manual pr cellbiol-v6

Manual de Prcticas y texto gua con conceptos tericos bsicos de

Bases de Biologa Celular

Universidad de Guadalajara, CUCI-UdG

Zaira Lpez Peter Knauth Vanessa Orozco Joel Salazar

Prcticas de Biologa Celular

I

ndicendice..............................................................................................................................................IAbreviaciones............................................................................................................................... IIReglamento del Laboratorio........................................................................................................ IIIBioseguridad .................................................................................................................................1Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetro ...............................................................9Microscopio: componentes y observacin ..................................................................................15Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas.................................................................22Comportamiento de las clulas eucariotas frente a soluciones con diferente osmolaridad ........29Observacin de estructuras internas de clulas eucariotas..........................................................34Fijacin y tincin de tejidos animales .........................................................................................39Ciclo celular: mitosis en clulas vegetales..................................................................................48Anexo: Colorantes y soluciones isotnicas.................................................................................54


II

AbreviacionesAbs AbsorbanciaA. dest. Aqua destillatum (agua destilada)BSL Biosafety Level (nivel de bioseguridad)DNA Deoxyribonucleic acid (cido desoxirribonucleico)DPX Di-n-butyl-Phthalate in Xylene (di-n-butil-ftalato en xileno)EM ErlenmeyerGLP Good Laboratory Practice (buenas prcticas del laboratorio)GMO Genetically Modified Organism (organismo genticamente modificado)HEPA High-efficiency Particulate Air (filtro de aire de alta eficiencia)HHS U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y

Servicios Sociales de los Estados Unidos)HIV Human Immunodeficiency Virus (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH)N.A. Numeric Aperture (apertura numrica)NB Nutrient Broth (caldo nutritivo)PBS Phosphate-Buffered Saline (buffer fosfato salino)RAMP Rapid Adhesive Mediated ProcedurerER rough Endoplasmatic Reticulum (retculo endoplasmtico rugoso)RG Risk Group (grupo de riesgo)RI Refractive Index (ndice de refraccin)rpm revolutions per minute (revoluciones por minuto)soln solucinTSB Tryptic Soy Broth (caldo soya tripticasa)HWD Height Width Depth (alto ancho profundo)WHO World Health Organization (Organizacin Mundial de la Salud, OMS)


III

Reglamento del Laboratorio

Proteccin Personal1. Usar batas limpias o uniformes especiales en todas las prcticas.2. Est prohibido usar las batas o uniformes fuera del laboratorio, p. ej. en

aulas, cafeteras, oficinas, bibliotecas, salas para el personal, baos etc.

3. Usar calzado cerrado, de preferencia de piel, seguro para caminar(no zapatos deportivos, sandalias, zapatillas, zapatos con tacn alto).

4. Usar guantes protectores apropiados para los procedimientos que entraancontacto directo o accidental con reactivos peligrosos o materialesbiolgicos infecciosos.

Uso de guantes:- Revisar los guantes visualmente antes del uso (existencia de agujeros)- No tocar con guantes objetos fuera del experimento (p.ej. telfono, teclado,

equipos, puertas, grifera) para evitar la distribucin del contaminante- Cambiar guantes contaminados inmediatamente!- No usar guantes por mucho tiempo (daa la piel)- Desprenderse de los guantes de manera inside out (de 'dentro a fuera')- Desechar aspticamente guantes contaminados con agentes biolgicos

infecciosos- Despus del uso, lavarse bien las manos y ponerse crema para piel* No existen guantes universales, que protegen contra todo* Guantes desechables tienen una solo cierta resistencia contra reactivos5. Usar gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos para proteger los ojos y

el rostro contra salpicaduras, impactos o radiacin cuando es indicado.


IV

Reglas Generales de Comportamiento en el Laboratorio1. Es obligatorio informarse sobre los riesgos especficos de sustancias

peligrosas y/o material biolgico infeccioso.Vase: http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html

2. Hay que mantener el laboratorio limpio y ordenado:- al material usado (p.ej. quitar escrituras y adhesivos)- a los equipos (p.ej. limpiar centrfuga o balanza despus de su uso)- el lugar de trabajo y lugares comunes (p.ej. campana, lavabo)3. Las superficies de trabajo se limpian antes y al final de cada jornada.

Adems, se descontamina inmediatamente de todo derrame de materialpotencialmente peligroso.

4. El laboratorio debe ser libre de materiales no relacionados con el trabajo(p.ej. bolsas, mochilas).

5. Hay que mantener libres las salidas de emergencias. Siempre!6. Hay que avisar a los responsables situaciones peligrosas y/o mal

funcionamiento de equipos.

7. Est prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos o manipularlentes de contacto..

8. Est prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano.9. Celulares deben ser apagados.

10. Est prohibido correr o jugar.11. Est prohibido usar equipos sin instruccin previa por el responsable

respectivo.12. Hay que lavarse las manos despus de manipular reactivos, animales y/o

materiales biolgicos, y antes de abandonar las zonas de trabajo.


V

Reglas Especiales de Comportamiento en el Laboratorio1. Est estrictamente prohibido pipetear con la boca.2. Est prohibido colocarse materiales en la boca, pasar etiquetas por la

lengua, tocarse la cara con manos contaminadas (especialmente ojos).3. Cualquier derrame o accidente con sustancias peligrosas y/o materiales

infecciosos se comunican al responsable del laboratorio. Se mantiene unregistro escrito de esos accidentes e incidentes.

4. Materiales contaminados hay que descontaminar antes de tirarlos olimpiarlos para ser reutilizados.

5. Mujeres embarazadas y madres amamantando no deben trabajar consustancias peligrosas y/o material biolgico infeccioso.

6. Almacenar sustancias y mezclas en recipientes adecuados marcando:- contenido (sustancia, mezcla, concentracin)- fecha, propietario, smbolo de peligro

7. Est prohibido almacenar reactivos en envases de alimentos.8. No se debe colocar tapas boca abajo sobre la mesa:

- eso deja residuos qumicos sobre la mesa y- trae contaminacin al recipiente

9. No se debe devolver reactivos a su envase original paraevitar contaminacin al recipiente original.

10. Se usa una esptula para sacar reactivos de su envase.

11. No se debe daar las etiquetas al trasvasar (p.ej. porgoteo).

12. No se debe llenar recipientes ms de 90 % de su mximacapacidad.

13. Cerrar bien los recipientes no usados.14. Sustancias que producen polvos, gases, vapores o aerosoles txicos,

nocivos, cancergenos, corrosivos o inflamables se manejan en unacampana de extraccin.

15. Para el transporte hay que evitar derrames accidentales utilizando envasessecundarios (estrilizable) o recipientes irrompibles.

Prctica de Biologa Celular Bioseguridad

1

Prctica 1

BioseguridadTipo de prctica: grupal Duracin de la prctica: 2 h

ObjetivoAdquirir el conocimiento para la mejor utilizacin de agentes biolgicos en prcticasexperimentales y con ello minimizar los riesgos que atenten contra la salud.

IntroduccinLa bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas para reducir el riesgo de contraerenfermedades por diferentes agentes biolgicos. En los laboratorios, donde se utilice cualquiermaterial biolgico, debe existir un manual de bioseguridad y una infraestructura adecuada parael manejo del agente biolgico; sin embargo la actitud y el modo de proceder de aquellaspersonas que trabajan en estos laboratorios determinarn su propia seguridad.Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgosLa Organizacin Mundial de la Salud, la Ley General de Salud en Mxico, el Real Decreto664/1997 de Espaa, la Directiva 2000/54/EC de la Unin Europea y el U.S. Department ofHealth and Human Services (HHS) coinciden en la clasificacin, que se basa en cuatro aspectosgenerales:1) Caractersticas biolgicas del agente:- Reproductividad (sexual, asexual, frecuencia)- Capacidad de formar esporas, semillas etc.2a) Virulencia para el ser humano- Infeciosidad: dosis infectiva mnima, vas de penetracin- Patogenicidad: virulencia y toxicidad- Modo de transmisin: por aerosoles, contacto, lesiones, vectores- Datos epidemiolgicos: presencia y grado de propagacin as como inmunizacin de la

poblacin- Tenacidad: capacidad de sobrevivencia (dentro y fuera del laboratorio)- Tratamientos profilcticos y curativos2b) Exposicin en el trabajo- Tipo de trabajo: organizacin y procedimiento- Frecuencia de exposicin- Medidas preventivas y posibilidad de desinfeccin


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3) Para el medio ambiente- Relacin con otros organismos (p.ej. predadores, insectos tiles como abejas)- Relacin a los ciclos de nutrientes (p.ej. fijacin de nitrgeno)- Cambios a la biodiversidad (extinguir formas silvestres)- Medidas para un monitoreo4) Organismos Genticamente Modificados (GMO)- Estabilidad gentica del husped y presencia de factores de virulencia (p.ej. E. coli K12)- Estabilidad gentica de la modificacin en el husped- Movilizacin del vector/de la modificacin gentica (transferencia gentica horizontal)- Expresin de genes nuevos y la actividad del producto del gen (toxinas, factores de virulencia)

Basndose en esto los agentes biolgicos se han clasificado en cuatro grupos de riesgo (RG):Agente biolgico del RG-1: Aquel que resulta poco probable que cause una enfermedad porinfeccin en el ser humano. El RG-1 incluye organismos no conocidos como patgenos,microorganismos de RG > 1 con delecin (es) en su (s) gen(es) de virulencia, psicrfilos (< 20C), termfilos (> 50 C), acidfilos (pH < 4), alcalfilos (pH > 8,5), fottrofo obligado ascomo cultivos celulares (de plantas, no-vertebrata y vertebrata sin primata). Cepas microbianasrepresentativas pueden ser Agrobacterium, Bacillus (mayora), Desulfobacter, Escherichia coliK12, Lactobacillus, Leuconostoc, Propionibacterium (sin acnes), Pseudomonas (mayora),Rhodococcus, Streptomyces, Thiobacillus; Aspergillus (mayora), Candida (varios), Hansenula,Kluyveromyces, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pichia, Rhizopus, Saccharomyces,Trichoderma, Ustilago.Agente biolgico del RG-2: Aquel que puede causar una enfermedad en el ser humano ypuede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a lapoblacin y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. El RG-2 incluye lamayora de organismos patgenos y parsitos, con virulencia baja para seres humanos sanos ybaja probabilidad de causar una epidemia, como: patgenos para plantas (sin riesgo paraanimales), Actinomyces, Bacillus cereus, Chlamydia, Clostridium (algunos son RG-1),Corynebacterium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia coli, Haemophilus, Helicobacterpylori, Klebsiella, Mycobacterium (varios son RG-3), Neisseria, Proteus, Pseudomonasaeruginosa, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus; Aspergillus niger,A. flavus y A. fumigatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis y C. tropicalis,Microsporum, Trichphyton; Trypanosomas (varios son RG-3), Toxoplasma gondii;Adenovirus, Coronavirus, Epstein-Barr virus, Herpes simplex, Influenza virus, Papilloma virus,Polio virus as como material no caracterizado y posiblemente infeccioso (p.ej. heces, lodosactivados, rganos de animales, fluidos corporales etc.).


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Agente biolgico del RG-3: Aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano,presenta un serio peligro para los trabajadores y riesgo de que se propague a la poblacin, peroexiste generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz. El RG-3 incluye los organismospatgenos y parsitos, con virulencia moderada para seres humanos sanos y moderadaprobabilidad de causar una epidemia, como: Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacteriumtuberculosis, M. leprae, M. bovis, Mycoplasma, Rickettsia, Yersinia pestis; Coccidioidesimmitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis; Trypanosoma brucei, T. cruzi;Dengue virus, Hanta virus, Hepatitis virus, Rabia virus, Human immunodeficiency virus (HIV),Zinga virus; Creutzfeld-Jacob prin.Agente biolgico del grupo 4: Aquel que puede causar una enfermedad grave en el serhumano, presenta un serio peligro para los trabajadores y alta probabilidad de que se propaguea la poblacin, sin que exista una profilaxis o tratamiento eficaz. Los virus son los nicosagentes biolgicos presentes en este grupo, los ms representativos son: Ebola virus, Flavivirus,Herpes B virus, Junin virus, Lassa fiebre virus, Machupo virus, Marburg virus, X-Arbovirus.

Fig. 1: Smbolo internacional de Riesgo Biolgico

Medidas preventivasEn base a la clasificacin en los 4 RG se puede implementar medidas preventivas paracompensar el riesgo respectivo. Estas medidas preventivas pueden ser:a) Tcnicas: - Construccin de edificios

- Construccin de equipos- Material de proteccin individual

b) Organizacionales: - Responsabilidades- Instrucciones de seguridad y seales- Anotacin (experimentos, accidentes)- Cursos de seguridad

c) Personales - Personal calificado- Tcnicas (microbiolgicas) apropiadas (GLP)

d) Biolgicas: - Clulas y vectores huspedes seguros


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La mayora de las reglas a respeto de la bioseguridad se refiere a medidas tcnicas decontencin, es decir inhibir la liberacin (accidental) de los agentes biolgicos. Se diferenciaentre 1) las tcnicas de laboratorio, 2) equipo (barreras primarias) y 3) instalacin/diseo dellaboratorio (barreras secundarias).1) Tcnicas de laboratorio: El elemento ms importante para contener los riesgos biolgicoses el seguimiento estricto de las buenas prcticas y tcnicas biolgicas (GLP). Como parte deestas prcticas est el desarrollo o adopcin por parte de cada laboratorio de un manual deoperaciones (o manual de seguridad biolgica) en que se identifiquen los riesgos que puedasufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar los riesgos.Las causas ms comunes para infectarse son:- Pipetear con la boca- Lastimarse con agujas y jeringas- Exposicin a aerosoles liberados por agitacin, centrifugacin, desintegracin, flamear asas,

homogeneizacin, pipetear, ultrasnicar- Falta de higiene: desinfectar rea de trabajo, equipo y manos antes y despus del trabajo as

como inmediatamente cuando ocurre una contaminacin o derrame; estrilizar materialcontaminado

2) Equipo de seguridad (barreras primarias): Se incluyen en este apartado tanto dispositivoso aparatos que garantizan la seguridad del personal (p.ej. campanas de seguridad biolgicanivel 1, 2 3 que eviten la liberacin de aerosoles y filtran aires de escape (Fig. 2)), como lasprendas de proteccin personal (guantes, mascarillas, batas, calzado, lentes etc.).

a) no seguro c)BSL-2

b) BSL-1 d)BSL-3

Fig. 2: Campanas, las flechas indican el flujo de aire: rojo = contaminado, azul = estril. a) Banco de trabajo de airelimpio: estril para el experimento e inseguro para el trabajador, que recibe aire contaminado. b) Campana deextraccin, que protege el trabajador contra aerosoles, pero el experimento es expuesto a aire contaminado. c)Campana de flujo laminar: adecuado para trabajos de RG-2, protegiendo tanto al trabajador como alexperimento. d) Cabina de alta bioseguridad, hermticamente sellada para evitar que cualquier agentebiolgico pueda salir; la manipulacin ocurre a travs de guantes: adecuado para trabajos de RG-3 y RG4.


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3) Diseo y construccin de la instalacin (barreras secundarias): La magnitud de lasbarreras secundarias depende del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio.Dentro de ellas se incluyen la separacin de las zonas donde tiene acceso el pblico, ladisponibilidad de sistemas de descontaminacin (autoclaves, incineradores etc.), el filtrado deaire de salida, presin negativa, flujo de aire direccional etc. (Tab. 1).

Tab. 1: Medidas de contencin (nivel de bioseguridad, BSL) que se aplican segn la naturaleza de lasactividades que est en concordancia con los grupos de riesgos (RG).

Medidas de contencin RG-2BSL-2

RG-3BSL-3

RG-4BSL-4

1. Lugar de trabajo separado de toda actividad que sedesarrolle en el mismo edificio

No Aconsejable S

2. El aire introducido y extrado del lugar de trabajo sefiltra por filtros de alta eficacia para partculas en el aire(HEPA) o de forma similar

No S, para lasalida de aire

S, para laentrada ysalida de aire

3. Solamente se permitir el acceso al personaldesignado

Aconsejable S S, con esclusade aire

4. El lugar de trabajo debe ser precintado para permitirsu desinfeccin (con gas)

No Aconsejable S

5. Procedimientos de desinfeccin especficos S S S6. El lugar de trabajo se mantendr con una presinnegativa respecto a la presin atmosfrica

No Aconsejable S

7. Control eficiente de vectores p.ej., roedores e insectos Aconsejable S S8. Superficies impermeables al agua y de fcil limpieza S, para

mobiliariocomo RG-2,adems suelo

como RG-3,adems techoy paredes

9. Superficies resistentes a cidos, lcalis, disolventes ydesinfectantes

Aconsejable S S

10. Almacenamiento para agentes biolgicos S S, seguro S, de altaseguridad

11. Ventanilla de observacin/un dispositivo alternativoen las zonas para que se pueda ver a sus ocupantes

Aconsejable Aconsejable S

12. Laboratorio con equipo propio Aconsejable S S13. El material infectado, animales incluidos, se debemanejar en una cabina de seguridad biolgica o en unaislador u otra contencin apropiada

Cuandoproceda

Si, cuando lainfeccin sepropague porel aire

S

14. Incinerador para destruccin de animales muertos Aconsejable S, disponible S, en elmismo lugar


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Material a utilizarMaterial didctico y visita a los laboratorios donde se trabaja con material biolgico.ProcedimientoEsta prctica se iniciar en el saln de clases, donde el profesor explicar a los estudiantes lasmedidas de seguridad en los laboratorios donde se trabaja con material biolgico (infeccioso).Despus de ello el profesor trasladar a los estudiantes a cada uno de los laboratorios delCentro Universitario para ensearles la infraestructura de cada laboratorio.

ResultadosElementos deseguridad

Laboratorio de...

Laboratorio de...

Laboratorio de...

Laboratorio de...

Manual deBioseguridadClasificacin deagentes biol. engrupos de riesgoMedidas decontencin

Observaciones

Conclusiones


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CuestionarioDefinir los siguientes conceptos:1. Agente biolgico:

2. Microorganismo:

3. Cultivo celular:

4. Peligro:

5. Dao:

6. Riesgo:

7. Desinfeccin:

8. Contaminacin:

9. Estrilizacin:


8

10. Incineracin:

11. Cules pases cuentan con laboratorios de BSL-4?:

Referencias bibliogrficas1. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud. Diario

Oficial de la Federacin del 3 de febrero de 1983. Disponible en:http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/compi/rlgsmis.html

2. Manual de procedimientos de Bioseguridad. Instituto de Investigaciones Biomdicas.Universidad Nacional Autnoma de Mxico (2010). Disponible en:http://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/manual_bioseguridad.pdf

3. Proteccin de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposicin a agentesbiolgicos durante el trabajo. Real Decreto 664/1997, de 12 de Mayo. B.O.E. No. 124 de 24de Mayo.

4. Biosafety in Microbbiological and biomedical laboratories. U.S. Department of Health andHuman Service, 5th ed. (2009). Disponible en:http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf

5a. Manual de Bioseguridad, OMS, 3a ed. (2005)http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf

5b. Laboratory Biosafety manual, WHO, 3rd ed. (2004)http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf

6. Pgina Web del Laboratorio de Biologa Celular en CUCINEGA:http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html

Prctica de Biologa Celular Soluciones & Espectrofotmetro

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Prctica 2

Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetroTipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 2-4 h

ObjetivoAdquirir la habilidad y aprender estrategias en la preparacin de soluciones y el uso delespectrofotmetro.

IntroduccinSolucin qumicaUna solucin o disolucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. Usualmente elcomponente en mayor proporcin se denomina "solvente" y los que se hallan en menorproporcin "solutos". Las soluciones a su vez se pueden denominar "concentrada" si posee unacantidad relativamente alta de soluto y "diluida" si la cantidad es relativamente baja (Riao-Cabrera, 2007).En funcin a la cantidad de soluto disuelto, las soluciones se pueden clasificar en insaturadas,saturadas o sobresaturadas:Insaturada: Solucin en que se ha disuelto una cantidad de soluto menor a la cantidad mximaque se puede disolver en el solvente.Saturadas: Solucin en que no se puede seguir admitiendo ms soluto, esto es cuando mssoluto ya no puede ser disuelto en el solvente.Sobresaturadas: Solucin en que se ha aadido ms soluto del que puede ser disuelto en elsolvente, por lo tanto, se observa que una parte del soluto se precipita (va al fondo delrecipiente).La solubilidad puede estar influenciada por la temperatura: si la temperatura aumenta, lacapacidad para admitir ms soluto tambin aumenta.

Fundamentos sobre el uso del espectrofotmetroAbsorcin de luz: Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber radiacinelectromagntica a una frecuencia caracterstica. En este proceso se transfiere energa a lamolcula, que provoca una disminucin en la intensidad de la radiacin electromagnticaincidente. Por consiguiente, la absorcin de la radiacin atena el rayo incidente de acuerdocon la ley de la absorcin.


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La ley de absorcin, tambin conocida como ley de Lambert y Beer, o simplemente ley deBeer, proporciona informacin cuantitativa de cmo la atenuacin de la radiacin depende de laconcentracin (c) de las molculas que la absorben y de la distancia (d) que recorre el rayo deluz en el medio ambiente (p.ej. una solucin). Cuando la luz atraviesa una solucin con elanalito, la intensidad de la radiacin disminuye (= atenuacin) como consecuencia de laexcitacin del analito (= absorcin) as como, en menor parte, la reflexin. Cuanto mayor sea latrayectoria (d) del rayo en la solucin de analito de una concentracin (c), habr ms analitoque absorba la radiacin, y la atenuacin ser mayor (Fig. 3). La absorbancia y transmitanciason fracciones respectivas en el espectro electromagntico de la luz. Debido a las interaccionesque suceden entre los fotones y las partculas absorbentes (= analitos), la intensidad del rayodisminuye desde I0 hasta I. La transmitancia T de la solucin, es la fraccin de radiacinincidente que transmite la solucin, tal como se muestra en la ecuacin T = I/I0. Latransmitancia suele expresarse como porcentaje o porcentaje de transmitancia (Skoog et al.,2003).

cI0 I

d T = I/I0A = lg I0/Id: distancia [cm]c: concentracin analito [mol/l]

Fig. 3: Atenuacin de un haz de radiacin por una solucin absorbente. La flecha ms grande es el rayo incidente,significa que la energa radiante es mayor que la que trasmite la solucin.

EspectrofotmetroEste equipo es utilizado frecuentemente para anlisis qumicos en la industria farmacutica yalimentaria. Sirve para medir la relacin entre valores relativos de una misma magnitudfotomtrica a dos haces de radiaciones, mide tambin la concentracin o reacciones qumicas obioqumicas de una muestra; ambas mediciones se realizan en funcin de una longitud de onda(Skoog et al., 2003). Estos instrumentos son utilizados principalmente para la cuantificacin decompuestos orgnicos e inorgnicos as como de microorganismos.


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Material a utilizarMaterial Consumibles6 Tubos de ensayo de 13100 Etanol 70 %1 Matraz EM o

vaso de precipitados de 50 mlAgua destilada (A. dest.)

2 Pipetas serolgicas de 5 10 ml Medios de cultivo2 Celdas espectrofotomtricas de 1 ml Tryptic Soy Broth (TSB) (anexo) 1 Perilla de tres vas Nutrient Broth (NB) (anexo)1 Micropipeta de 10 a 100 l1 Micropipeta de 100 a 1000 l EquipoPuntas amarillas y azules 1 AutoclaveTubos tipo Eppendorf 1 Espectrofotmetro

ProcedimientoEsta prctica complementa el conocimiento y habilidad del estudiante en la preparacin y usode soluciones, equipo o instrumentos utilizados en el rea de farmacia y biotecnologa. Lapreparacin de una solucin no solo debe asociarse a la preparacin de una solucin qumica,tambin existen otro tipo de soluciones, como en el caso de la biotecnologa donde se utilizansoluciones fisiolgicas, medios de cultivos lquidos y slidos etc. Por otra parte el uso delespectrofotmetro no solo se utiliza para medir absorbancia o transmitancia en solucionescoloreadas sino tambin se puede utilizar para medir la absorbancia de una suspensin celularbacteriana. Como se observar en esta prctica. En algunas disciplinas de la biotecnologa o enciertas circunstancias no es necesaria la exactitud de las mediciones de volmenes o cantidadescomo frecuentemente se exige en el rea de qumica.

Preparacin de un medio de cultivo lquido1. Realizar los clculos necesarios (seguir instrucciones del proveedor) para obtener la cantidad

de medio de cultivo que se disolvern en 20 ml de A. dest.2. Pesar el medido de cultivo en una balanza semianaltica y transferirlo a un matraz EM de 50

ml y adicionar 20 ml de A. dest. (en la preparacin de medios de cultivo no es necesarioaforar la solucin).

3. Mezclar muy bien el medio de cultivo en el A. dest.; esta solucin se le llama caldo decultivo.

4. Transferir 3 ml de caldo de cultivo homogneo, con una pipeta serolgica de 5 10 ml, acada uno de los 6 tubos de ensayo.


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5. Tapar estos tubos; dejarlos con la tapa floja para su estrilizacin (autoclave).6. Inocular con 100 l de caldo con Escherichia coli 3 tubos con caldo de cultivo estril e

incubar 12 h a 37 C.7. Despus de 12 h se obtendr una suspensin celular de aprox. 109 clulas/ml.Nota: Por fines prcticos, los puntos 5 y 6 pueden ser omitidos, si previo a la prctica los tuboscon caldo de cultivo fueron estrilizados e inoculados.

Uso del espectrofotmetro8. Transferir de la suspensin celular (muestra) con aprox. 109 cel/ml con una micropipeta 100

y 10 l, respectivamente, a diferentes tubos Eppendorf y aadir 900 y 990 l de caldo decultivo estril, respectivamente. Con ello se obtiene diluciones de 1/10 y 1/100 (estorealizarlo por triplicado).

9. De cada una de las muestras (triplicado): Transferir con una micropipeta, 1 ml de suspensincelular original, dilucin 1/10 y 1/100, respectivamente, a una celda espectrofotomtrica ascomo 1 ml de caldo de cultivo estril a otra celda espectrofotomtrica. La primera ser lamuestra y la segunda ser la referencia.

10. Calibrar el espectrofotmetro con la solucin de referencia a 600 nm (longitud de ondavisible utilizada en suspensiones microbianas) y realizar la medicin. Anotar lasabsorbancias (Abs).

Eliminacin de residuos biolgicos1. La desinfeccin de las mesetas se realiza con etanol al 70 %.2. Los volmenes restantes de caldos de cultivos con microorganismos se estrilizan en la

autoclave a 121 C, 1 bar (15 psi) por 20 min. Despus los caldos de cultivos se desechan aldesage con abundante agua.

Resultados1. Realizar los clculos de la cantidad de medio de cultivo a pesar


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2. Anotar el nmero de clulas en cada dilucin y la absorbancia que le corresponde.Muestras (cel/ml) Abs (1) Abs (2) Abs (3)

Suspensin original = 109

Dilucin 1/10 =Diucin 1/100 =

3. Graficar los resultados Abs vs concentracin

4. Con los resultados obtenidos responda a la siguiente pregunta: Si una suspensin bacterianacon 109 cel/ml tiene una absorbancia de ___________ cuntas clulas microbianas tendrn lasdiluciones?

Observaciones

Conclusiones


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Cuestionario1. Cul es la ecuacin de Lambert y Beer?

2. Cul es la diferencia entre una solucin, suspensin, dispersin y emulsin? (no definir losconceptos de cada una).

3 Qu es una solucin fisiolgica? Un medio de cultivo lquido es una solucin fisiolgica?Por qu?

4. Para qu se utiliza una solucin de referencia para medir al espectrofotmetro una muestra?

Referencias bibliogrficas1. Riao-Cabrera N. (2007): Fundamentos de Qumica Analtica Bsica: Anlisis Cuantitativo.

1a ed., Universidad de Caldas, Colombia. pp. 19-202. Skoog D.A., West D.M., Holler F.J., Crouch S.R. (2003): Qumica Analtica. 7a ed., Mc

Graw Hill, Mxico. pp. 575-5763. Manual de Qumica General de la Universidad Pontificia Catlica del Per (UPCP).

Disponible en: http://corinto.pucp.edu.pe/quimicageneral/contenido/62-tipos-de-soluciones-y-solubilidad

Prctica de Biologa Celular Microscopio

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Prctica 3

Microscopio: componentes y observacin

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 2-4 h

ObjetivoConocer los componentes del microscopio y adquirir la habilidad de usarlo mediante laobservacin de distintos tipos de clulas.

IntroduccinMicroscopiaEs el uso de un rayo de luz o electrones para hacer visibles los objetos que no son visibles asimple vista. Sus principios generales son: radiacin de longitud de onda, magnificacin,resolucin y contraste.

Radiacin de longitud de ondaCuando se habla de un haz de radiacin se refiere tanto a rayos como ondas. La luz visible esuna parte del espectro electromagntico que incluye rayos X, microondas y ondas de radio.Estas formas de radiacin difieren en longitud de onda y la distancia entre dos puntos de lamisma. El ojo humano es limitado a un rango de longitudes de onda (llamado "luz visible") yenva impulsos nerviosos al cerebro, el cual los interpreta como diferentes colores, p.ej.longitudes de onda de 400 nm como violeta y de 650 nm como rojo. La luz blanca estcompuesta de muchos colores (longitudes de onda) y tiene un promedio de 550 nm (Fig. 4). Porotra parte los electrones son cargados negativamente y su movimiento acta como ondas, dondesus longitudes dependen de su voltaje. Por ejemplo una longitud de onda de 10.000 V es 0,01nm, mientras que una de 1.000.000 V es 0,001 nm. Esto significa que al usar radiaciones delongitudes de onda ms pequeas se incrementa la utilidad del microscopio.


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Fig. 4: Espectro electromagntico, imagen extrada de http://1.bp.blogspot.com/

MagnificacinEste concepto se refiere al aparente incremento del tamao de un objeto, que es indicado poruna "x" que significa "vez". La magnificacin resulta cuando un haz de radiacin refracta alcruzar una lente. Lentes con curvatura refractan la luz y campos magnticos refractan el haz deelectrones. Una lente con curvatura convexo refracta rayos de luz que pasan a travs de superiferia en mayor proporcin que cuando pasan en el centro; parecido como una serie deprismas: los rayos que atraviesan la lente se reencuentran en el punto focal (Fig. 5). En estepunto focal los rayos se dispersan y favorecen al agrandamiento de la imagen (Fig. 6). El gradode la magnitud de la imagen depende del grosor de la lente, su curvatura y la velocidad de laluz al atravesar la muestra. Las propiedades que determinan la utilidad de la magnificacin sonresolucin y contraste.

Fig. 5 Refraccin de un haz de luz por una lente bi-convexo: distancia focal (f) y punto focal (F)

Fig. 6: Magnificacin de un objeto por una lente plano-convexo


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Resolucin:Esta propiedad describe la habilidad de distinguir con claridad dos objetos muy cercanos.Cuando luz pasa por una apertura se difracta, que limita a la resolucin (Fig. 7). Losmicroscopios modernos, que funcionan con luz visible y ultravioleta, pueden distinguir entreobjetos de 200 nm de distancia, los electrnicos, que funcionan con haz de electrones, tienen unpoder de resolucin de 0,1 nm. La resolucin depende de la longitud de onda de una radiacinelectromagntica, la apertura numrica de la lente y la capacidad de la lente para recuperar luz(Bauman, 2007).

Fig. 7: Poder de resolucin: 2 puntos son resueltos, cuando sus patrones de difraccin no se solapan(izquierdo), cuando se inician de solapar se alcanza el lmite de resolucin (centro) y cuando lospuntos se solapan no son resueltos (derecho).

Contraste:Esta propiedad se refiere a las diferencias en intensidad del brillo entre dos objetos (Fig. 8) uobjeto y el soporte (fondo). La mayora de los microorganismos no son coloreados y presentanmuy poco contraste. Una forma de aumentar el contraste es tindolos. Otra forma es explotarlas diferencias entre el ndice de refraccin de la clula y del medio; a este proceso se le llamafase (Nester et al., 2004).

Fig. 8: En reas con poco contraste (izquierda) no se puede diferenciar elementos; en reas con contraste elevado(derecha) se puede distinguir estructuras. En rojo se representa la "tone curve" respectiva; curvas muyinclinadas indican reas de contraste elevado.


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Microscopios ms utilizadosTab. 2: Diferentes tipos de microscopa y su uso (Bauman, 2007)

Tipo demicroscopio

Descripcin de la imagen Usos

Microscopio de luz Magnificacin til de 1x a 2 000x;resolucin hasta 200 nm

Luz visible, la longitud de onda azulsuministra mejor resolucin

- Campo claro Muestras coloreadas o no teidasen contra de un fondo brillante

Observacin y conteo demicroorganismos muertos

- Campo obscuro Muestras brillantes en contra de unfondo obscuro

Observacin de microorganismosvivos y no teidos

- Contraste de fases Muestras con reas claras yobscuras

Observacin de estructuras internasde microorganismos vivos

- Nomarski Parecen imgenes tridimensionalespor contraste de interferenciadiferencial

Observacin de estructuras demicroorganismos vivos

- Fluorescencia Muestras con colores fluorescentesen contra de un fondo obscuro

Localizacin de estructuras ocompuestos qumicos especficos

- Confocal Estructuras en un solo plano (corteptico) normalmente encombinacin con fluorescencia

Observacin detallada de estructurascelulares en una poblacin celular

Microscopioelectrnico

Magnificacin tpica 1 000x a10 000x, resolucin a 0,1 nm

Usa electrones con longitudes de ondacorta; las muestras tienen que estar envaco

- Transmisin Montono, doble dimensin,imagen altamente magnificada,puede tener un incremento de color

Observacin de detalles ultra-estructurales extremas de clulas,virus y bacterias

- Scanning Montono, tridimensional, imagenaltamente magnificada; puedetener un incremento de color

Observacin de los detalles de lasuperficie de la estructura celular

Microscopios deproximidad

Magnificacin mayor de100 000 000x

Estos microscopios se mueven sobrela superficie de la muestra

- Scanningtunneling

Molculas individuales y tomosvisibles

Observacin de la superficie delobjeto, suministra finamente detalles

- Fuerza atmica Molculas individuales y tomosvisibles

Observacin de material biolgico anivel molecular y atmico


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Componentes y fundamento del microscopioExplicar y describir con material didctico los componentes ms importantes que forman a unmicroscopio. Trasladar a los estudiantes al laboratorio y demostrarles el funcionamiento delaparato, mediante observaciones con diferentes tipos de clulas.

Material a utilizarMaterial Consumibles3 Portaobjetos con muestras teidas de clulas Etanol 70 %

vegetales, bacterianas y levaduras Agua destilada (A. dest.)3 Cubreobjetos

Equipo1 Microscopio

ProcedimientoObservacin al microscopio1. Muestras fijadas y coloreadas sobre un portaobjeto les sern entregadas a cada uno de los

equipos. Las muestras son clulas vegetales para el objetivo de 10x, levaduras para elobjetivo de 40x y bacterias para el objetivo de 100x.

2. Tomar un portaobjeto con la muestra de clula vegetal y colocar el cubreobjeto sobre lamuestra.

3. Colocar la preparacin sobre la platina y asegurarla con las pinzas, ajustar el objetivo 10x,enfocar, primero con el anillo macromtrico y despus, para lograr nitidez, enfocar con elanillo micromtrico. Por ltimo observar todo el campo con la perilla de movimiento. Paraobservar las bacterias se debe usar el objetivo de 100x y aceite de inmersin.

Eliminacin de residuos biolgicosAl final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 %por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para serreutilizados o desecharlos directamente a donde se almacena el material de vidrio para reciclar.Los cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgicoinfeccioso. Las soluciones de hipoclorito sdico, como la leja de uso domstico, contienen 50g/l de cloro libre y por tanto deben diluirse 1:10 para obtener una concentracin final de 5 g/l.


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Resultados1. Dibujar y sealar los componentes del microscopio.

2. Dibujar o fotografiar a las clulas observadas sealando los objetivos utilizados.

Observaciones

Conclusiones


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Cuestionario1. Usando un microscopio con el objetivo de 40x y una lente en el ocular de 10x Cuntasveces magnificada se ve la muestra?

2. Por qu se debe utilizar aceite de inmersin con el objetivo de 100x y no con el objetivo de10x?

3. Describa los 4 partes ms importante del microscopio? A cul sistema pertenece cada una?

Referencias bibliogrficas1. Bauman R. (2007): Microbiology with Diseases by Taxonomy. 2nd ed. Pearson, San

Francisco, USA. pp. 93-1222. Nester E.W., Anderson D.G., Roberts C.E., Pearsall N.N., Nester M.T. (2004):

Microbiology: a Human Perspective. 4th ed. McGraw Hill, New York, USA. pp. 39-45

Prctica de Biologa Celular Tincin de clulas

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Prctica 4

Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 4 h

ObjetivoAdquirir habilidad en la fijacin biolgica y tincin de diferentes tipos de clulas y observarcon el microscopio sus formas, tamaos y distribucin en un mismo plano.

IntroduccinFijacin de clulasLas clulas teidas y vistas bajo el microscopio deben ser semejantes a clulas vivas. Lafijacin es un proceso en cual las estructuras internas y externas de clulas o microorganismosson conservadas e inmovilizadas en una posicin. Entonces, en la fijacin se inactivan lasenzimas, que pueden alterar la morfologa celular, y se endurecen las estructuras celulares, paraque estas no cambien durante la tincin y observacin. Por lo tanto, la clula muere al momentode la fijacin.Hay dos tipos de fijacin fundamentalmente diferentes:1) Fijacin al calor: las muestras biolgicas se extienden (comnmente bacterias) sobre elportaobjeto y con una flama azul se confiere calor seco prudentemente y se fija la pelcula. Estopreserva la morfologa pero no la estructura interna de las clulas.2) Fijacin qumica: se usa para proteger las estructuras finas internas de las clulas y lamorfologa de los orgnulos subcelulares. Los fijadores qumicos penetran a las clulas yreaccionan con componentes celulares; usualmente protenas y lpidos para inactivar,insolubilizar e inmovilizarlos. La mezcla comn de fijadores contienen tales componentescomo metanol, etanol, acetona, cido actico, cloruro de mercurio, formaldehdo oglutar(di)aldehdo (Prescott et al., 2005).

Tinciones comunesLos diferentes colorantes usados para teir cualquier tipo de clula tienen dos caractersticas encomn:a) Tienen agentes cromforos (el que proporciona color a la molcula) que absorben luz, al serexcitados emiten diferentes colores dependiendo de la longitud de onda.


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b) Pueden unirse a las clulas mediante uniones covalentes, inicos o hidrofbicos. P.ej., uncolorante cargado positivamente puede unirse a las estructuras celulares cargadas negativa-mente.

Los colorantes ionizables pueden ser divididos en dos clases, de acuerdo con la naturaleza ycarga de su grupo:1) Colorantes bsicos: Azul de metileno, fucsina bsica, cristal-violeta, safranina o verde demalaquita tienen grupos con cargas positivas (algunas formas de nitrgeno tetravalente) y songeneralmente vendidos como sales de cloruro. Los colorantes bsicos se unen a las molculascargadas negativamente como cidos nucleicos y la mayora de las protenas. Dado que lassuperficies de la mayora de las clulas son cargadas negativamente, los colorantes bsicos sonfrecuentemente usados. Estos colorantes son utilizados para determinar el tamao, forma yarreglo o distribucin de las clulas.2) Colorantes cidos: Eosina, rosa de bengala o fucsina cida poseen grupos cargadosnegativamente tales como carboxilos (-COOH) o hidroxilos (-OH). Los colorantes cidos seunen a las estructuras celulares cargadas positivamente (Prescott et al., 2005).Las clulas pueden ser coloreadas in-vitro o in-vivo (p.ej. tejidos vivos). En las tinciones in-vivolas clulas o estructuras adquieren los colorantes de contraste y se puede estudiar sus arreglos,distribucin, morfologa mientras estn desempeando su funcin. Este tipo de tincin puederevelar donde o como se lleva a cabo una reaccin qumica-enzimtica dentro de las clulas otejidos, donde se almacena algn producto qumico determinado, donde est presente unaprotena especifica etc. Una tincin in-vitro es colorear clulas y estructuras que han sidoextradas de su sitio biolgico y tpicamente se observan formas, tamaos y estructuras conmejor detalle que in-vivo (Penney et al., 2002). En esta prctica se realiza una tincin in-vitro

Las tinciones simples o diferenciales son las ms utilizadas para material biolgico en estudiospreliminares.

Tincin simple: es el uso de un solo colorante, frecuentemente azul de metileno, que se aplicaal material biolgico mediante pasos sencillos. Esta tincin se utiliza principalmente paraobservar el tamao, la morfologa y la distribucin de las clulas en el mismo plano (Bauman,2007).Tincin diferencial: es el uso de dos o ms colorantes, donde uno es el que colorea y el (los)otro (s) son utilizados como mordiente (s) (proporciona mayor afinidad al colorante) o comocolorante (s) de contraste. Esta tincin se utiliza para distinguir grupos de microorganismos enel mismo plano o contrastar estructuras externas o internas de la misma clula (Bauman, 2007).


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Material a utilizarMaterial biolgico ConsumiblesSaccharomyces cerevisiae (levadura) Etanol 70 %Escherichia coli, Staphylococcus aureus (bacterias) Agua destilada (A. dest.)Cebolla Azul de metileno (anexo)Material Cristal violeta (anexo)3 Portaobjetos Safranina (anexo)3 Cubreobjetos Lugol (anexo)1 Pinza Etanol-Acetona (anexo)1 Placa de Petri Soluciones isotnicas (anexo)1 Escalpelo Equipo1 Asa de Kolle 1 Microscopio

1 Mechero Bunsen

ProcedimientoTincin simpleLa tincin simple se realiza a las tres muestras: Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli ycebolla.1) Saccharomyces cerevisiae, Escherichia colia) Fijar

1. Desengrasar el portaobjeto con etanol.2. Tomar una gota del cultivo, si es lquido, con el asa de Kolle o nicromo y colocarla en el

centro del portaobjeto. Si es slido tomar una gota de solucin isotnica y colocarla en elportaobjeto. Despus tomar una "asada" de la colonia y colocarla en medio de la gota.

3. Extender con el asa haciendo un valo.4. Secar a los lados de la flama del mechero (sin quemar la muestra).5. Repetir a partir del paso 2 (3 4 veces cuando es lquido o la muestra es muy diluida, si

proviene de medio slido, solo 1 vez).b) Colorear

1. Colocar unas gotas de azul de metileno sobre la muestra ya fijada y esperar 90 s.2. Lavar con A. dest. y decantar.3. Secar y observar al microscopio la levadura con el objetivo de 40x; la bacteria con el de

100x y aceite de inmersin.


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2) Preparacin de clulas epidermiales de la cebollaa) Fijar

1. Partir una cebolla y separar sus capas, extraer con ayuda del escalpelo y una pinza la capams delgada.

2. Depositar la capa o membrana en una placa Petri con solucin isotnica. Introduciroblicuamente el portaobjeto en la placa y con ayuda de una pinza colocar la membrana enel portaobjeto, intentar que no quede arrugas.

b) Colorear1. Cubrir con gotas de azul de metileno la membrana y esperar 5 min.2. Colocar el portaobjeto en la placa Petri vaca, un extremo en el borde y el otro en la base

(inclinacin aprox. 45) lavar desde el extremo superior al inferior con un chorro dbil deA. dest., presionando con una pinza la membrana para evitar que sea arrastrada.

3. Cuando el agua es clara o sin rastros del colorante, colocar el cubreobjeto sobre la muestraevitando la presencia de burbujas.

4. Observar al microscopio a 10x y 40x.

Tincin diferencial: Tincin de Gram (Fig. 9)Cultivo mixto de Escherichia coli y Staphylococcus aureusFijacin

1. Desengrasar el portaobjeto con etanol.2. Tomar una gota del cultivo lquido, con el asa y colocar en el centro del portaobjeto.3. Extender con el asa haciendo un valo.4. Secar a los lados de la flama del mechero (sin quemar la muestra).5. Repetir a partir del paso 2 (3 4 veces cuando es lquido o la muestra es muy diluida).

Tincin1. Colocar unas gotas de cristal violeta sobre la muestra ya fijada. Esperar 90 s.2. Inclinar el portaobjeto y lavar del extremo superior con A. dest.3. Colocar unas gotas de Lugol para lograr una mayor afinidad al colorante. Esperar 30 s.4. Lavar con etanol-acetona por 20 s y decantar.5. Lavar con A. dest. y decantar.6. Agregar safranina y esperar 90 s.7. Lavar con A. dest. y decantar.8. Secar y observar al microscopio con objetivo 100x y aceite de inmersin.


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Fig. 9: Las fases de la tincin de Gram: Fijacin, tincin con cristal violeta, aplicar mordiente con Lugol,decoloracin con etanol/acetona y coloracin de contraste con safranina.

Nota: para la preparacin de los colorantes vase anexo I.

Eliminacin de residuos biolgicos1. La desinfeccin de las mesetas se realiza con etanol al 70 %.2. Los volmenes restantes de caldos de cultivos con microorganismos se esteriliza en la

autoclave a 121 C, 1 bar (15 psi) por 20 min. Desechar los caldos de cultivo al desage conabundante agua.

3. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 %por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para serreutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos sedesechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso.

Resultados1. Dibujar cada clula observada.


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2. Nombrar a que dominio filogentico pertenece cada clula.

3. Sealar en los dibujos los nombres de las estructuras observadas.

Observaciones

Conclusiones


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Cuestionario1. Por qu es necesario fijar la muestra?

2. De acuerdo al rbol filogentico a qu divisin pertenece cada una de las clulas queutilizamos en esta prctica?

3. Por qu es necesario teir la muestra?

Referencias bibliogrficas1. Penney D.P., Powers J.M., Frank M., Willis C., Churukian C. (2002): Analysis and testing of

biological stains the Biological Stain Comission Procedures. Biotech. & Histochem., 77:237-275

2. Presccott M.L., Harley J.P., Klein D.A. (2005): Microbiology. 6th ed., McGraw Hill,Singapur. pp. 39-45

3. Bauman R. (2007): Microbiology with Diseases by Taxonomy. 2nd ed., Pearson, SanFrancisco, USA. pp. 93-122

Prctica de Biologa Celular smosis

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Prctica 5

Comportamiento de las clulas eucariotas frente asoluciones con diferente osmolaridad


ObjetivoIdentificar el comportamiento de las clulas expuestas a soluciones isotnicas, hipotnicas ehipertnicas.

IntroduccinTonicidad:La tonicidad es la osmolaridad de una solucin comparada con la osmolaridad de cualquier tipode clula. En otras palabras, es la relacin entre la concentracin de los iones (solutos) en unasolucin y los iones dentro de las clulas. Las soluciones que tienen la misma concentracin(osmolaridad) de iones que dentro de la clula son llamadas soluciones isotnicas. Lassoluciones con mayor osmolaridad que dentro de las clulas son llamadas hipertnicas y lassoluciones con menor osmolaridad que dentro de las clulas son hipotnicas (Speralakis, 2011).Soluciones isotnicas: Cuando las clulas se sumergen en una solucin con la mismaosmolaridad, la difusin del agua es en ambas direcciones y el ndice de difusin de agua es elmismo en ambos sitios. Entonces es una solucin isotnica o isoosmtica. Ejemplo de unasolucin isotnica es una solucin salina de NaCl al 0,9 %.Soluciones hipertnicas: En la biologa una solucin hipertnica (hiperosmtica) es unasolucin con mayor concentracin de solutos que el citosol. Cuando se sumergen las clulasdentro de una solucin hipertnica, la tendencia del flujo de agua es hacia fuera de las clulascon el fin de equilibrar la concentracin de solutos. Ejemplos de soluciones hipertnicas sonmermeladas, salmueras etc.En el caso de clulas animales, las clulas pierden agua y se arrugan, se ven hundidas o seencogen. En los eritrocitos este proceso se conoce como crenacin.En el caso de clulas vegetales o microbianas el agua sale del medio intracelular, elprotoplasma se retrae, producindose un espacio entre la membrana plasmtica y la paredcelular. A este fenmeno se le conoce como plasmlisis.


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Soluciones hipotnicas: En la biologa una solucin hipotnica (hipoosmtica) tiene menorconcentracin de solutos que el citosol o citoplasma. Cuando las clulas se sumergen ensoluciones hipotnicas el agua se difunde del exterior hacia el interior de la clula con el fin deequilibrar la concentracin de solutos para ambos sitios. Ejemplo tpico de una solucinhipotnica es el agua destilada (A. dest.).Clulas animales sufren del fenmeno de citlisis, dado que el agua entra al citosol, la clula sehincha y se pueden romper las membranas. En el caso de eritrocitos, a este fenmeno se ledenomina hemlisis.En clulas vegetales ocurre una presin de turgencia: cuando el agua entra a la clula se hinchay se puede destruir la membrana (lisis) pero no la pared celular debido a su gran estabilidad;algo muy parecido pasa con los hongos y bacterias (Speralakis 2011, Donnersberger, 2002).Aunque en el caso de bacterias la pared celular puede ser destruida.

Material a utilizarMaterial biolgico ConsumiblesSangre humana Etanol 70 %

Agua destilada (A. dest.)Material Solucin salina al 0,9 %

3 Portaobjetos Solucin salina al 1,5 %3 Cubreobjetos Algodn2 Lancetas estriles Aplicadores de madera

Papel para cocina

Equipo1 Microscopio


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ProcedimientoNota: Durante esta prctica es necesario usar guantes.1. Colocar una servilleta de papel sobre la superficie donde se trabaja.2. Colocar tres portaobjetos desengrasados sobre la servilleta, rotular en un extremo de un

portaobjeto Iso (soln. isotnica), Hipo (soln. hipotnica), Hiper (soln. hipertnica).3. Lavar y limpiar con un antisptico el extremo libre del dedo ndice.4. Con la lanceta pinchar rpidamente el extremo del dedo.5. Apretar la punta del dedo hasta ver una gota de sangre.6. Colocar una gota de sangre sobre cada portaobjeto.Nota: El siguiente proceso debe ser rpido! para evitar que la sangre se seque.7. Al portaobjeto sealado con Iso colocar una gota de solucin salina al 0,9 %.8. Al portaobjeto sealado con Hipo colocar una gota de A. dest.9. Al portaobjeto sealado con Hiper colocar una gota de solucin salina al 1,5 %.10. Con el aplicador mezclar suavemente las soluciones con la sangre de 3 a 5 s.11. Inmediatamente! colocar un cubreobjeto sobre cada muestra y observar al microscopio.12. Observar con el objetivo de 40x las clulas normales, la crenacin y hemlisis.

Eliminacin de residuos biolgicos1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %.2. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 %

por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para serreutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos sedesechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso.

3. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgicoinfeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).


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Resultados1. Dibujar las clulas normales, la crenacin y la hemlisis.

Iso Hipo Hiper

Observaciones

Conclusiones


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Cuestionario1. Qu ocurre en una clula vegetal si se sumerge en una solucin salina al 5 %?

2. Por qu en las clulas vegetales no ocurre una lsis? Qu tipo de componentes tiene supared celular?

3. Cuando ocurre una crenacin o hemlisis en los eritrocitos?

4. Cmo se prepara 100 ml de una solucin isotnica de NaCl? Qu osmolaridad tiene estasolucin?

5. Qu es la diferencia entre osmolaridad y osmolalidad?

Referencias bibliogrficas1. Donnersberger A.B., Lesak A.E. (2002): Laboratorio de Anatoma y Fisiologa. 1a ed.,

Paidotribo, Barcelona, Spain. pp. 345-3472. Sperelakis N. (2011): Cell Physiology Source Book: Essential of Membrane Biophysics. 4th

ed. Academic Press, Waltham, USA. pp. 288

Prctica de Biologa Celular Estructuras intracelulares

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Prctica 6

Observacin de estructuras internas de clulas eucariotas


ObjetivoObservar las estructuras internas de clulas animales mediante la tcnica de frotis sanguneo.

IntroduccinLas clulas eucariotas son muy complejas con un citoplasma organizado con orgnuloslimitados por membranas biolgicas, que son similares en su composicin a la membranacelular. El ncleo es el orgnulo ms notable y caracterstico tanto en clulas animales como envegetales, hongos y protistas. Por esto mismo un ejemplo tpico para observar una estructurainterna de una clula animal es el ncleo.

Frotis sanguneoLa tcnica de frotis sanguneo consiste en una extensin de sangre realizada sobre unportaobjeto con ayuda de otro portaobjeto (Fig. 10), que permite observar bajo el microscopiodiferentes formas celulares sanguneas. Con dbil aumento se explora la preparacin paralocalizar la zona en la que el frotis es ms perfecto (Fig. 11).En el campo del microscopio se ven con un dominio predominante los eritrocitos (tambinllamados glbulos rojos o hemates), teidos de color rojo. No tienen ncleo y se observa unentorno ms claro en medio que en los bordes. Los leucocitos (tambin llamados glbulosblancos) se identifican fcilmente por la presencia del ncleo (Warhurst & Williams, 1996).Estos se clasifican en:Linfocitos: Un poco ms grandes que los eritrocitos, con un ncleo muy voluminoso que ocupacasi toda la clula. Aparece fuertemente teido de un color violeta oscuro.Monocitos: Normalmente son poco frecuentes, hay que desplazarse por la preparacin paraencontrar alguno. Tienen un ncleo muy grande y redondeado que aparece teido en colorvioleta.Polimorfonucleares: Presentan el ncleo fragmentado, como lbulos grandes.Eosinfilos: Son granulocitos poco abundantes de color rojizo y el ncleo teido de color azulmarino. Estas clulas aumentan su nmero en caso de parasitosis o alergia.Basfilos: Presentan un ncleo teido de rojo y grnulos en el citoplasma teidos de color azuloscuro.


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Fig. 10: Tcnica del frotis sanguneo extendiendo la gota de sangre de un extremo al otro de un portaobjeto.

Fig. 11: Morfologa celular y ncleo de las clulas sanguneas (extrado de "Prcticas de citologa").

Material a utilizarMaterial biolgico ConsumiblesSangre humana Etanol 70 %

Agua destilada (A. dest.)Material Metanol

6 Portaobjetos Colorante de Giemsa (anexo)6 Cubreobjetos Guantes de latex2 Lancetas estriles Papel de cocina1 Soporte de tincin (recipiente rectangular de plstico,

10 - 15 cm largo y 5 - 10 cm de ancho)Equipo

1 Cinta adhesiva 1 Microscopio2 Aplicadores de madera largos (del mismo ancho que

el soporte de tincin)1 Mechero Bunsen


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ProcedimientoNota: En esta prctica se usa guantes.

Fijacin1. Colocar una servilleta de papel sobre la superficie donde se trabaja.2. Colocar los 6 portaobjetos desengrasados sobre la servilleta.3. Lavar y limpiar con un antisptico el extremo libre del dedo ndice.4. Con la lanceta pinchar rpidamente el extremo del dedo.5. Apretar la punta del dedo hasta lograr ver una gota de sangre.6. Colocar una gota de sangre en el extremo de uno de los portaobjetos.7. Seguidamente colocar un portaobjeto como lo indica Fig. 10 y deslizarlo de un extremo al

otro. Slo debe pasarse una vez de forma continua e ininterrumpida.8. Repetir la operacin con 2 portaobjetos ms, con el fin de seleccionar la mejor tincin.9. Secar al aire las extensiones lo ms rpido posible. La desecacin se facilita con un

movimiento en forma de abanico, nunca soplando ni usando calor. La rpida desecacinevita la deformacin de las clulas sanguneas.

10. Depositar el portaobjeto con la extensin de sangre encima del soporte de tinciones.11. Depositar sobre la extensin unas gotas de metanol y esperar que se evapore.

Tincin1. Una vez evaporado el metanol, depositar unas gotas de Giemsa (vase anexo I) cubriendo

toda la extensin, evitar desecacin y esperar 5 min.2. Lavar con A. dest. la preparacin hasta que arrastre todo el colorante.3. Secar al aire o bien al calor dbil de la flama del mechero.4. Colocar el cubreobjeto y observar al microscopio iniciando con 40x y despus con 100x.5. Identificar las clulas sanguneas de acuerdo a la Fig. 11.

Nota: Esta tcnica es muy til en anlisis clnicos para el conteo de clulas sanguneas ycomparar los resultados con valores estandarizados. En esta prctica no se tiene tal objetivo.


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Eliminacin de residuos biolgicos1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %.2. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 %

por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para serreutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos sedesechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso.

3. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgicoinfeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).

Resultados1. Dibujar y nombrar los diferentes tipos de clulas sanguneas con el ncleo correspondiente.


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Observaciones

Conclusiones

Cuestionario1. Qu otras estructuras internas celulares eucariotas se podran observar al microscopio decampo claro? Por qu?

2. Cul estructura interna es la ms notable dentro del compartimento de una clula vegetal?

3. Enliste las estructuras internas que constituyen a las clulas eucariotas y distinga cada una deellas de acuerdo al tipo de clula animal, vegetal y hongos.

Referencias bibliogrficas1. Warhurst D.C., Williams J.E. (1996): Laboratory diagnosis of malaria. J. Clin. Pathol., 49:

533-5382. Prcticas de Citologa (2007). Disponible en:

http://www.juntadeandalucia.es/averroes/averroes/html/adjuntos/2007/12/13/0003/frotissangre.html

Prctica de Biologa Celular Tejidos

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Prctica 7

Fijacin y tincin de tejidos animales


ObjetivoComprender los conceptos y tcnicas histolgicas bsicas usadas para el estudio de tejidosanimales.

IntroduccinConceptos bsicos:Un tejido es un conjunto de clulas con caractersticas estructurales y funcionales similares, quese organizan de una forma especfica y provienen de una capa germinal en comn.Un rgano es una estructura anatmicamente distinguible, formada por diferentes tejidos, quecumplen con una funcin en comn (corazn, rin etc).Un aparato o un sistema es un conjunto de rganos para cumplir una funcin en comn (aparatodigestivo, sistema sanguneo, sistema inmunitario etc).Tejidos bsicosSe pueden diferenciar cinco tejidos bsicos:1. Tejido epitelial2. Tejido conectivo3. Tejido muscular4. Sangre5. Tejido nerviosoRecientemente se consideran tambin otros criterios de clasificacin, surgidos de la disciplina:Biologa celular, por las caractersticas estructurales y funcionales de las clulas que se agrupancomo clulas contrctiles, clulas secretoras o clulas del sistema inmune (Stevens & Lowe,1997).


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Tcnicas histolgicas bsicas utilizando un microtomo: Para microscopiaptica1. Seleccionar la muestra a estudiar

2. Fijacin de la muestraLa fijacin de la muestra tiene dos objetivos:- preservar las estructuras del tejido lo ms parecido posible a su estado in-vivo (inhibir

autolisis).- aumentar la dureza de la muestra, para su posterior diseccin en cortes delgados.El fijador ms usado es una solucin acuosa de formaldehdo, sea "neutral buffered formalin" oparaformaldehdo al 4 %. Tambin se pueden usar otros fijadores (metanol, cido pcrico, etc).Los fijadores hacen que precipiten (cross-linking) las protenas tisulares.3. Inclusin en parafinaLa inclusin en parafina tiene como objetivo que la muestra tenga una dureza suficiente yhomognea para poder hacer cortes delgados. Como la parafina es inmiscible con el agua hayque deshidratar la muestra antes de incluirla en parafina. La deshidratacin de la muestra seconsigue pasndola por una serie de etanol con graduacin creciente: etanol 50 % (24 h) -etanol 70 % (8 h) - etanol 96 % (14 h) - etanol absoluto (4 h).Despus se pasa la muestra por un solvente intermedio (como xileno, benceno o tolueno, 24 h)y se introduce en un recipiente con parafina lquida durante varias horas hasta das (la parafinase mantiene lquida en una estufa a temperatura superior a su punto de fusin) hasta que laparafina se ha adherido completamente a la muestra. Finalmente, en un molde se hace unbloque de parafina que contenga la muestra y se deja solidificar a temperatura ambiente.A veces no es posible hacer la inclusin en parafina porque el proceso de deshidratacin alteraalgunas estructuras celulares que se quieren estudiar (p.ej. los lpidos, que se desnaturalizan conalcoholes durante el proceso de deshidratacin). Un cuidado especial requieren las tcnicas deinmunohistoqumica: tanto el fijador como la serie de etanol y la parafina hasta el aumento dela temperatura (mantener la parafina lquida) pueden alterar los epitopes en la muestra, quedespus no sean reconocidas por los anticuerpos especficos. En estos casos se pueden hacercortes delgados endureciendo la muestra (fijada o incluso antes de la fijacin) por congelacin.4. Corte de la muestraEl bloque de parafina, que contiene la muestra, se puede cortar en secciones delgadas de 2-5m con un microtomo (o de 5-10 m con un microtomo de congelacin). Estos cortes secolocan sobre portaobjetos para su tincin posterior.


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5. Tincin de los cortesLos diversos componentes tisulares tienen ndices de refraccin similares, y no podrandistinguirse si no se usan colorantes, que tien diferentes componentes segn su composicinqumica. Como los colorantes suelen ser hidroflicos hay que desparafinizar (p.ej. con xileno, 5min) y rehidratar los cortes, pasando los portaobjetos por una serie de etanol con graduacindecreciente: etanol absoluto (2 min) - etanol 90 % (2 min) - etanol 70 % (2 min) - etanol 50 % (2min) - agua (5 min).Despus de la rehidratacin se tien los cortes con el colorante o la mezcla de colorantesadecuados:Hematoxilina-eosina: la hematoxilina (un colorante bsico) tie las estructuras cidas (ncleo,rER) de color azul-violeta y la eosina (un colorante cido) tie las estructuras bsicas (lamayora de las protenas citoplasmticas, mitocondrias) de color rosa-rojo. Las fibras decolgeno de la matriz extracelular se tien de color rosa.Azan (Azocarmin G + Aniline blue): con esta tcnica se tie los ncleos celulares de color rojo,el citoplasma de color rosa y las fibras de colgeno de color azul. El msculo y los eritrocitosse tien de color rojo-naranja.Tricrmico de Mallroy: esta tcnica utiliza la fucsina cida que tie el citoplasma de color rosay el ncleo celular de color rojo, el azul de anilina que tie las fibras de colgeno de color azuly el naranja G que tie los eritrocitos de color naranja.van Gieson (Hematoxilina, cido pcrico, fucsina cida): esta tcnica tie los ncleos celularesde color azul oscuro-negro, el citoplasma y eritrocitos de color amarillo y las fibras decolgeno de color rojo.PAS (cido perydico, reactivo de Schiff [= fucsina bsica]): esta tcnica tie los carbohidratoscomplejos de las clulas de color rojo oscuro (p.ej. glucgeno, mucoprotenas, proteoglicanos,etc).Tinciones de lpidos: para visualizar las gotas lipdicas (lipid droplets) en las clulas (p.ej. enadipocitos) o las estructuras celulares ricas en lpidos (como la mielina) se utilizan diferentescolorantes de Sudan.Tinciones argnticas: son utilizadas para ver fibras finas de colgeno (fibras de reticulina) oclulas con prolongaciones celulares finas ricas en elementos del citoesqueleto (clulasdendrticas, axones neuronales etc.), que se tien en color negro o marrn oscuro y el fondo dela preparacin se ve dorado.


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Inmunohistoqumica: con esta tcnica se usa anticuerpos especficos dirigidos contraestructuras histolgicas o celulares dianas. El anticuerpo puede ser marcado con unfluorocromo o con una enzima, que revela un colorante (cromgeno). Si se usan anticuerposmarcados con sustancias fluorescentes hay que utilizar un microscopio de epifluorescencia paraobservar los preparados.

Despus de teir los cortes se aclara el exceso de colorantes que quede sin fijar en los tejidos y,dependiendo de la tcnica, se vuelven a deshidratar.

6. Montaje de los cortesAntes de observar los cortes al microscopio hay que preservarlos y cubrirlos con uncubreobjeto. La preservacin se logra con un montaje con resina en base de plsticos (p.ej.DPX) o aceites (p.ej. Permount). Adems, con resinas en base de plsticos se consigue quetodos los elementos (muestra-cubreobjeto-aceite de inmersin-lente) sean pticamente homo-gneos. Una vez que la resina se ha polimerizado, se puede examinar la preparacin con elmicroscopio.

Portaobjeto

MuestraResina

CubreobjetoAceite inmersin

Lente (objetivo)

Fig. 12: Sistema ptico: diferencias en los ndices de refraccin (RI) causan un deterioro de la imagen poraberracin. El sistema se compone de: lente (RI = 1,51); aceite de inmersin (RI = 1,51) o aire (RI = 1,00);cubreobjeto (RI = 1,51; crown glass); resina de plsticos (RI = 1,5) y la muestra (RI = 1,5, como la resina).Sistemas en base de agua usan aceite de inmersin especial (RI = 1,48); cubreobjeto de borosilicato (RI =1,47); resina en base de glicerol (RI = 1,48). Para objetivos con una apertura numrica (N.A.) elevada (i.e. N.A.> 1,2), la ptica es corregida por el grosor del cubreobjeto (0,17 mm).


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Material a utilizarMaterial biolgico ConsumiblesUn rgano interno de ave Etanol 70 %, 80 %, 90 % y 100 %

Material Agua destilada (A. dest.)2 Portaobjetos Hematoxilina de Harris (anexo)2 Cubreobjetos Eosina Y cida (anexo)1 Esptula acondicionada con una cuchilla de

microtomo desechableXilenoQuitaesmalte (acetona)

1 Soporte de madera de 5 x 7 x 10 cm (HWD) Mounting media1 Escalpelo Guantes de ltex1 Pinza larga (10 cm) Papel de cocina2 Clips de carpeta Equipo2 Clips normales 1 Microscopio

ProcedimientoEl estudiante de primer semestre de una carrera de Ciencias Biolgicas o de la Salud no tienelas bases ni los conocimientos para realizar este tipo de fijacin y cortes. Sin embargo si esnecesario que observe la conformacin de tejidos de los diferentes rganos humanos. En estaprctica se realiza una tcnica ms sencilla, que la descrita en la introduccin, llamada RAMP(Rapid Adhesive-Mediated Procedure), donde no se utiliza microtomo (real) sino un microtomo"casero" y rganos de aves. Finalmente tambin se observan tejidos de rganos humanospreviamente preparados con la tcnica (real) del microtomo.

Seleccin de la muestra1. Seleccionar un rgano interno de un ave (normalmente pollo o gallina) recientemente

sacrificado.2. Cortar transversalmente el rgano logrando un cuadrado de aproximadamente 4 cm2 por 2

cm de alto.

Fijacin1. En uno de los extremos de un portaobjeto pasar el pincel de un adhesivo (p.ej. Kola Loka)

dejando el adhesivo extendido en la superficie.2. Invertir el portaobjeto (adhesivo abajo) y colocarlo firmemente sobre el tejido y mantenerlo

as 10 s.


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3. Retirar el portaobjeto mediante un jaln suave pero firme y dejar secar el tejido pegado en eladhesivo por 2 a 3 min.

4. Sobre un trozo de madera de 5 cm de alto y 7 cm de ancho se coloca el portaobjeto. A unaesptula de 10 cm de ancho se fija con tornillos a los lados una cuchilla desechable de unmicrotomo (casero). Se invierte la esptula (cuchilla hacia abajo) y se corta con un ngulo de20, obteniendo una pelcula muy fina (10-20 m) que queda en el adhesivo (este pasorequiere paciencia y repeticiones).

Tincin1. Depositar unas gotas de hematoxilina (vase anexo I) sobre la pelcula y esperar 40 s.2. Lavar con A. dest.3. Cubrir la pelcula con una capa densa de etanol al 80 % y esperar 1 min.4. Eliminar el etanol y depositar unas gotas de eosina cida Y (vase anexo I) y esperar 1 min.5. Sumergir el portaobjeto con la pelcula en etanol al 90 % y despus al 100 %; aprox. 1 min

por cada inmersin (dos veces cada una).6. Para evitar perder la muestra durante el siguiente paso, se recomienda sujetarla con un clip

de carpetas, asegurando la orilla de la pelcula y la orilla del portaobjeto. Despus se colocasobre el resto de la pelcula un cubreobjeto de plstico y se sujeta con un clip normal.

7. Con la ayuda de unas pinzas sujetadas al otro extremo del portaobjeto se sumerge en unasolucin de quita-esmalte por 5-10 min.

8. Sacar el portaobjeto. Clarificarlo rpidamente con xileno.9. Retirar lentamente el clip de carpeta.10. Separar el cubreobjeto de la pelcula (en este punto la pelcula no es adherida al

cubreobjeto) y se deposita una gota de medio para montar (mounting media = es un agenteorgnico esencial para lograr una buena resolucin bajo el microscopio) sobre el tejido ysobre esta el cubreobjeto. El tejido ahora est permanentemente conservado y se puedeobservar cada vez que se desee (Fig. 12 en lugar de resina puede ser Permount).

Nota: Otros colorantes pueden ser usados como: azul de metileno, verde de metileno, azul detoluidina etc. Los tejidos que pueden ser observados de esta forma son: corazn, pulmn,trquea, hgado, rin, piel, nudo linfoide, timo etc. (Troyer et al., 2002).


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Eliminacin de residuos biolgicos1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %.2. Los tejidos utilizados en esta prctica se deben incinerar; si no se cuenta con un incinerador

se pueden autoclavar y desecharlos a la basura normal.3. Los portaobjetos y cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con

peligro biolgico infeccioso.4. La esptula con la cuchilla del microtomo se sumerge en etanol al 70 % por 20 min. Luego

lavarla con agua y por ltimo con A. dest.5. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgico

infeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).

Resultados1. Dibujar y nombrar los diferentes tipos de tejidos observados.


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Observaciones

Conclusiones

Cuestionario1. Explique qu es un microtomo?

2. Es necesario utilizar un microtomo para observar tejidos animales? Por qu?

3. Cules son las diferencias entre el corte, fijacin y tincin entre las muestras de tejidosanimales y tejidos vegetales?

4. Por qu hay que deshidratar y rehidratar la muestra durante la fijacin y tincin en latcnica del microtomo?


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5. Qu es un azetropo? Cmo se obtiene etanol absoluto? Qu es etanol desnaturalizado?

6. Por qu en la tcnica RAMP no se utiliza parafina?____________________________________________________________________________

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Referencias bibliogrficas1. Stevens A., Lowe J.S. (1997): Histologa Humana. 2a ed., Elsevier-Health Sciences Division,

Espaa. pp. 5.2. Introduccin a la Histologa. (2013).

http://wzar.unizar.es/acad/histologia/texto/TemasHistologia_I/1_1_Introduccion-Tecnicas.pdf3. Troyer D.L., Cash W.C., Provo-Klimek J., Kennedy G.A. (2002): A novel method for preparing

histology slides without a microtome. Anat. Hist. Embryol. 31:129-131

Prctica de Biologa Celular Ciclo delular

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Prctica 8

Ciclo celular: mitosis en clulas vegetales

Tipo de prctica: Equipos Duracin de la prctica: 8 d

ObjetivoObservar, identificar y aprender las diferentes fases de la mitosis en clulas vegetales.

IntroduccinCiclo celularEl objetivo del ciclo celular es generar de una clula dos clulas hijas genticamente idnticas:para eso se requiere duplicar en forma exacta la cantidad de DNA cromosmico y distribuir lascopias a las clulas hijas. Este proceso vara mucho en los distintos tipos de clulas. Porejemplo, una levadura en condiciones ideales puede dividirse en aproximadamente 2 h,mientras que una clula heptica de mamfero en ms o menos 24 h; aunque esto ocurre, enpromedio, menos de una vez por ao. El ciclo celular de eucariontes, examinado con elmicroscopio, muestra 4 fases, y los dos acontecimientos ms notables son la divisin nuclear(mitosis) y la divisin de la clula en dos (citocinesis) (Fig. 13).

MitosisEl mecanismo de la mitosis (del griego "mitos" = filamento, hilo) es semejante en todas lasclulas eucariontes, aunque existen diferencias entre clulas animales y vegetales. Durante lainterfase (G1, S y G2) la clula se prepara a la divisin celular: formar biomasa, replicar elgenoma, corroborar las condiciones adecuadas (p.ej. suficiente espacio). Durante toda la inter-fase el DNA est disperso y se observa como cordones finos. Al final de la fase G2 la clulaempieza la divisin celular (mitosis o fase M), que se puede diferenciar en cuatro etapas:profase, metafase, anafase y telofase; de stas la de mayor duracin suele tener la profase.Inicialmente el DNA se "condensa", es decir se compacta, y se forman los cromosomas, queahora son teibles (Fig. 14); cada uno consiste en dos rplicas llamadas cromtidas unidas entres por el centrmero. Dentro de ste hay estructuras proteicas, los cinetcoros. Despus loscromosomas se alinean, se separan los cromtidos a los dos polos de la clula, se re-estabilizael ncleo y se inicia con la separacin en dos clulas hijas (citocinesis). Al final la clularegresa a la fase G0, el estado fisiolgico normal.

Prctica de Biologa Celular Ciclo delular

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Fig. 13: Etapas del ciclo celular: G1 - S - G2 - Mhttp://www.acercaciencia.com/2012/10/15/ciclo-celular/

Fig. 14: Cromosoma replicado.http://genomasur.com/lecturas/Guia12b.htm

Material a utilizarMaterial biolgico Equipo20 semillas de haba con

manual pr cellbiol-v6

Documents

tincin de clulas eucariotas

clulas vegetales

manual de prcticas

soluciones isotnicas

immunodeficiency virus

uniformes especiales

batas limpias

tincin de tejidos animales