7. Nuclease (핵산 분해 효소)

Nuclease

• Nuclease란? – DNA를 중합하는 DNA polymerase와는 달리

핵산을 분해하는 효소

• Nuclease의 중요성 – 생체 내에서는 항상 핵산을 분해하는 일이 일

어나고 있으므로 생명현상을 공부한다는 점에서 중요

– 실제의 분자생물학 실험에서 polymerase보다 더 자주 쓰이고 있기 때문에 중요

Nuclease • Nuclease를 실험에 이용할 때 염두해 두어야 할 내용

– Sugar specificity : Nuclease가 작용하는 기질이 DNA인지 RNA인지 알아야함

– Endonuclease, 또는 exonuclease인지 알아야함

– Exonuclease라면 5’ exo인지 3’ exo인지 알아야함

– ss DNA-specific한지 ds DNA-specific한지를 구별해야 함

– 분해 산물의 phosphate group이 3’에 남아있는지 또는 5’에 남아 있는지 알아야함

– Base specificity : tRNA가 만들어지는 과정에 관여하는 RNase들과 같이 핵산의 특정 염기를 인식하고 절단하는 RNase가 있는 반면 DNase 중에는 그러한 것이 없음

Nuclease • Nuclease를 실험에 이용할 때 염두해 두어야 할

내용

– Chop or nick : 핵산을 절단할 때 양쪽 가닥을 모두 절단하는지 (chopping) 한쪽 가닥만 절단하는지를 (nicking) 알아야함

– Processivity : Exonuclease의 경우 핵산에 결합한 후 얼마나 많은 nucleotide를 분해하고 나서 분리되는지를 알아야 함

– Nuclease의 반응을 위해 Mg2+, ATP, S-adenosyl methionine과 같은 cofactor가 필요한지를 알아야 함

– Substrate size : 어떤 nuclease는 길이가 짧은 DNA를 잘 절단하는가 하면 어떤 것은 긴 DNA를 선호하는 것처럼 보이는 실험결과를 얻을 때가 있음

8. DNA Ligase (DNA 연결 효소)

DNA Ligase

• DNA Ligase 란?

– DNA 복제 및 수복 때 2중 나선 중 한쪽 사슬의 절단부인 3'-하이드록시기와 5'-인산기를 포스포디에스테르 결합시키는 효소

– 효소적 특성, kinetics, 반응 mechanism이 완전이 규명된 효소

• DNA Ligase의 발견

– Okazaki, Messelson : DNA를 연결시켜 주는 DNA ligase의 존재를 주장

• DNA ligase의 양이 부족한 mutant들이 만들어 졌는데 이들 mutant에서는 Okazaki fragment가 큰 DNA로 연결되는 과정이 느려지는 현상과 recombination이 보다 빈번히 일어나는 현상이 관찰되었다.

DNA Ligase • DNA Ligase의 발견

– Ligase activity를 발견 할 수 있는 몇가지 독립적인 분석 system

①Gellert : Lambda DNA의 sticky end가 circular form이 된 후 생기는 두 개의 nick을 ligase가 연결시켜 주면 이때 생기는 covalently closed circular (CCC) form의 DNA를 alkaline sucrose gradient centrifugation으로 분리하여 정량하는 방법으로 assay하였다.

(alkaline 조건에서는 ligation된 DNA반응물이 대단히 compact한 구조를 이루기 때문에 s 값이 매우 커지며 이 방법은 분석 시간이 오래걸리는 단점이 있다.)

DNA Ligase

• DNA Ligase의 발견

– Ligase activity를 발견 할 수 있는 몇가지 독립적인 분석 system

②Richardson, Lehman, Hurwitz : DNA의 nick 부위에 있는 5’ phosphate를 32P로 치환해 주고 여기에 ligation이 일어나면 phosphatase가 32P로 label된 phosphate를 떼어내지 못하게 되는 현상을 이용하여 분석하였다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 발견

– Ligase activity를 발견 할 수 있는 몇가지 독립적인 분석 system

③Cozzarilli : Oligo dC가 붙은 cellulose에 poly dI와 동위 원소로 label된 oligo dC를 넣어주고 ligation 반응을 수행 후 alkali로 denaturation 시켜 oligo dC에 연결되지 않은 label된 oligo dC를

제거한 후 filter에

cellulose를 걸러 쉽게

분석하였다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성 – 새로운 효소가 발견되었을 때 가장 먼저 수행하는 kinetics 실험

• substrate의 양을 충분히 많이 넣어 준 상태로 효소 농도 ([E])를 증가시

켜 주면서 반응속도를 관찰한다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성 – Bacteriophage T4로 infection된 E. coli를 터뜨린 extract를

효소로 사용하여 실험한 결과 • 1st order kinetics를 보이지 못하고 lagging period가 나타난다

는 사실이 발견 • 이 lagging period 동안에는 반응에 필요한 cofactor가 부족했었

다는 것을 알게됨 • T4 DNA ligase가 필요로 했던 cofactor를 추적하여 분석한 결과

cofactor는 바로 ATP 였음이 밝혀졌으며 추후 실험을 통하여 E. coli DNA ligase의 경우에는 ATP 대신 NAD가 cofactor로 쓰이고 있음을 알게됨

• NAD는 본래 전자전달계에서 쓰이는 물질이지만 E. coli DNA ligase 경우는 NAD가 high energy bond donor로 사용되고 있음을 알게됨

• ATP와 NAD는 AMP 구조를 공통으로 가지고 있으며 바로 이 AMP가 DNA ligation 반응에서 energy relay에 이용

DNA Ligase

• DNA Ligase 특성

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성

– Kinetics

• DNA ligase는 전형적인 double displacement kinetics를 따른다

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성

– Reaction mechanism

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성 – DNA ligase의 반응메커니즘을 규명하게 해 준 몇

가지 실험내용들 ① DNA independent pyrophosphate (PPi) exchange가 일

어난다.

: DNA가 없는 상태에서 32P로 label된 pyrophosphate와 label 되지 않은 ATP를 넣어주면 ligase에 의하여 DNA가 없어도 label된 ATP와 label되지 않은 pyrophosphate가 얻어진다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성 – DNA ligase의 반응메커니즘을 규명하게 해 준 몇가지

실험내용들 ② DNA ligase에 AMP가 공유결합으로 결합한다.

: -32P ATP를 사용하였을 경우 32P로 label된 효소를 얻을 수 있다.

AMP가 결합된 ligase를 adenylated ligase라고 하는데 이것을 분리하여 가수분해하면 AMP는 ligase의 Lysine residue에 연결되어 있음을 알 수 있다. Adenylated enzyme에 nicked DNA를 섞어주면 ATP없이도 ligation이 일어나는 것으로 보아 이것은 ligation 과정의 true inter mediate임이 틀림없다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성 – DNA ligase의 반응메커니즘을 규명하게 해 준 몇가지

실험내용들 ③ Activated nick의 존재

: Activated nick은 AMP가 nick의 5’ phosphate에 붙어 있는 상태의 transient 중간체이기 때문에 쉽게 분리되지 않는다. 그러나 Dideoxyneucleotide를 사용하였을 경우에는 3’ hydroxyl group이 없기 때문에 다음 단계로 넘어가지 못하고 transient 중간체가 축적될 수 밖에 없으므로 activated nick의 분리가 가능해진다.

Activated nick은 처음부터 화학 합성을 할 수도 있으며 합성된 중간체에 free(unadenylated) ligase를 섞어주었을 때 ligation이 일어나며 이 때 adenylated enzyme을 넣어주면 아무 반응도 일어나지 않는 것으로 보아 이 transient 중간체는 true 중간체 임을 알수있다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성

– DNA ligase의 반응메커니즘을 규명하게 해 준 몇가지 실험내용들

④DNA ligation 반응은 거의 비가역적인 반응이지만 supercoiled DNA에 ligase와 excess AMP를 넣어줄 경우 순간적인 역반응이 일어나고 그 역반응은 곧 다시 정반응으로 되돌아가게 된다. 이 때 supercoiled DNA는 relaxed form으로 풀리는 결과를 초래한다.

DNA Ligase

• DNA Ligase의 특성

– Substrate specificity • DNA ligase는 nicked DNA를 ligation시켜주는 역할을

하지만 sticky end DNA와 blunt end DNA도 ligation시켜줄 수 있다. DNA ligase가 고려하는 것은 어디까지나 ligation 반응이 일어난 후의 구조가 B form helix인가에 대한 것이다. 따라서 ligation이 일어나기 직전의 DNA 모양이 sticky end이건 blunt end건 관계없이 ligation 반응을 수행할 수 있다. 다만 blunt end ligation의 경우에는 helix의 외형에 준하는 모양이 만들어질 확률이 sticky end인 경우보다 어렵기 때문에 100배 이상 높은 효소가 필요하다.