Molecular analysis of microbiota associated with peri-implant diseases

Afya Sahib Diab Al-Radha, Abhi Pal b, Andre Philip Pettemerides c, Howard F. Jenkinson

Por: Laura Segura MuñozBiología Molecular

Medicina 3er semestreUPB

In this article, you will reach the correct diagnosis of the bacteria that cause diseases of peri-implant. There are two major diseases: peri-implant and peri-implantitis mucosis, the latter causing bone loss caused by stress and / or bacteria.

INTRODUCTION

INTRODUCTION

Studies will be used primarily for PCR and DGGE, which help determine the type of bacteria staying there (differentiated as the genetic material and its molecular weight), and further, the more bacteria associated with the disease, to offer patients this a more specific diagnosis.

PERI-IMPLANTE

A las personas con perdida dental se les ofrece una alternativa de implante. La mucosa alrededor del sitio del implante se conoce como Peri-implante, en la cual se puede dar crecimiento bacteriano por falta de higiene principalmente y también por la profundidad del sitio de implante.

La microbiota hace referencia a la flora bacteriana normal que tenemos en las diferentes partes del cuerpo, en especial las zonas húmedas.

La microbiota tiene una relación simbiótica con el hospedero, antagonismo microbiano (Lactobacilos).

Es de las mas complejas y heterogéneas.

Puede verse alterada con la llegada de bacterias oportunistas, causando biofilm.

MICROBIOTA

Método para amplificar una secuencia de DNA para poder estudiarla posteriormente, se realiza antes de la DGGE.

PCR

Es un método de rastreo molecular, por el cual se desnaturaliza en DNA, pasando de una doble cadena a una sencilla por método químico.El punto de desnaturalización aumentará con el tamaño de la secuencia de nucleótidos y por los nucleótidos de la secuencia (suele ser altos en G y C).

DGGEElectroforesis en gel

desnaturalizante en gradiente

Es en gradiente para que se de la desnaturalización de todos los fragmentos, aun los que tienen energía de Gibbs mas negativa.

Cada banda representa diferentes especies microbianas, ya que actúa como un cebador identificando los rRNA 16S bacterianos pudiéndolos diferenciar uno a uno.

HERRAMIENTA POTENCIALMENTE VALIOSA EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO, EN

CONJUNCIÓN CON EL EXAMEN CLÍNICO.

DGGEElectroforesis en gel

desnaturalizante en gradiente

La microbiota oral se puede ver afectada por el ingreso de bacterias en el área de peri-implante, dichas bacterias pueden causar estrés en exceso hasta producir perdida ósea. Por tal motivo se pide exámenes de PCR y DGGE, para identificar cada una de las bacterias involucradas, para poder ofrecer un mejor tratamiento y detectar a tiempo y posible daño a nivel óseo.

RELACIÓN

The aim of this study was to identify bacteria associated with peri-implant diseases using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) as a method for microbio- logical assessment.

GENERAL OBJETIVE

MUESTREO: Todos los 22 sujetos dieron su

consentimiento informado, con la aprobación del Comité de Ética (FCE) de la Facultad de Medicina y Odontología de la Universidad de Bristol

Ninguno de los sujetos que participaron en el estudio habían recibido tratamiento para la enfermedad peri-implante.

MATERIALES Y METODOS

Ninguno de los sujetos tenía una condición médica que requiere el uso de antibióticos locales, antibióticos sistémicos o fármacos anti-inflamatorios, o de agentes anti-microbianos, dentro de los últimos 3 meses.

Malestar y / o con enfermedad infecciosa en el momento del muestreo, el embarazo o la lactancia se consideraron como criterios de exclusión de la investigación.

MATERIALES Y METODOS

TOMA DE MUESTRA

El sitio de implante fue aislado utilizando rollos de algodón para evitar la contaminación con saliva. Entonces, la placa supragingival se eliminó, y la placa se obtuvo de la parte más profunda del surco implantes utilizando una cureta estéril.

MATERIALES Y METODOS

EXTRACCION DEL DNA:1. Las muestras se descongelaron y se mezclaron

en vortex antes de ser centrifugados.2. Se eliminó el sobrenadante y el ADN extraído a

partir de precipitado en suspensión usando GenElute bacteriana de ADN genómico Kit (Sigma-Aldrich) según las instrucciones del fabricante.

MATERIALES Y METODOS

PCR PARA EL DGGE:

Amplificación del DNA por la PCR usando los diferentes componentes y usando agua pura para el marcador negativo.

MATERIALES Y METODOS

DGGE

Luego de la PCR, los fragmentos se somenten a DGGE, para indentificar cada uno de los microorganismos presentes en la muestra.

Los cebadores abrazadera GC fueron confirmados en el apoyo de la amplificación por PCR de 16S rDNA, productos a partir de DNA extraído de una variedad de patógenos periodontales, incluyendo Treponema denticola y forsythia Tannerella.

MATERIALES Y METODOS

SECUENCIA DE LOS PRODUCTOS DGGE

Las bandas fueron extirpadas y luego estraidas del gel para rectificar la prueva usando de nuevo la PCR utilizando los mismos cebadores de DGGE.99% de identidad se utilizó como punto de corte para la identificación positiva de una especie bacteriana. El número promedio de pares de bases (pb) utilizados para el análisis de la secuenciación fue de 116 pb.

MATERIALES Y METODOS

ESPECIES PCR ESPECIFICA

MATERIALES Y METODOS

Se realizó usando cebadores específicos de especie dirigidos a regiones específicas en Aa, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, o Staphylococcus aureus. Los productos de PCR se separaron a través de agarosa al 1,5%, se tiñeron. Por lo menos dos bandas independientes obtenidos para cada PCR específica de la especie se cortaron de los geles y se secuenció para confirmar las especies auténticos.

El porcentaje global de éxito secuencias obtenidas fue del 68,2%, que van del 43% al 100% por tema, y aproximadamente 26 especies fueron identificadas.

Los porcentajes de las diferentes especies bacterianas se muestra en la figura. 1, en esta figura la presencia de más de una cepa bacteriana de la misma especie en una muestra se registró como una sola incidencia.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

Figura 1: Estos resultados sugieren que Fusobacterium spp., Prevotella spp., Y Porphyromonas spp., Contribuyeron a las bacterias más frecuentemente identificados utilizando 16S rDNA y DGGE.

RESULTADOS

RESULTADOS

figura. 2. Estos datos muestran diferencias en las especies en una base de paciente específico. De un total de 252 bandas, 36 (14,2%) fueron identificados como Fusobacterium spp., El 11,4% Prevotella spp. y el 5,9% Porphyromonas spp.

Más de la mitad de las bandas de bacterias pertenecían a la altamente patógena (rojo) y patógenos (naranja).

RESULTADOS

Figura 3: Correlaciones de bacterias diferentes con profundidad de la bolsa (PD), mostró el porcentaje más alto de patógenos (rojo y naranja grupo) bacterias (82%) en los bolsillos más superficiales (<3 mm). Disminuyo con la profundidad de la bolsa en aumento (51%), pero aumentó de nuevo (63%) para los bolsillos más llenos. Otro factor notable fue la relación positiva entre los porcentajes de bacterias altamente patógenas (rojo grupo) con profundidad de la bolsa.

RESULTADOS

RESULTADOS

Figura 4: relación con el índice gingival (GI), donde el porcentaje de bacterias del grupo rojo aumentó con mayor puntuación GI. Porcentaje de naranja bacterias del grupo disminuyó con la mayor puntuación de GI.

RESULTADOS

RESULTADOS

RESULTADOS

Scientific Theory Result

25. Quirynen M. et al.26. Romeo E. Et al.

In successful dental implants, plaque is mainly composed of Gram-positive cocci e.g. Streptococcus.25,26

No, because Streptococcus is the largest, is present but not in the highest quantities

6. Mombelli A. The more pencentage of pathogenic bacteria are red and orange groups.

Yes, he results presented here suggested that the percentage of pathogenic bacteria (red and orange groups) in infected implants was about 40% of the analysed bands.

35. Leonhardt A However, implant success rates can be increased to 95% if the patient maintains a good oral hygiene level.

Yes, because If the patiene maintains a good oral hygiene level, the pathogenics bacterias are no reproduced.

36. Leonhardt A Staphylococci, enteric species, and yeasts have also been found in failing implant microbiota.

Yes, the staphylococci stay in a results.

DISCUSSION

1. The use of PCR with DGGE, gives us a clear diagnosis of the type of bacteria accumulate in the peri-implant region.

2. Is necessary to know what are the bacteria involved in order to give a more specific treatment and more effective.

CONCLUSIONS

3. Hygiene plays a fundamental role in implant patients and to help prevent bacterial proliferation.

4. The bacterial flora microbiota is specific to each person in humid areas, in this case the mouth, when the entry of other bacterial diseases causing altered microbiota in peri-implant region.

CONCLUSIONS

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GRACIAS!!