NAMA JURNAL VOL./NO./BULAN/TAHUN (DIKOSONGKAN)

8

Efek Nefroprotektif Ekstrak Daun Sirsak (Annona muricata L.) pada Mencit Model yang Diinduksi Parasetamol

The Nephroprotective Effect of Ethanolic Extract of Soursop Leaf (Annona muricata L.) on Paracetamol Induced Mice Model

Nur Hidayah *), Suyatmi *), Ratih Puspita *)*) Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret

ABSTRACTBackground: Soursop Leaf (Annona muricata L.) contains active compounds that have antioxidants effect consisting of flavonoid, alkaloid, tannin, triterpenoid and steroid. The aims of this research was to know the protective effect of Soursop Leaf Extract on the renal histological damage on paracetamol induced mice.

Methods: This study was experimental research with the post test only controlled group design. Samples were 30 male Swiss webster mice (2-3 months old) weigh 20g. Samples were divided randomly into 5 groups, each group consisted of 6 mice. The normal group (KN) and negative control group (KKn) were given akuadest for 14 days. KP1,KP2, and KP3 were given soursop leaf extract in dose 5.6mg/20gb, 11.2mg/20gb, and 22.4mg/gb of mice rescpectively for 14 days. Paracetamol in dose 5.07g/20gbw of mice were given to KKn, KP1, KP2, and KP3 on the 12th ,13th ,14th days. On the 15th day mice were sacrificed and renal were taken for histological preparation and stained with HE. Renal histological features were assessed based on quantifying of necrotic cells (pyknosis, karyorhexis, karyolysis) of 50 epithelial cells from proximal tubule of right and left renal. Data were analyzed using One-Way ANOVA test and continued with Post Hoc (LSD) test.

Results: The means of necrotic cells for KN, KKn, KP1, KP2, and KP3 were 8.17, 38.58, 26.92, 21.08 and 11.67 respectively. The One-Way ANOVA test showed a significant differences of renal damage score in five groups with p = 0.000. The Post Hoc LSD test also showed significant difference between five groups, p = 0.000.

Conclusion: Soursop leaf extract can prevent the histological damage renal cell on paracetamol induced mice.Keywords: Soursop leaf extract, paracetamol, renal histological damage

PENDAHULUANGinjal adalah organ vital yang dalam keadaan normal berfungsi untuk mengatur cairan tubuh, mempertahankan keseimbangan elektrolit, mengatur keseimbangan asam basa dan pH, serta mengeluarkan sisa-sisa metabolisme yang tidak berguna bagi tubuh. Apabila kedua ginjal gagal menjalankan fungsinya, maka individu tersebut akan mengalami gagal ginjal (Price dan Wilson, 2006). Penyakit gagal ginjal ditandai dengan adanya kerusakan ginjal, baik struktur maupun fungsi, atau adanya penurunan laju filtrasi glomerulus hingga kurang dari 60ml/menit/1,73 m2 (Suwitra, 2009).Menurut Indonesian Society Nephrology (InaSN), glomerulonefritis kronis masih menjadi penyebab utama penyakit gagal ginjal di Indonesia (39,9%). Penelitian oleh Modlinger et al. (2004) menyebutkan bahwa stres oksidatif dapat berkontribusi atas terjadinya gagal ginjal secara langsung dengan menginduksi kerusakan glomerulus dan iskemia ginjal. Stres oksidatif dapat meningkatkan produksi molekul vasokonstriktor dan retensi garam primer oleh ginjal. Di sisi lain, terdapat Nitric Oxide (NO) sebagai pengatur aliran darah ginjal, umpan balik tubuloglomerular (TGF), dan tekanan natriuresis. Jika NO yang merupakan principal endothelial-derived relaxing factor bereaksi dengan superoxide anion (O2_) maka akan membentuk oksidan yang kuat. Sehingga fungsi NO berkurang yang selanjutnya mengakibatkan kerusakan progresif dari ginjal yang berakhir pada kondisi gagal ginjal. Walaupun sekarang tersedia pengobatan untuk gagal ginjal yaitu hemodialisis dan transplantasi ginjal, namun keduanya membutuhkan biaya yang sangat tinggi (Price dan Wilson, 2006). Karena alasan tersebut, maka sekarang ini banyak masyarakat kita yang tertarik untuk menggunakan obat-obatan herbal sebagai pilihan untuk terapi preventif gagal ginjal. Dengan melakukan pencegahan, diharapkan tidak akan terjadi kerusakan ginjal hingga fase gagal ginjal kronik sehingga bisa menghemat biaya pengobatan. Dari penelitian yang dilakukan oleh Kim et al. (1998) menyebutkan bahwa dalam daun sirsak terkandung senyawa aktif yang berkhasiat sebagai antioksidan. Antioksidan akan membantu melawan efek radikal bebas yang berbahaya bagi organ tubuh, sehingga kerusakan sel akan dihambat (Winarsi, 2007). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek nefroprotektor dari ekstrak daun sirsak.SUBJEK DAN METODE

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan rancangan penelitian yang digunakan adalah post test only controlled group design. Penelitian yang dilakukan di Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret Surakarta ini menggunakan sampel berupa 30 ekor mencit (Mus musculus) galur Swiss webster, jantan, berusia 2-3 bulan, berat badan 20 gram, dan kondisi mencit tidak cacat (aktif dan tidak cacat). Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah incidental sampling.Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak daun sirsak yang diekstraksi dengan metode maserasi dan menggunakan pelarut etanol 70%. Daun sirsak yang digunakan dalam pembuatan ekstrak adalah daun dengan letak dimulai dari lembar keempat setelah pucuk dengan penampakan warna hijau tua. Skala pengukuran variabel ini adalah skala kategorik ordinal.Variabel terikat yang digunakan adalah kerusakan sel epitel tubulus proksimal setelah diinduksi parasetamol dan diberi ekstrak daun sirsak. Skala pengukuran variabel ini adalah skala numerik rasio. Sedangkan variabel luar yang tidak dapat dikendalikan pada penelitian ini terdiri dari kondisi psikologis, reaksi hipersensitivitas, dan keadaan awal ginjal mencit. Sebelum memulai perlakuan, sampel diadaptasikan di tempat penelitian selama 1 minggu, kemudian sampel dibagi menjadi 5 kelompok secara random, yaitu KN (Kelompok Normal), KKn (Kelompok Kontrol Negatif), KP1 (Kelompok Perlakuan 1), KP2 (Kelompok Perlakuan 2), KP3 (Kelompok Perlakuan 3), sehingga masing-masing kelompok terdiri dari 6 ekor mencit.Mencit pada Kelompok Normal hanya diberi akuades 0,3 ml selama 14 hari. Kelompok Kontrol Negatif diberi akuades 0,3 ml selama 14 hari dan parasetamol per oral 0,1 ml/20g BB mencit pada hari ke-12,13, dan 14. Sedangkan Kelompok Perlakuan 1, Kelompok Perlakuan 2, dan Kelompok Perlakuan 3 diberi ekstrak daun sirsak dengan dosis bertingkat yaitu 5,6 mg; 11,2 mg; 22,4 mg selama 14 hari dan parasetamol per oral 0,1 ml/20 g BB mencit pada hari ke 12,13, dan 14. Perlakuan diberikan secara per oral dengan sonde lambung.Pada hari ke-15, mencit dikorbankan dengan cara dislokasi vertebra servikalis. Kemudian dibuat preparat histologi ginjal dengan metode blok parafin dan pengecatan Hematoksilin & Eosin dari ginjal kanan dan ginjal kiri. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya perbesaran 1000 kali pada tubulus kontortus proksimal. Jumlah sel yang mengalami kerusakan ditentukan dengan menghitung inti sel yang mengalami piknosis, karioreksis, maupun kariolisis dari tiap 50 sel.Data yang diperoleh diuji menggunakan uji statistik One-Way ANOVA (Analysis of Variance) dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Multiple Comparisons. Derajat kemaknaan yang digunakan adalah p < 0,05 HASIL

Dari pengamatan preparat didapatkan sel-sel ginjal mencit yang mengalami kerusakan. Berikut adalah hasil perhitungan rerata jumlah kerusakan histologis sel ginjal mencit pada 5 kelompok perlakuan.

Tabel 1. Rerata jumlah Kerusakan Histologis Sel Ginjal Mencit pada Masing-Masing KelompokKelompokKelompok Rata-rata Jumlah Standar Deviasi

KN8,172,406

KKn38,582,198

KP126,921,311

KP221,083,397

KP311,672,188

Dari hasil tabel di atas, dapat diketahui bahwa jumlah kerusakan yang paling tinggi adalah pada Kelompok Kontrol Negatif yaitu sebesar 38,58 2,198. Pada Kelompok Kontrol Negatif (KKn) tersebut mencit diberi akuades dan parasetamol tanpa diberi ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.). Sedangkan kerusakan sel ginjal paling sedikit terdapat pada Kelompok Normal (KN) , yaitu 8,17 2,406 di mana mencit hanya diberi akuades tanpa ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) maupun parasetamol. Uji normalitas data untuk membuktikan sebaran data normal atau tidak, dilakukan dengan uji Saphiro-Wilk karena jumlah sampel yang dianalisis dalam uji statistik adalah 12 irisan preparat untuk setiap kelompok.Dari hasil uji normalitas Saphiro-Wilk tersebut, nilai p > 0,05 untuk kelima kelompok perlakuan sehingga dapat dinyatakan bahwa distribusi data kelima kelompok adalah normal. Dari hasil uji Homogeneity of Variances menggunakan Levenes Test of Varians , didapatkan nilai p = 0,249. Hal ini menunjukkan bahwa varians data antarkelompok sama (p > 0,05).Hasil uji One-Way ANOVA dengan derajat kemaknaan = 0,05 didapatkan nilai signifikansi p = 0,000. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nilai rerata jumlah kerusakan sel ginjal mencit yang bermakna paling tidak pada dua kelompok perlakuan. Uji statistik kemudian dilanjutkan dengan uji Post Hoc untuk mengetahui antarkelompok mana yang mempunyai perbedaan rerata jumlah kerusakan histologis sel epitel tubulus proksimal ginjal yang bermakna. Uji Post Hoc yang digunakan adalah uji Least Significant Difference (LSD). Tabel 2. Hasil Uji Post Hoc (LSD) Antarpasangan KelompokKelompok IKelompok IIBeda Meanp

KNKKn-29.5000,000

KP1-17,3330,000

KP2-14,7500,000

KP3-1,7500,000

KKnKP112.1670,000

KP214,7500,000

KP327,7500,000

KP1KP22,5830,000

KP315,5830,000

KP2KP313,0000,000

Dari hasil Uji Post Hoc (LSD) didapatkan semua nilai p < 0,05 yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nilai rerata jumlah kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal yang bermakna pada semua pasangan antarkelompok data.Hasil pengamatan histologis ginjal mencit keseluruhan kelompok perlakuan dapat dilihat pada gambar 1.

Gambar 1. Fotomikrograf tubulus proksimal pars konvulata korteks ginjal (1) KN; (2) KKn; (3) KP1; (4) KP4; (5) KP3. Tampak dalam gambar, N: inti sel normal, P : inti sel piknosis (inti sel mengisut dan tercat lebih basofil), KR : inti sel karioreksis (inti sel mengalami fragmentasi), KL : inti sel kariolisis (inti sel menghilang). pengecatan HE. 1000x.

PEMBAHASAN

Penelitian ini menunjukkan adanya efek proteksi dari ekstrak daun sirsak yang bermakna secara statistik. Hasil uji One-Way ANOVA didapatkan p = 0,000 (p < 0,05) yang menunjukkan bahwa terdapat perbedaan nilai rerata jumlah kerusakan sel epitel tubulus proksimal ginjal yang bermakna pada paling tidak dua kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Post Hoc Multiple Comparisons menggunakan uji LSD menunjukkan perbedaan bermakna antara masing-masing kelompok. Hal ini berarti setiap pasangan antara dua kelompok terdapat perbedaan rerata kerusakan epitel tubulus yang bermakna. Sel epitel tubulus proksimal ginjal mencit pada Kelompok Normal yang hanya diberi akuades menunjukkan adanya gambaran kerusakan inti sel baik piknosis, karioreksis, dan kariolisis. Hal tersebut karena semua sel dapat mengalami apoptosis, yaitu kematian sel yang terpogram dan akan terjadi pada semua sel normal tanpa adanya pengurangan integritas membran dan akan membentuk badan apoptosis. Sedangkan pada sel yang mengalami nekrosis akan terjadi pengurangan integritas membran dan sel mengalami lisis yang menimbulkan respons peradangan di mana terjadi peningkatan neutrofil untuk memfagositosis sel tersebut (Mitchell dan Cotran, 2007). Berdasarkan hasil uji LSD menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna antara KN dan KKn di mana jumlah sel yang rusak pada KKn lebih banyak dibandingkan KN. Hasil ini sesuai teori yang menyatakan bahwa pemberian parasetamol dosis toksik pada KKn dapat meningkatkan kadar N-asetyl-p-benzoquinoneimine (NAPQI). Ketika NAPQI yang dihasilkan terlalu banyak, melebihi jumlah glutation (GSH) dalam tubuh maka NAPQI akan terakumulasi dalam tubuh dan tidak dapat dieliminasi. Sehingga akan memicu terjadinya stres oksidatif. Stres oksidatif akan mempermudah ikatan kovalen NAPQI dengan makromolekul seperti DNA, lipid, dan protein yang memicu terjadinya peroksidasi lipid, kerusakan membran organel sel, dan fragmentasi DNA (Rubin et al., 2005).Antara KKn-KP1, KKn-KP2, dan KKn-KP3 menunjukkan adanya perbedaan yang bermakna. Bila membandingkan rerata antar kelompok, nampak kelompok perlakuan dengan ekstrak daun sirsak, baik KP1, KP2, dan KP3 memiliki nilai rerata kerusakan lebih rendah dibandingkan Kelompok Kontrol Negatif (KKn). Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak daun sirsak dapat mengurangi kerusakan histologis sel epitel ginjal mencit akibat induksi parasetamol dosis toksik. Efek proteksi ekstrak daun sirsak berasal dari bahan aktif diantaranya flavonoid, triterpenoid, alkaloid, tanin, saponin dan steroid. Bahan-bahan tersebut telah terbukti mempunyai efek antioksidan yang nantinya akan mencegah kerusakan dan kematian sel terutama setelah diberi induksi parasetamol dosis toksik. Komponen-komponen tersebut tidak kalah penting perannya dalam menginduksi status antioksidan tubuh. Dengan meningkatkan status antioksidan tubuh akan memberikan perlindungan lebih besar dalam melawan radikal bebas. Sebagian senyawa di atas, seperti flavonoid, tanin dan steroid berfungsi dalam menangkap senyawa oksidan serta mencegah terjadinya reaksi berantai (Winarsi, 2007).Flavonoid yang terkandung dalam ekstrak daun sirsak memiliki peran yang besar dalam menghambat kerusakan sel ginjal mencit. Hal ini sesuai dengan penilitian yang dilakukan oleh Gupta et al. (2005) yang menyatakan bahwa dosis ekstrak daun sirsak 1,2 gr/hari/1,5 kg BB kelinci terkandung flavonoid maksimal yang memberikan efek nyata sebagai perlindungan organ tubuh akibat radikal bebas. Flavonoid akan menangkap radikal bebas dengan melepaskan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya dan memutus reaksi berantai dari radikal bebas sehingga dapat mencegah terjadinya stres oksidatif (Almatsier, 2004). Gao et al. (2010) telah meneliti tentang aktifitas antioksidan dalam tanin melalui Diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging. Saponin dan triterpenoid dapat mengurangi konsentrasi radikal bebas dengan meningkatkan kadar glutation tubuh. Peningkatan glutation tubuh akan mengisi kembali kekosongan dan dapat digunakan untuk konjugasi NAPQI sehingga toksisitas ginjal karena ikatan kovalen antara NAPQI dengan protein dapat dikurangi (Frank, 1995). Baskar et al. (2007) telah meneliti tentang potensi antioksidan pada ekstrak daun sirsak dalam melawan radikal bebas. Dengan menggunakan model in vitro, menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirsak mempunyai aktivitas tinggi dalam menangkal radikal bebas, diantaranya Azino-bis 3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) (90,05%), radikal hidroksil (85,88%), nitrit oksida (72,60%), dan DPPH (89,37%).Perbandingan antarkelompok yang diberi ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) yaitu KP1-KP2, KP1-KP3, dan KP2-KP3 menunjukkan perbedaan bermakna dimana jumlah kerusakan sel yang paling banyak adalah pada KP1 kemudian berturut-turut KP2 dan KP3. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan dosis dapat meningkatkan efek proteksi terhadap kerusakan histologis sel epitel tubulus proksimal ginjal yang diinduksi parasetamol dosis toksik. Penurunan jumlah kerusakan sel disebabkan oleh kandungan antioksidan senyawa aktif pada pemberian ekstrak daun sirsak KP3 > KP2 > KP1.Hal ini sesuai dengan penelitian oleh Suharyadi et al. (2013) yang menggunakan ekstrak daun sirsak sebagai nefroprotektor pada tikus putih yang diinduksi bahan oksidan Dymethylbenzanthrene (DMBA). Ekstrak daun sirsak diberikan dengan dosis yang berbeda yaitu 100, 200, dan 400 mg/kgBB tikus selama 8 minggu. Dalam penelitian ini didapatkan bahwa dosis ketiga yaitu 400mg/kgBB merupakan dosis paling efektif dalam mencegah kerusakan ginjal oleh DMBA.Meskipun peningkatan pemberian ekstrak daun sirsak pada penelitian ini dapat meningkatkan efek proteksi terhadap ginjal yang diinduksi parasetamol dosis toksik, namun masih belum mampu mengembalikan kondisi ginjal seperti pada kelompok normal (KN). Terdapat perbedaan yang signifikan antara KP1, KP2, dan KP3 dikarenakan dosis dan durasi pemberian ekstrak daun sirsak belum optimal untuk mencegah kerusakan sel ginjal hingga seperti kondisi awal.Dalam penelitian ini belum dapat menemukan Lethal Dose dari ekstrak daun sirsak, namun dari penelitian sebelumnya oleh Artini et al. (2012) dengan menggunakan ekstrak daun sirsak sebagai antioksidan pada penurunan kadar asam urat tikus Wistar didapatkan bahwa pada dosis tertinggi pada penelitian tersebut justru terjadi penurunan efek antioksidan dibandingkan dosis kedua. Ekstrak daun sirsak diberikan dalam 3 dosis, yaitu 100 mg/kgBB, 200 mg/kgBB, dan 400 mg/kgBB tikus. Dan hasilnya menunjukkan bahwa dosis paling efektif dalam menurunkan kadar asam urat adalah dosis kedua yaitu 200 mg/kgBB tikus. Kekurangan lain dalam penelitian ini adalah masih belum diketahui waktu optimum dalam pemberian ekstrak sehingga peneliti belum tahu pasti jangka waktu paling efektif untuk mengurangi kerusakan sel ginjal mencit sampai ke kondisi yang normal.SIMPULAN

Pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) dapat mencegah kerusakan sel ginjal mencit (Mus musculus) yang diinduksi parasetamol dengan nilai p < 0,001 dan beda mean antara Kelompok Kontrol Negatif (KKn) dan Kelompok Perlakuan 1 (KP1) adalah 12,167.SARAN

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan dosis dan lama pemberian ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) yang lebih bervariasi sehingga dapat diketahui dosis dan lama pemberian ekstrak daun sirsak yang paling tepat dan efektif untuk mengurangi kerusakan sel ginjal. Selain itu juga perlu dilakukan penelitian untuk meneliti masing-masing komponen senyawa dalam daun sirsak yang paling berperan dan berefek paling besar dalam mencegah kerusakan sel ginjal mencit. UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terimakasih kepada Isdaryanto, dr.,MARS dan Aji Suwandono, dr., SH atas bimbingan serta saran yang sangat membantu selama penelitian hingga penulisan naskah publikasi ini. DAFTAR PUSTAKA

Almatsier S (2004). Prinsip dasar ilmu gizi. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama, pp: 175-176.

Artini NPR, Wahyuni S, Sulihingtyas WD (2012). Ekstrak daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai antioksidan pada penurunan kadar asam urat tikus wistar. Jurnal Kimia 6 (2), pp:127-137

Baskar R, Rajeswari V, Kumar TS (2007). In Vitro antioxidant studies in leaves of Annona species. Indian Journal of Experimental Biology, 45:480-485

Frank CL (1995). Toksikologi dasar. 2nd ed. Jakarta: UI Press,pp: 227-235

Gao FD, Xu M, Yang CR, Zhang YJ (2010). Phenolic Antioxidants from the leaves of Camellia pachyandra Hu. Journal of Agriculture and Food Chemical,58(15), pp:8820-8824

Kim GS, Zeng L, Alali F, Roger LL, Wu FE, Sastrodiharjo S, Mc Laughlin JL (1998). Muricoreacin and murihexocin C, mono-tetrahydrofuran acetogenins, from the leaves of Annona muricata. Phytochemistry. 49(2):565-71

Kumar V, Cotran RS, Robbins SL (2007). Buku ajar patologi robbins volume 1. Edisi 7. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC

Mitchell R.N. dan Cotran R.S (2007). Jejas, adaptasi, dan kematian sel. Dalam: Kumar V., Cotran R.S., Robbins S.L. (eds). Buku ajar patologi robbins volume 1. Edisi VII. Jakarta: EGC, pp: 3, 26-27

Modlinger PS, Wilcox CS, Aslam S (2004). Nitric oxide, oxidative stress, and progression of chronic renal failure. Seminars in Nephrology. 24(4): 354-365

Price SA dan Wilson LM (eds). Patofisiologi konsep klinis proses-proses penyakit. Edisi 6. Volume 2. Jakarta: EGC,pp: 867-894

Prodjosudjadi W (2006). Incidence, prevalence, treatment and cost of end-stage renal disease in Indonesia. Ethnically & Disease. 16:14-16

Rubin E, Gorstein F, Rubin R, Schwarting R, Strayer D (2005). Rubins pathology: Clinicopathologic foundations of medicine. 4th ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins, pp: 22-24

Shewta G, Pramod KM, Surrender S, Sharma, Rimi S (2006). Antidiabetic, anti hypercolesterolemic and antioxidant effect of ocimum sanctum (kinn) seed oil. Indian Journal of Experimental Biology. 44:300-304

Suharyadi A, Sukohar A, Muhartono (2013). The Effect of Soursop Leaf Ethanol Extract on Renal Histopatological Analysis of DMBA Induced. Faculty of Medicine Lampung. pp: 23-37

Suwitra K (2009). Penyakit Ginjal Kronis. Dalam :Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, Simadibrata M,Setiati S (eds). Buku ajar ilmu penyakit dalam jilid II. Jakarta:Pusat Penerbitan Departemen Ilmu Penyakit Dalam FKUI, pp:1035-1040

Winarsi H (2007). Antioksidan alami dan radikal bebas: Potensi dan aplikasinya dalam kesehatan. Yogyakarta: Kanisius, pp: 20, 77-81