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Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Juliane Strauss

Krankheitserreger und Diagnose

•Bakterien

•Parasiten

•Pilze

•Prionen

•Viren



Bakterien (Krankheiten)• Cholera• Pest• Tuberkulose• Keuchhusten (Pertussis)• Botulismus• Lepra• Tetanus• Streptokokken• Staphylokokken• Neisserien

Gonokokken

Meningokokken

• Enterokokken



A macrophage extends a semiliquid projection (a so-called pseudopodium) towards some bacteria in the foreground.

Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH



• A series of images shows (top left to bottom right) the process – called phagocytosis – by which some bacteria are ingested by a macrophage.

Image by Lennert Nilsson, Karolinska Inst., Stockholm© Boehringer Ingelheim International GmbH



Parasiten (Krankheiten)• Schweinebandwurm• Trichinellen• Egel (Lungen-, Leber-)• Fadenwürmer• Hakenwürmer• Bandwürmer• Toxoplasmose (Toxoplasma gondii)• Malaria (Plasmodium malariae-Anophelesmücke)• afrikanische Tryponosomiasis, Schlafkrankheit

(Trypanosoma brucei-TseTse-Fliege)



Vor dem Essen, nach dem Essen, Händewaschen nicht vergessen." – diese Faustregel der Kindererziehung zielt ins Zentrum des Themas "Parasiten". Diese sind nur mikroskopisch erkennbare Krabbler, Saugmilben, Rebläuse etc. Auf eine freilebende Tierart kommen vier Parasitenarten - Parasiten sind damit die Gewinner der Evolution.



Mit ihrem Stich kann eine Sandmücke den Menschen mit Leishmanien infizieren. Zwei dieser Parasiten sind links abgebildet. Es handelt sich um einzellige Organismen, so genannte Flagellaten. Fotos: Moll, Uni Würzburg



Verlauf der Elephantiasis

In Afrika und anderen Ländern der Dritten Welt kann schon ein einfacher Mückenstich Elephantiasis verursachen. Manche Stechmücken übertragen die Larven des Fadenwurms Wuchereria bancrofti, der im menschlichen Organismus diese Erkrankung des Lymphsystems auslösen kann.

Filzläuse (Phthirus pubis, rechts) in unseren Haaren wirken wie Drahtseilakrobaten



Prionen

• Rinderwahn (BSE)

• Creutzfeldt-Jakob-Krankheit

• Kuru (Papua Neuguinea)

• Scrapie (Traberkrankheit)



Viren• DNA Viridae

Parvo- (Fetusfehlbildung, Hauterkrankungen)

Papova- (Papillomaviren: Warzen, Zervixkarz.)

Adeno- (Erkältungen, Durchfall)

Herpes-

Alpha-Virinae (orale, genitale Erkrankung, Windpocken)

Beta-Virinae (CMV: Fieber, Lungen-, Leber-, Netzhautentzündg.)

Gamma-Virinae (Epstein Barr Virus: Pfeiffer-Drüsenfieber)

Pox- (Pocken)

• BakteriophagenViren, deren Wirte Bakterien sind



• RNA ViridaePicorna-

Enterovirus Poliomyelitis V-Kinderlähmung, Coxsackie-V-abakterielle Meningitis, FieberHepatitis A (Serotyp 72)-Hep A

Revo- Rota- und Coloradoviren (Magen-Darmtrakt)

Paramyxo-Paramyxo V

Mumps-VirusMorbilli V

Masern-VirusRinderpest-VirusHundestaupe-Virus

Pneumo VMäusepneumonie-Virus



• RNA ViridaeRhabdo-

Vesiculo V

Lyssa V

Tollwutvirus (Virus gelangt ins ZNS-bis zur Herzlähmung)

Bunya- (fieberhafte Erkrankungen)

Toga-

Alpha-V ( Malaria z.B.)

Flavi-Virinae (West Nil V, FSME: Frühsommer-Meningo-

Enzephalitis, Gelbfieber)

Rubi-V (Rötelnvirus-Missbildungen in Schwangerschaft)

Retro-

Spumavirinae (biolog. Wirkung unbekannt)

Oncovirinae (für Mensch und Tier gefährlich-Krebs)

Lentivirinae (HIV-AIDS)



Diagnose von Viren

• Virusisolierung (Anzüchten in Tieren, Bakterien- oder Zellkultur)

• Direkter Virennachweis (Elektronenmikroskop)• Indirekter Nachweis (Plaquemethode)• Immunologische Verfahren (ELISA, RIA)• Serodiagnose (Antiköpernachweis: IgG, IgM)



VirusisolierungEventuell infiziertes Probenmaterial (z.B. von Menschen) wird auf Testsysteme übertragen:

Hühnerembryonen (bebrütete Hühnereier-selten)SäuglingsmäuseZellkulturen (Monolayer)

Das Auftreten von typischen Krankheitssymptomen im Testsystem zeigt Virus in Probenmaterial an:

CPE (zytopathischer Effekt)Plaques (Lysen)

Hühnereier werden bis heute zur Gewinnung von Impfstoffen verwendet.



Direkter Virusnachweis

• Elektronenmikroskopie (hohe Viruskonz. nötig)

Pockenviren

Rotaviren

Coronaviren (SARS)

• Elektronenmikroskop. Viruspartikelzählung (Zugabe einer bekannten Menge an Latexpartikeln-interner Standard)



Indirekter Virusnachweis

• Plaque Methode Aussäen von Monolayer auf festem Nährboden (Agar)

Infektion mit Probenmaterial (verschiedene Verdünnungen herstellen)

Virus lysiert Zelle, diese wiederum nur Nachbarzellen, dabei entstehen Plaques (Löcher im Zellrasen)

Pro Virus entsteht ein Plaque



Immunologische Verfahren• RIA

Kompetitive Probenbindung-Bekannte radioaktive Antigenprobe (in diesem Fall

der Virus der auch zu bestimmen ist)

-Unbekannte Virus-Antigen Probe-Zugabe von Antikörper, der Antigen bindet-Ausfällung des Antigen-AK Komplexes -Umso mehr Radioaktivität ausgefällt wurde,

umso weniger Virus in der zu untersuchenden ProbeSandwich

• ELISA



Serodiagnostik

• Komplementbingungsreaktion (KBR)• Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Neutralisationstest (NT)• Immunfloureszenz• Nukleinsäurehybridisierung

• Diagnostik Influenza Virus



Komplementbingungsreaktion (KBR)

• Patientenserumzufügen von Testantigenen in bekannter Menge

• Sind Antikörper im PatientenserumKomplex aus Antigen und Antikörper bildet sich

Zugabe von Komplement und Hammelerythrozyten:

Kein Farbumschlag-Infektion:

Sind Antikörper im Patientenserum, bindet das Komplement zur Gänze an den entstandenen Antikörper-Antigen Komplex-

Kein Kompliment übrig für die Hämolyse der Erys!

Farbumschlag-keine Infektion

Sind keine Antikörper im Patientenserum, bindet Komplement an die Erys, es kommt zur Hämolyse, diese zeigt somit an, dass keine

Infektion besteht!!



Hämagglutinationshemmtest (HHT)• Hämagglutinine sind Oberflächenstrukturen mancher Viren

(Rötelvirus)

• Hämagglutinine verklumpen rote Blutkörperchen (Agglutination)

• Vom Körper gebildete Antikörper richten sich gegen diese Hämagglutinine

• Testprinzip: Patientenserum werden Hämagglutinine zugegeben

Antikörper in der Patientenprobe: Hämagglut. werden gebunden. Eryzugabe führt zu keiner Agglutination

Keine Infektion: Hämagglutinine binden an zugegebene Erythrozyten: Agglutination



Neutralisationstest (NT)• Nutzt die Tatsache, dass der Körper gegen eingedrungenes

Antigen (Virus) Antikörper bildet

• Testprinzip: Patientenprobe wird def. Menge an Antigen (zu testendes Virus z.B.) zugegeben.

Infektion: Antikörper der Patientenprobe neutralisieren zugegebenes Antigen und Lösung ist nicht mehr imstande Zellkultur zu infizieren.

Keine Infektion: Keine Antikörper, damit wird zugegebenes Antigen nicht von Patientenprobe neutralisiert und kann damit Zellen infizieren!!



Immunfluoreszenz• Nachweis von Antikörpern im Patientenserum• Testprinzip: empfindliche Zellkultur wird mit dem zu

untersuchenden Virus infiziert.

Zugabe von Patientenserum: Bei Infektion: Antikörper des Serum neurtalisieren Virus und Zellen werden nicht cytopathisch.Keine Infektion: keine Antikörper, daher ist Virus

imstande Zellen zu infizieren

Zugabe von fluoreszensmarkierten Antikörpern, die den Erstantikörper binden

Bei Infektion: Antikörper-Antikörper Komplex, damit enststeht Fluoreszenz, im Mikroskop zu beobachten.

Keine Infektion: Kein Erstantikörper, keine Bindung an fluoreszenzmarkierten Antikörper möglich, keine Fluoreszenz



NukleinsäurehybridisierungDient dem Nachweis viraler Gene in der

PatientenprobeTestprinzip SB:

DNA aus Patientenprobe wird isoliert, fragmentiert, auf Gel aufgetragen und auf Nitrozellulose geblottet.

Verwendung radioaktiv markierter Gensonden (DNA Fragmente des nachzuweisenden Virus) zur Hybridisierung mit der Blot-DNA.

Infektion: es kommt zu einer Hybridisierung, auf der Photoplatte entstehen Schwärzungen

Keine Infektion: Gensonden sind nicht homolog zur Patientenprobe, keine Hybridisierung, keine Schwärzung.



Diagnostik Influenza Virus

Nachweis Viraler Antigene

Proben: Nasen-, Rachen-, Alveolarsekret

Nur 1-4 Tage nach Krankheitsbeginn möglich!ImmunfluoreszenzELISAVirusanzucht in Zellkultur

Hoch spezialisiert, nur in wenigen Labors möglich:

PCR Retrospektiv: serologischer Antikörpernachweis

KBR, ELISA, Immunfloureszenz



Diagnostik HIV: ELISAHIV Antikörper ist festphasengekoppelt

=ErstantikörperZugabe des Patientenserum (Antigen)Zugabe von Antikörper-Enzym-Konjugat

=ZweitantikörperÜberschuß an Konjugat durch Waschen

entfernenSubstratzugabe (an sich farblos), erst

durch Enzym wird Subtrat umgesetzt: Farbreaktion

Umso intensiver die Farbe umso mehr Antigene (HIV) waren in der Probe:

Direkt proportional!!

HIV wird immer durch Western Blot bestätigt!!!!



Influenzavirus

Adenovirus

HIV Virus

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