The Fluid Mosaic Model of the Structure of Cell Membranes

Cell membranes are viewed as two-dimensional solutions of oriented globular proteins and lipids.

Biological membranes play a crucial role in almost all cellular phenomena, yet our understanding of the molecular organization of membranes is still rudimentary. Experience has taught us, how- ever, that in order to achieve a satisfactory understanding of how any biological system functions, the detailed molecular composition and structure of that system must be known. While we are still a long way from such knowledge about membranes in general, progress at both the theoretical and experimental levels in recent years has brought us to a stage where at least the gross aspects of the organization of the proteins and lipids of membranes can be discerned. There are some investigators, however, who, impressed with the great diversity of membrane compositions and functions, do not think there are any useful generalizations to be made even about the gross structure of cell membranes. We do not share that view. We suggest that an analogy exists between the problems of the structure of membranes and the structure of proteins. The latter are tremendously diverse in composition, function, and detailed structure. Each kind of protein molecule is structurally unique. Nevertheless, generalizations about protein structure have been very useful in understanding the properties and functions of protein molecules. Similarly, valid generalizations may exist about the ways in which the proteins and lipids are organized in an intact membrane. The ultimate test of such generalizations, or models, is whether they are useful to explain old experiments and suggest new ones.

Singer (1) has recently examined in Dr. Singer is a professor of biology at the University of California at San Diego, La Jolla. Dr. Nicolson is a research associate at the Armand Hammer Cancer Center of the Salk Institute for Biological Studies, La Jolla, California. 720 considerable detail several models of the gross structural organization of membranes, in terms of the thermodynamics of macromolecular systems and in the light of the then available experimental evidence. From this analysis, it was concluded that a mosaic structure of alternating globular proteins and phospholipid bilayer was the only membrane model among those analyzed that was simultaneously consistent with thermodynamic restrictions and with all the experimental data available. Since that article was written, much new evidence has been published that strongly supports and extends this mosaic model. In particular, the mosaic appears to be a fluid or dynamic one and, for many purposes, is best thought of as a two- dimensional oriented viscous solution. In this article, we therefore present and discuss a fluid mosaic model of membrane structure, and propose that it is applicable to most biological membranes, such as plasmalemmal and intracellular membranes, including the membranes of different cell organelles, such as mitochondria and chloroplasts. These membranes are henceforth referred to as functional membranes. There may be some other membrane like systems, such as myelin, or the lipoprotein membranes of small animal viruses, which we suggest may be rigid, rather than fluid, mosaic structures, but such membrane systems, are not a primary concern of this article. Our objectives are (i) to review briefly some of the thermodynamics of macro- molecular, and particularly membrane, systems in an aqueous environment; (ii) to

discuss some of the properties of the proteins and lipids of functional membranes; (iii) to describe the fluid mosaic model in detail; (iv) to analyze some of the recent and more direct experimental evidence in terms of the model; and (v) to show that the fluid mosaic model suggests new ways of thinking about membrane functions and membrane phenomena.

Thermodynamics and Membrane Structure

The fluid mosaic model has evolved by a series of stages from earlier versions (1-4). Thermodynamic considerations about membranes and membrane components initiated, and are still central to, these developments. These considerations derived from two decades of intensive studies of protein and nucleic acid structures; the thermodynamic principles involved, however, are perfectly general and apply to any macro-molecular system in an aqueous environment. These principles and their application to membrane systems have been examined in detail elsewhere (1) and are only summarized here. For our present purposes, two kinds of non- covalent interactions are most important, hydrophobic (5) and hydrophilic (1). By hydrophobic interactions is meant a set of thermodynamic factors that are responsible for the sequestering of hydrophobic or nonpolar groups away from water, as, for example, the immiscibility of hydrocarbons and water. To be specific, it requires the expenditure of 2.6 kilocalories of free energy to transfer a mole of methane from a nonpolar medium to water at 25?C (5). Free energy contributions of this magnitude, summed over the many nonpolar amino acid residues of soluble proteins, are no doubt of primary importance in determining the conformations that protein molecules adopt in aqueous solution (6), in which the non- polar residues are predominantly sequestered in the interior of the molecules away from contact with water. By hydrophilic interactions is meant a set of thermodynamic factors that are responsible for the preference of ionic and polar groups for an aqueous rather than a nonpolar environment. For example, the free energy required to transfer a mole of zwitterionic glycine from water to acetone is about 6.0 kcal at 25?C, showing that ion pairs strongly prefer to be in water than in a non-polar medium (1). These and related free energy terms no doubt provide the reasons why essentially all the ionic residues of protein molecules are observed to be in contact with water, usually on the outer surface of the molecule, according to x-ray crystallographic studies. Similar thermodynamic arguments apply to saccharide residues (1). It requires the expenditure of substantial free energy to transfer a simple saccharide from water to a nonpolar solvent, and such residues will therefore be in a lower free energy state in con tact with water than in a less polar environment. There are other non- covalent inter- actions, such as hydrogen bonding and electrostatic interactions, which also contribute to determine macromolecular structure. However, with respect to gross structure, with which we are now concerned, these are very likely of secondary magnitude compared to hydrophobic and hydrophilic interactions. The familiar phospholipid bilayer structure illustrates the combined effects of hydrophobic and hydrophilic interactions. In this structure (Fig. 1) The nonpolar fatty acid chains of the phospholipids are sequestered together away from contact with water, thereby maximizing hydrophobic interactions. Furthermore, the ionic and zwitterionic groups are in direct contact with the aqueous phase at the exterior surfaces of the bilayer,

thereby maximizing hydrophilic interactions. In the case of zwitterionic phospholipids such as phosphatidylcholine, dipole-dipole interactions between ion pairs at the surface of the bilayer may also contribute to the stabilization of the bilayer structure. In applying these thermodynamic principles to membranes, we recognize first that of the three major classes of membrane components-proteins, lipids, and oligosaccharides-the proteinsare predominant. The ratio by weightof proteins to lipids ranges from about 1.5 to 4 for those functional membranes which have been well characterized [compare (7)]. A substantial fraction of this protein most probably plays an important role in determining the structure of membranes, and the structural properties of these proteins are therefore of first-order importance. Membrane proteins are considered in some detail in the following section. At this juncture, the significant point is that if hydrophobic and hydrophilic interactions are to be maximized and the lowest free energy state is to be attained for the intact membrane in an aqueous environment, the nonpolar amino acid residues of the proteins- along with the fatty acid chains of the phospholipids-should be sequestered (to the maximum extent feasible) from contact with water, while the ionic and polar groups of the proteins-along with those of the lipids and the oligosaccharides-should be in contact with the aqueous solvent. These requirements place restrictions on models of membrane structure; in particular, they render highly unlikely the classical model of a trilaminar arrangement of a continuouslipid bilayer sandwiched between two monolayers of protein. The latter model is thermodynamically unstable because not only are the nonpolar amino acid residues of the membrane proteins in this model perforce largely exposed to water but the ionic and polar groups of the lipid are sequestered by a layer of protein from contact with water. Therefore, neither hydrophobic nor hydrophilic interactions are maximized in the classical model.

Some Properties of Membrane Components

Peripheral and integral proteins. It seems both reasonable and important to discriminate between two categories of proteins bound to membranes, which we have termed peripheral and integral proteins (1). Peripheral proteins may be characterized by the following criteria. (i) They require only mild treatments, such as an increase in the ionic strength of the medium or the addition of a chelating agent, to dissociate them molecularly intact from the membrane; (ii) they dissociate free of lipids; and (iii) in the dissociated state they are relatively soluble in neutral aqueous buffers. These criteria suggest that a peripheral protein is held to the membrane only by rather weak monovalent (perhaps mainly electrostatic) interactions andis not strongly associated with membrane lipid. The cytochrome c of mitochondrial membranes, which can be dissociated free of lipids by high salt concentrations, and the protein spectrin(8) of erythrocyte membranes, which can be removed by chelating agents under mild conditions, are examples of membrane proteins that satisfy the criteria for peripheral proteins. On the other hand, the major portion (>70 percent) of the proteins of most membranes have different characteristics, which may be assigned to integral proteins: (i) they require much more drastic treatments, with reagents such as detergents, bile acids, protein denaturants, or organic solvents, to dissociate them from membranes; (ii) in many instances, they remain associated with lipids when isolated; (iii) if completely freed of lipids, they are usually

highly insoluble or aggregated in neutral aqueous buffers (9). The distinction between peripheral and integral proteins may be useful in several regards. It is assumed that only the integral proteins are critical to the structural integrity of membranes. Therefore, the properties and interactions of peripheral proteins, while interesting in their own right, may not be directly relevant to the central problems of membrane structure. The properties of cytochrome c, for example, may not be typical of mitochondrial membrane proteins. Furthermore, the biosynthesis of peripheral and integral proteins and their attachment to the membrane may be very different processes. This is not the appropriate occasion to discuss membrane biogenesis in any detail, but it may be significant that, although cytochrome c is a mitochondrial protein, it is synthesized on cytoplasmic rather than mitochondrial ribosomes; in fact only a small fraction of the total mitochondrial protein (perhaps only the integral proteins of the inner mitochondrial membrane?) appears to be synthesized on mitochondrial ribosomes (10). In any event, because of the relatively unimportant membrane structural role assigned to the peripheral proteins, they are not a primary concern of this article. Propertiesof integral proteins. Since the proteins we have classified as integral, according to the criteria specified, constitute the major fraction of membrane proteins, we assume that the properties to be discussed apply to the integral proteins. 1) For several well-characterized membrane systems, including erythrocyte and other plasma membranes, and mitochondrial membranes, the proteins has been shown to be grossly heterogeneous with respect to molecularweights (11). There is no convincing evidence that there exists one predominant type of membrane protein that is specifically a structural protein; recent reports to the contrary have been with- drawn. We consider this heterogeneity to be more significant for a general model of membrane structure than the fact that in a few specialized instances, as in the case of disk membranes of retinal rod outer segments (12, 13), a single protein species predominates. A satisfactory membrane model must be capable of explaining the heterogeneity of the integral membrane proteins. 2) The proteins of a variety of intact membranes, on the average, show appreciable amounts of the a-helical conformation, as was first shown iby Key (14), Wallach and Zahler (4), and Lenard and Singer (3). For example, circular dichroism measurements of aqueous suspensions of intact and mechanically fragmented human erythrocyte membranes (provided that we take into account certain optical anomalies of these measurements) reveal that about 40 percent of the protein is in the right-handed a-helical conformation (15). Most soluble globular proteins whose circular dichroism spectra have been obtained exhibit a smaller fraction of a-helix in their native structures. This suggests that the integral proteins in intact membranes are largely globular in shape rather than spread out as monolayers. On the other hand, a membrane model in which such globular proteins are attached to the outer surfaces of a lipid bilayer (16) would not be satisfactory because, among other reasons, it would require membrane thicknesses much larger than the 75 to 90 angstroms generally observed. A model in which globular protein molecules are intercalated within the membrane would, however, meet these restrictions. The phospholipids of membranes. There is now substantial evidence that the major portion of the phospholipids is in bilayer form in a variety of intact membranes. For example, differential calorimetry of intact

mycoplasma membranes shows that they undergo a phase transition in a temperature range very similar to that of aqueous dispersions of the phospholipids extracted from the membranes (16, 17). Thus the structures of the lipid in the membrane and of the lipid in isolated aqueous dispersion are closely similar; presumably the latter is the bilayer form. This conclusion is supported iby x-ray diffraction '(18) and spiraled studies(19) on similar membrane preparations. The bilayer character of membrane lipids rules out models such as that of Benson (20) in which the proteins and lipids form a single-phase lipoprotein subunit that is repeated indefinitely in two dimensions to constitute the membrane. In such a model, most of the lipids would be expected to have distinctly different properties from those of a bilayer. Two qualifications should be stressed, however, concerning the bilayer form of membrane lipids. (i) None of the evidence so far obtained for the bilayer form permits us to say whether the bilayer is continuous or interrupted (1). The calorimetrically observed phase transitions, for example, occur over a broad temperature interval, allowing the possibility that the cooperative unit involved in the phase transition is quite small, consisting perhaps of only 100 lipid molecules on the average. (ii) None of the experiments mentioned above is sufficiently sensitive and quantitative to prove whether 100 percent of the phospholipid is in the bilayer form. It is therefore not excluded that some significant fraction of the phospholipid (perhaps as much as 30 percent) is physically in a different state from the rest of the lipid. Protein-lipid interactions in membranes. Several kinds of experiments indicate that protein-lipid interactions play a direct role in a variety of membrane functions. Many membrane- bound enzymes and antigens require lipids, often specific phospholipids, for the expression of their activities [see table 2 in (21)]. Furthermore, the nature of the fatty acids incorporated into phospholipids affects the function of certain membrane-bound proteins in bacterial membranes (22). On the other hand, the calorimetric data discussed above give no significant indication that the association of proteins with the phospholipids of intact membranes affects the phase transitions of the phospholipids themselves. Experiments with phospholipase C and membranes have shown that the enzymic release of 70 percent of the phosphorylated amines from intact erythrocyte membranes profoundly perturbs the physical state of the residual fatty acid chains, but has no detectable effect (as measured by circular dichroism spectra) on the average con- formation of the membrane proteins (2). Such results therefore suggest that the phospholipids and proteins of membranes do not interact strongly; in fact, they appear to be largely independent. This paradox, that different types of experiments suggest strong protein-lipid interactions on the one hand, and weak or no interactions on the other, can be resolved in a manner consistent with all the data if it is proposed that, while the largest portion of the phospholipid is in bilayer form and not strongly coupled to proteins in the membrane, a small fraction of the lipid is more tightly coupled to protein. With any one membrane protein, the tightly coupled lipid might be specific; that is, the interaction might require that the phospholipid contain specific fatty acid chains or particular polar head groups. There is at present, however, no satisfactory direct evidence for such a distinctive lipid fraction. This problem is considered again in connection with a discussion of the experiments of Wilson and Fox (23).

Fluid Mosaic Model

Mosaic structure of the proteins and lipids of membranes. The thermodynamic considerations and experimental results so far discussed fit in with the idea of a mosaic structure for membranes (1-3, 24) in which globular molecules of the integral proteins (perhaps in particular instances attached to oligosaccharides to form glycoproteins, or interacting strongly with specific lipids to form lipoproteins) alternate with sections of phospholipid bilayer in the cross section of the membrane (Fig. 2). The globular protein molecules are postulated to be amphipathic (3, 4) as are the phospholipids. That is, they are structurally asymmetric, with one highly polar end and one nonpolar end. The highly polar region is one in which the ionic amino acid residues and any covalently bound saccharide residues are clustered, and which is in contact with the aqueous phase in the intact membrane; the nonpolar region is devoid of ionic and saccharide residues, contains many of the nonpolar residues, and is embedded in the hydrophobic interior of the membrane. The amphipathic structure adopted by a particular integral protein (or lipoprotein) molecule, and therefore the extent to which it is embedded in the membrane, are under thermodynamic control; that is, they are determined by the amino acid sequence and covalent structure of the protein, and by its interactions with its molecular environment, so that the free energy of the system as a whole is at a minimum. An integral protein molecule with the appropriate size and structure, or a suitable aggregate of integral proteins (below) may transverse the entire membrane (3); that is, they have regions in contact with the aqueous solvent on both sides of the membrane. It is clear from these considerations that different proteins, if they have the appropriate amino acid sequence to adopt an amphipathic structure, can be integral proteins of membranes; in this manner, the heterogeneity of the proteins of most functional membranes can be rationalized. The same considerations may also ex- plain why some proteins are membrane- bound and others are freely soluble in the cytoplasm. The difference may be that either the amino acid sequence of the particular protein allows it to adopt an amphipathic structure or, on the contrary, to adopt a structure in which the distribution of ionic groups is nearly spherically symmetrical, in the lowest free energy state of the system. If the ionic distribution on the protein surface were symmetrical, the protein would be capable of interacting strongly with water all over its exterior surface, that is, it would be a monodisperse soluble protein. The mosaic structure can be readily diversified in several ways. Although the nature of this diversification is a matter of speculation, it is important to recognize that the mosaic structure need not be restricted by the schematic representation in Fig. 2. Protein-protein interactions that are not explicitly considered in Fig. 2 maybe important in determining the properties of the membrane. Such interactions may result either in the specific binding of a peripheral protein to the exterior ex- posed surface of a particular integral protein or in the association of two or more integral protein subunits to form a specific aggregate within the membrane. These features can be accommodated in Fig. 2 without any changes in the basic structure. The phospholipids ofthe mosaicstructure are predominantly arranged as an interrupted bilayer, with their ionic and polar head groups in contact with the aqueous phase. As has been discussed, however, a small portion of the lipid may be more intimately associated with the integral proteins. This feature is not explicitly indicated in Fig. 2. The thickness of a mosaic membrane would vary along the

surface from that across a phospholipid bilayer region to that across a protein region, with an average value that could be expected to correspond reasonably well to experimentally measured membrane thicknesses. Matrix of the mosaic: lipid or protein? In the cross section of the mosaic structure represented in Fig. 2, it is not indicated whether it is the protein or the phospholipid that provides the matrix of the mosaic. In other words, which component is the mortar, which the bricks? This question must be answered when the third dimension of the mosaic structure is specified. Trhese two types of mosaic structure maybe expected to have very different structural and functionalproperties, and the question is therefore a critical one. It is our hypothesis that functional cell membranes have a long-range mosaic structure with the lipids constituting the matrix, as is shown in Fig. 3. Supporting evidence is discussed later. At this point, let us consider some of the consequences of this hypothesis. 1) There should generally be no long- range order in a mosaic membrane with a lipid matrix. By long range, we mean over distances of the order of a few tenths of a micrometer and greater. Suppose we have a membrane preparation containing many different protein species, and suppose further that 10,000 molecules of protein A are present in the membrane of a single cell or organelle. How is protein A distributed over the membrane surface? If the membrane proteins formed the matrix of the mosaic, defined by specific contacts between the molecules of different integral proteins, protein A might be distributed in a highly ordered, two- dimensional array on the surface. On the other hand, if lipid formed the matrix of the mosaic, there would be no long-range interactions intrinsic to the membrane influencing the distribution of A molecules, and they should there- fore be distributed in an aperiodic random arrangement on the membrane surface. The absence of long-range order should not be taken to imply an absence of short-range order in the membrane. It is very likely that such short-range order does exist, as, for example, among at least some components of the electron transport chain in the mitochondrial inner membrane. Such short- range order is probably mediated by specific protein (and perhaps protein- lipid) interactions leading to the formation of stoichiometric ally defined aggregates within the membrane. How- ever, in a mosaic membrane with a lipid matrix, the long-range distribution of such aggregates would be expected to be random over the entire surface of the membrane. The objection may immediately be raised that long-range order clearly exists in certain cases where differentiated structures (for example, synapses) are found within a membrane. We suggest, in such special cases, either that short-range specific interactions among integral proteins result in the formation of an unusually large two-dimensional aggregate or that some agent extrinsic to the membrane (either inside or outside the cell) interacts multiply with specific integral proteins to produce a clustering of those proteins in a limited 724 area of the membrane surface. In other words, we suggest that long-range random arrangements in membranes are the norm; wherever nonrandom distributions are found, mechanisms must exist which are responsible for them. 2) It has been shown that, under physiological conditions, the lipids of functional cell membranes are in a fluid rather than a crystalline state. (This is not true of myelin, however.) This evidence comes from a variety of sources, such as spin-labeling experiments (25), x-ray diffraction studies (18), and differential

calorimetry (16, 17). If a membrane consisted of integral proteins dispersed in a fluid lipid matrix, the membrane would in effect be a two- dimensional liquid-like solution of monomeric or aggregated integral proteins (or lipoproteins) dissolved in the lipid bilayer. The mosaic structure would be a dynamic rather than a static one. The integral proteins would be expected to undergo translational diffusion within the membrane, at rates determined in part by the effective viscosity of the lipid, unless they were tied down by some specific interactions intrinsic or extrinsic to the membrane. However, because of their amphipathic structures, the integral proteins would maintain their molecular orientation and their degree of intercalation in the membrane while undergoing translational diffusion in the plane of the membrane (as dis- cussed below). In contrast, if the matrix of the mosaic were constituted of integral proteins, the long-range structure of the membrane would be essentially static. Large energies of activation would be required for a protein component to diffuse in the plane of the membrane from one region to a distant one because of the many monovalent bonds between the proteins that would have to be simultaneously broken for ex- change to take place. Therefore, a mosaic membrane with a protein matrix should make for a relatively rigid structure with essentially no translational diffusion of its protein components within the membrane. From the discussion in this and the previous section, it is clear that the fluid mosaic model suggests a set of structural properties for functional membranes at least some of which can be tested experimentally. In an earlier article (1), a large body of experimental evidence was examined for its relevance to models of membrane structure. It was concluded that a mosaic structure was most consistent with the available evidence. Some more recent results, however, bear even more directly on the problem, and only this evidence is discussed below.

Some Recent Experimental Evidence

Evidence for proteins embedded in membranes. One proposal of the fluid mosaic model is that an integral protein is a globular molecule having a significant fraction of its volume embedded in the membrane. The results of recent freeze-etching experiments with membranes strongly suggest that a substantial amount of protein is deeply embedded in many functional membranes. In this technique (26) a frozen specimen is fractured with a microtome knife; some of the frozen water is sub- limed (etched) from the fractured surface if desired; the surface is then shadow cast with metal, and the surface replica is examined in the electron microscope. By this method the topography of the cleaved surface is revealed. A characteristic feature of the exposed surface of most functional membranes examined by this technique, including plasmalemmal, vacuolar, nuclear, chloroplast, mitochondrial, and bacterial membranes (27, 28), is a mosaic-like structure consisting of a smooth matrix interrupted by a large number of particles. These particles have a fairly characteristic uniform size for a particular membrane, for example, about 85-A diameter for erythrocyte membranes. Such surfaces result from the cleavage of a membrane along its interior hydrophobic face (29). This interior face (Fig. 2) corresponds to the plane indicated by the arrow. If cleavage were to occur smoothly between the two layers of phospholipid in the

bilayer regions, but were to circumvent the protein molecules penetrating the mid-plane of the membrane, then the alternating smooth and particulate regions observed on the freeze-etch surfaces can be readily explained by a mosaic structure for the membrane (Fig. 2), provided that the particles can be shown to be protein in nature. That the particles are indeed protein has been suggested by recent experiments (30). Another consequence of the mosaic model, suggested from its inception (3), is that certain integral proteins possessing the appropriate size and structure may span the entire thickness of the membrane and be exposed at both membrane surfaces. Chemical evidence that a trans-membrane protein, whose molecular weight is about 100,000, is present in large amounts in the human erythrocyte membrane has been obtained by two independent methods- one involving proteolysis of normal compared to everted membranes (31), and the other specific chemical labeling of the membrane proteins !(32). Distribution of components in the plane of the membrane. A prediction of the fluid mosaic model is that the two-dimensional long-range distribution of any integral protein in the plane of the membrane is essentially random. To test this prediction, we have developed and applied electron microscopic techniques to visualize the distribution of specific membrane antigens over large areas of their membrane surfaces (33) and have so far studied the distribution *of the Rhd(D) antigen on human erythrocyte membranes (34), and of H-2 histocompatibility alloantigens on mouse erythrocyte membranes (35). In the case of the Rho(D) antigen, for example, cells of 0, Rh-positive type were reacted with a saturating amount of 125I-labeled purified human antibody to Rho(D) [anti-Rlho(D)], and the treated (sensitized) cells were lysed at an air-water interface, so that the cell membranes were spread out flat. The flattened membranes, after being picked up on an electron microscope grid, were treated with the specific "indirect stain," ferritin-conjugated goat antibodies specific for human y-globulin. Thus, wherever the human anti-Rho (D) molecules were bound to the Rho (D) antigen on the membrane surface, the ferritin-labeled goat antibodies be- came specifically attached. In otherwords, the human y-globulin antibody now functioned as an antigen for the goat antibodies (Fig. 4). The ferritin was distributed in discrete clusters, each containing two to eight ferritin moleclues within a circle of radius about 300 A. The numblers of such clusters per unit area of the membrane surface corresponded to the number of 125I- labeled human anti-Rho(D) molecules bound per unit area. This indicates that each ferritin cluster was bound to a single anti-Rho(D) molecule, and a cluster represents the number of goat antibody molecules bound to a single human y-globulin molecule. Each cluster therefore corresponds to a single Rho(D) antigen site (36) on the membrane. Since the clusters were distributed in a random array, we conclude that the Rho(D) antigen, which exhibits properties of an integral protein (37), is molecularly dispersed and is distributed in a random ,two-dimensional array on the human erythrocyte membrane. Similar experiments were carried out withthe H-2 alloantigenic sites on mouse erythrocyte membranes. In this case (Fig. 5) the clusters -of ferritin molecules of the indirect stain were not isolated, as in the case of the Rho(D) antigen, but instead occurred in patches. The patchy distribution of the H-2 histocompatibility alloantigenic sites had earlier been observed by different techniques (38), but the two-dimensional distribution of the patches could not be ascertained. In

ourexperiments, the patches contained variable numbers of clusters, and were arranged in an irregular two-dimensional array on the membrane surface. The histocompatibility antigen appears to be glycoprotein in nature (39). The long-range distrilbution of both the Rho(D) and H-2 histocompatibility antigens on their respective membrane surfaces, therefore are in accord with the prediction of the fluid mosaic model that the integral proteins of membranes are randomly arranged in two dimensions. The particles on the inner membrane faces revealed by freeze-etching experiments, which (as discussed above) are probably protein in nature, are generally also relatively randomly distributed in two dimensions. Evidence that proteins are in a fluid state in intact membranes. An important series of experiments has been carried out (12, 40-44) with receptor disk membranes from the retina of the frog. This membrane system is unusual in that it contains as its predominant, if not only, protein component the pigment rhodopsin. In electron microscopy of the negatively stained surfaces of the dried membranes, a somewhat tightly packed and ordered array of particles (about 40 A) was observed. These particles are the individual rhodopsin molecules. Although the earlier studies suggested that there was a long-range order in the distribution of the particles (40), more recent x-ray diffraction data (42) on pellets of wet, receptor disk membranes showed that only a few orders of reflection were observed corresponding to the spacings of the rhodopsin molecules in the plane of the membrane. This indicated that a non- crystalline, aperiodic arrangement of the particles existed in the plane of the membrane. Furthermore, the temperature dependence of the characteristics of the x-ray diffraction maxima were consistent with the suggestion that the particles were in a planar liquid-like state in the intact membrane. ,Additional support for the existence of this liquid- like state was the observation that the absorption of a foreign protein (bovine serum albumin) to the membrane could definitely alter the x-ray spacings due to the rhodopsin particles; that is, the distribution of the rhodopsin molecules in the plane of the membrane was radically altered by the weak binding of the albumin. This alteration would not be expected if a rigid lattice structure of The rhodopsin molecules, or aggregates, were present in the plane of the membrane, These studies are particularly noteworthy because they involved a membrane which, by conventional electron microscopic techniques, appears to show long-range periodicity over its surface. Other specialized membranes have also exhibited ordered electron micrographic images of their surfaces [compare (43)]. However, it is likely that a very concentrated two-dimensional fluid solution of identical protein molecules will appear, when dried, to be arranged in an ordered array, particularly when optical tricks are used to enhance the apparent order (43). What is really a fluid phase may therefore artifactually be made 'to appear as a crystalline solid. This appears to be the situation with the retinal receptor disk membranes. A major contribution to membrane studies has been made by Frye and Edidin (44), who investigated the membrane properties of some cell fusion heterokaryons. Human and mouse cells in culture were induced to fuse with one another, with Sendai virus as the fusing agent. The distribution of human and mouse antigenic components of the fused cell membranes was then deter- mined by immunofluorescence, with the use of rabbit antibodies directed to the whole human cells, mouse antibodies directed against the H-2 alloantigen on the mouse cell membranes, and, as indirect stains, goat antiserum to rabbit y-glolbulin and goat antiserum to mouse

y-globulin labeled with two different fluorescent dyes. Shortly after cell fusion, the mouse and human antigenic components were largely segregated in different halves of the fused cell membranes; but after about 40 minutes at 37?C the components were essentially completely intermixed. Inhibitors of protein synthesis, of adenosine triphosphate (ATP) formation, and of glutamine-dependent synthetic pathways, ap- plied before or after cell fusion, had no effect on the rate of this intermixing process, but lowering the temperature below 15?C sharply decreased it. Frye and Edidin (44) suggest that the intermixing of membrane components is due to diffusion of these components within the membrane, rather than to their removal and reinsertion, or to the synthesis and insertion of new copies of these components, into the heterokaryon membrane. An unexplained finding of these experiments was the fairly frequent occurrence, at early and intermediate times after cell fusion, of heterokaryon membranes in which the human antigenic components were uniformly distributed over the membrane surface but the mouse components were still largely segregated to about half the membrane (Ml/2-H1 cells). On the other hand, the reverse situation, with the mouse antigenic components uniformly spread out over the membrane and the human components segregated (M1-H1/2), was only rarely observed. This result can now be explained by a diffusion mechanism for the intermixing process, as follows. The antibodies to the human cell membrane were no doubt directed to a heterogeneous set of antigens, whereas the anti- bodies ito the mouse cell were directed specifically to the histocompatibility alloantigen. However, the histocompatibility antigens occur as large aggregates in the membrane (Fig. 5), and might thereforebe expected to diffuse more slowly than a complex mixture of largely aggregated human antigens in the membrane. Thus, at appropriate intermediate times after cell fusion, significant numbers of (M1/2-HI) but not of (Ml-HI/2) fused cells might appear, to be converted at longer times to cells with completely intermixed components. A rough estimate may be made of the average effective diffusion constant required of the membrane components to account for the kinetics of intermixing in the Frye-Edidin experiments. Taking the average distance of migration, x, to have been about 5 micrometers in a time, t, of 40 minutes gives an apparent diffusion constant, D=x2/ 2t, of 5 X 10-11 cm2/sec. For comparison, the diffusion constant of hemoglobin in aqueous solutions is about 7 X 10-7 cm2/sec. The apparent effective viscosity of the membrane fluid phase is therefore about 103 to 104 times that of water. The Frye-Edidin experiments can be rationalized by the fluid mosaic model of membrane structure as being the result of the free diffusion and intermixing of the lipids and the proteins (or lipoproteins) within the fluid lipid matrix. Some experiments, however, appear to suggest that the lipids of membranes are not readily interchangeable within the membrane and are therefore not free to diffuse independently. For example, Wilson and Fox (23) have studied the induction of /l-galactosideand 8/-glucoside transport systems in mutants of Escherichia coli that cannot synthesize unsaturated fatty acids. Such fatty acids can be incorporated into phospholipids, however, if they are supplied in the growth medium. When cells were grown in particular fatty acid supplements and induced for the synthesis of the transport systems, the effect of temperature on the transport rate was characteristic of that fatty acid. If, then, the cells were first grown in medium containing oleic acid and then shifted to growth in a

medium supplemented with linoleic acid during a brief period of induction of either of the transport systems, the effect of temperature on transport was said to be characteristic of cells grown continually in the linoleic acid medium. In other words, although most of the phopholipids of the membrane contained oleic acid chains, these did not appear to exchange with the newly synthesized small amounts of phospholipids containing linoleic acid chains. These experiments, however, do not necessarily contradict the thesis that most of the phospholipids of membranes are freely diffusible and, hence, exchangeable. For example, each of the two transport systems might be organized in the membrane as a specific protein aggregate containing intercalated and strongly bound phospholipid components. If such lipoprotein aggregates had first to be assembled in order to be incorporated into the bulk lipid matrix of the membrane, the results of Wilson and Fox would be anticipated. In particular, the small fraction of the membrane phospholipid that was strongly bound, and perhaps segregated in such aggregates from the bulk of the membrane lipid, might not exchange rapidly with the bulk lipid. The Wilson- Fox experiments therefore do not require that the major part of the membrane phospholipid be static, but only that a small fraction of the lipids be structurally differentiated from the rest. The structural differentiation of some of the membrane lipid by strong binding to integral proteins is a possibility that was discussed above. The observations of Wilson and Fox, that there is a significant coupling of lipid and protein incorporation into membranes, appear to be a special case. The experiments of Mindich (45) demonstrate that more generally lipid and protein incorporation into bacterial membranes can occur independently, and 'that quite wide variations in the ratio of lipids and proteins in the membrane can be produced in vivo, as might be expected from the fluid mosaic model of membrane structure. The asymmetry of membranes. A substantial amount of evidence has ac- cumulated showing that the two surfaces of membranes are not identical in composition or structure. One aspect of this asymmetry is the distribution of oligosaccharides on the two surfaces of membranes. There exist plant proteins, called lectins or plant agglutinins, which bind to specific sugar residues, and, as a result, can cause the agglutination of cells bearing the sugar residues on their surfaces. By conjugating several such agglutinins to ferritin, we have been able to visualize the distribution of oligosaccharides on membranes in the electron microscope (33). For example, the ferritin conjugate of concanavalin A, a protein agglutinin that binds specifically to terminal a-D-glucopyranosyl or a-D- mannopyranosyl residues (46), attaches specifically to the outer surface of erythrocyte membranes and not at all to the inner cytoplasmic surface (33). A similar, completely asymmetric distribution of ferritin conjugates of ricin (a protein agglutinin) on the membranes of rabbit erythrocytes is shown in Fig. 6. Ricin binds specifically to terminal f/-D-galactopyranosyl and sterically related sugar residues (47). Such asymmetry has now been observed with several ferritin-conjugated agglutinins and a number of different mammalian cell plasma membranes (48). These findings extend earlier results obtained by different methods (49). The foregoing observations bear on many problems, including cell-cell inter- actions and membrane biogenesis (50). In the context of this article, however, the absence of oligosaccharides on inner membrane surfaces indicates that rotational

transitions of the glycoproteins of erythrocyte and other plasma membranes from the outer to the inner surfaces must occur at only negligibly slow rates. This conclusion probably applies to membrane proteins other than glycoproteins; for example, the Na,K-dependent and Mg-dependent adenosine triphosphatase activities of erythrocyte membranes are exclusively localized to the inner cytoplasmic surfaces (51). Individual molecules of spin- labeled zwitterionic and anionic phospholipids also exhibit very slow inside-outside transitions in synthetic vesicles of phospholipid bilayers (52). The very slow or negligible rates of such transitions can be explained by the mosaic model and the thermodynamic arguments already discussed. If the integral proteins (including the glycoproteins) in intact membranes have, like the phospholipids, an amphipathic structure, a large free energy of activation would be required to rotate the ionic and polar regions of the proteins through the hydrophobic interior of the membrane to the other side. To accommodate the fluid mosaic model to these conclusions concerning asymmetry, we specify that, while the two-dimensional translational diffusion of the integral proteins and the phospholipids of membranes occurs freely, the rotational diffusion of these components is generally restricted to axes perpendicular to the plane of the membrane; that is, in general, molecular tumbling does not occur at significant rates within the membrane. The asymmetry of the membrane introduces another factor into the problem of translational diffusion of membrane components. In the experiments of Frye and Edidin (44) only those membrane antigens exposed at the outer surface of the membrane were labeled by fluorescent antibodies, and the conclusion that these particular antigens were mobile in the plane of the membranes therefore, strictly speaking, applies only to those components accessible at the outer sur- face. Whether components confined to the inner surfaces also intermix and diffuse should be separately established. Thus, recent evidence obtained with many experimental methods and different kinds of functional membrane systems is entirely consistent with the predictions of the fluid mosaic model of membrane structure and provides strong support for the model. It seems amply justified, therefore, to speculate about how a fluid mosaic structure might carry out various membrane functions, and to suggest specific mechanisms for various functions that can be subjected to experimental tests.

The Fluid Mosaic Model and Membrane Functions

The hypothesis that a membrane is an oriented, two-dimensional, viscous solution of amphipathic proteins (or lipoproteins) and lipids in instantaneous thermodynamic equilibrum, leads to many specific predictions about the mechanisms of membrane functions. Rather than catalog a large number of these, we suggest some directions that such speculations may usefully take. Among these problems are nerve impulse transmission, transport through membranes, and the effects of specific drugs and hormones on membranes (1). The fluidity of the mosaic structure, which introduces a new factor into such speculations, is emphasized here. This new factor may be stated in general form as follows. The physical or chemical perturbation of a membrane may affect or alter a particular membrane component or set of components; a redistribution of membrane components can then occur by translational diffusion through the viscous two-dimensional solution, thereby allowing new thermodynamic interactions among the altered

components to take effect. This general mechanism may play an important role in various membrane-mediated cellular phenomena that occur on a time scale of minutes or longer. Much more rapidly occurring phenomena, such as nerve impulse transmission, would find the mosaic structure to be a static one, insofar as translational diffusion of the membrane components is concerned. In order to illustrate the concepts involved, we discuss two specific membrane phenomena. Malignant transformation of cells and the "exposure of cryptic sites." Normal mammalian cells grown in monolayer culture generally exhibit "contact inhibition"; that is, they divide until they form a confluent monolayer and they then stop dividing. Cells that have become transformed to malignancy by oncogenic viruses or by chemical carcinogens lose the property of contact inhibition; that is, they overgrow the monolayer. For some time, this experimental finding has been thought to reflect the difference between the normal and the malignant states in vivo, and to be due to differences in the surface properties of normal and malignant cells. Much excitement and investigative activity therefore attended the demonstration (53, 54) that malignant transformation is closely correlated with a greatly increased capacity for the transformed cells to be agglutinated by several saccharide-binding plant agglutinins. Furthermore, mild treatment of normal cells with proteolytic enzymes can render them also more readily agglutinable by these protein agglutinins. Burger (54) has suggested, therefore, that the agglutinin-binding sites are present on the membrane surfaces of normal cells but are "icryptic" (Fig. 7A) (that is, they are shielded by some other membrane components from effectively participating in the agglutination process), and that proteolytic digestion of normal cells or the processes of malignant transformation "exposes" these cryptic sites on the membrane surface. In some cases, quantitative binding studies have indeed indicated that no significant change in the numbers of agglutinin-binding sites on the membrane accompanies either mild proteolysis of normal cells or malignant transformation (55). An alternative explanation of these phenomena (Fig. 7B), based on the fluid mosaic model of membrane structure, may be proposed. Consider first the proteolysis experiments with normal cells. Suppose that the integral glycoproteins in the normal cell membrane are molecularly dispersed in the fluid mosaic structure. It is likely that mild proteolysis would preferentially release a small amount of glycopeptidesand other polar peptides from these proteins because these are the most exposed portions of the integral proteins at the outer surface of the membrane (Figs. 2 and 3). The remaining portions of these proteins may still contain a large fraction of their original oligosaccharide chains after the limited proteolysis, but the release of some of the more polar structures would make the remaining portions more hydrophobic. As these more hydrophobic glycoproteins diffused in the membrane, they might then aggregate in the plane of the membrane. The result would be a clustering of the agglutinin-binding sites on the enzyme-treated cell surface, as compared to the normal untreated surface. Such clustering (with no increase, or perhaps even a decrease in the total numbers of sites because of digestion) could enhance the agglutination of the treated cells, as compared to that of normal cells, because it would increase the probability of agglutinin bridges forming between the surfaces of two cells. In malignant transformation, distinct chemical changes in the glycolipids and the glycoproteins of the cell membrane are known to occur (56), and the enhanced agglutinability of the transformed cells may be much more complicated than is the case in

the proteolysis of normal cells. If, however, the two phenomena do have a basic feature in common, it could be a similar clustering of saccharide-binding sites on the transformed and the enzyme-treated normal cells. In malignant transformation, such clustering could be the result of the chemical changes in the membrane mentioned above; or some virus-induced gene product (57) may be incorporated into the cell membrane and serve as a nucleus for the aggregation of the agglutinin-binding glycoproteins within the membrane. These suggestions can be tested experimentally by the use of ferritin-conjugated agglutinins (33) as already dis- cussed (Fig. 6). The prediction is that with normal cells subjected to mild proteolysis, and also with malignant transformed cells, the total number of ferritin-agglutinin particles specifically bound to the outer surfaces of the cells might not be greatly different from those of normal cells, but larger clusters of ferritin particles would be found. Cooperative phenomena in membranes. By a cooperative phenomenon we mean an effect which is initiated at one site on a complex structure and transmitted to another remote site by some structural coupling between the two sites. A number of important membrane phenomena may fall into this category. However, before enumerating them, we should first discriminate between two types of cooperative effects that may occur. These can be termed trans and cis. Trans effects refer to cooperative (allosteric) changes that have been postulated to operate at some localized region on the membrane surface, to transmit an effect from one side of the membrane to the other (58). For example, fan integral protein may exist in the membrane as an aggregate of two (or more) subunits, one of which is expc,sed to the aqueous solution at the outer surface of the membrane, and the other is exposed to the cytoplasm at the inner surface. The specific binding of a drug or hormone molecule to the active site of the outward-oriented subunit may induce a conformational rearrangement within the aggregate, and thereby change some functional property of the aggregate or of its inward-oriented subunit. By cis effects, on the other hand, we refer to cooperative changes that may be produced over the entire membrane, or at least large areas of it, as a consequence of some event or events occur- ring at only one or a few localized points on the membrane surface. For example, the killing effects of certain bacteriocins on bacteria (59), the lysis of the cortical granules of egg cells upon fertilization of eggs by sperm (60), and the interaction of growth hormone with erythrocyte membranes (61) are cases which may involve transmission and amplification of localized events over the entire surface of a membrane. These phenomena may not all occur by the same or related mechanisms, but in at least two experimental studies, that involving the interaction of colicin E1 with intact Escherichia coli cells (62), and that of human growth hormone and isolated human erythrocyte membranes (61), there is substantial evidence that long-range cis- type cooperative effects intrinsic to the membranes are involved. The question we now address is, How might such cis effects work? Changeux and his co-workers (63) have proposed an extension to membranes of the Monod-Wyman-Changeux allosteric model of protein cooperative phenomena, using as a model of membrane structure an infinite two-dimensional aggregate of identical lipoprotein subunits [as, for example, the model described by Benson (20)]. In this theoretical treatment, the individual subunits are capable of existing in either of two conformational states, one of which has a much larger binding affinity for a specific ligand than does the other. The binding of a single ligand molecule to any one subunit then

triggers the cooperative conversion of many of the subunits to the ligand-bound conformation, in order to maximize the interactions among the subunits. This theory as presented relies on the membrane model used. If, however, the membrane is not a two-dimensional aggregate of lipoprotein subunits, but is instead a fluid mosaic of proteins and lipids, the physical situation would be quite different. The basic theory of Changeuex et al. (63) might still be formally applicable, but with important changes in physical significance. It is possible, for example, that a particular integral protein can exist in either of two conformational states, one of which is favored by ligand binding; in its normal unbound conformation the integral protein is monomolecular dispersed within the membrane, but in the conformation promoted by ligand binding, its aggregation is thermodynamically favored. The binding of a ligand molecule at one integral protein site, followed by diffusion of the non- liganded protein molecules to it, might then lead to an aggregation and simultaneous change in conformation of the aggregated protein within the membrane. This mechanism could result in a long-range cis-type cooperative phenomenon, if the eventual aggregate size was very large and if its presence produced local perturbations in the properties of the membrane. However, the transition would occur at a rate and over a time period determined by the rate of diffusion of the molecules of the integral protein in the fluid mosaic membrane. This time period is likely to be relatively long, of the order of minutes (44), as already mentioned. On the other hand, if cis-type cooperative effects occurred in a lipoprotein subunit model according to the mechanism postulated by Changeux et al. (63), one would expect the cooperative change to be much faster. Con- formation changes in the soluble allosteric protein aspartyltranscarbamylase, for example, have half-times of the order of 10 milliseconds (64). It is therefore of some interest that in the studies of the interaction of colicin E1 and E. coli the fluorescence changes that marked the apparent cis-type cooperative transitions in the cell membrane occurred over intervals of one to several minutes (62). If this suggested mechanism for the colicin effect is valid, one would predict that (i) freeze-etching experiments on the coli- cin-treated bacteria (28) might reveal an aggregation of normally dispersed particles at the inner membrane face, or (ii) changes in membrane fluidity, such as would be produced by suitable changes in temperature or by different compositions of membrane phospho- lipids (65), might markedly affect the kinetics of the fluorescence changes that are observed on addition of the colicin to the bacteria. In this discussion of membrane functions, some detailed mechanisms to account for two membrane phenomena have been presented. It may well turn out that these mechanisms are incorrect. Our object has been not so much to argue for these specific mechanisms, as to illustrate that the fluid mosaic model of membrane structure can suggest novel ways of thinking about membrane functions-ways that are amenable to experimental tests. Other membrane phenomena may be influenced by similar diffusional mechanisms: for example, cell-cell and cell-substrate interactions, where the apposition of intense local electric fields to a cell membrane may affect the distribution of electrically charged integral proteins within the membranes; or the specific binding of multivalent antibody to cell surface antigens, where the simultaneous binding of one antibody molecule to several molecules of the antigen may induce rearrangements of the distribution of the antigen in the plane of the membrane, an effect that may be involved in the phenomenon of antigenic modulation (66). There are other specific examples as

well. It may well be that a number of critical metabolic functions performed by cell membranes may require the translational mobility of some important integral proteins. This could be the ultimate significance of the longstanding observation (67) that the membrane lipids of poikilothermic organisms contain a larger fraction of unsaturated fatty acids the lower their temperature of growth. Appropriate enzymes apparently carry out the necessary biochemical adjustment (68) that keeps the membrane lipids in a fluid state at the particular temperature of growth; if these enzymes are not functional, for example, because of mutations, the organism-to grow at the lower temperature (65)-must be supplied with the unsaturated fatty acid exogenously. While it has been suggested before that the maintenance of lipid fluidity may be important to carrier mechanisms operating across a functional membrane, it is also possible that the real purpose of fluidity is to permit some critical integral proteins to retain their translational mobility in the plane of the membrane, as an obligatory step in their function.

Summary

A fluid mosaic model is presented for the gross organization and structure of the proteins and lipids of biological membranes. The model is consistent with the restrictions imposed by thermodynamics. In this model, the proteins that are integral to the membrane are a heterogeneous set of globular molecules, each arranged in an amphipathic structure, that is, with the ionic and highly polar groups protruding from the membrane into the aqueous phase, and the nonpolar groups largely buried in the hydrophobic interior of the membrane. These globular molecules are partially embedded in a matrix of phospholipid. The bulk of the phospholipid is organized as a discontinuous, fluid bilayer, although a small fraction of the lipid may interact specifically with the membrane proteins. The fluid mosaic structure is therefore formally analogous to a two-dimensional oriented solution of integral proteins (or lipoproteins) in the viscous phospholipid bilayer solvent. Recent experiments with a wide variety of techniques and several different membrane systems are described, all of which are consistent with, and add much detail to, the fluid mosaic model. It therefore seems appropriate to suggest possible mechanisms for various membrane functions and membrane-mediated phenomena in the light of the model. As examples, experimentally testable mechanisms are suggested for cell surface changes in malignant transformation, and for cooperative effects exhibited in the interactions of membranes with some specific ligands. Note added in proof: Since this article was written, we have obtained electron microscopic evidence (69) that the concanavalin A binding sites on the membranes of SV40 virus-transformed mouse fibroblasts (3T3 cells) are more clustered than the sites on the membranes of normal cells, as predicted by the hypothesis represented in Fig. 7B. There has also appeared a study by Taylor et al. (70) showing the remarkable effects produced on lymphocytes by the addition of antibodies directed to their surface immunoglobulin molecules. The antibodies induce a redistribution and pinocytosis of these surface immunoglobulins, so that within about 30 minutes at 37?C the surface immunoglobulins are completely swept out of the membrane. These effects do not occur, however, if the bivalent antibodies are replaced by their univalent Fab fragments or if the antibody experiments are carried out at 0?C instead of 37?C. These and related results strongly indicate that the bivalent antibodies produce an aggregation of the surface

immunoglobulin molecules in the plane of the membrane, which can occur only if the immunoglobulin molecules are free to diffuse in the membrane. This aggregation then appears to trigger off the pinocytosis of the membrane components by some unknown mechanism. Such membrane transformations may be of crucial importance in the induction of an antibody response to an antigen, as well as in other processes of cell differentiation.

EL MODELO DE MOSAICO FLUIDO DE LA ESTRUCTURA DE LAS MEMBRANAS CELULARES

Las membranas celulares son vistos como soluciones bidimensionales de proteínas globulares orientadas y lípidos.

Las membranas biológicas desempeñan un papel crucial en casi todos los fenómenos celulares, sin embargo, nuestra comprensión de la organización molecular de las membranas sigue siendo rudimentario. La experiencia nos ha enseñado, sin embargo, que con el fin de lograr una comprensión satisfactoria de cómo se deben conocer las funciones del sistema biológico, la composición molecular detallada y la estructura de ese sistema. Aunque todavía estamos muy lejos de ese conocimiento sobre las membranas en general, el progreso, tanto a nivel teórico y experimental de los últimos años nos ha llevado a una etapa en la que al menos los aspectos graves de la organización de las proteínas y los lípidos de las membranas pueden ser discernir. Hay algunos investigadores, sin embargo, que, impresionados por la gran diversidad de composiciones y funciones de la membrana, no creo que haya generalizaciones útiles para hacer aún acerca de la estructura general de las membranas celulares. No compartimos esa opinión. Sugerimos que existe una analogía entre los problemas de la estructura de las membranas y la estructura de las proteínas. Estos últimos son tremendamente diversa en la composición, función y estructura detallada. Cada tipo de molécula de proteína es estructuralmente única. Sin embargo, las generalizaciones sobre la estructura de las proteínas han sido muy útiles en la comprensión de las propiedades y funciones de las moléculas de proteína. Del mismo modo, pueden existir generalizaciones válidas acerca de las formas en las que las proteínas y los lípidos se organizan en una membrana intacta. La última prueba de este tipo de generalizaciones o modelos, es si son útiles para explicar los experimentos antiguos y sugerir otras nuevas.

Singer (1) ha examinado recientemente en Singer es profesor de biología en la Universidad de California en San Diego, La Jolla. Dr. Nicolson es investigador asociado en el Centro de Cáncer de ArmandHammer, del Instituto Salk de Estudios Biológicos en La Jolla, California. 720 detalle considerables varios modelos de la organización estructural grave de las membranas, en términos de la termodinámica de sistemas macromoleculares, ya la luz de la evidencia experimental disponible entonces. A partir de este análisis, se concluyó que una estructura de mosaico de alternancia de las proteínas globulares y bicapa de fosfolípidos fue el único modelo de membrana entre los analizados al mismo tiempo que era coherente con las restricciones termodinámicas y con todos los datos experimentales disponibles. Dado que el artículo fue escrito, mucha nueva evidencia publicada que apoya firmemente y se extiende este modelo mosaico. En particular, el mosaico parece ser un fluido o una dinámica y, para muchos propósitos, es mejor como una solución viscosa orientado de dos dimensiones. En este artículo, por lo tanto, presenta y discute un modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana, y proponemos que es aplicable a la mayoría de las membranas biológicas, tales como membranas plasmalemmal e intracelulares, incluyendo las membranas de diferentes orgánulos celulares, tales como las mitocondrias y los cloroplastos. Estas membranas se

denominan de ahora en adelante como membranas funcionales. Puede haber alguna otra membrana como sistemas, como la mielina o las membranas de las lipoproteínas de virus animales pequeños, que les proponemos puede ser rígido, en lugar de líquido, las estructuras de mosaico, pero este tipo de sistemas de membrana, no son el interés principal de este artículo. Nuestros objetivos son: (i) revisar brevemente algunas de la termodinámica de los macro-molecular, y en particular la membrana, sistemas en un entorno acuoso, (ii) discutir algunas de las propiedades de las proteínas y los lípidos de las membranas funcionales, (iii) describir el modelo de mosaico fluido en detalle, (iv) analizar algunos de los últimos y más directa evidencia experimental en términos del modelo, y (v) para demostrar que el modelo de mosaico fluido sugiere nuevas formas de pensar acerca de las funciones de membrana y los fenómenos de membrana .

Termodinámica y estructura de la membrana

El modelo de mosaico fluido ha evolucionado por una serie de etapas de las versiones anteriores (1-4). Consideraciones termodinámicas sobre las membranas y componentes de membrana iniciaron, y siguen siendo fundamentales para estos desarrollos. Estas consideraciones derivadas de dos décadas de estudios intensivos de las estructuras de proteínas y ácidos nucleicos; los principios termodinámicos implicados, sin embargo, son perfectamente general y se aplican a cualquier sistema de macro-molecular en un ambiente acuoso. Estos principios y su aplicación a los sistemas de membrana se han examinado en detalle en otra parte (1) y sólo se resumen a continuación. Para nuestros propósitos presentes, dos tipos de interacciones no covalentes son más importante, hidrófobo (5) e hidrófilos (1). Por interacciones hidrofóbicas se entiende un conjunto de factores termodinámicos que son responsables de la secuestrante de grupos hidrófobos o no polares de distancia a partir de agua, como, por ejemplo, la inmiscibilidad de hidrocarburos y agua. Para ser más específicos, se requiere el gasto de 2,6 kilocalorías de energía libre para transferir un mol de metano a partir de un medio no polar a agua a 25? C (5). Contribuciones de energía libre de esta magnitud, sumados por los muchos residuos de aminoácidos no polares de las proteínas solubles, son, sin duda de importancia primaria en la determinación de las conformaciones de las moléculas de proteína que adopten en solución acuosa (6), en la que los residuos no polares son en su mayoría secuestradas en el interior de las moléculas de distancia de contacto con el agua. Por interacciones hidrófilas se entiende un conjunto de factores termodinámicos que son responsables de la preferencia de los grupos iónicos y polares para una solución acuosa en lugar de un entorno no polar. Por ejemplo, la energía libre necesaria para transferir un mol de ion híbrido glicina a partir de agua a la acetona es de aproximadamente 6,0 kcal a 25? C, que muestra que los pares de iones fuertemente prefieren estar en el agua que en un medio no polar (1). Estos y términos relacionados con la energía libre hay duda de proporcionar las razones por las que esencialmente todos los residuos iónicos de las moléculas de proteína se observan a estar en contacto con el agua, por lo general en la superficie exterior de la molécula, de acuerdo a estudios cristalográficos de rayos x. Termodinámicas argumentos similares se aplican a los residuos de sacáridos (1). Se requiere el gasto de energía libre sustancial para transferir una simple sacárido de agua a un disolvente no polar, y por lo tanto, dichos residuos estará en un estado de energía

inferior libre en contacto con con agua que en un ambiente menos polar. Hay otras interacciones no covalentes, tales como enlaces de hidrógeno y las interacciones electrostáticas, que también contribuyen a determinar la estructura macromolecular. Sin embargo, con respecto a la estructura bruta, con la que nos ocupa, estos son muy probable de magnitud secundaria en comparación con las interacciones hidrófobas e hidrófilas. La estructura de bicapa de fosfolípidos familiarizado ilustra los efectos combinados de las interacciones hidrofóbicas e hidrofílicas. En esta estructura (Fig. 1) Las cadenas de ácidos grasos no polares de los fosfolípidos son secuestradas juntos lejos de contacto con el agua, maximizando de ese modo las interacciones hidrofóbicas. Además, los grupos iónicos y de ion híbrido están en contacto directo con la fase acuosa a las superficies exteriores de la bicapa, maximizando de ese modo las interacciones hidrófilas. En el caso de los fosfolípidos zwitteriónicos tales como fosfatidilcolina, interacciones dipolo-dipolo entre pares de iones en la superficie de la bicapa también pueden contribuir a la estabilización de la estructura de bicapa. En la aplicación de estos principios termodinámicos a las membranas, reconocemos que la primera de las tres clases principales de componentes de membrana de las proteínas, los lípidos y las proteínas-oligosacáridos son predominantes. La relación en peso de proteínas a los lípidos varía de aproximadamente 1,5 a 4 para esas membranas funcionales que han sido bien caracterizados [comparar (7)]. Una fracción sustancial de esta proteína más probablemente juega un papel importante en la determinación de la estructura de las membranas, y las propiedades estructurales de estas proteínas son por lo tanto de importancia de primer orden. Las proteínas de membrana se consideran con cierto detalle en la sección siguiente. En esta coyuntura, el punto significativo es que, si las interacciones hidrófobas e hidrófilas son para ser maximizado y el estado de energía libre más bajo es que hay que alcanzar para la membrana intacta en un ambiente acuoso, los residuos de aminoácidos no polares de las proteínas-junto con el graso cadenas de ácidos de los fosfolípidos-debe ser secuestrado (en la medida de lo posible) de contacto con el agua, mientras que los grupos iónicos y polares de las proteínas-junto con los de los lípidos y la oligosacáridos-debe estar en contacto con el disolvente acuoso. Estos requisitos imponen restricciones en los modelos de estructura de la membrana, en particular, que hacen muy poco probable el modelo clásico de una disposición de trilaminar de una bicapa lipídica continua intercalada entre dos monocapas de proteína. Este último modelo es termodinámicamente inestable porque no sólo están los residuos de aminoácidos no polares de las proteínas de membrana en este modelo forzosamente expuestos en gran medida a agua, pero los grupos iónicos y polares de los lípidos son secuestradas por una capa de proteína de contacto con el agua. Por lo tanto, ni las interacciones hidrófobas ni hidrófilo se maximizan en el modelo clásico.

Algunas propiedades de los componentes de la membrana

Las proteínas periféricas e integrales. Parece razonable y importante distinguir entre dos categorías de proteínas unidas a las membranas, lo que hemos denominado proteínas periféricas e integral (1). Las proteínas periféricas pueden caracterizarse por los siguientes criterios. (I) que sólo requieren tratamientos leves, tales como un aumento en la fuerza iónica del medio o la adición de un agente quelante, que se disocian ellos

molecularmente intacto de la membrana, (ii) se disocian libre de lípidos, y (iii) en el estado disociado que son relativamente solubles en tampones acuosos neutros. Estos criterios sugieren que una proteína periférica se mantiene a la membrana sólo por las interacciones más débiles monovalentes (quizás principalmente electrostática) y no está fuertemente asociado con lípidos de membrana. El citocromo c de las membranas mitocondriales, que puede ser disociado libre de lípidos por altas concentraciones de sal, y la proteína espectrina (8) de las membranas de eritrocitos, que puede ser retirado por los agentes quelantes en condiciones suaves, son ejemplos de proteínas de membrana que satisfacen los criterios para las proteínas periféricas. Por otro lado, la mayor parte (> 70 por ciento) de las proteínas de la mayoría de las membranas tienen diferentes características, que pueden ser asignados a las proteínas integrales de: (i) que requieren tratamientos mucho más drásticos, con reactivos tales como detergentes, ácidos biliares, desnaturalizantes de proteínas o disolventes orgánicos, que se disocian de las membranas, (ii) en muchos casos, siguen siendo asociados con lípidos cuando se aíslan, (iii) en caso de liberarse completamente de los lípidos, por lo general son muy insoluble o agregada en tampones acuosos neutros (9 ). La distinción entre las proteínas periféricas e integral puede ser útil en varios aspectos. Se supone que sólo las proteínas integrales son críticas para la integridad estructural de las membranas. Por lo tanto, las propiedades y las interacciones de las proteínas periféricas, aunque interesante por derecho propio, no pueden ser directamente pertinentes a los problemas centrales de la estructura de la membrana. Las propiedades de citocromo c, por ejemplo, no pueden ser típico de proteínas de la membrana mitocondrial. Por otra parte, la biosíntesis de proteínas periféricas e integrales ya su sujeción a la membrana puede ser muy diferentes procesos. Esta no es la ocasión apropiada para discutir biogénesis de la membrana en ningún detalle, pero puede ser significativo que, a pesar de citocromo c es una proteína mitocondrial, que se sintetiza en el citoplasma en lugar de ribosomas mitocondriales; de hecho, sólo una pequeña fracción de la proteína mitocondrial total de (tal vez sólo las proteínas integrales de la membrana mitocondrial interna?) parece ser sintetizados en los ribosomas mitocondriales (10). En cualquier caso, debido a la función estructural de membrana relativamente poco importante asignado a las proteínas periféricas, que no son una preocupación principal de este artículo. Propiedades de las proteínas integrales. Dado que las proteínas se han clasificado como parte integral, de acuerdo con los criterios especificados, constituye la principal fracción de proteínas de la membrana, se supone que las propiedades que se discutirán se aplican a las proteínas integrales. 1) Para varios sistemas bien caracterizados de membrana, incluyendo las membranas plasmáticas de eritrocitos y otros, y las membranas mitocondriales, las proteínas se ha demostrado ser extremadamente heterogéneas con respecto a los pesos moleculares (11). No hay pruebas convincentes de que existe un tipo predominante de proteína de membrana que es específicamente una proteína estructural; informes recientes al contrario han sido retirada. Consideramos que esta heterogeneidad a ser más significativo para un modelo general de la estructura de la membrana que el hecho de que en unos pocos casos especiales, como en el caso de las membranas de disco de los segmentos externos de los bastoncillos retinianos (12, 13), una sola especie de proteína predomina. Un modelo de membrana satisfactoria debe ser capaz de explicar la heterogeneidad de

las proteínas integrales de membrana. 2) Las proteínas de una variedad de membranas intactas, en promedio, muestran apreciables cantidades de la conformación de un-helicoidal, como se muestra iby primera clave (14), Wallach y Zahler (4), y Lenard y Singer (3). Por ejemplo, las mediciones de dicroísmo circular de suspensiones acuosas de membranas de eritrocitos humanos intactos y fragmentado mecánicamente (a condición de que se tiene en cuenta ciertas anomalías ópticas de estas mediciones) revelan que aproximadamente el 40 por ciento de la proteína está en la conformación helicoidal-un diestro ( 15). La mayoría de las proteínas globulares solubles cuyos espectros de dicroísmo circular han sido obtenidas presentan una fracción más pequeña de a-hélice en sus estructuras nativas. Esto sugiere que las proteínas integrales de membranas intactas son en gran parte de forma globular en lugar de extenderse en forma de monocapas. Por otra parte, un modelo de membrana en la que dichas proteínas globulares están asociadas a las superficies exteriores de una bicapa lipídica (16) no sería satisfactoria porque, entre otras razones, se requeriría la membrana espesores mucho más grandes que las de 75 a 90 angstroms generalmente observado. Un modelo en el que las moléculas de proteínas globulares se intercalan dentro de la membrana sería, sin embargo, cumplir con estas restricciones. Los fosfolípidos de las membranas. En la actualidad existe evidencia sustancial de que la mayor parte de los fosfolípidos está en forma de bicapa en una variedad de membranas intactas. Por ejemplo, la calorimetría diferencial de las membranas intactas micoplasma muestra que se someten a una transición de fase en un intervalo de temperatura muy similar a la de las dispersiones acuosas de los fosfolípidos extraídos de las membranas (16, 17). Por lo tanto las estructuras de los lípidos en la membrana y de los lípidos en la dispersión acuosa aislada son muy similares; presumiblemente la última es la forma bicapa. Esta conclusión está apoyada iby de difracción de rayos x '(18) y los estudios en espiral (19) en preparaciones de membrana similares. El carácter bicapa de lípidos de membrana excluye modelos tales como la de Benson (20) en la que las proteínas y los lípidos forman una subunidad de lipoproteína de una sola fase que se repite indefinidamente en dos dimensiones para constituir la membrana. En tal modelo, la mayor parte de los lípidos se esperaría que tienen propiedades claramente diferentes de las de una bicapa. Dos títulos hay que destacar, sin embargo, en relación con la forma de dos capas de lípidos de membrana. (I) Ninguna de las pruebas hasta ahora obtenidos para la forma de dos capas nos permite decir si la bicapa es continua o interrumpida (1). Las transiciones de fase observadas colorimétricamente, por ejemplo, se producen en un intervalo de temperatura amplio, lo que permite la posibilidad de que la unidad cooperativa que participe en la transición de fase es bastante pequeño, que consiste tal vez de sólo 100 moléculas de lípidos sobre la media. (Ii) Ninguno de los experimentos mencionado anteriormente es suficientemente sensible y cuantitativo para probar si el 100 por ciento del fosfolípido está en forma de bicapa. Por lo tanto, no se excluye que alguna fracción significativa del fosfolípido (quizás tanto como 30 por ciento) se encuentra físicamente en un estado diferente del resto del lípido. Interacciones proteína-lípidos en las membranas. Varios tipos de experimentos indican que las interacciones proteína-lípidos desempeñan un papel directo en una variedad de funciones de la membrana. Muchas enzimas unidas a la membrana y antígenos requieren lípidos, fosfolípidos menudo específicos para la expresión de sus

actividades [véase el cuadro 2 (21)]. Por otra parte, la naturaleza de los ácidos grasos incorporados en los fosfolípidos afecta a la función de ciertas proteínas unidas a la membrana en membranas bacterianas (22). Por otro lado, los datos calorimétricos discutidos anteriormente dar ninguna indicación significativa que la asociación de las proteínas con los fosfolípidos de las membranas intactas afecta a las transiciones de fase de los propios fosfolípidos. Los experimentos con fosfolipasa C y las membranas han demostrado que la liberación enzimática de 70 por ciento de las aminas fosforilados de membranas de eritrocitos intactos perturba profundamente el estado físico de las cadenas de ácidos grasos residuales, pero no tiene efecto detectable (tal como se mide por los espectros de dicroísmo circular) en la medio, auto-formación de las proteínas de la membrana (2). Por tanto, estos resultados sugieren que los fosfolípidos y las proteínas de membranas no interactúan fuertemente, de hecho, que parecen ser en gran medida independiente. Esta paradoja, que los diferentes tipos de experimentos sugieren fuertes interacciones proteína-lípido, por un lado, y las interacciones débiles o no en el otro, se pueden resolver de una manera coherente con todos los datos si se propone que, mientras que la porción más grande del fosfolípido está en forma de bicapa y no fuertemente acoplado a proteínas en la membrana, una pequeña fracción del lípido está más estrechamente unida a la proteína. Con cualquier proteína de la membrana, el lípido fuertemente acoplado podría ser específica, es decir, la interacción podría requerir que el fosfolípido contiene cadenas de ácidos grasos específicos o de grupos de cabeza polares. Hay en la actualidad, sin embargo, no hay evidencia directa satisfactoria para una fracción de lípidos tales distintivo. Este problema se considera de nuevo en relación con una discusión de los experimentos de Wilson y Fox (23).

Modelo del mosaico fluido

Estructura de mosaico de las proteínas y los lípidos de las membranas. Las consideraciones termodinámicas y los resultados experimentales hasta ahora discutidos encajan con la idea de una estructura de mosaico para las membranas (1-3, 24) en el cual las moléculas globulares de las proteínas integrales (tal vez en casos particulares unidos a oligosacáridos para formar glicoproteínas, o interactuar fuertemente con los lípidos específicos para formar lipoproteínas) alternan con secciones de bicapa de fosfolípidos en la sección transversal de la membrana (Fig. 2). Las moléculas de proteínas globulares se postulan para ser anfipático (3, 4) como son los fosfolípidos. Es decir, que son estructuralmente asimétrica, con un extremo altamente polar y un extremo no polar. La región altamente polar es una en la que se agrupan los residuos de aminoácidos iónicos y cualesquiera residuos de sacáridos unidos covalentemente, y que está en contacto con la fase acuosa en la membrana intacta; la región no polar está desprovisto de residuos iónicos y sacárido, contiene muchos de los los residuos no polares, y está incrustado en el interior hidrofóbico de la membrana. La estructura anfipática adoptada por una proteína particular integrante (o lipoproteína) molécula, y por lo tanto el grado en el que está embebido en la membrana, están bajo control termodinámico, es decir, que están determinados por la secuencia de aminoácidos y la estructura covalente de la proteína , y por sus interacciones con su entorno molecular, de modo que la energía libre del sistema en su conjunto está en un mínimo. Una molécula de proteína de una sola pieza con el

tamaño y la estructura apropiada, o un material adecuado de proteínas integrales (a continuación) puede atravesar toda la membrana (3); es decir, que tienen regiones en contacto con el disolvente acuoso en ambos lados de la membrana. Es evidente a partir de estas consideraciones que diferentes proteínas, si tienen la secuencia de aminoácidos apropiada para adoptar una estructura anfipática, pueden ser proteínas integrales de las membranas; de esta manera, la heterogeneidad de las proteínas de la mayoría de las membranas funcionales puede ser racionalizado. Las mismas consideraciones pueden también explicar por qué algunas proteínas son unida a la membrana y que otros son totalmente soluble en el citoplasma. La diferencia puede ser que, o bien la secuencia de aminoácidos de la proteína particular, permite a adoptar una estructura anfipática o, por el contrario, a adoptar una estructura en la que la distribución de los grupos iónicos es casi simetría esférica, en el estado de energía libre más bajo de el sistema. Si la distribución iónica en la superficie de la proteína fuera simétrica, la proteína sería capaz de interactuar fuertemente con el agua en toda su superficie exterior, es decir, sería una proteína soluble monodispersa. La estructura de mosaico puede ser fácilmente diversificada de varias maneras. Aunque la naturaleza de esta diversificación es un tema de especulación, es importante reconocer que la estructura de mosaico no tiene por qué estar limitado por la representación esquemática en la figura. 2. Interacciones proteína-proteína que no se consideran de forma explícita en la figura. 2 tal vez importante en la determinación de las propiedades de la membrana. Tales interacciones pueden dar como resultado, ya sea en la unión específica de una proteína periférica a la superficie expuesta exterior de una proteína integral particular o en la asociación de dos o más subunidades de proteínas integrales para formar un agregado específico dentro de la membrana. Estas características pueden ser acomodados en la figura. 2 sin ningún cambio en la estructura básica. Los fosfolípidos de la estructura de mosaico son predominantemente dispuestas como una bicapa interrumpida, con sus grupos de cabeza iónicos y polares en contacto con la fase acuosa. Como se ha discutido, sin embargo, una pequeña porción del lípido puede ser más íntimamente asociado con las proteínas integrales. Esta función no está explícitamente indicado en la figura. 2. El espesor de una membrana mosaico podría variar a lo largo de la superficie de que a través de una región de bicapa de fosfolípidos para que a través de una región de la proteína, con un valor medio que se podría esperar para que corresponda razonablemente bien a la membrana medido experimentalmente espesores. Matriz del mosaico: lípidos o proteínas? En la sección transversal de la estructura de mosaico representado en la figura. 2, no se indica si se trata de la proteína o el fosfolípido que proporciona la matriz del mosaico. En otras palabras, qué componente es el mortero, que los ladrillos? Esta pregunta debe ser respondida cuando se especifica la tercera dimensión de la estructura de mosaico. Trhese dos tipos de estructura de mosaico quizá espera que tengan muy diferentes propiedades estructurales y funcionales, y por lo tanto la cuestión es crítica. Es nuestra hipótesis de que las membranas celulares son funcionales y tienen una estructura en mosaico de largo alcance con los lípidos que constituyen la matriz, como se muestra en la figura. 3. Evidencia de apoyo se describe más adelante. En este punto, vamos a considerar algunas de las consecuencias de esta hipótesis. 1) Hay por lo general debería haber ninguna orden de largo alcance en una membrana mosaico con una matriz lipídica. Por largo alcance, nos referimos a través de

distancias del orden de unas pocas décimas de un micrómetro y mayor. Supongamos que tenemos una preparación de membrana que contiene muchas especies diferentes de proteínas, y supongamos además que 10.000 moléculas de proteína A están presentes en la membrana de una sola célula u orgánulo. ¿Cómo es la proteína A distribuida sobre la superficie de la membrana? Si las proteínas de la membrana forman la matriz del mosaico, definido por los contactos específicos entre las moléculas de diferentes proteínas integrales, proteína A se puede distribuir en una altamente ordenada, matriz de dos dimensiones en la superficie. Por otro lado, si lípido formado la matriz del mosaico, no habría interacciones de largo alcance intrínsecas a la membrana influyen en la distribución de las moléculas A, y deben por lo tanto ser distribuido en una disposición aleatoria aperiódica en la superficie de la membrana . La ausencia de orden de largo alcance no debe tomarse para implicar una ausencia de orden de corto alcance en la membrana. Es muy probable que dicha orden de corto alcance no existe, como, por ejemplo, entre al menos algunos componentes de la cadena de transporte de electrones en la membrana interna mitocondrial. Tal orden de corto alcance es probablemente mediada por la proteína específica (y quizás proteína-lípido) interacciones que conducen a la formación de aliado estequiométrica agregados definidos dentro de la membrana. Sin embargo, en una membrana mosaico con una matriz de lípidos, se esperaría que la distribución de largo alcance de tales agregados ser al azar sobre toda la superficie de la membrana. La objeción puede plantearse de inmediato ese orden de largo alcance claramente existe en ciertos casos en los que se encuentran las estructuras diferenciadas (por ejemplo, las sinapsis) dentro de una membrana. Sugerimos, en tales casos especiales, ya sea que las interacciones específicas de corto alcance entre las proteínas integrante resultado en la formación de un agregado de dos dimensiones inusualmente grande o que algún agente extrínseco a la membrana (ya sea dentro o fuera de la célula) interacciona con multiplican específica proteínas integrales para producir una agrupación de esas proteínas en un área limitada 724 de la superficie de la membrana. En otras palabras, se sugiere que los arreglos al azar de largo alcance en las membranas son la norma, donde se encuentran las distribuciones no aleatorias, deben existir mecanismos que son responsables de los mismos. 2) Se ha demostrado que, en condiciones fisiológicas, los lípidos de las membranas celulares son funcionales en un fluido en lugar de un estado cristalino. (Esto no es cierto de la mielina, sin embargo.) Esta evidencia proviene de una variedad de fuentes, tales como experimentos de giro de etiquetado (25), los estudios de difracción de rayos X (18), y de calorimetría diferencial (16, 17). Si una membrana consistió en proteínas integrales dispersos en una matriz lipídica de fluido, la membrana podría en efecto ser una solución líquida-como bidimensional de proteínas integrales monoméricos o agregada (o lipoproteínas) disueltos en la bicapa lipídica. La estructura de mosaico sería una dinámica en lugar de una estática. Puede esperarse que las proteínas integrales de someterse a la difusión traslacional dentro de la membrana, cuya alícuota se determina en parte por la viscosidad efectiva del lípido, a menos que se atados por algunas interacciones específicas intrínsecos o extrínsecos a la membrana. Sin embargo, debido a sus estructuras anfipáticas, las proteínas integrales mantendrían su orientación molecular y su grado de intercalación en la membrana mientras se somete a la difusión de traslación en el plano de la membrana (como discutido más abajo). Por el

contrario, si la matriz del mosaico fueron constituida de proteínas integrales, la estructura de largo alcance de la membrana sería esencialmente estática. Las grandes energías de activación serían necesarios para un componente de proteína de difundir en el plano de la membrana de una región a un lugar lejano a causa de los muchos enlaces monovalentes entre las proteínas que tendrían que ser roto simultáneamente para ex-cambiar para tener lugar. Por lo tanto, una membrana mosaico con una matriz de proteína debe hacer para una estructura relativamente rígida, esencialmente sin difusión traslacional de sus componentes de las proteínas dentro de la membrana. A partir de la discusión en este y en la sección anterior, está claro que el modelo de mosaico fluido sugiere un conjunto de propiedades estructurales de las membranas funcionales, al menos, algunos de los cuales pueden ser probados experimentalmente. En un artículo anterior (1), un gran cuerpo de evidencia experimental fue examinado por su relevancia para los modelos de estructura de la membrana. Se concluyó que una estructura de mosaico fue más consistente con la evidencia disponible. Algunos de los resultados más recientes, sin embargo, tienen aún más directa en el problema, y sólo estos datos se analizan a continuación.

Algunas evidencias experimentales recientes

La evidencia de proteínas incrustadas en las membranas. Una de las propuestas del modelo de mosaico fluido que es una proteína integral es una molécula globular que tiene una fracción significativa de su volumen incrustado en la membrana. Los resultados de los últimos experimentos de congelación y de grabado con membranas sugieren fuertemente que una cantidad sustancial de la proteína está profundamente arraigada en muchas membranas funcionales. En esta técnica (26) una muestra congelada se fractura con una cuchilla del micrótomo; una parte del agua congelada es sub-encalados (grabado) de la superficie de fractura, si se desea, la superficie es entonces sombra del molde con el metal, y la réplica de la superficie se examina en el microscopio electrónico. Por este método se revela la topografía de la superficie troceados. Un rasgo característico de la superficie expuesta de la mayoría de las membranas funcionales examinados por esta técnica, incluyendo plasmalemmal, vacuolar, nucleares, de cloroplastos, mitocondrias, y las membranas bacterianas (27, 28), es una estructura de mosaico que consiste en una matriz suave interrumpido por una gran número de partículas. Estas partículas tienen un tamaño bastante uniforme característico de una membrana particular, por ejemplo, alrededor de 85-Un diámetro de membranas de eritrocitos. Tal superficies resultado de la escisión de una membrana a lo largo de su cara hidrófoba interior (29). Esta cara interior (Fig. 2) se corresponde con el plano indicado por la flecha. Si la escisión se produjera sin problemas entre las dos capas de fosfolípidos en las regiones de dos capas, pero no son para eludir las moléculas de proteína que penetran en el plano medio de la membrana, a continuación, las regiones lisas y partículas alternando observan en las superficies de congelación de grabado puede ser fácilmente explicado por una estructura en mosaico de la membrana (Fig. 2), a condición de que las partículas se pueden mostrar a ser de naturaleza proteica. Que las partículas de proteína son de hecho ha sido sugerido por experimentos recientes (30). Otra consecuencia del modelo de mosaico, sugirió a partir de su inicio (3), es que ciertas proteínas integrales que poseen el tamaño y la estructura adecuada pueden abarcar todo el espesor de la membrana y ser expuesto en ambas

superficies de membrana. Evidencia química que una proteína trans-membrana, cuyo peso molecular es de aproximadamente 100.000, está presente en grandes cantidades en la membrana de los eritrocitos humanos se ha obtenido mediante dos métodos independientes-uno que implica proteolisis de lo normal en comparación con las membranas evertidos (31), y el otro etiquetado química específica de las proteínas de la membrana! (32). Distribución de los componentes en el plano de la membrana. Una predicción del modelo de mosaico fluido es que la distribución bidimensional de largo alcance de cualquier proteína integral en el plano de la membrana es esencialmente aleatoria. Para probar esta predicción, hemos desarrollado y aplicado técnicas de microscopía electrónica para visualizar la distribución de los antígenos de membrana específicos en grandes áreas de su superficie de membrana (33) y se ha estudiado hasta el momento de la distribución * del antígeno Rhd (D) en membranas de eritrocitos humanos (34), y de H-2 aloantígenos de histocompatibilidad sobre las membranas de eritrocitos de ratón (35). En el caso del antígeno Rho (D), por ejemplo, células de 0, tipo Rh positivo se hicieron reaccionar con una cantidad saturante de marcado con 125I se purificó anticuerpo humano a Rho (D) [anti-Rlho (D)], y las células tratadas (sensibilizados) se lisaron en una interfase aire-agua, de modo que las membranas celulares se extienden plana. Las membranas aplanadas, después de haber sido recogido en una rejilla de microscopio electrónico, se trataron con los indirectos "mancha", anticuerpos específicos de cabra conjugados con ferritina específicas para y-globulina humana. Por lo tanto, en la medida que las moléculas anti-Rho humanos (D) se unieron a la (D) antígeno Rho en la superficie de la membrana, las marcadas con ferritina anticuerpos de cabra se-llegó unida específicamente. En otras palabras, el anticuerpo y-globulina humana ahora funcionaba como un antígeno de los anticuerpos de cabra (Fig. 4). La ferritina se distribuyó en grupos discretos, cada uno contiene siete y cincuenta y ocho moleclues ferritina dentro de un círculo de radio de aproximadamente 300 A. Los numblers de tales racimos por unidad de área de la superficie de la membrana se correspondían con el número de 125I-anticuerpo anti-humano Rho (D ) moléculas unidas por unidad de área. Esto indica que cada grupo de ferritina se une a una sola (D) molécula anti-Rho, y un clúster representa el número de moléculas de anticuerpo de cabra unidos a una sola molécula y-globulina humana. Por tanto, cada agrupación corresponde a un solo sitio de antígeno Rho (D) (36) sobre la membrana. Dado que los grupos se distribuyeron al azar en una matriz, llegamos a la conclusión de que el (D) antígeno Rho, que presenta propiedades de una proteína integral (37), se dispersa molecularmente y se distribuye en una matriz aleatoria, de dos dimensiones en la membrana de los eritrocitos humanos . Similares experimentos se llevaron a cabo con los H-2 sitios aloantigénicas en membranas de eritrocitos de ratón. En este caso (figura 5) de los agregados de moléculas de ferritina de la mancha indirecta no fueron aislados, como en el caso del antígeno Rho (D), pero en su lugar se produjo en parches. La distribución desigual de los H-2 sitios aloantigénicas de histocompatibilidad anterior había sido observado por diferentes técnicas (38), pero la distribución bidimensional de los parches no pudo ser comprobada. En nuestros experimentos, los parches contenían un número variable de grupos, y se dispusieron en una matriz de dos dimensiones irregulares en la superficie de la membrana. El antígeno de histocompatibilidad parece ser glicoproteína en

la naturaleza (39). El distrilbution de largo alcance tanto de la Rho (D) y H-2 antígenos de histocompatibilidad sobre sus respectivas superficies de la membrana, por lo tanto, están de acuerdo con la predicción del modelo de mosaico fluido que las proteínas integrales de las membranas están dispuestas al azar en dos dimensiones. Las partículas en la membrana interna caras reveladas por experimentos de congelación-aguafuerte, que (como se discutió anteriormente) son probablemente la proteína en la naturaleza, están generalmente también relativamente distribuidos al azar en dos dimensiones. La evidencia de que las proteínas están en un estado líquido en las membranas intactas. Una importante serie de experimentos se ha llevado a cabo (12, 40-44) con las membranas de disco receptores de la retina de la rana. Este sistema de membrana es inusual en que contiene como su predominante, si no el único, componente de proteína del pigmento rodopsina. En la microscopía electrónica de las superficies de tinción negativa de las membranas secas, un arsenal poco apretada y ordenada de partículas se observó (unos 40 A). Estas partículas son las moléculas de rodopsina individuales. Aunque los estudios anteriores sugirieron que había un orden de largo alcance en la distribución de las partículas (40), los datos de difracción de rayos X más recientes (42) sobre gránulos de disco, las membranas del receptor húmedos mostraron que sólo unos pocos órdenes de reflexión fueron observado correspondiente a las separaciones de las moléculas de rodopsina en el plano de la membrana. Esto indicó que un no cristalino, arreglo aperiódica de las partículas existía en el plano de la membrana. Además, la dependencia de la temperatura de las características de la máximos de difracción de rayos x fueron consistentes con la sugerencia de que las partículas estaban en un estado líquido-como plana en la membrana intacta. , El apoyo adicional para la existencia de este estado líquido-como era la observación de que la absorción de una proteína extraña (albúmina de suero bovino) a la membrana podría alterar definitivamente los espaciamientos de rayos X debido a las partículas de rodopsina, es decir, la distribución de los las moléculas de rodopsina en el plano de la membrana fue alterado radicalmente por la débil unión de la albúmina. Esta alteración no se esperaría que si estaban presentes en el plano de la membrana una estructura reticular rígido de las moléculas de rodopsina, o los agregados,, Estos estudios son particularmente digno de mención porque implicaban una membrana que, por técnicas microscópicas de electrones convencionales, parece mostrar largo -gama periodicidad sobre su superficie. Otras membranas especializadas también han exhibido ordenó imágenes micrográfico de electrones de su superficie [Comparar (43)]. Sin embargo, es probable que aparecerá una disolución de fluido de dos dimensiones muy concentrada de moléculas de proteínas idénticas, cuando se seca, para ser dispuestos en una serie ordenada, en particular cuando se utilizan trucos ópticos para mejorar el orden aparente (43). Lo que es realmente una fase de fluido puede por lo tanto artifactually hacerse 'para aparecer como un sólido cristalino. Esta parece ser la situación con los receptores de membranas de disco retina. Una importante contribución a los estudios de la membrana ha sido hecha por Frye y Edidin (44), que investigó las propiedades de la membrana de algunas heterocariones fusión celular. Las células humanas y de ratón en cultivo fueron inducidos para fusionar uno con el otro, con el virus Sendai como el agente de fusión. La distribución de los componentes antigénicos humanos y de ratón de las membranas de células fusionadas fue entonces determinada

por inmunofluorescencia, con el uso de anticuerpos de conejo dirigidos a la totalidad de las células humanas, los anticuerpos de ratón dirigidos contra la H-2 aloantígeno en las membranas celulares de ratón, y , manchas como indirectos, cabra antisuero de conejo y-glolbulin y antisuero de cabra para ratón y-globulina marcada con dos colorantes fluorescentes diferentes. Poco después de la fusión celular, el ratón y los componentes antigénicos humanos fueron segregados en gran medida en diferentes mitades de las membranas de las células fusionadas, pero después de unos 40 minutos a 37 º C los componentes eran esencialmente completamente entremezclados?. Los inhibidores de la síntesis de proteínas, de trifosfato de adenosina (ATP) formación, y de vías de síntesis de glutamina-dependientes, aplicada antes o después de la fusión celular, no tuvo ningún efecto sobre la velocidad de este proceso de entremezclado, pero la reducción de la temperatura por debajo de 15? C bruscamente disminución de ella. Frye y Edidin (44) sugieren que la entremezcla de componentes de la membrana es debido a la difusión de estos componentes dentro de la membrana, en lugar de a su extracción y reinserción, o a la síntesis y la inserción de las nuevas copias de estos componentes, en la membrana heterocarión. Un hallazgo sin explicación de estos experimentos fue la aparición bastante frecuente, a veces temprana e intermedia después de la fusión de células, de las membranas heterocarión en el que los componentes antigénicos humanos se distribuyen uniformemente sobre la superficie de la membrana, pero los componentes de ratón todavía fueron segregados en gran medida a la mitad de la membrana (células Ml/2-H1). Por otra parte, la situación inversa, con los componentes antigénicos de ratón se extendió uniformemente a lo largo de la membrana y los componentes humanos segregado (M1-H1 / 2), se observó sólo en raras ocasiones. Este resultado puede ser explicado ahora por un mecanismo de difusión para el proceso de entremezclado, de la siguiente manera. Los anticuerpos a la membrana celular humana eran sin duda dirigida a un conjunto heterogéneo de antígenos, mientras que los anti-cuerpos ito la célula de ratón fueron dirigidas específicamente a la aloantígeno de histocompatibilidad. Sin embargo, los antígenos de histocompatibilidad se producen como grandes agregados en la membrana (Fig. 5), y por lo tanto se podría esperar que difundir más lentamente que una mezcla compleja de antígenos humanos agregados en gran medida en la membrana. Por lo tanto, en tiempos intermedios apropiados después de la fusión celular, un número significativo de (M1/2-HI) pero no de (Ml-HI / 2) células fusionadas pueden aparecer, al ser convertidos en tiempos más largos a las células con los componentes completamente entremezclados. Una estimación aproximada puede estar hecho de la constante de difusión media efectiva requerida de los componentes de la membrana para dar cuenta de la cinética de la entremezcla en los experimentos Frye-Edidin. Tomando la distancia media de la migración, x, que ha sido de aproximadamente 5 micrómetros en un tiempo, t, de 40 minutos da una constante de difusión aparente, D = x2 / 2t, de 5 X 10-11 cm2/seg. Para la comparación, la constante de la hemoglobina en soluciones acuosas de difusión es de aproximadamente 7 X 10-7 cm2/seg. Por consiguiente, la viscosidad efectiva aparente de la fase fluida la membrana es de aproximadamente 103 a 104 veces la del agua. Los experimentos Frye-Edidin pueden ser racionalizadas por el modelo de mosaico fluido de estructura de la membrana como el resultado de la difusión y el entremezclado de los lípidos y de las proteínas (o lipoproteínas) dentro de la matriz lipídica de líquido

libre. Algunos experimentos, sin embargo, parecen sugerir que los lípidos de las membranas no son fácilmente intercambiables dentro de la membrana y son por lo tanto, no es libre de difundir de forma independiente. Por ejemplo, Wilson y Fox (23) han estudiado la inducción de la / los sistemas de transporte 8/-glucoside l-galactósido y en los mutantes de Escherichiacoli que no pueden sintetizar ácidos grasos insaturados. Tales ácidos grasos pueden ser incorporados en fosfolípidos, sin embargo, si se suministran en el medio de crecimiento. Cuando las células se cultivaron en particular, suplementos de ácidos grasos y se indujeron para la síntesis de los sistemas de transporte, el efecto de la temperatura sobre la velocidad de transporte era característica de que el ácido graso. Si, a continuación, las células se cultivaron primero en ácido oleico que contiene el medio y luego cambiaron al crecimiento en un medio suplementado con ácido linoleico durante un breve período de inducción de cualquiera de los sistemas de transporte, el efecto de la temperatura sobre el transporte se dice que es característico de las células cultivadas continuamente en el medio ácido linoleico. En otras palabras, aunque la mayor parte de los fosfolípidos de la membrana contenía cadenas de ácido oleico, estos no parecen intercambiar con las pequeñas cantidades de nueva síntesis de fosfolípidos que contienen cadenas de ácido linoleico. Estos experimentos, sin embargo, no necesariamente contradicen la tesis de que la mayor parte de los fosfolípidos de las membranas son libremente difusible y, por lo tanto, intercambiables. Por ejemplo, cada uno de los dos sistemas de transporte puede ser organizado en la membrana como un agregado de proteína específica que contiene componentes de fosfolípidos intercaladas y fuertemente atado. Si tales agregados de lipoproteínas primero tenían que ser montado con el fin de ser incorporado en la matriz lipídica mayor parte de la membrana, se anticipó a los resultados de Wilson y Fox. En particular, la pequeña fracción de los fosfolípidos de membrana que se une fuertemente, y tal vez segregada en tales agregados de la mayor parte del lípido de la membrana, no puede intercambiar rápidamente con el lípido mayor. Los experimentos Wilson-Fox por lo tanto, no requieren que la mayor parte de los fosfolípidos de membrana ser estática, sino solamente que una pequeña fracción de los lípidos ser estructuralmente diferenciadas del resto. La diferenciación estructural de algunos de los lípidos de membrana por la fuerte unión a proteínas integrales es la posibilidad de que se discutió anteriormente. Las observaciones de Wilson y Fox, que hay un acoplamiento significativo de lípidos y la incorporación de proteína en las membranas, parecen ser un caso especial. Los experimentos de Mindich (45) demuestran que en general la incorporación de lípidos y proteínas en las membranas bacterianas pueden ocurrir de forma independiente, y 'que bastante amplias variaciones en la proporción de lípidos y proteínas en la membrana pueden ser producidos in vivo, como se podría esperar a partir de la modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana. La asimetría de las membranas. Una cantidad sustancial de evidencia se ha acumulado mostrando que las dos superficies de las membranas no son idénticas en composición o estructura. Un aspecto de esta asimetría es la distribución de oligosacáridos en las dos superficies de las membranas. Existen proteínas vegetales, llamados aglutininas o lectinas de plantas, que se unen a los residuos específicos de azúcar, y, como resultado, puede causar la aglutinación de las células que llevan los residuos de azúcar en sus superficies. Por la conjugación de varios de estos aglutininas a la ferritina, que hemos sido

capaces de visualizar la distribución de oligosacáridos en las membranas en el microscopio electrónico (33). Por ejemplo, el conjugado de ferritina de concanavalina A, aglutinina de un proteína que se une específicamente a la terminal aD-glucopiranosil o residuos aD-manopiranosilo (46), se une específicamente a la superficie exterior de las membranas de eritrocitos y en absoluto a la superficie citoplasmática interna (33 ). Una distribución similar, completamente asimétrica de conjugados de ferritina (una proteína de la ricina aglutinina) en las membranas de eritrocitos de conejo se muestra en la figura. 6. La ricina se une específicamente a la terminal f /-D-galactopiranosil y residuos de azúcar estéricamente relacionados (47). Tal asimetría ahora se ha observado con varios aglutininas ferritina conjugados y un número de diferentes membranas plasmáticas de células de mamíferos (48). Estos hallazgos se extienden anteriores resultados obtenidos por diferentes métodos (49). Las observaciones anteriores llevan a muchos problemas, incluyendo la célula-célula interacciones y biogénesis de la membrana (50). En el contexto de este artículo, sin embargo, la ausencia de los oligosacáridos en las superficies de la membrana interna indica que las transiciones rotacionales de las glicoproteínas de membranas plasmáticas de eritrocitos y de otro tipo del exterior a las superficies interiores deben producirse a tasas lentas sólo insignificantemente. Esta conclusión probablemente se aplica a otras proteínas de la membrana de las glicoproteínas, por ejemplo, las actividades de trifosfato de adenosina de Na, K y Mg-dependientes-dependiente de las membranas de eritrocitos se localizan exclusivamente a las superficies interiores citoplasmáticos (51). Las moléculas individuales de spin-etiquetados fosfolípidos de ion híbrido y aniónicos también exhiben transiciones dentro-fuera muy lentos en vesículas de bicapas de fosfolípidos sintéticos (52). Las tasas muy bajas o insignificantes de estas transiciones pueden ser explicadas por el modelo de mosaico y los argumentos termodinámicos ya discutidos. Si las proteínas integrales (incluyendo las glucoproteínas) en membranas intactas tienen, como los fosfolípidos, una estructura anfipática, una gran energía libre de activación sería requerido para hacer girar las regiones iónicos y polares de las proteínas a través del interior hidrofóbico de la membrana a la otro lado. Para acomodar el modelo de mosaico fluido a estas conclusiones relativas a la asimetría, se especifica que, mientras que la difusión traslacional de dos dimensiones de las proteínas integrales y los fosfolípidos de las membranas se produce libremente, la difusión rotacional de estos componentes se restringe generalmente a los ejes perpendiculares al plano de la membrana, es decir, en general, molecular volteo no se produce a tasas significativas dentro de la membrana. La asimetría de la membrana introduce otro factor en el problema de la difusión de traslación de componentes de la membrana. En los experimentos de Frye y Edidin (44) sólo aquellos antígenos de la membrana expuestas en la superficie externa de la membrana se marcaron mediante anticuerpos fluorescentes, y la conclusión de que estos antígenos particulares eran móviles en el plano de las membranas por lo tanto, estrictamente hablando, sólo se aplica a los componentes de acceso a la superficie exterior. Ya sea que los componentes limitan a las superficies interiores también se entremezclan y difusa deben establecerse por separado. Por lo tanto, la evidencia reciente obtenida con muchos métodos experimentales y diferentes tipos de sistemas de membranas funcionales es totalmente coherente con las predicciones del modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana y proporciona

un fuerte apoyo para el modelo. Parece ampliamente justificada, por lo tanto, especular acerca de cómo una estructura de mosaico fluido puede llevar a cabo diversas funciones de la membrana, y proponer mecanismos específicos para las distintas funciones que pueden ser sometidos a pruebas experimentales.

El modelo de mosaico fluido y funciones de la membrana

La hipótesis de que una membrana es una de dos dimensiones solución viscosa orientada,, de proteínas anfipáticas (o lipoproteínas) y lípidos en Equilibrum termodinámico instantánea, conduce a muchas predicciones específicas acerca de los mecanismos de funciones de la membrana. En vez de catálogo de un gran número de ellos, le sugerimos algunas direcciones que tales especulaciones pueden tomar provecho. Entre estos problemas están la transmisión de impulsos nerviosos, el transporte a través de membranas, y los efectos de las drogas y las hormonas en las membranas (1) específicos. La fluidez de la estructura en mosaico, que introduce un nuevo factor en tales especulaciones, se hace hincapié aquí. Este nuevo factor puede expresarse en forma general de la siguiente manera. La perturbación física o química de una membrana puede afectar o alterar un componente de la membrana particular o un conjunto de componentes; una redistribución de los componentes de la membrana entonces puede ocurrir por difusión de traslación a través de la solución de dos dimensiones viscoso, permitiendo de ese modo nuevas interacciones entre los componentes termodinámicos alterados a surta efecto. Este mecanismo general puede desempeñar un papel importante en varios fenómenos celulares mediadas por la membrana que se producen en una escala de tiempo de minutos o más. Mucho fenómenos que ocurren más rápidamente, tales como transmisión del impulso nervioso, se encuentra la estructura de mosaico ser una estática, en la medida en la difusión traslacional de los componentes de la membrana se refiere. Con el fin de ilustrar los conceptos involucrados, se discuten dos fenómenos específicos de membrana. La transformación maligna de las células y la "exposición de los sitios crípticos." Células de mamíferos normales en cultivo monocapa generalmente exhiben "inhibición por contacto", es decir, que se dividen hasta que formen una monocapa confluente y entonces dejan de dividirse. Las células transformadas que se han vuelto a la malignidad por virus oncogénicos o por carcinógenos químicos perder la propiedad de inhibición de contacto, es decir, que crecen en exceso en la monocapa. Desde hace algún tiempo, este hallazgo experimental ha sido pensado para reflejar la diferencia entre lo normal y los estados malignos in vivo, y para ser debido a las diferencias en las propiedades de la superficie de las células normales y malignas. Mucho entusiasmo y la actividad de investigación por lo tanto, asistieron a la demostración (53, 54) que la transformación maligna está estrechamente correlacionada con un gran aumento de la capacidad de las células transformadas a ser aglutinadas por varios aglutininas de plantas sacárido de unión. Además, el tratamiento suave de las células normales con enzimas proteolíticas puede hacerlos también más fácilmente aglutinables por estas aglutininas proteínas. Burger (54) ha sugerido, por lo tanto, que los sitios de unión a aglutinina están presentes en las superficies de las membranas de las células normales, pero son "icryptic" (fig. 7A) (es decir, que están protegidos por algunos otros componentes de la membrana de participar de manera efectiva en el proceso de

aglutinación), y que la digestión proteolítica de las células normales o de los procesos de transformación maligna "expone" estos sitios crípticos sobre la superficie de la membrana. En algunos casos, los estudios de unión cuantitativos de hecho han indicado que ningún cambio significativo en el número de sitios de unión a aglutinina en la membrana acompaña ya sea proteolisis suave de las células normales o de transformación maligna (55). Una explicación alternativa de estos fenómenos (fig. 7B), basado en el modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana, puede ser propuesto. Consideremos en primer lugar los experimentos de proteolisis con las células normales. Supongamos que las glicoproteínas integrales de la membrana celular normal se dispersan molecularmente en la estructura de mosaico fluido. Es probable que la proteolisis suave sería preferentemente liberar una pequeña cantidad de glicopéptidos y otros péptidos polares de estas proteínas porque éstas son las partes más expuestas de las proteínas integrales en la superficie externa de la membrana (Figs. 2 y 3). Las porciones restantes de estas proteínas pueden contener todavía una gran fracción de sus cadenas de oligosacáridos originales después de la proteolisis limitada, pero la liberación de algunas de las estructuras más polares harían que las porciones restantes más hidrófobo. A medida que estas glicoproteínas más hidrófobos difunden en la membrana, que podría entonces agregada en el plano de la membrana. El resultado sería una agrupación de los sitios de aglutinina de unión sobre la superficie de la célula tratada con enzimas, en comparación con la normal de la superficie no tratada. Tal agrupamiento (sin aumento, o tal vez incluso una disminución en el número total de sitios debido a la digestión) podría mejorar la aglutinación de las células tratadas, en comparación con la de las células normales, porque incrementaría la probabilidad de la formación de puentes de aglutinina de entre las superficies de dos células. En la transformación maligna, cambios químicos distintos en los glicolípidos y las glicoproteínas de la membrana de la célula se sabe que se producen (56), y la mayor capacidad de aglutinación de las células transformadas pueden ser mucho más complicado de lo que es el caso en la proteólisis de las células normales. Si, sin embargo, los dos fenómenos tienen una característica básica en común, que podría ser una agrupación similar de sitios de unión a sacárido en el transformado y las células normales tratadas con enzimas. En la transformación maligna, tal agrupamiento podría ser el resultado de los cambios químicos en la membrana se ha mencionado anteriormente, o algún producto génico inducido por virus (57) puede ser incorporado en la membrana celular y servir como núcleo para la agregación de la aglutinina de unión glicoproteínas dentro de la membrana. Estas sugerencias pueden ser probados experimentalmente mediante el uso de aglutininas ferritina-conjugados (33) como ya se ha discutido (fig. 6). La predicción es que con las células normales sometidas a proteolisis suave, y también con células transformadas malignas, el número total de partículas de ferritina-aglutinina unidos específicamente a las superficies exteriores de las células no podría ser muy diferente de los de las células normales, pero las agrupaciones más grandes de partículas de ferritina se encontraría. Fenómenos cooperativos en las membranas. Por un fenómeno cooperativo nos referimos a un efecto que se inicia en un sitio en una estructura compleja y se transmite a otro sitio remoto por algunos acoplamiento estructural entre los dos sitios. Una serie de importantes fenómenos de membrana puede entrar en esta categoría. Sin embargo, antes de enumerarlos, debemos

distinguir primero entre dos tipos de efectos cooperativos que puedan ocurrir. Estos pueden ser denominados trans y cis. Efectos trans se refieren a cambios de cooperación (alostérico) que se han postulado para funcionar a una región localizada en la superficie de la membrana, para transmitir un efecto de un lado de la membrana a la otra (58). Por ejemplo, la proteína integral de ventilador puede existir en la membrana como un agregado de dos (o más) subunidades, una de las cuales es expc, sed a la solución acuosa en la superficie externa de la membrana, y la otra está expuesta al citoplasma en la superficie interior. La unión específica de una molécula de fármaco o de la hormona al sitio activo de la subunidad orientada hacia el exterior puede inducir una reorganización conformacional dentro del agregado, y por lo tanto cambiar alguna propiedad funcional del agregado o de su subunidad orientada hacia el interior. Por efectos cis, por otro lado, nos referimos a los cambios de cooperación que se pueden producir en toda la membrana, o al menos grandes áreas de la misma, como consecuencia de algún acontecimiento o acontecimientos-anillo ocurrir en sólo uno o unos pocos puntos localizados en la superficie de la membrana. Por ejemplo, los efectos de muerte de ciertas bacteriocinas sobre las bacterias (59), la lisis de los gránulos corticales de las células de huevo a la fertilización de los huevos por espermatozoides (60), y la interacción de la hormona del crecimiento con las membranas de eritrocitos (61) son los casos que pueden implicar la transmisión y la amplificación de eventos localizados sobre toda la superficie de una membrana. Estos fenómenos no pueden producirse por todos los mismos o relacionados con los mecanismos, pero en al menos dos estudios experimentales, que implica la interacción de colicina E1 con células de Escherichiacoli intactas (62), y la de la hormona de crecimiento humana y membranas aisladas de eritrocitos humanos (61 ), existe evidencia sustancial de que de tipo cis efectos cooperativos de largo alcance intrínsecas a las membranas están involucrados. La pregunta que ahora abordamos es, ¿Cómo podrían tales cis trabajo de efectos? Changeux y sus colaboradores (63) han propuesto una extensión a las membranas del modelo alostéricoMonod-Wyman-Changeux de los fenómenos de cooperación de proteínas, usando como modelo de la estructura de la membrana un agregado bidimensional infinita de subunidades idénticas de lipoproteínas [como, por ejemplo, el modelo descrito por Benson (20)]. En este tratamiento teórico, las subunidades individuales son capaces de existir en cualquiera de los dos estados de conformación, uno de los cuales tiene una afinidad de unión mucho más grande para un ligando específico que lo hace el otro. La unión de una sola molécula de ligando a cualquier una subunidad activa entonces la conversión de cooperación de muchas de las subunidades de la conformación unida al ligando, con el fin de maximizar las interacciones entre las subunidades. Esta teoría tal como se presenta se basa en el modelo de membrana utilizada. Si, sin embargo, la membrana no es un agregado de dos dimensiones de las subunidades de las lipoproteínas, pero es en cambio un mosaico fluido de proteínas y lípidos, la situación física sería muy diferente. La teoría básica de Changeuex et al. (63) todavía podría ser aplicable formalmente, pero con cambios importantes en significado físico. Es posible, por ejemplo, que una proteína integral particular puede existir en cualquiera de los dos estados de conformación, uno de los cuales se ve favorecida por la unión del ligando; en su conformación normal de la proteína no unida integral es monomolecular dispersa dentro de la membrana, pero en la

conformación promovido por la unión de ligando, su agregación está favorecida termodinámicamente. La unión de una molécula de ligando en un sitio proteína integral, seguido de la difusión de las moléculas de proteína no-liganded a que, a continuación, podría conducir a una agregación y el cambio simultáneo en la conformación de la proteína agregada dentro de la membrana. Este mecanismo podría dar lugar a un fenómeno cooperativo de tipo cis-de largo alcance, si el tamaño de los agregados eventual era muy grande y si su presencia produce perturbaciones locales en las propiedades de la membrana. Sin embargo, la transición se produciría a una velocidad y durante un período de tiempo determinado por la velocidad de difusión de las moléculas de la proteína integral de la membrana mosaico fluido. Este período de tiempo es probable que sea relativamente largo, del orden de minutos (44), como ya se ha mencionado. Por otro lado, si los efectos cooperativos de tipo cis se produjeron en un modelo de subunidad lipoproteína de acuerdo con el mecanismo postulado por Changeux et al. (63), sería de esperar que el cambio de cooperación a ser mucho más rápido. Cambios Con-formación en la aspartyltranscarbamylase proteína alostérica soluble, por ejemplo, tienen tiempos medios del orden de 10 milisegundos (64). Por lo tanto, es de algún interés que en los estudios de la interacción de colicina E1 y E. coli los cambios de fluorescencia que marcaron las transiciones de cooperación de tipo cis aparentes en la membrana celular se produjo en intervalos de uno a varios minutos (62). Si este mecanismo sugerido para el efecto colicina es válida, se podría predecir que (i) congelación-grabado experimentos sobre las bacterias coli-cin-tratadas (28) podría revelar una agregación de partículas dispersa normalmente en la cara de la membrana interna, o (ii ) los cambios en la fluidez de membrana, como las que se producen por los cambios adecuados en la temperatura o por diferentes composiciones de membrana de fosfolípidos (65), pueden afectar notablemente a la cinética de los cambios de fluorescencia que se observan tras la adición de la colicina a las bacterias. En esta discusión de funciones de la membrana, se han presentado algunos mecanismos detallados para tener en cuenta dos fenómenos de membrana. Bien puede suceder que estos mecanismos son correctos. Nuestro objetivo ha sido no tanto para argumentar a favor de estos mecanismos específicos, como para demostrar que el modelo de mosaico fluido de la estructura de la membrana puede sugerir nuevas formas de pensar sobre la membrana funciones vías que son susceptibles de pruebas experimentales. Otros fenómenos de membrana pueden estar influenciadas por mecanismos de difusión similares: para las interacciones ejemplo, célula-célula y célula-sustrato, donde la aposición de intensos campos eléctricos locales a una membrana celular puede afectar a la distribución de las proteínas integrales cargadas eléctricamente dentro de las membranas, o la la unión específica de anticuerpo multivalente a antígenos de superficie celular, donde la unión simultánea de una molécula de anticuerpo a varias moléculas del antígeno puede inducir reordenamientos de la distribución del antígeno en el plano de la membrana, un efecto que puede estar involucrado en el fenómeno de la modulación antigénica (66). Hay otros ejemplos específicos, así. Es muy posible que una serie de funciones metabólicas críticas realizadas por las membranas celulares puede requerir la movilidad de traslación de algunas proteínas integrales importantes. Este podría ser el significado último de la observación prolongada (67) que los lípidos de la membrana de

organismos poikilothermic contienen una mayor fracción de los ácidos grasos insaturados de la más baja su temperatura de crecimiento. Enzimas apropiadas aparentemente llevar a cabo el ajuste necesario bioquímica (68) que mantiene los lípidos de membrana en un estado líquido a la temperatura particular de crecimiento, y si estas enzimas no son funcionales, por ejemplo, a causa de mutaciones, el organismo-a crecer en la parte inferior temperatura (65) debe ser suministrado con el ácido graso insaturado exógena. Si bien se ha sugerido antes de que el mantenimiento de la fluidez de los lípidos puede ser importante para los mecanismos de portadoras que operan a través de una membrana funcional, también es posible que el verdadero propósito de la fluidez es permitir algunas proteínas integrales críticos para retener su movilidad de traslación en el plano de la membrana, como un paso obligatorio en su función.

Resumen

Un modelo de mosaico fluido se presenta para la organización bruto y la estructura de las proteínas y los lípidos de las membranas biológicas. El modelo es consistente con las restricciones impuestas por la termodinámica. En este modelo, las proteínas que son parte integral de la membrana son un conjunto heterogéneo de moléculas globulares, cada uno dispuesto en una estructura anfipática, es decir, con los grupos iónicos y altamente polar que sobresalen de la membrana en la fase acuosa, y los grupos no polares en gran parte enterrado en el interior hidrofóbico de la membrana. Estas moléculas globulares están parcialmente incrustadas en una matriz de fosfolípido. La mayor parte del fosfolípido está organizada como una bicapa de fluido discontinua, aunque una pequeña fracción de los lípidos puede interactuar específicamente con las proteínas de la membrana. Por consiguiente, la estructura de mosaico fluido es formalmente análoga a una solución orientada bidimensional de proteínas integrales (o lipoproteínas) en la bicapa de fosfolípido viscoso disolvente. Recientes experimentos con una amplia variedad de técnicas y varios sistemas de membrana se describen diferentes, todos los cuales son compatibles con, y añadir tanto detalle a, el modelo de mosaico fluido. Por tanto, parece apropiado sugerir posibles mecanismos para diversas funciones de la membrana y los fenómenos de membrana mediada por la luz de la modelo. Como ejemplos, los mecanismos comprobables experimentalmente se sugieren para los cambios en la superficie de células en la transformación maligna, y para efectos cooperativos exhiben en las interacciones de membranas con algunos ligandos específicos. Se agregó una nota en la prueba: Desde que este artículo fue escrito, se han obtenido pruebas de microscopía electrónica (69) que la concanavalina A sitios de unión en las membranas de los fibroblastos de ratón virus SV40-transformado (3T3) están más agrupadas que los sitios en las membranas de las las células normales, según lo predicho por la hipótesis representado en la figura. 7B. También ha aparecido un estudio de Taylor et al. (70) que muestra los efectos notables sobre los linfocitos producidos por la adición de anticuerpos dirigidos a sus moléculas de inmunoglobulina de superficie. Los anticuerpos inducen una redistribución y pinocitosis de estas inmunoglobulinas de superficie, de modo que dentro de aproximadamente 30 minutos a 37? C inmunoglobulinas de la superficie están completamente barridos fuera de la membrana. Estos efectos no se producen, sin embargo, si los anticuerpos bivalentes se sustituyen por

sus fragmentos Fab monovalentes o si los experimentos de anticuerpos se llevan a cabo a 0? C en lugar de 37? C. Estos y otros resultados indican claramente que los anticuerpos bivalentes producen una agregación de las moléculas de inmunoglobulina de superficie en el plano de la membrana, que puede ocurrir sólo si las moléculas de inmunoglobulina son libres para difundir en la membrana. Esta agregación aparece a continuación, para desencadenar la pinocitosis de los componentes de la membrana por algún mecanismo desconocido. Tales transformaciones de membrana pueden ser de importancia crucial en la inducción de una respuesta de anticuerpo a un antígeno, así como en otros procesos de diferenciación celular.