On‐Line SPE LC/MS/MS Applications

Dr. Sheher Bano MohsinMass Spectrometry Applications

March 19, 2014

3/21/20141

• Introduction – Why Online SPE?• Sensitivity of the Mass Spectrometers• Application Examples• ‐Water Samples• ‐ Samples with dirty Matrices• Introducing the Flexcube for Online SPE

3/21/20142

Solid Phase Extraction (SPE)

• Wouldn’t it be great if you could automate SPE while reducing sample and solvent volumes?

3 3/21/2014

Agilent Online SPE System

Switching valves

Quaternary pump

Autosampler

Analytical column for separation

Binary pump for gradient elution

MS/MS

Replace with Flexcube

Agilent 1200 Infinity Series Online SPE solution

Solvent selection valve for up to three solvents

Reciprocating single‐piston pump for flows up to 4 ml/min (60 bar)

up to two Quick‐Change valves, according to application

5

Valves mounted in 1290 Infinity Flexible Cube

Online SPE with the Flex Cube

Autosampler with 900uL loop and extension seat capillary

1290 Binary Pump

1290 Autosampler

Column Compartment

6460 QQQ

Flexcube

Autosampler

Flex Cube and Autosampler

Single Piston Pump

6 port valve 10 port valve

Autosampler

6 mLvials

Mass Hunter B 06.00 with Flexcube Control

1260 Bin Pump

System with alternating SPE loading:Load sample to SPE1

SPE2

SPE1

Std. ALS 900 µL head

Flex cube pump Column

waste

Load

SPE starter set

G4742A

1260 Bin Pump

System with alternating SPE loading:Elute sample from SPE1 to column / Load sample 2 on SPE2 

SPE2

SPE1

Std. ALS 900 µL head

Flex cube Column

waste

Elute

Load

Mass Spec

Evaluation of On‐line Solid Phase Extraction and Direct Injection‐LC/MS/MS for the Analysis of Chemicals on U.S. EPA’s Contaminant Candidate 

List 3

Sheher Bano MohsinMichael Woodman

Chemicals for LC/MS/MS Evaluation*

• 4,4’‐methylenedianiline• 3‐hydroxycarbofuran• bensulide• clethodim• fenamiphos• fenamiphos sulfone

• fenamiphos sulfoxide

•methomyl• quinoline• tebuconazole• tebufenozide• thiodicarb

9 CCL3 chemicals                3 CCL3 degradates

*Slide Taken From: Evaluation of On‐line Solid Phase Extraction‐LC/MS/MS for the Analysis of Chemicals on U.S. EPA’s Contaminant Candidate List 3 ‐ Jody A. Shoemaker and Daniel R. Tettenhorst

Superimposed chromatograms Showing Reproducibility of Retention time as well as Area Counts for two runs Alternating Between two Different SPE Cartridges.  The calibration standard used has a concentration of 10 ppt (ng/L) each for all 12 compounds with quantifier and qualifier ions. Each run alternates between two different SPE cartridges.

Mix at 1 ppt

Fenomiphos Sulfoxide

Fenomiphos Sulfone

Tebufenozide

Thiodicarb

Clethodim

Bensulide

Tebuconazole

Fenomiphos

Carbofuran‐3‐Hydroxy

Methomyl

Quinoline

4,4‐diaminodiphenyl methane

Mix at 0.1 ppt

1 ppt and 0.1 ppt

1 ppt

0.1 ppt 1 ppt

0.1 ppt

1ppt

0.1 ppt

1 ppt

0.1 ppt

1 ppt

0.1 ppt

EPA Method 543: Selected Organic Contaminants by Online SPE – LC‐QQQ using the Agilent FlexCube and 6460 Tandem 

Quadrupole MS

Don Noot, Ralph HindleVogon Laboratory ServicesCochrane, AB, Canada

Multi‐lab Verification Study of the first online SPE LC/MS EPA method

Goals

• Demonstrate acceptable method performance using Agilent online SPE (Flexible Cube) and LC‐QQQ

• Demonstrate acceptable performance of the Agilent Bond Elut SPE PLRP‐S cartridges

• Method verification requirements:– Accuracy and Precision determination in reagent water and drinking water

• Accuracy: Recoveries between 70 and 130%• Precision: RSDs ≤ 20%

– Determination of LCMRL, using calculator supplied by EPA

18

19

The results show that the Agilent online SPE – LC‐QQQ system produces results (accuracy, precision and LCMRL) very similar to those produced  by the US EPA.

The Agilent Bond Elute SPE PLRP‐S cartridge produces results very similar to the Oasis HLB SPE cartridge, which is specified in the US EPA method.

Calibration• Compounds showed best fit using quadratic, 1/X weighting• Fenamiphos example shown (typical), from 0.02 to 20 ng/L

20

Calibration Range• Compounds were analysed at different concentrations due to differences 

in sensitivity• Calibration standards were prepared and down to levels where the 

compounds were not detected• The range of concentrations used for the calibration curves for each 

compound is shown in the table

21

Compound Range (ng/L)3‐Hydroxycarbofuran 0.20 – 50Bensulide 0.05 – 50Fenamiphos 0.02 – 20Fenamiphos sulfone 0.05 – 50Fenamiphos sulfoxide 0.05 – 50Tebuconazole 0.02 – 20Tebufenozide 0.02 – 20

Accuracy and Precision• Preserved tap water (surface water source)  was fortified at a mid‐level 

compared to the calibration curve range• Seven fortified replicates were analysed to determine Accuracy and 

Precision• Accuracy is presented as the average recovery of all seven replicates• Precision is presented as the % Relative Standard Deviation (%RSD)

22

Accuracy ‐ LFB

23

Accuracy (%)HLB PLRP‐S EPA*107 102 100104 99.4 102100 100 101101 100 10587.7 94.3 11296.7 102 101101 104 95.2

Accuracy ‐ LFSMAccuracy (%)

HLB PLRP‐S EPA*93.1 103 111100 105 102102 96.3 95104 100 97.2101 95.5 103100 96.1 105101 97.1 88.4

* EPA data from fortifications at a similar concentration level, and from a surface water for LFSM

Precision ‐ LFB

24

Precision ‐ LFSM

* EPA data from fortifications at a similar concentration level, and from a surface water for LFSM

Precision (%)HLB PLRP‐S EPA*1.6% 1.7% 4.11.3% 2.7% 4.00.8% 3.4% 4.42.0% 3.7% 3.74.2% 2.0% 5.41.4% 4.0% 3.62.7% 3.4% 2.9

Precision (%)HLB PLRP‐S EPA*4.8% 4.2% 3.53.5% 1.7% 4.00.9% 1.7% 1.82.8% 3.8% 6.76.5% 5.1% 9.85.1% 3.9% 8.31.2% 2.4% 12

LCMRL Calculations• Calculations are determined by entering values in EPA‐supplied LCMRL Calculator3

• LCMRL is defined as the lowest spiking concentration at which recovery of between 50 and 150% is expected 99% of the time by a single analyst

• Requires minimum of 4 replicates at each of 7 fortification levels, plus 4 LRBs• The LCMRL Calculator constructs mean and variance models of measurement as a 

function of spiking level• This procedure takes into account both precision and accuracy• When the LCMRL value is not bracketed by the fortified sample levels, the 

calculator gives a warning that an additional set of replicates will be needed• Next table shows calculated values and also US EPA values1.• Results are similar to EPA values, and PLRP‐S values are similar to HLB.

25

LCMRL Results

26

LCMRL (ng/L)

Compound Oasis HLBAgilent PLRP‐

S EPA (Oasis HLB)3‐Hydroxycarbofuran 2.1 3.4 1.7Fenamiphos sulfoxide 0.33 0.48 1.2Fenamiphos sulfone 0.25 0.16 1.4Fenamiphos 0.072 0.078 0.27Tebuconazole 0.21 0.57 1.3Tebufenozide 0.13 0.066 0.47Bensulide 0.73 0.36 1.2

Note: the EPA method specifies use of Ammonium Acetate as the mobile phase.  Better sensitivity can be achieved by using Ammonium Formate(especially for 3‐Hydroxycarbofuran)

LCMRL Example Plots

27

Fenamiphos sulfoxide Fenamiphos

Discussion and Conclusions• An Agilent on‐line SPE 1260‐1290/6460 LC‐QQQ system is suitable for the analysis of 

pesticides and metabolites in drinking water for EPA Method 543.• The Agilent Flexible Cube incorporates seamlessly into the LC system and is controlled 

by MassHunter software.  Online SPE provides many benefits for the analytical lab.• Agilent Bond Elut SPE PLRP‐S cartridges perform similarly to the Oasis HLB SPE 

cartridges for US EPA method 543.– LCMRLs are near or below EPA levels.– Accuracy and Precision values were similar to US EPA values.

• The Agilent Poroshell PhenylHexyl column provides excellent retention and separation of the target compounds.

• The analysis method time (injection to injection) of less than 17 minutes (including online SPE), allows many samples to be automatically processed each day.

28

Acknowledgements• Many Thanks to

• Trisa Robarge of Agilent Technologies for supplying the Bond Elute SPE PLRP‐S cartridges

• Sheher Mosin, Bettina Schuhn and Jean‐Francois Roy of Agilent Technologies for advice on setting up the Flexible Cube

29