UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN ANTONIO ABAD DE CUSCO

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS TROPICALES

TEMA: CLOSTRIDIUM BOTULINUM

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA GENERALDOCENTE: Blgo. WILBER ZUÑIGA

CARRERA PROFESIONAL DE ING. DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

INTEGRANTES: JUNIOR GALVEZ VENEGAS

PAUL VARA ZAMALLOA

J.JOSE HUARCA SUTTA

CLOSTRIDIUM

BOTULINUM

INTRODUCCION

• BOTULUS

• 1897:

• B. heridas

• B. lactantes

1870

Primera descripción de C. BOTULINUM

toxina

VAN ERNENGEM

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

REINO Bacteria

DIVISION Firmicutes

CLASE Clostridia

ORDEN Clostridiales

FAMILIA clostridiaceae

GENERO clostridium

ESPECIE clostridium botulinum

CLOSTRIDIUM BOTULINUM

Bacilos Gram positivos

4-8 micras

Es móvil, flagelo con esporas

Anaerobio

20 – 30 °C

PH 7.2 a 7.4

FUENTE DE INFECCION SUELO

HABITAT INTESTINO DE ALGUNOS ANIMALES

MECANISMO DE TRANSMICION ALIMENTOS

• Se adquiere por la ingestión de alimentos enlatados (carnes o verduras). Aquí se encuentran las esporas de C. botulinum.

• Las esporas germinan si la esterilización no fue correcta, debido a que en estos productos se forma un ambiente de anaerobiosis.

• Tiempo de incubación variable y depende de la cantidad ingerida. Promedio 12 – 36 horas.

BOTULISMO

.

MEDIOS DE CULTIVO E INCUBACIÓN MEDIOS SÓLIDOS.- Se pueden utilizar son el agar sangre o yema de huevo, el agar Brucella con 5% de sangre ovina y el agar alcohol feniletílico con sangre. MEDIOS LÍQUIDOS.- Incluyen un medio de almidón, glucosa y carne picada, un medio de carne cocida, un medio clostridial reforzado, caldo anaerobio y otros.

En los medios sólidos, las colonias de C. botulinum a menudo son de un color blanco grisáceo con un borde irregular. Las colonias son generalmente betahemolíticas en agar sangre, mientras que en un medio de yema de huevo, con frecuencia muestran iridiscencia en la superficie, que se extiende más allá de la colonia (lipasa positiva), y son variables para la actividad de la lecitinasa. La zona iridiscente que rodea la colonia tiende a ser mayor para las toxinas C, D y E.

EspecieGlucos

aMaltos

aLactos

aSalicilina H2S L de

GelatinaIndol Leche

C. Chavovel + + + + + Acidificada

C. septicum + + + + + + Acidificada

C. novyi + + + + Digerida

C.

perfringens

+ + + + +  

C.

Perfringens

+ + + + + Muy fermentad

a

C.

hemolyticum

+ + + + Acidificada

C. tetani +/ Sin cambio

C. botulinum + + + + Acidificada

C.

hystoliticum

+/ + Digerida

PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA DETERMINAR LA ESPECIE DEL CLOSTRIDIUM BOTULIUM

• Prueba de la producción de lecitinasa y lipasa en agar yema de huevo

• Prueba de la urea

Las muestras que pueden ser útiles paraaislamiento son las siguientes: • Heces• Alimentos• hisopado de herida.

AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM

1.Obtención y transporte de la Muestra

El tratamiento con calor o etanol puede ayudar a la recuperación en muestras altamente contaminadas tales como alimentos o heces. Estos tratamientos destruyen los microorganismos que compiten a la vez que permiten la supervivencia de las esporas clostridiales

Triturar u homogenizar el alimento (muestra) Poner en el tubo de dilución de tapa rosca muestra a

igual al peso de la solución salina a utilizar (dilución 1/1).

Centrifugar el homogenizado a alta velocidad, preferentemente en centrifuga refrigerada (se tendrán 2 tubos, o sea dos muestras).

Cogemos uno de s tubos centrifugados y lo sometemos a baño María por 10 min. (agua hervida).

2. Enriquecimiento

AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM

• Para el aislamiento usamos medios enriquecidos como el de carne cocida o el medio tripticasa-glucosa (ATG).

• En tubos de dilución con tapa rosca colocamos 10 ml del medio a usar (este esta previamente calentado, por lo tanto semilíquido).

• Previamente en cada tubo hemos agregado un poco de la muestra y luego agregaremos en cada tubo el ATG semilíquido calentado previamente.

Se podrá observar (si la muestra es positiva) la presencia de gas y resquebrajamiento del medio.

3. Aislamiento Selectivo

AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM

A partir del sedimento se siembra en agar yema de huevo para anaerobios y se incuba a 30º durante 72 horas. Las colonias de clostridium son con borde regular rodeadas de precipitado amarillento debido a la actividad lipolítica que da lugar a ácidos grasos que precipitan son de aspecto nacarado. Seleccionar colonias del medio agar para el aislamiento de C. botulinum rodeadas de un halo opaco con brillo aperlado y pasar a caldo TPGY. Incubar a 30ºC durante 5 días Si los cultivos son toxigénicos, se debe Sembrar directamente en agar hígado de ternera yema de huevo o en agar para el aislamiento de Clostridium botulinum (CBI)Seleccionar colonias bien aisladas sobre el agar hígado de ternera yema de huevo que presenten un halo opaco indicativo de lipolisis y pasarlas a caldo TPGY.. Incubar a 30ºC durante 5 días en jarra de Bre Wer (anaerobiosis)

• Algunas especies producen lecitinasa o lipasa que pueden demostrarse en agar yema de huevo. La lecitinasa (alfa-toxina, fosolipasa C) produce un halo opaco alrededor de la colonia por lisis de la lecitina y la lipasa transforma las grasas en glicerol y ácidos grasos, dando una capa iridiscente que cubre la superficie de la colonia.

AISLAMIENTO DE LA BACTERIA DEL CLOSTRIDIUM BOTULINUM

4. Pruebas Bioquimicas

• Se sembró la bacteria en medio BHI y se incubó por 7 días a 35ºC. • El cultivo se centrifugó a 2 500 rpm durante 20 minutos.• el sedimento se lavó dos veces con agua destilada estéril (ADE) y se resuspendió en 2 mL de ADE.• Este preparado se cuantificó según lo siguiente: se tomó 0,5 mL de la suspensión, se calentó en baño a 80ºC

durante 10 minutos para eliminar las células vegetativas y provocar la germinación de las esporas.• se enfrió en baño de agua fría y se le añadió 4,5 mL de ADE.

Preparación y cuantificación de la suspensiónde esporas de C. botulinum.

• Se hicieron diluciones decimales, desde 10-1 hasta 10-5 y se sembró, por esparcimiento, 0,1 ml de cada una de las diluciones en platos de agar tripticasa soya, por duplicado.

• Las placas se incubaron 48 horas a 35ºC en anaerobiosis y se realizó el recuento de colonias, procedimiento que se repitió a los 2 y a los 8 días de preparada la suspensión inicial.

PRUEBA EXPLORATORIA DE PRESENCIA DE LA TOXINA

Del contenido, inyectamos 0.5 ml. Al ratón de prueba, esto con aguja de tuberculina (N° 25) vía intraperitoneal.

Del otro tubo centrifugado se le inyectara a otro ratón de prueba de la misma cantidad de inoculo.

Se recomienda que antes de inyectarle el sobrenadante a los ratones se le debe inocular la antitoxina

Observar por 4 días

La positividad de la prueba se comprueba por la parálisis motora progresiva, es abdomen contraído, respiración dificultosa, arrastre de las patas, debilidad de la muestra.

La presencia de la toxina E causa una mucho más rápida (en menos de 24)