Examples of Epigenetic Phenomena

Monozygotic: Genomes are identical

Una cellula differenziata contiene

tutte le informazioni genetiche

necessarie a dirigere la formazione

di un organismo completo

Figure 7-2a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Memoria cellulare

Quando una cellula di un organismo

multicellulare diventa impegnata a differenziare

in un tipo cellulare specifico, la scelta del destino

è generalmente mantenuta attraverso molte

generazioni cellulari successive, il che significa

che i cambiamenti di espressione genica coinvolti

nella scelta devono essere ricordati

Epigenetic phenomena: heritable alternative states of gene activity that do not result from altered nucleotide sequence

Come la metilazione del DNA può spegnere i geni

Ereditabilità degli schemi di metilazione durante la

duplicazione del DNA

Inattivazione del cromosoma X nelle cellule di mammifero

In alcuni casi l’espressione di alcuni geni può

variare secondo se sono stati ereditati per via

paterna o materna.

Questa espressione differenziale viene definita

“imprinting genomico”

l’epigenoma e l’epigenetica

Epigenoma: trasformazioni del genoma a livello cellulare

Epigenetica: la trasmissibilità di queste trasformazioni nelle generazioni successive

Ambiente

ambiente

citoplasma

genoma

l’ambiente cellulare dell’organismo

l’ambiente esterno

Nutrizione ed epigenetica - Prof.ssa Franca Saccucci

I MicroRNAs (miRNAs) sono dei piccoli RNAs non

codificanti (21 – 25 nucleotidi)

che regolano negativamente l’espressione genica a

livello post-trascrizionale.

Regolazione dell’espressione genica

miRNA

Figure 7-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

elettroforesi bidimensionale di proteine

Microarray di cDNA

DIFFERENZE TRA TRASCRITTOMA E PROTEOMA

Riconoscono e si legano a sequenze localizzate nelle

regioni 3’ non tradotte (3’UTR) di specifici mRNAs ed

effettuano un meccanismo di “hetero-silencing”

degradando il messagero target o bloccando la

traduzione.

•

• Lo stesso miRNA può avere come bersaglio differenti mRNAs;

• Differenti miRNAs possono avere come bersaglio lo stesso mRNA.

WHAT IS A microRNA?

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous ~22 nt long

RNAs that can play important regulatory roles

in animals and plants by targeting mRNAs for

cleavage or translational repression.

By this way they can influence the output

of many protein-coding genes.

[David P. Bartel, Cell, Vol. 116, 281–297, January 23, 2004]

La complessità di un organismo non correla

necessariamente con il numero di geni

La regolazione dell’espressione genica è alla

base della complessità cellulare

This form of combinatorial coding endows an organism with n genes to create, in

theory, 2n different cell-specific gene batteries.

This rationalization provides an easy explanation for the fact that the absolute

number of genes in a genome does not correlate with organismal complexity

Create cellular complexity by differential genes expression

Hobert (2004) TIBS

Hobert (2004) TIBS

La loro scoperta risale al 1993;

Il primo mi-RNA (lin-4) fu identificato in C.elegans.

Regola l’espressione di mRNAs coinvolti nello sviluppo

embrionale del nematode;

Successivamente furono ritrovati sia nelle piante che

negli animali

Oggi si ritiene che il numero complessivo di geni

codificanti per mi-RNA rappresenti circa lo 0.5-1% del

numero di geni codificanti per proteine

• Le sequenze nucleotidiche dei miRNA si sono conservate nel corso dell’evoluzione;

• I loro geni possono essere localizzati sia in regioni intergeniche che all’interno di geni di seconda classe (di solito in introni o in

esoni non tradotti;

• Molte volte troviamo cluster di geni;

•Vengono trascritti (RNA pol II) quindi in modo indipendente o contemporaneamente al gene che li ospita;

•Subiscono un processo di maturazione sia nucleare che

citoplasmatico.

miRNA GENOMICS: INTERGENIC; INTRONIC; EXONIC AND…

Zhao Y and Srivastava D, 2007

microRNA BIOGENESIS

Il processo di maturazione dei miRNA è estremamente complesso

TRASCRIZIONE

Pri-miRNA

MATURAZIONE NUCLEARE

Pre-miRNA

TRASPORTO NEL CITOPLASMA MATURAZIONE CITOPLASMATICA

miRNA maturo

Generalmente i geni codificanti per miRNA sono trascritti nel nucleo dalla RNA-polimerasi II che dà vita a lunghi trascritti, i pri-miRNA, che presentano il cap e la poliadenilazione. Questi ultimi vengono processati da un’RNasi III, Drosha,e dal suo cofattore, Pasha. Si ottengono così trascritti di circa 70 nucleotidi, detti pre-miRNA Successivamente le proteine RAN-GTP ed exportin 5 trasportano i pre-miRNA dal nucleo al citoplasma. Un’altra RNasi III, Dicer, li processa per generare molecole di RNA duplex di circa 22 nucleotidi. Queste molecole vengono caricate nel complesso miRISC(miRNA-associated multiprotein RNA-induced silencing complex). I miRNA maturi a singolo filamento vengono poi mantenuti all’interno del complesso. I miRNA possono avere due modi diversi d’agire a seconda della complementarietà che vi è tra il miRNA e il suo target. Complementarità perfetta: degradazione dell’mRNA. Complementarità imperfetta: blocco della traduzione.

Ligands Cell-surface receptors Intracellular central signaling proteins Nuclear proteins

Fraction of miRNA target 9.1% (3/33) 31.2% (122/391) 18.8% (15/80) 50.0% (19/38)

Cui Q. er al, 2006 modified

Il ruolo biologico dei miRNA è associato al ruolo dei loro mRNA target

MAIN FUNCTIONS OF miRNAs

• Cell proliferazion; • Cell death; • Fat Metabolism

In Flies (Brennecke et al., 2003; Xu et al., 2003)

• Neuronal patterning In Nematodes (Johnston and Hobert, 2003)

• Modulation of Hematopoietic Lineage differentiation

In Mammals (Chen et al., 2004)

• Control of Leaf and Flower Development

In plants (Palatnik et al., 2003)

microRNA FUNCTIONS: SOME EXAMPLES

miR-125b CONTROLS PROLIFERATION OF DIFFERENTIATED CELLS;

miR-181 IS INVOLVED IN THE DIFFERENTIATION OF

MAMMALIAN HAEMATOPOIETIC CELLS TOWARDS THE B-CELL

LINEAGE;

miR-375 IS INVOLVED IN MAMMALIAN PANCREATIC ISLET-CELL

DEVELOPMENT AND IN THE REGULATION OF INSULIN SECRETION;

miR-143 IS INVOLVED IN MAMMALIAN ADIPOCYTE DIFFERENTIATION;

miR-1 PARTICIPATES IN MAMMALIAN HEART DEVELOPMENT

Dal ruolo biologico al coinvolgimento in patologie

Correlation analysis between DNA copy number alteration and miRNA expression.

©2006 by National Academy of Sciences

Correlation analysis between DNA copy number alteration and miRNA expression. (A–C) Expression of mature miRNA transcripts (by TaqMan miRNA assay) and DNA copy number of loci containing the specific miRNA (by aCGH) in 16 ovarian cancer cell lines. (A) Higher magnification of mir-15a and mir-15b maps. Each spot represents a cell line. Expression levels of mature miRNA transcripts are presented in the upper lane as a heat map in 16 cell lines. DNA status is presented in the lower lane (red, DNA copy number loss; green, DNA copy number gain). Cell lines are ranked based on DNA status (leftmost, amplified; middle, normal; rightmost, deleted gene copy). (B) miRNA genes (n = 57) showing concordance between DNA copy number alterations and miRNA transcript expression. (C) miRNA genes (n = 21) showing no concordance. (D) Comparison of miRNA aCGH data from the present tumor set with expression data of 28 miRNAs overexpressed in a different breast cancer set, as reported by Iorio et al. (50). miRNA genes with normal DNA copy number are marked in gray; gains are marked in green, and losses in red. miRNA transcript overexpression (relative to normal breast) is marked in pink; underexpression (relative to normal breast) is in blue (50).

Zhang L et al. PNAS 2006;103:9136-9141

microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG

66

I miRNA sono presenti in diversi fluidi biologici.

La loro espressione correla con specifici fenotipi patologici.

Possono essere utilizzati come biomarcatori non invasivi di patologie.

Possono essere utilizzati a scopo terapeutico.

The MicroRNA Spectrum in 12 Body Fluids, Clinical Chemistry (2010) Jessica A. Weber,1 David H. Baxter,1 Shile Zhang,1 David Y. Huang.

Possono essere liberati da una cellula dopo lisi Possono essere secreti mediante: Microvescicole (> 100 nm) Esosomi (<100 nm)

Analizzando il loro profilo di espressione nel siero di pazienti

e paragonandolo con controlli sono stati trovati

miRNA up o down regolati specificatamente in determinate patologie.

Possibilità di utilizzarli come marcatori precoci, non invasivi di patologie

oppure

come marcatori di risposta a determinate terapie farmacologiche.

DIAGNOSI

TERAPIA

Possibilità di inserire in particolari vettori e veicolarli in cellule bersaglio: miRNA sintetici (nel caso di miRNA specificatamente down-regolati) Antagomir (nel caso di miRNA specificatamente up-regolati)

Tecniche di laboratorio