a la celda fue de 7.33X10 -4mg de acuerdoa la siguiente operacin:

22 /

300 0.01 = 7.3310 4

9. Posteriormente se grafican:


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A) Actividad vs. concentracin de sustrato (grfica de Michaelis-Menten)B) La actividad de acuerdo a la ecuacin de Lineweaver-Burk.C) La actividad de acuerdo a la ecuacin de Hanes o Eadie-Hosftie

10. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax con los datos obtenidos de los tresgrficos anteriores y tabular los datos.

11. Analizar los valores de las constantes cinticas de la lactato deshidrogenasa.

Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH.

Al igual que en la seccin anterior se mide la actividad de la lactato deshidrogenasa adiferentes concentraciones de piruvato, pero ahora se adiciona el oxamato de sodio,compuesto que inhibe la actividad de la LDH (Tabla 3.5).

1. Adicionar en una celda de plstico los reactivos de acuerdo a los volmenes y el ordenindicados en la Tabla 3.5.

Tabla 3.5. Composicin de medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la lactatodeshidrogenasa.

Solucin 1 2 3 4 5 6

*Concentracin final de piruvato (mM) 0.06* 0.09* 0.15* 0.25* 0.36* 0.5*

100 mM Amortiguador de fosfatos pH 7.0 600 600 600 600 600 600

H2O c.b.p. 1000 L 287 284 278 268 257 243

10 mM Oxamato (L) 34 34 34 34 34 3410 mM Piruvato (L) 6 9 15 25 36 50

4 mM NADH (L) 63 63 63 63 63 63

Enzima (diluida) (L) 10 10 10 10 10 10

2. Registrar los valores de la absorbancia cada 30 segundos durante 5 minutos (Tabla3.6).

Sugerencias: Se puede registrar la actividad a tiempos menores de 30 seg, porejemplo cada 15 seg durante 3 min. Esto reduce el tiempo de uso delespectrofotmetro y an se tiene un buen nmero de puntos para construir una curvay obtener la pendiente.


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Tabla 3.5. Registro de absorbancias de la actividad de la LDH en presencia de un inhibidor.

Tiempo

(min)

Piruvato (mM) + Oxamato 0.35 mM

0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

3. Obtener la pendiente y calcular la actividad enzimtica especfica, de manera similar acomo se seal en el punto 8 de efecto de la concentracin de sustrato.

4. Realizar los siguientes grficos Y COLOCARLOS EN LA MISMA GRFICA QUE

LOS DEL EFECTO DE SUSTRATO SIN INHIBIDOR: A)Actividad vs. concentracinde sustrato; B) Grfica de actividad de acuerdo a Lineweaver-Burk y C) Curva deacuerdo al mtodo de Hanes-Wolff.

5. Calcular las constantes cinticas Km y Vmax con los datos obtenidos de los tresgrficos anteriores.

6. Determinar el tipo de inhibicin que oxamato ejerce sobre la LDH a travs de lacomparacin de los grficos de las cinticas sin inhibidor y en presencia del inhibidor.

Cuestionario

1. Por qu es importante determinar los valores de Km y Vmax de una enzima?

2. Disea un protocolo diferente al presentado en esta seccin para determinar laactividad de la lactato deshidrogenasa.3. Cul fue el blanco de la reaccin?4. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento

de primer orden?5. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento

de orden cero?6. En qu intervalo de concentracin la reaccin de la LDH muestra un comportamiento

de orden cero y en cul ser de orden mixto?


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7. Define Km e indica qu unidades tiene.8. Define Vmax e indica qu unidades tiene.9. Compara los valores de Km y Vmax obtenidos en las tres diferentes grficas que

realizaste.10. Qu tipo de inhibidor es el oxamato? Fundamenta tu respuesta.11. Cules son los inhibidores naturalesde la LDH de msculo?12. En el humano, cules tejidos contienen LDH?13. Qu es el ciclo de Cori y cmo participa la LDH en l?

Referencias Mathews C. 1992. Bioqumica, 2da edicin, Ed. McGraw-Hill pp. 398-433. Localizacin

QP514.2 Nelson D. 2004. Principles of Biochemistry. 2004, 4a edition Ed. Freeman and company, pp.

202-233.QH345 L43 Voet D, Voet JG. 1992. Bioqumica. Ed. Omega S.A. pp. 342-378. Localizacin QP514.2 Bennett NG, Gutfreund H. 1973. The Kinetics of the interconversion of intermediates of the

reaction of pig muscle lactate dehydrogenase with oxidized nicotinamide-adenine dinucleotideand lactate. Biochemistry Journal 135, 81-85.

Sitios recomendados para1. aprender utilizar los conceptos de Km, Vmax

http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/aotw3.html en la pgina pulsar la teclakinetics_model.xls,despus regresa a la pgina inicial y contesta las preguntas que sete hacen.

http://www.mhhe.com/biosci/genbio/biolink/j_explorations/ch07expl.htm
http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/kinetics_model.xlshttp://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/kinetics_model.xlshttp://csm.jmu.edu/biology/courses/bio220/kinetics_model.xls


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4. ESTRUCTURA, PROPIEDADES Y FUNCIN DE CIDOS NUCLEICOS

TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO I: CONJUGACIN

Objetivos

Identificar al DNA como portador de la informacin gentica Conocer los mecanismos por los que una bacteria puede adquirir un plsmido. Reconocer a la conjugacin bacteriana como un fenmeno de transferencia horizontal de

material gentico. Entender el mecanismo por el cual se realiza la conjugacin bacteriana.

Protocolo experimentalMaterial biolgicoCultivo de E. coli JM1452StrR (cepa receptora), cultivada por una noche en caldo Luria a37C.Cultivo de E. coliW3110/FKmTn3 (cepa donadora), cultivada por una noche en caldo Luria a

37C.

Materiales y equipo1 microtubo con 600 L de caldo Luria estril5 cajas Petri con medio Luria-agar-2% estreptomicina (25 g/ml)2 cajas Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)100 palillos de madera estriles1 asa bacteriolgica1 propipeta1 mecheroIncubadora a 37C

Bao Mara a 37CRefrigerador a 4C

Por grupo para controles de las cepas 1 caja Petri con medio Luria-agar 2%-estreptomicina (25 g/ml) 1 caja Petri con medio Luria-agar-2% sulfato de kanamicina (30 g/ml)

Desarrollo de la prctica1. En condiciones estriles tomar el tubo de microfuga con 600 L de caldo Luria estril y

hacer la siguiente mezcla de conjugacin: 300 L del cultivo de E. coliJM1452Str ms120 L del cultivo E. coliW3110/FKmTn3 (Figura 4.1).

2. Incubar el tubo a 37C SIN AGITACINdurante 30 min.3. Dividir una caja Petri con medio Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina en 3 partes.

Marcar la zona 1 como bacteria receptora, la zona 2 como conjugacin y la zona 3como bacteria donadora. Colocar una gota pequea de cada cultivo en el sitiocorrespondiente y dejar que se absorba.Nota: Si el profesor lo considera necesario, en lugar de colocar una gota delcultivo se puede sembrar por estra cada cultivo, lo anterior ofrece la ventaja deadelantar un da.


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4. Incubar a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento en la zona deconjugacin. Refrigerar a 4C.

5. Test igo por grupo: Dividir una caja petri con Luria-agar 2% sulfato de estreptomicina yuna caja petri con Luria-agar-2% sulfato de kanamicina. Sembrar por estra las cepasdonadora y receptora en cada mitad de las cajas respectivamente. Incubar a 37 Cdurante 24 h. Al observar crecimiento refrigerar las cajas.

6. Despus del tiempo de incubacin trabajar con la caja del paso 3. Si no se sembr porestra en el paso 3, tomar una asada de las zonas receptora y de conjugacin ysembrar por estra en una caja petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina, cadauna en una caja diferente. Incubar a 37C durante 24 h.

7. De las colonias aisladas,parcharcolonias de cada caja en una caja Petri con Luria-agar-2% sulfato de estreptomicina y 50 colonias en otra de Luria-agar 2%-estreptomicina ydespus la rplica en la caja de Luria-agar-2% sulfato de kanamicina.

Parchar consiste en transferir una colonia aislada de una caja a otra caja petri. En laprctica se transferir una misma colonia a 2 cajas petri, esto al picar con un palillo lacolonia de bacterias aislada, transferirla picando la caja Petri que contiene Luria-agarcon el antibitico estreptomicina y ese mismo palillo pica despus a la caja Petri quecontiene Luria-agar y kanamicina, as las dos cajas habrn sido picadas con la mismacolonia. Para facilitar y agilizar el parchado, marcar divisiones por la parte de atrs de lascuatro cajas o bien pegar una hoja cuadriculada en el exterior y por debajo de la caja ynumerar cada uno de los cuadros (ver figura 4.1).

8. Incubar ambas cajas a 37C durante 24 h o hasta que aparezca crecimiento. Observar yanalizar los resultados. Refrigerar a 4C las cajas.

9. Reportar el porcentaje de colonias transconjugantes, es decir aquellas que presentaronla resistencia a ambos antibiticos.


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Figura 4.1.Esquema experimental de conjugacin bacteriana. Produccin de una cepa transconjugante a partirde una cepa receptora resistente a estreptomicina, con una cepa que es capaz de proporcionar la informacingentica para la resistencia a kanamicina. No olvidar hacer los testigos.

Cuestionario

1. Qu es un plsmido?2. Cules son los mecanismos de transferencia horizontal de material gentico en

bacterias?3. Qu es la conjugacin?4. Qu diferencia existe entre la conjugacin y los otros mecanismos de transferencia

horizontal de material gentico?5. Cules son las principales caractersticas del plsmido F y qu genes contiene?6. Cules son los genes del plsmido F necesarios para la transferencia de material

gentico por conjugacin y para qu codifican?

7. De acuerdo al plsmido F cuntos tipos de cepas bacterianas se conocen? y qudiferencia existe entre ellas?

8. Seale qu tipo de transconjugantes se obtienen en cada una de las siguientescruzas:

a) F+X F-b) F X F-c) Hfr X F-

9. Qu caractersticas tienen las cepas empleadas en la prctica?10. Por qu tanto la cepa donadora como la receptora tienen un marcador de seleccin?


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11. Hubo crecimiento de las cepas empleadas en la prctica en las cajas controles conantibiticos? Por qu son importantes estas cajas control?

12. Por qu se parchan la cepa receptora y la transconjugante tanto en medio conestreptomicina como kanamicina? Qu resultados se obtuvieron en esas cajas?

13. Cmo se comprob la conjugacin en la prctica? Qu porcentaje de bacteriastransconjugantes se obtuvo?

14. Cul es el genotipo de la cepa transconjugante obtenida en la prctica?15. Qu diferencias existen entre un plsmido conjugativo y uno movilizable?16. La conjugacin puede realizarse entre las bacterias Gram positivas o slo ocurre en

las bacterias Gram negativas?17. Con qu frecuencia y dnde se realiza la conjugacin en forma natural?18. Cul es la importancia biolgica de la conjugacin?19. Indique los mecanismos por los que se da la resistencia de las bacterias a los

antibiticos utilizados en la prctica.20. Qu aplicaciones tienen en su prctica profesional o en su vida cotidiana los

conceptos adquiridos al realizar esta prctica?

Referencias Brown T.A. Genetics. A Molecular Approach.2nd ed. Chapman & Hall. USA. 1992.pp

467.

Lewin B. GenesV. Oxford University Press. USA. 1994. pp 1272. Gentica General, Manual de prcticas de laboratorio. Regulacin gentica en el

opern lac. Facultad de Qumica, UNAM. Ciudad Universitaria. Mxico, 2002.


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TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENTICO II: TRANSFORMACIN

Objetivos Conocer el fundamento para transformar clulas bacterianas. Realizar la tcnica de transformacin bacteriana.

Aprender a identificar clulas transformantes mediante su fenotipo. Conocer la definicin de organismo transgnico. Conocer las aplicaciones de la transformacin bacteriana: beneficios y riesgos.

Informacin previaEn la prctica utilizaremos el vector recombinante que se muestra en la Figura 4.2, quecontiene el gen de la -lactamasa (transgene). Se realizar la transformacin mediante latcnica de choque trmico y la resistencia a kanamicinase utilizar como indicador de quelas clulas son transformantes.

Figura 4.2. Vector recombinante pET-TEM-1-ompA -lactamasa. El vector pET24a (Figura 4.3) fue utilizado para laconstruccin del vector pET-TEM-1. Se insert el gen que codifica para la -lactamasa (transgene) en el sitio de clonacin

mltiple del vector pET24. El transgene, ompA-lac, contiene la secuencia completa de la protena TEM-1 -lactamasa.Para insertarlo se adicion el sitio de retriccin BamHI y adicionalmente se coloc hacia la regin 5 del gen la secuenciaque codifica para la secuencia seal o de trnsito de una protena que se encuentra en la membrana externa de bacterias,

en este caso la ompA. A diferencia de la protena OmpA, la -lactamasa es una enzima soluble, por lo que la secuenciaseal permitir que la bacteria transformante secrete a la enzima. Recuerda que al transformar a las clulas con el vector

pET-TEM-1-ompA-lactamasa pET, la resistencia que confiere a las clulas es a kanamicina ya que el plsmido contiene

un gene que confiere la resistencia a ese antibitico en particular.

Material biolgico 1 tubo de microcentrfuga con 100 L clulas competentes de E. coli por grupo

mantenerlas congeladas

manual de practicas-bqexp-0141 2015

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