This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

lust). Aus der Elementaranalyse der getrockneten Substanz (Gef. C 69,58, H 9,62, O 21 ,17%) berechnet sich ein Atomverhältnis von C4,4117.30!. Eine Mol.-Gew.-Bestimmung konnte wegen der Schwerlöslich-keit der Substanz in Campher nicht durchgeführt werden.

Der hier beschriebene Stoff ist unseres Wissens das erste Hormon des Insektenreiches, das in reiner Form isoliert wurde. Aus biologischen Versuchen über die hormonale Steuerung der Insektenmetamor-phose 13 ist bekannt, daß drei Hormondrüsen daran beteiligt sind: Das Gehirn mit seinen neurosekreto-rischen Zellen, die Prothorakaldrüse und die Corpora allata. Jeder Häutungsschritt wird eingeleitet von einem adenotropen Hormon des Gehirns, das auf die Prothorakaldrüse wirkt und diese zur Ausschüttung eines zweiten Hormons veranlaßt. Das Hormon der Prothorakaldrüse löst die Häutung aus und lenkt sie in imaginäle Richtung, wenn nicht gleichzeitig das Hormon der Corpora allata zur Wirkung kommt und der Häutung larvalen Charakter aufprägt (vgl. das Schema bei K a r l s o n und H a n s e r 5 ) . Die Ein-ordnung des von uns isolierten Stoffes in diese Zu-sammenhänge war möglich durch das Entgegenkom-men von Prof. C a r r o l l M. W i l l i a m s , der ihn an seinen Versuchsobjekten ausgewertet hat. Nadi seinen Ergebnissen 14 vermag das hier besdiriebene Hormon an Puppen der Saturniiden Samia icalkeri

13 Zusammenfassungen: V. B. W i g g l e s w o r t h , Bull. Biol. Suppl. 33, 174 [1949]; H. P i e p h o , Verh. dtsch. zool. Ges. 1951, 62; C . M . W i l l i a m s , Harvey Lectures 47,126 [1952]; vgl. auch V. B. W i g gl es w o r t h, J. exper. Biol. 29, 620 [1952]; C . M . W i l l i a m s , Biol. Bull. 103, 120 [1952].

14 Unveröffentlichte Privatmitteilung.

(Cynthia) und Platysamia cecropia, die sich in der Diapause befinden, die Imaginalentwicklung einzu-leiten; er ist wirksam sowohl an Puppen, denen das Gehirn exstirpiert wurde, als auch am isolierten Puppenabdomen, das keine endokrinen Drüsen mehr enthält. Die in diesem Test benötigte Dosis beträgt

Vergr. etwa 300-fach.

nadi bisherigen Ergebnissen etwa 12,5 y pro Tier. Da die Weiterentwicklung des isolierten Abdomens als spezifische Reaktion auf die Wirkung der Pro-thorakaldrüse anzusehen ist, muß der von uns iso-lierte Stoff das Hormon der Prothorakaldrüse sein.

Fräulein I n g e b o r g B r a c h m a n n danken wir für die gewissenhafte Ausführung der Tierversuche und für technische Hilfe; der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e -m e i n s c h a f t haben wir für eine großzügige Sachbei-hilfe zur Beschaffung des Ausgangsmaterials zu danken.

Über die Oxydationsreaktion der Gärung V o n O T T O W A R B U R G , H E L M U T K L O T Z S C H u n d K A R L F R I E D G A W E H N

Aus dem Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem (Z. Naturforschg. 9 b, 391 393 [1954]; eingegangen am 5. Mai 1954)

In wässerigen Phosphatlösungen, bei neutraler Reaktion, ohne Protein, oxydiert Pyridin-nucleotid Glycerinaldehyd.

I.

1925 fanden wir \ daß Glycerinaldehyd, der in neutraler wässeriger Lösung nicht wesentlich autoxydabel ist, bei Zusatz von Phosphat durch

i F. W i n d , Biochem. Z. 159, 58 [1925],

molekularen Sauerstoff zu Glykolsäure oxydiert wird. M e y e r h o f und L o h m a n n 2 fügten 1934 die Beobachtung hinzu, daß sich der phosphorylierte Glycerinaldehyd ( F i s c h e r - Ester) entsprechend

2 O. M e y e r h o f u. K. L o h m a n n , Biochem. Z. 271, 89 [1934],

verhält. Da Glycerin unter dem Einfluß von Phos-phat nidit autoxydabel wird, so kann die Ursache der Aktivierung des Aldehyds kaum eine andere sein, als daß primär die Aldehydgruppe mit dem Phos-phat reagiert:

/H R CHO + H3PO4 RC—OH

\ ) P 0 3 H 2

Die Aktivierung des Aldehyds durch Phosphat kann man nicht nur mit molekularem Sauerstoff, sondern auch mit andern Oxydationsmitteln nadi-weisen, z. B. mit Jod, das in neutralen Phosphat-lösungen mit Glycerinaldehyd schneller reagiert als

2,0 t » 16

0,8

Sowohl bei diesen Reaktionen als auch bei der Oxydation der Aldehyde durch molekularen Sauer-stoff haben wir verglichen, wie sich Orthophosphat, Pyrophosphat und Metaphosphat verhalten, und haben gefunden, daß molekularer Sauerstoff nur in Orthophosphat oxydierend wirkt. Pyridinnucleotide jedoch oxydieren Aldehyde in Pyrophosphat schneller als in Orthophosphat, in Metaphosphat jedoch lang-samer als in Orthophosphat. Dihydro-Pyridinnucleo-tid reduziert Aldehyde wesentlich nur in Orthophos-phat.

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10 20 30 W . 50 60 min

Abb. 1. Die Phosphatlösungen, deren Ph 7,7 war, enthiel-ten kein Protein, aber pro cm3 1 mg Diphospho-Pyridin-nucleotid und 3 mg Glycerinaldehyd. Sie wurden unter Luftabschluß in Quarzküvetten (Schichtdicken 1 cm) ein-gefüllt und bei 38° gehalten. Die Lichtabsorption der Lösungen in diesen Küvetten wurde für die Wellen-

länge 340 mu gemessen.

10 20 30 W , 50 SO mm —

Abb. 2. Die Phosphatlösungen, deren pH 7,7 war, ent-hielten kein Protein, aber pro cm3 0,1 mg Dihydro-Di-phospho-Pyridinnucleotid und 0,18 mg Glykolaldehyd. Sie wurden unter Luftabschluß in Quarzküvetten (Schicht-dicken 1 cm) eingefüllt und bei 38° C gehalten. Die Lichtabsorption der Lösungen in diesen Küvetten wurde

für die Wellenlänge 340 mp gemessen.

bei gleichem ph in andern Lösungen. Am bemerkens-wertesten aber, im Hinblick auf die Oxydations-reaktion der Gärung, ist das Verhalten des Glycerin-aldehyds in Phosphatlcsungen gegen Pyridinnucleotid.

Wie D o r o t h y N e e d h a m 3 fand, reagieren Pyridinnucleotid und Glycerinaldehyd, ohne Protein, in schwach alkalischer Lösung unter Bildung von hydriertem Pyridinnucleotid. Wir fanden, daß diese Reaktion in Phosphatlösungen wesentlich schneller und auch bei neutraler Reaktion vor sich geht. Ein Versuch ist in Abb. 1 graphisch dargestellt. Wie Glycerinaldehyd wird auch Glykolaldehyd durch Pyridinnucleotid oxydiert, in beiden Fällen entsteht die Bande 340 m/u des hydrierten Pyridinnucleotids. Andererseits reagiert in Phosphatlösungen auch das hydrierte Pyridinnucleotid, unter Abgabe von Was-serstoff, mit Aldehyden (Abb. 2).

3 D o r o t h y N e e d h a m u. Mitarbb., Biochem. J. 49, 113 [1951].

Es sei dazu bemerkt, daß die physiologische Oxyda-tionsreaktion der Gärung, mit Protein und F i s c h e r -Ester, nicht nur in Orthophosphat, sondern auch in Pyrophosphat abläuft und daß dabei wie in Ortho-phosphat (aber anders als in Arseniat) ein Oxyda-tions-Reduktions-Gleichgewicht entsteht.

II.

In den Jahren 1943 bis 1947 versuchte M e y e r -h o f 4 , die Reaktion zwischen F i s c h e r - E s t e r und Phosphat durch eine Verschiebung des Triosephos-phat-Gleichgewichts nachzuweisen, fand jedoch keine Verschiebung. L i p m a n n 5 versuchte, ähnliche Re-aktionen durch Änderung der UV-Absorption nach-zuweisen, gleichfalls ohne Erfolg. Angesichts der

4 O. M e y e r h o f u. Mitarbb., J. biol. Chemistry 149, 71 [1943]; 157, 571 [1945]; 170, 1 [1947],

5 F. L i p m a n n , Advances in Enzymol. 6, 240 [1946].

Abb. 1 und 2 wird man aus derartigen Versuchen schließen, daß im Gleichgewicht weniger von dem Reaktionsprodukt vorhanden ist, als mit den Me-thoden von M e y e r h o f und L i p m a n n nachgewie-sen werden kann; während unsere Methode, die Messung des Verbrauchs an aktivem Wasserstoff — der bei Verbrauch immer wieder nachgebildet wird — offenbar empfindlicher ist *.

III .

Unter dem Einfluß der negativen Ergebnisse von M e y e r h o f stellte R a c k e r 6 1952 die Theorie auf, daß bei der Oxydationsreaktion der Gärung zu-nächst der F i s c h e r - E s t e r an das Fermentprotein — und zwar an dessen SH-Gruppe — gebunden werde; daß er in dieser Bindung durch das Pyridin-nucleotid zur Acylthioverbindung oxydiert werde; und daß dann die Acylthioverbindung durch Phos-phorsäure zu Acylphosphat und SH aufgespalten werde. Keine dieser 3 Reaktionen ist bisher durdi ein Experiment nachgewiesen worden.

IV.

Die erste Forderung der Theorie R a c k e r s ist, daß Protein, F i s c h e r - E s t e r und Pyridinnucleotid ohne Phosphat mindestens ebenso schnell reagieren wie das ganze System mit Phosphat. Quantitative Versuche, in denen das Protein nicht Katalysator, sondern stöchiometrischer Reaktionsteilnehmer ist, wären also notwendig. Da aber der Umsatz in der Oxydations-Reaktion der Gärung bei Gegenwart von Phosphat rund 2 0 0 0 0 Mole pro Minute beträgt, so müßte der stöchiometrische Fermentumsatz in 0,003 Sek. gemessen werden, während 3 Sek., wegen der Mischungszeit, die kürzeste Zeit ist, in der man den Umsatz messen kann. F i s c h e r - E s t e r als Substrat eignet sich also nicht zur Prüfung der Theorie.

Ersetzt man den F i s c h e r - E s t e r durch nicht phosphorylierten Glycerinaldehyd, so hat man den Vorteil, daß die Reaktion etwa 1000-mal langsamer

* Anm. b. d. Korr. : Wir haben inzwischen gefun-den, daß eine starke Bande (Enolbande?) bei 290 mu auftritt, wenn man Glycerinaldehyd in m/2-Orthophos-phat anaerob bei pH 7,7 und 38° stehen läßt; und daß diese Bande bei Sauerstoff-Zutritt abnimmt.

6 E . R a c k e r u. J. K r i m s k y , J. biol. Chemistry 198, 731 [1952],

geht. Dann reicht die mögliche Meßzeit von 3 Sek. gerade aus, um den Umsatz stöchiometrischer Fer-mentmengen zu messen. Wir fanden, mit reinem oxydierendem Ferment aus Hefe, Glycerinaldehyd und Pyridinnucleotid immer — auch in den ersten 3 Sek. — größere Umsatzgeschwindigkeiten bei Gegenwart von Phosphat als bei Abwesenheit von Phosphat.

V.

Unter den Gründen, die zugunsten der Theorie von R a c k e r angeführt werden, nehmen die kri-stallisierten Quecksilbersalze der Fermentproteine, die wir entdeckt haben 7, einen hervorragenden Platz ein: weil wir fanden, daß sie katalytisch inaktiv sind, und daß Cystein ihre katalytische Wirkung wieder herstellt, sollen sie die chemische Bindung der Substrate an die SH-Gruppen der Proteine be-weisen. Bedenkt man aber, daß die Hefezymohexase aktiviert wird, wenn man das Quecksilber durch Zink verdrängt, so wird man aus der Inaktivierung der Fermentproteine durch Quecksilber und ihrer Re-aktivierung durch Cystein keine weiteren Schlüsse ziehen, als sie bei der Entdeckung der Erscheinungen gezogen worden sind.

VI.

Wenn nun auch nichts sicherer ist, als daß Glycerin-aldehyd und Phosphat unter den Bedingungen der Oxydationsreaktion der Gärung miteinander reagie-ren, und daß dabei Wasserstoff des Aldehyds akti-viert wird, so wäre es trotzdem möglich, daß die lebende Natur von dieser Aktivierung keinen Ge-brauch macht, sondern daß sie den R a c k er sehen Umweg zur Erzeugung des Acylphosphats wählt. Indessen — will man hier etwas beweisen oder widerlegen, so wird man zu den Tatsachen8 von 1939 nicht nur neue Überlegungen9, sondern audi neue Tatsachen hinzufügen müssen.

i O. W a r b u r g u. W . C h r i s t i a n , Biochem. Z. 310, 384 [1941]; F. K u b o w i t z u. P . O t t , Biochem. Z. 314, 94 [1943].

8 O. W a r b u r g u. W . C h r i s t i a n , Biochem. Z. 303, 40 [1939].

9 Th. B ü c h e r , Biochim. et biophysica Acta [Amster-dam] 8,219—222 [1952]; S i d n e y F. V e l i c k u.Mitarbb., J. biol. Chemistry 203, 527—583 [1953]; H. L . S e g a l u. P. D. B o y e r s , J. biol. Chemistry 204, 265 [1953]; P. O e s p e r , J. biol. Chemistry 207, 421 [1954],