od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu ... · od vzorca do antibiograma...
TRANSCRIPT
Diplomsko delo
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu – evaluacija metode z vzporednim kultiviranjem seča v bujonu v primerjavi s
standardnim postopkom
September, 2016 Mateja Zver
Mateja Zver
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu – evaluacija metode z vzporednim kultiviranjem seča v bujonu v primerjavi s
standardnim postopkom
Diplomsko delo
Maribor, 2016
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu – evaluacija metode z vzporednim kultiviranjem seča v bujonu v primerjavi s
standardnim postopkom Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa I. stopnje
Študent: Mateja Zver
Študijski program: visokošolski strokovni študijski program I. stopnje
Kemijska tehnologija
Predvideni strokovni naslov: diplomirani/a inženir/ka kemijske tehnologije (VS)
Mentor: red. prof. dr. Maja Leitgeb
Somentor: mag. Iztok Štrumbelj, dr.med
Maribor, leto 2016
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
I
Kazalo
Kazalo ........................................................................................................................................ I Izjava....................................................................................................................................... III Zahvala ................................................................................................................................... IV
Povzetek ................................................................................................................................... V Abstract ................................................................................................................................... VI Seznam tabel ......................................................................................................................... VII Seznam slik .......................................................................................................................... VIII
Uporabljeni simboli in kratice ................................................................................................ IX 1 Uvod .................................................................................................................................. 1
1.1 Opredelitev problema ................................................................................................. 1
1.2 Cilji in teze diplomskega dela .................................................................................... 4 2 Teoretični del ..................................................................................................................... 6
2.1 Okužbe sečil ............................................................................................................... 6 2.1.1 Povzročitelji okužb sečil ..................................................................................... 6
2.1.2 Enterobakterije .................................................................................................... 9 2.2 Mikrobiološki postopki preiskave urina na patogene bakterije in glive .................... 9
2.2.1 Osamitev in identifikacija bakterij.................................................................... 10
2.2.2 Določitev koncentracije bakterij v urinu s semikvantitativno urinokulturo ..... 10
2.2.3 Določanje občutljivosti bakterij za antibiotike ................................................. 11 2.2.4 Mednarodne smernice za antibiogram .............................................................. 12
3 Pregled literature ............................................................................................................. 14
3.1 Direktni antibiogram ................................................................................................ 14 3.2 Vpliv poročanja mikrobioloških rezultatov ............................................................. 16
3.3 Evropske smernice za antibiogram – EUCAST ....................................................... 17 3.4 Antibiotik v urinu ..................................................................................................... 18
4 Materiali in metode dela .................................................................................................. 19
4.1 Primerjava antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim
inokulomom ........................................................................................................................ 19
4.1.1 Kultiviranje urina v navadnem bujonu ............................................................. 23
4.1.2 Barvanje po Gramu ........................................................................................... 27
4.1.3 Izdelava antibiograma ....................................................................................... 28 4.1.4 Pregled plošč po inkubaciji, merjenje con inhibicije in interpretacija
antibiogramov .................................................................................................................. 31 4.1.5 Metodologija primerjave rezulatov antibiogramov po standardni metodi in hitri
metodi s standardnim inokulomom ................................................................................. 33
4.2 Uspešnost dodatka vankomicina pri zaviranju rasti po Gramu pozitivnih bakterij . 34 4.2.1 Priprava laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL in priprava bujona
z vankomicinom .............................................................................................................. 35 4.2.2 Način primerjave rezultatov cepljenja urina v navadno vialo in vialo z
vankomicinom ................................................................................................................. 35
4.3 Določitev trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL ................... 35 4.4 Testiranje na prisotnost antibiotika v urinu.............................................................. 36
5 Rezultati in diskusija ....................................................................................................... 38 5.1 Primerjava rezultatov antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s
standardnim inokulumom ................................................................................................... 38 5.1.1 Rezultati kultiviranja ........................................................................................ 38
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
II
5.1.2 Pozitivne viale - barvanje po Gramu in mikroskopski pregled preparata ......... 39 5.1.3 Pregled antibiogramov in odčitovanje con inhibicij ......................................... 39
5.1.4 Primerjava rezultatov hitrega in standardnega antibiograma ............................ 40 5.2 Vzporedna kultivacija v viali z vankomicinom ........................................................ 48 5.3 Določitev roka stabilnosti vankomicina v vodni raztopini za pripravo bujona z
vankomicinom ..................................................................................................................... 50 5.4 Dokaz antibiotika v urinu ......................................................................................... 51
6 Zaključek ......................................................................................................................... 52 7 Literatura.......................................................................................................................... 53 8 Priloge .............................................................................................................................. 57
8.1 Priloga 1. Šestdeset vzorcev, kjer je bila rast zaznana vsaj v navadnem bujonu -
podrobnosti posameznih vzorcev: izolati iz vzorca, ali so bili v preparatu po Gramu v viali
z navadnim ali vankomicinskim bujonom vidni le po Gramu negativni bacili, ali bi bil hitri
antibiogram smiselen, ali bi bil ob uporabi različnih strategij hitri antibiogram izdelan ali
ne. 9 Življenjepis ...................................................................................................................... 60
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
III
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal/a sam/a, prispevki drugih so posebej označeni.
Pregledal/a sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih:
Vir: PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)
Gesla: Število referenc
EUCAST IN disk diffusion 69
urinary tract infection IN direct antimicrobial testing 49
Vir: Google Scholar (https://scholar.google.si/)
Gesla: Število referenc
detection of antibiotic activity IN urine 12
Alifax IN urine IN HB&L 14
Vir: COBISS/OPAC (http://www.cobiss.si/scripts/cobiss?ukaz=getid, COBIB.SI)
Gesla: Število referenc
mikrobiologija IN mikrobi 105
infekcije IN urin 18
Skupno število pregledanih člankov: 65
Skupno število pregledanih knjig: 12
Maribor, september 2016 Mateja Zver
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
IV
Zahvala
Zahvaljujem se mentorici red. prof. dr. Maji Leitgeb, da je
sprejela mentorstvo pri diplomski nalogi in njeno strokovno
pomoč.
Iskrena hvala somentorju mag. Iztoku Štrumblju dr.med., ki mi
je omogočil opravljanje diplomskega dela v našem laboratoriju
in je kljub številnim nalogam našel čas za usmeritve in pomoč
pri nalogi.
Hvala moji družini, da nikoli niso nehali verjeti vame.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
V
Naslov diplomskega dela Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu – evaluacija metode z vzporednim
kultiviranjem seča v bujonu v primerjavi s standardnim postopkom
Povzetek
Okužbe sečil z enterobakterijami so pogoste, za usmerjeno zdravljenje je pomemben kratek
čas do antibiograma.
Namen diplomskega dela je bil ugotoviti, ali je mogoče standardnemu enakovreden
antibiogram enterobakterij izdelati v enem dnevu od sprejetja vzorca.
Metode. Vzporedno s standardnim postopkom, ki traja 2 dni (en dan za kultivacijo urina, en
dan za standardni antibiogram (SAT), smo vzorce urinov cepili v viale z bujonom (NBJ) in
jih inkubirali v analizatorju HB&L (Alifax): če smo zaznali rast gostote McFarland 0,5, smo
naredili razmaz in če so bile vidne samo po Gramu negativne bakterije (NB), smo izdelali
hitri antibiogram (HAT). Razlika: pri HAT smo inokulum gostote McFarland 0,5 pripravili
iz NBJ, pri SAT iz kolonij urinokulture. Primerjali smo rezultate HAT in SAT.
Pripravili smo tudi vankomicinski reagent. Pri delu vzorcev smo preučili 4 možne strategije
uporabe vial z vankomicinom ali brez, z ali brez razmaza po Gramu.
Rezultati. Cepili smo 230 urinov, pri 52 vzorcih smo v standardnem in hitrem postopku
osamili eno vrsto enterobakterij – pri teh smo primerjali rezultate HAT in SAT. Skupno smo
testirali 1030 kombinacij izolat/antibiotik in ugotovili 99,7 % skladnost. Velikih neskladnosti
in zelo velikih neskladnosti ni bilo, ugotovili smo 0,3 % majhnih neskladnosti. Kriteriji za
uspešno validacijo metode so izpolnjeni: več kot 90 % skladnosti in manj kot 3 % velikih ali
zelo velikih neskladnosti.
Poleg NBJ smo 150 vzorcev cepili tudi v vankomicinski bujon - VBJ. Najbolj učinkovita
strategija je nacepitev urina v VBJ, razmaz po Gramu in izdelava HAT, če so v preparatu
vidne le NB.
Ključne besede: direktni antibiogram, EUCAST, urin, inokulum
UDK: 612.461:616-088.846.1(043.2)
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
VI
Naslov diplomskega dela v angleškem jeziku From the sample to the antibiogram of Enterobacteria in a day – evaluation of the method of
the parallel cultivation of the urine in broth in comparison with the standard procedure
Abstract
Enterobacteriaceae are common cause of urinary tract infections. Short time to results of
antimicrobial susceptibility testing (AST) is important.
Purpose of the thesis was to find out whether it is possible to do reliable AST of
Enterobacteriaceae from urine sample in one day.
Method. In parallel with the standard procedure, which lasts 2 days (one day for cultivating
urine and one day for standard AST (SAT), we inoculated samples in vials with broth (NBJ)
and incubate them in HB&L Analyzer (Alifax). If we detected growth with density at least
McFarland 0.5, Gram stain was used and if only Gram negative bacteria (NB) were visible,
we made fast AST (HAT). The difference: in HAT, inoculum was prepared from NBJ, in
SAT from colonies of urine culture. We compared the results of HAT and SAT.
We prepared vancomycin reagent and examined use of 4 possible strategies: use of vials
with or without vancomycin, with or without a Gram stain.
Results. We inoculated 230 samples and in 52 only one species of Enterobacteriaceae was
isolated with both standard and expedited procedure. In these samples, results of HAT and
SAT were compared: a total of 1030 antibiotic/isolate combinations were tested with 99.7%
agreement and 0.3% of minor discrepancies were found. No major or very major
discrepancies were found. Criteria for successful validation of the methods were fulfilled:
more than 90% agreement and less than 3% of major or very major discrepancies.
In addition, we inoculated 150 samples in vancomycin broth - VBJ. The most effective
strategy is use of VBJ, Gram stain of suspension and use of HAT, if only NB were visible in
Gram stain.
Key words: direct antimicrobial susceptibility testing, EUCAST, urine, inoculum
UDK: 612.461:616-088.846.1(043.2)
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
VII
Seznam tabel
Tabela 1-1. Časovni potek posameznih metod od vzorcev urina do rezultata antibiograma ... 4
Tabela 2-1. Delež izolatov različnih bakterijskih vrst v dveh starostnih skupinah pacientk v
raziskavi ECO-SENS, 2003. ............................................................................................. 7
Tabela 2-2. Razvrstitev povzročiteljev okužb sečil po patogenosti in pogostosti povzročenih
okužb po smernicah European Urinalysis Guidelines. ..................................................... 8
Tabela 4-1. Opredelitev pravilnosti ali nepravilnosti rezultata strategije pri posameznem
vzorcu glede izdelave in smiselnost hitrega antibiograma ............................................. 27
Tabela 4-2. Seznam testiranih antibiotikov, okrajšave na diskih in količine antibiotika v
diskih, uporabljenih pri testitanju izoliranih enterobakterij iz urina............................... 31
Tabela 4-3. Razvrstitev neskladnosti v odvisnosti od rezultatov standardnega in hitrega
antibiograma. .................................................................................................................. 33
Tabela 5-1. Pregled rezultatov standardne semikvantitativne urinokulture 230 vzorcev urina
........................................................................................................................................ 38
Tabela 5-2. Pregled izolatov 76 vzorcev, kjer so enterobakterije v semikvantitativni
urinokulturi zrasle kot edini izolat iz vzorca. ................................................................. 40
Tabela 5-3. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega
izolata za antibiotike - 52 hitrih antibiogramov. Podatki iz raziskave. .......................... 43
Tabela 5-4. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega
izolata za antibiotike -52 standardnih antibiogramov iz standardne urinokulture. Podatki
iz programa MBL. .......................................................................................................... 44
Tabela 5-5. Seznam in razvrstitev neskladnosti pri testiranih 52 izolatih enterobakterij (vsak
testiran z 20 antibiotiki ) ................................................................................................. 46
Tabela 5-6. Deleži skladnosti in neskladnosti rezultatov direktnega antibiograma v
primerjavi s hitrim antibiogramom (izraženo v odstotkih) ............................................. 47
Tabela 5-7. Število vzorcev v različnih kategorijah pravilnosti / nepravilnosti postopkov,
seštevek in delež pravilnih postopkov v različnih strategijah med 60 vzorci, pri katerih
smo zaznali rast v viali z navadnim bujonom ................................................................. 49
Tabela 5-8. Izmerjene cone inhibicije reagenta vankomicin za določitev roka stabilnosti .... 50
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
VIII
Seznam slik
Slika 4-1: Shema postopka primerjave antibiogramov po standardni metodi in HMSI – hitri
metodi s standardnim antibiogramom ............................................................................. 19
Slika 4-2: Shema standardnega postopka................................................................................ 20
Slika 4-3: Shema postopka hitre metoda s standardnim inokulumom .................................... 22
Slika 4-4: HB&L Uroquattro .................................................................................................. 24
Slika 4-5: Merilni prostor za viale v HB&L ........................................................................... 25
Slika 4-6. Sporočilo na ekranu HB&L, leva slika: sporočilo o viali, kjer je rast ≥ 0,5 McF,
desna slika: krivulja rasti mikroorganizmov v navedenem času..................................... 26
Slika 4-7: Dva primera antibiograma: konfluentna rast čiste kulture in mešana rast različnih
vrst. .................................................................................................................................. 32
Slika 4-8: Slika testiranja trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin ............................. 36
Slika 5-1: Diagram stabilnosti reagenta vankomicin .............................................................. 50
Slika 5-2: Primer dokaza antibiotika v urinu .......................................................................... 51
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
IX
Uporabljeni simboli in kratice
Kratice AST testiranje občutljivosti za antibiotike (angl. antimicrobial susceptibility
testing)
ATCC ameriška zbirka tipskih kultur (angl. American Type Culture Collection)
CLSI Inštitut za klinične in laboratorijske standarde (angl. Clinical and Laboratory
Standards Institute)
CFB/L število poraslih bakterij/liter (angl. colony-forming bacteria/litre)
CFU/mL število poraslih kolonij/mililiter (angl. colony-forming units/mililitre)
EB enterobakterije
ECDC Evropski center za preprečevanje in obvladovanje bolezni(angl. European
Centre for Disease Prevention and Control)
ECLM Evropska zveza za laboratorijsko medicino (angl. European Council of Legal
Medicine)
ESCMID Evropsko združenje za klinično mikrobiologijo in infekcijske bolezni (angl.
European Society for Clinical Microbiology and Infection Disease Prevention
and Control)
ESBL betalaktamaze z razširjenim spektrom delovanja (angl. extended-spektrum
β-lactamase)
EMA evropska agencija za zdravila (European Medicines Agency)
EUCAST Evropski odbor za testiranje protimikrobne občutljivosti (angl. European
Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing)
HAT hitri antibiogram
HMSI hitra metoda s standardnim inokulumom
I zmerno občutljiv ali intermediaren (angl. intermediate)
KA krvni agar
MBL računalniški program
McF McFarland
MIK minimalna inhibitorna koncentracija
MHA Mueller Hinton agar
MRSA proti meticilinu rezistentna bakterija Staphylococcus aureus (angl.
methicillin-resistant Staphylococcus aureus)
NB negativne bakterije
NBJ viala z navadnim bujonom
NLZOH Nacionalni laboratorij za zdravje okolje in hrano
R odporen (angl. resistant)
SAB standardni antibiogram
SAT smiselni antibiogram
SKOUPZ Slovenska komisija za ugotavljanje občutljivosti za protimikrobna zdravila
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
X
SKUK semikvantitativna urinokultura
S občutljiv (angl.sensitive)
SP standardni postopek
URI kromogeni URI agar
VBJ viala z bujonom z vankomicinom
VRE vankomicin rezistentni enterokoki (angl. vancomycin-resistant enterococci)
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
1
1 Uvod
1.1 Opredelitev problema
Širjenje odpornosti mikroorganizmov proti antibiotikom se povečuje, kar predstavlja resen
zdravstveni problem tako pri nas kot drugod v Evropi in svetu.
Delovna skupina, ki jo je ustanovila britanska vlada, je nedavno proučila sedanje stanje v
svetu in izračunala posledice v prihodnosti. Ocenili so, da je zdaj število smrti zaradi
odpornosti proti protimikrobnim zdravilom v svetu 700.000 letno, če se trendi ne
spremenijo, pa bo do leta 2050 naraslo na 10.000.000 letno. S tem bi število smrti zaradi
odpornosti proti protimikrobnim zdravilom do leta 2050 preseglo skupno letno število smrti
zaradi raka (8.200.000) in prometnih nesreč (1.200.000). Bruto domači proizvod bi do leta
2050 zaradi tega lahko padel za 2 do 3,5 % 1.
Do nastanka bakterijske odpornosti pride zaradi pravilne kot neustrezne rabe antibiotikov.
Neustrezna raba antibiotikov je lahko:
- uporaba previsokih ali prenizkih koncentracij antibiotikov v veterini in humani medicini,
- neustrezen časovni interval zdravljenja (predolg ali prekratek čas),
- nepotrebna uporaba antibiotika širokega spektra,
- neusklajenost zdravljenja glede na podatke pridobljene z mikrobiološkimi raziskavami.
Okužbe sečil so za okužbami zgornjih dihal druga najpogostejša skupina infekcijskih
bolezni. Zaradi te pogostosti se v praksi za vnetja sečil predpiše kar 15% vseh predpisanih
antibiotikov.
Zaradi navedenih dejstev, ki povečujejo tveganje za odpornost bakterij in deleža porabe
antibiotikov za zdravljenja vnetij sečil, je veliko raziskav usmerjenih v čim hitrejšo
mikrobiološko diagnostiko.
Mikrobiološka diagnostika preiskave urina, s katero se določi povzročitelja okužbe in
občutljivost izolata za antibiotike ali njegovo odpornost proti antibiotikom, je osnova
usmerjenega zdravljenja pri okužbi sečil.
Večino antibiotikov se predpiše izkustveno, saj je čas od odvzema vzorca do rezultata
antibiograma praviloma približno 48 ur, kar je predolg čas, da bi z uvedbo zdravljenja lahko
čakali na izvid.
Čim hitrejši izvid je koristen za usmerjeno zdravljenje (zoženje spektra zdravila ali
zamenjava neučinkovitega antibiotika z učinkovitim, če je proti izkustveno uporabljenem
antibiotiku povzročitelj okužbe odporen).
V Centru za medicinskom mikrobiologijo Nacionalnega laboratorija za zdravje okolje in
hrano, v Oddelku za medicinsko mikrobiologijo Murska Sobota uporabljamo
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
2
semikvantitativno kultiviranje urina – iz poraslih kolonij naredimo antibiogram. Z navedeno
preiskavo, s katero določimo število in vrsto bakterij, sledi protimikrobno testiranje
občutljivosti izolirane bakterije, je potreben za končni rezultat čas približno 48 ur od
nacepitve vzorca. V nalogi nas zanima celotni čas od vzorca do antibiograma.
Antibiogram (določanje občutljivosti za antibiotike) enako kot večina evropskih
laboratorijev izvajamo s standardno metodo po smernicah organizacije European Committee
on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST). Uporabljamo disk-difuzijsko metodo,
čas inkubacije je 16 – 20 ur. Na te smernice je Slovenija prešla aprila leta 2014, prej smo
uporabljali ameriške smernice organizacije Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI).
Da bi rezultat dobili čimprej, so poskušali antibiogram pri okužbah, kjer je povzročitelj
praviloma ena bakterija (okužbe krvi in seča), narediti direktno iz vzorca – »direktni
antibiogram« – v našem primeru torej iz seča.
Obstaja več objavljenih raziskav z direktnim antibiogramom iz urina, večinoma so narejene
po smernicah CLSI (po metodi, ki je v Sloveniji ne uporabljamo več), tako da so rezultati teh
študij za nas le delno uporabni. Našli smo le eno študijo, kjer so direktni antibiogram iz urina
naredili po smernicah EUCAST 2.
Postopki za antibiogram so podrobno standardizirani, eden od bistvenih dejavnikov je
začetni inokulum, ki mora biti gostote 0,5 po McFarlandu.
Direktni antibiogram ima dve težavi – 1.) inokulum ni standardiziran, saj ne poznamo
koncentracije bakterij v vzorcu seča; 2.) v vzorcu je lahko več kot ena vrsta bakterij. V
švedski raziskavi so direktni antibiogram odčitali pri 188 od 233 vzorcev, saj je bil inokulum
pri ostalih preredek in zato rezultatov niso odčitali (inokulum po disk-difuzijki metodi
EUCAST mora imeti konfluentno rast bakterij na plošči).
Problemu mešanih bakterij v direktnem antibiogramu se lahko delno izognemo, če vzorec
seča pobarvamo po Gramu in ugotovimo, da gre za po Gramu pozitivne in po Gramu
negativne bakterije (direktnega antibograma v tem primeru ne naredimo). Ne moremo
razlikovati dveh ali več po Gramu negativnih bakterij.
Da bi odpravili problem z nestandardiziranim inokulumom, so v slovenski raziskavi
uporabili naslednji pristop: vzorec urina so nekaj ur kultivirali v bujonu, nato bujon redčili
do predpisane gostote McFarland 0,5 in še isti dan naredili antibiogram. Rezultati so bili
dobri, vendar narejeni po smernica CLSI, ki se v Sloveniji ne uporabljajo več; poleg tega so
v raziskavi uporabili posebno nestandardno gojišče – kromogeni agar Mueller Hinton.
Metoda združuje hitrost direktnega antibiograma in standardiziranost inokuluma
standardnega antibiograma, v nadaljevanju jo bomo imenovali hitra metoda s standardnim
inokulumom – HMSI 3.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
3
V povzetku navajamo časovni potek posameznih metod preiskave urina:
STANDARDNA METODA: od nacepitve urina do končnega rezultata preteče čas 48
ur, kar je za začetek zdravljenja neugodno.
DIREKTNI ANTIBIOGRAM: potreben čas od nacepitve urina do orientacijskega
antibiograma preteče 24 ur, vrednosti odčitkov občutljivosti bakterije za antibiotike
so le orientacijske, ker antibiogram ni izveden iz standardnega inokuloma.
HMSI: od nacepitve urina do končnega rezultata je potrebnih 24 ur, metoda je
omejena le na vzorce urina, kjer je povzročitelj okužbe ena bakterija.
Med povzročitelji okužb sečil so daleč najpogostejše enterobakterije (Enterobacteriaceae),
pri katerih je v zadnjem času prišlo do velikega porasta odpornosti, zato je hiter antibiogram
pri njih zelo pomemben. V raziskavi se bomo omejili nanje.
Praviloma okužbo sečil povzroča ena sama bakterijska vrsta, najpogosteje enterobakterije.
Po Gramu pozitivne bakterije redkeje povzročajo okužbe sečil; če so povzročitelj, so
praviloma prisotne v veliki koncentraciji – tovrstni vzorci niso del raziskave.
Za našo raziskavo so težava po Gramu pozitivne bakterije, ki so kontaminanti, del normalne
mikrobiote, ki v majhni količini pridejo v seč ob odvzemu urina, v bujonu pa se nato
razmnožijo in kot redke majhne kolonije včasih motijo odčitavanje antibiograma HMSI. V
navedeni slovenski raziskavi so bili ti kontaminanti vidni kot majhne modro obarvane
kolonije na kromogenem agarju, na standardnem Mueller Hinton agarju pa niso obarvane in
je zaradi njih antibiogram enterobakterije lahko težje odčitljiv.
Problemu se je verjetno mogoče izogniti z dodatkom vankomicina (zavre po Gramu
pozitivne bakterije) v bujon. Bujon z vankomicinom v laboratorijih NLZOH uporabljamo za
kultiviranje nadzornih kužnin (brisov rektuma); ali deluje tudi z vzorci urina, ni znano.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
4
1.2 Cilji in teze diplomskega dela
HMSI skrajša čas od vzorca do rezultata antibiograma za polovico, niso pa objavljene lastnosti HMSI
v primerjavi s standardno metodo.
Cilj naloge je primerjati rezultate antibiograma, narejenega s HMSI, v primerjavi s standardnim
antibiogramom standardne metode. Osnovni postopek prikazuje tabela 1-1.
Tabela 1-1. Časovni potek posameznih metod od vzorcev urina do rezultata antibiograma
METODA
TRAJANJE
STANDARDNA METODA HITRA METODA S STANDARDNIM
INOKULOMOM (HMSI)
1. dan
(čas=0)
urin cepimo na URI agar
(URISELECT 4 agar) in KA (krvni
agar),
inkubiramo 18 – 24 ur
1. urin cepimo v HB&L vialo z »eugonic«
bujonom
2. če je rast po nekaj urah do
gostote ≥ 0,5 McF
3.preparat po Gramu
4.če le po Gramu neg. bakt.
5. izvedba standardnega antibiograma iz
inokuluma McF 0,5
16 do 20 ur
2. dan
(čas=24 ur od
nacepitve vzorca)
izvedba standardnega antibiograma
iz kolonij
16 do 20 ur
odčitamo antibiogram HMSI
3. dan
(čas=48 ur od
nacepitve vzorca)
odčitamo standardni antibiogram
»Eugonic« bujon: gre za sterilni bujon za kultiviranje urina v vialah z vloženim magnetnim
mešalčkom, ki se po nacepitvi vloži v HB&L aparaturo, ki z vrtenjem mešalčka pospeši rast
v bujonu.
Za ugotovitev, ali so rezultati antibiogramov izolatov, pridobljeni s hitro metodo primerljivi
s klasično, je potrebno opraviti primerjalno študijo med obema metodama. Primerjalne
študije antibiogramov za bakterije, ki so bile izolirane po hitri metodi z bujonom in po
standardni metodi, so bile že opravljene, vendar po smernicah CLSI. Od leta 2014 veljajo v
Sloveniji sprejete EUCAST smernice, zato je potrebno, da se izvede vzporedna primerjava
protimikrobnega testiranja občutljivosti po veljavnih evropskih smernicah.
Poleg standardne metode bomo vzporedno izvajali metodo HMSI; kot bujon HMSI bomo
vsaj v začetku vzporedno nacepili vialo bujona z vankomicinom in originalno vialo brez
vankomicina.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
5
Glavni cilj diplomske naloge:
1. Evaluacija HMSI metode v primerjavi s standardnim postopkom obdelave vzorcev
urina in antibiogramom iz čiste kulture kolonij.
Bistveni rezultat bo za veliko število antibiotikov (za vsak antibiotik posebej) ugotovljeno
število ujemanja rezultatov obeh metod (občutljivost, intermediarnost, odpornost) ter
majhnih, velikih in zelo velikih napak HMSI antibiograma v primerjavi s standardnim
antibiogramom.
Teza, ki temelji na objavljeni študiji s CLSI postopkom in neobjavljeni raziskavi je, da je
metoda vsaj dobra orientacijska metoda, raziskava pa bo vsaj pilotno pokazala, ali je tudi
enakovredna standardni metodi. Od rezultatov bo odvisna uporabnost metode v praksi.
Analiza je zanimiva za mikrobiološke laboratorije znotraj Nacionalnega laboratorija za
zdravje, okolje in hrano, katerega del je tudi Oddelek za medicinsko mikrobiologijo Murska
Sobota, zato se bo izvajala kot del dejavnosti NLZOH. Ob potrditvi ustreznosti hitre metode,
bi v prihodnosti bila dana možnost nudenja višje kakovosti storitev našim naročnikom.
Podrejena cilja diplomskega dela sta:
2. Ugotoviti, kako uspešno zavira rast po Gramu pozitivnih bakterij dodatek
vankomicina v bujonu.
3. Ugotoviti trajnost vankomicina v raztopini, ki jo bomo dodajali v viale HB&L.
Vsakodnevno tehtanje bi bilo namreč za prakso prezahtevno. Raztopino bomo kapnili
na prazen disk, ki ga bomo uporabili za kontrolni antibiogram s standardnim sevom:
izmerjena inhibicijska cona bo pokazala aktivnost vankomicina v raztopini.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
6
2 Teoretični del
2.1 Okužbe sečil
Okužba sečil pomeni vdor mikroorganizmov v sečila, kjer se v sečniku, votlem sistemu ali
ledvičnem parenhimu razmožijo in povzročijo vnetje. Običajni povzročitelji so bakterije,
redkeje glive, virusi ali paraziti 4.
Bakterijske okužbe sečil najpogosteje povzročajo bakterije, ki so del črevesne in nožnične
flore in prodrejo v sečila ascendentno, po sečnici navzgor, se prilepijo na epitel sečil in se
razmnožijo, lahko pa se razširijo tudi v zgornje dele sečil (sečevod, ledvice).
Bakterije lahko vnesemo v sečila tudi pri endoskopskih preiskavah ali vstavljanju urinskega
katetra.
Okužbe sečil razdelimo glede na anatomsko umeščenost okužbe:
Okužbe spodnjih sečil: uretritis (okužbe sečnice), cistitis (okužbe sečnega mehurja),
pri moških pa še epididimitis in prostatitis.
Okužbe zgornjih sečil: pielonefritis (vnetje ledvičnih čašic) in ledvični absces.
Sečila so pri zdravem človeku brez mikroorganizmov v večjem delu urinskega trakta, le v
spodnjem delu sečnice je mikrobna flora, ki je naravna zaščita pred okužbo sečil. Obrambo
pred okužbo predstavljajo tudi beljakovine v seču, ki vežejo mikrobe in preprečujejo njihovo
adheranco na sluznico. Ob spontanem mokrenju je zelo verjetno, da zaradi turbulence toka
seča in refluksa seča, v sečni mehur pride majhno število bakterij, ki pa v večini primerov ne
povzročajo okužbe, kajti te bakterije odstranimo ob naslednjem praznjenju sečnega mehurja.
Na morebitni razvoj okužbe vplivajo: število bakterij, lastnosti bakterij ter lokalni in
sistemski obrambni mehanizmi. Pojav simptomatske okužbe sečil je odvisen od razmerja
med sposobnostjo bakterij, da vdrejo v sečila, in sposobnostjo organizma, da bakterije
odstrani 5.
2.1.1 Povzročitelji okužb sečil
Več kot 95% nezapletenih okužb sečnega mehurja povzroča ena sama vrsta bakterij in
večinoma je povzročitelj Escherichia coli (80-90%), pri mladih ženskah pa po pogostosti
sledi Staphylococcus saprophyticus. Zapletene okužbe sečil in okužbe sečil pri bolnikih s
funkcijskimi in anatomskimi nepravilnostmi sečil, pacientih po operacijah ali pacientih s
presnovno boleznijo in bolnikih v negovalnih ustanovah, so kar 30 % polimikrobne 5.
V študiji ECO·SENS, ki je bila izvedena leta 2003 (Kahlmeter) in je bila prva mednarodna
raziskava o protimikrobni odpornosti patogenov iz nezapletenih okužb sečil, je bilo
vključenih 252 zdravstvenih ustanov iz 17 držav. Preiskovanih je bilo 4734 vzorcev
srednjega curka urina pacient s simptomi nezapletenih okužb sečil. Bakterije so bile prisotne
pri 3278 ( 69,2%) pacientkah. V tabeli 2-1 prikazujemo podrobnosti izolatov, podatki kažejo,
da E. coli predstavlja več kot 75 % izolatov 6.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
7
Tabela 2-1. Delež izolatov različnih bakterijskih vrst v dveh starostnih skupinah pacientk v
raziskavi ECO-SENS, 2003.
Starostna skupina (v letih)
18-50 (n=3445) 51-65 (n=1289)
Vsi izolati 2344 (68) 934 (72,5)
E. coli 1822 (77,7) 703 (75,3)
P. mirabilis 122 (5,2) 86 (9,2)
Klebsiella spp. 65 (2,8) 37 (4,0)
druge Enterobacteriaceaea 91 (3,9) 37 (4,0)
S. saprophyticus 108 (4,6) 11 (1,2)
drugi izolatib 136 (5,8) 60 (6,4)
a Acinetobacter spp, Citrobacter spp., Enterobacter spp., Morganella morganii
b ostali Staphylococcus spp, Enterococcus spp.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
8
Povzročitelje okužb sečil so strokovnjaki Evropske zveze za laboratorijsko medicino ( ECLM, 2000)
razvrstili v 16 kategorij, na osnovi štririh stopenj patogenosti (I-IV) in pogostosti povzročenih okužb
(A-D), kar prikazuje tabela 2-2. Podatki v tabeli so pridobljeni po večletnem zbiranju podatkov
kliničnih mikrobiologov 7.
Tabela 2-2. Razvrstitev povzročiteljev okužb sečil po patogenosti in pogostosti povzročenih
okužb po smernicah European Urinalysis Guidelines.
Patogenost v
sečilih
Pogostost
povzročenih
okužb (%)
A. Običajen
(> 10%)
B. Redkejši (1-
10%)
C. Neobičajen
(0,1 – 1%)
D. Redek
(<0,1%)
I. Primarni
patogen
Escherichia coli Staphylococcus
saprophyticus
E. coli – CO2
odvisna
Salmonella spp.
II. Sekundarni
patogen
Enterobacter
spp.
Enterococcus
spp.
Klebsiella spp.
Proteus mirabilis
Pseudomonas
aueruginosa
Citrobacter spp.
Morganella
morganii
Proteus vulgaris
Serratia spp.
Staph. aureus
Corynebacterium
urealyticum
Haemphilus spp.
pnevmokoki
III. Vprašljiv
patogen
Streptococcus
agalactiae
Kvasovke
Koagulaza neg.
stafilokok
Acinetobacter spp.
Pseudomonas spp.
Stenotrophomonas
maltophilia
Številni mikrobi
IV. Običajna
uretro-genitalna
flora
Alfa hemolitični
(viridans)
streptokoki
Gardnerella spp.
laktobacili
Bifidobacterium
spp.
difteroidi
I. Primarni patogen: vrsta povzročiteljev, ki povzroči nezapletene okužbe sečil. V to
skupino spadata E. coli in S. saprophyticus.
II. Sekundarno patogeni povzročitelji: vrste, ki redko povzročijo nezapleteno okužbo sečil,
vendar se pogosto pojavljajo v bolnišnično pridobljenih okužbah sečil. Enterobacter
spp., Enterococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp. in Staph. aureus so pogosti
sekundarni povzročitelji.
III. Vprašljiv patogen: bakterije, ki so del bakterijske flore kože in druge vrste. Koagulaza
negativni stafilokoki (razen S. saprophyticus) so včasih povzročitelji bolnišnično
pridobljenih okužb sečil.
IV. Običajna uretro-genitalna flora: vrste, ki so del običajne urogenitalne flore. To so
pogosto kontaminanti urinskih vzorcev.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
9
2.1.2 Enterobakterije
Družina Enterobacteriaceae je velika, heterogena skupina bakterijskih vrst, med katere
poleg E. coli spadajo še salmonele, šigele, jersinije, klebsiele, proteusi, providencije,
morganele, citrobaktri, enterobaktri in seracije. Enterobakterije, za večino katerih je naravni
habitat prebavni trakt človeka in živali, so del normalne flore (npr. E. coli), lahko pa so
povzročitelji bolezni; salmonele in šigele pa so patogeni za človeka.
Enterobakterije so aerobni in fakultativno anaerobni po Gramu negativni bacili. Biokemično
je za njih značilno, da reducirajo nitrate v nitrite, fermentirajo glukozo, imajo encim
katalazo, nimajo oksidaze. Številne enterobakterije, razen Klebsiella spp., Shigella spp. in
Yersinia spp., so gibljive 8.
Kolonije E. coli in večine enterobakterij so na krvnem agarju v obliki vlažnih, sivih kolonij,
njihova oblika je okrogla, so dvignjene in lahko imajo ozek pas beta hemolize. Po videzu na
neselektivnih gojiščih ni mogoče ločiti posameznih enterobakterij, do vrst jih identificiramo
z biokemičnimi testi.
2.2 Mikrobiološki postopki preiskave urina na patogene bakterije in glive
Smernice ECML navajajo, da so cilji mikrobiološke preiskave:
ugotoviti etiološke povzročitelje okužbe sečil, kar pomeni patogene bakterije, pa tudi
porast mešane flore, kot znak kontaminacije,
določiti koncentracijo bakterij,
ponuditi testiranje občutljivosti bakterij za protimikrobno zdravljenje,
spremljanje učinkov protimikrobnega zdravljenja med potekom okužbe 9.
V klinični praksi pa ni nujno, da za vsakega pacienta, pri katerem je sum na okužbo sečil,
izvedemo vse preiskave, taka izjema so mlade, zdrave ženske z nezapleteno okužbo sečnega
mehurja 5.
Vzorec seča bolnika z okužbo sečil pošljemo v mikrobiološki laboratorij na kvantitativno
urinokulturo z identifikacijo povzročitelja in test občutljivosti bakterije za antibiotike v
primerih, ki jih navaja literatura:
- bolnikov s simptomi kot so akutno vnetje ledvičnih čašic ali vnetje sečil, ki ga
spremlja vročina bolnika,
- bolnišnično pridobljene okužbe sečil (bakterije z mehanizmi odpornosti, kot so
ESBL),
- pri pacientih z preddispozicijo za okužbe, kot so sladkorni bolniki in bolniki z
anomalijami sečil, po napadih ledvičnih kamnov in osebe z oslabljenim imunskim
stanjem,
- pri pacietnih po prvem neuspešnem zdravljenju z antibiotiki,
- pri bolnikih z vročino, ki imajo vstavljen urinski kateter,
- zapletene okužbe sečil pri moških,
- simpomatske okužbe zgornjih sečil nosečnic,
- sum na okužbo sečil pri otrocih in mladostnikih.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
10
2.2.1 Osamitev in identifikacija bakterij
Domnevne povzročiteljice okužbe moramo iz kužnine najprej osamiti, če hočemo spoznati
morfološke, biokemijske in antigenske značilnosti bakterij 8.
Večina bakterij potrebuje 24 ur, da se na trdnih gojiščih razmnožijo do velikosti kolonij, ki
jih vidimo s prostim očesom. Nekatere bakterije pa zrastejo šele v nekaj dneh ali tednih do
vidne velikosti.
Bakterijske kolonije, ki so zrasle na bakterioloških gojiščih, identificiramo, kar pomeni, da
bakterijam določimo rod in vrsto. Bakterije identificiramo na osnovi mikroskopske slike v
razmazu čiste kulture obarvanem po Gramu, z biokemičnimi testi in analizatorji za
identifikacijo bakterij (kot VITEK®2, bioMerieux).
2.2.2 Določitev koncentracije bakterij v urinu s semikvantitativno urinokulturo
Število ugotovljenih bakterij v urinu navajamo kot: število poraslih kolonij / mililiter:
CFU/mL (angl. Colony-forming units/mililitre). Na predlog strokovnjakov Evropske zveze
za laboratorijsko medicino (ECLM) bi enoto (unit) zamenjala bakterije (bacteria), kajti pri
preštevanju gre za štetje vidnih bakterij, mililiter pa bi zamenjal liter, ki je osnovna enota za
merjenje volumna 7.
Priporočena nova enota za izražanje koncentracij mikroorganizmov v urinu je CFB/L
(angl.Colony-forming bacteria/L), vendar se ni uveljavila, zato v besedilu uporabljamo enoto
CFU / mL (1 CFU / mL je enak 1000 CFB / L).
Vrednotenje rezultatov kvantitativne urinokulture
Kassov kriterij
Diagnoza okužbe sečil je bila zadnja štiri desetletja definirana na osnovi Kassovih
meril, kar pomeni, da odkritje 105
ali več poraslih bakterijskih kolonij (CFU) v 1 mL
seča, ob kliničnih znakih okužbe, le to potrjuje.
Kass je v študiji dokazal, da ima 95 % žensk z vnetjem sečil vsaj 105
bakterij ene
vrste v 1 mL seča, v vzorcu srednjega curka urina 10.
Nizko število bakterij v urinu
Nizko število bakterij v mililitru urinu (102 – 10
4) je dolgo časa veljalo kot
kontaminacija. Novejše raziskave pa kažejo, da tudi bistveno nižje število
bakterijskih kolonij lahko kaže na vnetje sečil, je pa potrebno odgovoriti na vprašanje
kako in kdaj je pomembno manj kot 105 CFU/mL 11.
Mešana kultura
Večino nezapletenih okužb sečil povzroča ena bakterijska vrsta. V primeru več kot
enem izoliranem organizmu iz enega samega vzorca urina, se rezultat interpretira ob
upoštevanju a) ali kateri mikrob prevladuje, b) način odvzema vzorca, c) rezultati
prejšnjih preiskav, d) drugi podatki o pacientu (spol, starost, nosečnost, imunsko
stanje, bolezni) in simpomih ali znakih bolezni.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
11
Zaradi kontaminacije, ki je posledica neustreznosti odvzema vzorca seča, je lahko
preseženo število 105 CFU/mL in pri pacientu ne gre za okužbo sečil.
Vrednotenje rezultatov semikvantitativne urinokulture
V praksi se namesto kvantitativne urinokulture uporablja semikvantitativna urinokultura –
SKUK. Interpretacijo za SKUK metodo so strokovnjaki NLZOH objavili na internetni strani
12.
Za interpretacijo urinokulture najpomembnejši dejavniki:
- število poraslih bakterij v urinu (CFU/mL), število in vrsta izoliranih bakterij/gliv,
- način odvzema vzorca urina (primeri: srednji curek urina, urin iz trajnega katetra,
urin iz stome, urin, odvzet s punkcijo),
- drugi podatki o bolniku (spol, starost, nosečnost, imunsko stanje, ostale bolezni),
- drugi podatki o bolezenskih znakih in simptomih,
- zdravljenje z antibiotikom.
2.2.3 Določanje občutljivosti bakterij za antibiotike
Antibiotike in kemoterapevtike uporabljamo za zdravljenje bolezni, ki jih povzročajo
bakterije. Pri izbiri ustreznega antibiotika uporabljamo dve metodi: izkustveno in racionalno
(po določitvi antibiograma) 13. V praksi se antibiotiki pogosto predpisujejo empirično
(izkustveno) in laboratorijske preiskave služijo za pojasnitev neuspešnih zdravljenj in
določitev primernega antimikrobnega sredstva 14. Kljub temu da je racionalna odločitev za
dajanje določenega antibiotika dolgotrajnejša in dražja, se ob zapletih izkaže kot edina
uspešna. Po racionalni metodi zdravljenja zdravnik pred uvedbo antibiotika odvzame z
značilnega mesta vzorec kužnine in ga pošlje v mikrobiološki laboratorij za določitev
povzročitelja in ugotovitev občutljivosti (ali odpornosti ) bakterij za antibiotike. Tak rezultat
je dobra opora za nadaljnje zdravljenje, saj zdravniku pove, kateri antibiotik je
najučinkovitejši in vitro 13.Usmerjeno zdravljenje z antibiotiki je pri bakterijskih okužbah
eden temeljnih razlogov za izvajanje mikrobiološkega diagnosticiranja in ena
najpomembnejših nalog kliničnega mikrobiološkega laboratorija 5. Namen testiranja
občutljivosti je zanesljivo odkrivanje klinično pomembne odpornosti izolatov proti
antibiotiku, kar večinoma lahko dosežemo le s pravilno uporabo standardizirane metode
15. Testiranje občutljivosti bakterij za antibiotike je pomembno tudi iz epidemioloških
razlogov in s stališča službe za bolnišnično higieno, ki mora spremljati pojav in morebitno
širjenje odpornih sevov bakterij, kot so MRSA, VRE, enterobakterije, ki izdelujejo ESBL in
karbapenemaze, in večkratno odporni po Gramu negativni nefermentativni bacili (npr.
psevdomonas, acinetobakter) 5. Podatki o občutljivosti za antibiotike so pomembni za
načrtovanje izkustvenega zdravljenja, za ugotavljanje pojavljanja odpornih bakterij, kakor
tudi za spremljanje njihovega širjenja 15. Rezultati redne mikrobiološke diagnostike v
Sloveniji, so zbrani v letnem pregledu Slovenske komisije za ugotavljanje občutljivosti za
protimikrobna zdravila (SKUOPZ). Namen je predstaviti podatke o občutljivosti in
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
12
odpornosti izolatov izbranih bakterijskih vrst in skupin v Sloveniji; le ti nam služijo v boju
proti zmanjševanju občutljivosti bakterij na antibiotike.
Določanje občutljivosti bakterijskega izolata za protibakterijsko učinkovino in vitro se
običajno izvede z antibiogramom. Antibiogram naredimo iz čiste bakterijske kulture. Če iz
vzorca izoliramo več klinično pomembnih bakterijskih vrst, vsako najprej osamimo v čisti
kulturi in ji določimo občutljivost.
Metode, ki jih uporabljamo za določanje občutljivosti za antibiotik lahko v grobem
razdelimo v dve skupini: (1) kvalitativne – npr. Kirby-Bauerjeva difuzijska metoda in (2)
kvantitativne metode – agardilucijski, makrodilucijski in mikrodilucijski antibiogram , Etest.
Difuzijski antibiogram je preprosta in hitra metoda, pri katerem določimo za katera
protimikrobna sredstva je bakterijski izolat občutljiv.
Pri kvantitativnih metodah pa določimo minimalno inhibitorno koncentracijo (MIK)
antibiotika v µg/mL, iz tega podatka lahko izračunamo dozo antibiotika, ki jo mora dobiti
bolnik, da bo zdravljenje uspešno. MIK je najmanjša koncentracija antibiotika, ki ustavi
razmnoževanje bakterij 8.
V svetu pa so že na voljo hitre avtomatske metode za določanje občutljivosti za antibiotik,
npr. Vitek®2 (bioMerieux). Prednost te metode pred klasičnimi je v dobri ponovljivosti, zelo
enostavni in hitri izvedbi ter nezahtvenost in lažje spremljanje kontrolnih postopkov; slabosti
pa zelo draga oprema, drag potrošni material in malo možnosti za izbor različnega nabora
antibiotikov 15.
2.2.4 Mednarodne smernice za antibiogram
Bakterijsko občutljivost za antibiotike moramo testirati in tolmačiti v skladu z izbranimi
mednarodnimi merili oz. standardi. Vsi medicinski mikrobiološki laboratoriji v Sloveniji so
v preteklosti uporabljali merila ameriškega Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) 5.
Po sklepu Slovenske komisije za ugotavljanje občutljivosti za protimikrobna zdravila,
SKUOPZ, so skoraj vsi medicinski mikrobiološki laboratoriji aprila 2014 prešli na evropske
smernice za antibiogram, ki jih pripravlja EUCAST, European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing. Te smernice v Evropi močno prevladujejo, temeljijo na rezultatih
raziskav farmakokinetike in farmakodimanike, posameznega zdravila, mehanizmov
odpornosti mikrobov, »in vitro« raziskav, kliničnih raziskav glede učinkovitosti in na
izkušnjah z uspešnostjo zdravljenja okužb v klinični praksi 16.
S podporo Evropskega združenja za klinično mikrobiologijo in infekcijske bolezni
(ESCMID) in evropskih držav, je EUCAST (stalni odbor pri ESCMID) določil mejne
vrednosti za disk difuzijski antibiogram v korelaciji z kliničnimi mejnimi vrednostmi MIK
17.
Disk difuzijska metoda za določanje občutljivosti klinično pomembnih bakterij za antibiotike
je standardiziran postopek po EUCAST:
Ustrezno gosto suspenzijo čiste kulture zasejemo na površino trdnega gojišča (Mueller-
Hinton agar) v petrijevki. Na zasejano gojišče položimo standardizirane antibiotične diske.
Antibiotiki s papirnih diskov difundirajo v gojišče in v krogu okrog diskov zavirajo
razmnoževanje občutljivih bakterij. Antibiogram odčitamo po 16-20 urah pri 35±1 °C tako,
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
13
da izmerimo premer zaviralnega pasu v milimetrih. Petrijevko držimo nad temno površino in
ob odbiti svetlobi izmerimo premer cone inhibicije s kljunastim merilom za posamezni
antibiotik. Upoštevamo rob inhibicije, kjer je popolna zavrtost rasti. Stopnjo občutljivosti
bakterijskega seva določimo tako, da izmerjene vrednosti primerjamo s podatki za
posamezne antibiotike v tabelah, oblikovanih po mednarodnih standardih. Rezultat izrazimo
kot občutljivost (S), zmerna občutljivost (I) ali odpornost (R) 18.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
14
3 Pregled literature
3.1 Direktni antibiogram
Zanesljivo in hitro določanje občutljivosti bakterij za antibiotike, je ključnega pomena za
ustrezno zdravljenje okužb. Za ugotovitev učinkovitosti protimikrobnega sredstva, moramo
testirati sposobnost rasti bakterije v prisotnosti antibiotika, kar naredimo z izdelavo
antibiograma 19. Večina mikrobioloških laboratorijev v Sloveniji uporablja disk difuzijsko
metodo po evropskih standardih, ki jih določi EUCAST. Metoda je standardizirana, ni
zahtevna in omogoča širok izbor testiranih antibiotikov. Rezultati testiranja so na voljo
naslednji dan, kar je slabost metode.
V nuji po hitrem in ciljanem zdravljenju z antibiotikom, je trend razvoja v hitrih avtomatskih
metodah in skrajšanih postopkih. V svetu so razvili kar nekaj takšnih sistemov, npr. Vitek®
2 (bioMerieux), Phoenix (Becton Dickinson), Walkawaj (Baxter Microscan). Z njihovo
uporabo je rezultat identifikacije in testiranje občutljivosti znan že v nekaj urah namesto
naslednji dan. Za omenjene metode še vedno potrebujemo čisto bakterijsko kulturo, tako da
so rezultati znani najhitreje en dan po odvzemu vzorca 15.
Več je različnih pristopov, s katerimi znanstveniki želijo skrajšati čas do končnega
antibiograma in ujemanja rezultatov hitrih metod s standardnimi.
Navodila EUCAST za izdelavo standardnega antibiograma navajajo poleg ostalih zahtev še,
da mora biti pripravljen inokulum gostote 0,5 McF iz čiste kulture bakterij, rast pa
konfluentna 18.
Zaradi pogostosti okužb sečil in praviloma enega povzročitelja okužbe, je bilo izdelanih več
študij z direktnim antibiogramom 2,20-26. Vsem tem raziskavam je skupno, da nimajo
standardiziranega inokuluma za izdelavo antibiograma in ni zagotovila, da bo rast
konfluentna.
Sundqvist s sod. je izvajal primerjavo med poraslim številom CFU/mL po semikvantitativni
metodi in rastjo bakterij na direktnem antibiogramu. V primerjavo je bilo vkjučenih 233
urinov, pri katerih je bila izolirana ene po Gramu negativna enterobakterija. Konfluentna rast
je bila pri 188 od 233 vzorcih. Noben od 26 vzorcev urina, kjer je po semikvantitativni
metodi poraslo med 104 in 10
5 CFU/mL ni imel konfluentne rasti na direktnem
antibiogramu. Tudi pri 19 vzorcih s številom CFU/mL ≥ 105 ni bilo neprekinjenega sloja
rasti bakterij. Zaključuje, da je zanesljivo rezulate direktnega antibiograma uporabljati pri
konfluentni rasti E. coli in K. pneumoniae. Opozarja pa na težavo pri vrsti P. mirabilis zaradi
rojenja in interpretacije antibiotika trimetoprim in predlaga, da se ne uporablja podatek iz
direktnega antibiograma za to kombinacijo 2.
Breteler s sod. je v študiji direktne antibiograme izvajal le iz urinov, kjer so bili v direktnem
preparatu vidne le po Gramu negativne bakterije. Rezultate direktnega antibiograma je
primerjal z rezultati rutinskega testiranja na protimikrobno občutljivost po avtomatiziranem
sistemu Phoenix (AST). Napake so ocenili kot »zelo velike napake«, če so občutljivi v
direktnem antibiogramu, vendar odporni pri standardnem antibiogramu, »velike napake«, če
je odporen pri direktnem in občutljivi pri standradnem. Vse druge razlike so bile opredeljene
kot »manjše napake«. Etest metoda je bila referenčna metoda. Če je bil z direktnim
antibiogramom in rutinsko metodo najden le en izolat, je ujemanje za direktni in standardni
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
15
antibiogram bilo doseženo v 96% primerov. Nižje 88% ujemanje je bilo v primeru, ko je na
rutinski kulturi bil najden več kot en izolat, v direktnem antibiogramu pa eden. V primeru, da
je po obeh metodah najden več kot en izolat je bilo ujemanje tudi 88%. Na osnovi tega avtor
zaključuje, da je direktni antibiogram na urinu zanesljiv pri okužbi z eno enterobakterijo
21.
Nekateri avtorji raziskav pa so uporabili ciljne vzorce, kjer so s hitrimi avtomatiziranimi
metodami (kot so: MicroflexTM
, MALDI-TOF) identificirali povzročitelje in se tako izognili
mešani rasti na direktnem antibiogramu 2,24-26.
Okužba krvi predstavlja življenjsko nevarno infekcijo, ki zahteva takojšnje zdravljenje. Zato
je v laboratorijski praksi, da se iz pozitivnega vzorca krvi – hemokulture izvede direktni
antibiogram za hiter, preliminaren izvid občutljivosti povzročitelja sepse 27-29.
Coorevits s sod. je pri različnih kliničnih vzorcih (respiratorni vzorci, urini abscesi in
punktati ) primerjal direktne antibiograme s standardnimi. Vzorci so bili izbrani po različnih
kriterijih, kot so zahteva zdravnika po direktnem antibiogramu, nova infekcija pri hudo
bolnem pacientu, ali v mikroskopskem preparatu kužnine prevladujoči stafilokoki ali po
Gramu negativne bakterije 30.
Sistem HB&L za določevanje mikroorganizmov v urinu, omogoča določevanje prisotnosti
mikroorganizmov v primarno sterilnih tekočinah v nekaj urah (Instruction for use, Alifax).
Po vrednotenju aparata Alfred 60/AST, Lahanas s sod. zaključuje, da je aparat bolj natačnen
pri presejalni metodi za negativne urinske vzorce, kot za pozitivne. To utemeljuje z
ugotovitvijo, da je naparava nepravilno odčitala 9 od 80 vzorcev. Nizko občutljivost za glive
bi bilo potrebno še raziskati 31.
Spezzotti pa zavrača navedene trditve. Navaja, da so nekateri pomembni tehnični aspekti
aparata bili neupoštevani, kar je doprineslo k podcenjevanju zmogljivosti karakteristik
naprave 32.
Nas v naši raziskavi ni zanimalo število poraslih kolonij CFU/mL, ampak gostota rasti do 0,5
McF.
Raziskovalci so težavo z nestandardnim inokulumom odpravili z nacepitvijo urina v bujon,
nekaj urno inkubacijo v aparatu HB&L in izdelavo antibiograma pri pozitivnih vzorcih.
Tako so dobili rezultat direktnega antibiograma s standardnim inokulumom naslednji dan
3,33
Štrumbelj je iz pozitivnih izbral za izdelavo direktnega antibiograma tiste, kjer so v
preparatu iz bujona bile samo po Gramu negativne bakterije. Študija je zajemala dvesto
izolatov enterobakterij, ki so bile testirane s petnajstimi antibiotiki. Cone direktnega
antibiograma so bile primerjane s standardnim antibiogramom po smernicah CLSI. Rezultati
direktnega antibiograma in standardne metode za 3000 testiranih antibiotikov se v 2900
primerih (96,7%) popolnoma ujemajo. Stopnja malih napak (2,8%), velikih napak (0,4%) in
zelo velikih napak (0,2%); stopnja zelo velikih in velikih napak je nizka za vse preiskovane
antibiotike. Popolnoma ujemanje za rezultat S-občutljiv je pri osmih antibiotikih, stopnja pri
direktnem antibiogramu za vse testirane antibiotike je visoka (minimalno 96,3%) 3.
S centrifugiranjem pozitivnih vial iz HB&L in uporabo sedimenta so Ilke in sod. določali z
odpornost različnih izolatov. Sediment so uporabili za identifikacijo in antibiogram z
aparatom VITEK®2 (bioMerieux). Raziskava je potekala v dveh stopnjah. V prvem koraku
so iz vseh urinov (1480) naredili mikroskopske preparate, ter vzorce obdelali po klasični
metodi nacepitve na trda gojišča in v HB&L bujon. Primerjava rasti po klasični metodi in v
bujonu HB&L napoveduje 93% občutljivost in 96,9% specifičnost pri uporabi bujona.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
16
V drugem koraku so vse izolate dobljene po klasični metodi, kot del rutinskega postopka in
sedimente bujonov testirali z HB&L in VITEK2 aparatom, sedimentov je bilo 102.
Identifikacija je bila pri 81,3% izolatih iz HB&L bujona pravilna. Skladnost je bila najvišja
(94,7%) za izolate Klebsiella spp., za 13,6% pa identifikacija ni bila uspešna.
Ujemanje antibiograma iz sedimenta s standardnim po smernicah CLSI je nad 90%, kar pa je
nižje kot pri študiji, ki je bila izvedena s standardnim inokulumom iz bujona HB&L. 33
Sandqvist s sod.je prvi, ki je primerjal direktni antibiogram iz urina po smernicah EUCAST.
Direktni antibiogram je bil izvedel po dveh postopkih in sicer: a) direktni antibiogram iz
urina tako, da je bil bombažni bris pomočen v urin in narejen razmaz na Mueller Hinton
agarju in b) izolat pripravljen s centrifugiranjem urina in pripravo pelet za MALDI-TOF,
kjer je bila izvedena identifikacija in antibiogram. Obe metodi sta bili primerjani s
standardnim disk difuzijskim antibiogramom po EUCAST. V raziskavo je bilo zajetih 196
vzorcev urinov z samo eno vrsto po Gramu negativnih bakterij. Za obe metodi sta stopnji
napak nizki, večina napak je pri ostalih vrstah, razen E.coli, največ za Proteus mirabilis. Pri
855 testiranih antibiotikih pri obeh metodah, je bilo 15 napak, od tega 3 zelo velike napake,
5 velikih napak in 7 manjših napak. V zaključku avtor navaja, da sta obe metodi z
interpretacijo z EUCAST mejnimi vrednostmi, varni za uporabo podatkov v klinične namene
2.
V znanstvenem prispevku Zboromyrska s sod. za izdelavo direktnega antibiograma iz urina
izbere tiste, pri katerih je bila identifikacija na MALDI-TOF-MS zanesljiva. Direktna
identifikacija je bila možna na 108 (86,4%) od vseh 125 pozitivnih urinov. Direktni
antibiogram je bil izveden na 102 identificiranih vzorcih. Rezultat je bil popolnoma skladen
z rutinsko metodo v 83 primerih enomikrobne infekcije. Po opisanem protokolu je čas za
mikrobiološko identifikacijo povzročitelja uroinfekta 1 uro, za antibiogram pa 24 ur 20.
Ker je sepsa življensko nevarna, zahteva hitro antibiotično zdravljenje z namenom, da se
posledično zmanjša smrtnost. Stokkou s sod. je izvedel direktni antibiogram iz hemokulture
in ga primerjal s standardnim antibiogramom iz Vitek 2 sistema z EUCAST mejnimi
vrednostmi. Cilj te študije je bil raziskati zanesljivost direktnega antibiograma iz pozitivne
hemokulture enobakterijske rasti. V primerjavi je bilo zajetih 428 izolatov iz hemokulture in
110 različnih bakterijskih vrst. V primerjavi za 2803 kombinacij bakterija – antibiotik je
ujemanje 95,4% z 1,28 % zelo velikih napak, 3,42% velikih in majhnih napak. Na ravni
bakterijske vrste so opazili zelo velike napake v kombinaciji Enterococcus spp.– gentamicin-
high level (10,87%) in Staphylococcus spp. – rifampicin (5%). Do zelo velikih napak ni
prišlo v primerih enterobakterij in Pseudomonas spp. Ob tem avtor zaključuje, da se v večini
kombinacij, vrsta bakterij – antibiotična učinkovina, rezutlat direktnega antibiograma z
mejnimi vrednostmi po smernicah EUCAST, lahko uporablja za optimiziranje empirične
antibiotične terapije, dokler niso na razpolago dokončni rezulatati 27.
3.2 Vpliv poročanja mikrobioloških rezultatov
Neprimerno predpisovanje antibiotikov je povezano s povečanjem stroškov za zdravstevmo
oskrbo in zmanjšanje kakovosti oskrbe.
V raziskavi, katere cilj je bil izmeriti klinični in gospodarski vpliv hitrega poročanja
mikrobioloških rezultatov, ki jo je opravil Galar s sod., so dokazali pomembno vlogo hitrih
metod. Avtomatiziran sistem VITEK®2 (bioMerieux) so uporabili za idenifikacijo in
testiranje odpornosti. Vključeni so bili le hospitalizirani bolniki z bakterijskimi okužbami,
razdeljeni so bili v dve skupini in sicer v skupino, kjer so rezultati bili na vojlo naslednji dan
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
17
in intervencijsko skupino, pri katerih je bil rezulatat isti dan. S skrajšanjem časa poročanja
pri urinih z 23,4 ur na 9,3 ure, pri ranah in abscesih z 23,5 ur na 9,5 ur so izračuni pokazali
pomembno krajši čas hospitalizacije in manjše skupne stroške. Vendar pa interventno
poročanje rezultatov izolatov krvnih kultur niso povzročili večjih kliničnih in finančnih
koristi 34
Daley s sod. pa v retrogradni študiji preučuje koliko zdravnikov bi se odločilo drugače, če bi
imeli podatek za direktni antibiogram. Kar v 52,8 % bi bila po študiji potrebna zamenjava
terapije iz širokospektralne v ciljano, pa se zdravniki ne bi odločili za spremembo. Na
odločitev glede izbire terapije vplivajo ne samo laboratorijski izvidi, ampak tudi težavnost
obolenja, vir bakterijske okužbe, alergije in druge sekundarne bolezni 28
3.3 Evropske smernice za antibiogram – EUCAST
EUCAST je organizacija, ki je nastala leta 1997 in deluje v okviru ESCMID, ECDC in
različnih nacionalnih ustanov za spremljanje in interpretacijo občutljivosti ter sodeluje z
evropsko agencijo za zdravila (EMA). Njen namen je, da vpelje standardizirane in vitro
metode testiranja občutljivosti, ter postavi merila za interpretiranje rezultatov 5.
EUCAST je razvil disk difuzijsko testiranje občutljivosti za antibiotike, ki je skupaj z novimi
evropskimi menjimi vrednostmi impelmentirana znotraj in zunaj Evrope. Do uvedbe
EUCAST smernic, so se uporabljale ameriške smernice CLSI. Sodelovanje CLSI in
EUCAST se nadaljuje po skupni odločitvi ustanovitve komiteja za »Določitev metod in
mejnih vrednosti za polimiksin/kolistin«, z namenom pridobitve mednarodne mejne
vrednosti za kolistin 35.
CLSI je v zadnjih letih naredil nekaj velikih odločitev. Eno od teh je bilo, da glede mejnih
vrednosti odločajo ljudje iz industrije. Ampak to ni dovolj, EUCAST je formiran od
ESCMID, po drugi strani pa je CLSI financiran od prodaje dokumentov in industrije 35
V članku Uvajanje testiranja občutljivosti za protimikrobna zdravila po smernicah EUCAST
v Sloveniji Štrumbelj s sod. navaja, da je prva stopnja določitev minimalnih inhibitornih
koncentracij (MIK-ov) posameznega antibiotika za posamezne vrste bakterij z ustrezno
standardizirano dilucijsko metodo. MIK je najmanjša koncentracija antibiotika, ki in vitro
zaustavi razmnoževanje bakterij. Ko so znane MIK, je potrebno določiti »mejno vrednost«,
to je MIK, ki ima določen pomen. Za usmerjanje zdravljenja pri bolniku uporabimo klinične
mejne vrednosti MIK, ki jih praviloma izražamo v znanih kategorijah občutljivost (S),
intermediarna občutljivost (I) in odpornost (R) 36.
Smith in Kronvall sta v svoji študiji analizirala 163 podatkovnih nizov disk difuzije, od tega
115 za bakterijske vrste in 48 za tipe sevov. Rezultati so uporabljeni pri EUCAST smernicah
za optimiziranje nastavitvenih parametrov standardnega postopka za interpretacijo
normiranja podatkov o odpornosti 37.
Implementacija EUCAST disk difuzijske metode v klinične laboratorije ni težavna, je pa
potrebno planiranje postopkov za vpeljavo. Izbira in priprava Mueller Hinton agarja,
izdelava in inkubiranje antibiogramov, merjenje con inhibicij, ter izvajanje kontrole kvalitete
navaja Matuschek s sod. kot nekaj pomembnejših aspektov 17.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
18
Pod okriljem SKOUPZ so slovenski strokovnjaki Štrumbelj, Ribič in Pirš izdali kratka
pojasnila za uporabo evropskih smernic 16.
Disk difuzijski antibogram je v Evropi evidentirano harmoniziran, čeprav bo trajalo še nekaj
časa, da bodo vsi laboratoriji šli skozi harmonizacijo. Drugo vprašanje pa je, če je možna
globalna harmonizacija. Lahko bi se to zgodilo, ker se vedno več držav poslužuje enostavnih
in dostopnih EUCAST priporočil in ker se lahko vsak udeleži odprte diskusije, ki je
nekajkrat letno objavljena na internetni strani EUCAST 38.
3.4 Antibiotik v urinu
Zaradi aktivnosti antimikrobnih ostankov v urinu, ki motijo rast bakterij in vitro, so lahko
rezultati urinokulture lažno negativni 39.
V literaturi navajajo avtorji različne metode, ki se razlikujejo po indikatorskem bakterijskem
sevu, vrsti in količini preiskovanega vzorca, princip testa je enak pri vseh izvedenih študijah.
Z enostavnim laboratorijskim poizkusom z disk difuzijo, se oceni nedavno antibiotično
zdravljenje.
Cardozo s sod. je preverjal pojav lažno negativnih urinskih kultur, ki se pojavljajo zaradi
prisotnosti protimikrobnih ostankov v vzorcih bolnikov, ki so bili sprejeti na bolnišnično
obravnavo.
Negativne vzorce urinov so preverjali z analizatorjem Alfred 60 (Alifax) in z metodo diska
tako, da so na dva prazna celulozna diska nanesli vzorec urina, disk so položili na dva
Mueller Hinton agarja. Enega so inokulirali s standardnim sevom E. coli ATCC 25922 ,
drugega pa z E. faecalis ATCC 29212. V originalni viali za test antibiotika v urinu je
raztopina bujona s suspenzijo S. epidermidis. Študija je pokazala boljše rezultate z
avtomatizirano metodo. Avtor navaja, da je razlog v nizki občutljivosti za disk metodo v
majhnem volumnu vzorca urina na disk (10µL) 39.
Z uporabo večkratno odpornih sevov ESBL E.coli za indikatorski sev, pa Emary s sod.
ugotavlja uporabo antibiotikov karbapenemov za zdravljenje. Študija je bila del regionalnega
nadzora nad uporabo antibiotikov 40.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
19
4 Materiali in metode dela
4.1 Primerjava antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim inokulomom
Načrt primerjave
Za primerjavo antibiograma po standardni metodi in antibiograma po hitri metodi s
standardnim inokulumom, je vsak vzorec urina bil preiskan po:
Metodi A: semikvantitativna urinokulturo, kot predpisan postopek preiskave seča
v mikrobiološkem laboratoriju
Metodi B: kultiviranje seča v bujonu in inkubacijo v aparatu HB&L
Primerjani bodo rezultati le tistih antibiogramov, kjer bo izolat le ena enterobakterija.
Na spodnji sliki je prikazana shema primerjave antibiogramov.
Slika 4-1: Shema postopka primerjave antibiogramov po standardni metodi in HMSI – hitri metodi s
standardnim antibiogramom
DOLOČANJE OBČUTLJIVOSTI BAKTERIJSKEGA IZOLATA ZA ANTIBIOTIKE
Metoda A:
Standardni postopek
Metoda B:
HMSI
PREMER INHIBICIJSKE
CONE (mm)
S/I/R
PREMER INHIBICIJSKE
CONE (mm)
S/I/R
PRIMERJAVA REZULTATOV ZA POSAMEZNE ANTIBIOTIKE
- Primerjava stopenj občutljivosti standardnega antibiograma in antibiograma HMSI
za posamezne testirane antibiotike
- Izračun deleža skladnosti / neskladnosti za vsak posamezen antibiotik
- Izračun deleža skladnosti za vse antibiotike
- Izračun deleža zelo velikih, velikih in majhnih odstopanj za vsak posamezen
antibiotik
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
20
Metoda A: standardni postopek
Materiali:
gojišča v petrijevkah: URI agar (URISELECT 4, BioRad)
KA (Columbia agar, Biomerieux z dodatkom ovčje krvi)
MHA (Mueller Hinton agar, Becton Dickinson)
0,85% NaCl, sterilna fiziološka raztopina
gojišča in testi za identifikacijo bakterij
testni diski s standardnimi koncentracijami antibiotikov (Becton Dickinson)
drugi materiali: kalibrirane cepilne zanke 10 µL, sterilni suhi brisi, plastične sterilne
kapalke, plastične epruvete
Oprema:
inkubator, 35 °C z aerobno atmosfero
stresalnik
nefelometer
digitalno pomično (kljunasto) merilo
računalniški program MBL, ki interpretira cone v skladu z EUCAST standardi
Kužnina: Nacepimo:
URIN 10 µL URI agar, KA
inkubiramo 24 ur, 35 °C
rast kolonij podatek: CFU/mL
razni testi suspenzija bakterij z gostoto 0,5 McF
antibiogram
identifikacija
MHA + diski z antibiotiki
podatek: povzročitelj okužbe inkubiramo 16 do 20 ur, 35 °C
odčitovanje con inhibicije
podatek: STANDARDNI ANTIBIOGRAM - SAT
Slika 4-2: Shema standardnega postopka
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
21
Metoda B: HMSI – hitra metoda s standardnim inokulumom
Materiali:
viale z bujonom URO-QUICK SCREENING KIT (SI 390.900, ALIFAX S.P.A.)
gojišča v petrijevkah: URI agar (URISELECT 4, BioRad)
MHA (Mueller Hinton agar, BBL-Becton Dickinson)
0,85% NaCl, sterilna fiziološka raztopina
gojišča in testi za identifikacijo bakterij
testni diski s standardnimi koncentracijami antibiotikov (Becton Dickinson)
raztopina vankomicina s koncentracijo 100 µg / 10 µL
drugi materiali: kalibrirane cepilne zanke 10 µL, sterilni suhi brisi, plastične sterilne
kapalke, plastične epruvete
Oprema:
pipete
inkubator, 35 °C z aerobno atmosfero
stresalnik
nefelometer
aparat HB&L
digitalno pomično (kljunasto) merilo
računalniški program MBL, ki interpretira cone v skladu z EUCAST standardi
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
22
Kužnina: Cepimo:
URIN 500 µL viala z » eugonic« bujonom
vstavimo v HB&L do 4 ure, 35 °C (poglavje 4.1.1)
rast po nekaj urah do gostote ≥ 0,5 McF
iz viale naredimo preparat po Gramu (poglavje 4.1.2)
mikroskopski
pregled razmaza
niso po Gramu neg. bakt. po Gramu neg. bakt.
konec preiskave, cepimo redčimo do 0,5 McF
ne gre za enterobakterije antibiogram
URI agar MHA + diski z antibiotiki
inkubiramo 24 ur, 35 °C inkubiramo 16 do 20 ur, 35 °C
primerjava rasti odčitovanje con inhibicije
z rastjo na primarnem
URI agarju iz SKUK
podatek: HITRI ANTIBIOGRAM - HAT
Slika 4-3: Shema postopka hitre metoda s standardnim inokulumom
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
23
Izvedba
Za pripravo gojišč, uporabo materialov in izvajanje postopkov smo upoštevali navodila za
delo Oddelka za medicinsko mikrobiologijo Murska Sobota in predpise sistemskega
postopka (SP) Nacionalnega laboratorija za zdravje, okolje in hrano.
V raziskavo smo vključili 230 vzorcev urina, ki so bili poslani iz različnih oddelkov Splošne
bolnišnice Murska Sobota, regionalnih zdravstvenih domov in zasebnih ambulant, v obdobju
od maja do junija 2016.
Vzorci glede na način odvzema so bili: srednji curek urina, urin, odvzet iz trajnega katera in
urin, odvzet z enkratno kateterizacijo.
Vzorci urina, ki so prispeli v laboratorij so bili obdelani po standardnem postopku – metodi
A in hitri metodi s standardnim inokulumom – metoda B.
Standardna metoda z nacepitvijo urina po semikvantitativni urinokulturi je rutinska
preiskava seča v mikrobiološkem laboratoriju. V eksperimentalnem delu preiskava po
standardnem postopku ni posebej opisana, ker ni predmet raziskave, potekala je neodvisno in
izvajali so jo drugi zaposleni v laboratoriju.
Rezultat antibiograma po standardni metodi pa je referenčna vrednost za primerjavo
antibiograma po hitri metodi s standardnim inokulumom (HMSI).
Omejili se bomo na metodo HMSI. Faze dela: barvanje po Gramu, izdelava in odčitovanje
antibiogramov pa je pri obeh metodah enako.
V nadaljevanju so podrobneje opisani instrumenti in raziskovalne metode, ki so bile
uporabljene pri metodi HMSI.
4.1.1 Kultiviranje urina v navadnem bujonu
Kužnino urina smo nacepili v vialo z navadnim bujonom (NBJ) in inkubirali v analizatorju
HB&L. Analizator spremlja rast bakterij v vzorcu urina in daje informacijo o številu bakterij
CFU/mL in gostoto po McFarlandu.
Pri standardni metodi poteka primarna inkubacija do izolata čez noč.
Z nacepitvijo urina v bujon in inkubiranjem v HB&L, smo skrajšali čas inkubacije vzorca do
največ 4 ure.
Analizator HB&L UROQUATTRO
OPIS ANALIZATORJA
naziv aparata: HB&L UROQUATTRO (v nadaljevanju HBL)
koda: SI 190.300
proizvajalec: ALIFAX S.p.A., Italija
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
24
Slika 4-4: HB&L Uroquattro
HB&L je prvi analizator na trgu za določevanje prisotnosti mikroorganizmov in testiranje
protimikrobne občutljivosti v primarno sterilnih tekočinah, kot so urin, kri, likvor, plevralne
in bronhialne tekočine, na osnovi monitoringa bakterijske rasti.
Z uporabo patentirane tehnologije, ki temelji na sipanju svetlobe, je možno odkriti prisotnost
bakterij in njihove odpornosti na antibiotike že v nekaj urah, z visoko občutljivostjo in
specifičnostjo.
PRINCIP HITRE METODE ZA DOLOČITEV OKUŽBE URINARNEGA TRAKTA
Vzorec urina cepimo v stekleno vialo z URO-QUICK reagentom (kat.št.: SI 390.900,
proizvajalec: ALIFAX S.p.A., Italija). Reagent v viali je »eugonic« bujon, ki omogoča rast
večine mikroorganizmov, ki jih najdemo v patoloških vzorcih urina.
V vsaki viali je magnetno mešalo, ki tekom analize zagotavlja, de je suspenzija homogena.
Z metodo laserske nefelometrije poteka kinetična detekcija na dveh detektorjih. Z laserskim
sipanjem svetlobe pri 650 nm sta meritvi vzorca izvedeni pod kotom 30° in 90°. Vzorec je v
mediju tekoče kulture, ki je mešan in inkubiran pri 37 °C.
HB&L spremlja faze rasti bakterij v preiskovanem vzorcu vse od začetne nacepitve v bujon,
s podporo dvosmernega vmesnika podatkov vsakokratne merilne rezultate obdela s
programsko opremo in tako zagotavlja podatke za rastno krivuljo v realnem času in podatek
o številu bakterij v CFU/mL. Občutljivost je odvisna od izbranega časa analize in za rutinsko
obdelavo vzorcev proizvajalec aparata priporoča triurno inkubacijo, kjer bodo zaznani kot
pozitivni, vzorci z ≥ 30.000 CFU/mL.
Vse vzorce inkubiramo pri 37 °C in prvi odčitek aparata je v ničelni fazi, kar pomeni, da
bodo v poteku inkubacije zaznane samo žive bakterije. Motnje, kot so eritrociti, levkociti,
mrtve celice in soli v vzorcu, se tako izločijo v ničelni fazi.
Stopnja zamotnitve bujona dosežene med preizkusom, se izpisuje na monitorju kot
McFarland Monitor in ko vzorec doseže 0,5 McF nam aparat da vizualni in zvočni signal.
Tak vzorec se lahko testira na občutljivost bakterije na antibiotik z antibiogramom, brez
potrebe po redčenje in koncu čakanja analize.
Programska oprema HB&L aparata omogoča različne teste, ki bi potekali istočasno, vsak
čitalnik položaja je neodvisen od drugih mest in se lahko nastavi glede na tip vzorca,
inkubacijski čas, analitični protokol in referenčno vrednost.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
25
OMEJITVE PRI UPORABI
Rast mikroorganizmov je odvisna od pogojev za rast in razmnoževanje (prehranske potrebe
mikroorganizmov in pogoji inkubacije), pa tudi od specifičnih dejavnikov kot so npr.
prisotnost antibiotika v vzorcu, oslabljenost mikroorganizma in inkubacijska doba.
Aparat HB&L ima za določene primere vzorcev omejitve testiranj, proizvajalec predlaga
rešitve za takšne situacije:
- visoko stopnjo motnosti vzorca urina HB&L zazna in na ekranu se izpiše TURBID;
priporoča se dilucija vzorca,
- prisotnost velike koncentracije antibiotika v vzorcu lahko zavira rast bakterij in ima
vpliv na končni rezultat; priporoča se uporaba viale URO-QUICK RAA KIT za
testiranje,
- zaradi nezmožnosti zagotavljanja hladne verige pri pošiljanju, je vzorec urina odvzet
v zbiralniku z borno kislino ali drugimi stabilizatorji za stabilizacijo številčne
koncentracije bakterij v urinu; priporoča se minimalni štiriurni čas inkubacije v
HB&L.
4.1.1.1 Izvedba
V raziskavo smo vključili 230 kliničnih vzorcev urina. Populacijski vzorec za obdelavo je bil
naključen in obdelani so bili zaporedni vzorci tistega dne, ko je to dopuščal delovni
postopek.
Vzorce, poslane na preiskavo seča na patogene bakterije, smo nacepili v vialo z »eugonic«
bujonom - v nadaljevanju viala z navadnim bujonom, NBJ. V vialo smo odpipetirali z
avtomatsko pipeto 500 µL urina. Viale damo v prazno pozicijo v merilnem prostoru, kot
kaže slika 4-5 , in vnesemo podatke o vzorcu v aparat.
Slika 4-5: Merilni prostor za viale v HB&L
Inkubacija vzorca in odčitovanje rezultatov, ki so izpisani na ekranu aparata in izpisu s
tiskalnika, poteka do 4 ure. Če je rast po nekaj urah do gostote ≥0,5 McF, lahko prekinemo
inkubacijo za vzorec ali počakamo do konca inkubacije in naredimo preparat po Gramu iz
viale. Spodnji sliki nam prikazujeta: leva slika, sporočilo o gostoti McF, desna pa krivuljo
rasti mikroorganizmov.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
26
Slika 4-6. Sporočilo na ekranu HB&L, leva slika: sporočilo o viali, kjer je rast ≥ 0,5 McF, desna
slika: krivulja rasti mikroorganizmov v navedenem času
Spremljali smo rast in jo enako interpretirali pri vseh vialah. Rast v viali je v celotni nalogi
opredeljena takole:
- Rast pomeni rast, pri kateri gostota mikroorganizmov v vzorcu doseže ali preseže
gostoto McFarland 0,5
- Če rast mikroorganizmov v 4 urah ne doseže gostote McFarland 0,5 ali več, smo to
interpretirali kot »ni rasti«. Zanimala nas je namreč le rast, iz katere je mogoče
narediti antibiogram, za kar je potreben standardni inokulum gostote McFarland 0,5.
Če v vialah ni bilo rasti, je bil postopek končan.
Postopek in interpretacija rasti v vialah, v katerih je bila dosežena »rast«
Cilj metod v nalogi je, da bi HAT naredili iz vseh vial z rastjo, kjer iz vzorca SKUK čista
kultura ene EB in ne bi izdelali HAT iz vial, kjer v vzorcu ni čiste kultura ene EB.
Cilj naloge so bile namreč le EB, ker smo uporabili zanje ustrezen antibiogram in ker so
ostale NB v SKUK preredke in bi bilo premalo rezultatov za analizo.
Opredelitev »smiselnega« in »uporabnega« HAT, ki velja v celotni nalogi
Izdelava HAT iz vzorca je »smiselna«, če v SKUK osamimo eno samo vrsto enterobakterije.
V vseh ostalih primerih je izdelava HAT »nesmiselna«.
»Smiselnost« je torej opredeljena na osnovi rasti v SKUK, podatek, ki ga izvemo naknadno.
Izdelava HAT je lahko smiselna, ni pa izvedljiva, če v viali ne zaznamo rasti.
Izdelava HAT iz vzorca je »uporabna«, če v SKUK osamimo eno samo vrsto enterobakterije
in v HAT dobimo čisto rast istega izolata. Če v SKUK ali v HAT dobimo dve vrsti bakterij,
SAT ali HAT ni mogoče odčitati in primerjati.
Pri vzorcu je lahko HAT smiseln, izdelan, a ni uporaben, če dobimo mešano kulturo v HAT.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
27
Le pri »uporabnih« HAT smo lahko primerjati rezultate HAT s SAT (to je bil osnovni cilj
naloge), ker gre v tem primeru za isti izolat, z antibiogramom, pridobljenem po standardnem
in na hitri način.
Pristop k vialam z rastjo je lahko različen, poimenovali smo 4 različne pristope, strategije A,
B, C in D – ob katerih pogojih iz viale z rastjo naredimo HAT:
- Strategija A - cepimo vialo z NBJ, HAT izdelamo iz vseh vial z rastjo, preparata po
Gramu iz vial ne delamo.
- Strategija B - cepimo vialo z VBJ (viala z bujonom z vankomicinom), HAT
izdelamo iz vseh vial z rastjo, preparata po Gramu iz vial ne delamo.
- Strategija C - cepimo vialo z NBJ, iz vseh vial z rastjo naredimo razmaz kužnine po
Gramu in HAT izdelamo le, če v razmazu vidimo le NB.
- Strategija D - cepimo vialo z VBJ, iz vseh vial z rastjo naredimo razmaz kužnine po
Gramu in HAT izdelamo le, če v razmazu vidimo le NB.
Rezultat strategije pri posameznem vzorcu je lahko »izdelava« HAT ali »ni izdelave«, oboje
je lahko pravilno ali nepravilno. Pri preučevanju strategij smo opredelili, kdaj je izdelava
HAT pravilna in kdaj nepravilna, kar je pregledno prikazano v tabeli 4-1.
»Pravilno« je, če:
- je HAT izdelan, če je »smiselen«
- da HAT ni izdelan, ko je »nesmiselen«
»Nepravilno« je, če:
- je HAT izdelan, pa ni »smiselen«
- HAT ni izdelan, če je »smiselen«.
Tabela 4-1. Opredelitev pravilnosti ali nepravilnosti rezultata strategije pri posameznem
vzorcu glede izdelave in smiselnost hitrega antibiograma
HAT je izdelan HAT je smiselen Opredelitev izdelave in pravilnosti
DA DA izdelan, pravilno
DA NE izdelan, nepravilno
NE DA ni izdelan, nepravilno
NE NE ni izdelan, pravilno
Legenda: HAT je hitri antibiogram
4.1.2 Barvanje po Gramu
Barvanje smo izvedli po standardnem postopku za bakterije 41.
Razmaz iz bujona v viali:
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
28
Kapljico smo kanili na objektno steklo in počakali, da se na zraku posuši.
Fiksacija (pritrdi strukture na stekelce):
S stekelcem, na katerem je preparat,smo trikrat zaokrožili skozi plamen gorilnika (razmaz
mora biti na zgornji ploskvi stekelca). Uporabili smo vodoravne navpične (od zgoraj
navzdol) gibe: pomembno je, da je preparat razumno, ne prekratek, ne predolg čas v
plamenu, da se stekelce segreje na približno 60 °C.
Barvanje po Gramu:
1. Na fiksiran preparat smo nakapljali KRISTAL-VIOLET REAGENT. Pustili
smo 30 sekund.
2. Sprali smo pod tekočo vodo.
3. Na preparat smo nakapljali LUGOL REAGENT (jodova raztopina). Pustili
smo 30 sekund.
4. Odlili smo LUGOL s stekelca in obilno nanesli 96% ETANOL za
razbarvanje: Pustili smo 30 sekund: če je preparat gost, smo vmes odlivali
vijoličasti alkohol in dolivali sveži alkohol.
5. Ponovno smo sprali pod tekočo vodo.
6. Na preparat smo nakapljali FUKSIN REAGENT. Pustili smo 30 sekund.
7. Sprali smo pod tekočo vodo.
8. Preparat smo popivnali z mehkim papirjem, pustili smo, da se je posušil na
zraku do konca.
4.1.2.1 Izvedba
Pri 92 vzorcih od 230 testiranih vzorcev je bila rast mikroorganizmov v vzorcu do gostote
≥0,5 McF. Za teh 92 vzorecv smo naredili preparat po Gramu in ga pregledali.
Mikroskopirali smo pri 1000 x povečavi z imerzijo (mikroskop: model Standard 20, Carl
Zeiss).
V preparatih vzrocev, kjer so bili vidni samo po Gramu negativni bacili, se je postopek
raziskave nadaljeval po shemi Metode B - izdelava antibiograma.
Za vzorce, kjer so v preparatu bile prisotne še druge oblike mikroorganizmov, je bila
preiskava zaključena, ker so naša ciljna populacija enterobakterije.
4.1.3 Izdelava antibiograma
Splošno:
Izdelavo antibiograma izvedemo po standardnem EUCAST postopku, metodo izvajamo
brez modifikacij, da zagotovimo zanesljive rezultate 18.
Disk difuzija je eden izmed najstarejših pristopov za testiranje občutljivosti za antibiotike.
Priprava in hranjenje gojišč
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
29
Za disk difuzijsko testiranje občutljivosti bakterij za protimikrobna zdravila po metodi
EUCAST-a uporabimo gojišče Mueller-Hinton agar (MHA). Gojišče pripravimo v
laboratoriju po navodilih proizvajalca.
Gojišče za testiranje občutljivosti mora biti debeline 4 mm ± 0,5 mm (približno 25 mL
gojišča nalijemo v plošče s premerom 90 mm).
Pred uporabo se prepričamo, da je površina gojišča suha, vendar pazimo, da gojišča ne
presušimo.
Pogoji skladiščenja, sušenja in roki uporabnosti v laboratoriju pripravljenih gojišč so
opredeljeni v sistemu nadzora kakovosti v laboratoriju.
Priprava inokuluma
Za izvedbo disk difuzijskega antibiograma po metodi EUCAST potrebujemo inokulum
gostote McFarland 0,5. Pregost inokulum povzroči premajhne, preredek inokulum pa
prevelike cone. Inokulum umerimo z uporabo nefelometra.
a. Po standardnem postopku za neposredno pripravo inokuluma uporabimo kolonije,
ki so porasle po inkubaciji čez noč na neselektivnem gojišču. S sterilno
bakteriološko zanko ali bombažnim brisom izberemo nekaj po obliki podobnih
kolonij in jih suspendiramo v fiziološki raztopini. Inokulum umerimo na gostoto
McFarland 0,5. Želeno gostoto dosežemo tako, da v suspenzijo dodajamo
fiziološko raztopino ali dodatni odmerek bakterijske rasti. Izvedba tega
antibiograma ni del raziskave, je pa opisan, da se prikaže razlika v pripravi
inokuluma.
b. Po HMSI postopku bujonu po potrebi dodajamo po kapljicah fiziološko raztopino
do gostote 0,5 McFarland.
Pripravljena suspenzija je uporabna še 60 minut po pripravi, priporočeno pa jo je
uporabiti v roku 15 minut po pripravi.
Nacepitev plošč
S pripravljenim inokulumom smo v roku 15 minut nacepili gojišča za testiranje
občutljivosti.
V pripravljeno bakterijsko suspenzijo namočimo sterilen bris. Odvečno tekočino iz brisa
odstranimo tako, da bris pritiskamo ob steno epruvete nad nivojem suspenzije.
Inokulum enakomerno premažemo z brisom po celotni površini gojišča ročno tako, da
gojišče premažemo v treh smereh po celotni površini.
V roku 15 minut po tem, ko smo premazali plošče položimo diske.
Če čakamo predolgo, bi se na sobni temperaturi začela rast in bi dobili premajhne cone.
Polaganje antibiotičnih diskov
Diske smo položili na gojišče z dispenzorjem, tako, da se disk gojišča dotika enakomerno
s celotno površino. Ko smo diske enkrat položili, jih ne smemo več premikati, ker se
difuzija antibiotika v agar začne v trenutku, ko se disk dotakne gojišča.
Število diskov na posamičnem gojišču mora biti omejeno tako, da ne prihaja do
prekrivanja zaviralnih con in jih lahko zanesljivo izmerimo.
Praviloma na ploščo 90 mm položimo največ 6 diskov.
Da preprečimo izgubo učinkovitosti protimikrobne snovi v diskih, kar povzroči
zmanjšane cone, smo jih hranili pri ustreznih pogojih. Diske smo hranili v zaprtih
posodah z izsuševalcem in zaščitene pred svetlobo.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
30
Zaloge in delovne zaloge diskov hranimo v zaprtih posodah v hladilniku pri temperaturi
pod 8 °C.
Ko posodo vzamemo iz hladilnika, jo nekaj časa pustimo na sobni temperaturi, da se
ogreje, šele nato jo odpremo. Tako preprečimo kondenzacijo vodnih par.
Inkubacija plošč
Najkasneje 15 minut po tem, ko smo položili diske, plošče obrnemo in inkubiramo pri
35±1 °C v aerobni atmosferi, 16 do 20 ur.
Za kontrolo rasti iz bujona smo cepili URI agar, ga inkubirali čez noč pri 35±1 °C v aerobni
atmosferi. URI agar je kromogeno gojišče, ki lažje odkriva mešane rasti. Pri metodi HMSI
identifikacije nismo izvajali posebej, ampak smo samo primerjali barvo kolonij s končno
identifikacijo po standardnem postopku.
4.1.3.1 Izvedba
Občutljivost bakterij 66 vzorcev iz vial za antibiotike, kjer so bili vidni samo po Gramu
negativni bacili, smo določali z disk difuzijsko metodo v skladu z navodili evropskih
smernic za antibiogram, ki jih pripravlja EUCAST, European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing.
Suspenzijo v viali smo redčili z dodajanjem po kapljiacah s sterilno 0,85% fiziološko
raztopino, da smo pripravili bakterijsko suspenzijo gostote 0,5 McF. Ob vsakem dodatku
fiziološke raztopine suspenziji, smo suspenzijo premešali s stresalnikom (vortex), da smo
zmes homogenizirali in ji izmerili gostoto (motnost) bakterijskih suspenzij z nefelometrom.
Tako pripravljen inokulum vsebuje približno 1-2 x 108 CFU/mL (angl. Colony forming
units).
Pripravljen inokulum z gostoto 0,5 McF smo s sterilnim brisom zasejali na petrijevke
Mueller Hinton agarja. Omočen bris v suspenzijo, smo narahlo oželi ob steno epruvete in z
enakomernim nanosom premazali površino treh Mueller Hinton agarjev. Razmaz suspenzije
se mora absorbirati v gojišče, zato smo nekaj minut počakali (ne več kot 15 minut) in nato
položili antibiotične diske.
Celulozne diske premera 6 mm, ki vsebujejo standardno koncentracijo antibiotika, smo z
dispenzorji položili na inokulirane plošče. Skupno smo pri vsakem vzorcu testirali 18
antibiotikov, na vsaki petrijevki po šest antibiotičnih diskov. Seznam testiranih antibiotokov
je naveden v tabeli 4-2.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
31
Tabela 4-2. Seznam testiranih antibiotikov, okrajšave na diskih in količine antibiotika v diskih,
uporabljenih pri testitanju izoliranih enterobakterij iz urina
Antibiotik Okrajšava Količina na disk (µg)
Ampicilin AM-10 10
Amoksicilin s klavaulansko kislino AMC-30 30
Amikacin AN-30 30
Ceftazidim CAZ-30 30
Cefiksim CFM-5 5
Cefadroksil CFR-30 30
Ciprofloksacin CIP-5 5
Ceftriakson CRO-30 30
Cefuroksim CXM-30 30
Ertapenem ETP-10 10
Cefepim FEP-30 30
Nitrofurantoin FM-100 100
Gentamicin GM-10 10
Imipenem IPM-10 10
Levofloksacin LVX-5 5
Meropenem MEM-10 10
Trimetoprim-sulfametoksazol SXT-25 25
Piperacilin s tazobaktamom TZP-36 36
Antibiograme smo inkubirali aerobno, 16-20 ur pri temperaturi 35±1 °C.
Iz vsake viale smo cepili še s sterilno ezo kapljico na kromogeno gojišče URI agar. Naslednji
dan preverimo rast kolonij na agarju za potrditev števila vrst bakterij.
4.1.4 Pregled plošč po inkubaciji, merjenje con inhibicije in interpretacija antibiogramov
Z nanosom ustreznega inokuluma in pravilno nacepitvijo gojišč, dobimo enakomerno
konfluentno bakterijsko rast.
Rast mora biti enakomerno zasejana po plošči in konfluentna tako, da so zaviralne cone
enakomerne in okrogle (niso nazobčane).
Na sliki 4-7 je primer antibiograma s konfluentno rastjo, cone inhibicij z okroglimi oblikami
in jasnimi robovi in primer antibiograma z mešano rastjo dveh bakterijskih vrst.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
32
Slika 4-7: Dva primera antibiograma: konfluentna rast čiste kulture in mešana rast različnih vrst.
Velikost zaviralnih con odčitamo s prostim očesom na meji popolnega zaviranja rasti tako,
da ploščo držimo približno 30 cm od očes.
Plošče odčitavamo z zadnje strani, pri poševno padajoči svetlobi tako, da plošče držimo pod
kotom nad temno podlago.
Premer zaviralne cone natančno izmerimo z digitalnim kljunastim merilom.
Izmerjene premere con interpretiramo na podlagi sprejetih EUCAST smernic.
Pregledali smo rast in barvo kolonij na URI agar in jo primerjamo z rastjo na URI agarju, ki
je bil nacepljen po SKUK metodi. Na URI agarju rastejo vse enterobakterije, a različno
obarvano. Če so kolonije na obeh URI agarjih enake po obliki in velikosti in so enake barve,
smo prevzeli identifikacijo iz standardnega postopka. Posebej pri metodi B identifikacije
tako nismo izvajali.
4.1.4.1 Izvedba
Po inkubaciji mora biti bakterijska rast na agarskih ploščah z antibiogrami konfluentna, cone
inhibicije ob položenem antibiotičnem disku pa enakomerno okrogle oblike. Antibiogrami,
kjer sta porasli dve ali več bakterijski vrsti, niso bili vključeni v primerjavo antibiogramov.
Pri 52 antibiogramih od narejenih 66 smo dobili rast v čisti kulturi ene enterobakterije in
odčitali cone inhibicij.
Premere con inhibicij (mm) smo izmerili z digitalnim kljunastin merilom in s prenosom
podatkov v računalniški program MBL (mikrobiološki laboratorij ga uporablja za vnos
podatkov o pacientu in vzorcu, vnosu in tiskanju izvida, interpretaciji rezultatov,
povezovanju v mreži in ostale aplikacije) dobili kategorijo občutljivosti bakterijskega izolata
in jo izrazili kot občutljiv (S, angl. sensitive), intermediaren ali zmerno občutljiv (I, angl.
intermediate) in odporen ali neobčutljiv (R, angl. resistant) v skladu z navodili EUCAST.
Rezultat smo natisnili in izbrisali iz programa MBL. Ročno smo jih prepisali v EXCEL
tabelo za nadaljnjo primerjavo.
Pregledamo rast in barvo kolonij na URI agar. Rezultate primerjamo s končno identifikacijo
po standardni metodi.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
33
4.1.5 Metodologija primerjave rezulatov antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim inokulomom
Rezultate, stopnje občutljivosti 52 bakterijskih izolatov, ki smo jih dobili po HMSI metodi,
smo primerjali z rezultati, dobljenimi po standardni metodi, ki so referenčna vrednost.
Rezultate standardnega antibiograma so odčitali drugi zaposleni v laboratoriju, zaradi
izključitve vpliva avtorja raziskave na rezultate.
Natančnost določanja občutljivosti po HMSI za antibiotike je bila primerjana z rezultati
določanja občutljivosti po standardni metodi. Nabor testiranih antibiotikov je enak pri obeh
metodah in gre za antibiotike, ki so v rednem rutinskem testiranju pri izolatih enterobakterij
iz urina.
Izračunali smo deleže skladnosti med metodama za posamezne antibiotike in skupni delež
skladnosti po formuli:
Napake smo opredelili kot neskladnost med rezultatom HAT in SAT (referenčna metoda).
Kriteriji za interpretacije napak glede na kategorije občutljivosti, določene z dvema
metodama navaja Bengtsson s sod. 42.
Opredelitve velikosti neskladnosti:
MAJHNA NESKLADNOST – če je rezultat ene metode zmerna občutljivost (I), druge
metode pa občutljivost (S) ali odpornost (R)
VELIKA NESKLADNOST – kadar je rezultat referenčne metode občutljivost, rezulat
primerjalne metode pa odpornost – gre za lažno odporen test antibiotika po HMSI
ZELO VELIKA NESKLADNOST – kadar je rezultat referenčne metode definiran kot
odporen, primerjalna metoda pa da za organizem občutljivost – gre za lažno občutljiv test
antibiotika po HMSI
V tabeli 4-3. so opredeljene različne možnosti rezultatov.
Tabela 4-3. Razvrstitev neskladnosti v odvisnosti od rezultatov standardnega in hitrega
antibiograma.
MAJHNA NESKLADNOST
VELIKA
NESKLADNOST
ZELO VELIKA
NESKLADNOST
Referenčna metoda: STANDARDNI ANTIBIOGRAM
S I I R S R
Primerjalna metoda: HITRI ANTIBIOGRAM
I S R I R S
Legenda: občutljivost (S), zmerna občutljivost (I) in odpornost (R)
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
34
Izračunali smo deleže majhnih, velikih in zelo velikih neskladnosti za vsak posamezni
antibiotik in skupni delež vseh majhnih, velikih, in zelo velikih neskladnosti po formulah:
Rezultati so sprejemljivi, če je delež skladnosti pri primerjavi dveh metod ≥ 90 %, delež
velikih neskladnosti in delež zelo velikih neskladnosti pa ≤ 3%. Ta kriterij je ocena za
primerljivost ujemanja dveh metod.
Enake kriterije za ustreznost metode navaja Bengtsson s sod. primerjavi mejnih vrednosti po
EUCAST za disk difuzijsko metodo in referenčno standardno mikrodilucijo 42.
4.2 Uspešnost dodatka vankomicina pri zaviranju rasti po Gramu pozitivnih bakterij
Pri našem vsakdanjem delu ne uporabljamo kromogenega Mueller Hinton agarja, zato je bil
naš namen, da po Gramu pozitivne bakterije, ki so ponavadi kontaminanti v urinu, zavremo z
dodatkom vankomicina.
Začetnih 150 vzorcev urina od 230 smo vzporedno cepili v vialo NBJ in vialo, ki smo ji v
laboratoriju dodali vankomicin VBJ. Naša cilja sta bila preveriti:
ali dodatek vankomicina v vialo z bujonom in nacepljenim vzorcem urina, zavira
eventuelno prisotne po Gramu pozitivne bakterije v urinu, ki v urin v majhnih količinah
pridejo ob odvzemu in se v bujonu razmnožijo, kar predstavlja motnjo pri odčitovanju
antibiograma po HMSI.
določiti časovno stabilnost raztopine vankomicina. Raztopino smo kapnili na prazen
disk, ki ga bomo uporabili za kontrolni antibiogram s standardnim sevom: izmerjena
inhibicijska cona bo pokazala aktivnost vankomicina v raztopini. Prva dva tedna smo
preverjali z antibiogramom cono inhibicije z vankomicinom prepojenega diska vsakih
nekaj dni, od tretjega pa do dvanajstega tedna pa enkrat tedensko. Izmerjene cone bomo
podali v tabeli in grafično.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
35
4.2.1 Priprava laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL in priprava bujona
z vankomicinom
Priprava raztopine vankomicina iz praška vankomicina v viali
Sestavina viale: viala z 1g vankomicina (sterilen prašek, ampula z vankomicinom).
Priprava: V vialo z 1 g vankomicina vbrizgamo 10 mL sterilne vode, dobro premešamo in
počakamo, da se prašek raztopi: dobimo osnovno raztopino v viali s koncentacijo 100
mg/mL. To je stock solution VA: 100 mg / mL.
1 mL stock solution VA smo dodali 9 mL sterilne vode, premešali in tako smo dobili
delovno raztopino vankomicina s koncentracijo »100 µg/10µL« (enako 10 mg / mL),
razpipetiramo v viale po 1 mL. Tako pripravljena raztopina je dobila oznako: VA 100 µg /10
µL 17.05.2016, kar je pomenilo serijo raztopine.
Eno vialo hranimo do porabe reagenta v hladilniku, ostale pa do prve uporabe v
zamrzovalniku. Testirali smo le vialo, ki smo jo hranili v hladilniku.
Priprava viale z dodajanjem vankomicina, rezultat je bujon v viali z vankomicinom
Pred cepljenjem urina smo 20 µL reagenta VA 10 mg / mL smo odpipetirali v originalno
vialo z NBJ (vsebuje 2 mL bujona, ki ga proizvajalec imenuje »eugonic broth«) in premešali,
s čimer smo dobili bujon z vankomicinom, s končno koncentracijo vankomicina v bujonu
100 µg / mL.
4.2.2 Način primerjave rezultatov cepljenja urina v navadno vialo in vialo z
vankomicinom
Za primerjavo smiselnosti rabe viale z vankomicinom, smo vzporedno nacepili prvih 150
vzorcev urina od preiskovanih 230 vzorcev v vialo z NBJ in z VBJ. Obe viali smo vnesli v
analizator in spremljali krivuljo rasti. Čas inkubacije: do dosežene gostote McFarland 0,5
(takrat se inkubacija lahko prekine) ali največ 4 ure.
4.3 Določitev trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin 10 mg / mL
Raztopino vankomicina v laboratoriju pripravljamo kot laboratorijski reagent, ki se uporablja
kot dodatek pri pripravi selektivnih agarjev in bujonov.
Vsakodnevno tehtanje in priprava, ter kontrola kvalitete reagenta vankomicina predstavlja v
delovnem procesu obremenitev z vsakodnevnimi kontrolami. Z določitvijo roka stabilnosti
pripravljenega reagenta se izognemo tem preverjanjem.
Za določitev roka stabilnosti smo v začetku testiranja na dva do tri dni kontrolirali
učinkovitost vankomicina z izvedbo standardnega antibiograma s standardnim sevom
S.auereu ATCC 29213. Na razmaz bakterijskega inokuluma smo položili disk, na katerega
smo nanesli 10 µL raztopine vankomicina s koncentracijo 100 µg/10µL. Antibiogram smo
inkubirali 35 °C in po inkubaciji 16-20 ur, odčitali cono inhibicije.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
36
Slika 4-8: Slika testiranja trajnosti laboratorijskega reagenta vankomicin
Kriterij za stabilnost vankomicinskega reagenta: reagent je stabilen, če ni upada cone za več
kot 3 mm od začetne izmerjene cone.
Časovno stabilnost vankomicinskega reagenta bomo prikazali v tabeli in grafu.
4.4 Testiranje na prisotnost antibiotika v urinu
V času trajanja študije smo opazili, da je nezanemarljiv delež vzorcev, ki ni dosegel praga
pozitivnosti gostote ≥ 0,5 McF v analizatorju HB&L, po semikvantitativni metodi pa je bila
urinokultura pozitivna.
Proizvajalec navaja možen vzrok »nerasti« tudi prisotnost antibiotika v urinu. Odločili smo
se, da urine dodatno testiramo na prisotnost antibiotika v urinu, če je po SKUK bila rast
(≥103
CFU/mL) v čisti kulturi enterobakterije. Ta dodatni test ni zajel vseh urinov, ker smo
ga začeli izvajati v sredini raziskave.
Urine, ki so bili po rutinskem postopku v laboratoriju pozitivni, rezultat rasti do motnosti
≥ 0,5 McF v aparatu pa ni bil dosežen, smo testirali na prisotnost antibiotika v urinu.
Gre za metodo z disk difuzijo: na Mueller Hinton agar pripravimo standardni inokulum
standardnega bakterijskega seva, na prazen disk nanesemo kužnino in agar inkubiramo.
Zanimalo nas je ali antibiotik v urinu inhibira rast nacepljenega bakterijskega seva. Večina
objavljenih metod interpretira vsako cono inhibicije okrog diska kot dokaz za prisotnost
antibiotika v urinu.
Ker nas je zanimalo ali antibiotik v urinu inhibira enterobakterije, smo za izvedbo testa
uporabili metodo, ki jo navaja Driscoll s sod., pri kateri je indikatorski sev za antibiotike v
urinu E.coli ATCC 25922, na disk pa nanesemo 20 µL kužnine 43.
Izvedba
S standardnim sevom bakterije E.coli ATCC 25922 smo pripravili inokulum v 2 mL sterilne
0,85 % fiziološke raztopine z gostoto 0,5 McF. Suspenzijo smo s sterilnim brisom aseptično
zasejali na Mueller Hinton agar. Na prazni celulozni disk, premera 6 mm smo s pipeto
nanesli 20 µL urina, in počakali približno minuto, da se je urin absorbiral. Disk smo položili
na gojišče inokulirani s standardnim sevom E.coli ATCC 25922. Naslednji dan pregledamo
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
37
ali se je pojavila cona zavrtosti rasti standardnega seva, kar kaže na prisotnost antibiotika v
urinu.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
38
5 Rezultati in diskusija
Raziskovalne metode so bile v poglavju Materiali in metode opisane v več podpoglavjih in v
skladu s tem bodo podani tudi rezultati z interpretacijo oz. diskusijo.
5.1 Primerjava rezultatov antibiogramov po standardni metodi in hitri metodi s standardnim inokulumom
5.1.1 Rezultati kultiviranja
V raziskavo smo vključili 230 kliničnih vzorcev urina.
Ugotovili smo, da je bilo od 230 vzorcev v semikvantitativni urinokulturi pozitivnih 133
vzorcev, kjer smo osamili različne mikroorganizme: kvasnice, po Gramu pozitivne ali po
Gramu negativne bakterije.
Rast v viali z gostoto ≥ 0,5 McF smo v HB&L aparatu ugotovili v 92 primerih vzorcev od
230 nacepljenih, v 41 primerih pa ne.
Od 41 vzorcev, kjer v viali ni bilo rasti gostote ≥ 0,5 McF, je bilo 16 vzorcev, pri katerih
smo v SKUK osamili eno samo vrsto enterobakterij, a te niso dosegle praga rasti do gostote
0,5 McF v HB&L analizatorju. Razprava o možnih vzrokih, zakaj tu ni bilo rasti, je v točki
5.1.4
Tabela 5-1. Pregled rezultatov standardne semikvantitativne urinokulture 230 vzorcev urina
Rezultat urinokulture Število
rezultatov
Najpogostejši izolati (število)
En izolat po Gramu negativne
bakterije
79 Enterobakterije (76), Pseudomonas aeruginosa (3)
En izolat po Gramu pozitivne
bakterije
15 Enterococcus faecalis (7), Streptococcus agalactiae
(4), Staphylococcus aureus (2), Staphylococcus
epidermidis (1), Staphylococcus warneri (1)
Dva različna izolata bakterij 29 Različne kombinacije dveh bakterij (29)
En izolat gliv 8 Candida albicans (4), C. glabrata (3), Trichosporon
asahii (1)
Več vrst bakterij (mešana
flora)
10
Negativna urinokultura 43
Na zasejanih gojiščih ni bilo
rasti
46
SKUPAJ 230
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
39
5.1.2 Pozitivne viale - barvanje po Gramu in mikroskopski pregled preparata
Za 92 pozitivnih vzorcev iz HB&L analizatorja smo izvedli postopek barvanja po Gramu in
pregledali mikroskopske preparate.
V 66 vzorcih urinov so bili vidni samo po Gramu negativni bacili.
Samo kvasovke so bile vidne v treh preparatih urinov, v enajstih preparatih samo po Gramu
pozitivne bakterije – rezulat barvanja je bil v teh primerih skladen z izolati v SKUK.
V 8 preparatih urinov so bile vidne po Gramu pozitivne in negativne bakterije. Pri teh
vzorcih smo v SKUK osamili le eno bakterijsko vrsto po Gramu negativnih bakterij. Po
pregledu primarno nacepljenega URI agarja v SKUK smo ugotovili, da je v vseh teh
primerih porasla zelo majhna populacija raznih bakterij, katerih rast na URI agarju je bila
opisana kot: bele, turkizne, drobne (opis kolonij ustrezen za po Gramu pozitivne bakterije).
Sklepamo, da se je populacija, ki jo po SKUK označujemo kot verjetno kontaminacijo
vzorca s sluznic (malo po Gramu pozitivnih bakterij) v viali z NBJ namnožila, da je bilo v
preparatu po Gramu bilo teh bakterij nezanemarljivo veliko.
5.1.3 Pregled antibiogramov in odčitovanje con inhibicij
Iz 66 vzorcev urinov iz vial, pri katerih so bili v preparatu vidne po Gramu negativne
bakterije, smo izdelali antibiogram. V besedilu navajamo, da gre za hitri antibiogram – HAT.
Hitrost ni v času inkubacije samega antibiograma, ampak v času razmnoževanju bakterij do
rasti, ko je gostota mikroorganizmov vzorcu ≥ 0,5 McF. Ta opazovani čas je do 4 ure, v
primeru zgodnejše dosežene gostote, lahko inkubacijo prekinemo.
Nismo uporabili izraza direktni antibiogram, ker se ta v literaturi uporablja za antibiogram
direktno izveden iz kužnine (brez vmesne rasti v bujonu).
Pri 52 antibiogramih od narejenih 66, smo dobili rast v čisti kulturi ene enterobakterije.
Čista kultura poraslih enterobakterij bakterij in konfuentna rast na Mueller Hinton agarju sta
predpogoja za odčitovanje antibiograma in upoštevanje rezultatov v primerjalni študiji.
Pri ostalih 14 narejenih antibiogramih od 66, je bila pri 11 ugotovljena mešana dveh ali več
enterobakterij, pri 3 antibiogramih pa rast bakterije Pseudomonas aeruginosa, ki je
nefermentativen po Gramu negativen bacil in ni zajet v raziskavo.
Ko smo izdelali hitri antibiogram, smo hkrati cepili še URI agar. Pred odčitovanjem HAT
smo preverili na URI agarju skladnost barve poraslih kolonij z barvo kolonij na URI agarju,
ki je bil narejen po SKUK metodi. Če je bila barva in oblika kolonij na obeh agarjih enaka,
smo za identifikacijo pri hitri metodi upoštevali izolat SKUK metode.
V primeru, da še identifikacija po SKUK ni bila končana, HAT pa je bilo potrebno odčitati,
smo v program MBL vnesli kot izolat koliformne bakterije.
S pomočjo digitalnega kljunastega merila smo po inkubaciji in pregledu gojišč izmerili
premere zaviralnih con. S prenosom podatkov v računalniški program MBL
mikrobiološkega laboratorija, se izpiše kategorija občutljivosti bakterijskega izolata, ki se
izrazi kot občutljiv (S, angl. sensitive), zmerno občutljiv ali intermediaren (I, angl.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
40
intermediate) in odporen (R, angl.resistant) za testiran antibiotik. Za interpretacijo con
inhibicije, je predloga v programu MBL usklajena z veljavnimi mejami posameznih
kategorij – »breakpoints« po EUCAST.
Podatki HAT odčitanih občutljivosti bakterij za antibiotike so zbrani v tabeli 5-3 Kategorije
občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata za antibiotike za - 52
hitrih antibiogramov.
5.1.4 Primerjava rezultatov hitrega in standardnega antibiograma
V 76 vzorcih od 230 so v SKUK enterobakterije zrasle kot edini izolat iz vzorca. V tabeli 5-2
so navedene bakterijske vrste, ki smo jih osamili. Posebej so navedeni izolati, pri katerih
smo iz vzorca naredili HAT in tisti, kjer HAT nismo naredili.
Tabela 5-2. Pregled izolatov 76 vzorcev, kjer so enterobakterije v semikvantitativni
urinokulturi zrasle kot edini izolat iz vzorca.
Bakterijska vrsta Izolati s
HAT*
Izolati brez
HAT*
Vsi izolati Delež izolatov s HAT
(%)
Escherichia coli 40 16 56 71,4
Proteus mirabilis 4 2 6 66,7
Klebsiella pneumoniae 4 1 5 80
Enterobacter cloacae 2 2 4 50
Morganella morganii 0 2 2 0
Providencia stuartii 0 1 1 0
Klebsiella oxytoca 1 0 1 100
Citrobacter koseri 1 0 1 100
SKUPAJ 52 24 76 68,4
Legenda: HAT je hitri antibiogram.
Pri teh vzorcih bi bil zaradi čiste kulture enterobakterij v SKUK HAT »smiseln«; če ni bil
izdelan, je to neželen izhod uporabljenega pristopa.
Pri 24 (31,4 % od 76 izolatov) vzorcih z eno samo vrsto enterobakterij v SKUK HAT nismo
naredili. Vzroka, da po opredelitvah raziskave »smiselni« HAT niso bil izdelani, sta bila v
osnovi dva:
- pri 8 izolatih HAT nismo naredili, ker smo v preparatu kužnine po Gramu videli
poleg NB tudi PB: pri teh izolatih HAT nismo delali in smo te vzorce izključili iz
izdelave HAT, saj smo pričakovali mešano rast različnih bakterij.
- pri 16 izolatih HAT nismo naredili, ker v viali z NBJ ni bilo rasti, zato HAT ni bil
izvedljiv.
Zakaj v 16 vialah z NBJ ni bilo ni bilo rasti, lahko domnevamo.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
41
Prva domneva je, da do rasti v viali ni prišlo, ker je bil čas inkubacije pri majhnem
inokulumu bakterij v urinu viale prekratek, da bi se inokulum razmnožil do gostote
McFarland 0,5.
Pri 6 vzorcih je bilo število CFU/mL v SKUK majhno (enako ali manjše od 104 CFU/mL) -
morda ti vzorci v maksimalno 4 urah inkubacije, kot je v protokolu določeno, niso imeli
dovolj časa, da bi se razmnožili do potrebne gostote McFarland 0,5.
Druga domneva je, da je bil v nekaterih vialah antibiotik, ki ga je bolnik dobival in izločal v
urin - antibiotik v urinu je zaviral rast bakterij. Pri inokulaciji v 2 mL HBL vialo z NBJ
inokuliramo 0,5 mL urina: gre torej za redčenje urina v razmerju 1 : 4, kar ni veliko, če je
antibiotik v urinu prisoten v veliki koncentraciji.
V SKUK na agar cepimo majhno količino urina (1 µL ali 10 µL), ki jo redčimo po celotnem
agarju, s čimer morebitni antibiotik iz urina na površini agarja močno razredčimo – s tem se
možnost rasti bakterije poveča. Pri vsakodnevnem delu pri bolnikih včasih opazimo
naslednji pojav: na mestu in v bližini inokulacije kapljice urina na agar ni rasti, periferno,
kamor kapljico z bakteriološko zanko redčimo, pa se rast pojavi.
Pri 10 vzorcih, kjer je v SKUK poraslo veliko število CFU/mL (≥105 CFU/mL), v viali pa ni
bilo rasti, bi bil vzrok za odsotnost rasti lahko antibiotik v v urinu bolnika. Znano je, da se
večina antibiotikov v urinu koncentrira in lahko povzročijo začasno negativno urinokulturo,
čeprav so viabilne bakterije prisotne, ampak zavrte 39.
Prisotnosti antibiotikov v urinu smo preverjali in pri manjšem število urinov v drugem delu
raziskovalnega dela. Obstajajo številne modifikacije iste osnovne metode, s katero lahko
enostavno dokaj zanesljivo ugotavljamo, ali bolnik dobiva antibiotike 39-40. V osnovi je
metoda naslednja: na prazen disk kapnemo kapljico urina in disk uporabimo kot potencialni
»antibiotični disk« - analogno antibiogramu: na Mueller Hinton agar inokuliramo dobro
občutljiv indikatorski sev (npr. E. coli ATCC 25922) enako kot za standardni antibiogram, z
urinom omočeni disk položimo na agar. Inkubiramo preko noči in interpretiramo: inhibicija
rasti okrog diska z urinom pomeni prisotnost antibiotika v urinu, odsotnost cone inhibicije
okrog diska z urinom pomeni odsotnost antibiotika v urinu 44.
Menimo, da bi bilo v prihodnjih raziskavah HAT iz urina smiselno ugotavljati, ali urini
vsebujejo antibiotik, čeprav vedenje o tem ne spremeni dejstva, da precejšen del
enterobakterij, ki so v SKUK zrasle, v NBJ ne raste – pri teh vzorcih HAT torej ni mogoč,
čeprav je po opredelitvi naše naloge smiselen.
Na osnovi navedenega lahko domenvamo, da je HAT izvedljiv:
- pri velikem deležu bolnikov, ki imajo hudo okužbo sečil z velikim številom bakterij v urinu
in ki pred odvzemom urina niso dobili antibiotika
- pri majhnem deležu bolnikov, ki imajo okužbo sečil z majhnim številom bakterij v urinu ali
so pred odvezemom urina dobili antibiotik.
Pregled izdelave HAT v 154 vzorcih, kjer v SKUK enterobakterije niso zrasle kot edini
izolat iz vzorca:
pri 140 vzorcih HAT pravilno ni bil izdelan
pri 14 vzorcih pa je bil HATpo nepotrebnem narejen, čeprav je bil nesmiselen.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
42
V 13 primerih je bil HAT nesmiselen, ker sta iz vzorca porasli dve vrsti bakterij, od tega 12-
krat le po Gramu negativne bakterije. V enem primeru je bil HAT nesmiselen, ker je zarasla
neciljna bakterija (Pseudomonas aeruginosa).
HAT smo po protokolu študije praviloma izdelali, če smo v razmazu iz viale videli le po
Gramu negativne bakterije. Ker razlikovanje dveh vrst enterobakterij na osnovi morfologije
bacilov v razmazu ni možno, je razumljivo, da smo iz teh vzorcev HAT izdelali, saj na
osnovi razmaza nismo mogli vedeti, da gre za več vrst bakterij.
Skupaj smo izdelali 66 HAT:
Smiselnih HAT je bilo 52 (78,8 % od vseh izdelanih). Vsi smiselni HAT so bili
uporabni za analizo, saj so pri njih enterobakterije zrasle v čisti kulturi kot
konfluentna rast na MHA.
Nesmiselnih HAT je bilo 14 (21,2 % od vseh izdelanih), bili so neuporabni za analizo
v naši raziskavi.
V klinični praksi ti HAT ne bi bili popolnoma neuporabni, saj bi na osnovi rasti in
identifikacije izolatov lahko orientacijsko ocenili, za katere antibiotike sta oba izolata
verjetno občutljiva in proti katerim antibiotikom je vsaj en izolat verjetno odporen.
Rezultate antibiogramov – v nadaljevanju HAT, ki smo jih dobili po HMSI in so zbrani
tabeli 5-3, smo primerjali z rezultati, dobljenimi po standardni metodi.
Za referenčno vrednost za primerjavo smo izbrali izdelane standardizirane antibiograme
izolatov končnih izvidov – v nadaljevanju SAB, ki so v tabeli 5-4 Kategorija občutljivosti
(občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata za antibiotike - 52 standardnih
antibiogramov iz standardne urinokulture.
Odčitane zaviralne cone izolatov za posamezni antibiotik so v tabeli kategorizirane kot
stopnje občutljivosti S (občutljiv), I (zmerno občutljiv) in R (odporen).
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
43
Tabela 5-3. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata
za antibiotike - 52 hitrih antibiogramov. Podatki iz raziskave. Zap.št. vzorca ESBL Izolat AM AMC AMCu AN CAZ CFM CFR CIP CRO CXM CXMp ETP FEP FM GM IPM LVX MEM SXT TZP
5 K. oxytoca R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
12 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
22 P. mirabilis R R R S S S S R S S S S S R S S I S R S
24 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
32 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
34 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
35 C. diversus R S S S S S S S S S NI S S NI S S S S S S
37 E. coli R S S S S S S R S S S S S S S S R S R S
40 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
51 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
54 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
55 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
56 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
57 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
61 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
69 ESBL E. cloacae R R R S S R R R R R NI I I NI S S R S R R
70 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
73 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
77 E. coli R R S S S S S R S S S S S S S S R S S S
79 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
83 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
85 ESBL E. coli R R R I R R R R R R R S S S S S R S R R
93 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
95 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
100 P. mirabilis R S S S S S S S S S S S S R S S S S S S
107 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
112 ESBL K. pneumoniae R R S S R R R R R R R S R R R S S S I S
113 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
117 ESBL E. coli R R R S R R R R R R R S R S R S R S R S
130 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S R S
134 E. coli R R S S S S S R S S S S S S R S R S S S
139 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S S I
150 E. coli R R R S S S S S S S S S S S S S S S S S
154 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
158 P. mirabilis S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S
159 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
162 E. coli R R R S S S R R S R R S S R S S R S R R
164 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
167 P. mirabilis S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S
168 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
170 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S R I
172 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
173 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
181 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S S I
182 ESBL E. cloacae R R R S R R R I R R NI S R NI R S S S S I
190 E. coli R R S S S S S R S S S S S S S S R S S S
194 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
195 ESBL E. coli R R R S S R R R R R R S S S S S R S R I
205 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
207 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
226 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
229 E. coli S S S S S S S R S S S S S S S S R S S S
Legenda: S - občutljiv ( angl. sensitive); I – zmerno občutljiv (angl. intermediate); R – odporen (angl. resistant), NI – ni interpretacije.
AM – ampicilin, AMC – amoksicilin s klavulansko kislino, sistemska okužba, AMCu – amoksicilin s klavulansko kislino, rezultat za nezpletene okužbe sečil, AN – amikacin, CAZ –
ceftazidim, CFM – cefiksim, CFR – cefadroksil, CIP- ciprofloksacin, CRO – ceftriakson, CXM – cefuroksim, rezultat za nezpletene okužbe sečil, CXMp – cefuroksim parenteralni, ETP
– ertapenem, FEP – cefepim, FM – nitrofurantoin, GM – gentamicin, IPM – imipenem, LVX – levofloksacin, MEM – meropenem, SXT – trimetoprim s sulfametoksazolom, TZP –
piperacilin z tazobaktamom
ESBL – izolat izloča betalaktamaze razširjenega spektra
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
44
Tabela 5-4. Kategorija občutljivosti (občutljiv/zmerno občutljiv/odporen) bakterijskega izolata
za antibiotike -52 standardnih antibiogramov iz standardne urinokulture. Podatki iz programa
MBL. Zap.št. vzorca ESBL Izolat AM AMC AMCu AN CAZ CFM CFR CIP CRO CXM CXMp ETP FEP FM GM IPM LVX MEM SXT TZP
5 K. oxytoca R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
12 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
22 P. mirabilis R R R S S S S R S S S S S R S S I S R S
24 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
32 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
34 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
35 C. diversus R S S S S S S S S S NI S S NI S S S S S S
37 E. coli R S S S S S S R S S S S S S S S R S R S
40 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
51 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
54 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
55 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
56 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
57 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
61 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
69 ESBL E. cloacae R R R S S R R R R R NI I I NI S S R S R R
70 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
73 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
77 E. coli R R S S S S S R S S S S S S S S R S S S
79 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
83 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
85 ESBL E. coli R R R I I R R R R R R S S S S S R S R R
93 K. pneumoniae R S S S S S S S S S S S S NI S S S S S S
95 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
100 P. mirabilis R S S S S S S S S S S S S R S S S S S S
107 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
112 ESBL K. pneumoniae R R S S R R R R R R R S R R R S S S I S
113 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
117 ESBL E. coli R R R S I R R R R R R S I S R S R S R S
130 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S R S
134 E. coli R R S S S S S R S S S S S S R S R S S S
139 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S S I
150 E. coli R R R S S S S S S S S S S S S S S S S S
154 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
158 P. mirabilis S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S
159 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
162 E. coli R R R S S S R R S R R S S R S S R S R R
164 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
167 P. mirabilis S S S S S S S S S S S S S R S S S S S S
168 E. coli R S S S S S S S S S S S S S S S S S R S
170 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S R I
172 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
173 E. coli R R S S S S S S S S S S S S S S S S S S
181 E. coli R R R S S S S R S S S S S S S S R S S I
182 ESBL E. cloacae R R R S R R R I R R NI S R NI R S S S S I
190 E. coli R R S S S S S R S S S S S S S S R S S S
194 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
195 ESBL E. coli R R R S S R R R R R R S S S S S R S R I
205 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
207 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
226 E. coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S
229 E. coli S S S S S S S R S S S S S S S S R S S S
Legenda: S - občutljiv ( angl. sensitive); I – zmerno občutljiv (angl. intermediate); R – odporen (angl. resistant), NI – ni interpretacije.
AM – ampicilin, AMC – amoksicilin s klavulansko kislino, sistemska okužba, AMCu – amoksicilin s klavulansko kislino, rezultat za nezpletene okužbe sečil, AN – amikacin, CAZ –
ceftazidim, CFM – cefiksim, CFR – cefadroksil, CIP- ciprofloksacin, CRO – ceftriakson, CXM – cefuroksim, rezultat za nezpletene okužbe sečil, CXMp – cefuroksim parenteralni, ETP
– ertapenem, FEP – cefepim, FM – nitrofurantoin, GM – gentamicin, IPM – imipenem, LVX – levofloksacin, MEM – meropenem, SXT – trimetoprim s sulfametoksazolom, TZP –
piperacilin z tazobaktamom
ESBL – izolat izloča betalaktamaze razširjenega spektra
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
45
EVALUACIJA HAT
Primerjali smo rezultate HAT (hitri antibiogram) in SAB pri 52 HAT, ki so bili uporabni za
analizo.
Rezultati kategorij občutljivosti izolatov so v tabeli 5-3 In 5-4.
Testirali smo 18 antibiotičnih snovi, rezultati pa so navedeni za 20 »antibiotikov«.
Gre za to, da imata antibiotika cefuroksim in amoksicilin s klavulansko kislino vsak dva
rezultata – eden velja za sistemske okužbe, drugi pa le za nezapletene okužbe sečil. To je
posebnost pri interpretaciji glede na mesto okužbe in vrsto bakterije.
Pri izolatih enterobakterij iz sečil sta za amoksicilin s klavulansko kislino dva rezultata:
- Za zapletene okužbe sečil in sistemske okužbe – rezultat za ta namen ima okrajšavo
AMC – amoksicilin s klavulansko kislino.
- Posebna interpretacija je za zdravljenje nezapletenih okužb sečil. S tem se možnost
uporabe antibiotika pri teh okužbah poveča – rezultat za ta namen ima okrajšavo
antibiotika AMCu – amoksicilin s klavulansko kislino - cistitis.
Pri izolatih iz sečil sta za cefuroksim dva rezulata:
- Rezultat za i.v. cefuroksim velja za zapletene okužbe sečil in za sistemske okužbe z
vrstama E.coli in P. mirabilis ter vsemi vrstami rodu Klebsiella.
- Rezultat za peroralno obliko cefuroksim aksetil velja le pri nezapletenih okužbah
sečil.
Pri nekaterih izolatih ni rezultatov za vse antibiotike, ker nekatere vrste enterobakterij za
nekatere antibiotike nimajo interpretacije npr.:
- Pri enterobakterijah rezultati za nitrofurantoin veljajo le za E. coli in le pri
nezapletenih okužbah sečil.
E. coli predstavlja z 40 izolati (76,9 %) največji delež med izolati HAT, sledita P. mirabilis
in K. pneumoniae s po 7,7 % pogostostjo. Izolirana sta bila še dva primera vrste E. cloacae
in po en primer izolata C. koseri in K. oxytoca.
Od 52 izolatov HAT je bilo v populaciji 11,5 % izolatov bakterij, ki izločajo ESBL.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
46
V tabeli 5-5. so prikazane razlike med antibiotiki in skladnost / neskladnost obeh metod za
vsak antibiotik posebej.
Tabela 5-5. Seznam in razvrstitev neskladnosti pri testiranih 52 izolatih enterobakterij (vsak
testiran z 20 antibiotiki )
Antibiotik Št. izolata Vrsta Rezultat standardnega antibiograma
Rezultat direktnega antibiograma
Neskladnost
Ceftazidim 22 Escherichia coli*
zmerna občutljivost odpornost majhna
Ceftazidim 29 Escherichia coli*
zmerna občutljivost odpornost majhna
Cefepim 29 Escherichia coli*
zmerna občutljivost odpornost majhna
* vse tri neskladnosti so se pojavile pri dveh izolatih, ki sta izločala ESBL
Neskladnosti, ki jih ugotavljamo, so se pojavile pri dveh izolatih E. coli, ki sta izločala
ESBL.
Verjetnost za pojav napake pri poročanju testiranja antibiotikov je občutno višja pri
bakterijskih populacijah, ki imajo posebne mehanizme odpornosti, kot pri populaciji divjega
tipa - to je ugotovil raziskovalec Maurer s sod. v študiji z disk difuzijsko metodo za 7.148
kliničnih izolatov. Poročanje napak za amoksicilin s klavulansko kislino in piperacilin z
tazobaktamom v primerih okužb z E. coli, so bili skoraj izključno zaradi prisotnosti
betalaktamaz (ESBL) 45.
Coorevits in sod. pri testiranju kliničnih vzorcev direktnega antibiograma podobno
ugotavljajo, da je več neskladnosti kot posledica bolj odpornih mutantov ali pa dodatnih
izolatov z večjo odpornostjo 30.
Bakterije z ESBL imajo najpogosteje CTX encime, ki najhitreje razgrajujejo cefotaksim,
cefepim in ceftazidim pa prizadenejo manj, tako da Valsesia in sod. ugotavljajo, da so cone
inhibicije teh izolatov za cefepim in ceftazidim na meji med intermediarnimi in odpornimi
izolati 46.
Novais s sod. je ugotovil, da imajo izolati z ESBL lahko zelo pogoste mutacije, ki povečajo
odpornost proti ceftazidimu 47.
Vzrok, zakaj je do teh neskladnosti prišlo ravno pri ESBL izolatih je verjetno posledica
zgoraj opisanih pojavov.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
47
Primerjali smo stopnje občutljivosti, določene z omenjenima metodama. Izračunali smo
deleže skladnosti in neskladnosti za vsak posamezni antibiotik in za vse antibiotike in
podatki so zbrani v tabeli 5-6.
Tabela 5-6. Deleži skladnosti in neskladnosti rezultatov direktnega antibiograma v primerjavi s
hitrim antibiogramom (izraženo v odstotkih)
Antibiotik Število z antibiotiko
m testiranih izolatov
Delež skladnosti
(%)
Delež majhnih
neskladnosti (%)
Delež velikih
neskladnosti (%)
Delež zelo velikih
neskladnosti (%)
Delež skladnosti
≥ 90 %
Delež velikih
neskladnosti <3 %
Delež zelo velikih
neskladnosti <3 %
AM 52 100 100 0 0 DA DA DA
AMC 52 100 100 0 0 DA DA DA
AMCu 52 100 100 0 0 DA DA DA
AN 52 100 100 0 0 DA DA DA
CAZ 52 96,2 3,8 0 0 DA DA DA
CFM 52 100 100 0 0 DA DA DA
CFR 52 100 100 0 0 DA DA DA
CIP 52 100 100 0 0 DA DA DA
CRO 52 100 100 0 0 DA DA DA
CXM 52 100 100 0 0 DA DA DA
CXMp 49* 100 100 0 0 DA DA DA
ETP 52 100 100 0 0 DA DA DA
FEP 52 98,1 1,9 0 0 DA DA DA
FM 45* 100 100 0 0 DA DA DA
GM 52 100 100 0 0 DA DA DA
IPM 52 100 100 0 0 DA DA DA
LVX 52 100 100 0 0 DA DA DA
MEM 52 100 100 0 0 DA DA DA
SXT 52 100 100 0 0 DA DA DA
TZP 52 100 100 0 0 DA DA DA
Vsi antibiotiki
1030 99,7 0,3 0 0 DA DA DA
*Pri nekaterih bakterijskih vrstah za antibiotiki ni interpretacije.
Legenda: AM – ampicilin, AMC – amoksicilinsklavulanska kislina, AMCu –URIN amoksicilin s klavulanska kislina, AN – amikacin, CAZ – ceftazidim, CFM – cefiksim, CFR –
cefadroksil, CIP- ciprofloksacin, CRO – ceftriakson, CXM – cefuroksim, CXMp – cefuroksim parenteralni, ETP – ertapenem, FEP – cefepim, FM – nitrofurantoin, GM – gentamicin,
IPM – imipenem, LVX – levofloksacin, MEM – meropenem, SXT – trimetoprim s sulfametoksazolom, TZP – piperacilin s tazobaktam
Skupno smo testirali 1030 kombinacij izolat / antibiotik. Skladnost smo ugotovili pri 1027
testih ali pri 99,7 % odstotkih.
Velikih ali zelo velikih neskladnosti ni bilo, ugotovili smo 3 MAJHNE NESKLADNOSTI
kar predstavlja 0,3 % majhnih neskladnosti.
Pregled pri posameznih antibiotokih:
Za 18 antibiotikov od 20: ampicilin, amoksicilin s klavulansko kislino, URIN amoksicilin s
klavulansko kislino, amikacin, cefiksim, cefadroksil, ciprofloksacin, ceftriakson, cefuroksim,
cefuroksim parenteralni, ertapenem, nitrofurantoin, gentamicin, imipenem, levofloksacin,
meropenem, trimetoprim s sulfametoksazolom in piperacilin s tazobaktamom je bil delež
skladnosti 100 %, za ceftazidim 96,2 % in za cefepim 98,1 %.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
48
Za vseh dvajset testiranih antibiotikov je delež skladnosti ujemanja med rezultati SAB in
HAT višji od 90 %, kar potrjuje dobro primerljivost teh dveh metod.
Ugotovili smo visok delež skladnosti vseh antibiotikov (99,7 %) in odsotnost velikih in zelo
velikih napak - deleža obeh sta namreč 0 %.
Zaključek: rezultati ne kažejo na bistvena odstopanja med primerjanima metodama za
testirane antibiotike, enakovredna je standardni metodi. Metoda HAT izpolnjuje pogoje za
uspešno validacijo metode, ki jih je EUCAST postavil za validacijo standardnega disk-
difuzijskega antibiograma [42].
Ker smo validacijo naredili na relativno majhnem številu izolatov bi bilo smiselno
nadaljevati s primerjavo na večjem številu pozitivnih vzorcev urinov.
5.2 Vzporedna kultivacija v viali z vankomicinom
Prvih 150 vzorcih smo cepili v NBJ in VBJ (2 viali) in preučevali učinke različnih strategij.
Pri teh smo za analizo uporabili navedene opredelitve.
REZULTATI
Od 150 inkubiranih vzorcev, ki smo jih vzporedno cepili v vialo z NBJ in VBJ, je bilo:
- 90 takih, pri katerih v obeh vialah ni bilo rasti – HAT iz njih ni izvedljiv
- 60 takih, pri katerih je bila rast vsaj v viali z NBJ (od tega je bilo 6 vzorcev takih, da v viali
z VBJ ni bilo rasti, 54 vzorcev pa takih, kjer je bila rast v obeh vialah, z NJB in VJB).
Pri teh 60 vzorcih smo preučili posledice uporabe različnih pristopov do izdelave HAT.
Pristope smo imenovali strategija A, B, C in D, opredeljeni so v poglavju o metodah.
Podrobnosti eksperimenta za 60 vzorcev, pri katerih je bila rast vsaj v viali z NBJ, pa so v
prilogi 1.
Med 60 vzorci z rastjo v NBJ je bilo 39 vzorcev s čisto kulturo ene EB v SKUK; pri teh je
HAT opredeljen kot smiselen, ker iz bujona pričakujemo uporaben HAT (čisto kulturo EB).
V vseh ostalih primerih je izdelava HAT opredeljena kot nesmiselna, ker ne pričakujemo
uporabnega antibiograma NB.
Vse NB, ki so zrasle v NBJ, so zrasle tudi v VBJ: pričakovano vankomicin ni zavrl rasti NB.
V tabeli 5-7 so izračuni za vse štiri strategije.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
49
Tabela 5-7. Število vzorcev v različnih kategorijah pravilnosti / nepravilnosti postopkov,
seštevek in delež pravilnih postopkov v različnih strategijah med 60 vzorci, pri katerih smo
zaznali rast v viali z navadnim bujonom
Kategorija pravilnosti postopka Strategija A Strategija B Strategija C Strategija D
HAT izdelan, pravilno 39 39 31 35
HAT izdelan, nepravilno 21 15 4 8
HAT ni izdelan, nepravilno 0 0 8 4
HAT ni izdelan, pravilno 0 6 17 13
Seštevek pravilnih postopkov 39 45 48 48
Delež pravilnih postopkov 65% 75% 80% 80%
Med 60 vzorci je bilo 39 vzorcev, pri katerih je bil HAT smiseln in 21, pri katerih je bil
nesmiseln.
V strategiji A in B bi zajeli vse vzorce, kjer je HAT smiseln, vendar bi naredili veliko
nesmiselnih HAT, delež pravilnih postopkov je najmanjši pri uporabi strategije A.
Delež pravilnih postopkov je v strategijah C in D enak (80 %), vendar strategija D zajame
večji del smiselnih HAT kot strategija C: s strategijo C bi naredili HAT pri 35 od 39
smiselnih HAT (90 %), pri strategiji C pa le pri 31 od 39 HAT (79 %).
Ocenjujemo, da bi bila strategija D najprimernejša za vsakdanje delo. Če bi uporabili
strategijo D (kultivacija urina v VBJ, pri rasti v viali bi naredili razmaz po Gramu in izdelali
HAT, če bi videli le NB) pri 150 vzorcih, ki smo jih cepili v VBJ, bi bilo število postopkov
naslednje:
- urin bi cepili v 150 vial, ki bi jim pred tem dodali vankomicin
- rast bi zaznali v 54 vialah
- naredili bi 54 razmazov po Gramu (pri 6 vzorcih od 60, kjer so bile v NBJ prisotne le
PB, v VBJ ni bilo rasti, ker jim je vankomicin preprečil rast).
- naredili bi 43 HAT, od katerih bi bilo smiselnih HAT 35, 8 pa nesmiselnih
- pri štirih vzorcih od skupno 150 vzorcev HAT ne bi naredili, čeprav bi bil smiseln.
Pri teh 150 vzorcih gre za izračune na osnovi v poglavju o metodah opredeljenih pojmov,
kdaj je HAT »smiseln«, kdaj je pravilno izdelan in kdaj ne: iz vial z VBJ nismo naredili
nobenega HAT.
Za pristop k vzorcem v celotni nalogi z 230 vzorci smo uporabljali modificirano strategijo C
(HAT smo naredili iz NBJ, če smo ga naredili): razlika med strategijo C in strategijo v
nalogi je v tem, da smo v nalogi HAT izjemoma naredili, četudi smo v preparatu po Gramu
videli poleg NB tudi PB, če »je bilo zelo malo PB v primerjavi z NB« (subjektivna ocena
razmerja PB in NB). HAT smo vedno naredili iz NBJ. Pokazalo se je, da je subjektivna
ocena nezanesljiva – HAT smo izdelali v 6 primerih, ko »je bilo zelo malo PB v primerjavi z
NB«: v 4 primerih tako izdelanih HAT smo v SKUK ugotovili dve vrsti bakterij (nesmiseln
HAT) in v 2 smiseln HAT (v SKUK ena vrsta NB).
Ker je strategija D z uporabo viale z VBJ pokazala dobre rezultate, bi bilo smiselno narediti
še raziskavo z izdelavo HAT z uporabo strategije D.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
50
5.3 Določitev roka stabilnosti vankomicina v vodni raztopini za pripravo bujona z vankomicinom
Viale z VBJ niso komercialno dostopne; če bi tehtali vankomicin in sproti pripravljali
raztopino, bi bilo to prezapleteno in časovno potratno (varnostna oprema, čas). Dodajanje že
pripravljene raztopine vankomicina pa je enostavno in hitro. Zanimalo nas je, koliko časa po
pripravi je vodna raztopina vankomicina učinkovita. Rezultati so v naslednjem delu naloge.
Testiranje se je izvajalo z reagenton vankomicin oznaka: VA 100 µg/10µL 17.05.2016,
trajalo je dvanajst tednov in rezultati odčitanih con inhibicij so zbrani v tabeli 5-8 in grafično
prikazani na sliki 5-1.
Tabela 5-8. Izmerjene cone inhibicije reagenta vankomicin za določitev roka stabilnosti
Datum: 18.05.2016 20.05.2016 23.05.2016 25.05.2016 28.05.2016 31.05.2016 07.06.2016
Cona (mm): 21 21 22 22 22 22 22
Datum: 14.06.2016 21.06.2016 28.06.2016 05.07.2016 12.07.2016 20.07.2016 27.07.2016
Cona (mm): 22 22 22 22 21 21 21
Datum: 03.08.2016
Cona (mm): 22
Slika 5-1: Diagram stabilnosti reagenta vankomicin
Zaključek: V obdobju dvanajstih tednov smo testirali laboratorijsko pripravljen reagent
vankomicin z oznako VA 100 µg/10µL 17.05.2016. Območja premerov odčitanih con
inhibicij so bile pri vseh meritvah med 21 in 22 mm in se v času testiranja niso zmanjšale za
3 mm in so ostale znotraj kriterija za stabilnost.
18
19
20
21
22
23
24
25
con
a (m
m)
datum odčitovanja
STABILNOST REAGENTA VANKOMICIN
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
51
S testiranjem smo potrdili, da je laboratorijsko pripravljen reagent vankomicin hranjenj v
hladilniku, stabilen najmanj 12 tednov.
5.4 Dokaz antibiotika v urinu
Testiranje na prisotnost antibiotika v urinu nismo izvajali v celotni študiji. Potreba po tem
testu se je pokazala v času raziskave in primerjave rezultatov po standardni semikvantitativni
metodi in metodi obdelave vzorcev urinov v HB&L analizatorju, ko smo opazili, da v več
vialah ni bilo rasti, po SKUK metodi pa je poraslo veliko število bakterij (≥105 CFU/mL).
Preverjali smo 13 urinov, kjer v NBJ viali ni bilo rasti, po SKUK pa so bakterije porasle.
V 5 primerih od 13, kar je 38,5 %, smo dokazali prisotnost antibiotika v urinu.
Slika 5-2: Primer dokaza antibiotika v urinu
Zaključek: Izsledki naših testiranj dokaza antibiotika v urinu, kažejo na potrebo po
nadaljnjih študij po izvedbi tega testa.
Tudi Cardozo s sod. v zaključku svoje študije predlaga, da se vključi preverjanje prisotnosti
antibiotika v urinu v rutinsko obdelavo kužnine urina pri sumu na urioinfekt 39.
V prispevku Driscoll s sod. navaja, da je metoda z diskom za ugotavljanje prisotnosti
antibiotika v telesnih tekočinah kljub nekaterim omejitvam (npr. ali serum ali plazma) še
vedno uporabna. Metoda je prvič opisana pred več kot 60 leti in je še vedno zanimiva zaradi
nizkih stroškov, preproste izvedbe in detekcije predhodnega zdravljenja z antibiotiki 43.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
52
6 Zaključek
Okužbe sečil so za okužbami zgornjih dihal druga najpomembnejša skupina infekcijskih
bolezni, kar predstavlja resen problem tako v svetu kot tudi pri nas. Zaradi razširjenosti tega
pojava se v praksi predpiše velik delež antibiotikov, s čimer se povečuje tveganje za
odpornost bakterij pri zdravljenju vnetja sečil.
Cilj mikrobiološke diagnostike preiskave urina je določiti povzročitelja okužbe in
občutljivost izolata za antibiotike ali njegovo odpornost proti antibiotikom v čim krajšem
času.
V raziskavi smo pokazali, da je mogoče standardnemu enakovreden antibiogram
enterobakterij izdelati v enem dnevu od sprejetja vzorca urina. Kriteriji za uspešno
validacijo metode HAT so bili izpolnjeni: ugotovili smo mnogo več kot potrebnih 90 %
skladnosti in mnogo manj kot 3 % velikih ali zelo velikih neskladnosti.
Smiselno bi bilo ponoviti preiskavo še na večjem vzorcu urinov, vendar tudi teoretični
argumenti govore o tem, da je HAT ekvivalenten SAT in ni le orientacijska metoda: celoten
postopek je enak, le inokulum je pripravljen na drugačen način, a je standardiziran na
gostoto McFarland 0,5 – to je bistvena prednost v primerjavi z direktnim antibiogramom iz
vzorca.
Le tveganje za mešano kulturo je večje, precej narejenih antibiogramov z mešano rastjo
večih izolatov je potrebno zavreči. Skupaj z dodatno vialo gojišča in delom (inokulacija vial,
spremljanje rasti v aparatu in preparati po Gramu) mešani antibiogrami povečajo stroške
preiskave, vendar je krajši čas do izvida pomembna prednost.
V katerih okoliščinah je dodatek HMSI metode k standardni urinokulturi upravičen, bi bilo
smiselno raziskati – gotovo pri bolnikih s hudo obliko okužb (pielonefritis, sepsa), zagotovo
ne pri preučevanju asimptomatske bakteriurije.
Preučili smo tudi strategijo uporabe viale z vankomicinom in barvanje po Gramu iz vial z
rastjo: to je bila teoretično najboljša strategija za HAT enterobakterij. Dodatek vankomicina
vialam je enostaven, trajnost reagenta dolga, tako da ne prinaša velikega dodatnega dela; se
pa na ta način ne da ugotavljati rasti PB.
Prikazani rezultati potrjujejo, da je HMSI metoda koristna – čas bo pokazal njeno uporabnost
v vsakodnevnem delu - zdi se, da je uporaben drobec znanja za upočasnitev razvoja
odpornosti bakterij z bolj usmerjenim antibiotičnim zdravljenjem.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
53
7 Literatura
[1] The Review on Antimicrobial Resistance. Antimicrobial Resistance: Tackling a crisis
for the health and wealth of nations. The Review on Antimicrobial Resistance, chaired
by Jim O’Neill. December 2014. Dosegljivo s spletne strani 21. 10. 2015: http://amr-
review.org/Publications.
[2] Sundqvist M, Olafsson J, Matuschek. EUCAST breakpoints can be used to interpret
direct susceptibility testing of Enterobacteriaceae from urine samples.APMIS. 2015
Feb;123(2):152-5.
[3] Štrumbelj I. New broth – chromogenic Mueller Hinton agar procedure samples – next
– day – results of Enterobacteriaceae antimicrobial susceptibility testing Dosegljivo
18.05.2016 s spletne strani :
https://www.escmid.org/escmid_publications/escmid_elibrary/?q=%C5%A1trumbelj+
&id=2173&L=0&x=0&y=0
[4] Lindič J. Okužbe sečil. Krka Med Farm 2003; 24: Suppl.1: 11-62.Dosegljivo s spletne
strani:06.07.2016http://www.mf.unilj.si/dokumenti/957b02a34d28fa7653072943b75d
b265.pdf
[5] Tomažič J, Strle F. Infekcijske bolezni. 1. izd. Ljubljana: Združenje za infektologijo,
Slovensko zdravniško društvo ; 2014/2015.
[6] Kahlmeter G; ECO.SENS. An international survey of the antimicrobial susceptibility
of pathogens from uncomplicated urinary tract infections: the ECO.SENS Project. J
Antimicrob Chemother. 2003 Jan;51(1):69-76.
[7] European Confederation of Laboratory Medicine. European urinalysis guidelines.
Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2000;231:1-86.
[8] Kotnik V, s sod. Praktikum iz mikrobiologije in imunologije za študente medicine.
Ljubljana : medicinska fakulteta , Inštitut za mikrobiologijo in imunologijo, Katedra za
mikrobiologijo in imunologijo ; 2011.
[9] Aspevall O, Hallander H, Gant V, Kouri T. European guidelines for urinalysis: a
collaborative document produced by European clinical microbiologists and clinical
chemists under ECLM in collaboration with ESCMID. Clin Microbiol Infect. 2001
Apr;7(4):173-8.
[10] Nicolle LE, Bradley S, Colgan R, Rice JC, Schaeffer A, Hooton TM; Infectious
Diseases Society of America; American Society of Nephrology; American Geriatric
Society. Infectious Diseases Society of America guidelines for the diagnosis and
treatment of asymptomatic bacteriuria in adults. Clin Infect Dis. 2005 Mar
1;40(5):643-54. Epub 2005 Feb 4. Erratum in: Clin Infect Dis. 2005 May
15;40(10):1556.
[11] Kubik JM, McCarter YS. Controversies in the Diagnosis of Urinary Tract
Infections.Clinical Microbiology Newsletter; 2012 December 1; Vol. 34, No. 23.
Dosegljivo 10.06.2016 s spletne strani : http://ac.els-cdn.com/S0196439912000505/1-
s2.0-S0196439912000505-main.pdf?_tid=cffa9532-643f-11e6-b302-
00000aab0f6b&acdnat=1471413771_f2f839d96054538ceed87fbff314cb40.
[12] Delovna skupina Centra za medicinsko mikrobiologijo NLZOH. Novosti pri
interpretaciji rezultatov preiskave vzorcev seča na bakterije in glive (urinokulture).
Dosegljivo 01.05.2016 s spletne strani: http://www.nlzoh.si/index.php/navodila-za-
uporabnike/center-za-medicinsko-mikrobiologijo/vsi-oddelki.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
54
[13] Gubina M,Ihan A. Medicinska mikrobiologija z imunologjo in mikologijo. Ljubljana :
Medicinski razgledi;2002.
[14] Collins CH, s sod. Microbiological Methods. 7th Edition. Great Britain: Butterworth
Heinemann Ltd.; 1995.
[15] Štorman A, Čretnik ŽT. Prispevek mikrobiološkega laboratorija k racionalni uporabi
antibiotikov. In : Müller PM,Gubina M,ed Mikrobi in antibiotiki 2001. Mikrobiološki
simpozij z mednarodno udeležbo ; 2001 junij 22 – 23 ; Ljubljana : Sekcija za klinično
mikrobiologijo in bolnišnične okužbe.
[16] Štrumbelj I, Ribič H, Pirš M. Kratka pojasnila – uporaba evropskih smernic za
antibiogram – EUCAST 2015. Slovenska komisija za ugotavljanje občutljivosti za
protimikrobna zdravila (SKUOPZ). 2015 junij. Dosegljivo 18.05.2016 s spletne strani :
http://www.imi.si/strokovna-zdruzenja/skuopz.
[17] Matuschek E, Brown DF, Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion
antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine
microbiology laboratories Clin Microbiol Infect 2014;20:O255–O26610.1111/1469-
0691.12373 Dosegljivo 18.05.2016 s spletne strani http://www.eucast.org.
[18] EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing -Version
5.0 (January 2015). Dosegljivo 18.05.2016 s spletne strani:
http://www.eucast.org.
[19] Greenwood D, Slack R, Peutherer J, Barer M. Medical microbiology: a guide to
microbial infections: pathogenesis, immunity, laboratory investigation and control.
Edinburgh : Churchill Livingstone / Elsevier; 2012.
[20] Zboromyrska Y, Rubio E, Alejo I, Vergara A, Mons A, Campo I, Bosch J, Marco F,
Vila J. Development of a new protocol for rapid bacterial identification and
susceptibility testing directly from urine samples. Clin Microbiol Infect. 2016
Jun;22(6):561.e1-6 Dosegljivo 05.08.2016 s spletne strani: http://www.eucast.org.
[21] Breteler KB, Rentenaar RJ, Verkaart G, Sturm PD. Performance and clinical
significance of direct antimicrobial susceptibility testing on urine from hospitalized
patients. Scand J Infect Dis. 2011 Oct;43(10):771-6
[22] Johnson JR, Tiu FS, Stamm WE. Direct antimicrobial susceptibility testing for acute
urinary tract infections in women. J Clin Microbiol. 1995 Sep;33(9):2316-23.
[23] Brönnestam R. Direct antimicrobial susceptibility testing in bacteriuria. APMIS. 1999
Apr;107(4):437-44.
[24] Olafsson J. Antimicrobial Susceptibility Testing Directly from Urine Samples - a
Comparison between Standardised and Direct Disk Diffusion Testing together with
Direct Species Identification using Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time
of Flight. Kalmar Växjö: Linnæus University; 2013.
[25] Hansen DS, Butt R, Christiansen T, Pedersen MS, Leerbeck L. Primary susceptibility
testing of urine specimen, why not reduce time to laboratory report and cost?. 22nd
ECCMID London 2012. Poster P1492.Dosegljivo 05.08.2016 s spletne strani
[26] Vickius N, Ekelund O. Direct antimicrobial susceptibility testing on urine samples – is
it achievable in Enterobacteriaceae other than Escherichia coli and Klebsiella
pneumoniae. 25th
ECCMID Cpenhagen 2015. Poster P0804.
[27] Stokkou S, Geginat G, Schlüter D, Tammer I. Direct disk diffusion test using European
Clinical Antimicrobial Susceptibility Testing breakpoints provides reliable results
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
55
compared with the standard method. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2015
Mar;5(1):103-11.
[28] Daley P, Comerford A, Umali J, Penney C. The Performance of Direct Disk Diffusion
for Community Acquired Bacteremia due to Gram-Negative Bacilli and Its Impact on
Physician Treatment Decisions. Can J Infect Dis Med Microbiol. 2016;2016:5493675.
[29] Coyle MB, McGonagle LA, Plorde JJ, Clausen CR, Schoenknecht FD. Rapid
antimicrobial susceptibility testing of isolates from blood cultures by direct inoculation
and early reading of disk diffusion tests. J Clin Microbiol. 1984 Sep;20(3):473-7.
[30] Coorevits L, Boelens J, Claeys G. Direct susceptibility testing by disk diffusion on
clinical samples: a rapid and accurate tool for antibiotic stewardship. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2015 Jun;34(6):1207-12.
[31] Lahanas S, Stathopoulos G, Chan RC, van Hal SJ. Evaluation of the Alfred 60/AST
device as a screening test for urinary tract infections. J Clin Microbiol.2013
Oct;51(10):3406-8.
[32] Spezzotti G. Technical notes on the correct configuration of the Alfred 60/AST device
for the detection of urinary tract infections. J Clin Microbiol. 2014 May;52(5):1805-6.
[33] Ilki A, Bekdemir P, Ulger N, Soyletir G. Rapid reporting of urine culture results:
impact of the uro-quick screening system. New Microbiol. 2010 Apr;33(2):147-53.
[34] Galar A, Yuste JR, Espinosa M, Guillén-Grima F, Hernáez-Crespo S, Leiva J. Clinical
and economic impact of rapid reporting of bacterial identification and antimicrobial
susceptibility results of the most frequently processed specimen types. Eur J Clin
Microbiol Infect Dis. 2012 Sep;31(9):2445-52
[35] Kahlmeter G. Defining antibiotic resistance-towards international harmonization. Ups
J Med Sci. 2014 May;119(2):78-86.
[36] Štrumbelj I, Golle A, Petrovec M, Pirš M, Poljak M, Seme K. Uvajanje testiranja
občutljivosti za protimikrobna zdravila po smernicah EUCAST v Sloveniji. Revija
ISIS: 2013 junij; 62-63.
[37] Smith P, Kronvall G. Estimating the precision of disc diffusion antibiotic susceptibility
data published by the European committee on antimicrobial susceptibility testing.
APMIS. 2014 Nov;122(11):1096-101.
[38] Kahlmeter G. Defining antibiotic resistance-towards international harmonization. Ups
J Med Sci. 2014 May;119(2):78-86
[39] Cardozo D, Kussen GMB, Cogo LL. Research on antimicrobial residues activity in
urine samples of hospitalized patients. J. Bras. Patol. Med. Lab., Rio de Janeiro , v. 50,
n. 6, p. 417-420,2004 Dec. Dosegljivo 18.07.2016 s spletne
strani:http://www.scielo.br/pdf/jbpml/v50n6/1676-2444-jbpml-50-06-0417.pdf.
[40] Emary KR, Carter MJ, Pol S, Sona S, Kumar V, Day NP, Parry CM, Moore CE.
Urinary antibiotic activity in paediatric patients attending an outpatient department in
north-western Cambodia. Trop Med Int Health. 2015 Jan;20(1):24-8.
[41] Isenberg HD. Clinical microbiology procedures handbook. Vol 1. Washington:
American Soceity for Microbiology, 1992: 1.5.1 - 18
[42] Bengtsson S, Bjelkenbrant C, Kahlmeter G. Validation of EUCAST zone diameter
breakpoints against reference broth microdilution. Clin Microbiol Infect. 2014
Jun;20(6):O353-60.
[43] Driscoll AJ, Bhat N, Karron RA, O'Brien KL, Murdoch DR. Disk diffusion bioassays
for the detection of antibiotic activity in body fluids: applications for the Pneumonia
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
56
Etiology Research for Child Health project. Clin Infect Dis.2012 Apr;54 Suppl
2:S159-64.
[44] Khennavong M, Davone V, Vongsouvath M, Phetsouvanh R, Silisouk J, Rattana O,
Mayxay M, Castonguay-Vanier J, Moore CE, Strobel M, Newton PN. Urine antibiotic
activity in patients presenting to hospitals in Laos: implications for worsening
antibiotic resistance. Am J Trop Med Hyg. 2011 Aug;85(2):295-302.
[45] Maurer FP, Courvalin P, Böttger EC, Hombach M. Integrating forecast probabilities in
antibiograms: a way to guide antimicrobial prescriptions more reliably? J Clin
Microbiol. 2014 Oct;52(10):3674-84.
[46] Valsesia G, Roos M, Böttger EC, Hombach M. A statistical approach for
determination of disk diffusion-based cutoff values for systematic characterization of
wild-type and non-wild-type bacterial populations in antimicrobial susceptibility
testing. J Clin Microbiol. 2015 Jun;53(6):1812-22.
[47] Novais A, Cantón R, Coque TM, Moya A, Baquero F, Galán JC. Mutational events in
cefotaximase extended-spectrum beta-lactamases of the CTX-M-1 cluster involved in
ceftazidime resistance. Antimicrob Agents Chemother. 2008 Jul;52(7):2377-82.
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
57
8 Priloge
8.1 Priloga 1. Šestdeset vzorcev, kjer je bila rast zaznana vsaj v navadnem bujonu - podrobnosti posameznih vzorcev: izolati iz vzorca, ali so bili v preparatu po Gramu v viali z navadnim ali vankomicinskim bujonom vidni le po Gramu negativni bacili, ali bi bil hitri antibiogram smiselen, ali bi bil ob uporabi različnih strategij hitri antibiogram izdelan ali ne.
Zap.št. vzorca Izolat 1 Izolat 2
GRAM IZ NBJ
(različne možnosti)
GRAM IZ VBJ
(različne možnosti)
GRAM IZ NBJ (NB ali
drugo)
GRAM IZ VBJ (NB ali
drugo) RAST V
NBJ RAST V
VBJ
Ali je hitri antibiogram
smiselen
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija A
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija B
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija C
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija D
69 Enterobacter cloacae NB NB NB NB DA DA DA da da da da
24 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
32 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
37 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
40 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
54 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
55 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
56 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
57 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
61 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
70 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
73 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
77 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
79 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
83 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
85 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
95 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
107 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
113 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
117 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
58
Nadaljevanje priloge 1.
Zap.št. vzorca Izolat 1 Izolat 2
GRAM IZ NBJ
(različne možnosti)
GRAM IZ VBJ
(različne možnosti)
GRAM IZ NBJ (NB ali
drugo)
GRAM IZ VBJ (NB ali
drugo) RAST V
NBJ RAST V
VBJ
Ali je hitri antibiogram
smiselen
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija A
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija B
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija C
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija D
130 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
134 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
139 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
150 Escherichia coli NB NB NB NB DA DA DA da da da da
34 Klebsiella pneumoniae NB NB NB NB DA DA DA da da da da
51 Klebsiella pneumoniae NB NB NB NB DA DA DA da da da da
93 Klebsiella pneumoniae NB NB NB NB DA DA DA da da da da
112 Klebsiella pneumoniae NB NB NB NB DA DA DA da da da da
22 Proteus mirabilis NB NB NB NB DA DA DA da da da da
100 Proteus mirabilis NB NB NB NB DA DA DA da da da da
5 Klebsiella oxytoca NB NB NB NB DA DA DA da da da da
35 Citrobacter koseri PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da
62 Escherichia coli PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da
78 Escherichia coli PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da
74 Proteus mirabilis PB, NB NB drugo NB DA DA DA da da NE da
146 Enterobacter cloacae PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE
12 Escherichia coli PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE
89 Escherichia coli PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE
88 Klebsiella pneumoniae PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA DA da da NE NE
87 Escherichia coli Escherichia coli NB NB NB NB DA DA NE da da da da
7 Klebsiella oxytoca Escherichia coli NB NB NB NB DA DA NE da da da da
136 Proteus mirabilis Escherichia coli NB NB NB NB DA DA NE da da da da
90 Pseudomonas aeruginosa NB NB NB NB DA DA NE da da da da
63 Escherichia coli Escherichia coli PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da
45 Proteus mirabilis Klebsiella pneumoniae PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
59
Nadaljevanje priloge 1.
Zap.št. vzorca Izolat 1 Izolat 2
GRAM IZ NBJ
(različne možnosti)
GRAM IZ VBJ
(različne možnosti)
GRAM IZ NBJ (NB ali
drugo)
GRAM IZ VBJ (NB ali
drugo) RAST V
NBJ RAST V
VBJ
Ali je hitri antibiogram
smiselen
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija A
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija B
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija C
Ali bi bil hitri antibiogram
izdelan? Strategija D
81 Ena od treh vrst v vzorcu. Ena od treh vrst v vzorcu. PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da
123 Pseudomonas aeruginosa PB, NB NB drugo NB DA DA NE da da NE da
16 Candida albicans KVAS KVAS drugo drugo DA DA NE da da NE NE
64 Candida albicans KVAS KVAS drugo drugo DA DA NE da da NE NE
19 Enterococcus faecalis PB PB drugo drugo DA DA NE da da NE NE
38 Enterococcus faecalis PB PB drugo drugo DA DA NE da da NE NE
67 Staphylococcus aureus PB PB drugo drugo DA DA NE da da NE NE
53 Escherichia coli Enterobacter cloacae PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA NE da da NE NE
48 Providencia stuartii Enterococcus faecalis PB, NB PB, NB drugo drugo DA DA NE da da NE NE
82 Corynebacterium spp. Enterococcus faecalis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE
6 Staphylococcus epidermidis Staphylococcus
epidermidis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE
1 Ena od treh vrst v vzorcu. Ena od treh vrst v vzorcu. PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE
9 Enterococcus faecalis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE
92 Enterococcus faecalis PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE
141 Streptococcus agalactiae PB nt drugo drugo DA NE NE da NE NE NE
Legenda: NBJ - viala z navadnim bujonom, VBJ - viala z bujonom z vankomicinom, NB - po Gramu negativne bakterije, PB - po Gramu
pozitivne bakterije, nt - ni testirano
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
60
9 Življenjepis
OSEBNI PODATKI Zver Mateja
Jugovska ulica 16, 9233 Odranci (Slovenija)
051 215 084
DELOVNE IZKUŠNJE
IZOBRAŽEVANJE IN
USPOSABLJANJE
KOMPETENCE
1.1. 2014–v teku Vodja VI
Nacionalni laboratorij za zdravje, okolje in hrano, Maribor (Slovenija)
15.11. 1991–31.12. 2013 Vodja enote za oskrbo oddelka za mikrobiologijo
Zavod za zdravstveno varstvo Murska Sobota, Murska Sobota (Slovenija)
1.9. 1985–23.6. 1989 Kemijski tehnik
Srednja kemijska šola "Jože Knific - Iks", Ruše (Slovenija)
Materni jezik slovenščina
Drugi jeziki RAZUMEVANJE GOVORJENJE PISNO SPOROČANJE
Slušno razumevanje Bralno razumevanje Govorno
sporazumevanje Govorno sporočanje
nemščina B2 B2 B2 B2 B2
angleščina B2 B2 B2 B2 B2
Stopnja: A1 in A2: Osnovni uporabnik - B1 in B2: Samostojni uporabnik - C1 in C2: Usposobljeni uporabnik
Skupni evropski jezikovni okvir
Komunikacijske kompetence - sposobnosti delovanja v timu in komunikacije s strankami
- sposobnost hitrega razumevanja bistva problema
- sposobnost komuniciranja s poslovnimi partnerji
Pridobljeno tekom zaposlitve.
Organizacijske/vodstvene
kompetence - sposobnost vodenja skupine
- pogajanja s ponudniki materialov
- sposobnost sodelovanja
- sposobnost planiranja potrebnih obdobnih pregledov opreme
Od vzorca do antibiograma enterobakterij v enem dnevu
61
Strokovne kompetence - pravilna in varna uporaba sterilizatorjev in avtoklavov (pridobljeno znanje na seminarju za varno delo
s sterilizatorji)
- dobro poznavanje mikrobiološke analize tekočih vzorcev (udeležba na usposabljanju)
- poznavanje in uporaba orodja za elektronsko poslovanje (praktično usposabljanje na seminarju)
Digitalna
pismenost SAMOVREDNOTENJE
Obdelava informacij
Komunikacija Ustvarjanje
vsebin Varnost Reševanje problemov
Samostojni uporabnik Samostojni uporabnik Samostojni
uporabnik
Samostojni
uporabnik Samostojni uporabnik