net electronic journal* nanociencia et...

R. Gómez Puerto, A. Ramirez, R. Díaz-Ruiz

Internet Electron. J. Nanocs. Moletrón. 2015, Vol. 13, No 2, pags. 2443-2456

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http://www.revista-nanociencia.buap.mx

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Internet Electronic Journal*

Nanociencia et Moletrónica

Diciembre 2015, Vol.13, N°2, pp 2443-2456

Microdeformaciones en superficies fotoreceptoras de

hojas de plantas

R. Gómez Puerto1, A. Ramirez2, R. Díaz-Ruiz1

1Colegio de Postgraduados, Campus Puebla. Km 125.5 Carretera Federal México-Puebla, C.P. 72760, Puebla, Puebla. México.

2Laboratorio de Nanotrónica, Facultad de Ciencias de la Electrónica de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Ciudad Universitaria, 72550 Puebla, Puebla. México

e-mail: [email protected]

recibido: 12 de Mayo 2015 publicado: 30 de Diciembre 2015

Citation of the article: R. Gómez Puerto, A. Ramirez, R. Díaz-Ruiz, Microdeformaciones en superficies

fotoreceptoras de hojas de plantas, Internet Electron. J. Nanocs. Moletrón. 2015, Vol. 13, No 2, pags. 2443-2456

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Microdeformaciones en superficies fotoreceptoras de hojas de plantas

R. Gómez Puerto1, A. Ramirez2, R. Díaz-Ruiz1

1Colegio de Postgraduados, Campus Puebla. km 125.5 Carretera Federal México-Puebla, C.P. 72760, Puebla, Puebla. México.

2Laboratorio de Nanotrónica de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Ciudad Universitaria, 72550 Puebla, Puebla. México

e-mail: [email protected]

RESUMEN Siendo el proceso de fotosíntesis elemento primordial en el desarrollo de las plantas, es de sumo interés conocer el tipo de morfología superficial presente en el material biológico, en este caso el haz de las hojas (Phaseolus Vulgaris), principal fotorreceptor de la planta, cuyas características morfológicas determinan su alta o baja eficiencia de fotorecepción y por consiguiente de la planta. El análisis está limitado a tres tipos de hojas crecidas en condiciones de invernadero: testigo (T), anticongelante (ANT) y giberelina (G). El instrumento para el análisis es el Microscopio de Fuerza Atómica (AFM) que nos permite conocer tanto las condiciones estructurales de las muestras a micro y nano escala, para localizar microdeformaciones y agregados que permitan determinar las variaciones de la superficie fotoreceptora. Palabras clave: Microdeformaciones, fotoreceptores, material biológico, AFM.

1. INTRODUCCIÓN La manipulación genética en plantas ha mostrado señales de éxito, y se han empleado durante siglos para mejorar la producción de cosechas, como son los tratamientos para plantas a prueba de congelación, estos tratamientos derivan de muchos organismos marinos como los peces de la Antártida que producen una proteína de tipo anticongelante, la cual se caracteriza por su superficie hidrofóbica, que impide la formación de cristales de hielo a bajas temperaturas. La inserción de este gen ha permitido obtener cosechas estables en la época tardía de congelación de la primavera o en áreas que cuentan con estaciones de cultivo muy limitadas [1]. Por otra parte está el uso de Giberelinas, las cuales fueron aisladas por primera vez a partir de un hongo parásito Gibberella fujikuori que causa un crecimiento anormal de las plántulas de arroz y que posteriormente se descubrió que era una hormona natural del crecimiento en muchas plantas, donde la elongación se lleva a cabo mediante un incremento tanto del número de divisiones celulares en determinadas zonas como del alargamiento de las células en que se han dividido [2].

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Si bien los tratamientos antes expuestos son de suma importancia para el crecimiento de la planta bajo condiciones específicas, la pregunta que nos surge es si dichos tratamientos tienen algún efecto en el principal fotorreceptor de las plantas, en este caso, en las hojas del frijol sometidas a dichos tratamientos. Tomando en cuenta que la luz regula, controla el desarrollo y la evolución de la planta, se ha minimizado la importancia de las características estructurales de la superficie de las hojas (región primaria de incidencia de la luz solar) que bien pueden permitir una mayor o menor fotorecepción[3]. La morfología de los cuerpos son diversas y su ordenamiento es distinto en la superficie, cuando es analizada su topografía presenta una compleja y amplia diversidad de particularidades estructurales naturales o artificiales que las caracterizan, donde la rugosidad es el concepto que permite describir dichas irregularidades en la superficie [4]. La tendencia en la investigación sobre materiales nano-estructurados tiene su fundamento en la naturaleza, tal como lo fue el efecto Lotus [5], los trabajos sobre piel de tiburón [6] y trabajos posteriores [7], donde es posible generar aplicaciones novedosas con base a características estructurales de los materiales, entre otros. Debido a que la luz juega un papel importante en la fotosíntesis, en este trabajo se pone de manifiesto la superficie de absorción de la luz, se analiza la superficie del haz de la hoja para ver de qué forma “atrapa” los fotones, siendo estos los que proveen de la energía necesaria para los procesos biológicos [8]. Haciendo una analogía con los sistemas fotovoltaicos, cuanto mayor sea la cantidad de fotones que inciden sobre la superficie podríamos decir que mayor será la cantidad de energía asimilada, para que se cumplan altas expectativas en el foto-asimilado se debe considerar la micro estructura de la superficie, es decir, montículos columnares que tienen un efecto positivo en la eficiencia de captación de energía solar, tendencia de la tercera generación de sistemas fotovoltaicos que son el camino a futuros sistemas fotovoltaicos en base a “copiar” las características estructurales de sistemas biológicos [9]. Para mejorar la eficiencia de la conversión de energía solar, se debe considerar una superficie que reduzca al mínimo la cantidad de luz reflejada de modo que el material (en este caso las hojas de frijol) pueda captar tanta luz como sea posible [10], es decir, que el texturizado de la superficie permita mejorar la captación de fotones, que de otra manera podrían ser reflejados lejos de la superficie. Sin embargo, dicho efecto de reflexión puede ser aprovechado por la morfología de la superficie, es decir, parte de la luz reflejada puede ser asimilada por una micro estructura adyacente al lugar de incidencia donde tendrá otra oportunidad de ser absorbida, de esta forma las perdidas por reflexión son minimizadas y como consecuencia hay una mejora en la foto-sensibilidad del material [11]. Las condiciones estructurales son una tendencia importante dentro del análisis y diseño de los nuevos sistemas fotoreceptores, ya que en base a características específicas de crecimiento será posible en un mediano/largo plazo replicar dichos diseños. En el caso particular de las hojas de las plantas, estas presentan características estructurales durante su crecimiento y sufren un



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proceso de adaptación natural al medio, estos foto-sensores naturales son tópico de interés para realizar observaciones a escala nanométrica sobre sus condiciones estructurales, el AFM nos permitirá describir y cuantificar la rugosidad y saber si existe un diseño estocástico o determinista en su superficie [5,7] que permita saber si con ello se presenta un efecto positivo o negativo en la captación de la luz considerando para este caso en particular el efecto que tengan los productos aplicados a la planta. 2. Materiales y Métodos La variedad de frijol utilizada fue Negrito-CP, la cual es de tipo II con un ciclo biológico de seis meses. Se realizaron cuatro aplicaciones de Giberelinas y de anticongelante a razón de 1 g y 2.5 g por litro respectivamente a intervalos de 15 días. Los pesos de los productos se hicieron con una balanza analítica ADAM® versión 3.3. Las aspersiones fueron con un atomizador con capacidad de un litro evitando escurrimientos en las hojas. La siembra fue en macetas de plástico con 6 Kg de suelo agrícola depositando una semilla por maceta. Las plantas fueron fertilizadas con sulfato de amonio como fuente de nitrógeno superfosfato de calcio triple para fósforo a razón equivalente a la fórmula 40-40-00 recomendado para frijol. La aplicación fue en dos momentos, uno a la primera hoja trifoliada formada depositando todo el fósforo y la mitad de nitrógeno, y la segunda a los 15 días para agregar el resto de nitrógeno. Se analizaron 6 muestras de hojas de frijol tomadas de distintas plantas en el invernadero

localizado en el Colegio de Postgraduados Campus Puebla, el criterio para su elección fue que dichas hojas se encontraran en el tercer nudo del tallo ascendente, ubicando una hoja compuesta (trifoliada) y tomando como muestra la hoja central del trifolio, otro aspecto a considerar fue que dichas hojas tuvieran una longitud equivalente en su nervadura central tomando como referencia la altura desde la superficie del suelo (ver Tabla 1)

Tabla 1. Muestras tomadas en el invernadero y nomenclatura

Tratamiento Abreviatura Altura (cm) Longitud de Hoja (cm)

Testigo T 20.5 4.4

Anticongelante ATN 20.25 4.2

Giberelina G 21 4.6

Se analizaron tres segmentos del haz de cada hoja (ver Figura 1), ubicados en su parte central (a2) y en los extremos de la misma (a1 y a3) para observar la morfología de dichas zonas y



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averiguar si presentan las mismas características estructurales a escala micro y nano métrica, como referencia primaria se consideró el punto central del haz de la hoja (a2), y la distancia a los extremos partiendo de ese punto fue de 1.6 cm (a1 y a3) que se tomó como distancia fija.

La técnica experimental que se empleo es la microscopía de fuerza atómica (AFM, por sus siglas en inglés), con un microscopio JEOL® SPM 5200, cuyo principio de funcionamiento se basa en la interacción local entre la punta y la superficie de la muestra, con lo que se generan imágenes tridimensionales con alta resolución espacial en tiempo real, que proporcionan un perfil tridimensional de la superficie, lo que permite la caracterización de agregados, texturas y defectos superficiales de las hojas de frijol coleccionadas [12,13]. Los análisis morfológicos a través del AFM, permiten conocer la rugosidad de la superficie (Ra) que se aplica a un plano tridimensional, a través de:

Ra =1

Lf x( )

0

L

ò dL , (1)

donde L es la longitud de muestreo. Mientras que la superficie neta del plano de análisis (S), nos indica el área “real” de la superficie. Las imágenes obtenidas ayudarán a través de la perfilometría a conocer las características estructurales que presentan las hojas para la fotorecepción, asimismo permitirá averiguar si se presentan diferencias estructurales de acuerdo al tratamiento químico al que fueron sometidas.

Figura 1. Segmentos analizados del haz el foliolo central del trifolio de frijol en la parte apical (a1), central (a2) y

basal (a3).

Las medición máxima se hizo en base a los límites de operación del AFM, siendo estos de 25 μm2 y disminuyendo la escala cada 5 μm2 con una velocidad constante de barrido de 333.3 μs lo que garantiza una mejor resolución en los resultados.

a1

a2

a3

1.6cm

1.6cm



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3. RESULTADOS Los resultados del análisis morfológico de las muestras del Testigo, presentan un aumento de 42.20% en relación al área real, es decir, si extendiéramos la superficie rugosa esta ocuparía el cien por ciento real del área más el porcentaje que presenta de aumento debido a su rugosidad (ver Tabla 2), dicho resultado es relevante debido a que permite cuantificar el área real de forecepción. La naturaleza provee a la hoja de frijol de una superficie texturizada que además de brindarle mayor área de incidencia de fotones, también tiene el propósito de redirigir la luz reflejada en la superficie de la hoja, es decir, que la hoja pueda absorber la luz recibida desde diferentes posiciones, por lo que no es necesario que la hoja reciba la luz directamente. Los resultados de topografía de las muestras analizadas (Figura 2) se procesaron para poder tener un escenario de la topografía de las muestras, lo que permite apreciar la topografía general de la superficie, donde se localizan micro-deformaciones y agrupamientos en una distribución irregular con una altura máxima de 3.2 μm en (c) y 888 nm en (e) como altura mínima, lo que quiere decir que la hoja tiene dos niveles de estructuras localizados en la superficie, donde es posible detectar estructuras a micro-escala y nano escala, situación que se presenta en cada una de las muestras analizadas.

Tabla 2. Resultados de análisis de la muestra testigo

Mediciones [µm]

a1 a2 a3

Ra [µm] S [µm2] Ra [µm] S [µm2] Ra [µm] S [µm2]

25 0.5045 ± 0.0535

799.75 ± 145.25

0.465 ± 0.087

773.75 ± 127.65

0.342 ± 0.026

719.1 ± 46.2

20 0.492 ± 0.019

627.25 ± 129.35

0.434 ± 0.147

635.55 ± 200.15

0.297 ± 0.016

484.05 ± 43.95

15 0.4875 ± 0.0385

268.75 ± 8.35

0.3655 ± 0.1465

355 ±107.7

0.353 ± 0.001

331.6 ± 74.1

10 0.336 ± 0.009

118.55 ± 4.25

0.3285 ± 0.1495

133.5 ± 29.1

0.240 ± 0.003

140.15 ± 15.95

5 0.152 ± 0.05

29.15 ± 1.45

0.1695 ± 0.0255

32.1 ± 3.2

0.115 ± 0.015

29.85 ± 0.95

En este punto se observa una morfología donde la asociación espontánea de constituyentes forman estructuras las cuales podrían formarse por un proceso de auto-ensamblaje con un diseño estocástico. Otra característica importante a considerar es cuando los agrupamientos en



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una distribución irregular localizados en la morfología presentan algún patrón en su ordenamiento, es decir un diseño determinista de la superficie. Sin embargo se observaron dos niveles estructurados en el orden de micrómetros y nanómetroa, donde se aprecian niveles de rugosidad que difieren entre las muestras de (a), (b) y (c) que tienen un área de 25 µm2 y las muestras (d), (e) y (f) con 5 µm2 de área de barrido, donde a dimensiones de 5 µm2 son perceptibles características morfológicas que a 25 µm2 no podemos apreciar tan fácilmente. A diferencia de las muestras de Testigo, en el caso de las muestras de Anticongelante, se presentan agrupamientos que siguen un patrón como se observa en (d), (e) y (f) de la Figura 3, dichos patrones se presentan en áreas de 1 x 2 µm con alturas que oscilan entre 196 nm y 585 nm, lo que confirma que un nivel estructural se puede apreciar en el orden de micro metros y otro nivel en el orden de nano metros donde se detecta un diseño determinista parecido a un sistema auto-organizado.

Figura 2. Topografía de la muestra Testigo en los puntos de análisis a1, a2 y a3, donde se aprecian diferencias estructurales como en las muestras de a1 y a3 y micro-deformaciones en (b) y (d), así como agrupamientos en una

distribución irregular como en el caso de (c) y (f).



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Tabla 3. Resultados de análisis de la muestra Anticongelante

Mediciones [µm]

a1 a2 a3

Ra [µm] S [µm2] Ra [µm] S [µm2] Ra [µm] S [µm2]

25 0.678 ± 0.094

818.85 ± 82.05

0.47 ± 0.108

695.15 ± 26.45

0.321 ± 0.002

638.7 ± 1.8

20 0.716 ± 0.123

545.6 ± 53.2

0.597 ± 0.195

467 ± 29

0.498 ± 0.039

524.65 ± 58.95

15 0.528 ± 0.132

354.7 ± 83.4

0.457 ± 0.112

251.25 ± 8.85

0.416 ± 0.021

333.5 ± 86.3

10 0.334 ± 0.123

145.8 ± 7.2

0.298 ± 0.083

112.45 ± 4.65

0.332 ± 0.046

138.05 ± 26.15

5 0.167 ± 0.053

34.6 ± 3.4

0.139 ± 0.039

29.2 ± 0.4

0.191 ± 0.062

32.7 ± 4.7

Figura 3. Topografía de la muestra de Anticongelante, donde se observa una condición estructural en (a), (b) y (c) en el orden de micrómetros, mientras que en (d), (e) y (f) observamos un diseño determinista.

Las micro deformaciones en las morfología de Anticongelante, presentan una altura máxima de 4.6 µm (ver Figura 3 (a)). Mientras que la superficie de incidencia de luz presenta un aumento



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de 51.45% en relación del área real de incidencia (Tabla 3), lo que nos indica una mejor captación de energía en la superficie. Para las muestras de Giberelina (ver Figura 4), se presentan montículos con una altura máxima de 4.4 µm y una altura mínima de 3.8 µm para el primer nivel estructural, donde observamos un diseño aleatorio. Mientras que la superficie de incidencia de luz presenta un aumento de 46.13% en relación del área real de incidencia (Tabla 4), lo que nos indica que en su segundo nivel estructural debe presentar una morfología compleja, ya sea del tipo estocástico o determinista. Para tener un panorama más claro de las características estructurales de la muestras analizadas, en la Figura 5 se presenta un esquema general de topografía 3D, donde es posible apreciar que en las muestras de Testigo y Giberelina se presentan aglomerados y una región aparentemente lisa en la muestra de 25 µm2 mientras que en las muestras de menor área es posible apreciar una distribución irregular (estocástica) que hace evidente como dichas superficies no son lisas y presentan una morfología con micro y nano estructuras, lo que nos hace pensar que a un nivel de análisis más superficial se puedan encontrar micro-deformaciones y/o agrupamientos que hablarían de dos niveles estructurales localizados. En el caso de las muestra de Anticongelante es posible apreciar un patrón determinista en su morfología, lo que nos hace pensar en un proceso de auto-organización estructural, dicha característica deja ver la influencia positiva de microestructuras adyacentes en la superficie de incidencia. Al tener una superficie texturizada la luz reflejada se puede redirigir a la superficie, además de que dicha condición permite que la hoja pueda absorber la luz recibida desde diferentes posiciones.

Tabla 4. Resultados de análisis de la muestra Giberelinas

Mediciones [µm]

a1 a2 a3

Ra [µm] S [µm2] Ra [µm] S [µm

2] Ra [µm] S [µm

2]

25 0.688 ± 0.045

879.8 ± 174

0.453 ± 0.028

716.7 ± 2.3

0.531 ± 0.001

791.15 ± 109.95

20 0.738 ± 0.067

542.05 ± 73.75

0.574 ± 0.125

519.95 ± 50.05

0.295 ± 0.101

430.95 ± 15.95

15 0.769 ± 0.05

469 ± 195.7

0.703 ± 0.118

318.2 ± 6.8

0.456 ± 0.139

316.5 ± 16.9

10 0.525 ± 0.058

196.85 ± 79.15

0.395 ± 0.098

215.3 ± 100.5

0.443 ± 0.140

143.55 ± 6.25

5 0.185 ± 0.098

58.8 ± 32.2

0.215 ± 0.102

35.65 ± 7.85

0.199 ± 0.014

32.1 ± 0.5



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Figura 4. Topografía de la muestra de Giberelina, donde observamos micro-deformaciones.

Los resultados del análisis morfológico de las muestras presentaron un aumento en relación al área real de su superficie para captación de energía solar, donde esto lo entendemos como la extensión de la superficie rugosa como si de una micro-lamina se tratase (ver Grafica 1). Se observa mayor rugosidad en el caso de las Giberelinas y anticongelante en relación al testigo a escalas de 10 a 15 μm, hecho que indica un efecto en la superficie de las hojas de frijol al agregar dichos productos. Una mayor área real de incidencia se presenta en las muestras de Anticongelante seguida de las Giberelinas (Gráfica 2), donde se observa un diseño determinista parecido a un sistema auto-organizado ya que en las muestras de 5 μm2 presentó cierto patrón en su superficie.



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Figura 5. Esquema general de topografías 3D, de las muestras de Testigo, Anticongelante y Giberelina, donde se puede observar que a dimensiones “mayores” de 25 μm

2 se presentan defectos estructurales que no son

perceptibles como en el caso de muestras de menor dimensión, es decir que en muestras de 25 μm2 no

apreciamos características estructurales que si podemos observar en muestras de 5 μm2.



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Gráfica 1. Rugosidad de los segmentos de las regiones a1, a2 y a3 de las muestras de Testigo, Anticongelante y Giberelina. Las barras representan la desviación estándar

Gráfica 2. Área real de incidencia (energía solar) de las muestras de Testigo, Anticongelante y Giberelina.

Un análisis más a fondo a nano-escala permitirá saber si en las muestras de Testigo y Giberelina se produce un diseño estocástico o determinista en su superficie, situación que puede presentarse de forma no tan evidente, pero que puede influenciar significativamente en la fotorecepción.



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4. CONCLUSIONES Las características estructurales en el material biológico presentan un diseño en apariencia estocástico, sin embargo en el caso de la topografía de anticongelante se presentó un patrón determinista a una escala de 5 μm, característica estructural y periódica que se presenta en las muestras que se tomaron en sus diferentes segmentos (a1, a2 y a3), a diferencia de las muestras de Testigo y Giberelina donde se observaron micro-deformaciones y agrupamientos en una distribución irregular. Es importante señalar que a dimensiones grandes (25 μm) no son perceptibles dichos agrupaciones, caso contrario a lo que sucede en muestras de 5 μm donde las diferencias son perceptibles. Además las superficies de las muestras de anticongelante y Giberelinas presentan una mayor extensión del área analizada en relación al testigo, debido al tipo de micro-deformaciones que se presentan, lo que a su vez se traduce como una mayor área de incidencia de energía solar (fotones). Dichas condiciones podrían evidenciar un menor o mayor rendimiento en la planta lo que podría servir como diseño estructural para futuras celdas solares basadas en material biológico. AGRADECIMIENTO Los autores agradecen al Prof. Dr.rer.nat.habil. Dr.h.c. Alfred F. K. Zehe Kuhnt, por las facilidades prestadas para el uso del Microscopio de Fuerza Atómica en el Laboratorio de Nanotrónica de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. BIBLIOGRAFÍA [1] Campbell M., S. Farrell. Bioquímica. Thomson. México. pp 372-373. 2004 [2] Raven P., R. Evert., S. Eichhorn. Biología de las Plantas. Reverté. España. pp 489-492. 1992 [3] Herrera J., R. Alizaga., E. Guevara., y V. Jiménez. Germinación Y Crecimiento de la Planta. Editorial Universidad de Costa Rica. San José, Costa Rica. pp 63–64. 2006 [4] Hinojosa M., E. Bouchaud., y N. Bernard. Rugosidad a larga distancia en superficies de fracturas de materiales. Ingenieras. 3: 16-20 (2000). [5] Cheng Y., D. Rodak., C. Wong., and C. Hayden. Effects of micro- and nano-structures on the self-cleaning behaviour of lotus leaves. Nanotechnology. 17: 1359-1362 (2006) [6] Ball P. Shark Skin and Other Solutions. Nature. 400: 507-509 (1999) [7] Gómez P., R., y A. Ramírez. Mecánica cuántica de electrones en Nano-montículos y Nano-arreglos semiconductores. Internet Electronic J. Nanociencia et Moletrónica. 8: 1655-1670 (2011) [8] Bidwell R., G. Fisiología Vegetal. AGT Editorial. México. pp 157-161. 2002 [9] Zehe A. Análisis de interfaces y estructuras de capas sólidas. Tecnoplus. México-Alemania. pp 33-38. 1997



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